JPH0698749A - Production of beer having high fermentation degree - Google Patents
Production of beer having high fermentation degreeInfo
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- JPH0698749A JPH0698749A JP4274828A JP27482892A JPH0698749A JP H0698749 A JPH0698749 A JP H0698749A JP 4274828 A JP4274828 A JP 4274828A JP 27482892 A JP27482892 A JP 27482892A JP H0698749 A JPH0698749 A JP H0698749A
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- Distillation Of Fermentation Liquor, Processing Of Alcohols, Vinegar And Beer (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、糖質分解酵素を用いて
高発酵度ビールを製造する方法に関し、詳しくは酵素の
漏洩の非常に少なく、しかも安価な固定化糖質分解酵素
を用いて効率よく高発酵度ビールを製造する方法に関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing beer having a high fermentation rate by using a glycolytic enzyme, and more specifically, it uses an inexpensive immobilized glycolytic enzyme with very little leakage of the enzyme. The present invention relates to a method for efficiently producing high-fermentation beer.
【０００２】[0002]
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】低カロ
リービールやダイエットビールなどのビールは、通常の
ビールよりも残存するエキス（主に未分解のデキストリ
ン）の少ない高発酵度ビールである。このエキスは、ビ
ールのもとになる麦汁を麦芽から製造する段階で、麦芽
の持つ澱粉分解酵素により分解されずに残ったものであ
る。従って、高発酵度ビールを製造するには、この残存
エキスを何らかの方法で分解する必要がある。このよう
な方法の一つとして、麦汁を製造する仕込の工程中に、
糖質分解酵素を添加する方法がある。例えば、仕込段階
でプルラナーゼを添加する方法（ＧＢＡ２０６９５２
７）や煮沸前の麦汁へグルコアミラーゼを添加する方法
（ＤＤ８７２８８）である。しかしながら、この方法で
は、発酵度の向上に一定の限界がある。その理由として
は、仕込の糖化工程が一般に３時間程度の短時間で行な
われることや、酵素の分解生成物である低分子糖が蓄積
し、酵素の反応効率が低下するなどといったことが考え
られる。また、充分なエキスの分解を行なうためには、
大量の酵素が必要となる。2. Description of the Related Art Beer such as low-calorie beer and diet beer is a high-fermentation beer with less residual extract (mainly undegraded dextrin) than ordinary beer. This extract remains without being decomposed by the starch-degrading enzyme of malt at the stage of producing wort, which is the source of beer, from malt. Therefore, in order to produce high-fermentation beer, it is necessary to decompose this residual extract by some method. As one of such methods, during the step of preparing wort,
There is a method of adding a glycolytic enzyme. For example, a method of adding pullulanase in the preparation stage (GBA206952
7) or a method of adding glucoamylase to wort before boiling (DD87288). However, with this method, there is a certain limit to the improvement of the degree of fermentation. The reason may be that the saccharification step of charging is generally performed in a short time of about 3 hours, and that low-molecular-weight sugar, which is a decomposition product of the enzyme, accumulates and the reaction efficiency of the enzyme decreases. . In addition, in order to sufficiently decompose the extract,
Large amounts of enzymes are needed.
【０００３】もう一つの方法としては、発酵の段階に酵
素を添加する方法がある。例えば、プルラナーゼ、アミ
ラーゼを発酵段階で添加する方法（ＵＳＰ ４３５５０
４７）などである。この方法では、酵素により分解され
た低分子糖が発酵中の酵母により次々と消費されるた
め、発酵度をほぼ限界まで向上させることが可能であ
り、また、発酵の期間が長いため、添加する酵素の量も
少なくて済むという利点がある。しかしながら、この方
法では、製品ビール中に残存する酵素活性により、消費
されるまでの間に微量残存しているエキスがさらに分解
され、甘味を生じることがあるといった問題がある。Another method is to add an enzyme to the fermentation stage. For example, a method of adding pullulanase or amylase at the fermentation stage (USP 43550).
47) etc. In this method, the low molecular sugars decomposed by the enzyme are consumed one after another by the yeast during fermentation, so that it is possible to improve the fermentation degree to the limit, and since the fermentation period is long, it is added. There is an advantage that the amount of enzyme can be small. However, this method has a problem in that the enzyme activity remaining in the product beer may further decompose the extract that remains in a trace amount before it is consumed, and may cause sweetness.
【０００４】そこで、これら従来の欠点を解決する手段
として、固定化酵素の使用が考えられる。発酵中に固定
化グルコアミラーゼを作用させ、高発酵度ビールを製造
する方法がいくつか提案されており、例えば、ＵＳＰ
４４３０３４８には高発酵度ビール製造のための固定化
グルコアミラーゼリアクターが開示されている。しかし
ながら、この方法でも、固定化酵素から酵素が漏洩すれ
ば、同じ問題が生じる。また、一般に固定化酵素用の担
体は、特殊な方法で多孔質の形状に成形したものや、特
殊な官能基を結合させたものなどが多く、担体の製造コ
ストが高価であるばかりか、酵素の漏洩を完全に防止す
ることはできなかった。Therefore, the use of an immobilized enzyme is considered as a means for solving these conventional drawbacks. Several methods for producing high-fermentation beer by allowing immobilized glucoamylase to act during fermentation have been proposed. For example, USP
4430348 discloses an immobilized glucoamylase reactor for the production of high fermentation beer. However, even in this method, if the enzyme leaks from the immobilized enzyme, the same problem occurs. Further, generally, the carrier for the immobilized enzyme is often formed into a porous shape by a special method, or has a special functional group bonded thereto, so that not only the cost of producing the carrier is high, but also the enzyme is expensive. Could not be completely prevented.
