CN101978054B - 能够与肝素结合性表皮生长因子样生长因子结合的单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

对于治疗以HB-EGF水平增加为特征的疾病的药物一直有需求。因此，本发明公开了一种能够与细胞膜结合型HB-EGF、膜锚定型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的单克隆抗体，或所述单克隆抗体的片段。

Description

能够与肝素结合性表皮生长因子样生长因子结合的单克隆抗体
技术领域
本发明涉及细胞膜结合型肝素结合性表皮生长因子样生长因子(在后文称为“HB-EGF”)、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的单克隆抗体或其抗体片段。
背景技术
HB-EGF由东山(Higashiyama)等在1992年从巨噬细胞分化的人巨噬细胞样细胞系U-937的培养上清液中分离和纯化(非专利文献1)。HB-EGF带有在表皮生长因子(EGF)家族中共同保守的6个半胱氨酸残基，并属于EGF家族，与属于EGF家族的其他蛋白情况相似，被合成为I型膜蛋白(非专利文献1和2)。膜型HB-EGF被金属蛋白酶转化成14到22千道尔顿(在后文中称为“kDa”)的分泌型HB-EGF，该金属蛋白酶由多种生理刺激例如由热或渗透压导致的应激、生长因子、细胞因子和作为G蛋白偶联受体(GPCR)的溶血磷脂酸(LPA)所激活(非专利文献1到3)。分泌型HG-EGF结合EGF受体(EGFR/ErbB1)(非专利文献1)、ErbB4(非专利文献4)和N-精氨酸二盐基转化酶(非专利文献5)，并对成纤维细胞和平滑肌细胞(非专利文献1)、角质细胞(非专利文献6)、肝细胞(非专利文献7)和系膜细胞(非专利文献8)具有生长加速活性。此外，也已知道，HB-EGF与例如心脏瓣膜的器官发生(非专利文献28、29和31)、伤口愈合(非专利文献9和10)、动脉粥样硬化引起的平滑肌细胞增生(非专利文献11)、再狭窄(非专利文献12和13)、肺动脉高血压(非专利文献14)、肝再生(非专利文献15)、脑病(非专利文献16)和癌症(非专利文献28到35)有关。
另一方面，已报道在细胞表面上表达的相当量的膜型HB-EGF没有被消化成其分泌型(非专利文献17)。已知膜型HB-EGF与CD9等四次跨膜蛋白或整合蛋白α3β1在细胞表面上形成复合物，并且也已报道它作为近分泌生长因子与邻近的细胞相互作用(非专利文献17到22)。此外，Naglich等已报道，膜型HB-EGF起到白喉毒素受体的作用，与白喉毒素进入细胞的内化作用有关(非专利文献23)。
当目加田等通过制备HB-EGF敲除(KO)小鼠来分析HB-EGF的生理功能时，HB-EGF KO小鼠显示出心室扩张、心功能降低和心脏瓣膜肥大症状，超过一半的动物在出生后几天内死亡。该事实显示，HB-EGF是心脏发育和功能维持所必需的蛋白(非专利文献24)。
接下来，目加田等制备了两个HB-EGF的基因，一个HB-EGF由于在蛋白酶消化位点中引入突变而变得不能转变成分泌型(在后文中称为“HBuc”)，另一个HB-EGF缺乏跨膜区，能够被分泌，并且其分泌不依赖于蛋白酶消化(在后文中称为“HBΔtm”)。通过制备表达相应HB-EGF突变体的转基因小鼠，分析了膜型和分泌型HB-EGF的生理功能(非专利文献25)。结果，因为表达HBuc的小鼠显示出与HB-EGF KO小鼠类似的症状，因此认为分泌型HB-EGF起到活性型蛋白的作用。大多数表达HBΔtm的小鼠在新生期之前或新生期死亡。此外，在其中只在一个等位基因中引入了突变的表达HBΔtm/+的小鼠中，发现了角质细胞增生和心室肥大。这些症状是与HB-EGF KO小鼠和HBuc小鼠直接相反的表现型。已知为白喉毒素突变体的CRM197(非专利文献26)，特异性抑制HB-EGF的细胞生长加速活性，并且不透过细胞膜。因为该CRM197抑制了作为表达HBΔtm小鼠的表现型的增生和心室肥大，因此认为在表达HBΔtm的小鼠中形成的HBΔtm，不通过在其分泌前与其细胞内受体结合而起作用，而是通过在分泌到细胞外后与细胞表面上的受体结合而起作用。因此，活体中膜型HB-EGF与分泌型HB-EGF之间的定量平衡，是维持正常生理功能所必需的，并认为，从HB-EGF的膜型转化成分泌型的过程，在活体中是受控的。
东山等发现，在通过缩窄胸主动脉诱导了心脏肥大的小鼠心脏中，心脏中的分泌型HB-EGF蛋白增加。已报道，当向该小鼠施用能够抑制将膜型HB-EGF转化为分泌型HB-EGF的蛋白酶的低分子量化合物时，由于在心脏中抑制膜型HB-EGF向分泌型转化，从而抑制了心脏肥大(非专利文献27)。
到目前为止，已报道与正常组织相比，HB-EGF在多种癌症例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌和膀胱癌中以高水平表达(非专利文献28到31)。此外，最近已发现，HB-EGF是癌症增殖的重要因子(非专利文献32和33)。目加田(Mekada)等已经发现，当HB-EGF的小干扰RNA(siRNA)被导入到癌细胞系中时，或在人卵巢癌细胞系移植到裸鼠的模型***中，向移植了癌细胞系的小鼠施用CRM197时，识别到了明显的肿瘤生长抑制效应。东山等也已发现，在转入了HB-EGF基因的膀胱癌细胞系中，体外的细胞生长、集落形成能力、血管内皮生长因子(VEGF)表达和周期蛋白D1的表达等增加。此外，已经报道，在体内也发现了致瘤性的增加和肿瘤血管生成的增加。这样的生长刺激活性只有当膜型HB-EGF基因或分泌型HB-EGF基因表达时才能发现，但是当强制表达蛋白酶抗性的膜型HB-EGF基因时不能发现。因此，提示了这样的可能性，即分泌型HB-EGF是与卵巢癌和膀胱癌的肿瘤生长相关的重要因子。关于HB-EGF在临床患者中的表达，目加田等已经分析了卵巢癌患者的肿瘤组织和腹水中HB-EGF mRNA的表达量和分泌型HB-EGF的浓度，并报道了在EGF家族中只有HB-EGF被表达(非专利文献32)。此外，宫本等已经报道，在肿瘤的HB-EGF mRNA高表达的卵巢癌患者，其预后比低表达的患者差(非专利文献34)。上述结果显示，至少在卵巢癌中，癌症产生的分泌型HB-EGF通过自分泌或旁分泌机制与癌症生长相关联(非专利文献35)。作为与分泌型HB-EGF结合并抑制其活性的抗体，已知的有一些多克隆抗体和一种单克隆抗体(均由R&D制造)。已经报道，抗HB-EGF山羊多克隆抗体(由R&D制造)与COS-7细胞中表达的细胞表面膜型HB-EGF结合(非专利文献3)。众所周知，当膜蛋白呈递在细胞例如癌细胞的表面上时，与该蛋白结合的单克隆抗体可以变成抑制该细胞生长的治疗剂(非专利文献36)。
已经知道，一般来说，当向人施用非人类动物抗体例如小鼠抗体时，它被识别作外来物质，从而在人体中诱导了针对小鼠抗体的人抗体[人抗小鼠抗体(HAMA)]。已知HAMA与施用的小鼠抗体反应，由此诱导了副作用(非专利文献37到40)，增加了小鼠抗体从体内的消除(非专利文献38、41和42)，并降低了小鼠抗体的治疗效果(非专利文献43和44)。
为了解决这些问题，已经尝试了使用基因重组技术从非人抗体制备重组抗体，例如人嵌合抗体或人源化抗体。
在临床应用中，人嵌合抗体和人源化抗体与非人抗体例如小鼠抗体相比，在施用于人类方面具有多种优点。例如，已经报道，在使用猴的试验中，与小鼠抗体相比，其免疫原性降低，在血液中的半衰期延长(非专利文献45和46)。也就是说，因为人嵌合抗体和人源化抗体与非人抗体相比，在人类中引起更少的副作用，因此预计其治疗效果持续更长时间。
此外，因为人嵌合抗体和人源化抗体使用基因重组技术制备，因此它可以制备成各种不同形式的分子。例如，当使用γ1亚类作为人抗体的重链(在后文中称为“H链”)恒定区(在后文中称为“C区”)(H链C区被称为“CH”)时，可以制备具有高的效应子功能、例如抗体依赖的细胞的细胞毒性(在后文中称为“ADCC活性”)的人嵌合抗体和人源化抗体(非专利文献14)，并可以预期它在血液中的半衰期与小鼠抗体相比延长了(非专利文献46)。特别是，在进行治疗以减少表达膜型HB-EGF的细胞或在其细胞膜表面上结合有分泌型HB-EGF的细胞的情况下，细胞毒性活性、例如经抗体Fc区域(抗体重链铰链区后的区域)的补体依赖性细胞毒性(在后文中称为“CDC活性)和ADCC活性的程度，对于其疗效是重要的。在人类治疗中，为了执行细胞毒性活性，优选使用人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体(非专利文献47和48)。
此外，由于蛋白质工程和遗传工程的最新进展，也可以将人嵌合抗体或人源化抗体制备成低分子量抗体片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(在后文中称为“scFv”)(非专利文献49)、二聚化的V区片段(在后文中称为“双抗体”)(非专利文献51)、二硫键稳定的V区片段(在后文中称为“dsFv”)(非专利文献52)、或含有互补性决定区(在后文中称为“CDR”)的肽(非专利文献50)，这些抗体片段与完整抗体分子相比，具有更出色的向靶组织迁移的能力(非专利文献53)。
上述事实显示，作为在临床情况下应用于人的抗体，人嵌合抗体或人源化抗体比非人类动物抗体例如小鼠抗体更为优选。
非专利文献1：Science，Vol.251，936，1991
非专利文献2：J.Biol.Chem.267(1992)6205-6212
非专利文献3：Nature，Vol.402，884，1999
非专利文献4：EMBO J.16(1997)1268-1278
非专利文献5：EMBO J.20(2001)3342-3350
非专利文献6：J.Biol.Chem.269(1994)20060-20066
非专利文献7：Biochem Biophys.Res.Commun.198(1994)25-31
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非专利文献9：Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.90(1993)3889-3893
非专利文献10：J.Cell Biol.151(2000)209-219
非专利文献11：J.Clin.Invest.，95，404，1995
非专利文献12：Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.16(1996)1524-1531
非专利文献13：J.Biol.Chem.277(2002)37487-37491
非专利文献14：Am.J Pathol.143(1993)784-793
非专利文献15：Hepatology 22(1995)1584-1590
非专利文献16：Brain Res.827(1999)130-138
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非专利文献18：J.Cell Biol.128(1995)929-938
非专利文献19：J.Cell Biol.129(1995)1691-1705
非专利文献20：Cytokine Growth Factor Rev.，Vol.11，335，2000
非专利文献21：Int.J.Cancer，Vol.98，505，2002
非专利文献22：J.Histochem.Cytochem.，Vol.49，439，2001
非专利文献23：Cell，Vol.69，1051，1992
非专利文献24：PNAS，Vol.100，3221，2003
非专利文献25：J.of Cell Biology，Vol.163，469，2003
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非专利文献28：Breast Cancer Res.Treat.，Vol.67，81，2001
非专利文献29：Oncol.Rep.，Vol.8，903，2001
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非专利文献31：Cancer Res.，Vol.61，6227，2001
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非专利文献35：Clin.Cancer Res.，Vol.11，4639，2005
非专利文献36：Nat.Rev.Drug.Discov.，Vol.2，52-62，2003
非专利文献37：J.Clin.Oncol.，2，881(1984)
非专利文献38：Blood，65，1349(1985)
非专利文献39：J.Natl.Cancer Inst.，80，932(1988)
非专利文献40：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，1242(1985)
非专利文献41：J.Nucl.Med.，26，1011(1985)
非专利文献42：J.Natl.Cancer Inst.，80，937(1988)
非专利文献43：J.Immunol.，135，1530(1985)
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非专利文献45：Cancer Res.，56，1118(1996)
非专利文献46：Immunol.，85，668(1995)
非专利文献47：J.Immunol.，144，1382(1990)
非专利文献48：Nature，322，323(1988)
非专利文献49：Science，242，423(1988)
非专利文献50：Nature Biotechnol.，15，629(1997)
非专利文献51：Molecular Immunol.，32，249(1995)
非专利文献52：J.Biol.Chem.，271，2966(1996)
非专利文献53：Cancer Res.，52，3402(1992)
发明的公开内容
本发明拟解决的问题：
治疗与HB-EGF相关的疾病的药物是有需求的。
解决问题的手段：
本发明涉及下面(1)到(28)：
(1)一种单克隆抗体或其抗体片段，其与细胞膜结合型肝素的结合性表皮生长因子样生长因子、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合；
(2)根据(1)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生长因子样结构域(EGF样结构域)结合；
(3)根据(1)或(2)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其抑制分泌型HB-EGF与HB-EGF受体的结合；
(4)根据(1)到(3)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其对分泌型HB-EGF具有中和活性；
(5)根据(1)到(4)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与分泌型HB-EGF和HB-EGF受体或HB-EGF和白喉毒素的结合区结合；
(6)根据(1)到(5)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第133、135和147位氨基酸的至少一个的表位结合；
(7)根据(6)所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与包含SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列中第133、135和147位氨基酸的表位结合；
(8)根据(1)到(5)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第141位氨基酸的表位结合；
(9)根据(1)到(3)、(5)和(8)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与杂交瘤KM3579(FERM BP-10491)产生的单克隆抗体结合的表位相结合；
(10)根据(1)到(7)所述任一项的单克隆抗体或其抗体片段，其与杂交瘤KM3567(FERM BP-10573)产生的单克隆抗体结合的表位相结合；
(11)根据(1)到(7)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其与杂交瘤KM3566(FERM BP-10490)产生的单克隆抗体结合的表位相结合；
(12)根据(1)到(11)任一项所述的单克隆抗体或其抗体片段，其中单克隆抗体是重组抗体；
(13)根据(12)所述的抗体或其抗体片段，其中重组抗体选自人嵌合抗体、人源化抗体和人抗体；
(14)根据(13)所述的重组抗体或其抗体片段，其中抗体的重链可变区(后文中称为“VH”)的CDR(互补性决定区，后文中称为“CDR”)1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NOs：12、13和14显示的氨基酸序列，和抗体的轻链可变区(后文中称为“VL”)的CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NOs：15、16和17显示的氨基酸序列；
(15)根据(13)所述的人嵌合抗体或其抗体片段，其中人嵌合抗体的VH含有SEQ ID NO：9显示的氨基酸序列，和人嵌合抗体的VL含有SEQID NO：11显示的氨基酸序列；
(16)根据(13)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体的VH含有SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val；并且其中人源化抗体的VL含有SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列，或在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu；
(17)根据(13)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体的VH含有在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中导入氨基酸修饰中的至少一个修饰的氨基酸序列，所述氨基酸修饰选自Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val；并且其中人源化抗体的VL含有在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中导入至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu；
(18)根据(13)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体的VH含有SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列，人源化抗体的VL含有SEQID NO：43显示的氨基酸序列；
(19)根据(13)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体的VH含有SEQ ID NO：42显示的氨基酸序列，人源化抗体的VL含有SEQID NO：23显示的氨基酸序列；
(20)根据(13)所述的人源化抗体或其抗体片段，其中人源化抗体的VH含有SEQ ID NO：42显示的氨基酸序列，人源化抗体的VL含有SEQID NO：43显示的氨基酸序列；
(21)根据(1)到(20)任一项所述的抗体片段，其选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定的V区(dsFv)和含有6个CDRs的肽；
(22)一种DNA，其编码(1)到(21)任一项的抗体或其抗体片段；
(23)一种重组载体，其含有(22)的DNA；
(24)一种转化体，其能通过将(23)的重组载体导入宿主细胞而获得；
(25)一种用于生产(1)到(21)任一项的抗体或其抗体片段的方法，所述方法包括将(24)的转化体在培养基中培养，以在培养物中形成和积累(1)到(21)任一项的抗体或其抗体片段，以及从培养物中回收抗体或抗体片段；
(26)一种药物组合物，其含有(1)到(21)任一项的抗体或其抗体片段作为活性成分；
(27)一种用于治疗与HB-EGF相关的疾病的药剂，其含有(1)到(21)任一项的抗体或其抗体片段作为活性成分；以及
(28)根据(27)所述的药剂，其中与HB-EGF相关的疾病是癌症。
发明的效果
本发明提供了与细胞膜结合型肝素结合性表皮生长因子样生长因子、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的单克隆抗体或其抗体片段。
附图说明
[图1A]它通过结合ELISA显示了各种抗HB-EGF单克隆抗体的反应性。上图显示了对人HB-EGF的结合ELISA结果，下图显示了对作为阴性对照的牛血清白蛋白(BSA)的结合ELISA结果。横坐标显示每种抗体的浓度，纵坐标显示每种抗体的结合活性。◇显示单克隆抗体KM511，■显示单克隆抗体KM3566，△显示单克隆抗体KM3567，▲显示单克隆抗体KM3579，○显示单克隆抗体MAB259。
[图1B]它显示抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的HB-EGF-EGFR结合抑制活性。横坐标显示每种抗体的浓度，纵坐标显示通过荧光强度显示的生物素标记的HB-EGF的结合。横向实线显示当加入生物素标记的HB-EGF时和没有加入抗体时的荧光强度，横向虚线显示当没有加入生物素标记的HB-EGF和没有加入抗体时的荧光强度。△显示单克隆抗体KM3566，×显示单克隆抗体KM3567，●显示单克隆抗体KM3579，■显示单克隆抗体MAB259。
[图2A]它显示各种抗HB-EGF单克隆抗体的HB-EGF中和活性。横坐标显示每种抗体的浓度，纵坐标显示生长抑制率(％)。分别是，◇显示单克隆抗体KM511，■显示单克隆抗体KM3566，▲显示单克隆抗体KM3579，○显示单克隆抗体MAB259。
[图2B]它显示各种抗HB-EGF单克隆抗体的HB-EGF中和活性。横坐标显示每种抗体的浓度，纵坐标显示细胞生长。HB-EGF(+)显示当加入HB-EGF并且未加入抗体时的细胞生长，HB-EGF(-)显示当不加入HB-EGF并且未加入抗体时的细胞生长。□显示单克隆抗体MAB259，■显示单克隆抗体KM3567，▲显示单克隆抗体KM3566。
[图3]它通过FCM分析显示各种抗HB-EGF单克隆抗体的反应性。横坐标显示每种抗体的浓度，纵坐标显示平均荧光强度。×显示单克隆抗体KM511，△显示单克隆抗体KM3566，□显示单克隆抗体KM3579，○显示单克隆抗体MAB259。虚线显示不含抗体的阴性对照(当加入抗HB-EGF单克隆抗体并且未加入FITC-标记的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)多克隆抗体时)的平均荧光强度MFI值。
[图4]它通过FCM分析显示各种抗HB-EGF单克隆抗体对MDA-MB-231细胞的反应性。在每个直方图中，左侧峰显示阴性对照抗体KM511，右侧峰显示每种抗HB-EGF抗体。(a)、(b)、(c)和(d)分别显示MAB529、KM3566、KM3567和KM3579。
[图5]它显示抗HB-EGF嵌合抗体表达载体pKANTEX3566的构建步骤。
[图6]它显示纯化的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的SDS-PAGE(使用5到20％的梯度凝胶)电泳图形。第1道显示分子量标志，第2和3道分别显示还原条件和非还原条件下的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966。
[图7]它通过流式细胞术显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对人实体癌细胞系的反应性。在图中，纵坐标显示细胞数量，横坐标显示荧光强度。
[图8]它通过流式细胞术显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对重组HB-EGF处理过的人实体癌细胞系的反应性。在图中，纵坐标显示细胞数量，横坐标显示荧光强度。
