JPH0695958B2 - アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物 - Google Patents
アルカリ性ホスフアタ−ゼアツセイ用２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ−ル緩衝液中の基質組成物Info
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は酵素アッセイ用基質組成物、特に５−ブロモ−
４−クロル−３−インドリルホスフェートおよびテトラ
ゾリウム塩を含むアルカリ性ホスファターゼアッセイ用
の基質組成物に関する。
４−クロル−３−インドリルホスフェートおよびテトラ
ゾリウム塩を含むアルカリ性ホスファターゼアッセイ用
の基質組成物に関する。
従来技術 少量存在する物質の検出用アッセイは指示薬の使用によ
る。生理学的アッセイにおける１種の指示薬には検出し
ようとする目標物質に選択的に結合するプローブに付着
する酵素の利用がある。目標物に結合すれば酵素は基質
との反応を接触して肉眼で又は機械装置によって容易に
検出できる生成物を生ずるリポーターグループとして働
く。
る。生理学的アッセイにおける１種の指示薬には検出し
ようとする目標物質に選択的に結合するプローブに付着
する酵素の利用がある。目標物に結合すれば酵素は基質
との反応を接触して肉眼で又は機械装置によって容易に
検出できる生成物を生ずるリポーターグループとして働
く。
リポーターグループとして役に立つ酵素の１例はアルカ
リ性ホスファターゼである。アルカリ性ホスファターゼ
とは一般にpH約8.5乃至10.5にわたりモノリン酸エステ
ルを加水分解する非特異的酵素をいう。
リ性ホスファターゼである。アルカリ性ホスファターゼ
とは一般にpH約8.5乃至10.5にわたりモノリン酸エステ
ルを加水分解する非特異的酵素をいう。
多数の基質がアルカリ性ホスファターゼ酵素と反応しう
るが、５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルホスフ
ェート（BCIP）の様な３−インドリルフォスフェート塩
は特に便利なシグナルを与える。アルカリ性ホスファタ
ーゼはBCIPを有機部分とホスフェートに分解する。有機
部分はダイマー化して青色生成物を生ずる。りん酸転移
性緩衝液は酵素によって５−ブロモ−４−クロル−３−
インドリルホスフェートから転移したホスフェートを除
去するので、酵素によるホスフェートの蓄積及びその後
におこる酵素作用の阻害を避ける。この反応に便利なり
ん酸転移性緩衝液には２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール（2A2M1P）、ジエタノールアミン、エタンア
ミノエタノールおよび２−アミノ−２−メチル−1,3−
プロパンジオールがある。スタークウエザー（Starkwea
ther）の米国特許第4,030,995号明細書及び英国特許第
1,263,202号明細書を参照されたい。
るが、５−ブロモ−４−クロル−３−インドリルホスフ
ェート（BCIP）の様な３−インドリルフォスフェート塩
は特に便利なシグナルを与える。アルカリ性ホスファタ
ーゼはBCIPを有機部分とホスフェートに分解する。有機
部分はダイマー化して青色生成物を生ずる。りん酸転移
性緩衝液は酵素によって５−ブロモ−４−クロル−３−
インドリルホスフェートから転移したホスフェートを除
去するので、酵素によるホスフェートの蓄積及びその後
におこる酵素作用の阻害を避ける。この反応に便利なり
ん酸転移性緩衝液には２−アミノ−２−メチル−１−プ
ロパノール（2A2M1P）、ジエタノールアミン、エタンア
ミノエタノールおよび２−アミノ−２−メチル−1,3−
プロパンジオールがある。スタークウエザー（Starkwea
ther）の米国特許第4,030,995号明細書及び英国特許第
1,263,202号明細書を参照されたい。
BCIPによるアルカリ性ホスファターゼ反応の増進はニト
ロブルーテトラゾリウム（NBT）の添加によって達成さ
れ得る。
ロブルーテトラゾリウム（NBT）の添加によって達成さ
れ得る。
アルカリ性ホスファターゼのBCIPとの反応の生成物はNB
Tを不溶性青色ジホルマザンに還元し、そしてそのホル
マザンはBCIP反応生成物のみによって生ずるよりも強い
