JPH0696597B2 - インシユリン誘導体の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 インシユリンは生体内でプレプロインシユリンと呼ばれ
る前駆物質の形態で合成される。その前駆配列は膜との
相互作用のための信号域を表わし、合成中または合成後
直ちに分解される。これに対して、プロインシユリンは
膵臓抽出物に中に少量見い出されうる物質である。それ
のインシユリンへの変換中に、Ｃ−ペプタイドは特定の
酵素系によつて分解される。

該酵素による切断部位はB31位−B32位のArg−Arg配列お
よび62位（Al）−63位（AO）のLys−Arg配列である。因
に、B30はＢ鎖のＣ−末端の後の位置を表し、AOおよびA
lはＡ鎖のＮ−末端の前の位置を表す。プロインシユリ
ンは、トリプシンおよびカルボキシペプチダーゼＢ作用
〔Kemmler氏等「JBC」第246巻第6786−91頁（1971）〕
を有する酵素によつて試験管内で容易にインシユリンに
変換され得る。これに対してトリプシンまたはトリプシ
ン様酵素のみによる蛋白質分解はＢ鎖のＣ−末端におけ
る31および32位に１つまたは両方のアルギニンをなお有
する中間体を優先的に与え、さらにＢ−末端で分解して
リジン−（B29）−インシユリン〔デアラニン−（B30）
−ブタインシユリン、デスレオニン−（B30）−ヒトイ
ンシユリン〕を与えるかまたはアルギニン−（B22）−
インシユリン（デオクタペプタイドインシユリン）を与
えるインシユリン分解生成物を与える（Chance氏「Pro
c.VIICongress of International Diabetes Fed.」（19
70）、D.E.Steiner氏等「Fed.Proc.」第33巻第2105〜15
（1974）、J.Markussen氏「Proc.Symp.on Proinsulin、
Insulin、Ｃ−Pep−tide、Tokushima」（1978））。

プレプロインシユリンは現在遺伝子工学的方法によつて
原始核生物（prokaryotes）特に大腸菌（E.coli）から
入手される。ヒトインシユリン配列を有するプロインシ
ユリンを含有するこれらの菌株はここでは特に興味深
い。さらにプラスミドの修飾により新しい配列部分を制
御された手段、殊に酵素的または化学的解裂部位がイン
シユリンまたはインシユリン誘導体の放出のために保持
されるような手段によるプロインシユリン配列の31〜33
位および61〜63位における変換によつて構成することが
可能である。これらは例えば31および32位の一方または
両方のアルギニンの代りに別の塩基性アミノ酸すなわち
リジンまたはヒスチジンを含み、そのためトリプシンの
特性を有する酵素が解裂のために使用されるような誘導
体である。しかしながら、他の既知の蛋白質分解酵素の
基質である配列または化学的方法による解裂が可能であ
る配列を導入することもできる。本発明のための前提条
件はもつぱら次のことである。すなわちＡ鎖のＮ−末端
の前に追加のアミノ酸を含まず、Ｂ鎖（31〜33位）のＣ
−末端に３個までの追加のアミノ酸のなかで少なくとも
１つの塩基性アミノ酸を有しているインシユリン誘導体
が形成されることである。

Ｂ鎖のＣ−末端にさらに陽電荷を有するインシユリン誘
導体、それらの製造方法、それらを含む剤ならびにそれ
らの用途は西ドイツ特許出願第P3326472.4号および同第
P3326473.2号の主題である。それらの結晶化法は西ドイ
ツ特許出願第P3327709.5号の主題である。

これらのインシユリン誘導体は、フエノールまたは同様
の芳香族体の存在下で所望の誘導体の等電点付近で蛋白
質分解による消化または化学的分解を行うことによつて
相当する中間体、プロインシユリン、プレプロインシユ
リンまたは相当する同族体から格別に容易に製造されう
ることが発見された。この方法によれば最終生成物が反
応溶液から沈殿し、反応平衡から実質的に除かれるだけ
でなく、上記条件下では鋭いふちを有するプリズム状の
結晶が媒体中に直接形成され、該結晶は小さい表面積の
ために例えば無晶形の沈殿物よりもさらなる反応を受け
にくい。かくして例えば結晶状態における誘導体たるイ
ンシユリン−Arg^B31−OHがさらなるトリプシン分解に対
して特別に安定であることは驚ろくべきことである。