[图9]它显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对人HB-EGF的中和活性。在图中，纵坐标显示代表活细胞数量的OD 450nm处的吸光度值，横坐标显示抗体的浓度。■显示阴性对照抗体人IgG，□显示KM3966。HB-EGF(-)表示未添加HB-EGF，HB-EGF(+)表示添加了HB-EGF。
[图10]它显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对人实体癌细胞系的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)。在图中，纵坐标显示细胞毒性率(％)，横坐标显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的抗体浓度。横向直线显示在没有加入抗体时的细胞毒性。
[图11]它显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966在早期癌症模型中的抗肿瘤活性。在图中，纵坐标显示肿瘤体积，横坐标显示癌细胞移植后的天数。●显示PBS给药组，○显示10mg/kg KM3966给药组。棒表示标准偏差。
[图12]它显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966在晚期癌症模型中的抗肿瘤活性。在图中，纵坐标显示肿瘤体积，横坐标显示癌细胞移植后的天数。●显示PBS给药组，○显示10mg/kg KM3966给药组。棒表示标准偏差。
[图13]它通过流式细胞术显示抗HB-EGF小鼠抗体KM3566对人血癌细胞系的反应性。在图中，纵坐标显示细胞数量，横坐标显示荧光强度。“A”表示急性骨髓性白血病细胞系，“B”表示T细胞白血病细胞系。
[图14]它显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对人血癌细胞系的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)。在图中，纵坐标显示细胞毒性率(％)，横坐标显示抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的抗体浓度。横向直线显示在没有加入抗体时的细胞毒性。
[图15]它显示抗HB-EGF抗体对人卵巢癌细胞系MCAS的反应性。在图中，纵坐标显示细胞数量，横坐标显示荧光强度。
[图16]它显示抗HB-EGF抗体对人胃癌细胞系MKN-28的中和活性。在图中，纵坐标显示细胞增殖，横坐标显示添加的重组人HB-EGF和添加的抗HB-EGF抗体的蛋白浓度。
[图17]它显示抗HB-EGF人源化抗体对血液癌细胞系的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)的测量结果。纵坐标显示细胞毒性活性(％)，横坐标显示抗体浓度。保持稳定的实线显示了未加入抗体时的细胞毒性活性。
[图18]它显示抗HB-EGF单克隆抗体KM3566和KM3579以及嵌合抗体KM3966对突变HB-EGF表达细胞的反应性。在图中，纵坐标显示每种抗体的反应性(％)，横坐标显示突变HB-EGF的种类。
本发明的最佳实施方式
在本发明中，膜型HB-EGF是通过跨细胞膜结构域与细胞膜结合型HB-EGF，并由信号序列、前区、肝素结合结构域、EGF样结构域、近膜结构域和细胞质结构域构成。具体来说，它包括含有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽。此外，在本发明中，分泌型HB-EGF是含有EGF样结构域的细胞外结构域，其中膜型HB-EGF的膜结合区被蛋白酶等切开。具体来说，它包括含有SEQ ID NO：3显示的氨基酸序列的多肽。细胞膜结合型HB-EGF是其中分泌型HB-EGF通过其肝素结合活性、静电结合活性等与细胞膜的表面结合的HB-EGF。
与细胞膜上的分泌型HB-EGF结合的物质可以是任何物质，只要它能够结合细胞膜上的分泌型HB-EGF即可。具体来说，它包括多糖，优选为糖胺聚糖，更优选为硫酸乙酰肝素。
HB-EGF具有与白喉毒素或EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性。
膜型HB-EGF包括下面(a)、(b)和(c)等的蛋白：
(a)含有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的蛋白；
(b)由SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并具有与白喉毒素结合的活性的蛋白；
(c)由与SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列构成、并具有与白喉毒素结合的活性的蛋白。
此外，分泌型HB-EGF包括下面(a)、(b)和(c)等的蛋白：
(a)含有SEQ ID NO：3、4或5显示的氨基酸序列的蛋白；
(b)由SEQ ID NO：3、4或5显示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并具有与EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性的蛋白；
(c)由与SEQ ID NO：3、4或5显示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列构成、并具有与EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性的蛋白。
在本发明中，由SEQ ID NO：2、3、4或5任何一个显示的氨基酸序列中缺失、取代、***和/或添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并具有与白喉毒素或EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性的蛋白，是指通过例如将位点定向诱变引入所编码的蛋白具有SEQ ID NO：2、3、4或5任何一个显示的氨基酸序列的DNA中而获得的蛋白，其中位点定向诱变描述在《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning，SecondEdition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology(1987-1997))、Nucleic Acids Research，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad Sci.，USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、NucleicAcids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci USA，82，488(1985)等中。被缺失、取代、***和/或添加的氨基酸残基的数量是一个或多个，并且没有具体限制，但是它在通过已知的方法例如上面描述的位点定向诱变有可能进行缺失、取代、***或添加的范围内。适合的数量是1到几十个，优选为1到20个，更优选为1到10个，最优选为1到5个。
此外，与SEQ ID NO：2、3、4或5显示的氨基酸序列具有80％以上同源性、并具有与白喉毒素或EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性的蛋白，是与SEQ ID NO：2、3、4或5任何一个显示的氨基酸序列具有至少80％以上的同源性、优选85％以上的同源性、更优选90％以上的同源性、更优选95％以上的同源性、特别优选97％以上的同源性、最优选99％以上的同源性、并具有与白喉毒素或EGF受体ErbB1或ErbB4结合的活性的蛋白。
除非另有指明，否则本发明中描述的同源性数值可以是通过使用已知的同源性搜索程序计算出的已知数值。对于核苷酸序列来说，该数值可以通过在BLAST[J.Mol.Biol.，215，403(1990)]等中使用缺省参数来计算，对于氨基酸序列来说，该数值可以通过在BLAST2[NucleicAcids Res.，25，3389(1997)]、Genome Res.，7，649(1997)或http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html由使用缺省参数来计算。作为缺省参数，G(开放间隙的罚分(cost to opengap))对于核苷酸序列来说是5，对于氨基酸序列来说是11；-E(扩展间隙的罚分(cost to extend gap))对于核苷酸序列来说是2，对于氨基酸序列来说是1；-q(核苷酸错配的罚分(penalty for nucleotidemismatch))是-3；-r(核苷酸匹配的奖励(reward for nucleotide match))是1；-e(预期值(expect value))是10；-W(字长(wordsize))对于核苷酸序列来说是11个残基，对于氨基酸序列来说是3个残基；-y(blast延伸的减少(X)的位数(dropoff(X)for blast extensions in bits))对于blastn来说是20，对于blastn之外的程序来说是25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。此外，用于氨基酸序列的分析软件包括FASTA[Methods in Enzymology，183，63(1990)]等。
本发明的抗体包括与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合，并且能够与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF的表皮生长因子样结构域(EGF样结构域)结合的单克隆抗体。
EGF样结构域包括例如含有SEQ ID NO：4或5等显示的氨基酸序列的多肽。
与EGF样结构域结合的单克隆抗体包括抑制分泌型HB-EGF与HB-EGF受体结合的单克隆抗体。
抑制分泌型HB-EGF与HB-EGF受体结合的单克隆抗体，包括与分泌型HB-EGF与HB-EGF受体或白喉毒素等的结合区域结合的单克隆抗体。
本发明的抗体包括对分泌型HB-EGF具有中和活性的抗体。在本发明中，中和活性是抑制分泌型HB-EGF的生物学活性的活性，包括例如抑制表达HB-EGF受体的细胞的细胞生长的活性，等等。
本发明的抗体的例子包括，与含有具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽中第115位到147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位结合的单克隆抗体，优选与含有第133位到147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位结合的单克隆抗体，更优选与含有第115、122、124、125、127、129、133、135、141和147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位结合的单克隆抗体，更加优选与含有第133、135和147位氨基酸中的至少第133和135位氨基酸的表位结合的单克隆抗体，最优选与含有第133、135和147位氨基酸的表位结合的单克隆抗体，等等。
此外，本发明的抗体的例子包括与杂交瘤KM3566(FERMBP-10490)产生的单克隆抗体、杂交瘤KM3567(FERM BP-10573)产生的单克隆抗体或杂交瘤KM3579(FERM BP-10491)产生的单克隆抗体所结合的表位结合的单克隆抗体。
具有中和活性的抗体的例子包括与含有具有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的多肽中第133、135和147位氨基酸的表位结合的单克隆抗体。
单克隆抗体是由单一克隆的抗体产生细胞分泌的抗体，只识别一种表位(也称为抗原决定簇)，并具有统一的氨基酸序列(一级结构)。
本发明的单克隆抗体包括由杂交瘤产生的抗体、重组抗体等。
表位包括被单克隆抗体识别并结合的单一氨基酸序列、由氨基酸序列构成的构象结构、结合糖链的氨基酸序列、由结合糖链的氨基酸序列构成的构象结构等。
表位的例子包括含有SEQ ID NO：2显示的氨基酸序列的第115位到147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位，优选为含有序列号2显示的氨基酸序列的多肽中第133位到147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位，更优选为含有第115、122、124、125、127、129、133、135、141和147位氨基酸中的至少一个氨基酸的表位，更优选为含有第133、135和147位氨基酸中的至少第133和135位氨基酸的表位，最优选为含有第133、135和147位氨基酸的表位，等等序列号。
杂交瘤是产生具有所需免疫特异性的单克隆抗体的细胞，通过将用抗原免疫非人类哺乳动物所获得的B细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到。
重组抗体包括通过基因重组生产的抗体，例如人嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及其抗体片段。在重组抗体中，作为治疗剂，优选的是具有与单克隆抗体相同的特征、低免疫原性和延长的血液半衰期的重组抗体。
本发明的重组抗体的例子包括这样的重组抗体，其中抗体的VH的CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NO：12、13和14显示的氨基酸序列，抗体的VL的CDR1、CDR2和CDR3分别含有SEQ ID NO：15、16和17显示的氨基酸序列。
人嵌合抗体是含有非人类动物的抗体的VH和VL以及人抗体的重链恒定区(在后文中称为“CH”)和轻链恒定区(在后文中称为“CL”)的抗体。
本发明的人嵌合抗体可以如下产生。首先，从产生与细胞膜结合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF结合的单克隆抗体的杂交瘤获得编码VH和VL的cDNA。将所得到的cDNA***到用于动物细胞的、含有人抗体的CH和CL的编码基因的表达载体中，从而构建人嵌合抗体表达载体，将人嵌合抗体表达载体导入到动物细胞中从而表达人嵌合抗体，然后就可以生产人嵌合抗体。
对于人嵌合抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于人免疫球蛋白(在后文中称为“hIg”)即可，优选属于hIgG类别的，并且可以使用属于hIgG类别的任何一个亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人嵌合抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，并可以使用属于κ类别或λ类别的。
本发明的人嵌合抗体包括，例如，其中抗体的VH含有SEQ ID NO：9显示的氨基酸序列和抗体的VL含有SEQ ID NO：11显示的氨基酸序列的人嵌合抗体，人嵌合抗体KM3966等。
人源化抗体是其中源自非人类动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列被移植到人抗体的VH和VL的适当位置中的抗体，也被称为CDR移植抗体、重构抗体(reshaped-antibody)等。
本发明的人源化抗体可以如下产生。首先，构建编码V区的cDNA，其中源自于非人类动物的、与细胞膜结合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列，被移植到任何人抗体的VH和VL的构架中(在后文中称为“FR”)。将构建的cDNA分别***到用于动物细胞的、含有人抗体的CH和CL的编码基因的表达载体中，从而构建人源化抗体表达载体。接下来，将构建的人源化抗体表达载体导入到动物细胞中以表达人源化抗体，并可以生产人源化抗体。
对于人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列来说，可以使用任何氨基酸序列，只要它们分别是源自于人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列即可。例子包括在数据库例如蛋白数据库(Protein Data Bank)中登记的人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列、在例如美国卫生与人类服务部(Dept.Health and Human Services)的《免疫学重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(1991)中描述的人抗体的VH和VL的每个亚组FR的共有氨基酸序列，等等。
对于人源化抗体的CH来说，可以使用任何CH，只要它属于hIg即可，优选的是hIgG类别的，并可以使用属于hIgG类别的任何一个亚类，例如hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4。对于人CDR移植抗体的CL来说，可以使用任何CL，只要它属于hIg类别即可，并可以使用属于κ类别或λ类别的。
本发明的人源化抗体包括例如这样的人源化抗体，其中抗体的VH含有SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列或其中选自SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中的9位的Ala、20位的Val、30位的Thr、38位的Arg、41位的Pro、48位的Met、67位的Arg、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val的至少一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，和/或抗体的VL含有SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列或其中选自SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中的15位的Leu、19位的Ala、21位的Ile、49位的Pro和84位的Leu的至少一个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，等等。这些被导入的修饰的数量没有具体限制。
人源化抗体的例子显示如下。
例如，对于抗体的VH的氨基酸序列来说，例子包括：
人源化抗体，其中抗体的VH含有其中在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中20位的Val、30位的Thr、38位的Arg、48位的Met、67位的Arg、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列，优选抗体的VH含有其中20位的Val、30位的Thr、48位的Met、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；
优选的人源化抗体，其中抗体的VH含有其中30位的Thr、48位的Met、68位的Val、70位的Ile和95位的Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；
优选30位的Thr、48位的Met、68位的Val和70位的Ile被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；
优选的人源化抗体，其中抗体的VH含有其中30位的Thr、68位的Val、70位的Ile和95位的Tyr被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；
优选的人源化抗体，其中抗体的VH含有其中30位的Thr、68位的Val和70位的Ile被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；
优选的人源化抗体，其中抗体的VH含有其中30位的Thr和70位的Ile被其他氨基酸残基取代的氨基酸序列；等等。
通过上面的氨基酸修饰获得的抗体的VH的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中导入了至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val。
导入了11个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中进行下面修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val。
导入了10个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中进行下面修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等等。
导入了9个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，等等。
导入8个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，等等。
导入7个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile、Phe取代95位的Tyr和Leu取代118位的Val，等等。
导入6个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等等。
导入5个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，等等。
导入4个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Lys取代67位的Arg、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val、Leu取代70位的Ile和Leu取代118位的Val，等等。
导入3个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala、Arg取代30位的Thr和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val、Arg取代30位的Thr和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Lys取代38位的Arg和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Thr取代41位的Pro和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Ile取代48位的Met和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Lys取代67位的Arg和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr、Leu取代70位的Ile和Leu取代118位的Val，等等。