【０００５】すなわち、酵素を担体に固定化する手段と
して最も一般的に行なわれているのは、多孔質の形状を
有する担体に酵素を物理的に吸着させ、さらに架橋剤な
どを用いて固定化を強化するという方法である。また、
多孔質による物理的吸着によらず、イオン結合や疎水結
合で酵素を担体に吸着させる方法もある。しかしなが
ら、これらの方法では、担体内部まで入り込んで吸着さ
れている酵素分子全てを架橋により安定化させることは
不可能である。そのため、架橋剤と反応しなかった酵素
は拡散によって徐々に担体の外部へ漏洩してくる。この
ように担体に大量の酵素を吸着させる方法では、酵素の
漏洩を完全に防ぐことはできない。また、固定化酵素の
発現活性は、主に反応液と接触する担体の表面積に依存
しており、一定以上の酵素を吸着させても実際の反応に
は寄与していない場合もある。That is, the most commonly used means for immobilizing an enzyme on a carrier is to physically adsorb the enzyme on a carrier having a porous shape and then immobilize the enzyme using a crosslinking agent or the like. Is a method of strengthening. Also,
There is also a method of adsorbing the enzyme to the carrier by an ionic bond or a hydrophobic bond, instead of physical adsorption by the porous material. However, with these methods, it is impossible to stabilize all the enzyme molecules that have penetrated into the inside of the carrier and are adsorbed by crosslinking. Therefore, the enzyme that has not reacted with the crosslinking agent gradually leaks to the outside of the carrier due to diffusion. Thus, the method of adsorbing a large amount of enzyme on the carrier cannot completely prevent the leakage of the enzyme. Further, the expression activity of the immobilized enzyme depends mainly on the surface area of the carrier that comes into contact with the reaction solution, and even if a certain amount or more of the enzyme is adsorbed, it may not contribute to the actual reaction.
【０００６】本発明者らは、糖質分解酵素を用いて高発
酵度ビールを製造するに際し、製造コストが安価であ
り、しかも酵素の漏洩のない固定化糖質分解酵素を得る
べく鋭意研究を重ねた。その研究過程において、酵素を
従来のように担体内部ではなく、担体の表面（表層部
分）のみに固定化できないかと考え、幾多の試行錯誤の
結果、担体として用いるセルロース系の素材を過ヨウ素
酸酸化処理することを思いついた。すなわち、過ヨウ素
酸酸化は、隣接する二個の水酸基に作用してこれを解裂
させ、二個のアルデヒド基を生成させ、さらにアルデヒ
ド基は、アミノ基と反応してシッフ塩基を形成、結合す
る性質があるが、固定化酵素の担体として用いるセルロ
ースは分子内に二個の水酸基が隣接する構造を有してい
るので、過ヨウ素酸酸化処理によって、セルロース表層
にアルデヒド基を生成させれば、酵素分子のアミノ基と
の反応により、酵素を直接セルロース表層に共有結合さ
せることができると考えた。本発明はかかる知見に基づ
いてなされたものであり、製造コストが安価であり、し
かも酵素の漏洩のない固定化糖質分解酵素を用いること
により、効率よく高発酵度ビールを製造する方法を提供
することを目的とするものである。The present inventors have conducted diligent research in order to obtain an immobilized glycolytic enzyme which is inexpensive in production and has no leakage of the enzyme when producing high-fermenting beer using the glycolytic enzyme. Overlaid. In the process of research, we wondered if the enzyme could be immobilized only on the surface (surface layer) of the carrier, not inside the carrier as in the past, and as a result of many trials and errors, the cellulosic material used as the carrier was oxidized with periodate. I came up with something to process. That is, periodate oxidation acts on two adjacent hydroxyl groups and cleaves them to form two aldehyde groups, and the aldehyde groups react with amino groups to form Schiff bases and bond. However, since cellulose used as a carrier for immobilized enzymes has a structure in which two hydroxyl groups are adjacent to each other in the molecule, it is possible to generate an aldehyde group on the cellulose surface layer by periodate oxidation treatment. It was thought that the enzyme could be directly covalently bound to the cellulose surface layer by the reaction with the amino group of the enzyme molecule. The present invention has been made on the basis of such findings, the production cost is low, and by using an immobilized glycolytic enzyme that does not leak the enzyme, a method for efficiently producing high-fermentation beer is provided. The purpose is to do.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、過ヨ
ウ素酸酸化処理したセルロース系素材に糖質分解酵素を
反応させ、共有結合させてなる固定化酵素を、麦汁発酵
液に接触させることを特徴とする高発酵度ビールの製造
方法を提供するものである。[Means for Solving the Problems] That is, the present invention comprises contacting an immobilized enzyme obtained by reacting a cellulosic material subjected to periodate oxidation treatment with a glycolytic enzyme and covalently binding it to a wort fermentation liquid. The present invention provides a method for producing high-fermentation beer characterized by:
【０００８】本発明において用いるセルロース系素材と
しては、種々の形態のものが挙げられる。例えば、粒子
状や繊維状のものなどを使用することができ、さらに各
種成形手段により、各種形状に成形されたものを用いる
ことができる。具体的には、木綿繊維を原料として作ら
れる脱脂綿、織布（ガーゼを含む）、不織布、紡糸な
ど、パルプを原料として作られるろ紙、セルロースパウ
ダーなど、また、セルロースエステルのようなセルロー
ス誘導体（セルロースアセテート、セルロースニトレー
トなど）を成形して作られるフィルム、メンブランフィ
ルターなど、セルロース分子の構造を含んでいる素材全
般を用いることができる。The cellulosic material used in the present invention may be in various forms. For example, particles or fibrous materials can be used, and materials molded into various shapes by various molding means can be used. Specifically, absorbent cotton made from cotton fiber, woven fabric (including gauze), non-woven fabric, spinning paper, filter paper made from pulp, cellulose powder, and cellulose derivatives such as cellulose ester (cellulose). It is possible to use all materials including the structure of the cellulose molecule, such as a film formed by molding (acetate, cellulose nitrate, etc.) and a membrane filter.
