JPH02257064A - カチオン界面活性剤含有洗浄液ならびにクラミジアおよび淋菌の測定におけるその使用 - Google Patents
カチオン界面活性剤含有洗浄液ならびにクラミジアおよび淋菌の測定におけるその使用Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56927—Chlamydia
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、生物学的被験体中のクラミジア生菌体または
淋菌生菌体の測定方法で有用な洗浄液に関する。具体的
には、この発明はカチオン界面活性剤を含んでなる洗浄
液に関する。
淋菌生菌体の測定方法で有用な洗浄液に関する。具体的
には、この発明はカチオン界面活性剤を含んでなる洗浄
液に関する。
最近では、イムノアッセイが感染性疾患の存在を検出す
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するだめの試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。
るのに使用されてきた。このアッセイが有用であるため
には、高度の信頼性を保ちながら特殊な生菌体を検出し
なければならない。これには殆どの場合に、生菌体に関
する特定抗原の単離およびその抗原と対応する抗体との
反応が必要である。商業的に成功するだめの試金石とし
ては、加えて、相当安価であり使用が簡便で、かつ迅速
であることも必要である。
イムノアッセイによって検出することができるかかる生
菌体の1つは、タラミジアーレス(Chlamydia
les) 目、クラミジアセエ(Ch Iamyd 1
aceae)属の2つの菌種の1つであるクラミジア・
トラコマチス(イ達見対艮trachomatis)(
本明細書では、「C,トラコマチス」という)である。
菌体の1つは、タラミジアーレス(Chlamydia
les) 目、クラミジアセエ(Ch Iamyd 1
aceae)属の2つの菌種の1つであるクラミジア・
トラコマチス(イ達見対艮trachomatis)(
本明細書では、「C,トラコマチス」という)である。
トラコーマ、包入体性結膜炎、性病性リンパ肉芽腫、非
淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数のヒトの
眼および性器の疾病の原因となるこの種に属する15以
上の菌株が存在する。C,)ラコマチスに由来する感染
症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性尿道
炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じられ
る。
淋菌性尿道炎および直腸肛門炎を包含する多数のヒトの
眼および性器の疾病の原因となるこの種に属する15以
上の菌株が存在する。C,)ラコマチスに由来する感染
症は、普通の人々の間で蔓延し、そのため非淋菌性尿道
炎だけをとっても各年毎に数百万人存在すると信じられ
る。
淋菌は、ナイセリア(Neisseria)属、特にN
、ボッo工工(N、肪武n伽狙封)に属する細菌により
惹起される性器接触で一般に伝播される疾病である。
、ボッo工工(N、肪武n伽狙封)に属する細菌により
惹起される性器接触で一般に伝播される疾病である。
々の間に存続している。この生菌体の検出および処置の
重要性は、十分に認識されている。N、メニンギチジス
(IJ、匹紅皿旦用旦)およびN、ラクタミカ(N、
lactamica) もまた医療および診断」二無視
できない対象の種である。
重要性は、十分に認識されている。N、メニンギチジス
(IJ、匹紅皿旦用旦)およびN、ラクタミカ(N、
lactamica) もまた医療および診断」二無視
できない対象の種である。
これら分疾病の広く蔓延する性質のため、これらの原因
となる生菌体の検出について迅速、簡便かつ信顛できる
試験を入手することに相当な興味が存在する。これらの
生菌体から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い
出すべくかなりの研究が行われてきた。例えば、米国特
許第4,427,782号および同4,663,291
号明細書ならびにヨーロッパ特許公開第174,106
号および同193,431号公報を参照のこと。
となる生菌体の検出について迅速、簡便かつ信顛できる
試験を入手することに相当な興味が存在する。これらの
生菌体から検出可能な抗原を抽出する有用な方法を見い
出すべくかなりの研究が行われてきた。例えば、米国特
許第4,427,782号および同4,663,291
号明細書ならびにヨーロッパ特許公開第174,106
号および同193,431号公報を参照のこと。
固体支持体を使用して実施するC、トラコマチスおよび
N、ゴノロエエについてのアッセイは、それぞれ米国特
許第4,497,899号および同4,497,900
号明細書に記載されている。記載されているアッセイは
、生菌体から抗原を抽出し、それを裸の固体支持体上に
塗布することによって行われている。
N、ゴノロエエについてのアッセイは、それぞれ米国特
許第4,497,899号および同4,497,900
号明細書に記載されている。記載されているアッセイは
、生菌体から抗原を抽出し、それを裸の固体支持体上に
塗布することによって行われている。
次に、塗布された抗原が、1つは適当に標識されている
1種または2種の抗体いずれかにより検出されている。
1種または2種の抗体いずれかにより検出されている。
このアッセイの主要な態様は、付着の目的で全くどのよ
うな材料によっても処理または塗布されていない固体支
持体が使用されていることが明らかである。抗原の付着
は、支持体上への抗原の吸着を起こすのに十分長い時間
その塗布支持体をインキュベーションすることにより達
成されていることが明らかである(米国特許第4.49
7,899号明細書、カラム2.51〜55行)。米国
特許第4,497,899号明細書に記載されるアッセ
イ全体は、完結までに少なくとも3時間かかる。
うな材料によっても処理または塗布されていない固体支
持体が使用されていることが明らかである。抗原の付着
は、支持体上への抗原の吸着を起こすのに十分長い時間
その塗布支持体をインキュベーションすることにより達
成されていることが明らかである(米国特許第4.49
7,899号明細書、カラム2.51〜55行)。米国
特許第4,497,899号明細書に記載されるアッセ
イ全体は、完結までに少なくとも3時間かかる。
N、ゴノロエエについて、はんのわずか早められた同様
なアッセイは、米国特許第4,497,900号明細書
(カラム、4および5を参照のこと)に記載されている
。
なアッセイは、米国特許第4,497,900号明細書
(カラム、4および5を参照のこと)に記載されている
。
このような既知のアッセイを実施するに際して、結合抗
原および結合免疫複合体は水または緩衝液により洗浄さ
れている。Ca1diyellら(J、Cl1n、Mi
crobiol、 1B(3)、 539〜545ペー
ジ、1983 )は、洗浄工程を非イオン界面活性剤、
Tween”20を含有するリン酸緩衝溶液(PBS)
を使用して行うC,l−ラコマチスに対するイムノアッ
セイを記載する。N。
原および結合免疫複合体は水または緩衝液により洗浄さ
れている。Ca1diyellら(J、Cl1n、Mi
crobiol、 1B(3)、 539〜545ペー
ジ、1983 )は、洗浄工程を非イオン界面活性剤、
Tween”20を含有するリン酸緩衝溶液(PBS)
を使用して行うC,l−ラコマチスに対するイムノアッ
セイを記載する。N。
ゴノロエエに対する同様なアッセイは、米国特許第4,
241,045号明細書に記載されている。
241,045号明細書に記載されている。
クラミジア生菌体または淋菌生菌体に関するアッセイで
既知の洗浄方法を使用することは、そのバックグランド
が高すぎるかもしくは感度が低くすぎ、そして抗体が抗
原に対するよりもむしろ固体支持体に結合することが見
い出されることから受は入れることができない。
既知の洗浄方法を使用することは、そのバックグランド
が高すぎるかもしくは感度が低くすぎ、そして抗体が抗
原に対するよりもむしろ固体支持体に結合することが見
い出されることから受は入れることができない。
〔課題を解決するための手段〕
前記課題は、1種以上のカヂオン界面活性剤を少なくと
も0.1重量%含んでなる洗浄液によって解決される。
も0.1重量%含んでなる洗浄液によって解決される。
この発明はまた、
(A)クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むことが
予測される被験体からそれぞれ抽出されたクラミジア抗
原または淋菌抗原を、その抗原に対する抗体と接触させ
ることにより抗原と抗体の免疫複合体を形成する工程; (B)複合体形成と同時または前後に、抗原もしくは抗