导入2个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Lys取代38位的Arg和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代41位的Pro和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Ile取代48位的Met和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Lys取代67位的Arg和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Ala取代68位的Val和Leu取代70位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代70位的Ile和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代70位的Ile和Leu取代118位的Val，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Thr取代9位的Ala和Arg取代30位的Thr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Leu取代20位的Val和Arg取代30位的Thr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Lys取代38位的Arg，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Thr取代41位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Ile取代48位的Met，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Lys取代67位的Arg，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Ala取代68位的Val，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Phe取代95位的Tyr，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Arg取代30位的Thr和Leu取代118位的Val，等等。
导入1个修饰的VH的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中
用Thr取代9位的Ala的氨基酸序列，
用Leu取代20位的Val的氨基酸序列，
用Arg取代30位的Thr的氨基酸序列，
用Lys取代38位的Arg的氨基酸序列，
用Thr取代41位的Pro的氨基酸序列，
用Ile取代48位的Met的氨基酸序列，
用Lys取代67位的Arg的氨基酸序列，
用Ala取代68位的Val的氨基酸序列，
用Leu取代70位的Ile的氨基酸序列，
用Phe取代95位的Tyr的氨基酸序列，以及
用Leu取代118位的Val的氨基酸序列。
抗体的VL包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中15位的Leu、19位的Ala、21位的Ile和84位的Leu被取代的氨基酸序列。
其中19位的Ala、21位的Ile和84位的Leu被取代的氨基酸序列是优选的。
通过上面的氨基酸修饰获得的氨基酸序列，包括在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中导入了至少一个修饰的氨基酸序列，所述修饰选自Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu。
其中导入5个修饰的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。
其中导入4个修饰的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。
其中导入3个修饰的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Met取代21位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Val取代19位的Ala和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Met取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Met取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala、Met取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Met取代21位的Ile、Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。
其中导入2个修饰的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu和Val取代19位的Ala，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu和Met取代21位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代15位的Leu和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala和Met取代21位的Ile，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Val取代19位的Ala和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Met取代21位的Ile和Ser取代49位的Pro，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Met取代21位的Ile和Val取代84位的Leu，
进行下面的修饰的氨基酸序列：Ser取代49位的Pro和Val取代84位的Leu，等等。
其中导入1个修饰的VL的氨基酸序列包括，例如，在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中
用Val取代15位的Leu的氨基酸序列，
用Val取代19位的Ala的氨基酸序列，
用Met取代21位的Ile的氨基酸序列，
用Ser取代49位的Pro的氨基酸序列，
用Val取代84位的Leu的氨基酸序列，等等。
本发明的人源化抗体的具体例子，包括其中可变区的H链包含SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列的人源化抗体；其中可变区的H链包含SEQ IDNO：22显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：43显示的氨基酸序列的人源化抗体；其中可变区的H链包含SEQ ID NO：42显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列的人源化抗体；其中可变区的H链包含SEQ ID NO：42显示的氨基酸序列和/或可变区的L链包含SEQ ID NO：43显示的氨基酸序列的人源化抗体；等等。
人抗体原来是人体中天然存在的抗体，但是它也包括从基于遗传工程、细胞工程和发育工程技术的最新进展制备的人抗体噬菌体文库或产生人抗体的转基因动物获得的抗体。人体中存在的抗体可以例如如下制备：分离人外周血淋巴细胞，通过用EB病毒等感染使其永生化，然后对它进行克隆，从而获得能够生产抗体的淋巴细胞，对这样获得的淋巴细胞进行培养，并从培养上清液中纯化抗体。人抗体噬菌体文库，是其中通过将从人B细胞制备的编码抗体的基因***到噬菌体基因中，而在噬菌体表面上表达抗体片段例如Fab和scFv的文库。表达具有所需抗原结合活性的抗体片段的噬菌体，可以利用它与固定有抗原的基质的结合活性作为指标，从文库中回收。抗体片段可以通过遗传工程技术进一步转变为含有两条完整的H链和两条完整的L链的人抗体分子。产生人抗体的转基因动物是其中人抗体基因被整合到细胞中的动物。具体来说，产生人抗体的转基因动物可以如下制备：将编码人抗体的基因导入到小鼠ES细胞中，将ES细胞移植到另一只小鼠的早期胚胎中，然后使其发育。人抗体可以从产生人抗体的转基因非人类动物如下制备：通过通常在非人类哺乳动物中进行的杂交瘤制备方法获得产生人抗体的杂交瘤，将获得的杂交瘤进行培养，并在培养上清液中形成和积累人抗体。
在构成上述的抗体或抗体片段的氨基酸序列中，其中一个或多个氨基酸被缺失、取代、***或添加、但仍与上述抗体或其抗体片段具有相似活性的抗体或其抗体片段，也包括在本发明的抗体或其抗体片段中。
被缺失、取代、***和/或添加的氨基酸数量是一个或多个，没有具体的限制，但是它在通过已知方法例如位点定向诱变有可能进行缺失、取代、或添加的范围内，位点定向诱变描述在《分子克隆》(第二版)(Molecular Cloning，Second Edition)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology(1987-1997))、Nucleic AcidsResearch，10，6487(1982)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，6409(1982)、Gene，34，315(1985)、Nucleic Acids Research，13，4431(1985)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，488(1985)等中。例如，数量为1到几十个，优选为1到20个，更优选为1到10个，最优选为1到5个。
上述抗体的氨基酸序列中“一个或多个氨基酸被缺失、取代、***或添加”的表述意义如下。即，它意味着在该序列和一个或多个氨基酸序列中的任选位置上，存在着一个或多个氨基酸的缺失、取代、***或添加。此外，缺失、取代、***或添加可以同时发生，被取代、***或添加的氨基酸可以是天然类型或非天然类型的。天然类型的氨基酸包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸等。
可互相取代的氨基酸的优选例子显示在下面。同样组中的氨基酸可以互相取代。
A组：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，O-甲基丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸
B组：天冬氨酸，谷氨酸，异天冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸
C组：天冬酰胺，谷氨酰胺
D组：赖氨酸，精氨酸，鸟氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸
E组：脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸
F组：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸
G组：苯丙氨酸，酪氨酸
本发明的抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、scFv、双抗体、dsFv、包含6个CDR的肽等。
Fab是通过用蛋白酶——木瓜蛋白酶处理IgG抗体分子获得的。这是具有大约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中在木瓜蛋白酶(在H链的224位切开氨基酸残基)获得的片段中，H链的大约一半N-端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。
本发明的Fab可以通过用蛋白酶——木瓜蛋白酶处理抗体来生产。此外，本发明的Fab也可以通过将编码抗体的Fab的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核细胞中以表达Fab来生产。
F(ab′)2是具有抗原结合活性的抗体片段，分子量为大约100,000，在用蛋白酶——胃蛋白酶(在H链的234位氨基酸残基处切开)处理IgG抗体而获得的片段中，比通过铰链区中的二硫键连接在一起的Fab略大。
本发明的F(ab′)2可以通过用蛋白酶——胃蛋白酶处理抗体来生产。此外，本发明的F(ab′)2也可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产。
Fab′是其中上述F(ab′)2的铰链区中的二硫键被切开后具有抗体结合活性的抗体片段，分子量为大约50,000。
本发明的Fab′可以通过F(ab′)2使用还原剂二硫苏糖醇来生产。此外，本发明的Fab′也可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′，来生产。
scFv是具有抗原结合活性的抗体片段，是VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其中使用了适当的肽接头(在后文中称为“P”)将一条VH链和一条VL链连接在一起。本发明的scFv可以通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将编码抗体的scFv的DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv，来进行生产。
双抗体是具有二价抗原结合活性的抗体片段，其中scFvs被二聚化。二价抗原结合可以是彼此相同或不同的。本发明的双抗体可以通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA使得P的氨基酸序列长度是8个残基以下，将DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双链抗体，来进行生产。
dsFv是通过将其中VH和VL中的各一个氨基酸残基用半胱氨酸残基取代的多肽，通过半胱氨酸残基之间的二硫键连接在一起而获得的。用半胱氨酸残基取代的氨基酸残基，可以按照Reiter等(ProteinEngineering，7，697-704(1994))所示的方法，根据抗体的三维结构评估进行选择。本发明的dsFv可以通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码dsFv的DNA，将DNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv，来进行生产。
含有本发明中使用的CDR的肽，可以通过构建与HB-EGF特异性结合的抗体的VH和VL的CDR的编码cDNA，将cDNA***到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达肽，来进行生产。含有CDR的肽也可以通过化学合成方法例如Fmoc法(芴基甲氧基羰基法)、tBoc法(叔丁氧基羰基法)等来生产。
在本发明中，可以使用其中放射性同位素、蛋白或药剂被结合到上述抗体或其抗体片段上的抗体衍生物。
本发明的抗体衍生物可以通过将药剂化学结合到与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的抗体或其抗体片段的H链或L链的N-端侧或C-端侧、抗体的适合的取代基或侧链、或抗体中的糖链上来生产[《抗体工程手册》(Antibody EngineeringHandbook)，Osamu Kanemitsu主编，Chijin Shokan出版(1994)]。
此外，抗体衍生物也可以如下通过遗传手法生产：将与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的抗体或其抗体片段的编码DNA与编码待结合药剂例如蛋白的其它DNA连接在一起，将DNA***到表达载体中，并将表达载体导入到宿主细胞中。
药剂包括化疗剂、治疗性抗体、免疫刺激剂、具有高分子量的药剂等。
蛋白包括细胞因子、生长因子、毒性蛋白等。
此外，待连接到抗体或其抗体片段上的药剂可以是药物前体的形式。本发明中的药物前体受到肿瘤环境中存在的酶的化学修饰、并被转化成具有损害肿瘤细胞的活性的物质的药剂。
化疗剂包括任何化疗剂，例如烷基化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗癌性抗生素物质、来源于植物的生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法药剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂复合物衍生物、M期抑制剂和激酶抑制剂。化疗剂的例子包括阿米福汀(Ethyol)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、氮芥(氮芥子气)、链脲佐菌素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(亚德里亚霉素)、多柔比星脂质体(Doxyl)、表柔比星、吉西他滨(Gemsal)、柔红霉素、柔红霉素脂质体(Daunozome)、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春花碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌氮芥、紫杉醇(泰素)、多烯紫衫醇(泰素帝)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉曲滨、喜树碱、CPT-11、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、5-氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、异环磷酰胺、伊达比星、美司那、伊立替康、盐酸拓扑替康、米托蒽醌、拓扑替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、米托坦、培门冬酶、戊制菌素、哌泊溴烷、链脲霉素、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、硫替哌、尿嘧啶氮芥、长春瑞宾、苯丁酸氦芥、氢化可的松、***龙、甲基***龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI 571)、埃罗替尼、Flt3抑制剂、血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(易瑞沙，特罗凯)、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安丫啶、全反式视黄酸、沙利度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢霉素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、***、孕激素物质、***物质、阿那曲唑(瑞宁得)、来普隆、阿司匹林、吲哚美辛、塞来考昔、硫唑嘌呤、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯吡胺、氯苯那敏、氯马斯汀、维A酸、蓓萨罗丁、砷、voltezomib、别嘌呤醇、吉妥单抗、替伊莫单抗、131托西莫单抗、塔革雷汀、ONTAK、奥唑米星、克拉霉素、甲酰四氢叶酸、异环磷酰胺、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明、氨甲蝶呤、maytansinoid及其衍生物等。
将化疗剂与抗体结合的方法包括其中化疗剂与抗体的氨基通过戊二醛结合的方法，其中化疗剂的氨基与抗体的羧基通过水溶性碳二亚胺连接的方法，等等。
治疗性抗体包括针对通过结合抗体诱导凋亡的抗原的抗体、针对参与肿瘤的病态形成例如肿瘤细胞的生长或转移的抗原的抗体、调节免疫功能的抗体、以及抑制病变部位中血管生成的抗体。
与抗体的结合诱导了凋亡的抗原包括分化簇(在后文中称为“CD”)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、II类人白细胞抗原(HLA)、EGFR，等等。
与肿瘤病理状况的形成相关或调节免疫功能的抗体的抗原包括CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3、B7-H4)、B7家族分子的配体(CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(TNF)受体家族分子(DR4、DR5、TNFR1、TNFR2)、诱导TNF相关的凋亡的配体受体(TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3、TRAIL-R4)、核因子κB配体(RANK)的受体激活剂、RANK配体、CD25、叶酸受体4、细胞因子[白介素-1α(后文中白介素称为“IL”)、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(TGF)β、TNFα，等等]、这些细胞因子的受体、趋化因子(SLC、ELC、I-309、TARC、MDC、CTACK等)以及这些趋化因子的受体。
在病变部位抑制血管生成的抗体的抗原包括血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素、成纤维细胞生长因子(FGF)、EGF、血小板衍生的生长因子(PDGF)、***(IGF)、***(EPO)、TGFβ、IL-8、ephilin、SDF-1等。
免疫刺激剂可以是任何被称为免疫佐剂的天然产物。增强免疫原的药剂的例子包括β(1→3)葡聚糖(香菇多糖，裂裥菌素)、α-半乳糖苷神经酰胺(KRN7000)、菌体粉末(picibanil，BCG)和菌体提取物(云芝多糖)。
具有高分子量的药剂包括聚乙二醇(在后文中称为“PEG”)、白蛋白、葡聚糖、聚氧乙烯、苯乙烯-马来酸共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过将这些具有高分子量的化合物与抗体或抗体片段结合，预期发生下列效应：(1)改进对抗多种化学、物理或生物因子的稳定性，(2)显著延长在血液中的半衰期，(3)免疫原性消失、抑制抗体生产等[生物结合药物，广川书店(1993)]。例如，PEG结合抗体的方法，包括使抗体与PEG修饰试剂进行反应的方法[生物结合药物，广川书店(1993)]。PEG修饰试剂包括赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(特开昭61-178926)、天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(特开昭56-23587)、精氨酸的胍基的修饰剂(特开平2-117920)等。
细胞因子或生长因子可以是任何细胞因子或生长因子，只要它增强了细胞例如NK细胞、巨噬细胞和嗜中性细胞即可。例子包括干扰素(在后文中称为“INF”)-α、INF-β、INF-γ、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。
毒性蛋白包括篦麻毒素、白喉毒素、ONTAK等，还包括在蛋白中导入突变以便控制毒性的毒性蛋白。
放射性同位素包括131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu、211At等。放射性同位素可以通过氯胺-T法直接与抗体相连。此外，也可以将螯合放射性同位素的物质与抗体结合。螯合剂包括甲基苯甲基二亚乙基-三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
在本发明中，用于本发明的抗体可以与一种或多种其他药剂组合给药，并也可以组合使用放射性辐照。其它的药剂包括上面描述的化疗剂、治疗性抗体、免疫刺激剂、细胞因子、生长因子等。
放射性辐照包括光子(电磁)辐照例如X-射线或γ-射线、粒子辐照例如电子束、质子束或重粒子束，等等。
在组合给药的方法中，药剂可以与本发明中使用的抗体同时给药，或者药剂可以在本发明中使用的抗体给药之前或之后给药。
下面将对本发明进行详细描述。
1.生产重组抗体组合物的方法
(1)抗原的制备
含有编码分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分长度(在后文中简称为分泌型HB-EGF)的cDNA的表达载体，被导入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中进行表达，以获得分泌型HB-EGF或分泌型HB-EGF的部分片段。此外，可以通过蛋白酶处理从表达HB-EGF的细胞纯化细胞外区域中的HB-EGF。分泌型HB-EGF能够从表达大量分泌型HB-EGF的多种人肿瘤培养细胞、人组织等中纯化。此外，可以制备具有分泌型HB-EGF的部分序列的合成的肽并用作抗原。
具体来说，在本发明中使用的分泌型HB-EGF可以通过例如将编码它的DNA在宿主细胞中表达来生产，使用在《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons(1987-1997)等中描述的方法如下进行。