【０００９】本発明においては、まず上記セルロース系
素材を過ヨウ素酸酸化処理する。ここで過ヨウ素酸酸化
（マラプラード反応）は、過ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩
による有機化合物の選択的酸化反応であり、前記した如
く、隣接する二個の水酸基に作用してこれを解裂させ、
二個のアルデヒド基を生成させる。ここで用いられる過
ヨウ素酸又は過ヨウ素酸塩としては、市販されており、
かつ、食品に使用できるものであれば種々のものを用い
ることができる。過ヨウ素酸としては、例えばメタ過ヨ
ウ素酸（ＨＩＯ4 ），オルト過ヨウ素酸（Ｈ5 ＩＯ6 ）
などが挙げられる。また、過ヨウ素酸塩としては、例え
ばメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4），メタ過ヨ
ウ素酸カリウム（ＫＩＯ4 ），パラ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（Ｎａ3Ｈ2 ＩＯ6 ），メタ過ヨウ素酸アンモニウム
（ＮＨ4 ＩＯ4 ）などが挙げられる。但し、メタ過ヨウ
素酸カリウムは溶解度が低いので、メタ過ヨウ素酸ナト
リウムの方が望ましい。通常は、これら過ヨウ素酸又は
過ヨウ素酸塩を、１〜５％（Ｗ／Ｗ）の濃度の水溶液と
して用いればよい。過ヨウ素酸酸化処理の条件として
は、特に制限はないが、例えばセルロース系素材を過ヨ
ウ素酸又は過ヨウ素酸塩の水溶液に懸濁し、これを遮光
下に４℃程度の低温下において、一晩〜二晩程度攪拌
し、反応させればよい。In the present invention, the above-mentioned cellulosic material is first subjected to a periodate oxidation treatment. Here, periodate oxidation (malaplad reaction) is a selective oxidation reaction of an organic compound by periodate or periodate, and as described above, it acts on two adjacent hydroxyl groups to cleave them. ,
Two aldehyde groups are formed. The periodate or periodate used here is commercially available,
In addition, various materials can be used as long as they can be used for foods. Examples of periodic acid include metaperiodic acid (HIO 4 ), orthoperiodic acid (H 5 IO 6 ).
And so on. Examples of the periodate include sodium metaperiodate (NaIO 4 ), potassium metaperiodate (KIO 4 ), sodium paraperiodate (Na 3 H 2 IO 6 ), and ammonium metaperiodate ( NH 4 IO 4 ) and the like. However, since sodium metaperiodate has a low solubility, sodium metaperiodate is preferable. Usually, these periodate or periodate may be used as an aqueous solution having a concentration of 1 to 5% (W / W). The conditions for the periodate oxidation treatment are not particularly limited, but for example, a cellulosic material is suspended in an aqueous solution of periodate or periodate, and the suspension is kept in the dark at a low temperature of about 4 ° C. overnight. It may be allowed to react by stirring for about two nights.
【００１０】このようにしてセルロース系素材を過ヨウ
素酸酸化処理し、分子内にジアルデヒドの構造を持つセ
ルロース（セルロース系素材）を調製する。次いで、こ
れに糖質分解酵素を反応させ、共有結合させる。すなわ
ち、上記の如くして得られた分子内にジアルデヒドの構
造を持つセルロース（セルロース系素材）に、糖質分解
酵素を反応させる。本発明において用いる糖質分解酵素
としては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコア
ミラーゼ及びプルラナーゼよりなる群から選ばれた１種
以上のものであり、特にプルラナーゼを使用する場合に
は、これ単独ではなく、グルコアミラーゼ，β−アミラ
ーゼ等を併用することが好ましい。このように糖質分解
酵素と反応させることにより、セルロース分子内のアル
デヒド基と、酵素タンパク質分子のアミノ基が反応し
て、シッフ塩基を形成する。このようにして、酵素タン
パク質分子のアミノ基との反応により、酵素を直接セル
ロース表層に共有結合させることができる。糖質分解酵
素との反応は、例えば上記の如くして得られた分子内に
ジアルデヒドの構造を持つセルロース（セルロース系素
材）を、１００〜５００Ｕ／ｍｌ程度の濃度の糖質分解
酵素溶液に浸漬し、反応させればよい。In this way, the cellulosic material is subjected to periodate oxidation treatment to prepare cellulose having a dialdehyde structure in the molecule (cellulosic material). Then, this is reacted with a glycolytic enzyme to covalently bond it. That is, the saccharide-degrading enzyme is reacted with the cellulose (cellulosic material) having a dialdehyde structure in the molecule obtained as described above. The carbohydrate-degrading enzyme used in the present invention is one or more selected from the group consisting of α-amylase, β-amylase, glucoamylase and pullulanase, and when pullulanase is used, it may be used alone. However, it is preferable to use glucoamylase, β-amylase and the like together. By reacting with the saccharide-degrading enzyme in this way, the aldehyde group in the cellulose molecule reacts with the amino group of the enzyme protein molecule to form a Schiff base. In this way, the enzyme can be covalently bound directly to the cellulose surface by reaction with the amino groups of the enzyme protein molecule. For the reaction with the glycolytic enzyme, for example, the cellulose (cellulosic material) having a dialdehyde structure in the molecule obtained as described above is converted into a glycolytic enzyme solution having a concentration of about 100 to 500 U / ml. It may be immersed and reacted.