シグナルを生ずる。例えばペアレント（Parent）らのPh
ytoprotection,66、53-57（1985）を参照されたい。し
かし約24時間の調整によりBCIPとNBTとを含む水性基質
組成物中に沈澱が生ずる。この沈澱生成は活性損失を伴
うので、アルカリ性ホスファターゼ基質組成物の調剤用
キット中でNBT、BCIPおよび緩衝液の別個の包装を必要
とする。
Tを不溶性青色ジホルマザンに還元し、そしてそのホル
マザンはBCIP反応生成物のみによって生ずるよりも強い
シグナルを生ずる。例えばペアレント（Parent）らのPh
ytoprotection,66、53-57（1985）を参照されたい。し
かし約24時間の調整によりBCIPとNBTとを含む水性基質
組成物中に沈澱が生ずる。この沈澱生成は活性損失を伴
うので、アルカリ性ホスファターゼ基質組成物の調剤用
キット中でNBT、BCIPおよび緩衝液の別個の包装を必要
とする。
発明の概要 本発明はアルカリ性ホスファターゼアッセイ用の安定な
基質組成物を提供するものである。この組成物は十分に
安定なのでNBT、BCIPおよび緩衝剤は予め混合し１単位
として包装できる。組成物は５−ブロモ−４−クロル−
３−インドリルホスフェート；該ホスフェートと反応し
て検出可能なシグナルを生ずるために有効な濃度のテト
ラゾリウム塩；および水溶液中での該ホスフェートと該
テトラゾリウム塩との反応を反応を進行させるpHの範囲
内に緩衝化するために有効な濃度の２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノールを包含する。
基質組成物を提供するものである。この組成物は十分に
安定なのでNBT、BCIPおよび緩衝剤は予め混合し１単位
として包装できる。組成物は５−ブロモ−４−クロル−
３−インドリルホスフェート；該ホスフェートと反応し
て検出可能なシグナルを生ずるために有効な濃度のテト
ラゾリウム塩；および水溶液中での該ホスフェートと該
テトラゾリウム塩との反応を反応を進行させるpHの範囲
内に緩衝化するために有効な濃度の２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノールを包含する。
本発明による基質組成物は約1.0乃至約10mMの濃度の５
−ブロモ−４−クロル−３−インドリルホスフェート、
約0.05乃至約0.5mMの濃度のニトロブルーテトラゾリウ
ムおよび約0.1乃至約1.0Mの濃度の２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノールを含むことが好ましい。基質組
成物はまた約1.0mMの濃度のMgCl2を含んでいてもよい。
−ブロモ−４−クロル−３−インドリルホスフェート、
約0.05乃至約0.5mMの濃度のニトロブルーテトラゾリウ
ムおよび約0.1乃至約1.0Mの濃度の２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノールを含むことが好ましい。基質組
成物はまた約1.0mMの濃度のMgCl2を含んでいてもよい。
本発明による基質組成物が濃度1.2mMの５−ブロモ−４
−クロル−３−インドリルホスフェート、濃度0.17mMの
ニトロブルーテトラゾリウム、濃度100mMの２−アミノ
−２−メチル−１−プロパノール、濃度１ミリＭのMgCl
2および濃度0.02％のナトリウムアジドを含むと特に好
ましい。
−クロル−３−インドリルホスフェート、濃度0.17mMの
ニトロブルーテトラゾリウム、濃度100mMの２−アミノ
−２−メチル−１−プロパノール、濃度１ミリＭのMgCl
2および濃度0.02％のナトリウムアジドを含むと特に好
ましい。
具体的説明 2A2M1PはNBTの非存在下で実施されるアルカリ性ホスフ
ァターゼアッセイ（上記スタークウエザー）に有用であ
り、またアルカリ性ホスファターゼ自体の貯蔵にも有用
である〔マックコブ（McComb）らのAlkaline Phosphata
se，プレナムプレス、ニューヨーク、7.5.7.3（197
9）〕にもかかわらず、本発明以前にはNBTを含むアルカ
リ性ホスファターゼ基質組成物中での2A2M1Pの併用から
は何らの特別な利益も得られないことが知られていたと
信じられる。その結果として２−アミノ−２（ヒドロキ
シメチル）−1,3−プロパンジオール（トリス）緩衝剤
が、沈澱生成を避けるために基質組成物の成分を別個に