首先，通过将全长cDNA***到适合的表达载体的启动子下游而产生重组载体。这时，如果需要，可以制备具有适当的长度、含有基于全长cDNA的多肽的编码区域的DNA片段，该DNA片段可以代替上述的全长cDNA使用。接下来，通过将重组载体导入适合表达载体的宿主细胞，可以获得产生HB-EGF的转化体。
宿主细胞可以是任何细胞，只要它能够表达目的基因即可，包括大肠杆菌、动物细胞等。
表达载体包括能够在供使用的宿主细胞中自主复制的载体，或者能够整合到含有适当启动子的染色体中使得编码分泌型HB-EGF的DNA能够被转录的位置的载体。
当使用原核生物例如大肠杆菌作为宿主细胞时，优选含有编码本发明中使用的HB-EGF的DNA的重组载体在原核生物中可以自主复制，并含有启动子、核糖体结合序列、在本发明中使用的DNA以及转录终止序列。重组载体还可以含有调控启动子的基因。
表达载体包括例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(都由RocheDiagnostics制造)、pKK233-2(Pharmacia制造)、pSE280(Invitrogen制造)、pGEMEX-1(Promega制造)、pQE-8(QIAGEN制造)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry，48，669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53，277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene制造)、pTrs30[从大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[从大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[从大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备，特开昭60-221091]、pGKA2[从大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)中制备，特开昭60-221091]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB 110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.，172，2392(1990)]、pGEX(Pharmacia制造)、pET***(Novagen制造)、pME18SFL3，等等。
任何启动子都可以使用，只要它能够在供使用的宿主细胞中起作用即可。例子包括源自于大肠杆菌、噬菌体等的启动子，例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子。此外，人工设计和修饰的启动子也可以使用，例如其中两个Ptrp串联连接的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子和letI启动子。
此外，上述的重组载体优选为质粒，其中作为核糖体结合序列的(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间的间距被调整到适当的距离(例如6到18个核苷酸)。在本发明所用的分泌型HB-EGF的编码DNA的核苷酸序列中，能够适当地安排核苷酸，以获得适合在宿主中表达的密码子，使得目的分泌型HB-EGF的生产率可以提高。此外，上述重组载体中的转录终止序列对于表达基因来说不是必需的。但是，优选将转录终止序列安排在紧邻结构基因的下游。
用作宿主细胞的原核生物包括属于大肠杆菌属的原核生物，例子包括大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49，等等。
任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是用于将DNA导入到上述的宿主细胞中的方法即可，例子包括在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)、Gene，17，107(1982)、Molecular & GeneralGenetics，168，111(1979)中描述的使用钙离子的方法，等等。
当动物细胞被用作宿主细胞时，表达载体包括例如pcDNAI、pcDM8(从Funakoshi获得)、pAGE107[特开平3-22979；Cytotechnology，3，133(1990)]、pAS3-3(特开平2-227075)、pCDM8[Nature，329，840，(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen制造)、pREP4(Invitrogen制造)、pAGE103[J.Biochemistry，101，1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3，等等。
任何启动子都可以使用，只要它能够在动物细胞中起作用即可。例子包括细胞肥大病毒(CMV)的IE(立即早期)基因的启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子等。此外，人CMV的IE基因的增强子可以与启动子一起使用。
宿主细胞包括人Namalwa细胞、猴COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、HST5637(特开昭63-299)，等等。
任何导入重组载体的方法都可以使用，只要它是用于将DNA导入到动物细胞中的方法即可，例子包括电穿孔[Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙方法(特开平2-227075)、脂转染方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，7413(1987)]，等等。
作为基因的表达方法，除了直接表达之外，还可以按照《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中的描述进行分泌生产、融合蛋白表达等。当在真核生物来源的细胞中进行表达时，可以获得添加有糖或糖链的分泌型HB-EGF。
在本发明中使用的分泌型HB-EGF可以通过将如此获得的转化体在培养基中进行培养以在培养基中形成和积累分泌型HB-EGF、并从培养物中回收它来生产。在培养基中培养转化体的方法按照在宿主培养中常用的方法来进行。
当用含有可诱导的启动子作为启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，如果需要，可以在培养基中加入诱导剂。例如，当对使用lac启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷等，或者当对使用trp启动子的重组载体转化的微生物进行培养时，可以在其中加入吲哚丙烯酸等。
当使用动物细胞作为宿主细胞获得的转化体进行培养时，培养基包括常用的RPMI 1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation，199，519(1967)]、Eagle的MEM培养基[Science，122，501(1952)]、Dulbecco修饰的MEM培养基[Virology，8，396(1959)]以及199培养基[Proceeding of the Society for Experimental Biology and Medicine，73，1(1950)]、添加了胎牛血清等的培养基，等等。培养一般在存在5％CO2的情况下，在pH 6到8和30到40℃下进行1到7天。如果必要，在培养过程中可以向培养基添加抗生素例如卡那霉素或青霉素。
因此，在本发明中使用的分泌型HB-EGF，可以通过按照通用的培养方法，对源自于微生物、动物细胞等的转化体进行培养，所述转化体包含其中***了本发明使用的分泌型HB-EGF的编码DNA的重组载体，从而形成和积累多肽，然后从培养液中回收分泌型HB-EGF，来进行生产。
对于基因的表达方法来说，除了直接表达之外，还可以按照《分子克隆实验指南》(第二版)(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述的方法进行分泌生产、融合蛋白表达等。
生产分泌型HB-EGF的方法包括在宿主细胞中进行细胞内表达的方法、从宿主细胞进行细胞外分泌的方法、在宿主细胞外膜上生产的方法，等等。适合的方法可以通过改变使用的宿主细胞和产生的分泌型HB-EGF的结构来选择。
当在宿主细胞中或宿主细胞外膜上生产分泌型HB-EGF时，按照Paulson等的方法[J.Biol.Chem.，264，17619(1989)]、Lowe等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，8227(1989)，Genes Develop.，4，1288(1990)]、特开平05-336963和WO94/23021中描述的方法等，可以将基因产物主动分泌到细胞外。
此外，按照特开平2-27075中描述的方法，利用使用二氢叶酸还原酶基因的基因扩增***，能够增加产量。分泌型HB-EGF可以例如如下所述从上述培养物中分离和纯化。当分泌型HB-EGF以溶解状态在细胞内表达时，细胞在培养后通过离心回收，悬浮在水性缓冲液中，然后使用超声波破碎器、French压力器、Manton Gaulin匀浆器、珠磨机等进行破碎，以获得无细胞的提取物。将无细胞的提取物进行离心以获得上清液，并通过对上清液使用通用的酶分离和纯化技术来获得纯化的制备物，这些技术例如溶剂抽提，使用硫酸铵等进行盐析，脱盐，用有机溶剂沉淀，使用树脂例如二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖凝胶、DIAION HPA-75(三菱化学社制造)进行阴离子交换层析，使用树脂例如S-琼脂糖凝胶FF(Pharmacia制造)进行阳离子交换层析，使用树脂例如丁基-琼脂糖凝胶或苯基-琼脂糖凝胶进行疏水层析，使用分子筛进行凝胶过滤，亲和层析，层析聚焦，电泳例如等点聚焦，等等，它们可以单独或组合使用。
当分泌型HB-EGF通过形成包含体在细胞内表达时，细胞以同样的方式回收、破碎和离心，分泌型HB-EGF的包含体作为沉淀级份被回收。将回收的蛋白包含体用蛋白变性剂进行溶解。通过对溶解的溶液进行稀释或透析，使蛋白成为正常的三维结构，然后通过与上述相同的分离纯化方法获得分泌型HB-EGF的纯化产品。
当分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化产物被分泌到细胞外时，可以从培养上清液中回收分泌型HB-EGF或衍生物例如糖基化产物。即，通过例如离心的方法、以与上述相同的方式来处理培养物，得到除去了固形物的培养上清液，从培养上清液中通过与上述相同的分离纯化方法，可以获得多肽的纯化产品。此外，在本发明中使用的分泌型HB-EGF可以通过化学合成法来生产，例如Fmoc(芴基甲氧基羰基)法或tBoc(叔丁氧基羰基)法。此外，可以使用由Advanced ChemTech、Perkin-Elmer、Pharmacia、Protein Technology Instrument、Synthecell-Vega、PerSeptive、岛津制作所等制造的肽合成仪来化学合成它。
(2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
使用上面制备的抗原免疫3到20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠，然后从动物的脾脏、***或外周血收集抗体产生细胞。此外，当在上述动物中发现由于低的免疫原性而导致足够的滴度增加时，可以使用HB-EGF敲除的小鼠作为供免疫的动物。
免疫通过给动物皮下、静脉内或腹膜内注射施用抗原连同适合的佐剂(例如完全弗氏佐剂，氢氧化铝凝胶与百日咳菌苗的组合等)来进行。当抗原是部分肽时，用载体蛋白例如BSA(牛血清白蛋白)、KLH(匙孔血蓝蛋白)等产生结合物，将其用作抗原。
在第一次施用后，每一周或每两周施用抗原，进行5到10次。在每次施用后的第三到第七天，从眼底收集血液样品，通过例如酶免疫分析[《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)]等测试血清与抗原的反应性。在其血清中显示出针对免疫抗原的足够的抗体滴度的小鼠、大鼠或仓鼠，被用作抗体产生细胞的供应源。
在抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的融合中，在最后施用抗原后的第三到第七天，摘出免疫接种的小鼠、大鼠或仓鼠的含有抗体产生细胞的组织例如脾脏，以收集抗体产生细胞。当使用脾脏细胞时，将切下来的脾脏置于MEM培养基中(日水制药社制造)，用镊子打散，并离心(1200rpm，5分钟)。然后，丢弃上清液，加入Tris-氯化铵缓冲液(pH 7.65)1到2分钟以除去红细胞。在用MEM培养基洗3次后，提供了用于融合的抗体产生细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
从小鼠获得的已建立的细胞系被用作骨髓瘤细胞。例子包括8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(源自于BALB/c小鼠)的骨髓瘤细胞系P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and Immunology，18，1-7(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology，6，511-519(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature，276，269-270(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology，123，1548-1550(1979)]、P3-X63-Ag8(X63)[Nature，256，495-497(1975)]，等等。将这些细胞系在8-氮杂鸟嘌呤培养基中传代培养[该培养基是将谷氨酰胺(1.5mM)、2-巯基乙醇(5×10-5M)、庆大霉素(10μg/ml)和胎牛血清(FCS)加入到RPMI-1640培养基(在后文中称为“正常培养基”)中，并再加入8-氮杂鸟嘌呤(15μg/ml)]，并且在细胞融合之前将它们在正常培养基中传代培养3或4天，以确保在进行融合的当天细胞数量达到2×107个以上。
(4)细胞融合
将上述的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞用MEM培养基或PBS(1.83g磷酸氢二钠，0.21g磷酸二氢钾，7.65g氯化钠，1升蒸馏水，pH 7.2)进行充分清洗和混合，使抗体产生细胞∶骨髓瘤细胞的比率＝5-10∶1，然后离心(1200rpm，5分钟)。然后丢弃上清液，将沉淀的细胞群充分打散。向108个抗体产生细胞中，在37℃、搅拌下加入2g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、2mL MEM和0.7mL二甲亚砜的混合物溶液0.2到1mL，每1或2分钟加入1到2mL MEM培养基数次，并加入MEM培养基使得总量为50mL。离心(900rpm，5分钟)后，将上清液丢弃，轻轻地将细胞打散，通过使用吸量管吹吸，将细胞轻柔地悬浮在100mL HAT培养基中[该培养基是添加了次黄嘌呤(10-4M)、胸腺嘧啶(1.5×10-5M)和氨基蝶呤(4×10-7M)的正常培养基]。将悬浮液以100μL/孔分配到96孔培养板上，在5％CO2的培养箱中在37℃培养7到14天。
培养后，将部分培养上清液作为样品，通过下面描述的结合分析方法筛选生产对所有的细胞膜结合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF均有反应性的单克隆抗体的杂交瘤或纯化的抗体。
然后，通过有限稀释方法将进行两次克隆[第一次使用HT培养基(除去了氨基蝶呤的HAT培养基)，第二次使用正常培养基]，选择显示出稳定的高抗体滴度的杂交瘤作为生产单克隆抗体的杂交瘤。
(5)单克隆抗体的制备
将在(4)中获得的产生抗HB-EGF单克隆抗体的杂交瘤细胞，以2×106到5×107个细胞/动物的剂量通过腹膜内注射施用于8到10周龄的降植烷处理过的小鼠或裸鼠中(0.5ml 2，6，10，14-四甲基十五烷(降植烷)腹膜内注射，然后饲养2周)。杂交瘤在10到21天内产生腹水肿瘤。从小鼠收集腹水液，离心(3,000rpm，5分钟)以除去固形物，用40到50％饱和的硫酸铵进行盐析，然后用辛酸沉淀，通过DEAE-琼脂糖凝胶柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱，收集IgG或IgM级份作为纯化的单克隆抗体。
抗体的亚类可以使用亚类分型试剂盒通过酶免疫分析来确定。蛋白的量可以通过Lowry方法或从280nm处的吸光度来测定。
(6)结合分析
导入了基因的细胞或通过(1)中的方法将含有本发明使用的HB-EGF的编码cDNA的表达载体导入到大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等中而获得的重组蛋白、或从人组织获得的纯化的HB-EGF或部分肽，被用作抗原。当抗原是部分肽时，使用载体蛋白例如BSA(牛血清白蛋白)或KLH(匙孔血蓝蛋白)制备结合物，并使用。
在这些抗原中，将其中细胞结合有分泌型HB-EGF和HB-EGF的细胞系分配到96孔板中并固相化，然后分配作为第一抗体的免疫动物的血清、产生单克隆抗体的杂交瘤的培养上清液、或纯化的抗体，并进行反应。在用PBS或PBS-0.05％Tween充分清洗后，分配作为第二抗体的用酶、化学发光物质、放射性物质等标记的抗免疫球蛋白抗体，并进行反应。在用PBS-Tween充分清洗后，根据第二抗体中的标记物质进行反应。
按照上面描述的方法，可以筛选出能够生产对所有的细胞膜结合型HB-EGF、分泌型HB-EGF和膜型HB-EGF具有反应性的单克隆抗体的杂交瘤或纯化的抗体。
在获得的单克隆抗体中，具有分泌型HB-EGF与HB-EGF受体的结合抑制活性的抗体，包括杂交瘤细胞系KM3566产生的单克隆抗体KM3566、杂交瘤细胞系KM3567产生的单克隆抗体KM3567，以及由杂交瘤KM3579产生的单克隆抗体。杂交瘤KM3579已经根据布达佩斯条约于平成18年1月24日作为FERM BP-10491保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
此外，能够与本发明的抗HB-EGF单克隆抗体竞争与HB-EGF的结合的单克隆抗体，可以通过向上述结合分析***加入待检测抗体、然后进行反应来获得。即，能够与获得的单克隆抗体竞争与HB-EGF的结合的抗体，可以通过筛选在加入待检测抗体时抑制了单克隆抗体的结合的抗体，来获得。
此外，其结合的表位与本发明的抗HB-EGF单克隆抗体所识别的表位相同的抗体，可以通过鉴定在上述结合分析中获得的抗体的表位，制备模拟表位的构象结构的部分合成肽、合成肽等，然后进行免疫，来获得。
(7)中和活性
此外，获得的单克隆抗体对分泌型HB-EGF是否具有中和活性，可以通过使用HB-EGF依赖性细胞进行细胞生长抑制分析来证实。
用于细胞生长抑制分析的细胞可以是任何细胞，只要该细胞具有能够与分泌型HB-EGF结合的受体即可。例子包括通过将EGF受体基因导入到小鼠骨髓衍生的细胞系32D clone 3(ATCC No.CRL-11346)等中获得的细胞系。
在使获得的单克隆抗体与分泌型HB-EGF在板上反应后，向其中加入上述的细胞系，然后进行培养。作为对照，将上述的细胞系同样加入到添加了分泌型HB-EGF但是没有加入单克隆抗体的板以及既没有加入分泌型HB-EGF也没有加入单克隆抗体的板中，然后进行培养。通过测量每个板上的细胞数量，可以测定细胞生长抑制比率。可以将具有高细胞生长抑制比率的单克隆抗体选作具有中和活性的单克隆抗体。
本发明中具有中和活性的单克隆抗体的例子包括由杂交瘤细胞系KM3566产生的单克隆抗体KM3566和由杂交瘤细胞系KM3567产生的单克隆抗体KM3567。杂交瘤细胞系KM3566和KM3567已经根据布达佩斯条约分别于平成18年1月24日和平成18年3月23日作为FERM BP-10490和FERM BP-10573保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6)。
2.重组抗体的制备
(1)表达人源化抗体的载体的构建
表达重组抗体的载体可以是任何用于动物细胞的表达载体，只要是***了编码人抗体的CH和/或CL的基因即可。表达人源化抗体的载体可以通过将每个编码人抗体的CH和CL的基因克隆到动物细胞表达载体中来构建。
人抗体的C区可以是任何人抗体的CH和CL。例子包括人抗体中H链的IgG1亚类的C区(在后文中称为“hCγ1”)、人抗体中L链的κ类的C区(在后文中称为“hCκ”)，等等。对于编码人抗体的CH和CL的基因来说，可以使用含有外显子和内含子或cDNA的染色体DNA，cDNA也可以使用。
对于动物细胞的表达载体来说，可以使用任何表达载体，只要其中能够***并表达编码人抗体的C区的基因即可。例子包括pAGE107[Cytotechnol.，3，133-140(1990)]、pAGE103[J.Biochem.，101，1307-1310(1987)]、pHSG274[Gene，27，223-232(1984)]、pKCR[Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，78，1527-1531(1981)]、pSG1βd2-4[Cytotechnol.，4，173-180(1990)]，等等。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的例子包括SV40早期启动子和增强子[J.Biochem.，101，1307-1310(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR启动子和增强子[Biochem.Biophys.Res.Commun.，149，960-968(1987)]、免疫球蛋白H链启动子[Cell，41，479-487(1985)]和增强子[Cell，33，717-728(1983)]，等等。
用于重组抗体表达的载体可以是抗体的H链和L链存在于分开的载体上的类型，或它们存在于同一个载体上的类型(在后文中称为“串联类型”)。对于构建用于人嵌合抗体和人源化抗体表达的载体的容易性、导入动物细胞的容易性、以及动物细胞中抗体H链和L链的表达量之间的平衡来说，串联类型的表达人源化抗体的载体是优选的[Journal of Immunological Methods，167，271-278(1994)]。串联类型的用于表达人源化抗体的载体的例子包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18[Hybridoma，17，559-567(1998)]，等等。
(2)非人类动物抗体V区的编码cDNA的获得及氨基酸序列分析
编码非人类动物抗体例如小鼠抗体的VH和VL的cDNA可以按照下面的方式获得。
从杂交瘤提取mRNA用于合成cDNA。将合成的cDNA克隆到载体例如噬菌体或质粒中以获得cDNA文库。通过使用编码小鼠抗体的C区和V区的cDNA作为探针，从文库中分离了各个含有编码VH的cDNA的重组噬菌体或重组质粒和含有编码VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。测定了重组噬菌体或重组质粒上目的小鼠抗体的VH和VL的全长核苷酸序列，并从核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列。
对于非人类动物来说，可以使用任何动物，只要能够从该动物制备杂交瘤细胞即可，例如小鼠、大鼠、仓鼠和兔子。从杂交瘤制备总RNA的方法包括硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods in Enzymology，154，3-28(1987)]，从总RNA制备mRNA的方法包括寡聚(dT)固定化的纤维素柱方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Lab.Press New York(1989)]，等等。用于从杂交瘤制备mRNA的试剂盒的例子包括Fast Track mRNA分离试剂盒(Invitrogen制造)和Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制造)，等等。