【００１１】なお、形成されたシッフ塩基は、ｐＨ変化
などで容易に解裂する不安定なものであるので、水素化
ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4 ）などを用いて還元処理
し、安定な共有結合に変化させる。還元処理の条件は特
に制限はないが、通常は室温程度の温度において、１〜
６時間程度、好ましくは２〜４時間程度行なえばよい。Since the formed Schiff base is an unstable one which is easily cleaved due to a change in pH, it is subjected to a reduction treatment with sodium borohydride (NaBH 4 ) or the like to form a stable covalent bond. Change. The conditions for the reduction treatment are not particularly limited, but usually at a temperature of about room temperature, 1 to
The time may be about 6 hours, preferably about 2 to 4 hours.
【００１２】さらに、必要に応じて架橋剤による架橋処
理を行ない、酵素分子同士を架橋し、固定化を強化す
る。架橋処理は、二価性試薬を用いて行なわれる。ここ
で二価性試薬としては種々のものがあるが、例えば次式
（Ｉ）Further, if necessary, a cross-linking treatment with a cross-linking agent is carried out to cross-link the enzyme molecules with each other to enhance immobilization. The cross-linking treatment is performed using a divalent reagent. There are various divalent reagents, for example, the following formula (I)
【化１】 （式中、Ｒ1 はアルキル基を示す。）で表されるジアル
デヒド類があり、具体的にはグルタルアルデヒド〔ＯＨ
Ｃ（ＣＨ2 ）3 ＣＨＯ〕等が挙げられる。また、二価性
試薬としては、次式（II）[Chemical 1] (In the formula, R 1 represents an alkyl group.) There are dialdehydes represented by glutaraldehyde [OH
C (CH 2 ) 3 CHO] and the like. Further, as a divalent reagent, the following formula (II)
【化２】 （式中、Ｒ2 〜Ｒ4 はそれぞれアルキル基を示し、これ
らは同一のものであってもよいし、異なるものであって
もよい。）で表されるビスイミドエステル類があり、具
体的にはジメチルスベリンイミデート等が挙げられる。
さらに、二価性試薬としては、次式（III ）[Chemical 2] (In the formula, R 2 to R 4 each represent an alkyl group, and these may be the same or different.) Examples include dimethylsuberine imidate.
Further, as the divalent reagent, the following formula (III)
【化３】 （式中、Ｒ5 はアルキル基を示す。）で表されるジイソ
シアナート類があり、具体的にはトルエン−２，４−ジ
イソシアナート等が挙げられる。また、架橋処理の条件
としては、１〜２．５％程度のグルタルアルデヒド水溶
液を用いて、２〜１０℃程度の低温下で行なうことが好
ましく、通常、４℃程度で行なえばよい。なお、架橋処
理を室温下で行なうと、酵素活性が著しく失活するため
好ましくない。[Chemical 3] (In the formula, R 5 represents an alkyl group), and there are diisocyanates, and specific examples thereof include toluene-2,4-diisocyanate. The conditions for the cross-linking treatment are preferably performed at a low temperature of about 2 to 10 ° C. using an aqueous solution of glutaraldehyde of about 1 to 2.5%, usually about 4 ° C. In addition, it is not preferable to carry out the cross-linking treatment at room temperature because the enzyme activity is significantly inactivated.
【００１３】次に、本発明の方法による固定化の原理に
ついて、具体的に説明する。以下の説明は、具体的な化
合物を用いて行なったが、勿論、本発明はこれに限定さ
れるものではない。まず、次のようにセルロースをメタ
過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ4 ）などによって酸化
し、分子内にジアルデヒドの構造を持つセルロースを調
製する。Next, the principle of immobilization by the method of the present invention will be specifically described. Although the following description was given using specific compounds, the present invention is not limited to these, of course. First, cellulose is oxidized with sodium metaperiodate (NaIO 4 ) or the like to prepare cellulose having a dialdehyde structure in the molecule as follows.
【００１４】[0014]
【化４】 [Chemical 4]
【００１５】次に、得られたセルロースに糖質分解酵素
を反応させることにより、セルロース分子内のアルデヒ
ド基と、酵素タンパク質分子のアミノ基が以下のように
してシッフ塩基を形成する。Next, by reacting the obtained cellulose with a saccharide-degrading enzyme, the aldehyde group in the cellulose molecule and the amino group of the enzyme protein molecule form a Schiff base as follows.