包装する必要性によって生ずる必然的な不利益、高経費
および潜在的な不正確にもかかわらずこの様な組成物に
緩衝剤として一般に使用されている。
ァターゼアッセイ（上記スタークウエザー）に有用であ
り、またアルカリ性ホスファターゼ自体の貯蔵にも有用
である〔マックコブ（McComb）らのAlkaline Phosphata
se，プレナムプレス、ニューヨーク、7.5.7.3（197
9）〕にもかかわらず、本発明以前にはNBTを含むアルカ
リ性ホスファターゼ基質組成物中での2A2M1Pの併用から
は何らの特別な利益も得られないことが知られていたと
信じられる。その結果として２−アミノ−２（ヒドロキ
シメチル）−1,3−プロパンジオール（トリス）緩衝剤
が、沈澱生成を避けるために基質組成物の成分を別個に
包装する必要性によって生ずる必然的な不利益、高経費
および潜在的な不正確にもかかわらずこの様な組成物に
緩衝剤として一般に使用されている。
実施例１では沈澱生成の原因を見つけるため基質組成物
を試験している。実施例２ではトリス緩衝剤の変性型を
沈澱生成について試験している。実施例３では沈澱生成
を抑制するためにトリス緩衝基質組成物に有機溶剤を加
えている。実施例４では多数の緩衝剤がトリスに代る手
段として成功しないと考えられ、そして2A2M1Pがアルカ
リ性ホスファターゼアッセイ用に基質組成物を安定化す
るために特に適した緩衝剤として認められる。実施例５
ではBCIP/NBTアッセイでの色生成が2A2M1Pで緩衝化され
た組成物およびトリスで緩衝された組成物について比較
される。実施例６ではBCIPとNBTとの種々の濃度での2A2
M1Pのシグナルの強さと安定性についてのこれらの影響
を考察している。実施例７では2A2M1Pにおける長期間の
安定性について種々の基質調剤を検べている。実施例８
では2A2M1P緩衝剤の使用の最適条件を追究している。実
施例９では実施例８の好ましい基質溶液の安定性を試験
している。実施例10では2A2M1P緩衝基質の生成物とトリ
ス緩衝基質の生成物との分光光度の比較を行っている。
実施例11では本発明の固相アッセイへの適用について試
験している。実施例12では本発明の酵素結合エンザイム
イムノアッセイ（ELISA）への適用について試験してい
る。実施例13では本発明のウエスタンブロットアッセイ
への適用を試験している。
を試験している。実施例２ではトリス緩衝剤の変性型を
沈澱生成について試験している。実施例３では沈澱生成
を抑制するためにトリス緩衝基質組成物に有機溶剤を加
えている。実施例４では多数の緩衝剤がトリスに代る手
段として成功しないと考えられ、そして2A2M1Pがアルカ
リ性ホスファターゼアッセイ用に基質組成物を安定化す
るために特に適した緩衝剤として認められる。実施例５
ではBCIP/NBTアッセイでの色生成が2A2M1Pで緩衝化され
た組成物およびトリスで緩衝された組成物について比較
される。実施例６ではBCIPとNBTとの種々の濃度での2A2
M1Pのシグナルの強さと安定性についてのこれらの影響
を考察している。実施例７では2A2M1Pにおける長期間の
安定性について種々の基質調剤を検べている。実施例８
では2A2M1P緩衝剤の使用の最適条件を追究している。実
施例９では実施例８の好ましい基質溶液の安定性を試験
している。実施例10では2A2M1P緩衝基質の生成物とトリ
ス緩衝基質の生成物との分光光度の比較を行っている。
実施例11では本発明の固相アッセイへの適用について試
験している。実施例12では本発明の酵素結合エンザイム
イムノアッセイ（ELISA）への適用について試験してい
る。実施例13では本発明のウエスタンブロットアッセイ
への適用を試験している。
実施例１ 沈澱の原因を検べるために0.1Mジエタノールアミン（pH
9.8）中にNBTを含まぬ1.4mMBCIP;BCIPを含まぬ0.24mM N
BT;又は1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを含む液をそれぞ
れつくつた。この溶液の沈澱生成を室温において観察し
た。
9.8）中にNBTを含まぬ1.4mMBCIP;BCIPを含まぬ0.24mM N
BT;又は1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを含む液をそれぞ
れつくつた。この溶液の沈澱生成を室温において観察し
た。