体のいずれかかまたは両者を固体支持体上で不溶化する
ことにより結合した免疫複合体を形成する工程; (C)1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1
重量%を含んでなる洗浄液で前記複合体を洗浄すること
により結合した免疫複合体から複合体化していない物質
を分離する工程;ならびに(D)被験体中のクラミジア
生菌体または淋菌生菌体の量を示すものとして前記結合
した複合体の存在を測定する工程、を含んでなるクラミ
ジア生菌体または淋菌生菌体の測定方法をも提供する。
予測される被験体からそれぞれ抽出されたクラミジア抗
原または淋菌抗原を、その抗原に対する抗体と接触させ
ることにより抗原と抗体の免疫複合体を形成する工程; (B)複合体形成と同時または前後に、抗原もしくは抗
体のいずれかかまたは両者を固体支持体上で不溶化する
ことにより結合した免疫複合体を形成する工程; (C)1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1
重量%を含んでなる洗浄液で前記複合体を洗浄すること
により結合した免疫複合体から複合体化していない物質
を分離する工程;ならびに(D)被験体中のクラミジア
生菌体または淋菌生菌体の量を示すものとして前記結合
した複合体の存在を測定する工程、を含んでなるクラミ
ジア生菌体または淋菌生菌体の測定方法をも提供する。
(具体的な記述〕
本発明は、適当な医療および診断法を使用して患者から
得られた生物学的被験体中のC,I−ラコマチス(C,
trachomatis) (または他のクラミジア種
)の存在、あるいはN、ゴノロエエ(N、p1打rho
eae)(または他の淋菌種)の存在を測定する方法で
ある。このような被験体としては、例えば、患者の頚管
、尿道、咽喉または肛門から得られる綿棒被験体、およ
び滑液または病巣由来の流体のような体液が挙げられる
。こうして得られる生物学的被験体は、測定されるべき
クラミジア抗原もしくは淋菌抗原(またはそれらの混合
物)を有するクラミジア生菌体または淋菌生菌体を含む
ことが予測される。
得られた生物学的被験体中のC,I−ラコマチス(C,
trachomatis) (または他のクラミジア種
)の存在、あるいはN、ゴノロエエ(N、p1打rho
eae)(または他の淋菌種)の存在を測定する方法で
ある。このような被験体としては、例えば、患者の頚管
、尿道、咽喉または肛門から得られる綿棒被験体、およ
び滑液または病巣由来の流体のような体液が挙げられる
。こうして得られる生物学的被験体は、測定されるべき
クラミジア抗原もしくは淋菌抗原(またはそれらの混合
物)を有するクラミジア生菌体または淋菌生菌体を含む
ことが予測される。
このアッセイは、クラミジア細胞全体または淋菌細胞全
体の抗原部位の検出を行うことができるが、アッセイ感
度を高めるにはそれらの生菌体から抗原を抽出すること
が一般に望ましい。標準的な手段、例えば溶媒希釈また
は高pH溶菌溶液、酵素処理および超音波または遠心の
ような物理的撹拌を使用することで、生菌体を熔解し、
そして含まれる抗原を遊離させることができる。加熱法
も当該技術分野で溶菌法として公表されている。ドデシ
ル硫酸すトリウムおよびデオキシコール酸すトリウムの
ようなアニオン洗浄剤または塩の使用は、米国特許第4
,497,899号、同4,497,900号および同
4,663.291号明細書に記載されている。
体の抗原部位の検出を行うことができるが、アッセイ感
度を高めるにはそれらの生菌体から抗原を抽出すること
が一般に望ましい。標準的な手段、例えば溶媒希釈また
は高pH溶菌溶液、酵素処理および超音波または遠心の
ような物理的撹拌を使用することで、生菌体を熔解し、
そして含まれる抗原を遊離させることができる。加熱法
も当該技術分野で溶菌法として公表されている。ドデシ
ル硫酸すトリウムおよびデオキシコール酸すトリウムの
ようなアニオン洗浄剤または塩の使用は、米国特許第4
,497,899号、同4,497,900号および同
4,663.291号明細書に記載されている。
好ましい態様では、本発明を使用してタラミジアリポポ
リザッカライド(糖脂質群)抗原(例えば、ヨーロッパ
特許公開第193431号公報に記載〕を検出すること
ができる。その公報には、また、抽出法も記載されてい
る。もう一つの態様では、検出される抗原が会合する外
層膜蛋白全体の60%を占めるその生菌体のクラミジア
主要外層膜蛋白であってもよい。ある例では、これらの
クラミジア抗原混合物が本発明を使用して検出されうる
。
リザッカライド(糖脂質群)抗原(例えば、ヨーロッパ
特許公開第193431号公報に記載〕を検出すること
ができる。その公報には、また、抽出法も記載されてい
る。もう一つの態様では、検出される抗原が会合する外
層膜蛋白全体の60%を占めるその生菌体のクラミジア
主要外層膜蛋白であってもよい。ある例では、これらの
クラミジア抗原混合物が本発明を使用して検出されうる
。
さらにもう一つの態様では、本発明を使用して1種以上
の淋菌抗原(IAもしくはIB蛋白)または別個の淋菌
株に由来する抗原混合物が検出される。
の淋菌抗原(IAもしくはIB蛋白)または別個の淋菌
株に由来する抗原混合物が検出される。
好ましい抽出組成物は、アルコールアミンまたはその塩
を含んでなD、かつ高p11(少なくとも8)を有する
。この好ましい組成物のより詳細は、例との関連で後述
する。
を含んでなD、かつ高p11(少なくとも8)を有する
。この好ましい組成物のより詳細は、例との関連で後述
する。
さらに、蛋白質、全血または粘液を分解するため抽出工
程でプロテアーゼを使用することが好ましい場合もある
。
程でプロテアーゼを使用することが好ましい場合もある
。
必須ではないが、生菌体から抗原の抽出がされた後、次
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残層、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい。予備
濾過は、ある型のフィルターを有する適当な容器で行う
ことができる。
の操作を行う前に被験体を予備濾過して細胞残層、微小
粒子または他の不要物を除去することが望ましい。予備
濾過は、ある型のフィルターを有する適当な容器で行う
ことができる。
抽出は、抗原の抽出用として特別に設計された装置を含
むいずれかの適当な容器で行うことができる。利用可能
な装置は、米国特許第4,746,614号明細書を含
む従来技術で知られている。
むいずれかの適当な容器で行うことができる。利用可能
な装置は、米国特許第4,746,614号明細書を含
む従来技術で知られている。
抽出された抗原は1種以上の適当な抗体とそれを免疫的
に反応させるイムノアッセイを使用して検出される。得
られた免疫複合体は、適当な放射線、比色、蛍光または
酵素標識試薬を使用して検出される。ある場合には、試
薬は抗原に対する標識抗体であD、またある場合には、
抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識抗−抗体で
ある。
に反応させるイムノアッセイを使用して検出される。得
られた免疫複合体は、適当な放射線、比色、蛍光または
酵素標識試薬を使用して検出される。ある場合には、試
薬は抗原に対する標識抗体であD、またある場合には、
抗原と反応する未標識抗体に向けられる標識抗−抗体で
ある。
このようなイムノアッセイは、一般に、塗布されている
かまたは塗布されていないある型の固体支持体上での検
出可能な免疫複合体の形成、それに続く適当な検出法を
含む。別のアッセイは、免疫複合体の少なくとも1種の
反応体(例えば、抗体)が複合体形成中に一緒に凝集す
るようなある型の標識または未標識粒子に付着された場
合に免疫複合体の凝集を伴う。
かまたは塗布されていないある型の固体支持体上での検
出可能な免疫複合体の形成、それに続く適当な検出法を
含む。別のアッセイは、免疫複合体の少なくとも1種の
反応体(例えば、抗体)が複合体形成中に一緒に凝集す
るようなある型の標識または未標識粒子に付着された場
合に免疫複合体の凝集を伴う。
有用なアッセイの例としては、コンペティティブイムノ
アッセイまたはエンザイム・リンクド・イムノアブソー
ヘント・ (通常rEIJsA Jと称される)が挙げ
られる。これらのアッセイは米国特許第4,427,7
82号明細書およびSchmeerらによD、J、Cl
1n、Microbiol、、15(5)、 8308
34ページ(1982)に振込されている。使用される
クラミジア抗体または淋菌抗体は生菌体から抽出されて
いるいずれかの抗原または数種の抗原に向けることがで
きる。
アッセイまたはエンザイム・リンクド・イムノアブソー
ヘント・ (通常rEIJsA Jと称される)が挙げ
られる。これらのアッセイは米国特許第4,427,7
82号明細書およびSchmeerらによD、J、Cl
1n、Microbiol、、15(5)、 8308