【００１６】[0016]
【化５】 [Chemical 5]
【００１７】形成されたシッフ塩基は、ｐＨ変化などで
容易に解裂する不安定なものであるので、次のようにＮ
ａＢＨ4 などを用いて還元処理し、安定な共有結合に変
化させる。The formed Schiff base is an unstable one which is easily cleaved due to pH change and the like.
It is converted to a stable covalent bond by reducing with aBH 4 or the like.
【００１８】[0018]
【化６】 [Chemical 6]
【００１９】さらに、グルタルアルデヒドなどの架橋剤
で酵素分子同士を架橋し、固定化を強化する。Further, the enzyme molecules are cross-linked with a cross-linking agent such as glutaraldehyde to strengthen the immobilization.
【００２０】本発明は、このようにして得られる固定化
酵素を、麦汁発酵液に接触させることを特徴とするもの
である。麦汁発酵液としては、ビールの製造に通常用い
られるものであればよく、特に制限はない。本発明にお
いては、上記の如くして得られる固定化酵素を、麦汁発
酵液に、浸漬するなどの方法により、直接接触させれば
よい。以上の如くして、目的とする高発酵度ビールを製
造することができる。The present invention is characterized in that the immobilized enzyme thus obtained is brought into contact with a wort fermentation liquid. The wort fermented liquid is not particularly limited as long as it is usually used in the production of beer. In the present invention, the immobilized enzyme obtained as described above may be directly contacted with the wort fermentation solution by a method such as dipping. As described above, the desired high-fermentation beer can be produced.
【００２１】[0021]
【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに詳しく説
明する。なお、本発明はその要旨を超えない限り、以下
の実施例に限定されるものではない。 試験例１ 表１に示すように粒度の異なるセルロースパウダーを用
い、これをそれぞれ過ヨウ素酸酸化処理し、グルコアミ
ラーゼの固定化を行ない、発現活性とリーク活性を調べ
た。まず蒸留水に約１％濃度で過ヨウ素酸ナトリウムを
溶解し、これに粒度の異なるセルロースパウダーをそれ
ぞれ懸濁して、遮光下に４℃で一晩攪拌し、反応させ
た。反応物は、ブフナー漏斗上で蒸留水で充分に洗浄し
た後、アセトンで洗浄し、乾燥させた。各々の過ヨウ素
酸酸化セルロース５０ｍｇを、１０Ｕ／ｍｌ濃度のグル
コアミラーゼ溶液５００μｌ中に浸漬し、室温で一晩反
応させた後、５０ｍＭのＮａＢＨ4 （ｐＨ８．５、５０
ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液）２．５ｍｌ
で室温下、３時間の還元処理を行ない、固定化した。酵
素固定化後のセルロースは蒸留水で充分に洗浄した。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail by way of examples. The present invention is not limited to the following examples as long as the gist thereof is not exceeded. Test Example 1 Cellulose powders having different particle sizes as shown in Table 1 were subjected to periodate oxidation treatment to immobilize glucoamylase, and the expression activity and leak activity were examined. First, sodium periodate was dissolved in distilled water at a concentration of about 1%, and cellulose powders having different particle sizes were suspended in each, and the mixture was stirred overnight at 4 ° C. in the dark to react. The reaction product was thoroughly washed with distilled water on a Buchner funnel, then with acetone, and dried. 50 mg of each periodate-oxidized cellulose was immersed in 500 μl of a glucoamylase solution having a concentration of 10 U / ml and reacted overnight at room temperature, and then 50 mM NaBH 4 (pH 8.5, 50) was added.
mM triethanolamine-HCl buffer) 2.5 ml
At room temperature, reduction treatment was performed for 3 hours to immobilize. The cellulose after enzyme immobilization was thoroughly washed with distilled water.
【００２２】固定化後の試料は、０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）２０ｍｌ中に懸濁し、そのうち５０μｌ
を取り、１％可溶性澱粉を基質として、ｐＨ４．５、４
０℃で１５分間反応させ、生成したグルコース量を測定
し、発現活性とした。発現活性は酵素活性単位（ユニッ
ト：Ｕ）で表記した。同じ試料懸濁液をメンブランフィ
ルターで濾過し、固定化酵素を除去した後、５００μｌ
を用い、１％可溶性澱粉を基質として、４０℃で一晩イ
ンキュベートし、生成したグルコース量を測定し、リー
ク活性とした。過ヨウ素酸酸化セルロースの固定化グル
コアミラーゼの発現活性、リーク活性を表１に示す。な
お、表中の値は、セルロース５０ｍｇあたりの値であ
る。リーク活性は、各固定化酵素をｐＨ４．５の緩衝液
中に３０日間保存した後、上清中に遊離してきた酵素の
量である。The sample after immobilization was suspended in 20 ml of 0.1 M acetate buffer (pH 4.5), 50 μl of which was suspended.
, 1% soluble starch as substrate, pH 4.5, 4
The reaction was carried out at 0 ° C for 15 minutes, and the amount of glucose produced was measured and defined as the expression activity. The expression activity was expressed in enzyme activity unit (unit: U). The same sample suspension was filtered with a membrane filter to remove the immobilized enzyme, and then 500 μl
Using 1% soluble starch as a substrate, the mixture was incubated at 40 ° C. overnight, and the amount of glucose produced was measured and used as the leak activity. Table 1 shows the expression activity and leak activity of immobilized glucoamylase of periodate-oxidized cellulose. The values in the table are values per 50 mg of cellulose. Leak activity is the amount of enzyme released in the supernatant after each immobilized enzyme was stored in a buffer solution of pH 4.5 for 30 days.