NBTを含まぬ1.4mM BCIP溶液では沈澱は認められなかつ
た。
た。
BCIPを含まぬ0.24mM NBT溶液では青色沈澱が多量に認め
られた。
られた。
1.4mM BCIPと0.24mM NBTの両方を含む溶液においても青
色沈澱が多量に認められた。
色沈澱が多量に認められた。
したがつてNBTの存在が不用の沈澱を生成すると結論し
た。
た。
実施例２ 変性型トリス緩衝剤がBCIP/NBTアツセイにおいて十分に
働くかどうかまた更に貯蔵中沈澱生成の傾向がないかど
うか検べるため次の実験を行なつた。
働くかどうかまた更に貯蔵中沈澱生成の傾向がないかど
うか検べるため次の実験を行なつた。
標準アツセイの他の成分によつて入るかもしれない異物
から基質組成物を分離するため試験管に酵素結合物と基
質を混合して基質組成物のアツセイを行なつた。
から基質組成物を分離するため試験管に酵素結合物と基
質を混合して基質組成物のアツセイを行なつた。
試験管アツセイにおいて20μｌの結合物〔メリーランド
州ゲイタースバーグ、キルケガールド アンド ペリー
ラボラトリーズ社により0.5mg/mlで供給されたアルカリ
性ホスフアターゼに結合した抗−人間抗体の1:1000稀釈
液〕をクヴエツト中で1.0mlの基質と混合し発色を波長5
75nmにおいて監視した。次式： （式中Ａは575nmにおける吸収度であり、Ｘは試料採取
時点とする）から毎分の吸収度（ΔA/分）増加を計算し
て反応速度の数的比較ができる。
州ゲイタースバーグ、キルケガールド アンド ペリー
ラボラトリーズ社により0.5mg/mlで供給されたアルカリ
性ホスフアターゼに結合した抗−人間抗体の1:1000稀釈
液〕をクヴエツト中で1.0mlの基質と混合し発色を波長5
75nmにおいて監視した。次式： （式中Ａは575nmにおける吸収度であり、Ｘは試料採取
時点とする）から毎分の吸収度（ΔA/分）増加を計算し
て反応速度の数的比較ができる。
トリス緩衝基質の初めの組成は1.4mM BCIP;0.24mM NBT;
100mMトリスベース（pH9.6）および50mM MgCl2を含んで
いた。種々のpHにおける溶液中のトリスの種々の濃度を
比較した。50mM MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを
含む100mMトリス緩衝液と1.4mM BCIPおよび0.24mM NBT
を含む1.0Mトリス緩衝液の結果を表１に示している。
100mMトリスベース（pH9.6）および50mM MgCl2を含んで
いた。種々のpHにおける溶液中のトリスの種々の濃度を
比較した。50mM MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを
含む100mMトリス緩衝液と1.4mM BCIPおよび0.24mM NBT
を含む1.0Mトリス緩衝液の結果を表１に示している。
表１ ΔA575／分 pH 0.1Mトリス 1.0Mトリス 9.0 0.071 0.151 9.2 0.115 0.174 9.4 0.126 0.224 9.6 0.180 0.261 9.8 0.118 0.252 10.0 測定せず 0.222 表１からpH9.6における1.0Mトリス液が元の組成物より
も性能のよいことが決定された。しかしpH9.6において
トリス（pKa＝8.05）はその有効緩衝範囲外である。故
にトリスが有効緩衝剤であるpH値範囲内でトリス液が有
用であると発見されなかつた。
も性能のよいことが決定された。しかしpH9.6において
トリス（pKa＝8.05）はその有効緩衝範囲外である。故
にトリスが有効緩衝剤であるpH値範囲内でトリス液が有
用であると発見されなかつた。
実施例３ 実施例２の溶液で認められた沈澱生成をさけるためトリ
ス緩衝した基質に有機溶媒を加えた。50mMエタノール、
50mMジメチル ホルムアミド又は50mMジメチルスルホキ
シドの様な少量の添加は沈澱生成を抑制するよりもそれ
を促進した。この結果は有機溶媒中の濃厚液としてBCIP
やNBTを加えても沈澱問題を解決しないことを示してい
る。
ス緩衝した基質に有機溶媒を加えた。50mMエタノール、
50mMジメチル ホルムアミド又は50mMジメチルスルホキ
シドの様な少量の添加は沈澱生成を抑制するよりもそれ
を促進した。この結果は有機溶媒中の濃厚液としてBCIP
やNBTを加えても沈澱問題を解決しないことを示してい