用于合成cDNA和制备cDNA文库的方法包括常规的方法[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Lab.Press New York(1989)，《分子生物学现代方法》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，附录1-34]，使用可商购试剂盒，例如用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScriptTM质粒***(GIBCO BRL制造)和ZAP-cDNA合成试剂盒(Stratagene制造)的方法，等等。
在cDNA文库制备中，对使用从杂交瘤提取的mRNA作为模板合成的cDNA进行整合的载体可以是任何载体，只要cDNA可以整合即可。适合的载体的例子包括ZAP Express[Strategies，5，58-61(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research，17，9494(1989)]、λZAPII(Stratagene制造)、λgt10、λgt11[《DNA克隆实用方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，I，49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech制造)、λExCell、pT7T3 18U(Pharmacia制造)、pcD2[Molecular &CellularBiology，3，280-289(1983)]、pUC18[Gene，33，103-119(1985)]，等等。
对于导入用噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌来说，可以使用任何大肠杆菌，只要cDNA文库可以被导入、表达和维持即可。例子包括XL1-Blue MRF′[Journal of Biotechnology，23，271-289(1992)]、C600[Genetics，59，177-190(1968)]、Y1088、Y1090[Science，222，778-782(1983)]、NM522[Journal of Molecular Biology，166，1-19(1983)]、K802[Journal of Molecular Biology，16，118-133(1966)]、JM105[Gene 38，275-276(1985)]，等等。
从cDNA文库中筛选编码非人类动物来源的抗体的VH和VL的cDNA克隆的方法包括使用同位素或荧光标记的探针进行菌落杂交或噬斑杂交[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press New York(1989)]。通过制备引物并使用cDNA或cDNA文库作为模板进行聚合酶链反应(在后文中称为“PCR”)[《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning，ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press New York(1989)，《分子生物学现代方法》(Current Protocols in MolecularBiology)，附录1-34]来制备编码VH和VL的cDNA，也是可能的。
通过上述方法筛选的cDNA的核苷酸序列可以如下确定：用适合的限制性酶切开cDNA，将片段克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)中，然后通过通用的核苷酸序列分析方法例如双脱氧方法[Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America，74，5463-5467(1977)]或通过使用核苷酸序列分析仪例如ABI PRISM 377 DNA测序仪(ABI制造)来分析序列。
从测定的核苷酸序列推导出VH和VL的全长氨基酸序列，并与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列进行比较[《免疫重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)]，由此可以证实获得的cDNA编码了完整含有包括分泌信号序列的抗体的VH和VL的氨基酸序列。将含有信号序列的抗体的VH和VL的全长氨基酸序列与已知抗体的VH和VL的全长氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)]进行比较，由此推导出信号序列的长度和N-末端氨基酸序列，并且可以知道它们所属的亚类。此外，VH和VL的每个CDR的氨基酸序列可以通过将其与已知抗体的VH和VL的每个CDR的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部(US Dept.Health and Human Service)(1991)]进行比较来发现。
通过使用VH和VL的全长氨基酸序列，使用任何数据库例如SWISS-PROT或PIR-Protein进行序列同源性搜索、例如BLAST方法[Journal of Molecular Biology，215，403-410(1990)]，可以研究序列的新颖性。
(3)人嵌合抗体表达载体的构建
将编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA，克隆到表达人源化抗体的载体中编码人抗体的CH和CL的基因上游，从而构建了人嵌合抗体表达载体，在所述表达人源化抗体的载体中按照本部分上面(2)-1中所述***了编码人抗体的CH和CL的DNA。例如，将每个编码非人类动物的抗体的VH和VL的cDNA，与含有非人类动物抗体的VH和VL的3′-末端的核苷酸序列和人抗体的CH和CL的5′-末端的核苷酸序列并在两端具有适当的限制性酶的识别序列的合成DNA进行连接和克隆，以便每个cDNA都以适当的形式在表达抗体的载体中编码人抗体的CH和CL的基因的上游表达，从而构建了人嵌合抗体表达载体，在所述表达抗体的载体中按照本部分上面(2)-1中所述***了编码人抗体的CH和CL的DNA。此外，使用含有编码非人类动物抗体的VH和VL的cDNA的质粒作为探针，使用在5’-末端具有适当的限制性酶的识别序列的引物，通过PCR扩增了编码VH和VL的cDNA，并将它们各克隆到本部分上面(2)-1中描述的表达人源化抗体的载体中编码CH和CL的基因的上游，以便它可以以适当的形式表达，从而构建了人嵌合抗体表达载体。
(4)人源化抗体(CDR移植抗体)的V区的编码cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNAs可以如下获得。首先，选择人抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列，在该序列中移植非人类动物的靶抗体的VH或VL中CDR的氨基酸序列。可以使用人抗体的VH或VL中FR的任何氨基酸序列，只要它们源自于人抗体即可。例子包括在数据库例如蛋白数据库(Protein Data Bank)中登记的人抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列、在人抗体的VH或VL中FR亚类共有的氨基酸序列[《免疫重要的蛋白序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)]，等等。其中，为了生产具有强活性的人源化抗体，优选选择与非人类动物的靶抗体的VH或VL中FR的氨基酸序列具有高度同源性(至少60％以上)的氨基酸序列。然后，将非人类动物的靶抗体的VH或VL中CDR的氨基酸序列分别移植到人抗体的VH或VL中FR的选定氨基酸序列中，以设计人源化抗体的VH或VL的每个氨基酸序列。通过考虑在抗体基因的核苷酸序列[《免疫重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)]中发现的密码子使用频率，将设计的氨基酸序列转化成DNA序列，并设计了编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。根据设计的DNA序列，合成几个长度大约150个核苷酸的合成DNA，使用它们进行PCR。在这种情况下，鉴于反应的效率和可以合成的DNA的长度，优选对于每个VH和VL设计4个合成的DNA。
此外，通过在两端上存在的合成的DNA的5’-末端引入适当的限制性酶的识别序列，可以将它容易地克隆到在本部分上述(2)-1中构建的用于人源化抗体的表达载体中。在PCR后，将每个扩增产物克隆到质粒例如pBluescript SK(-)(Stratagene制造)中，按照在本部分上述2(2)中描述的方法测定核苷酸序列，从而获得了具有所需人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的质粒。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的修饰
已经知道，当通过仅仅将非人类动物的靶抗体的VH和VL中的CDR简单地移植到人抗体的VH和VL的FR中来生产人源化抗体时，它的抗原结合活性比来自非人类动物的原始抗体的抗原结合活性低[BIO/TECHNOLOGY，9，266-271(1991)]。因此认为，不仅在CDR而且在FR中的几个氨基酸残基，与非人类动物的原始抗体的VH和VL中的抗原结合活性直接或间接相关，并且作为CDR移植的结果，这些氨基酸残基被改变成了人抗体的VH和VL中FR的不同氨基酸残基。为了在人源化抗体中解决这个问题，在人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中，鉴定了直接与结合抗原相关的氨基酸残基、或通过与CDR中的氨基酸残基相互作用或通过维持抗体的三维结构间接地与结合抗原相关的氨基酸残基，并将其修改成在非人类动物的原始抗体中发现的氨基酸残基，从而使已经降低的抗原结合活性增加[BIO/TECHNOLOGY，9，266-271(1991)]。在人源化抗体的生产中，最重要的是如何有效地鉴定FR中与抗原结合活性有关的氨基酸残基，以便通过X-射线晶体学[Journal of Molecular Biology，，112，535-542(1977)]、计算机模拟[Protein Engineering，7，1501-1507(1994)]等构建并分析抗体的三维结构。尽管抗体三维结构的信息在人源化抗体的生产中是有用的，但还没有建立起能够适用于任何抗体的生产人CDR移植抗体的方法。因此，现在必须需要进行各种不同的尝试，例如，生产每种抗体的几种修饰的抗体，并检验每种修饰的抗体与其抗体结合活性之间的相关性。
人抗体的VH和VL中FR的氨基酸序列的修改可以使用用于修饰的各种合成DNA，按照本部分上面2(4)中描述的PCR来进行。对于通过PCR获得的扩增产物来说，核苷酸序列按照本部分2(2)中描述的方法来测定，以便验证目的修饰是否已经发生。
(6)人源化抗体表达载体的构建
通过将在本部分上述2(4)和2(5)中描述的构建的人源化抗体的VH或VL的每个编码cDNA，克隆到在本部分上述2(1)中描述的用于表达抗体的载体中人抗体的CH或CL的每个编码基因的上游中，可以构建人源化抗体表达载体。例如，当在本部分上述2(4)和2(5)中构建人源化抗体的VH或VL中使用的合成DNA中，两端位置的合成DNA的5’-末端中引入适当的限制性酶的识别序列时，克隆能够进行，以便它们在本部分上述2(1)中描述的用于表达抗体的载体中，在编码人抗体的CH或CL的每个基因的上游中以适当的形式表达。
(7)重组抗体的瞬时表达
为了有效评估产生的多种人源化抗体的抗原结合活性，可以使用在本部分上述2(3)和2(6)中描述的人源化抗体表达载体或通过修改它而获得的表达载体来瞬时表达人源化抗体。任何细胞都可以用作导入表达载体的宿主细胞，只要宿主细胞能够表达人源化抗体即可。一般来说使用COS-7细胞(ATCC CRL1651)，因为它的表达量高[Methodsin Nucleic Acids Research，CRC Press，283(1991)]。将表达载体导入COS-7细胞的方法的例子包括DEAE-葡聚糖方法[Methods in NucleicAcids Research，CRC Press，283(1991)]、脂转染方法[Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，84，7413-7417(1987)]，等等。
导入表达载体之后，在培养上清液中人源化抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA[《抗体实验指南》(Antibodies：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory，第14章(1988)；《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，Academic Press Limited(1996)]等来测定。
(8)重组抗体的稳定表达
稳定表达人源化抗体的转化体细胞可以通过将本部分上述2(3)和2(6)中描述的人源化抗体表达载体导入到适合的宿主细胞中来获得。将表达载体导入宿主细胞的方法的例子包括电穿孔[Cytotechnology，3，133-140(1990)]等。对于其中导入人源化抗体表达载体的宿主细胞来说，可以使用任何细胞，只要它是能够表达人源化抗体的宿主细胞即可。例子包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(在后文中称为″dhfr″)缺陷的CHO细胞[Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America，77，4216-4220(1980)]、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，在后文中称为″YB2/0细胞″)，等等。
在导入表达载体之后，按照在特开平2-57891中公开的方法，通过在含有药剂例如G418硫酸化物(在后文中称为″G418″)等的用于动物细胞培养的培养基中进行培养，来筛选稳定地表达重组抗体的转化体。培养动物细胞的培养基的例子包括RPMI1640培养基(日水制药社制造)、GIT培养基(日本制药社制造)、EX-CELL301培养基(JRH制造)、IMDM培养基(GIBCO BRL)制造、杂交瘤-SFM培养基(GIBCOBRL制造)、通过在这些培养基中加入各种添加物例如FBS而获得的培养基，等等。通过将选出的转化体细胞在培养基中进行培养，重组抗体可以表达并积累在培养上清液中。培养上清液中重组抗体的表达量和抗原结合活性可以通过ELISA测定。此外，在转化体细胞中，可以按照特开平2-57891中公开的方法，通过使用DHFR扩增***等来增加重组抗体的表达量。
可以通过使用蛋白A柱，从转化体细胞的培养上清液中纯化重组抗体[《抗体实验指南》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，第8章(1988)；《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，Academic PressLimited(1996)]。除此之外，也可以使用任何用于蛋白纯化的其他常规方法。例如，人源化抗体可以通过凝胶过滤、离子交换层析、超滤等的组合来纯化。人源化抗体的H链或L链或完整抗体分子的分子量可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(在后文中称为″PAGE″)[Nature，227，680-685(1970)]、Western印迹[《抗体实验指南》(Antibodies：ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，第12章(1988)；《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies：Principles andPractice)，Academic Press Limited(1996)]等来测定。
(9)重组抗体与抗原的结合活性的评估
人源化抗体与抗原的结合活性可以按照上面的描述通过ELISA来评估。
3.抗体片段的制备
抗体片段可以在上面的第1和2部分中描述的抗体的基础上，按照遗传工程方法或蛋白质化学方法来制备。
遗传工程方法包括这样的方法，其中构建编码目的抗体片段的基因，并使用适当的宿主例如动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等进行表达并纯化。
蛋白质化学方法包括这样的方法，其中使用蛋白酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶进行部分特异性裂解、纯化等。
下面具体描述抗体片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′、scFv、双抗体、dsFv和包含6个CDR的肽的生产方法。
(1)Fab的制备
Fab可以使用蛋白质化学方法通过用蛋白酶——木瓜蛋白酶处理IgG来制备。在用木瓜蛋白酶处理后，如果原始抗体是对蛋白A具有结合性质的IgG亚类，则可以通过过蛋白A柱将IgG分子与Fc片段分离开，收集到均一的Fab[《单克隆抗体：原理和实践》(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)，第三版(1995)]。在对蛋白A没有结合活性的IgG亚类抗体的情况下，可以通过离子交换层析在低盐浓度下洗脱的级份中收集Fab[《单克隆抗体：原理和实践》(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)，第三版(1995)]。此外，Fab通常也可以通过遗传工程方法使用大肠杆菌来制备，并可以使用昆虫细胞、动物细胞等来制备。例如，将本部分2(2)、2(4)和(5)中提到的抗体的V区的编码DNA克隆到用于表达Fab的载体中，从而制备Fab表达载体。任何表达Fab的载体都可以使用，只要Fab的DNA可以被***和表达即可。例子包括pIT 106[Science，240，1041-1043(1988)]等。将Fab表达载体导入到适合的大肠杆菌中，从而在包含体或周质空间中生产和积累Fab。从包含体中，可以通过通常用于蛋白的重新折叠方法获得具有活性的Fab，而当在周质空间中表达时，具有活性的Fab泄漏到培养上清液中。在重新折叠后或从培养上清液中，可以使用结合抗原的柱子来纯化均一的Fab[《抗体工程实用指南》(Antibody Engineering，APractical Guide)，W.H.Freeman and Company(1992)]。
(2)F(ab′)2的制备
F(ab′)2可以使用蛋白质化学方法通过用蛋白酶胃——蛋白酶处理IgG来制备。在用胃蛋白酶处理后，按照与Fab相同的方式，通过纯化操作回收到均一的F(ab′)2[《单克隆抗体：原理和实践》(MonoclonalAntibodies：Principles and Practice)，第三版，Academic Press(1995)]。它也可以通过下面3(3)中提到的将Fab′用马来酰亚胺例如o-PDM或双马来酰亚胺处理以形成硫醚键的方法、或用DTNB[5，5′-二巯基双(2-硝基苯甲酸)]处理以形成S-S键的方法[《抗体工程实用方法》(AntibodyEngineering，A Practical Approach)，IRL Press(1996)]来制备。
(3)Fab′的制备
Fab′可以通过将上面3(2)中描述的F(ab′)2用还原剂例如二硫苏糖醇进行处理来制备。此外，Fab′也可以通过遗传工程的大肠杆菌来制备。此外，它也可以使用昆虫细胞、动物细胞等来制备。例如，将本部分2(2)、2(4)和(5)中提到的抗体的V区的编码DNA克隆到用于表达Fab′的载体中，从而制备Fab′表达载体。对于用于表达Fab′的载体来说，可以使用任何的载体，只要Fab′的DNA可以被***和表达即可。例子包括pAK19[Bio/Technology，10，163-167(1992)]等。将Fab′表达载体导入到适合的大肠杆菌中，从而在包含体或周质空间中生产和积累Fab′。从包含体中，可以通过通常用于蛋白的重新折叠方法获得具有活性的Fab′，当Fab′在周质空间中表达时，可以通过用例如溶菌酶部分消化、渗透压冲击和超声进行处理来破碎细胞，从而对其进行细胞外回收。在重新折叠后或从破碎细胞溶液中，可以使用蛋白G柱子等来纯化均一的Fab′[《抗体工程实用方法》(Antibody Engineering，A PracticalApproach)，IRL Press(1996)]。
(4)scFv的制备
scFv可以使用噬菌体、大肠杆菌、昆虫细胞、动物细胞等通过遗传工程方法来制备。例如，将2(2)、2(4)和2(5)中提到的抗体V区的编码DNA克隆到用于表达scFv的载体中，从而制备scFv表达载体。任何用于表达scFv的载体都可以使用，只要scFv的DNA可以被***和表达即可。例子包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA[HumanAntibodies & Hybridomas，5，48-56(1994)]等。当scFv表达载体被导入到适合的大肠杆菌中并用辅助噬菌体进行感染时，可以获得在噬菌体表面上以与噬菌体的表面蛋白融合的形式表达scFv的噬菌体。此外，scFv也可以在其中导入了scFv表达载体的大肠杆菌的周质空间或包含体中生产并积累。从包含体中，可以通过通常用于蛋白的重新折叠方法获得具有活性的scFv，当scFv在周质空间中表达时，可以通过用例如溶菌酶部分消化、渗透压冲击和超声进行处理来破碎细胞，对其进行细胞外回收。在重新折叠后或从破碎的细胞的溶液中，可以使用阳离子交换层析等来纯化均一的scFv[《抗体工程实用方法》(AntibodyEngineering，A Practical Approach)，IRL Press(1996)]。
(5)双抗体的制备
双抗体通常可以使用大肠杆菌或昆虫细胞、动物细胞等通过遗传工程方法来制备。例如，制备了其中连接了本部分2(2)、2(4)和2(5)中描述的抗体的VH和VL、致使由其接头编码的氨基酸残基是8个残基以下的DNA，并将其克隆到用于表达双抗体的载体中，从而制备双抗体表达载体。任何用于表达双抗体的载体都可以使用，只要双抗体的DNA可以被***和表达即可。例子包括pCANTAB5E(Pharmacia制造)、pHFA[Human Antibodies Hybridomas，5，48(1994)]等。双抗体可以在其中导入了双抗体表达载体的大肠杆菌的周质空间或包含体中生产并积累。从包含体中，可以通过通常用于蛋白的重新折叠方法获得具有活性的双抗体，当双链抗体在周质空间中表达时，可以通过用例如溶菌酶部分消化、渗透压冲击和超声进行处理来破碎细胞，对其进行细胞外回收。在重新折叠后或从破碎的细胞的溶液中，可以使用阳离子交换层析等来纯化均一的双抗体[《抗体工程实用方法》(AntibodyEngineering，A Practical Approach)，IRL Press(1996)]。
(6)dsFv的制备
dsFv通常可以使用大肠杆菌或昆虫细胞、动物细胞等通过遗传工程方法来制备。首先，将突变导入到本部分上述2(2)、2(4)和2(5)中提到的抗体的VH和VL的编码DNA的适当位置中，以制备其中被编码的氨基酸残基被半胱氨酸代替的DNA。将制备的每个DNA克隆到用于表达dsFv的载体中，从而制备VH和VL的表达载体。任何用于表达dsFv的载体都可以使用，只要dsFv的DNA可以被***和表达即可。例子包括pULI 9[Protein Engineering，7，697-704(1994)]等。将VH和VL的表达载体导入到适当的大肠杆菌中，dsFv在包含体或周质空间中形成并积累。将从包含体或周质空间获得VH或VL混合并进行通常用于蛋白的重新折叠方法，从而获得具有活性的dsFv。在重新折叠后，它可以通过离子交换层析、凝胶过滤等来进一步纯化[ProteinEngineering，7，697-704(1994)]。