本発明は、ヒト−、ブタ−もしくはウシインシュリンの
プロインシュリン、デノナペプタイド−ブタプロインシ
ュリンまたはサルプレプロインシュリンを分解すること
により式Ｉ （上記式中、R³⁰はAla、ThrおよびSerから選択される中
性Ｌ−アミノ酸の基を示し、Ｘは遺伝学的に符号化され
うるＬ−アミノ酸の同一または異なつた基であつて少な
くともそれらの１つは塩基性アミノ酸でありその際Ｃ−
末端員がホモセリン−ラクトン基でありうる基を示し、
ＹはPheまたはＨであり、そしてｎは２または３であ
る）を有するインシユリン誘導体を製造するにあたり、
芳香族ヒドロキシ化合物の存在下で前記式Ｉのインシユ
リン誘導体の等電点付近で分解を行うことを特徴とす
る、インシユリン誘導体の製造方法に関するものであ
る。

Ｙは好適にはPheである。

下記のＬ−アミノ酸は遺伝学的に符号化されうる。Gly 、ALa 、Ser 、Thr 、Val 、Leu、ILe、 Asp、Asn 、Glu 、Gln 、Cys 、Me
t 、Arg 、Lys 、His 、Tyr 、Phe 、TrpおよびPro（中性アミノ酸に
は下線が付されている）中性アミノ酸は字義通りのもの
として理解され、特に、Gly、ALa、Ser、Thr、Val、Le
u、Ile、Asn、Gln、Met、PheまたはProである。塩基性
アミノ酸は字義通りのものとして理解され、解にArg、L
ysまたはHisである。

例えば、下記のインシユリン誘導体が本発明の方法によ
つて製造されるが本発明はこれに限定されるものではな
い。

ヒトインシユリン−Arg^B31−OH ブタインシユリン−Arg^B31−OH ウシインシユリン−Arg^B31−OH ヒトインシユリン−Arg^B31−Arg^B32−OH ブタインシユリン−Arg^B31−Arg^B32−OH ウシインシユリン−Arg^B31−Arg^B32−OH ヒトインシユリン−Lyg^B31−OH ヒトインシユリン−ALa^B31−Lys^B32−OH ヒトインシユリン−Val^B31−Arg^B32−OH ヒトインシユリン−Leu^B31−Arg^B32−Arg^B33−OH ブタインシユリン−Val^B31−His^B32−Arg^B33−OH ブタインシユリン−Leu^B31−Val^B32−Arg^B33−OH ヒトインシユリン−Arg^B31−Phe^B32−OH ヒトインシユリン−Arg−NH 本発明による方法は１種のフエノールまたはそれ以上の
フエノールの混合物の存在下で前記式Ｉのインシュリン
誘導体の等電点の±1pH単位のpH範囲で好適に実施され
る。

上記pHは適当な緩衝液（例えば酢酸塩、クエン酸塩また
はリン酸塩）によつて設定されている。

前記式Ｉのインシュリン誘導体の等電点は天然のインシ
ュリンより高く、およそpH5.8〜8.5である。本発明のイ
ンシュリン誘導体の代表的な化合物の等電点をあげれば
次のようである。

ブタインシュリン−Arg^B31−Arg^B32−OH等電点6.9 ブタインシュリン−Arg^B31−OH等電点6.2 ヒトインシュリン（B30）−コリンエステル等電点6.3 ヒトインシュリン−Arg^B31−Lys^B32−OCH₃等電点6.9 ヒトインシュリン−Arg^B31−OH等電点6.2 ヒトインシュリン−Arg^B31−Arg^B32−OH等電点6.9 本発明の方法において、出発物質の濃度は0.5〜30mg/m
l、好適には１〜10mg/ml、反応の速度は結晶の形成速度
よりやや大きいかまたは等しい速度で反応を実施するの
が好ましい。このことは多くの結晶の種が形成され、結
晶の大きさは平均30μｍを越えないことを意味する。所
望の方法で反応の速度を非常に正確に制御することは殊
に酵素触媒の場合には可能である。