【００２３】[0023]
【表１】 [Table 1]
【００２４】上記表１に示す如く、発現活性は微結晶セ
ルロースである Avicel と、最も粒度の粗い（繊維状に
近い）セルロースパウダーＤが、他のセルロースパウダ
ーに比べて高かった。実験上の扱い易さなどを考慮し、
以下の実験にはセルロースパウダーＤを用いることとし
た。As shown in Table 1 above, the expression activity of Avicel, which is microcrystalline cellulose, and cellulose powder D, which has the coarsest particle size (close to fibrous), was higher than those of other cellulose powders. Considering the ease of handling in experiments,
Cellulose powder D was used in the following experiments.
【００２５】試験例２ 次に、架橋剤としてグルタルアルデヒド（ＧＡ）を用
い、固定化の強化、リーク活性の抑制を試みた。上記試
験例１で得られた過ヨウ素酸酸化セルロースパウダーＤ
５０ｍｇを、１００Ｕ／ｍｌ濃度のグルコアミラーゼ
溶液５００μｌ中に浸漬し、４℃又は室温で、３時間又
は一晩反応させた。この試料に対し、５０ｍＭのＮａＢ
Ｈ4 （ｐＨ８．５、５０ｍＭトリエタノールアミン−Ｈ
Ｃｌ緩衝液）２．５ｍｌを用いて室温下、３時間の還元
処理を行なった後、蒸留水で洗浄し、固定化条件の異な
る固定化酵素を調製した。各々の固定化酵素について、
２．５％グルタルアルデヒド溶液（ｐＨ８．５）２．５
ｍｌを用い、４℃又は室温で、３時間反応させた後、蒸
留水で充分に洗浄を行ない、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）中で、４℃で静置保存し、１週間毎に発現活性
とリーク活性を測定した。これらの結果を表２に示す。
なお、活性測定は１週間毎に４回行ない、発現活性は４
回の平均、リーク活性は４回の測定の最大値を示した。
活性はセルロースパウダー５０ｍｇあたりの値である。Test Example 2 Next, glutaraldehyde (GA) was used as a cross-linking agent to try to enhance immobilization and suppress leak activity. Periodate oxidized cellulose powder D obtained in Test Example 1 above
50 mg was immersed in 500 μl of a glucoamylase solution having a concentration of 100 U / ml and reacted at 4 ° C. or room temperature for 3 hours or overnight. For this sample, 50 mM NaB
H 4 (pH 8.5, 50 mM triethanolamine-H
After performing a reduction treatment for 3 hours at room temperature using 2.5 ml of Cl buffer solution, it was washed with distilled water to prepare immobilized enzymes having different immobilization conditions. For each immobilized enzyme,
2.5% glutaraldehyde solution (pH 8.5) 2.5
After reacting for 3 hours at 4 ° C. or room temperature with ml, thoroughly wash with distilled water to obtain a 0.1 M acetate buffer (pH
In 4.5), the sample was allowed to stand at 4 ° C. for storage, and the expression activity and leak activity were measured every week. The results are shown in Table 2.
The activity was measured 4 times a week, and the expression activity was 4 times.
The average of the number of times and the leak activity showed the maximum value of four measurements.
The activity is a value per 50 mg of cellulose powder.
【００２６】[0026]
【表２】 [Table 2]
【００２７】表２に示すように、グルタルアルデヒド処
理を室温で行なうと、酵素活性は著しく失活した。ま
た、グルタルアルデヒド処理を４℃，３時間という温和
な条件下で処理を行なったものでは、２Ｕ／５０ｍｇ・
セルロース程度の活性があり、発現活性は処理前の約１
／４になっていたものの、リーク活性は処理前の１／１
００以下に低下しており、この方法では検出されなかっ
た。このリーク活性測定法では、５×10-5Ｕ／５０ｍｇ
・セルロース程度が検出限界であり、今回のサンプルは
これを充分にクリアしており、充分に実用可能と思われ
る。以上のように、グルタルアルデヒド処理の条件を検
討した結果、発現活性は充分に残しながら、リーク活性
を検出限界以下に抑えることが可能であることが判っ
た。なお、予備試験としては、セルロースパウダーを用
いて実験を行なったが、ビール発酵試験に使用するにあ
たり、扱いの容易な形状のセルロースとして、ガーゼを
使用した。ガーゼを用いた固定化グルコアミラーゼの使
用により、固定化酵素でも発酵液に直接酵素を添加した
場合と、ほぼ同等の効果が得られることを確認すること
ができた（次の実施例参照）。As shown in Table 2, when the glutaraldehyde treatment was carried out at room temperature, the enzyme activity was significantly inactivated. In addition, when the glutaraldehyde treatment was performed under mild conditions of 4 ° C. for 3 hours, 2 U / 50 mg.
It has about the same activity as cellulose, and the expression activity is about 1 before treatment.
Although it was / 4, the leak activity is 1/1 before the treatment.