(7)含有6个CDR的肽的制备
含有6个CDR的肽可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来制备。此外，制备含有CDR的肽的编码DNA，并将得到的DNA克隆到适合的表达载体中，由此可以制备含有CDR的肽的表达载体。对于表达载体来说，可以使用任何载体，只要编码含有CDR的肽的DNA可以***和表达即可。例子包括pLEX(由Invitrogen制造)、pAX4a+(由Invitrogen制造)等。将表达载体导入适合的大肠杆菌，在包含体或周质空间中形成并积累。从包含体或周质空间获得含有CDR的肽，并可以通过离子交换层析、凝胶过滤等进行纯化[ProteinEngineering，7，697(1994)]。
4.本发明中的药物和治疗剂
含有本发明的单克隆抗体作为活性成分的药剂可用于治疗各种与HB-EGF有关的疾病。
与HB-EGF有关的疾病包括癌症、心脏病、动脉粥样硬化等。癌症包括实体癌例如乳腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和卵巢生殖细胞肿瘤。此外，它包括伴随任何实体癌的由连续性转移、血行性转移或淋巴细胞性转移导致的转移癌、腹膜播散等。此外，它包括了其他癌症，例如源自于造血细胞的癌症(血液癌或血癌)，包括白血病(急性骨髓性白血病、T细胞性白血病等)、淋巴瘤、骨髓瘤等。
含有本发明的抗体或抗体片段作为活性成分的药剂，优选被供应成通过在制药技术领域中众所周知的适合的方法，将其与一种或多种可药用载体相混合而生产的药物制剂。
优选选择在治疗中最有效的给药途径。例子包括口服给药和肠胃外给药，例如颊、气管、直肠、皮下、肌肉内或静脉内给药。在抗体或肽制剂的情况下，优选静脉内给药。剂型包括喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、糖浆、乳剂、栓剂、注射剂、软膏、胶带剂等。
适合于经口给药的药物制剂包括乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂等。液体制剂例如乳剂和糖浆剂可以使用下述作为添加剂来生产：水，糖类如蔗糖、山梨糖醇和果糖，二醇例如聚乙二醇和丙二醇，油例如芝麻油、橄榄油和大豆油，抗菌剂例如对羟基苯甲酸酯，香料例如草莓香料和胡椒薄荷等。胶囊、片剂、散剂、颗粒剂等可以使用下述作为添加剂来生产：赋形剂例如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇，崩解剂例如淀粉和藻酸钠，润滑剂例如硬脂酸镁和滑石粉，粘合剂例如聚乙烯醇、羟丙基纤维素和明胶，表面活性剂例如脂肪酸酯，增塑剂例如甘油等。
适合肠胃外给药的药物制剂包括注射剂、栓剂、喷雾剂等。注射剂可以使用载体例如盐溶液、葡萄糖溶液或其二者的混合物来制备。栓剂可以使用载体例如可可脂、氢化脂肪或羧酸来制备。喷雾剂可以使用抗体或抗体片段本身、或将其与不刺激患者的口腔或气道粘膜并能通过将化合物分散成细小粒子而促进其吸收的载体一起使用来制备。载体包括乳糖、甘油等。根据抗体和载体的性质，生产药物制剂例如气溶胶或干粉是可能的。此外，成分例如用于经口制剂的添加剂也可以添加到肠胃外制剂中。
尽管给药的剂量或频率根据目标疗效、给药方法、治疗时间、年龄、体重等而变化，但它通常为每个成年人每天10μg/kg～30mg/kg。
下面将在实施例的基础上对本发明进行详细的解释；但是，实施例是对本发明的说明，本发明不限于这些实施例。
实施例1
抗HB-EGF单克隆抗体的制备：
(1)免疫原的制备
将R&D System制造的重组分泌型人HB-EGF冻干制剂(目录号259-HE/CF)溶解在Dulbecco磷酸盐缓冲液中(磷酸盐缓冲的盐水：PBS)，并用作免疫原。
(2)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
对HB-EGF缺陷小鼠[从大阪大学微生物疾病研究所细胞生物学部获得，PNAS，Vol.100，No.100，3221-3226(2003)]，施用在实施例1(1)中制备的25μg重组分泌型人HB-EGF、以及2mg氢氧化铝佐剂(《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，p.99，1988)和1×109个细胞的百日咳疫苗(千叶血清研究所)。在施用2周后，每周施用一次单独的25μg HB-EGF，共4次。从眼底的静脉丛部分收集血液，通过下面显示的酶免疫分析检测其血清抗体滴度，在最后免疫后3天，从显示出足够抗体滴度的小鼠摘出脾脏。将脾脏在MEM(最小必需培养基)培养基(日水制药社制造)中切成小片，使用一副镊子将细胞分开并离心(1,200rpm，5分钟)。将这样获得的沉淀级份用Tris-氯化铵缓冲液(pH 7.6)处理1到2分钟以除去红细胞。将这样获得的沉淀级份(细胞级份)用MEM清洗3次，并用于细胞融合。
(3)酶法免疫分析(结合ELISA)
将实施例1(1)中的重组人HB-EGF以0.5μg/ml和50μl/孔分配在用于ELISA的96孔板中(Greiner制造)，在4℃放置过夜进行吸附，并用于分析中。在洗板后，以50μl/孔向其中加入1％牛血清白蛋白(BSA)-PBS，在室温放置1小时以阻断剩余的活性基团。在将板放置之后，弃去1％BSA-PBS，将作为第一抗体的被免疫的小鼠的抗血清或杂交瘤培养上清液以50μl/孔分配到板中，放置2小时。在用0.05％聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯[(ICI商标Tween 20的相当品，由和光纯药社制造)]/PBS(在后文中称为“Tween-PBS”)洗板后，加入50μl/孔过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgGγ链(Kirkegarrd & PerryLaboratories制造)作为第二抗体，在室温放置1小时。在用Tween-PBS洗板后，加入ABTS[2，2-联氮基双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵]底物溶液[1mmol/l ABTS/0.1mol/l柠檬酸缓冲液(pH 4.2)，0.1％H2O2]进行显色，使用读板器(Emax；molecular Devices制造)测定OD 415nm的吸光度。
(4)小鼠骨髓瘤细胞的制备
将8-氮杂鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8U.1(P3-U1，从ATCC购买)培养在添加了10％胎牛血清的RPMI 1640中(Invitrogen制造)，确保在细胞融合的当天有2x107个以上的细胞，作为亲本细胞系用于细胞融合。
(5)杂交瘤的制备
将实施例1(2)中获得的小鼠脾细胞和实施例1(4)中获得的骨髓瘤细胞以10∶1的比率混合，然后离心(1,200rpm，5分钟)。将这样获得的沉淀级份的细胞群完全打散，在37℃下一边搅拌一边以每108个小鼠脾细胞0.5ml的量加入1g聚乙二醇-1000(PEG-1000)、1ml MEM培养基和0.35ml二甲基亚枫的混合溶液，以1到2分钟的时间间隔在悬浮液中数次加入1ml MEM培养基，然后通过加入MEM培养基将总体积调整到50ml。将悬浮液离心(900rpm，5分钟)，将如此获得的沉淀级份的细胞轻轻打散，然后通过用吸管轻柔地吹吸，将细胞悬浮在100ml HAT培养基中[通过将HAT培养基添加物(Invitrogen制造)加入到添加了10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中制备的培养基]。将悬浮液以200μl/孔分配到96孔培养板中，然后在5％CO2培养箱中在37℃培养10到14天。培养后，通过用实施例1(3)中描述的酶免疫吸附检测培养滤液，筛选出对重组人HB-EGF有反应的孔，将从中获得的细胞通过有限稀释方法重复克隆两次，从而建立了产生抗HB-EGF单克隆抗体的杂交瘤细胞系KM3566、KM3567和KM3579。
(6)单克隆抗体的纯化
将每个在实施例1(5)中获得的杂交瘤细胞系以5到20×106个细胞/动物的剂量腹膜内注射到降植烷处理的8周龄雌性裸鼠中。在此后的10到21天，从每只由于杂交瘤的腹水肿瘤而引起腹水液积累的小鼠中收集腹水液(1到8ml/动物)。将腹水液离心(3,000rpm，5分钟)以除去固形物。按照辛酸沉淀法(《抗体实验指南》(Antibodies-ALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)进行纯化以获得纯化的IgG单克隆抗体。每个单克隆抗体的亚类使用亚类分型试剂盒通过ELISA来确定。单克隆抗体KM3566的亚类是IgG 1，单克隆抗体KM3567的亚类是IgG1，单克隆抗体KM3579的亚类是IgG2b。
实施例2
抗HB-EGF单克隆抗体对HB-EGF的反应性：
(1)通过结合ELISA分析与HB-EGF的反应性
本实验按照实施例1(3)中显示的方法进行。将抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579的各种纯化抗体以及可商购的抗HB-EGF单克隆抗体MAB259(R&D制造)和阴性对照抗体KM511(抗G-CSF衍生物的单克隆抗体)，从10μg/ml开始通过5倍连续稀释进行逐级稀释，并用作第一抗体。结果显示在图1A中。
抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259中的每一种都与重组人HB-EGF反应，但是不与BSA反应。
(2)通过Western印迹分析与HB-EGF的反应性
每道20ng重组人HB-EGF(R&D制造)通过SDS聚丙烯酰胺电泳进行分级，电泳后将凝胶转移到PVDF膜上。在用10％BSA-PBS阻断膜后，使用10％BSA-PBS将抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579、MAB259的每种纯化抗体和阴性对照抗体KM511稀释到1μg/ml，将它们在室温反应2小时。在用Tween-PBS彻底清洗膜之后，将过氧化物酶标记的抗小鼠免疫球蛋白抗体(ZymedLaboratory制造)稀释，并在室温反应1小时。将膜用Tween-PBS彻底清洗，使用ECLTM Western印迹检测试剂(Amersham Pharmacia制造)来检测条带。
从每种抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259中都检测到了相当于重组分泌型人HB-EGF分子量的约15到30千道尔顿(在后文中称为“kDa”)的条带。
(3)抗HB-EGF单克隆抗体的HB-EGF-EGFR结合抑制活性的评估
使用32D/EGFR细胞和生物素标记的HB-EGF，检测抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的HB-EGF-EGFR结合抑制活性。
重组分泌型人HB-EGF以通常的方式使用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素(Pierce制造)进行生物素标记。
KM3566、KM3567、KM3579和MAB259各从10μg/ml开始通过5倍连续稀释进行逐级稀释，以50μl/孔分配到96孔板中。然后，以l×104细胞/50μl/孔分配32D/EGFR细胞。此外，生物素标记的HB-EGF和Alexa 647标记的链亲和素被稀释到最适的浓度，分别以10μl/孔和50μl/孔分配，在混合后，令混合物在暗处室温下反应3小时。使用8200细胞检测***(Applied Biosystems制造)，测定由633nm He/Ne激光辐照激发的650nm到685nm的波长。
结果显示在图1B中，所有的KM3566、KM3567、KM3579和MAB259抗体都浓度依赖性地抑制生物素化的HB-EGF与EGFR的结合。因此，发现所有抗HB-EGF单克隆抗体都抑制HB-EGF与EGFR的结合。
实施例3
抗HB-EGF单克隆抗体对HB-EGF的中和活性的检测：
通过使用HB-EGF依赖性细胞的细胞生长抑制分析，检测了抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的中和活性。将32D/EGFR用作HB-EGF依赖性细胞。将抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579和MAB259的每种纯化抗体和阴性对照抗体KM511，从20μg/ml开始以3到4倍的稀释率进行连续稀释，并以50μl/孔分配到96孔板中。接下来，以10μl/孔分配0.1μg/ml的重组人HB-EGF(R&D制造)，在混合后，将混合物在冰上反应2小时。然后，将32D/EGFR细胞以1×104细胞/40μl/孔的细胞数量接种，然后培养36小时。以10μl/孔的量加入活细胞测量试剂(Nacalai Tesque制造)，2小时后，使用读板器(Emax；Molecular Devices制造)测量OD 450nm的吸光度。
通过把只加入HB-EGF的孔的吸光度作为0％抑制率，没有加入HB-EGF和抗体的孔的吸光度作为100％抑制率，计算每个孔的细胞生长抑制率，结果显示在图2A中。结果，KM3566显示出对细胞系32D/EGFR的HB-EGF依赖性细胞生长抑制活性，与MAB259的水平相似。因此，发现了这两种抗体具有相似的HB-EGF中和活性水平。另一方面，因为KM3579不抑制细胞系32D/EGFR的生长，发现它不具有HB-EGF中和活性。
此外，以同样的方式进行的KM3567的中和活性的检测结果显示在图2B中。结果，尽管KM3567的活性与KM3566相比较弱，但它仍具有抑制HB-EGF依赖性细胞生长的活性。
实施例4
抗HB-EGF单克隆抗体对膜型HB-EGF的反应性的检测
将抗HB-EGF单克隆抗体KM3566、KM3567、KM3579、MAB259和阴性对照抗体KM511各用0.1％BSA-PBS稀释到多种浓度，加入到1到5x 105个细胞的人胃癌细胞系MKN-28(HSRRB JCRB 0253)、人卵巢癌细胞系ES-2(ATCC CRL-1978)或人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26)中，在混合后，将总体积调整到50μl。使这些细胞悬浮液每一种在冰上反应40分钟，然后用0.1％BSA-PBS洗3次。向细胞加入通过用0.1％BSA-PBS稀释制备的50μl FITC标记的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)多克隆抗体(Kirkegaard & PerryLaboratories制造)，使混合物在冰上反应40分钟。细胞用0.1％BSA-PBS清洗，然后悬浮在0.1％BSA-PBS中，并使用流式细胞仪(Coulter制造)测量荧光强度。
图3显示了平均荧光强度(MFI值)，其中每种上面提到的单克隆抗体从20μg/ml开始被稀释2倍，并与MKN-28和ES-2反应。图4显示了每种抗体反应性的直方图，其中将20μg/ml的每种上述单克隆抗体与人乳腺癌细胞系MDA-MB-231反应。结果，对于MKN-28来说，发现了KM3566和KM3579的结合活性。此外，在ES-2的情况下，发现结合活性的次序是KM3566＞KM3579。此外，在MDA-MB-231的情况下，发现结合活性的次序是KM3566＞KM3567≈KM3579。此外，在所有细胞中，MAB259的MFI值与阴性对照抗体KM511和未加入抗体的阴性对照相似，并且MAB259基本上不与细胞结合。从上述结果，发现单克隆抗体KM3566、KM3567和KM3579与癌细胞系的膜型和细胞膜结合型HB-EGF结合。
实施例5
编码抗HB-EGF单克隆抗体可变区的cDNA的分离和分析
(1)从产生抗HB-EGF单克隆抗体的杂交瘤细胞制备mRNA
从实施例1中描述的杂交瘤KM3566的5x107个杂交瘤细胞中，使用RNAeasy Maxi试剂盒(QIAGEN制造)和OligotexTM-dt30<super>mRNA纯化试剂盒(Takara制造)，并按照其随附的说明书制备了大于4.8μg mRNA。
(2)抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的H链和L链可变区的DNA克隆
使用BD SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒(BD Biosciences制造)，按照其随附的说明书，从实施例5(1)中获得的抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的1μg mRNA，获得了在5’末端具有试剂盒随附的BDSMART IITM A寡核苷酸序列的cDNA。使用该cDNA作为模板，使用试剂盒随附的通用引物Amix以及具有SEQ ID NO：6显示的核苷酸序列的小鼠Ig(γ)特异性引物进行PCR，扩增VH的cDNA片段。此外，通过使用具有SEQ ID NO：7显示的核苷酸序列的小鼠Ig(κ)特异性引物代替Ig(γ)特异性引物进行PCR，扩增VL的cDNA片段。在94℃加热5分钟后，通过5个由94℃30秒和72℃3分钟反应组成的循环，5个由94℃30秒、70℃30秒和72℃3分钟反应组成的循环，和30个由94℃30秒、68℃30秒和72℃3分钟反应组成的循环，然后在72℃反应10秒来进行PCR。PCR使用PTC-200DNA Engine(Bio-Rad制造)来进行。
为了克隆这样获得的PCR产物并确定它们的核苷酸序列，通过琼脂糖凝胶电泳将它们分离，并使用凝胶提取试剂盒(Gel Extraction Kit，QIAGEN制造)提取各具有大约600bp的H链和L链的PCR产物。使用Ligation High(东洋纺织社制造)将每个这样获得的提取片段连接到SmaI-消化的pBluescript II SK(-)载体中，然后通过Cohen等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]转化大肠杆菌菌株DH5α。使用自动质粒提取装置(KURABO制造)从获得的转化体中提取质粒，使用BigDye终止物循环测序FS快速反应试剂盒(BigDye Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit，PE Biosystems制造)、按照随附的说明书进行反应，然后使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析克隆到的PCR产物的核苷酸序列。结果，获得了含有完整长度的H链cDNA的质粒KM3566VH10G2和含有L链cDNA的质粒KM3566VL10K2，其中被认为是起始密码子的ATG序列存在于cDNA的5′末端中。
(3)抗HB-EGF单克隆抗体V区的氨基酸序列的分析
质粒KM3566VH10G2中包含的VH的完整核苷酸序列显示在SEQID NO：8中，从该序列推导的含有信号序列的VH的完整氨基酸序列显示在SEQ ID NO：9中，质粒KM3566VL10K2中包含的VL的完整核苷酸序列显示在SEQ ID NO：10中，从序列推导的含有信号序列的VL的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：11中。根据与小鼠抗体的已知序列数据[《免疫重要的蛋白的序列》(SEQUENCES of Proteins ofImmunological Interest)，美国卫生与人类服务部(1991)]的比较，和与使用蛋白测序仪(Shimadzu Corp.制造，PPSQ-10)分析纯化的抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的H链和L链的N-末端氨基酸序列的结果比较，发现分离到的相应cDNA是编码含有分泌信号序列的抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的全长cDNA，并且在SEQ ID NO：9显示的氨基酸序列中1到19位的氨基酸序列是H链的分泌信号序列，而在SEQ ID NO：11显示的氨基酸序列中1到20位的氨基酸序列是L链的分泌信号序列。
接下来，检测了抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的VH和VL的新颖性。使用GCG程序包(9.1版，Genetic Computer Group制造)作为序列分析***，通过BLASTP方法[Nucleic Acids Res.，25，3389(1997)]检索了现有的蛋白氨基酸序列数据库。结果，对于VH和VL没有发现完全一致的氨基酸序列，因此证实了抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的VH和VL具有新的氨基酸序列。
此外，通过与已知抗体的氨基酸序列进行比较，鉴定了抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的VH和VL的CDR。抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的VH的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQID NOs：12、13和14中，VL的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs：15、16和17中。
实施例6
抗HB-EGF嵌合抗体的制备：
(1)抗HB-EGF嵌合抗体表达载体pKANTEX3566的构建
使用在WO 97/10354中描述的人源化抗体表达载体pKANTEX93和实施例5(2)中获得的质粒KM3566VH10G2和KM3566VL10K2，通过下述的方法构建了抗HB-EGF嵌合抗体表达载体pKANTEX3566。
使用100ng质粒KM3566VH10G2作为模板，将总体积100μl的溶液，其由10μl 10×KOD缓冲液、10μl 2mmol/l dNTP、2μl 25mmol/l氯化镁、1μl 10μmol/l的每种具有SEQ ID NOs：18和19中描述的核苷酸序列的引物以及1μl KOD聚合酶(东洋纺织社制造)组成，在96℃加热3分钟，然后进行25个由94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟反应组成的循环，然后进一步在72℃反应8分钟。通过该反应，合成了编码KM3566的VH的cDNA，其含有用于***到pKANTEX93中的限制性酶识别序列。通过同样的方式，将总体积为100μl的溶液，其由作为模板的100ng质粒KM3566VL10K2、10μl 10×KOD缓冲液、10μl 2mmol/l dNTP、2μl 25mmol/l氯化镁、1μl 10μmol/l的每种具有SEQ ID NOs：20和21显示的核苷酸序列的引物以及1μl KOD聚合酶(东洋纺织社制造)组成，在96℃加热3分钟，然后进行25个由94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟反应组成的循环，然后进一步在72℃反应8分钟。通过该反应，合成了编码KM3566的VL的cDNA，其中含有用于***到pKANTEX93中的限制性酶识别序列。通过用乙醇沉淀，纯化和浓缩各PCR产物，并将其克隆到SmaI消化的pBluescriptII SK(-)中，获得了含有编码KM3566的VH的核苷酸序列的质粒pKM3566VH和含有编码KM3566的VL的核苷酸序列的质粒pKM3566VL。
接下来，在上面获得的每种载体pKANTEX93和pKM3566VL中加入限制性酶BsiWI(New England Biolabs制造)，在55℃反应1小时，然后向其中加入限制性酶EcoRI(Takara制造)，之后在37℃反应1小时。将该反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，然后使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN制造)回收大约12.8kb的pKANTEX93EcoRI-BsiWI片段和大约0.43kb的VL EcoRI-BsiWI片段。使用LigationHigh(东洋纺织社制造)按照随附的说明书将所获得的两个片段连接，使用这样获得的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。通过从转化体的克隆制备每种质粒DNA并通过限制性酶处理进行证实，获得了含有大约0.43kb的目的EcoRI-BsiWI片段的质粒pKANTEX3566VL。