上記方法を用いることによつて所望の生成物の方向に反
応をより良く進行させ、それによつて収率における重要
な改良が可能である。生成物は、単に洗浄するだけでさ
らなる処理が容易であり、かつ過剰の分解剤、例えばプ
ロテアーゼから実質的に解放されうる形態で得られる。

選択された分解剤は、例えば、所望の基Xnが保持され、
一方分解が行なわれた後にＡ鎖が遊離のＮ−末端Ｈ−Gl
yを有しているような特性を有するプロテアーゼであ
る。プロインシユリン配列における相当する部位でメチ
オニンが導入される場合には、分解は臭化シアンによつ
て実施されることができ、その場合にはＣ−末端にホモ
セリン−ラクトン基が保持される。

式Ｉのインシュリン誘導体は知られた化合物であるが、
このものおよびこれを含有する医薬は完全に新規な遅効
作用を有し、その作用は亜鉛または硫酸プロタミンのよ
うな貯蔵物質の補助なしに生じる。貯蔵物質の作用は、
蛋白質化学に由来する固有の物理的原理、すなわち、等
電点でのインシユリン誘導体を低い溶解性に帰因する。

生理学的条件下での上記物質の再溶解は付加的塩基性基
を分離させることによつて達成され、それは誘導体によ
り、トリプシンまたはトリプシン−様酵素および／また
はカルボキシペプチダーゼＢまたはカルボキシペプチダ
ーゼＢ−様酵素および／またはエステラーゼの作用によ
つて起こる。

実施例１ フエノールの不存在または存在下におけるブタからのデ
ノナペプタイド−プロインシユリンのトリプシン消化 デノナペプタイド−ブタプロインシユリン350mgを酸性
条件下で溶解し、該溶液をトリプシン（ウシ）200μｇ
を含む0.1Mトリスバツフア（pH＝7.5）215mlに加えた。
数分内に濁りが生じた。反応終了（約１時間）後、トリ
プシン阻害剤100μｇを加え、該混合物を遠心分離し、
白色沈殿を0.1％の適当な洗剤を含有する0.05M酢酸アン
モニウムバツフア（pH＝4.0）20mlに溶解し、０〜1M食
塩勾配を有する陽イオン交換体上で精製した。次のもの
が単離された。純粋な状態でのインシユリン−Arg^B31−
Arg^B32−OH96mg（36.6％）およびインシユリン−Arg^B31
−Arg^B32−OHとインシユリン−Arg^B31−OHとの混合物72
mg（27.4％）およびさらに少なくとも２種類の不純物
（等電点電気泳動および高圧液体クロマトグラフイー
（HPLC））、14.9％の出発物質、8.7％のジ−およびモ
ノアルギニン誘導体、49.3％のデ−アラニン（B30）−
インシユリンおよび12.2％のデオクタペプタイド−イン
シユリンを含む混合物56mg（約21％）が少量の未確定の
ピーク（HPLC）のものとともに反応の上澄液から単離さ
れた。

別のバツチにおいて、デノナペプタイド−ブタプロイン
シユリン100mgを酸性条件下で溶解し、該溶液をｍ−ク
レゾール2.5mg/mlおよびトリプシン（ウシ）50μｇを含
む0.1Mトリスバツフアー、（pH＝7.5）50mlに加えた。
約15分後、約５〜15μｍの大きさのシヤープな緑のプリ
ズム状の結晶沈殿が生成した。反応は３時間後に上記の
ようにして中断された。操作は上記のようにして遂行さ
れた。

インシユリン−Arg^B31−Arg^B32−OHの収量56mg（74.7
％）、ジ−アルギニンおよびモノ−アルギニン誘導体の
混合物11mg（14.7％）。痕跡量のインシユリン様物質の
みが上澄液に残つた。