34ページ(1982)に振込されている。使用される
クラミジア抗体または淋菌抗体は生菌体から抽出されて
いるいずれかの抗原または数種の抗原に向けることがで
きる。
−の態様では、抗体がC,トラコマチスのりポポリザソ
カイドのような単一抗原に向けられる。もう一つの態様
では、各種抗体混合物が数種の淋菌株から抽出されるよ
うな数種の抗原に向けられる。
カイドのような単一抗原に向けられる。もう一つの態様
では、各種抗体混合物が数種の淋菌株から抽出されるよ
うな数種の抗原に向けられる。
好ましくは、抽出された抗原はそれが結合し・うるポリ
マー固体支持体と接触される。利用可能な支持体材料と
しては、ガラス、セルロース系またはポリマービーズ、
フィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当該技術分
野で既知のものが挙げられる。好ましくは、支持体材料
はより詳細について後述するような微孔質膜である。こ
の膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によっても処理
されていないかまたは塗布されていないものであること
ができる。しかしながら、それはアッセイ性能を高めう
る物質(例えば、界面活性剤)で好ましくは処理または
塗布される。
マー固体支持体と接触される。利用可能な支持体材料と
しては、ガラス、セルロース系またはポリマービーズ、
フィルム、チューブ、ゲル、プレートおよび当該技術分
野で既知のものが挙げられる。好ましくは、支持体材料
はより詳細について後述するような微孔質膜である。こ
の膜は、「裸」、すなわち何等かの物質によっても処理
されていないかまたは塗布されていないものであること
ができる。しかしながら、それはアッセイ性能を高めう
る物質(例えば、界面活性剤)で好ましくは処理または
塗布される。
ある態様では、固体支持体は複数の正荷電基をその表面
に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジティ
ブな電荷、すなわち広いpi(範囲を通じてポジティブ
なゼータ(zeta)電位を生じさせる。ゼータ電位は
、支持体とそれに接触する流体との間の電位差として知
られている。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせる
すべての正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能であ
る。
に有する。これらの正荷電基は、支持体表面にポジティ
ブな電荷、すなわち広いpi(範囲を通じてポジティブ
なゼータ(zeta)電位を生じさせる。ゼータ電位は
、支持体とそれに接触する流体との間の電位差として知
られている。支持体上に所定のゼータ電位を生じさせる
すべての正荷電化学残基が本発明の実施上利用可能であ
る。
例えば、この支持体は、抽出抗原とイオン的に結合し得
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネ−1・、ポリエチレンイ
ミン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニル
モノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技術
分野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチ
オン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホ
ニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウ
ム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもの
である。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容と
なる、前述の出願を調査することにより得ることができ
る。
る適当なカチオン基を表面上に有するいずれかの天然ま
たは合成ポリマーから構築することができる。利用可能
なポリマーとしては、必要な荷電基を有するポリエステ
ル、ポリアミド、ポリカーボネ−1・、ポリエチレンイ
ミン、セルロース系材料およびエチレン系不飽和ビニル
モノマーから製造される付加ポリマーならびに当該技術
分野で既知の他のポリマーが挙げられる。一般に、カチ
オン基としては、第四級アンモニウム塩、第四級ホスホ
ニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピリジニウム
塩、第四級ピリミジニウム塩または第四級イミダゾリウ
ム塩が挙げられ、第四級アンモニウム塩が好ましいもの
である。さらなる詳細は、引用により本明細書の内容と
なる、前述の出願を調査することにより得ることができ
る。
ある種の利用可能なポリマー固体支持体は、Pos 1
dyne”またはBiodyne”−B膜のような既知
の微孔質膜である。これらの支持体は、細孔に第四級ア
ンモニウム基を有するポリエステルが塗布されたナイロ
ン膜からなる。他の膜、例えば界面活性剤が塗布された
ものも、また本発明の実施上利用可能である。
dyne”またはBiodyne”−B膜のような既知
の微孔質膜である。これらの支持体は、細孔に第四級ア
ンモニウム基を有するポリエステルが塗布されたナイロ
ン膜からなる。他の膜、例えば界面活性剤が塗布された
ものも、また本発明の実施上利用可能である。
抗原が免疫反応前に固体支持体に結合される前述の態様
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにパインディングすることができる。
と対比して、本発明のアッセイは、抗原が固体支持体に
付着すると同時かまたはその前後で免疫複合体を形成す
ることによっても実施することができる。換言すれば、
溶液中で複合体が形成された後、固体支持体との接触に
よりそれにパインディングすることができる。
本明細書で開示される支持体は、アッセイを実施するた
めの他の備品(ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ)と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しろる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。
めの他の備品(ボトル、試験管、綿棒、ビーカーまたは
カップ)と組み合わせて使用することができる。また、
好ましくは、支持体はアッセイを実施しそしてすべての
流体に適合しろる使い捨て試験装置中に固定された微孔
質膜を有する。
利用可能な試験装置の構成は、米国特許第3,825,
410号、同3,888,629号、同3,970,4
29号および同4.446,232号明細書を含む従来
技術で知られている。特に有用な装置は、特開昭63−
223563号公報(昭和63年9月19日公開)およ
び特願昭63−234692号明細書(昭和63年9月
18日出願)に記載されている。
410号、同3,888,629号、同3,970,4
29号および同4.446,232号明細書を含む従来
技術で知られている。特に有用な装置は、特開昭63−
223563号公報(昭和63年9月19日公開)およ
び特願昭63−234692号明細書(昭和63年9月
18日出願)に記載されている。
前記荷電支持体と抗原の接触によD、はとんど瞬間的に
抗原は支持体に結合される。場合によD、すべての未結
合抗原は、本発明の洗浄液で洗浄することよって支持体
から除去してもよい。
抗原は支持体に結合される。場合によD、すべての未結
合抗原は、本発明の洗浄液で洗浄することよって支持体
から除去してもよい。
前記接触の10分以内、好ましくは1〜5分以内に結合
抗原は、クラミジア抗体または淋菌抗体と接触されるこ
とにより支持体上で免疫複合体を形成する。流体と未結
合物質は、同時に素早く除去することができる。アッセ
イが使い捨て装置を使用して実施される場合、その支持
体は、被験体中の流体および複合体化していない物質を
通過させ、膜に抗原が結合するような微孔質膜であって
もよい。
抗原は、クラミジア抗体または淋菌抗体と接触されるこ
とにより支持体上で免疫複合体を形成する。流体と未結
合物質は、同時に素早く除去することができる。アッセ
イが使い捨て装置を使用して実施される場合、その支持
体は、被験体中の流体および複合体化していない物質を
通過させ、膜に抗原が結合するような微孔質膜であって
もよい。
このアッセイで使用されるクラミジア抗体または淋菌抗
体は、1種以上のクラミジア株または淋菌株(目的の生
菌体が何んであるかに応じて)と特異的免疫反応性を有
する。それは、ポリクロナルまたはモノクロナルである
ことができる。ポリクロナルの場合には、それは市販さ
れているか、または検出される生菌体株に共通ずる抗原