It was decreased to below 00 and was not detected by this method. In this leak activity measurement method, 5 × 10 −5 U / 50 mg
・ The detection limit is about cellulose, and this sample has cleared this sufficiently, and it seems that it can be practically used. As described above, as a result of examining the conditions of glutaraldehyde treatment, it was found that it is possible to suppress the leak activity below the detection limit while leaving sufficient expression activity. As a preliminary test, an experiment was conducted using cellulose powder, but gauze was used as the cellulose having a shape that is easy to handle when using it in a beer fermentation test. It was confirmed that by using the immobilized glucoamylase using gauze, almost the same effect can be obtained with the immobilized enzyme as when the enzyme is directly added to the fermentation solution (see the following Examples).
【００２８】実施例 （１）固定化グルコアミラーゼの調製 １％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液４００ｍｌにガーゼを
浸漬し、４℃で一晩振とうし、過ヨウ素酸酸化処理を行
なった。反応後のガーゼは蒸留水で充分に洗浄した後、
アセトンで洗浄し、乾燥させた。次に、過ヨウ素酸酸化
処理したガーゼ約１．８ｇを１００Ｕ／ｍｌ濃度のグル
コアミラーゼ溶液５０ｍｌ中に浸漬し、４℃で二晩反応
させた後、５０ｍＭのＮａＢＨ4 （ｐＨ８．５）１００
ｍｌで室温下、３時間の還元処理を行ない、固定化し
た。酵素固定化後のガーゼは蒸留水で充分に洗浄した。
さらに、２．５％グルタルアルデヒド溶液（ｐＨ８．
５、５０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液）１
００ｍｌに浸漬し、４℃で３時間処理し、蒸留水で充分
に洗浄した。これを固定化グルコアミラーゼとして、次
のビール発酵試験に用いた。なお、発現活性は約４０Ｕ
／１．８ｇ・セルロースであった。Example (1) Preparation of immobilized glucoamylase Gauze was immersed in 400 ml of a 1% sodium periodate aqueous solution and shaken at 4 ° C. overnight to perform periodate oxidation treatment. After the reaction, the gauze is thoroughly washed with distilled water,
It was washed with acetone and dried. Next, about 1.8 g of periodate-oxidized gauze was immersed in 50 ml of a glucoamylase solution having a concentration of 100 U / ml and reacted at 4 ° C. for two nights, and then 50 mM NaBH 4 (pH 8.5) 100 was added.
Immobilization was performed by performing a reduction treatment with ml at room temperature for 3 hours. The gauze after the enzyme immobilization was thoroughly washed with distilled water.
Furthermore, a 2.5% glutaraldehyde solution (pH 8.
5, 50 mM triethanolamine-HCl buffer) 1
It was immersed in 00 ml, treated at 4 ° C. for 3 hours, and thoroughly washed with distilled water. This was used as the immobilized glucoamylase in the next beer fermentation test. The expression activity is about 40U.
It was /1.8 g-cellulose.
【００２９】（２）発酵試験及び発酵液中の残存グルコ
アミラーゼ活性の測定 発酵試験は、発酵容器として１リットル容メスシリンダ
ーを用い、発酵温度１０．５℃にて、以下の如くして行
なった。酵素を固定化したガーゼを発酵液中に浸漬し、
マグネチックスターラーにより発酵液を攪拌した。一
方、比較のためにグルコアミラーゼ（ＧＡ）を直接添加
したものについて、静置発酵を行なった。発酵終了後の
発酵液１００μｌ、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）
４００μｌ、２％可溶性澱粉５００μｌを混合し、４０
℃で１０分間若しくは一晩インキュベートし、生成した
グルコース量を定量、発酵液中のグルコアミラーゼ活性
とした。また、予め１００℃、５分間の処理で酵素活性
を失活させた発酵液を用いて、同じ反応を行ない、対照
とした。それぞれの発酵液の発酵１ケ月後の真性発酵度
を図１（発酵１回目）及び図２（発酵２回目）に示す。
図１及び図２によれば、固定化酵素使用区では、発酵２
回共に真性発酵度が８５％に達し、本発明における固定
化酵素が充分に再使用に耐えることが示された。なお、
ビール中の残存デキストリンを酵素により強制的に分解
して得られる発酵度は、ほぼ８７％が限界であり、この
試験における発酵度は充分限界に近いものである。ま
た、固定化グルコアミラーゼを用いた発酵試験の発酵経
過（仮性エキス）を図３（発酵１回目）及び図４（発酵
２回目）に示す。さらに、各発酵液をサンプリングし、
液中の遊離グルコアミラーゼ活性を測定した。結果を表
３（発酵１回目）及び表４（発酵２回目）に示す。(2) Fermentation test and measurement of residual glucoamylase activity in the fermentation broth The fermentation test was carried out as follows at a fermentation temperature of 10.5 ° C. using a 1 liter measuring cylinder as a fermentation container. . Immerse the enzyme-immobilized gauze in the fermentation liquid,
The fermented liquid was stirred by a magnetic stirrer. On the other hand, for comparison, static fermentation was carried out for those to which glucoamylase (GA) was directly added. 100 μl of fermented liquid after completion of fermentation, 0.1 M acetate buffer (pH 4.5)
Mix 400 μl, 500 μl of 2% soluble starch, 40
After incubating at 0 ° C for 10 minutes or overnight, the amount of glucose produced was quantified and used as the glucoamylase activity in the fermentation broth. In addition, the same reaction was performed using a fermented liquid in which the enzyme activity was inactivated by treatment at 100 ° C. for 5 minutes, and used as a control. The degree of true fermentation of each fermented liquid after 1 month of fermentation is shown in FIG. 1 (first fermentation) and FIG. 2 (second fermentation).