接下来，在上面获得的每个pKANTEX3566VL和pKM3566VH中加入限制性酶ApaI(Takara制造)，在37℃反应1小时，然后向其中加入限制性酶NotI(New England Biolabs制造)，之后在37℃反应1小时。该反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳进行分级以回收ApaI-NotI片段，分别回收到了大约13.2kb的pKANTEX3566VL和大约0.47kb的VH。使用Ligation High(东洋纺织社制造)按照随附的说明书将这样获得的两个片段连接，使用这样获得的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α(东洋纺织社制造)。通过从转化体的克隆制备每种质粒DNA并通过限制性酶处理进行证实，获得了含有大约0.47kb的目的ApaI-NotI片段的质粒pKANTEX3566。对于质粒来说，使用BigDye终止物循环测序FS快速反应试剂盒(PE Biosystems制造)，按照随附的说明书进行反应后，使用同一公司的测序仪ABI PRISM 3700分析核苷酸序列。结果，获得了克隆有编码KM3566的VH的目的cDNA和编码其VL的cDNA的抗HB-EGF嵌合抗体表达载体pKANTEX3566。载体结构的示意图显示在图5中。
(2)抗HB-EGF嵌合抗体在动物细胞中的表达
使用在上面提到的(1)中获得的抗HB-EGF嵌合抗体表达载体pKANTEX3566，通过常用的方法[《抗体工程实用指南》(AntibodyEngineering，A Practical Guide)，W.H.Freeman and Company(1992)]将抗HB-EGF嵌合抗体表达在动物细胞中，获得产生抗HB-EGF嵌合抗体的转化体KM3966。
(3)纯化的嵌合抗体的制备
在通过通常培养方法对上面提到的(2)中获得的转化体KM3966进行培养后，将细胞悬浮液回收并在3,000rpm和4℃下离心10分钟，然后将如此回收的上清液通过孔径为0.22μm的Millex GV滤器(Millipore制造)进行过滤除菌。使用蛋白A高容量树脂(Protein AHigh-capacity resin，Millipore制造)柱，按照随附的说明书，从如此获得的培养上清液中纯化抗HB-EGF嵌合抗体KM3966。使用梯度凝胶(ATTO制造，E-T520L)按照随附的说明书通过SDS-PAGE证实了纯度和分子量。
结果显示在图6中。对于纯化的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的分子量来说，在非还原条件下发现是大约150到200kDa的单一条带，在还原条件下发现是大约50kDa和大约25kDa的两条条带。这些分子量与报道一致，在报道中指出，IgG类的抗体在非还原条件下具有大约150kDa的分子量，但是由于切开了分子间的S-S键，被降解成具有大约50kDa的分子量的H链和具有大约25kDa的分子量的L链[《抗体实验指南》(Antibodies-A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory，第14章(1988)，《单克隆抗体原理与应用》(MonoclonalAntibodies-Principals and Practice)，Academic Press Limited(1996)]。因此，证实了抗HB-EGF嵌合抗体KM3966被表达成具有正确结构的抗体分子。
实施例7
抗HB-EGF嵌合抗体的活性评估：
(1)对人实体癌细胞系的结合活性
为了评估在实施例6中获得的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的结合活性，以下面的方式通过荧光抗体技术对它进行了检测。
将人卵巢癌细胞系MCAS(JCRB 0240)、RMG-I(JCRB IF 050315)和ES-2(CRL 1978)、人乳腺癌细胞系MDA-MB-231(ATCC HTB-26)、T47D(HTB-133)、SK-BR-3(ATCC HTB-30)和ZR-75-1(ATCCCRL-1500)以及人胃癌细胞系MKN-28(HSRRB JCRB 0253)的每种细胞系用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离并用PBS清洗，然后以1～2×105细胞/50μl/孔分配到96孔U型底的板中(FALCON制造)。以50μl/孔分配用1％BSA-PBS制备到20μg/ml的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966溶液，然后使用板混合器搅拌，将板在冰上放置30分钟。在用PBS清洗两次后，以50μl/孔向其中加入稀释100倍的第二抗体FITC结合的AffinityPure F(ab′)2片段兔抗人IgG(H+L)(JacksonLaboratories制造)，然后使用板混合器搅拌，将板在暗处在冰上放置30分钟。在用PBS清洗两次后，使用流式细胞仪EPICS XL***II v.3.0(BECKMAN COULTER制造)测量荧光强度。使用抗FGF-8嵌合抗体KM3034(US 2004-0253234)作为阴性对照抗体。
结果显示在图7中。抗HB-EGF嵌合抗体KM3966与所有人实体癌细胞系的膜型和细胞膜结合型HB-EGF结合。
(2)测量抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对人HB-EGF的结合活性
为了分析小鼠抗体KM3566和嵌合抗体KM3966对人HB-EGF在反应动力学上的结合活性，使用Biacore进行结合活性测量。所有下面的操作都使用Biacore T-100(Biacore制造)来进行。通过胺偶联法，将使用HBS-EP缓冲液(Biacore制造)制备成5μg/ml的人HB-EGF(R&D制造)固定化在CM 5传感器芯片上(Biacore制造)，水平为80RU(共振单位)。然后，使每种从9nmol/l稀释5倍的抗体以10μl/分钟的速度在芯片上流动，通过分析每种浓度下的传感器图，计算每种抗体对人HB-EGF的结合速率常数和解离速率常数。
结果发现，在两种抗体的情况下，在抗体浓度范围内，抗体与人HB-EGF结合后几乎没有发现解离反应，使得解离速率常数不能计算。另一方面，结合速率常数可以计算，结果显示在表1中。根据结果，证实了这两种抗体对人HB-EGF具有几乎相同的结合活性。
表1
Figure BPA00001190018900741
(3)抗HB-EGF单克隆抗体对细胞膜结合型HB-EGF的反应性
将每种细胞系用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离并用PBS清洗，然后与RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制造)混合，并以300g离心5分钟，丢弃上清液。在细胞中加入1μg/ml用0.1％BSA-PBS稀释的重组人HB-EGF(R&D制造)，并允许在37℃反应10分钟。当不加入重组人HB-EGF时，仅加入0.1％BSA-PBS，并以同样的方式允许在37℃反应10分钟。在用1％BSA-PBS清洗两次后，以50μl/孔分配用1％BSA-PBS制备成10μg/ml的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966溶液，然后使用板混合器搅拌，将板在冰上放置30分钟。在用PBS清洗两次后，以50μl/孔向其中加入稀释100倍的第二抗体FITC结合的AffinityPure F(ab′)2片段兔抗人IgG(H+L)(JacksonLaboratories制造)，然后使用板混合器搅拌，将板在暗处在冰上放置30分钟。在用PBS清洗两次后，使用流式细胞仪EPICS XL***II v.3.0(BECKMAN COULTER制造)测量荧光强度。使用抗FGF-8嵌合抗体KM3034(US 2004-0253234)作为阴性对照抗体。
结果，在所有的细胞系中，与未处理的细胞相比，在用重组HB-EGF处理的细胞中抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的反应性增加(图8)。因此，发现了本发明的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966与膜型和细胞膜结合型HB-EGF都结合。
(4)对人实体癌细胞系的中和活性
为了评估在实施例6中获得的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的HB-EGF中和活性，测量了HB-EGF依赖性细胞生长的抑制。对于HB-EGF依赖性细胞来说，使用了HB-EGF阳性的人卵巢癌细胞系RMG-I(JCRB IF 050315)和人胃癌细胞系MKN-28(HSRRB JCRB)。
将每种细胞系用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离并用PBS清洗，然后与RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制造)(无血清)混合，并以300g离心5分钟，丢弃上清液。在将细胞悬浮于同样的培养基中之后，分别以2.5x 103细胞/50μl/孔和1x 104细胞/50μl/孔将RMG-I和MKN-28接种到96孔板中。加入用0.1％BSA-PBS稀释的重组人HB-EGF(R&D制造)，在RMG-I的情况下为份额50μl/孔和浓度3ng/ml，在MKN-28的情况下为份额50μl/孔和浓度30ng/ml，然后将抗HB-EGF嵌合抗体KM3966从30μg/ml开始通过4个连续步骤稀释10倍，以50μl/孔的份额加入，然后混合。使用人IgG(三菱制药社制造)作为阴性对照抗体。在37℃培养72小时后，以15μl/孔加入活细胞测量试剂WST-1(Nacalai Tesque制造)，在2小时后，使用读板器(Emax；Molecular Devices制造)测量在OD 450nm的吸光度。
结果显示在图9中。RMG-I和MKN-28二者都显示出由于加入HB-EGF引起的细胞生长，并显示出HB-EGF依赖性的细胞生长。抗HB-EGF嵌合抗体KM3966以抗体浓度依赖性方式抑制了HB-EGF依赖性细胞生长，因此显示出中和活性。
(5)抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)
按照下面显示的方法测定了在实施例6中获得的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的ADCC活性。
(5)-1靶细胞溶液的制备
将每种人卵巢癌细胞系MCAS、RMG-I和ES-2，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、T47D、SK-BR-3和ZR-75-1以及人胃癌细胞株MKN-28用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，并用含有1％FCS(JRH制造)且不含酚红的RPMI 1640培养基(Invitrogen制造)(在后文中称为ADCC培养基)清洗，然后使用同样的培养基调整到最适浓度，用作靶细胞溶液。
(5)-2效应细胞溶液的制备
通过下面显示的方法从健康人的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)。使用含有少量肝素钠注射液N″Shimizu″(清水制药社制造)的注射器，从健康人收集50ml外周血。加入同样体积的生理盐水(制造商的名称)将如此收集到的外周血稀释，然后彻底搅拌。在容量为15ml的试管(Greiner制造)中分配大约6.5ml Polymorphprep(NYCOMED制造)，将同样体积的稀释外周血轻轻覆盖在其上，在室温下以800G离心30分钟，分离单核细胞层。在用ADCC培养基清洗两次后，使用同样的培养基将其制备成最适的浓度，并用作效应细胞溶液。
(5)-3ADCC活性的测定
将抗体稀释溶液以50μl的份额分配到96孔U型底的板的孔中，向其中加入50μl在(4)-1中制备的靶细胞溶液和50μl在(4)-2中制备的效应细胞溶液(效应细胞(E)与靶细胞(T)的比率设置到25)，将总体积调整到150μl，反应在37℃进行4小时。通过加入50μl靶细胞溶液和100μl培养基获得了靶细胞自发游离的值，通过加入50μl靶细胞溶液、50μl效应细胞溶液和50μl培养基获得了靶细胞和效应细胞自发游离的值。通过加入50μl靶细胞溶液和80μl培养基、并在反应完成前45分钟加入20μl 9％Triton X-100溶液，获得了靶细胞总游离的值。在反应后，将板离心，通过使用LDH-细胞毒性测试(Wako制造)，按照随附的说明书测量吸光度来检测上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。ADCC活性通过下式计算。
(式)
ADCC活性(％)＝([样品的吸光度]-[靶细胞和效应细胞自发游离的吸光度])/([靶细胞总游离的吸光度]-[靶细胞自发游离的吸光度]x100
结果显示在图10中。抗HB-EGF嵌合抗体KM3966显示出对HB-EGF阳性的人实体癌细胞系的抗体依赖性细胞毒性。
(6)使用小鼠异种移植物评估抗肿瘤活性
为了评估在实施例6中获得的抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的抗肿瘤活性，使用了人卵巢癌和人乳腺癌的小鼠异种移植物早期癌症模型和晚期癌症模型进行评估。
(6)-1通过早期癌症模型评估
将人卵巢癌细胞系MCAS和ES-2每种用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，并用PBS清洗，向其中加入RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制造)，然后以300G离心5分钟，弃去上清液。加入同样的培养基通过离心操作清洗细胞并制备成最适的浓度，将100μl这样制备的细胞悬浮液皮下移植到每只8周龄雌性SCID小鼠(日本CLEA制造)的右肋下。从当天开始，对于抗体施用组来说从尾静脉施用100μl用PBS稀释的抗体溶液，或者在对照组的情况下只施用PBS(每组5到7只动物)。施用每周进行2次，总共8次，从发现肿瘤的时间开始，使用游标卡尺测量肿瘤的直径。肿瘤的体积通过下式计算。
(式)
肿瘤体积(mm3)＝长度x宽度2x0.5
结果显示在图11中。抗HB-EGF嵌合抗体KM3966显著抑制卵巢癌细胞系MCAS和ES-2的肿瘤生长。因此，发现抗HB-EGF嵌合抗体KM3966在早期癌症模型中具有抗肿瘤效应。
(6)-2通过晚期癌症模型进行的评估
将人卵巢癌细胞系MCAS和ES-2以及人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的每一种用0.02％-EDTA溶液(Nacalai Tesque制造)剥离，并用PBS清洗，然后向其中加入RPMI 1640培养基(GIBCO-BRL制造)，然后以300G离心5分钟，弃去上清液。加入同样的培养基后，通过离心清洗细胞，然后制备成最适的浓度，将100μl这样制备的细胞悬浮液皮下移植到每只6-8周龄的雌性SCID小鼠(日本CLEA制造)的右腋窝。通过观察发展，选择出肿瘤体积变为大约100mm3的小鼠，对它们进行分组，分组的方式使得相应的组中的平均肿瘤体积变成相似的水平。从当天开始，对于抗体施用组来说从尾静脉施用100μl用PBS稀释的抗体溶液，或者在对照组的情况下只施用PBS(每组6到7只动物)。施用每周进行2次，总共8次，从施用抗体时间开始使用游标卡尺测量肿瘤的直径。肿瘤的体积通过下式计算。
(式)
肿瘤体积(mm3)＝长度x宽度2x0.5
结果显示在图12中。结果是，抗HB-EGF嵌合抗体KM3966显著抑制卵巢癌细胞系MCAS和ES-2以及乳腺癌细胞系MDA-MB 231的肿瘤生长。因此，发现抗HB-EGF嵌合抗体KM3966在晚期癌症模型中具有抗肿瘤活性。
实施例8
抗HB-EGF抗体对人血液癌细胞系的反应性和抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)的评估
(1)人血液癌细胞系中的HB-EGF表达分析
为了评估HB-EGF在人血液癌细胞系中的表达，通过荧光抗体技术对其进行了检测。将人急性骨髓性白血病细胞系ML-1(DSMZ ACC464)、MOLM-13(DSMZ ACC 554)、MV-4-11(ATCC CRL 9591)、HL-60(ATCC CRL-240)、NB-4(DSMZ ACC 207)和KG-1a(ATCC CCL-246.1)以及人T细胞白血病细胞系Karpas 299(DSMZ ACC 31)和Jurkat(RCB RCB 0806)各用PBS清洗，制备成最适浓度，然后以50μl/孔(大约2×105个细胞)分配到96孔U型底的板中(FALCON制造)。以50μl/孔分配用1％BSA-PBS制备成20μg/ml的抗HB-EGF小鼠抗体KM3566溶液，然后使用板混合器进行搅拌，并将板在冰上放置30分钟。在用PBS清洗两次后，向其中加入稀释50倍的第二抗体抗小鼠Igs/FITC山羊F(ab′)2(DAKO制造)50μl/孔，然后使用板混合器进行搅拌，并将板在暗处在冰放置30分钟。在用PBS清洗两次后，使用流式细胞仪EPICS XL***II v.3.0(BECKMAN COULTER制造)测量荧光强度。使用小鼠IgG1(DAKO制造)作为阴性对照抗体。
结果显示在图13中。KM3566与T细胞白血病和急性骨髓性白血病细胞系特异性结合。因此，证实了HB-EGF在人血液癌细胞系中表达。
(2)抗HB-EGF嵌合抗体对人血液癌细胞系的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC活性)
通过下面显示的方法测定了抗HB-EGF嵌合抗体KM3966对其中证实了HB-EGF表达的急性骨髓性白血病细胞系的ADCC活性。
(2)-1靶细胞溶液的制备
将人急性骨髓性白血病细胞系ML-1、MOLM-13、MV-4-11、HL-60、NB-4和KG-1a各用PBS清洗，用ADCC培养基清洗，然后使用同样的培养基制备成最适的浓度，用作靶细胞溶液。
(2)-2效应细胞溶液的制备
通过下面显示的方法，从健康人的外周血分离了外周血单核细胞(PBMC)。使用含有少量肝素钠注射液N″Shimizu″(清水制药社制造)的注射器从健康人收集50ml外周血。通过加入同样体积的生理盐水(大塚制药制造)将收集到的外周血稀释，然后彻底搅拌。在容量为15ml的试管(Greiner制造)中分配大约6.5ml Polymorphprep(NYCOMED制造)，将同样体积的稀释外周血轻轻覆盖在其上，然后在室温下以800G离心30分钟以分离单核细胞层。在用ADCC培养基清洗两次后，使用同样的培养基将其调整到最适的浓度，并用作效应细胞溶液。
(2)-3ADCC活性的测定
将抗体稀释溶液以50μl分配到96孔U型底的板(FALCON制造)的孔中，在其中加入50μl在(2)-1中制备的靶细胞溶液和50μl在(2)-2中制备的效应细胞溶液(效应细胞(E)与靶细胞(T)的比率设置为25)，将总体积调整到150μl，反应在37℃进行4小时。通过加入50μl靶细胞溶液和100μl培养基获得了靶细胞自发游离的值，通过加入50μl靶细胞溶液、50μl效应细胞溶液和50μl培养基获得了靶细胞和效应细胞自发游离的值。通过加入50μl靶细胞溶液和80μl培养基、并在反应完成前45分钟加入20μl 9％Triton X-100溶液，获得了靶细胞总游离的值。在反应后，将板离心，通过使用LDH-细胞毒性测试(Wako制造)，按照随附的说明书测量吸光度来检测上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。ADCC活性通过下式计算。
(式)
ADCC活性(％)＝([样品的吸光度]-[靶细胞和效应细胞自发游离的吸光度])/([靶细胞总游离的吸光度]-[靶细胞自发游离的吸光度]x 100
结果显示在图14中。抗HB-EGF嵌合抗体KM3966显示出对HB-EGF阳性的人血液癌细胞系的抗体依赖性细胞毒性。因此表明，有可能本发明的抗HB-EGF单克隆抗体和重组抗体不仅对实体癌例如表达HB-EGF的卵巢癌、而且对血液癌例如急性骨髓性白血病和T细胞白血病都有效。
实施例9
抗HB-EGF人源化抗体的制备
(1)设计抗HB-EGF人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列
首先，如下设计抗HB-EGF人源化抗体的VH的氨基酸序列。
为了移植SEQ ID NOs：12到14中分别显示的抗体VH的CDR1到3的氨基酸序列，选择了人抗体的VH的FR氨基酸序列。Kabat等已经根据氨基酸序列的同源性将多种已知人抗体的VH分成三个亚类(HSG I到III)，并进一步报道了相应亚类间的共有序列(《免疫学重要的蛋白序列》(SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部，1991)。因为这些保守序列有在人类中降低免疫原性的可能性，因此决定在这些保守序列的基础上设计抗HB-EGF人源化抗体的VH的氨基酸序列。为了在设计时制备具有更高结合活性的抗HB-EGF人源化抗体，决定在三个亚类的人抗体的VH的共有序列的FR氨基酸序列中，选择与抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的VH的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基酸序列。
作为同源性检索的结果，HSG I、HSG II和HSG III的同源性分别为73.6％、50.6％和56.3％。因此，KM3566的VH区的FR的氨基酸序列与亚类I具有最高的同源性。
基于上面的结果，将抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的VH的CDR氨基酸序列移植到人抗体的VH的亚类I的共有序列的FR氨基酸序列的适当位置中。但是，尽管在SEQ ID NO：9中描述的KM3566的VH氨基酸序列中，74位Lys在人抗体FR氨基酸序列的相应区中不是Kabat等所述的具有最高使用频率的氨基酸残基，但它也是以相对高频率使用的氨基酸残基，因此决定使用在KM3566的氨基酸序列中发现的上面描述的氨基酸残基。因而设计了SEQ ID NO：22中显示的抗HB-EGF人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0。
接下来，如下设计了抗HB-EGF人源化抗体的VL的氨基酸序列。
为了移植SEQ ID NOs：15到17中分别显示的抗体VL的CDR1到3的氨基酸序列，选择了人抗体的VL的FR氨基酸序列。Kabat等已经根据氨基酸序列的同源性将多种已知人抗体的VL分成四个亚类(HSG I到IV)，然后报道了相应亚类间的共有序列(《免疫学重要的蛋白序列》(SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部，1991)。因此，与VH的情况类似，从人抗体的四个亚类的VL的共有序列的FR氨基酸序列中，选择了与抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的VL的FR氨基酸序列具有最高同源性的FR氨基酸序列。
作为同源性检索的结果，HSG I、HSG II、HSG III和HSG IV的同源性分别为75.0％、75.9％、71.3％和81.3％。因此，KM3566的VL区的FR的氨基酸序列与亚类IV具有最高的同源性。
基于上面的结果，将抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的VL的CDR氨基酸序列移植到人抗体的VL的亚类IV的共有序列的FR氨基酸序列的适当位置中。但是，尽管在SEQ ID NO：11中描述的KM3566的VL氨基酸序列中，110位Leu在人抗体FR氨基酸序列的相应区中不是Kabat等所述的具有最高使用频率的氨基酸残基，但它是以相对高频率使用的氨基酸残基，因此决定使用在KM3566的氨基酸序列中发现的上面描述的氨基酸残基。因而设计了SEQ ID NO：23中显示的抗HB-EGF人源化抗体的VL的氨基酸序列LV0。