を使用する既知の方法で各種動物で産生される。単一抗
体またはその混合物も使用することができる。例えば、
タラミジアリポポリサッカイドまたは主要外層膜蛋白抗
原のいずれかに対する抗体、あるいは両抗原に対する抗
体をこのアッセイで使用することができる。好ましくは
、抗体は市販または標準的なハイブリドーマ法を使用し
て調製されるモノクロナルである。
体は、1種以上のクラミジア株または淋菌株(目的の生
菌体が何んであるかに応じて)と特異的免疫反応性を有
する。それは、ポリクロナルまたはモノクロナルである
ことができる。ポリクロナルの場合には、それは市販さ
れているか、または検出される生菌体株に共通ずる抗原
を使用する既知の方法で各種動物で産生される。単一抗
体またはその混合物も使用することができる。例えば、
タラミジアリポポリサッカイドまたは主要外層膜蛋白抗
原のいずれかに対する抗体、あるいは両抗原に対する抗
体をこのアッセイで使用することができる。好ましくは
、抗体は市販または標準的なハイブリドーマ法を使用し
て調製されるモノクロナルである。
−の態様では、抗原に対する抗体は検出のために標識さ
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であD、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するざらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ウ
レアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼなどである場合には、基質および色素生成試薬もま
た必要である。
れる。利用可能な標識は、当該技術分野で既知であD、
これらには適当な方法および装置を使用して直接検出で
きる化学的または生物学的化合物、ならびに検出可能な
種を提供するざらなる化学的または特異的なバインディ
ング反応を介して検出することができる化合物が含まれ
る。標識が酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、ウ
レアーゼ、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼなどである場合には、基質および色素生成試薬もま
た必要である。
特に好ましい態様では、標識がペルオキシダーゼであD
、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素生
成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例えば、
有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾールロ
イコ染料またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存
在下で反応して色素を提供する他の化合物(すなわち、
ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を提供
する化合物)のようなロイコ染料が含まれる。
、アッセイのある時点で過酸化水素および適当な色素生
成試薬を添加し、検出可能な色素を提供する。例えば、
有用な色素生成試薬には、トリアリールイミダゾールロ
イコ染料またはペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存
在下で反応して色素を提供する他の化合物(すなわち、
ペルオキシダーゼの触媒作用により反応して色素を提供
する化合物)のようなロイコ染料が含まれる。
好ましい態様では、クラミジア抗体または、淋菌抗体は
標識されておらず、そして形成され支持体に結合されて
いる抗体−抗原複合体の検出は、それぞれ前記未標識(
標識されていない)抗体に特異性を有し、かつ適当に標
識されている第二の抗体(以下に記載する)を使用して
行われる。
標識されておらず、そして形成され支持体に結合されて
いる抗体−抗原複合体の検出は、それぞれ前記未標識(
標識されていない)抗体に特異性を有し、かつ適当に標
識されている第二の抗体(以下に記載する)を使用して
行われる。
結合抗原が一度りラミシア抗体または淋菌抗体と接触し
てしまうと、支持体上で結合免疫複合体が形成される。
てしまうと、支持体上で結合免疫複合体が形成される。
この複合体の形成を促進するには、一般に、15〜30
°Cの温度で10分未満前記抗体と抗原がインキュベー
ションされる。好ましくは、インキュベーションは18
〜25°C(すなわち、室温)で1〜5分間行われる。
°Cの温度で10分未満前記抗体と抗原がインキュベー
ションされる。好ましくは、インキュベーションは18
〜25°C(すなわち、室温)で1〜5分間行われる。
この温和なインキュベーション条件は、米国特許筒4,
497,899号明細書で裸の支持体に対するクラミジ
ア抗原の吸着のための要件として記載される37°C3
0分と際立った対照を示す。
497,899号明細書で裸の支持体に対するクラミジ
ア抗原の吸着のための要件として記載される37°C3
0分と際立った対照を示す。
前記インキュベーション後であって抗体−抗原の接触1
0分以内に、結合複合体は、一般にpH7〜12、好ま
しくはpH9〜11を有するこの発明の洗浄液で1度以
上洗浄される。洗浄液のpHは、特定の塩基または緩衝
剤の緩衝能に応じて緩衝剤を使用して得ることができる
。すなわち、溶液のpnは塩基で高めそして緩衝剤で持
続するか、または特定の強緩衝剤を使用してpl+の上
昇と持続の両者を達成することができる。
0分以内に、結合複合体は、一般にpH7〜12、好ま
しくはpH9〜11を有するこの発明の洗浄液で1度以
上洗浄される。洗浄液のpHは、特定の塩基または緩衝
剤の緩衝能に応じて緩衝剤を使用して得ることができる
。すなわち、溶液のpnは塩基で高めそして緩衝剤で持
続するか、または特定の強緩衝剤を使用してpl+の上
昇と持続の両者を達成することができる。
洗浄液中に存在させうる緩衝剤は、当業者に自明なもの
である。例としては、水酸化アルカリ金属、アルカリ土
類金属およびアンモニうム(例えば、水酸化ナトリウム
、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウム)、リン酸
塩(例えば、リン酸三ナトリウムおよびリン酸三カリウ
ム)、ホウ酸塩、3−シクロへキシルアミノ−1−プロ
パンスルポン酸、3−(N−シクロへキシルアミノ)エ
タンスルホン酸、3−シクロへキシルアミノ−3ヒドロ
キシ−1−プロパンスルホン 該技術分野で既知の他のものが挙げられる。緩衝剤と塩
基の量は、適切なpl+および緩衝能を提供するように
選ばれる。場合により緩衝剤と塩基の混合物を使用して
もよい。
である。例としては、水酸化アルカリ金属、アルカリ土
類金属およびアンモニうム(例えば、水酸化ナトリウム
、水酸化カリウムおよび水酸化アンモニウム)、リン酸
塩(例えば、リン酸三ナトリウムおよびリン酸三カリウ
ム)、ホウ酸塩、3−シクロへキシルアミノ−1−プロ
パンスルポン酸、3−(N−シクロへキシルアミノ)エ
タンスルホン酸、3−シクロへキシルアミノ−3ヒドロ
キシ−1−プロパンスルホン 該技術分野で既知の他のものが挙げられる。緩衝剤と塩
基の量は、適切なpl+および緩衝能を提供するように
選ばれる。場合により緩衝剤と塩基の混合物を使用して
もよい。
洗浄液はまた、1種以上のカチオン界面活性剤を含む。
特に有用な界面活性剤は、第四級アンモニウム塩、第四
級ホスホニウム塩、第四級ピリジニウム塩および第四級
イミダゾリウム塩または分子中に他のカチオン基を有す
るカチオン界面活性剤である。一般に、支持体上の結合
抗原または免疫複合体に悪影響を及ぼさない限りすべて
のカチオン界面活性剤を本発明で使用することができる
。
級ホスホニウム塩、第四級ピリジニウム塩および第四級
イミダゾリウム塩または分子中に他のカチオン基を有す
るカチオン界面活性剤である。一般に、支持体上の結合
抗原または免疫複合体に悪影響を及ぼさない限りすべて
のカチオン界面活性剤を本発明で使用することができる
。
これらの要件に合致する多くのカチオン界面活性剤が当
該技術分野で知られている。McCutcheon s
Emulsifiers and Deter ent
s, 1986版(McCu tcheonDivis
ion,Publishing Co.、 Glen
Rock,N.J.1986)の標準的な供給源に相談
すると有用なカチオン界面活性剤のいくつかを見い出す
ことができる。
該技術分野で知られている。McCutcheon s
Emulsifiers and Deter ent
s, 1986版(McCu tcheonDivis
ion,Publishing Co.、 Glen
Rock,N.J.1986)の標準的な供給源に相談
すると有用なカチオン界面活性剤のいくつかを見い出す
ことができる。