According to FIG. 1 and FIG. 2, in the group using immobilized enzyme, fermentation 2
The degree of true fermentation reached 85% over time, indicating that the immobilized enzyme of the present invention is sufficiently resistant to reuse. In addition,
The fermentation degree obtained by forcibly decomposing residual dextrin in beer with an enzyme has a limit of about 87%, and the fermentation degree in this test is close to the limit. Further, the fermentation process (tentative extract) of the fermentation test using immobilized glucoamylase is shown in FIG. 3 (first fermentation) and FIG. 4 (second fermentation). Furthermore, each fermentation liquor is sampled,
The free glucoamylase activity in the liquid was measured. The results are shown in Table 3 (first fermentation) and Table 4 (second fermentation).
【００３０】[0030]
【表３】 [Table 3]
【００３１】[0031]
【表４】 [Table 4]
【００３２】[0032]
【発明の効果】本発明の方法では、過ヨウ素酸酸化処理
したセルロース系素材に糖質分解酵素を反応させ、共有
結合させてなる固定化酵素を用いているため、担体であ
るセルロース系素材からの酵素の漏洩が非常に少なく、
酵素のリークを検出限界以下に抑えることができる。ま
た、この固定化は担体表層のみの固定化であるため、固
定化に使用する酵素量を低減化することができる。さら
に、担体及び固定化に要する試薬が安価であるばかり
か、この固定化酵素は、発酵液に直接酵素を添加した場
合とほぼ同等の活性を有し、充分に再使用に耐えるもの
である。また、使用する固定化酵素の活性量及び発酵液
と固定化酵素の接触時間を調節することによりビールの
発酵度を自在にコントロールすることも可能となる。し
たがって、本発明の方法によれば、固定化糖質分解酵素
を用いて効率よく高発酵度ビールを製造することができ
る。The method of the present invention uses an immobilized enzyme obtained by reacting a cellulosic material that has been subjected to periodate oxidation treatment with a glycolytic enzyme and covalently bonding it to the cellulosic material that is a carrier. Very few enzyme leaks,
Enzyme leakage can be suppressed below the detection limit. Further, since this immobilization is immobilization only on the surface layer of the carrier, the amount of enzyme used for immobilization can be reduced. Furthermore, not only the carrier and the reagent required for immobilization are inexpensive, but this immobilized enzyme has almost the same activity as when the enzyme is directly added to the fermentation liquor, and is sufficiently resistant to reuse. In addition, the degree of fermentation of beer can be freely controlled by adjusting the active amount of the immobilized enzyme used and the contact time between the fermentation solution and the immobilized enzyme. Therefore, according to the method of the present invention, highly fermented beer can be efficiently produced by using the immobilized glycolytic enzyme.
【図１】は実施例における発酵液の発酵１回目の真性発
酵度を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the degree of true fermentation at the first fermentation of the fermentation broth in Examples.
【図２】は実施例における発酵液の発酵２回目の真性発
酵度を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the degree of true fermentation in the second fermentation of the fermentation broth in Examples.
【図３】は実施例における発酵試験の発酵１回目の発酵
経過（仮性エキス）を示すグラフである。FIG. 3 is a graph showing the first fermentation process (pseudo-extract) in the fermentation test in Examples.
【図４】は実施例における発酵試験の発酵２回目の発酵
経過（仮性エキス）を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing the second fermentation process (pseudo extract) in the fermentation test of the example.
Claims (3)
材に糖質分解酵素を反応させ、共有結合させてなる固定
化酵素を、麦汁発酵液に接触させることを特徴とする高
発酵度ビールの製造方法。1. A high fermentation beer characterized in that a immobilized enzyme obtained by reacting a cellulosic material subjected to periodate oxidation treatment with a glycolytic enzyme and covalently bonding it to a wort fermented liquid is used. Production method.
したセルロース系素材に糖質分解酵素を反応させ、共有
結合させた後、さらに架橋剤による架橋処理を行なうこ
とにより得られる固定化酵素を用いる請求項１記載の高
発酵度ビールの製造方法。2. An immobilized enzyme obtained by reacting a cellulosic material subjected to periodate oxidation treatment with a glycolytic enzyme to form a covalent bond and then further performing a crosslinking treatment with a crosslinking agent as the immobilized enzyme. The method for producing a high fermentation beer according to claim 1, which is used.
アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びプルラナーゼよりな
る群から選ばれた１種以上のものである請求項１又は２
記載の高発酵度ビールの製造方法。3. Glycolytic enzyme is α-amylase, β-
The one or more selected from the group consisting of amylase, glucoamylase and pullulanase.
A method for producing a high fermentation beer as described.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4274828A JPH0698749A (en) | 1992-09-21 | 1992-09-21 | Production of beer having high fermentation degree |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4274828A JPH0698749A (en) | 1992-09-21 | 1992-09-21 | Production of beer having high fermentation degree |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0698749A true JPH0698749A (en) | 1994-04-12 |
Family
ID=17547144
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4274828A Withdrawn JPH0698749A (en) | 1992-09-21 | 1992-09-21 | Production of beer having high fermentation degree |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0698749A (en) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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-
1992
- 1992-09-21 JP JP4274828A patent/JPH0698749A/en not_active Withdrawn
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