这样设计的抗HB-EGF人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0，是其中只有抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的CDR氨基酸序列被移植到选定的人抗体的FR氨基酸序列中的序列。但是，一般来说，当制备人源化抗体时，在许多只移植了小鼠抗体的CDR氨基酸序列的情况下，结合活性降低了。因此，为了避免结合活性的这种降低，在人抗体与小鼠抗体之间不同的FR氨基酸残基中，进行了被认为对结合活性有影响的氨基酸残基的修饰，并与移植CDR氨基酸序列一起进行移植。因此，在本实施例中，还如下鉴定了被认为对结合活性有影响的FR氨基酸残基。
首先，通过计算机模拟技术，构建了由上面设计的抗HB-EGF人源化抗体的VH的氨基酸序列HV0和VL的氨基酸序列LV0构成的抗体V区(HV0LV0)的三维结构。这种构建是使用用于制备三维结构坐标的软件AbM(Oxford Molecular制造)和用于显示三维结构的软件Pro-Explore(Oxford Molecular制造)或ViewerLite(Accelrys制造)，按照随附的相应说明书来进行的。此外，也以同样的方式构建了抗HB-EGF小鼠单克隆抗体KM3566的V区的三维结构的计算机模型。此外，还通过制备其中选择出在HV0LV0的VH和VL的FR氨基酸序列中与抗HB-EGF小鼠抗体KM3566不同的氨基酸残基、并将其修改成抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的氨基酸残基的氨基酸序列，而以同样的方式构建了三维结构模型。通过对这些制备的抗HB-EGF小鼠抗体KM3566、HV0LV0和修改的产物的V区的三维结构进行比较，鉴定了被认为对抗体的结合活性有影响的氨基酸残基。
结果是，在HV0LV0的FR氨基酸残基中，被认为通过改变抗原结合区的三维结构而对抗体活性具有影响的氨基酸残基，分别是，对于HV0来说选出9位的Ala、20位的Val、30位的Thr、38位的Arg、41位的Pro、48位的Met、67位的Arg、68位的Val、70位的Ile、95位的Tyr和118位的Val，对于LV0来说选出15位的Leu、19位的Ala、21位的Ile、49位的Pro和84位的Leu。通过将至少一个或多个这些选出的氨基酸残基修改成在小鼠抗体KM3566的同样区域中存在的氨基酸残基，设计了具有各种修改的人源化抗体的VH和VL。具体来说，对于抗体VH来说，导入了下述氨基酸修饰中的至少一个修饰，其中在SEQ ID NO：22显示的氨基酸序列中，9位的Ala被Thr取代，20位的Val被Leu取代，30位的Thr被Arg取代，38位的Arg被Lys取代，41位的Pro被Thr取代，48位的Met被Ile取代，67位的Arg被Lys取代，68位的Val被Ala取代，70位的Ile被Leu取代，95位的Tyr被Phe取代，118位的Val被Leu取代。此外，对于VL来说，导入了下述氨基酸修饰中的至少一个修饰，其中在SEQ ID NO：23显示的氨基酸序列中，15位的Leu被Val取代，19位的Ala被Val取代，21位的Ile被Met取代，49位的Pro被Ser取代，84位的Leu被Val取代。
(2)编码抗HB-EGF人源化抗体的VH的cDNA的构建
按照下面的方式使用PCR构建了在本实施例(1)中设计的抗HB-EGF人源化抗体的VH氨基酸序列HV0的编码cDNA。
首先，通过与SEQ ID NO：9的1到19位中描述的抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的H链的分泌信号序列连接，将设计的氨基酸序列制备成完整的抗体氨基酸序列。接下来，将氨基酸序列转变成遗传密码子。当1个氨基酸残基存在两个或多个遗传密码子时，通过将在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子用法[《免疫学重要的蛋白序列》(SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部，1991]考虑在内，来确定相应的遗传密码子。通过将这样确定的遗传密码子相连，设计了编码完整的抗体V区氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，并将用于PCR扩增的引物的结合性核苷酸序列(包括用于克隆到人源化抗体表达载体中的限制性酶识别序列)加到5′-末端和3′-末端。这样设计的核苷酸序列从5′-末端一侧开始被分成总共4个核苷酸序列，每个具有大约100个核苷酸，(邻近的核苷酸序列被设计成使得末端具有大约20个核苷酸的交叠序列)，并通过正义链和反义链的交替次序排列它们来合成合成的DNA片段(SEQ ID NOs：24到27)。
将每个合成的DNA片段(SEQ ID NOs：24到27)加入到50μl反应溶液中，使终浓度为0.1μmol/l，使用0.5μmol/l T3引物(TakaraShuzo制造)、0.5μmol/l T7引物(Takara Shuzo制造)和1单位KOD聚合酶(东洋纺织社制造)，按照KOD聚合酶随附的说明书进行PCR。对于这种情况下的反应条件来说，PCR按照说明书中描述的条件进行(30个由94℃30秒、50℃30秒和74℃60秒反应构成的循环)。将反应溶液进行乙醇沉淀，将沉淀溶解在无菌水中，用适当的限制性酶处理，然后与质粒pBluescript II SK(-)连接。使用这样获得的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α，从每个转化体制备各种质粒DNA，然后使用Big Dye终止物循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸序列。结果，获得了具有目的核苷酸序列的质粒。
接下来，通过制备具有突变的合成DNA并进行上面描述的PCR，或者通过使用含有编码上面制备的HV0的cDNA的质粒DNA作为模板、合成的DNA片段作为引物进行PCR、并分离扩增到的基因片段，来修改在本实施例(1)中设计的FR氨基酸残基。修改后氨基酸残基的基因密码子被制备成使它们变成在抗HB-EGF小鼠抗体KM3566中发现的基因密码子。此外，除非下面另有指明，反应通过35个循环的PCR进行，每个循环由94℃30秒、55℃30秒和72℃60秒的反应构成。PCR使用KOD-plus聚合酶(TOYOBO制造)来进行。此外，在本文中使用的合成的DNA是FASMAC Co.，Ltd的产品。
接下来，通过下述方法制备了其中上述HV0的Val20Thr30Met48Val68Ile70Tyr95Val118被修改成Leu20Arg30Ile48Ala68Leu70phe95Leu118的VH(在后文中称为HV7)。
通过加入0.1μmol/l具有氨基酸突变(SEQ ID NOs：32到35)的合成DNA和0.4μmol/l位于其两个末端的M13RV引物和M13M4引物，进行PCR。使用凝胶提取试剂盒纯化PCR溶液，进行0.8％到1.5％的琼脂糖电泳，使用凝胶提取试剂盒提取大约0.45kbp的目的基因片段。亚克隆到已经用特异性限制性酶SmaI处理过的pBluesecript II SK(-)(在后文中称为pBS)中，以获得载体pBS/HV7，它含有抗HB-EGF人源化抗体的VH氨基酸序列HV7的编码基因(SEQ ID NO：36)。
(3)编码抗HB-EGF人源化抗体的VL的cDNA的构建
如下所述，使用PCR构建了在本实施例(1)中设计的抗HB-EGF人源化抗体的VL氨基酸序列的编码cDNA。
首先，通过与SEQ ID NO：11的1到20位显示的抗HB-EGF小鼠抗体KM3566的L链的分泌信号序列连接，将设计的氨基酸序列制备成完整的抗体氨基酸序列。接下来，将氨基酸序列转变成遗传密码子。当1个氨基酸残基存在两个或多个遗传密码子时，通过将在抗体基因的核苷酸序列中发现的密码子用法[《免疫学重要的蛋白序列》(SEQUENCES of Proteins of Immunological Interest)，美国卫生与人类服务部，1991]考虑在内，来确定相应的遗传密码子。通过将这样确定的遗传密码子相连，设计了编码完整的抗体V区氨基酸序列的cDNA的核苷酸序列，并将用于PCR扩增的引物的结合性核苷酸序列(包括用于克隆到人源化抗体表达载体中的限制性酶识别序列)加到5′-末端和3′-末端。这样设计的核苷酸序列从5′-末端一侧开始分成总共4个核苷酸序列，每个具有大约100个核苷酸(邻近的核苷酸序列被设计成使得末端具有大约20个核苷酸的交叠序列)，并通过正义链和反义链交替的次序排列它们来合成合成的DNA片段(SEQ ID NOs：28到31)。
将每个合成的DNA片段(SEQ ID NOs：28到31)加入到50μl反应溶液中，使终浓度为0.1μmol/l，按照与上面描述的(2)中同样的方式，使用0.5μmol/l T3引物(Takara Shuzo制造)、0.5μmol/l T7引物(Takara Shuzo制造)和1单位KOD聚合酶(东洋纺织社制造)，按照KOD聚合酶随附的说明书进行PCR。将反应溶液进行乙醇沉淀，将沉淀溶解在无菌水中，进行适当的限制性酶处理，然后与质粒pBluescript II SK(-)连接。使用这样获得的重组质粒DNA溶液转化大肠杆菌DH5α，从每个转化体制备每种质粒DNA，然后使用Big Dye终止物循环测序试剂盒(Applied Biosystems制造)分析其核苷酸序列。结果，获得了具有目的核苷酸序列的质粒pBS/LV0。
接下来，通过制备具有突变的合成DNA并进行上面描述的PCR，或者通过使用含有编码上面制备的LV0的cDNA的质粒DNA作为模板、合成的DNA片段作为引物进行PCR、并分离扩增到的基因片段，来修改在本实施例(1)中设计的FR氨基酸残基。修改后氨基酸残基的基因密码子的制备方式，使得它们变成在抗HB-EGF小鼠抗体KM3566中发现的基因密码子。
PCR进行35个循环，每个循环由94℃30秒、55℃30秒和72℃60秒的反应构成，使用KOD-plus聚合酶(东洋纺织社制造)。此外，在本文中使用的合成的DNA是FASMAC Co.，Ltd的产品。
接下来，通过下述方法制备了其中上述LV0的Leu15Ala19Ile21Pro49Leu84被修改为Val15Val19Met21Ser49Val84的VL(在后文中称为LV5)。
通过加入0.1μmol/l具有氨基酸突变(SEQ ID NOs：37到40)的合成DNA和0.4μmol/l位于其两个末端的引物M13RV引物(由TakaraShuzo制造)和M13M4引物(由Takara Shuzo制造)，进行PCR。使用凝胶提取试剂盒纯化PCR溶液，进行0.8％到1.5％的琼脂糖电泳，使用凝胶提取试剂盒提取大约0.45kbp的目的基因片段。亚克隆到已经用特异性限制性酶SmaI处理过的pBS中，以获得载体pBS/LV5，它含有抗HB-EGF人源化抗体的VH氨基酸序列LV5的编码基因(SEQ IDNO：41)。
(4)抗HB-EGF人源化抗体表达载体的构建
通过将在本实施例(2)或(3)中获得的编码HV0或LV0的cDNA、或编码其修改产物的cDNA***到WO 97/10354中描述的用于人源化抗体表达的载体pKANTEX93的适当位置中，构建了各种抗HB-EGF人源化抗体表达载体。
(5)抗HB-EGF人源化抗体的稳定表达和使用动物细胞制备纯化的抗体
使用动物细胞稳定表达抗HB-EGF人源化抗体，和从培养上清液中纯化抗体，按照与实施例6(2)和(3)中描述的方法相同的方式来进行。作为结果，制备了三种抗HB-EGF人源化抗体，即其中抗体的VH和VL分别为HV0和LV0的HV0LV0、其中抗体的VH和VL分别为HV7和LV0的HV7LV0以及其中抗体的VH和VL分别为HV7和LV5的HV7LV5。
实施例10
(1)抗HB-EGF人源化抗体对人HB-EGF的结合活性测量
为了进行抗HB-EGF人源化抗体对人HB-EGF的结合活性的反应动力学分析，按照与实施例7(2)中相同的方式，使用BIACORE T100(由BIACORE制造)对其进行测量。
结果，与实施例2(2)中抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的结果类似，在与人HB-EGF结合后，在实施例9中制备的抗HB-EGF人源化抗体几乎不显示解离反应，因此不能计算解离速率常数。
另一方面，能够计算结合速率常数，其结果显示在表2中。作为结果，其中将抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的CDR简单移植到人框架中的抗HB-EGF人源化抗体HV0LV0的人HB-EGF结合活性，降低到接近抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的大约1/2，但是只向H链添加了氨基酸修饰的抗HB-EGF人源化抗体HV7LV0和向H链和L链添加了氨基酸修饰的抗HB-EGF人源化抗体HV7LV5的结合活性，增加到与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966几乎相同的水平。
表2
(2)抗HB-EGF人源化抗体对HB-EGF表达细胞的反应性
以与实施例2(1)中相同的方式，测量抗HB-EGF人源化抗体对表达HB-EGF的癌细胞的反应性。使用人卵巢癌细胞系MCAS作为细胞系。结果显示在图15中。与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的情况类似，所有人源化抗体都与MCAS反应。
(3)抗HB-EGF人源化抗体的中和活性
以与实施例2(4)中相同的方式，测量抗HB-EGF人源化抗体的中和活性。
结果显示在图16中。当将未添加HB-EGF时的细胞生长当作1时，由于外源HB-EGF，使用MKN-28观察到了细胞生长，从而显示出HB-EGF依赖性生长。显示出抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的大约1/2结合活性的抗HB-EGF人源化抗体HV0LV0，其中和活性与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966相比略低，但是与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966具有几乎相同的人HB-EGF结合活性的抗HB-EGF人源化抗体HV7LV0和HV7LV5，显示出与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966等同的中和活性。
(4)抗HB-EGF人源化抗体的ADCC活性
以与实施例2(5)中相同的方式，测量抗HB-EGF人源化抗体的ADCC活性。
结果显示在图17中。显示出抗HB-EGF嵌合抗体KM3966的大约1/2结合活性的抗HB-EGF人源化抗体HV0LV0，其ADCC活性与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966相比降低到大约1/10，但是与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966具有几乎相同的人HB-EGF结合活性的抗HB-EGF人源化抗体HV7LV0和HV7LV5，显示出与抗HB-EGF嵌合抗体KM3966等同的ADCC活性。
实施例11
抗HB-EGF抗体的结合表位的分析：
在抗HB-EGF抗体KM3566、KM3579和KM3966对人HB-EGF的结合表位上进行了下面的分析。
(1)突变型人HB-EGF全长基因转化细胞的构建
所有的抗HB-EGF抗体KM3566、KM3579和KM3966都与人HB-EGF反应，但不显示出与小鼠HB-EGF的交叉反应。因此，构建了表达10种突变型人HB-EGF全长蛋白(在后文中称为突变HB-EGF)的基因转化细胞，所述蛋白在人HB-EGF的EGF样结构域的氨基酸序列中，与小鼠HB-EGF不同的10个氨基酸中的每一个都被源自小鼠的氨基酸所取代，并通过测量抗HB-EGF抗体对它们的结合活性，分析了结合表位。制备的10种突变HB-EGF显示如下。
(1)从N-末端开始的第115位苯丙氨酸被酪氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“F115Y”)
(2)从N-末端开始的第122位赖氨酸被精氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“K122R”)
(3)从N-末端开始的第124位缬氨酸被亮氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“V124L”)
(4)从N-末端开始的第125位赖氨酸被谷氨酰胺取代的突变HB-EGF(在后文中称为“K125Q”)
(5)从N-末端开始的第127位亮氨酸被苯丙氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“L127F”)
(6)从N-末端开始的第129位丙氨酸被苏氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“A129T”)
(7)从N-末端开始的第133位异亮氨酸被赖氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“I133K”)
(8)从N-末端开始的第135位组氨酸被亮氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“H135L”)
(9)从N-末端开始的第141位谷氨酸被组氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“E141H”)
(10)从N-末端开始的第147位丝氨酸被苏氨酸取代的突变HB-EGF(在后文中称为“S147T”)。
此外，构建了下面的人/小鼠嵌合HB-EGF全长基因转化细胞作为阳性对照。
(11)制备了人/小鼠嵌合HB-EGF，其中从N-末端开始1到49位的序列由源自小鼠HB-EGF的序列构成，从N-末端开始50到208位的序列由源自人HB-EGF的序列构成。因为所有EGF样结构域都是源自于人HB-EGF的序列，因此该HB-EGF被用作阳性对照。
使用目加田等的方法(J.Bio.Chem.，272，27084-27090(1997))，制备了用于瞬时表达上面提到的突变HB-EGF和人/小鼠嵌合HB-EGF的质粒。将小鼠LMTK细胞(ATCC CCL-1.3)用添加有100单位/ml青霉素G、100μg/ml链霉素和10％牛血清白蛋白的Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基进行培养。通过磷酸钙方法将每种上面提到的表达质粒转入小鼠LMTK细胞，然后将细胞培养48小时并用于下面的试验。
通过仅将载体转入小鼠LMTK细胞而制备的细胞(在后文中称为“模拟体”)被用作阴性对照。
(2)使用突变HB-EGF基因转化细胞进行的抗HB-EGF抗体结合活性分析
首先，将用结合缓冲液(通过将非必需氨基酸、20mMHEPES-NaOH(pH 7.2)和10％胎牛血清添加到Ham′s F12中而制备)稀释到2μg/ml的生物素标记的抗HB-EGF抗体(KM3566、KM3579或KM3966)，与1x105个细胞的突变HB-EGF基因转化细胞、人/小鼠嵌合HB-EGF基因转化的细胞或模拟体在4℃反应2小时。反应后，将细胞用冰冷的清洗缓冲液(通过向PBS中加入0.5mM CaCl2、0.5mMMgCl2和0.1％胎牛血清而制备)清洗两次，然后用PBS(+)(通过向PBS中加入0.5mM CaCl2和0.5mM MgCl2而制备)清洗一次。将用PBS(+)稀释到1.8％的甲醛溶液加入到洗过的细胞中，将细胞在4℃固定20分钟。接下来，将细胞用PBS(+)清洗一次，然后用甘氨酸溶液(0.2M甘氨酸，100mM Tris，pH 8.1)在4℃处理20分钟，然后在清洗缓冲液中在4℃下温育20分钟。接下来，将细胞与用结合缓冲液稀释到0.1μg/ml的HRP偶联的链亲和素在4℃下反应20分钟，并用清洗缓冲液洗两次，用PBS(+)洗两次。通过使用过氧化物酶检测试剂盒(ELISAPOD底物OPD试剂盒，Nacalai Tesque制造)进行显色，测定492nm处的吸光度，并测量细胞结合的HRP的活性。
通过从抗HB-EGF抗体的每种不同的突变HB-EGF基因转化细胞或人/小鼠嵌合HB-EGF基因转化细胞的吸光度中减去对模拟体的吸光度而获得的值，被用作值A。
接下来，为了分析在小鼠LMTK细胞的细胞膜上表达的突变HB-EGF蛋白的表达，通过与上面描述相同的方法，测定了同等地结合所有突变HB-EGF的抗HB-EGF兔多克隆抗体(抗体名称：H-6，通过用合成的肽免疫兔而制备的抗体，该合成的肽位于人HB-EGF从N-末端开始的54到73位，并与Sepharose CL-6B交联)，对突变HB-EGF基因转化细胞、人/小鼠嵌合HB-EGF基因转化细胞以及模拟体的吸光度。但是，生物素标记的H-6抗体以10μg/ml的抗体浓度使用。通过从H-6抗体的各个突变HB-EGF基因转化细胞或人/小鼠嵌合HB-EGF基因转化细胞的吸光度中减去对模拟体的吸光度而获得的值，被用作值B。
为了校正基因转化细胞之间表达量的差别，通过用值A除以值B计算了A/B值。当将抗HB-EGF抗体对阳性对照pRTHGC-6的A/B值当作100％时，计算对每个突变HB-EGF的A/B值的比率，该比率被用作每个突变HB-EGF的相对结合活性。
结果显示在图18中。与pRTHGC-6相比，抗HB-EGF单克隆抗体KM3566几乎不结合I133K、H135L和S 147T。因此，发现了抗HB-EGF单克隆抗体KM3566识别含有133位的I、135位的H和147位的S的氨基酸的表位。此外，与抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的情况类似，具有同样抗体可变区的抗HB-EGF单克隆抗体KM3966，与pRTHGC-6相比，也几乎不结合I133K和H135L，并且对S147T的结合活性被降低到大约1/3。因此，发现了抗HB-EGF单克隆抗体KM3966与抗HB-EGF单克隆抗体KM3566的情况类似，识别含有133位的I、135位的H和147位的S的氨基酸的表位。
与pRTHGC-6相比，抗HB-EGF单克隆抗体KM3579不仅仅与E141H结合，对所有其他突变HB-EGF都显示出与pRTHGC-6同等的结合活性。因此，发现了抗HB-EGF单克隆抗体KM3579识别含有141位的E氨基酸的表位。
基于上面的结果，发现抗HB-EGF单克隆抗体KM3566和抗HB-EGF单克隆抗体KM3966以及抗HB-EGF单克隆抗体KM3579识别HB-EGF的不同表位。
尽管已经详细地并参考其具体实施方案对本发明进行了描述，但对于本领域的专业人员来说，显然可以在其中进行各种不同改变和修改，而不背离其精神和范围。
本申请基于2007年12月5日提交的日本专利申请(特愿2007-315068)，其全部内容在此引为参考。
所有本文引用的参考文献以其全文引用。
工业实用性
本发明提供了与细胞膜结合型HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合的单克隆抗体或其抗体片段。
序列表的自由文本
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Claims (7)

1.一种单克隆抗体或其抗体片段，其与细胞膜结合型肝素结合性表皮生长因子样生长因子HB-EGF、膜型HB-EGF和分泌型HB-EGF结合，其中抗体的重链可变区由SEQ ID NOs：22或42所示的氨基酸序列组成，和抗体的轻链可变区由SEQ ID NOs：23或43所示的氨基酸序列组成，所述抗体片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)和二硫键稳定化的V区(dsFv)。
2.一种DNA，其编码权利要求1的抗体或其抗体片段。
3.一种重组载体，其含有权利要求2的DNA。
4.一种转化体，其能通过将权利要求3的重组载体导入宿主细胞而获得。
5.一种用于生产权利要求1的抗体或其抗体片段的方法，所述方法包括将权利要求4的转化体在培养基中培养，以在培养物中形成和积累权利要求1的抗体或其抗体片段，以及从培养物中回收所述抗体或抗体片段。
6.一种药物组合物，其含有权利要求1的抗体或其抗体片段作为活性成分。
7.一种用于治疗与HB-EGF相关的癌症的药剂，所述药剂含有权利要求1的抗体或其抗体片段作为活性成分。
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