代表的な界面活性剤としては、ポリプロポキシ第四級ア
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
(BmcolTMとして市販されている)、脂肪酸アミ
ノアルキルメチルアミン(Schercodines商
品名)、エトキシル化脂肪族アミン(Pegameen
s商品名)、長鎖アルキルジェタノールメチル第四級ア
ンモニウムクロライド(M−QuatTM) 、イミダ
シリンの脂肪酸誘導体(Monazolines+商品
名)、ポリオキシエチレン脂肪族アミン(Mazeen
” )ならびに長鎖アルキルヒドロキシエチルイミダプ
リン(A lkaz ines +商品名)が挙げられ
る。最も有用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−も−ア
ミンの第四級アンモニウム塩(例えばEmcol”CC
−9、CC−55およびCC−57)である。溶液中の
カチオン界面活性剤量は、一般に少なくとも0. 1重
量%である。好ましくは、0.5〜3重量%の量で存在
する。
ンモニウムクロライド、アセテートおよびホスフェート
(BmcolTMとして市販されている)、脂肪酸アミ
ノアルキルメチルアミン(Schercodines商
品名)、エトキシル化脂肪族アミン(Pegameen
s商品名)、長鎖アルキルジェタノールメチル第四級ア
ンモニウムクロライド(M−QuatTM) 、イミダ
シリンの脂肪酸誘導体(Monazolines+商品
名)、ポリオキシエチレン脂肪族アミン(Mazeen
” )ならびに長鎖アルキルヒドロキシエチルイミダプ
リン(A lkaz ines +商品名)が挙げられ
る。最も有用な界面活性剤は、ポリプロポキシ−も−ア
ミンの第四級アンモニウム塩(例えばEmcol”CC
−9、CC−55およびCC−57)である。溶液中の
カチオン界面活性剤量は、一般に少なくとも0. 1重
量%である。好ましくは、0.5〜3重量%の量で存在
する。
この量は、最高の結果を得るためにはそれぞれの界面活
性剤について調整することができる。特に有用な洗浄液
は、例との関連で後述する。
性剤について調整することができる。特に有用な洗浄液
は、例との関連で後述する。
前述の態様で、クラミジア抗体または淋菌抗体が標識さ
れている場合には、洗浄後のアッセイ手順は、直接的な
その標識の検出か、または適当な試薬添加後の間接的な
検出となる。検出は、結合複合体の洗浄後の、比較的速
やかに、すなわち、−船釣に10分以内、好ましくは1
〜5分以内に行われる。場合により標識の検出は、試薬
が許容するならばインキュベーションにより促進しても
よい。次に、標準的な装置および方法を使用して標識が
検出される。
れている場合には、洗浄後のアッセイ手順は、直接的な
その標識の検出か、または適当な試薬添加後の間接的な
検出となる。検出は、結合複合体の洗浄後の、比較的速
やかに、すなわち、−船釣に10分以内、好ましくは1
〜5分以内に行われる。場合により標識の検出は、試薬
が許容するならばインキュベーションにより促進しても
よい。次に、標準的な装置および方法を使用して標識が
検出される。
好ましい態様では、クラミジア抗体または淋菌抗体は標
識されておらず、そして結合複合体の洗浄後にそれが、
標識されていない抗体に向けられた抗体と接触される。
識されておらず、そして結合複合体の洗浄後にそれが、
標識されていない抗体に向けられた抗体と接触される。
この第二の抗体(すなわち、抗−抗体)は、前述した標
識のいずれかにより適当に標識される。この抗体は、市
販または既知の方法を使用して調製されるモノクロナル
またはポリクロナルであることができる。クラミジアの
アッセイでは、抗−抗体はりボボリザソカライド抗体ま
たは主要外層膜蛋白抗体のいずれかと反応性を有するポ
リクロナル抗体が好ましい。
識のいずれかにより適当に標識される。この抗体は、市
販または既知の方法を使用して調製されるモノクロナル
またはポリクロナルであることができる。クラミジアの
アッセイでは、抗−抗体はりボボリザソカライド抗体ま
たは主要外層膜蛋白抗体のいずれかと反応性を有するポ
リクロナル抗体が好ましい。
この接触後、支持体に結合されている得られた抗原−抗
体−抗体複合体は、15〜30°Cの温度で10分未満
、好ましくは18〜25°Cで1〜5分間インキユヘー
ションされる。
体−抗体複合体は、15〜30°Cの温度で10分未満
、好ましくは18〜25°Cで1〜5分間インキユヘー
ションされる。
次に、本発明の洗浄液またはいずれか他の適当な洗浄液
(例えば、水または緩衝液)を使用してさらに洗浄を行
って複合体化していない物質を除去し、次いで適当な酵
素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な種を
提供する。その後、この抗原−抗体−標識抗体複合体は
、標準的な放射線、比色、蛍光または他の検出法を使用
して支持体上で検出される。
(例えば、水または緩衝液)を使用してさらに洗浄を行
って複合体化していない物質を除去し、次いで適当な酵
素基質または他の必要な試薬を添加して検出可能な種を
提供する。その後、この抗原−抗体−標識抗体複合体は
、標準的な放射線、比色、蛍光または他の検出法を使用
して支持体上で検出される。
クラミジア生菌体または淋菌生菌体の測定に好ましい方
法は以下の工程を含んでなる:A.クラミジア生菌体ま
たは淋菌生菌体を含むことが予測される被験体から、そ
れぞれ抽出されたクラミジア抗原または淋菌抗原を、ポ
リマー固体支持体と接触させることによりその固体支持
体上に抗原を結合する工程、 B、前記接触の10分以内に、前記結合抗原を未標識ク
ラミジア抗体または淋菌抗体と接触させることにより支
持体上に結合した免疫複合体を形成する工程、 C3前記抗体−抗原の接触の10分以内に、この発明の
洗浄液で前記複合体を洗浄することによD、前記結合免
疫複合体から複合体化していない物質を分離する工程、 D、前記結合複合体を、その未標識抗体に対する標識抗
体と接触させることにより支持体上に標識抗体−抗体−
抗原複合体を形成する工程、E、工程りにおける接触の
10分以内に、この発明の洗浄液で前記標識複合体を洗
浄することによりその結合標識複合体から複合体化して
いない物質を分離する工程、および F、被験体中のクラミジア生菌体または淋菌生菌体の量
の測定として支持体」二の標識複合体の存在を測定する
工程。
法は以下の工程を含んでなる:A.クラミジア生菌体ま
たは淋菌生菌体を含むことが予測される被験体から、そ
れぞれ抽出されたクラミジア抗原または淋菌抗原を、ポ
リマー固体支持体と接触させることによりその固体支持
体上に抗原を結合する工程、 B、前記接触の10分以内に、前記結合抗原を未標識ク
ラミジア抗体または淋菌抗体と接触させることにより支
持体上に結合した免疫複合体を形成する工程、 C3前記抗体−抗原の接触の10分以内に、この発明の
洗浄液で前記複合体を洗浄することによD、前記結合免
疫複合体から複合体化していない物質を分離する工程、 D、前記結合複合体を、その未標識抗体に対する標識抗
体と接触させることにより支持体上に標識抗体−抗体−
抗原複合体を形成する工程、E、工程りにおける接触の
10分以内に、この発明の洗浄液で前記標識複合体を洗
浄することによりその結合標識複合体から複合体化して
いない物質を分離する工程、および F、被験体中のクラミジア生菌体または淋菌生菌体の量
の測定として支持体」二の標識複合体の存在を測定する
工程。
前記の好ましい方法では、必要によD、この発明の洗浄
液を使用して結合抗原から未結合抗原を分離することも
可能である。
液を使用して結合抗原から未結合抗原を分離することも
可能である。
以下の例で本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲
を限定するものでない。
を限定するものでない。
なお、本明細書でrTM、が付される名称は商品名また
は商標であることを意味する。
は商標であることを意味する。
クラミジアリポポリサッカライド抗原に対するマウスモ
ノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法およびマウ
ス細胞系を使用して調製し、アジド0.01重量%を含
有するリン酸緩衝溶液(PBS) (pH7,4)中に
貯蔵した。このアッセイで使用される抗体組成物は、カ
ゼイン(0,5重量%)およびLonzaine” C
両性界面活性剤(0,01重量%)含有PBSに前記抗
体溶液試料(19I11)を添加(1:800希釈)し
て調製し、次いで0.22μmのフィルターで濾過して
使用液を得た。
ノクロナル抗体は、標準的ハイブリドーマ法およびマウ
ス細胞系を使用して調製し、アジド0.01重量%を含
有するリン酸緩衝溶液(PBS) (pH7,4)中に
貯蔵した。このアッセイで使用される抗体組成物は、カ
ゼイン(0,5重量%)およびLonzaine” C
両性界面活性剤(0,01重量%)含有PBSに前記抗