実施例２ 大腸菌において表現されたサンプレプロインシユリンか
らのトリプシン消化によるヒトインシユリン−Arg^B31−
OHの製造 サンプレプロインシユリン10mgを酸性条件下で溶解し、
該溶液を、フエノール1.5mg/ml、ｍ−クレゾール0.7mg/
mlおよびトリプシン（ウシ）25μｇを含み、0.5M食塩
（pH＝6.8）を含有する0.1Mリン酸バツフア5mlに加え
る。所望の生成物は約５〜20μｍの大きさの鈍いふちを
有するプリズム状で反応液中に沈殿する。結晶は92％の
インシユリンおよびインシユリン誘導体を含む。HPLCに
よれば生成物の78％はヒトインシユリン−Arg^B31−OHで
あり、そして14％はヒトインシユリン−Arg^B31−Arg^B32
−OHである。５％以下のインシユリン様蛋白のみが反応
液の上澄液に見出される。結晶の懸濁液をトリプシンの
存在下に室温でさらに２日間放置すると、理論量の87％
のインシユリンおよびインシユリン誘導体が結晶状態で
なお残り、生成物の79％はヒトインシユリン−Arg^B31−
OHでありそして11％はヒトインシユリンArg^B31−Arg^B32
−OHである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト−、ブタ−もしくはウシインシュリン
   のプロインシュリン、デノナペプタイド−ブタプロイン
   シュリンまたはサルプレプロインシュリンを分解するこ
   とにより式Ｉ （上記式中R³⁰はAla、ThrおよびSerから選択される中性
   Ｌ−アミノ酸の基を示し、Ｘは遺伝学的に符号化されう
   るＬ−アミノ酸の同一または異なった基であって少なく
   ともそれらの１つは塩基性アミノ酸であり、その際Ｃ−
   末端員がホモセリン−ラクトンでありうる基を示し、Ｙ
   はPheまたはＨであり、そしてｎは２または３である）
   を有するインシュリン誘導体を製造するにあたり、芳香
   族ヒドロキシ化合物の存在下で前記式Ｉのインシュリン
   誘導体の等電点付近で分解を行うことを特徴とする、イ
   ンシュリン誘導体の製造方法。
2. 【請求項２】式ＩにおいてＹがPheを示す特許請求の範
   囲第１項に記載の製造方法。
3. 【請求項３】式Ｉのインシュリン誘導体がヒトインシュ
   リン、ブタインシュリンまたはウシインシュリンの配列
   を有する特許請求の範囲第１項または第２項に記載の製
   造方法。
4. 【請求項４】式ＩにおいてＸが中性および／または塩基
   性アミノ酸基である特許請求の範囲第１項ないし第３項
   のいずれかの項に記載の製造方法。
5. 【請求項５】分解反応がフェノールまたは数種のフェノ
   ールの混合物の存在下で実施される特許請求の範囲第１
   項ないし第４項のいずれかの項に記載の製造方法。
6. 【請求項６】反応の速度が反応生成物が30μｍまでの大
   きさの結晶の状態で優先的に得られるように選択されて
   いる特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかの項
   に記載の製造方法。
7. 【請求項７】前記プロインシュリンまたはプレプロイン
   シュリンが反応開始時に0.5〜30mg/mlの濃度で反応媒体
   中に存在する特許請求の範囲第１項ないし第６項のいず
   れかの項に記載の製造方法。
8. 【請求項８】反応媒体が適当な手段で緩衝化された水性
   媒体である特許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれ
   かの項に記載の製造方法。
9. 【請求項９】分解剤がプロテアーゼであり、それの特性
   は所望の基Xnを保持させ、一方分解を遂行した後でＡ鎖
   が遊離Ｎ−末端を有するようなものである特許請求の範
   囲第１項ないし第８項のいずれかの項に記載の製造方
   法。
10. 【請求項１０】分解剤は臭化シアンであり、ホモセリン
    −ラクトン基はＢ鎖のＣ−末端に保持されており、一方
    Ａ鎖の天然型のＮ−末端がMet−AOでの分解で形成され
    る特許請求の範囲第１項ないし第８項のいずれかの項に
    記載の製造方法。