る。
実施例４ トリスに代る基質組成物の安定性を増す代替品をえるた
め種々の緩衝剤をしらべた。
め種々の緩衝剤をしらべた。
すべての緩衝剤を100mM濃度でpH9.5に調節し1mM MgCl2
を加えて試験した。緩衝液は45℃で培養した。各基質緩
衝液のBCIP濃度を1.4mMとしNBT濃度を0.24mMとした。各
緩衝剤の安定試験と平行して各貯蔵液の効力をHCGアツ
セイで試験した。
を加えて試験した。緩衝液は45℃で培養した。各基質緩
衝液のBCIP濃度を1.4mMとしNBT濃度を0.24mMとした。各
緩衝剤の安定試験と平行して各貯蔵液の効力をHCGアツ
セイで試験した。
固相アツセイにおいて平均直径約0.1乃至５ミクロンを
もつ多数の実質的球形固体粒子を繊維状物質の多孔性マ
トリツクス上に固定した。繊維状物質はガラス、ポリス
チレン膜をもつガラス、セルロース、ナイロン又は粒子
と相互作用しそれらを固定すると知られている他の繊維
状物質から生成できる。粒子はポリスチレン、ポリメタ
クリレート、ポリプロピレン、ラテツクス、ポリアクリ
ロニトリル、ポリカーボネート又は分析される物質を保
持できる表面をもつ同様の材料より成るものでもよい。
もつ多数の実質的球形固体粒子を繊維状物質の多孔性マ
トリツクス上に固定した。繊維状物質はガラス、ポリス
チレン膜をもつガラス、セルロース、ナイロン又は粒子
と相互作用しそれらを固定すると知られている他の繊維
状物質から生成できる。粒子はポリスチレン、ポリメタ
クリレート、ポリプロピレン、ラテツクス、ポリアクリ
ロニトリル、ポリカーボネート又は分析される物質を保
持できる表面をもつ同様の材料より成るものでもよい。
人の絨毛膜ゴナドトロピン（HCG）アツセイ用微粒子は
1.0mlの5mMメチル エチル スルホネート（MES）緩衝
液（pH4.75）と75μｌの抗−HCG抗体溶液（2mg/ml）中
にカルボキシレート−変性ポリスチレン微粒子（インデ
イアナ州、インジアナポリス、セラゲンより市販）100
μｌを加えて製造した。溶液を攪拌後水1mlに0.5mg濃度
の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドHCl（EDAC）100mlを加えた。溶液を2-8℃で
１夜攪拌後微粒子を遠心分離し0.1％トウイーン−20液
で洗いりん酸塩緩衝された塩溶液（0.01M KH2PO4および
0.15M NaCl、pH7.2）に懸濁させて0.125％溶液とした。
りん酸塩緩衝塩溶液（PBS）に再懸濁後粒子を次の使用
まで2-8℃で貯蔵した。
1.0mlの5mMメチル エチル スルホネート（MES）緩衝
液（pH4.75）と75μｌの抗−HCG抗体溶液（2mg/ml）中
にカルボキシレート−変性ポリスチレン微粒子（インデ
イアナ州、インジアナポリス、セラゲンより市販）100
μｌを加えて製造した。溶液を攪拌後水1mlに0.5mg濃度
の１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミドHCl（EDAC）100mlを加えた。溶液を2-8℃で
１夜攪拌後微粒子を遠心分離し0.1％トウイーン−20液
で洗いりん酸塩緩衝された塩溶液（0.01M KH2PO4および
0.15M NaCl、pH7.2）に懸濁させて0.125％溶液とした。
りん酸塩緩衝塩溶液（PBS）に再懸濁後粒子を次の使用
まで2-8℃で貯蔵した。
ホワツトマンGF/Dガラスフイルターの中心に抗体被覆し
た粒子50μｌを滴加した後豚血清100μｌを加え、フイ
ルターと微粒子を室温の湿室中で30分培養した。次にフ
イルターを300μｌのPBS緩衝液で３回洗つた。フイルタ
ーは使用まで湿室に貯蔵した。微粒子がフイルターのガ
ラス繊維上に不可逆的に付着又は凝集したことは電子顕
微鏡検査によつて確認された。
た粒子50μｌを滴加した後豚血清100μｌを加え、フイ
ルターと微粒子を室温の湿室中で30分培養した。次にフ
イルターを300μｌのPBS緩衝液で３回洗つた。フイルタ
ーは使用まで湿室に貯蔵した。微粒子がフイルターのガ
ラス繊維上に不可逆的に付着又は凝集したことは電子顕
微鏡検査によつて確認された。
抗体−酵素結合物がねずみの抗−HCGモノクロナール抗
体からキヤネイらのImmunology・123、1548（1979）の
方法によつて製造された。アルカリ性ホスフオターゼは
インジアナ州インジアナポリス、ベーリンゲル マンハ