体溶液試料(19I11)を添加(1:800希釈)し
て調製し、次いで0.22μmのフィルターで濾過して
使用液を得た。
使用される標識ポリクロナル抗体は、ワサビペルオキシ
ダーゼに接合させたヤギ抗マウスIgG抗体であった。
ダーゼに接合させたヤギ抗マウスIgG抗体であった。
この接合体を、カゼイン0.5重量%とLonzain
eTMCO,01重量%含有PBSで1 : 2000
まで希釈し、次いで0.22μmのフィルターで濾過し
て使用液を得た。
eTMCO,01重量%含有PBSで1 : 2000
まで希釈し、次いで0.22μmのフィルターで濾過し
て使用液を得た。
抗原抽出溶液は、次の成分から調製した:アジ化ナトリ
ウム(25戚中25mg) 、塩化ナトリウム(1,5
モル濃度溶液2.5 mp、を25Idに希釈した)、
ジチオスレイトール還元剤(25戚中29mg)、エタ
ノールアミン(10%溶液6.25雌を25m1に希釈
した)、エチレンジアミン四酢酸(25戚中0.23g
)および水酸化ナトリウム(0,1モル濃度、pHを1
2.5に調節)。この溶液15 mAに、メタノ−99
10重量%のEmcolTMCC−36力ヂオン界面活
性剤(ポリプロポキシ−し−アミンの塩化四級アンモニ
ウム塩)溶液375μlを添加した。
ウム(25戚中25mg) 、塩化ナトリウム(1,5
モル濃度溶液2.5 mp、を25Idに希釈した)、
ジチオスレイトール還元剤(25戚中29mg)、エタ
ノールアミン(10%溶液6.25雌を25m1に希釈
した)、エチレンジアミン四酢酸(25戚中0.23g
)および水酸化ナトリウム(0,1モル濃度、pHを1
2.5に調節)。この溶液15 mAに、メタノ−99
10重量%のEmcolTMCC−36力ヂオン界面活
性剤(ポリプロポキシ−し−アミンの塩化四級アンモニ
ウム塩)溶液375μlを添加した。
1:2 の を するクラミジア・トラフこの例は
、2種の抗体、一つはりボボリサソカライドC,)ラコ
マチス抗原に向けられたものであD、第二は標識され、
かつそのクラミジア抗体に向けられた抗体を使用する本
発明の実施例を示す。
、2種の抗体、一つはりボボリサソカライドC,)ラコ
マチス抗原に向けられたものであD、第二は標識され、
かつそのクラミジア抗体に向けられた抗体を使用する本
発明の実施例を示す。
アッセイは、使い捨て装置により行った。それは表面上
に四級アンモニウム基を有する微孔質膜(Pall B
iodyneTM−B膜として市販されている、Pa1
l Corp、製)を含めた。使用前にこの膜は、Zo
nylTMFSNで処理した。
に四級アンモニウム基を有する微孔質膜(Pall B
iodyneTM−B膜として市販されている、Pa1
l Corp、製)を含めた。使用前にこの膜は、Zo
nylTMFSNで処理した。
クラミジアリポポリサッカライド抗原は、前述の抽出組
成物を使用して約5分間約20°Cで基本小体(ele
mentary body)蛋白から抽出した。次に、
シトレート(0,7モル濃度溶液100μm)を添加し
て約p117〜8に低下させ、次いで市販のプロテアー
ゼ(例えば、Sigma Chemicalから入手し
たプロテアーゼPO652のPBS溶液2 mg /
mlの400μl)を添加した。約20°Cでさらに5
分間抽出を続けた後、過酸化水素と水酸化ナトリウム(
pH10以上)を加えて内因性カタラーゼ、ペルオキシ
ダーゼおよびミエロペルオキシダーゼを除去した。
成物を使用して約5分間約20°Cで基本小体(ele
mentary body)蛋白から抽出した。次に、
シトレート(0,7モル濃度溶液100μm)を添加し
て約p117〜8に低下させ、次いで市販のプロテアー
ゼ(例えば、Sigma Chemicalから入手し
たプロテアーゼPO652のPBS溶液2 mg /
mlの400μl)を添加した。約20°Cでさらに5
分間抽出を続けた後、過酸化水素と水酸化ナトリウム(
pH10以上)を加えて内因性カタラーゼ、ペルオキシ
ダーゼおよびミエロペルオキシダーゼを除去した。
次に、5μmのフィルターで処理被験体を濾過して不要
物を除去した。濾過した抽出物(120μI)を、使い
捨て試験装置の試験ウェルに添加した。被験体流体を膜
に接触させながら流出させた。2または3秒以内で膜を
通してすべての流体を排出し、前述のモノクロナル抗体
溶液を試験ウェルに添加し排液さセた。
物を除去した。濾過した抽出物(120μI)を、使い
捨て試験装置の試験ウェルに添加した。被験体流体を膜
に接触させながら流出させた。2または3秒以内で膜を
通してすべての流体を排出し、前述のモノクロナル抗体
溶液を試験ウェルに添加し排液さセた。
膜に結合した免疫複合体を、PBS(pH7,2)中E
mcolTMCC−9カチオン界面活性剤(0,75重
量%)を含有するこの発明の洗浄液で2度洗浄した。
mcolTMCC−9カチオン界面活性剤(0,75重
量%)を含有するこの発明の洗浄液で2度洗浄した。
2度目の洗浄直後に、前述のペルオキシダーゼ標識ポリ
クロナル抗体溶液(120μm)を試験ウェルに添加し
、次いで直ちに流体を排出した。約5分間約20’Cで
インキュベーションして、膜にイオン的に結合した抗原
−抗体−標識抗体複合体を形成させた。
クロナル抗体溶液(120μm)を試験ウェルに添加し
、次いで直ちに流体を排出した。約5分間約20’Cで
インキュベーションして、膜にイオン的に結合した抗原
−抗体−標識抗体複合体を形成させた。
前述の洗浄液(160μl)で2度洗浄した後、試験ウ
ェルに色素生成組成物(120μl)を添加した。この
組成物は、過酸化水素(10ミリモル濃度)、2(4−
ヒドロキシ−3−メトキシフェニル)4.5−ビス(4
−メトキシフェニル)イミダゾールロイコ染料(0,0
05重量%)、ポリ(ビニルピロリドン)(1重量%)
、4′−ヒドロ4;ジアセトアニリド(5ミリモル濃度
)およびジエチレントリアミン五酢酸(10ミリモル濃
度)を含む。
ェルに色素生成組成物(120μl)を添加した。この
組成物は、過酸化水素(10ミリモル濃度)、2(4−
ヒドロキシ−3−メトキシフェニル)4.5−ビス(4
−メトキシフェニル)イミダゾールロイコ染料(0,0
05重量%)、ポリ(ビニルピロリドン)(1重量%)
、4′−ヒドロ4;ジアセトアニリド(5ミリモル濃度
)およびジエチレントリアミン五酢酸(10ミリモル濃
度)を含む。
室温で約5分後に、試験ウェル中で被験体から得られた
クラミジア抗原の存在を示す赤色色素が観察された。抗
原抽出後の全アッセイは、30分未満で実施された。
クラミジア抗原の存在を示す赤色色素が観察された。抗
原抽出後の全アッセイは、30分未満で実施された。
この例は、アッセイにおいてただ1種の抗体を使用した
こと以外は例1と同様である。この抗体は、C,トラコ
マチスのりポポリザッカライド抗原に対するペルオキシ
ダーゼ標識マウスモノクロナル抗体であった。この標識
抗体は、標準的なハイブリドーマ法を使用して得た。
こと以外は例1と同様である。この抗体は、C,トラコ
マチスのりポポリザッカライド抗原に対するペルオキシ
ダーゼ標識マウスモノクロナル抗体であった。この標識
抗体は、標準的なハイブリドーマ法を使用して得た。
PBS中ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル(
0,05重量%、80Δ)、ZonylTMFSN(1
重量%、80μりおよびエチレンジアミン四酢酸(20
ミリモル濃度、80μりの混合物を使用して基本小体蛋
白質から抗原を抽出した。このPBS容量は、抗原57
50pg含有試料について緩衝化対照溶液(抗原を含ま
ない)560μm〜510μlに変化させた。抽出は4
5°Cで10分間行い、10秒間撹拌し次いで室温に放
冷した。
0,05重量%、80Δ)、ZonylTMFSN(1
重量%、80μりおよびエチレンジアミン四酢酸(20
ミリモル濃度、80μりの混合物を使用して基本小体蛋
白質から抗原を抽出した。このPBS容量は、抗原57
50pg含有試料について緩衝化対照溶液(抗原を含ま
ない)560μm〜510μlに変化させた。抽出は4
5°Cで10分間行い、10秒間撹拌し次いで室温に放
冷した。
使い捨て試験装置中のPos 1dyne”膜は、ポリ
オキシエチレン−9−ラウリルエーテル(0,005重
1%、100μf)、ZonylT″4FSN(0,1
重量%)およびエチレンジアミン四酢酸(2ミリモル濃
度)で予め湿潤させた後、37°Cで15分間乾燥させ
た。
オキシエチレン−9−ラウリルエーテル(0,005重
1%、100μf)、ZonylT″4FSN(0,1
重量%)およびエチレンジアミン四酢酸(2ミリモル濃
度)で予め湿潤させた後、37°Cで15分間乾燥させ
た。
いろいろな濃度の抗原(288,575,1150,2
875および5750pg)を有する抽出抗原溶液およ
び対照溶液を、別個に使い捨て装置に添加し、直後に流
体を排出させた。
875および5750pg)を有する抽出抗原溶液およ
び対照溶液を、別個に使い捨て装置に添加し、直後に流
体を排出させた。
0.05モル濃度のPBS(pH’7.2 )中の市販
の脱脂粉乳(1重量%)、ウシ給仕血清(1重量%)で
1:450に希釈したペルオキシダーゼ標識抗体接合体
の溶液(200μm)を加え、次いで負圧で膜の上面に
流体を維持しながら室温で5分間試験装置内で反応混合
物をインキュベーションした。その後、膜を通して流体
を排出させた。
の脱脂粉乳(1重量%)、ウシ給仕血清(1重量%)で
1:450に希釈したペルオキシダーゼ標識抗体接合体
の溶液(200μm)を加え、次いで負圧で膜の上面に
流体を維持しながら室温で5分間試験装置内で反応混合
物をインキュベーションした。その後、膜を通して流体
を排出させた。
PBS中Emcal”CG−9力チオン界面活性剤(0
,75重量%)含有のこの発明の洗浄液(500μl)
を、試験装置に加え、次いで排液した。
,75重量%)含有のこの発明の洗浄液(500μl)
を、試験装置に加え、次いで排液した。
負圧で膜の上面に流体を維持しながら前述のロイコ染料
溶液(504)を試験装置に加えた。2もしくは3秒後
、流体を排出し次いで色素を生成させた。
溶液(504)を試験装置に加えた。2もしくは3秒後
、流体を排出し次いで色素を生成させた。
色素濃度を視覚的に読みとった後段階付けしたところ、
試験された抗原量の増加につれて着色段階の上昇がみら
れた。対照ウェルでは全く色素が観察されなかった。
試験された抗原量の増加につれて着色段階の上昇がみら
れた。対照ウェルでは全く色素が観察されなかった。
炎立求丈で華に上玉貫=
この例は、本発明に従う洗浄組成物と従来技術の洗浄組
成物とを比較する。
成物とを比較する。
羽二」斗
本発明の洗浄組成物は、以下の材料から調製した:3−
(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロ
パンスルホン酸(1,186g)を蒸留水(100m1
)に溶解し、次いで0.05N水酸化ナトリウムを添加
してplllo、0に高めた。[!mcol”CG−9
力チオン界面活性剤(0,75g)をこの溶液に加えた
。
(シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシ−1−プロ
パンスルホン酸(1,186g)を蒸留水(100m1
)に溶解し、次いで0.05N水酸化ナトリウムを添加
してplllo、0に高めた。[!mcol”CG−9
力チオン界面活性剤(0,75g)をこの溶液に加えた
。
試験試料は、PBS(0,1mg/ml)中ウシ血清ア
ルブミン(0,1mg/ ml )とクラミジア基本小
体(前述のようにして得た)を含有する溶液を使用した
。
ルブミン(0,1mg/ ml )とクラミジア基本小
体(前述のようにして得た)を含有する溶液を使用した
。
最終の基本小体濃度は約11000pであった。
対照試料は、PBS中にウシ血清アルブミン(0,1m
g / ml )を含ませた。すなわち、クラミジア抗
原は全く存在しない。
g / ml )を含ませた。すなわち、クラミジア抗
原は全く存在しない。
米国特許第4,746,614号明細書(前記)に記載
されるような抽出装置を、トリス(ヒドロキシメチル)
アミノエクン緩衝剤(1,65モル濃度溶液20μi、
pnll、1)とチメロサール防腐剤(0,01重量
%)の乾燥塗布物を含ませて作製した。
されるような抽出装置を、トリス(ヒドロキシメチル)
アミノエクン緩衝剤(1,65モル濃度溶液20μi、
pnll、1)とチメロサール防腐剤(0,01重量
%)の乾燥塗布物を含ませて作製した。
塩化ナトリウム(50ミリモル濃度)、塩化カルシウム
(5ミリモル濃度LL、2−プロパンジオール(10%
w/v)および防腐剤(0,01重量%)を含有する2
−(N−モルホリノ)エクンスルホン酸緩衝液(10ミ
リモル濃度、pH6,0)にAm1deck”プロテア
ーゼ(Eastman Kodak Cog BioP
roductDivision) (4mg/ ml、
170単位/■)を溶解させた。
(5ミリモル濃度LL、2−プロパンジオール(10%
w/v)および防腐剤(0,01重量%)を含有する2
−(N−モルホリノ)エクンスルホン酸緩衝液(10ミ
リモル濃度、pH6,0)にAm1deck”プロテア
ーゼ(Eastman Kodak Cog BioP
roductDivision) (4mg/ ml、
170単位/■)を溶解させた。
抽出組成物は、以下の成分を含む:塩酸エタノルアミン
(0,47モル濃度)、塩化ナトリウム(0,27モル
濃度)、防腐剤(30ミリモル濃度)、エチレンジアミ
ン四酢酸(50ミリモル濃度)、E+ncolTMCC
−36力チオン界面活性剤(0,45容量%)および水
酸化ナトリウム(0,66N)(p++13.4に調節
)過酸化水素洗浄液は、過酸化水素(12容量%)、ジ
エチレントリアミン五酢酸(10マイクロモル濃度)お
よび防腐剤(0,01重量%)を含ませた。
(0,47モル濃度)、塩化ナトリウム(0,27モル
濃度)、防腐剤(30ミリモル濃度)、エチレンジアミ
ン四酢酸(50ミリモル濃度)、E+ncolTMCC
−36力チオン界面活性剤(0,45容量%)および水
酸化ナトリウム(0,66N)(p++13.4に調節
)過酸化水素洗浄液は、過酸化水素(12容量%)、ジ
エチレントリアミン五酢酸(10マイクロモル濃度)お
よび防腐剤(0,01重量%)を含ませた。
アッセイで使用した洗浄組成物は以下のとおりである。
ILA: 3−シクロヘキシルアミノ−2−ヒドロキシ
−1−プロパンスルホン酸緩衝液(0,05モル濃度、
plllo、0)、 ][B : IJ :、[緩衝?8?&(PBS) (
pH7,2)、劃」[しPBSおよびTween 20
非イオン界面活性剤(Tweenは商品名、0.75重
量%)、l : PBSおよびEmcolTMCC−9
力チオン界面活性剤(0,75重量%)、ならびに JLL: 2−シクロへキシルアミノ−2−ヒドロキシ
−1−プロパンスルホン酸緩衝液(0,05モル濃度、
plllo、0)およびEmcol”CC−9力チオン
界面活性剤(0,75重量%)。
−1−プロパンスルホン酸緩衝液(0,05モル濃度、
plllo、0)、 ][B : IJ :、[緩衝?8?&(PBS) (
pH7,2)、劃」[しPBSおよびTween 20
非イオン界面活性剤(Tweenは商品名、0.75重
量%)、l : PBSおよびEmcolTMCC−9
力チオン界面活性剤(0,75重量%)、ならびに JLL: 2−シクロへキシルアミノ−2−ヒドロキシ
−1−プロパンスルホン酸緩衝液(0,05モル濃度、
plllo、0)およびEmcol”CC−9力チオン
界面活性剤(0,75重量%)。
対照試薬組成物は、PBS (pH7,2)中クレアチ
ンキナーゼ間に対する抗体(5μg/ml>、カゼイン
(0,5重量%) 、Lonzaine7MC両性界面
活性剤(0,01重量%)および防腐剤(0,01重量
%)を含めた。
ンキナーゼ間に対する抗体(5μg/ml>、カゼイン
(0,5重量%) 、Lonzaine7MC両性界面
活性剤(0,01重量%)および防腐剤(0,01重量
%)を含めた。
タラミジアリボボリサソカライド抗原に対するモノクロ
ナル抗体(4μg / ml )は、前記対照組成物に
ついて記載したカゼイン、両性界面活性剤および防腐剤
と一緒に供給した。
ナル抗体(4μg / ml )は、前記対照組成物に
ついて記載したカゼイン、両性界面活性剤および防腐剤
と一緒に供給した。
ワサビペルオキシダーゼに接合したヤギポリクロナル抗
マウスIgG抗体は、pH5(pH7,2)中力ゼイン
(0,5重量%) 、LonzaineTMC両性界面
活性剤(0,1重量%)、4′−ヒドロキシアセトアニ
リド(10ミリモル濃度)および防腐剤(0,01重量
%)組成物中に供給した(1ニア00希釈)。
マウスIgG抗体は、pH5(pH7,2)中力ゼイン
(0,5重量%) 、LonzaineTMC両性界面
活性剤(0,1重量%)、4′−ヒドロキシアセトアニ
リド(10ミリモル濃度)および防腐剤(0,01重量
%)組成物中に供給した(1ニア00希釈)。
ロイコ染料組成物は、2−(4−ヒドロキシ3−メトキ
シフェニル) −4、5−ヒス(4−メトキシフェニ
ル)イミダゾールロイコ染料(0,008重量%)、リ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH6,8,10ミリモル濃度
)、ジエチレントリアミン五酢酸(10マイクロモル濃
度)、4′−ヒドロキシアセトアニリド(2ミリモル濃
度)および過酸化水素(10ミリモル濃度)を含む。
シフェニル) −4、5−ヒス(4−メトキシフェニ
ル)イミダゾールロイコ染料(0,008重量%)、リ
ン酸ナトリウム緩衝液(pH6,8,10ミリモル濃度
)、ジエチレントリアミン五酢酸(10マイクロモル濃
度)、4′−ヒドロキシアセトアニリド(2ミリモル濃
度)および過酸化水素(10ミリモル濃度)を含む。