イム社からえられた。
体からキヤネイらのImmunology・123、1548（1979）の
方法によつて製造された。アルカリ性ホスフオターゼは
インジアナ州インジアナポリス、ベーリンゲル マンハ
イム社からえられた。
抗体が被覆された微粒子をもつガラスフイルター物質を
直径12mmの実質的円板に切りとり過剰の液体を吸収させ
る様吸取紙と接触させた。次いで各マトリツクス上にあ
るプレフイルターをとおしてHCG0、50又は100mIU/ml量
を含む人尿の標準試料（カリフオルニア州、サンジエ
ゴ、スクリツプ研究所から市販）５滴（約280μｌ）を
加えた。次に抗体−酵素結合物の３滴をプレフイルター
をとおし各マトリツクスに加え、各マトリツクスを室温
で約２分培養した。プレフイルターをとり除き、1.0ml
の洗浄液（シトレート、ホスフエートおよびトウイーン
20を含む）を各マトリツクスに加えて過剰の抗体−酵素
結合物を除去した。マトリツクスを再び吸取紙上にお
き、試験する基質緩衝液５滴（約250μｌ）を各マトリ
ツクスに加えた。２分後に1mlの洗液を加え各マトリツ
クスの色の発生を肉眼検査した。HCGを含む試験試料の
発色が認められた。発色に対応する吸光度を普通の分光
光度計を用いて測定した。結果を45℃における培養日数
と不合格理由と共に表２に示している。
直径12mmの実質的円板に切りとり過剰の液体を吸収させ
る様吸取紙と接触させた。次いで各マトリツクス上にあ
るプレフイルターをとおしてHCG0、50又は100mIU/ml量
を含む人尿の標準試料（カリフオルニア州、サンジエ
ゴ、スクリツプ研究所から市販）５滴（約280μｌ）を
加えた。次に抗体−酵素結合物の３滴をプレフイルター
をとおし各マトリツクスに加え、各マトリツクスを室温
で約２分培養した。プレフイルターをとり除き、1.0ml
の洗浄液（シトレート、ホスフエートおよびトウイーン
20を含む）を各マトリツクスに加えて過剰の抗体−酵素
結合物を除去した。マトリツクスを再び吸取紙上にお
き、試験する基質緩衝液５滴（約250μｌ）を各マトリ
ツクスに加えた。２分後に1mlの洗液を加え各マトリツ
クスの色の発生を肉眼検査した。HCGを含む試験試料の
発色が認められた。発色に対応する吸光度を普通の分光
光度計を用いて測定した。結果を45℃における培養日数
と不合格理由と共に表２に示している。
表２に示すとおりこれらの各緩衝剤は酵素を抑制するか
又はクロモーゲン沈澱を促進するかいづれかにより不良
とわかつた。フエノールとCHES中NBTは培養前不溶性で
あつた。（即ち０日であつた。） 実施例２に記載の試験管アツセイにおいて0.1Mと1.0Mに
おけるpH9.6のトリス緩衝液を11.4mM BCIPと0.24mM NBT
基質溶液中の1.0Mジエタノールアミン（pH9.3）と0.1M
2A2MIP（pH9.8）と比較した。結果を表３に示してい
る。
又はクロモーゲン沈澱を促進するかいづれかにより不良
とわかつた。フエノールとCHES中NBTは培養前不溶性で
あつた。（即ち０日であつた。） 実施例２に記載の試験管アツセイにおいて0.1Mと1.0Mに
おけるpH9.6のトリス緩衝液を11.4mM BCIPと0.24mM NBT
基質溶液中の1.0Mジエタノールアミン（pH9.3）と0.1M
2A2MIP（pH9.8）と比較した。結果を表３に示してい
る。
表２において1.0Mトリスと1.0Mジエタノールアミンは室
温において2-3日で沈澱生成したため45℃で試験しなか
つた。
温において2-3日で沈澱生成したため45℃で試験しなか
つた。
したがつて1.0Mトリス中で製造した基質は0.1Mトリス中
でつくつたものよりも容易に沈澱すると認められた。更
に重要なことはこの実験で2A2M1Pは基質組成物（クロモ
ーゲン）の存在で効力と便利な貯蔵期間の両方を示す唯
一の緩衝剤であつた。
でつくつたものよりも容易に沈澱すると認められた。更
に重要なことはこの実験で2A2M1Pは基質組成物（クロモ
ーゲン）の存在で効力と便利な貯蔵期間の両方を示す唯
一の緩衝剤であつた。
実施例５ 他の一連の実験において2A2M1P中につくつた基質におけ
る発色速度がトリス中の同じ基質の発色速度に匹敵し
た。各アツセイにおいて実施例２のとおり20μｌの結合
物を1.0mlの基質組成物と混合し発色を吸光光度計でし
らべた。溶液は0.1M 2A2M1P（pH9.8）、1.4mM BCIP、0.