アッセイ
抽出装置にプロテアーゼ溶液(280μp)を加え、次
いでジチオスレイトール(0,18888モル濃とポリ
(アクリルアミド)(6,35重重量)含有溶液(50
μl)、さらに試験試料(12,5μりを加えた。別個
の抽出および試験装置を使用して対照試料(12,5μ
I)との並列比較を行った。抽出装置中で得られた溶液
を混合してそして3分間室温でインキュベーションした
。
いでジチオスレイトール(0,18888モル濃とポリ
(アクリルアミド)(6,35重重量)含有溶液(50
μl)、さらに試験試料(12,5μりを加えた。別個
の抽出および試験装置を使用して対照試料(12,5μ
I)との並列比較を行った。抽出装置中で得られた溶液
を混合してそして3分間室温でインキュベーションした
。
次に、前述の抽出溶液(280pz)を抽出装置に加え
、混合そして3分間室温でインキュベーションした。次
に、過酸化水素溶液(280μi)を加え、さらに3分
間室温でインキュベーションした。
、混合そして3分間室温でインキュベーションした。次
に、過酸化水素溶液(280μi)を加え、さらに3分
間室温でインキュベーションした。
この抽出装置中の溶液の一部(160μI)を、本明細
書に記載するような使い捨て試験装置の3個のウェルに
それぞれ加えた。第1のウェルは対照ウェルとし、残り
の2つのウェルは試験ウェルとした。
書に記載するような使い捨て試験装置の3個のウェルに
それぞれ加えた。第1のウェルは対照ウェルとし、残り
の2つのウェルは試験ウェルとした。
各ウェル中の膜を通して流体を排出し、次いで各ウェル
を前記洗浄組成物で各2度ずつ洗浄し、流体は排出させ
た。
を前記洗浄組成物で各2度ずつ洗浄し、流体は排出させ
た。
排液することなく、前記対照試薬組成物(80μりを、
各対照ウェルに加え、クラミジア抗原組成物(80μり
を各試験ウェルに加えた。室温でのインキュベーション
を2分間行った。
各対照ウェルに加え、クラミジア抗原組成物(80μり
を各試験ウェルに加えた。室温でのインキュベーション
を2分間行った。
流体を排出させ、各ウェルを再び2度洗浄した。
次に、抗−抗体組成物(80μりを各ウェルに添加し、
引き続き5分間室温で・インキュベーションした。
引き続き5分間室温で・インキュベーションした。
さらなる洗浄工程の後、Iコイコ染料組成物(80μm
)を各ウェルに添加した。室温でのインキュベーション
を5分間行い、次いでアジ化ナトリウム溶液(0,01
重量%、120μl)を添加することにより反応を停止
させた。膜上の色素濃度を測定し、透過濃度(DT )
に換算した。結果を以下の表に示す。それらから、本発
明の洗浄組成物は、好ましい低いバンクグランドと改良
された感度を与えることがわかる。例4は、より高いp
Hの洗浄組成物が使用されているので、最も低いへツク
グランドと最も高い感度を提供する。
)を各ウェルに添加した。室温でのインキュベーション
を5分間行い、次いでアジ化ナトリウム溶液(0,01
重量%、120μl)を添加することにより反応を停止
させた。膜上の色素濃度を測定し、透過濃度(DT )
に換算した。結果を以下の表に示す。それらから、本発
明の洗浄組成物は、好ましい低いバンクグランドと改良
された感度を与えることがわかる。例4は、より高いp
Hの洗浄組成物が使用されているので、最も低いへツク
グランドと最も高い感度を提供する。
アッセイは高感度であD、低いハックグラン)Zを示し
、そして阻害する可能性のある負荷電物質の影響は少な
い。さらに、アッセイにおける固体支持体への抗体の好
ましくない結合は、極小化される。これらの利点は、カ
チオン界面活性剤を含む洗浄液を使用する本発明によっ
て達成される。
、そして阻害する可能性のある負荷電物質の影響は少な
い。さらに、アッセイにおける固体支持体への抗体の好
ましくない結合は、極小化される。これらの利点は、カ
チオン界面活性剤を含む洗浄液を使用する本発明によっ
て達成される。
この洗浄液は、アッセイにおいて少なくとも1度は使用
され、すなわち、通常は、支持体に結合する抗体−抗原
免疫複合体の形成後に使用される。
され、すなわち、通常は、支持体に結合する抗体−抗原
免疫複合体の形成後に使用される。
[発明の効果]
この発明のアッセイは、使用に関して迅速であD、信頼
性を有しかつ簡便である。例えば、アッセイは室温で3
0分未満で行うことができる。抽出クラミジア抗原(例
えば、0.トラコマチス)、特にそのリポポリサッカラ
イド抗原の測定について高い信頼性を有する。このアッ
セイを使用して、また、淋菌抗原(例えば、N、ゴノロ
エエ)を迅速かつ高感度で検出することができる。
性を有しかつ簡便である。例えば、アッセイは室温で3
0分未満で行うことができる。抽出クラミジア抗原(例
えば、0.トラコマチス)、特にそのリポポリサッカラ
イド抗原の測定について高い信頼性を有する。このアッ
セイを使用して、また、淋菌抗原(例えば、N、ゴノロ
エエ)を迅速かつ高感度で検出することができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1重
量%を含んでなる洗浄液。 2、A、クラミジア生菌体または淋菌生菌体を含むこと
が予測される被験体からそれぞれ抽出されたクラミジア
抗原または淋菌抗原を、その抗原に対する抗体と接触さ
せることにより抗原と抗体の免疫複合体を形成する工程
、 B、複合体形成と同時または前後に、抗原もしくは抗体
のいずれかかまたは両者を固体支持体上で不溶化するこ
とにより結合した免疫複合体を形成する工程、 C、1種以上のカチオン界面活性剤少なくとも0.1重
量%を含んでなる洗浄液で前記複合体を洗浄することに
より結合した免疫複合体から複合体化していない物質を
分離する工程、ならびにD、被験体中のクラミジア生菌
体または淋菌生菌体の量を示すものとして前記結合した
複合体の存在を測定する工程、を含んでなるクラミジア
生菌体または淋菌生菌体の測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US255924 | 1988-10-07 | ||
US07/255,924 US5047325A (en) | 1988-10-07 | 1988-10-07 | Wash solution containing a cationic surfactant and its use in chlamydial and gonococcal determinations |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02257064A true JPH02257064A (ja) | 1990-10-17 |
JPH07109421B2 JPH07109421B2 (ja) | 1995-11-22 |
Family
ID=22970412
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1260371A Expired - Lifetime JPH07109421B2 (ja) | 1988-10-07 | 1989-10-06 | カチオン界面活性剤含有洗浄液ならびにクラミジアおよび淋菌の測定におけるその使用 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5047325A (ja) |
EP (1) | EP0363108B1 (ja) |
JP (1) | JPH07109421B2 (ja) |
DE (1) | DE68916735T2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009536958A (ja) * | 2006-05-11 | 2009-10-22 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 細胞からのタンパク質抽出方法 |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5482830A (en) * | 1986-02-25 | 1996-01-09 | Biostar, Inc. | Devices and methods for detection of an analyte based upon light interference |
US5639671A (en) * | 1989-09-18 | 1997-06-17 | Biostar, Inc. | Methods for optimizing of an optical assay device |
US5541057A (en) * | 1989-09-18 | 1996-07-30 | Biostar, Inc. | Methods for detection of an analyte |
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