24mM NBTおよび1.0mM MgCl2；と0.1Mトリス（pH9.6）、
1.4mM BCIP、0.24mM NBTおよび50mM MgCl2であつた。
る発色速度がトリス中の同じ基質の発色速度に匹敵し
た。各アツセイにおいて実施例２のとおり20μｌの結合
物を1.0mlの基質組成物と混合し発色を吸光光度計でし
らべた。溶液は0.1M 2A2M1P（pH9.8）、1.4mM BCIP、0.
24mM NBTおよび1.0mM MgCl2；と0.1Mトリス（pH9.6）、
1.4mM BCIP、0.24mM NBTおよび50mM MgCl2であつた。
図１に示すとおり575nmにおける光学密度（O.D.）対時
間のプロツトにおいて2A2M1Pの結果は曲線Ａでまたトリ
スの結果は曲線Ｂで示されているが、発色速度は２分後
大体直線であると示されている。
間のプロツトにおいて2A2M1Pの結果は曲線Ａでまたトリ
スの結果は曲線Ｂで示されているが、発色速度は２分後
大体直線であると示されている。
0.1M 2A2M1Pについて式（１）を用いて 0.1Mトリスについては 実施例６ 適当な色の強力信号と2A2M1Pにおける安定性増進を与え
るBCIPとNBTの濃度をきめるため実験を行なつた。
るBCIPとNBTの濃度をきめるため実験を行なつた。
この要求に適するBCIPとNBTの濃度をきめるに1.0mM MgC
l2を含む0.1M 2A2M1P（pH9.8）中に９基質のマトリツク
スをつくつた。BCIP濃度は2.3mM、1.4mM又は1.0mMであ
つた。またNBT濃度は0.24mM、0.10mM又は0.05mMであつ
た。これらの基質を実施例２による試験管アツセイおよ
び群Ａストレプトコカスのアツセイによつて試験した。
試験管アツセイの結果を表４にΔA575/分として示して
いる。
l2を含む0.1M 2A2M1P（pH9.8）中に９基質のマトリツク
スをつくつた。BCIP濃度は2.3mM、1.4mM又は1.0mMであ
つた。またNBT濃度は0.24mM、0.10mM又は0.05mMであつ
た。これらの基質を実施例２による試験管アツセイおよ
び群Ａストレプトコカスのアツセイによつて試験した。
試験管アツセイの結果を表４にΔA575/分として示して
いる。
表４に対し比較基質緩衝液組成物（0.1Mトリス（9.
6）、50mM MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを含
む）はΔA575／分値0.174を示した。
6）、50mM MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBTを含
む）はΔA575／分値0.174を示した。
群Ａストレプトコカスアツセイの結果は表５に示してい
るが、このアツセイは兎抗−群Ａストレプトコカス抗体
を被覆したポリスチレン微粒子が結合しているマトリツ
クスにストレプトコツカルな抽出溶液（ml当り５×104
細胞からの）３滴を加えた。次いでアルカリ性ホスフア
ターゼが結合した兎抗−群Ａストレプトコツカス抗体溶
液３滴を加えた。マトリツクスを洗い基質組成物を加え
ると２分後に発色した。マトリツクスを洗つた後レフレ
クタンス測定機で色強度を測定した。結果を表５に示し
ているが、低レフレクタンスは暗点を示し、またこれに
ついて比較緩衝剤組成物〔0.1Mトリス（pH9.6）、50mM
MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBT〕はアツセイにお
いてレフレクタンス37.0を示した。
るが、このアツセイは兎抗−群Ａストレプトコカス抗体
を被覆したポリスチレン微粒子が結合しているマトリツ
クスにストレプトコツカルな抽出溶液（ml当り５×104
細胞からの）３滴を加えた。次いでアルカリ性ホスフア
ターゼが結合した兎抗−群Ａストレプトコツカス抗体溶
液３滴を加えた。マトリツクスを洗い基質組成物を加え
ると２分後に発色した。マトリツクスを洗つた後レフレ
クタンス測定機で色強度を測定した。結果を表５に示し
ているが、低レフレクタンスは暗点を示し、またこれに
ついて比較緩衝剤組成物〔0.1Mトリス（pH9.6）、50mM
MgCl2、1.4mM BCIPおよび0.24mM NBT〕はアツセイにお
いてレフレクタンス37.0を示した。
表５に示すとおりNBTを0.05mMに減少するとマトリツク
ス上の沈澱の色は紫から青に変つた。レフレクタンス読
みは僅かの差を認めただけであるが、青色は匹敵するレ
フレクタンスをもつ紫点の様に暗色であると眼で認めな
かつた。３基質組成物は色の肉眼知覚と光学レフレクタ
ンス測定の両方で優秀な性能をもつと一貫して選ばれ
た。これらは1.4mM BCIP、0.24mM NBT;1.4mM BCIP、0.1
0mM NBT;および1.0mM BCIP、0.24mM NBT、であつた。
ス上の沈澱の色は紫から青に変つた。レフレクタンス読
みは僅かの差を認めただけであるが、青色は匹敵するレ
フレクタンスをもつ紫点の様に暗色であると眼で認めな
かつた。３基質組成物は色の肉眼知覚と光学レフレクタ
ンス測定の両方で優秀な性能をもつと一貫して選ばれ
た。これらは1.4mM BCIP、0.24mM NBT;1.4mM BCIP、0.1
0mM NBT;および1.0mM BCIP、0.24mM NBT、であつた。
実施例７ 室温における長期間安定性の短時間表示をえるため基質
組成物を45℃で培養した。
組成物を45℃で培養した。
実施例４に記載したとおり、0.1M 2A2M1P（pH9.8）、1.
0mM MgCl2 pH9.8中でつくりガラスびん中暗所45℃で貯
えた各基質についてHCGアツセイを行なつた。
0mM MgCl2 pH9.8中でつくりガラスびん中暗所45℃で貯
えた各基質についてHCGアツセイを行なつた。
表６はBCIP/NBTマトリツクスから45℃貯蔵によつて基質
中に沈澱が見えはじめた日数を示している。
中に沈澱が見えはじめた日数を示している。
表６でわかるとおり0.1Mトリス、0.1M 2A2M1P、および
0.1M 2A2M1P中1.4mM BCIPと0.24mM NBTを含む基質は４
日間安定でいた。これらの同じ液にMgCl2を加えると12
日まで沈澱が認められなかつた。これによつてBCIPとNB
Tの濃度減少とMgCl2添加とによつて沈澱生成をおくらせ
うることがわかる。
0.1M 2A2M1P中1.4mM BCIPと0.24mM NBTを含む基質は４
日間安定でいた。これらの同じ液にMgCl2を加えると12
日まで沈澱が認められなかつた。これによつてBCIPとNB
Tの濃度減少とMgCl2添加とによつて沈澱生成をおくらせ
うることがわかる。
実施例８ 2A2M1P（pKa9.3）を緩衝剤として使用する最適条件をし
らべた。
らべた。
図２に示すとおり2A2M1P中に製造された基質の最適pHを
定めた。基質を実施例２によつて管アツセイ（曲線Ａ）
で、またルベラに対する高濃度抗体を含む高陽性血清
（曲線Ｂ）と陰性試料（曲線Ｃ）を用いるルベラビール
スアツセイで試験した。0.1Mトリス（pH9.6）中につく
つた基質は対照として管アツセイにおいてＤを、Ｂの様
なルベラ高陽性アツセイにおいてＥを、またルベラ陰性
アツセイにおいてＦを含んでいた。
定めた。基質を実施例２によつて管アツセイ（曲線Ａ）
で、またルベラに対する高濃度抗体を含む高陽性血清
（曲線Ｂ）と陰性試料（曲線Ｃ）を用いるルベラビール
スアツセイで試験した。0.1Mトリス（pH9.6）中につく
つた基質は対照として管アツセイにおいてＤを、Ｂの様
なルベラ高陽性アツセイにおいてＥを、またルベラ陰性
アツセイにおいてＦを含んでいた。
各組成物は100mM2A2M1P中1.4mM BCIP、0.24mM NBT、お
よび1.0mM MgCl2を含んでいた。各溶液のpHを濃HClを用
い調節した。微粒子をルベラビールスで被覆し次いでル
ベラビールスに対する抗体を含む人の血清にさらした後
アルカリ性ホスフアターゼ結合兎抗−人間抗体にさらし
た。
よび1.0mM MgCl2を含んでいた。各溶液のpHを濃HClを用
い調節した。微粒子をルベラビールスで被覆し次いでル
ベラビールスに対する抗体を含む人の血清にさらした後
アルカリ性ホスフアターゼ結合兎抗−人間抗体にさらし
た。
曲線ＡはちがつたpHにおける2A2M1P中で緩衝された基質
の試験管アツセイにおける発色速度を示している。比較
のため点Ｄはトリス（0.1M、pH9.8、50mM MgCl2含有）
中緩衝された基質の発色速度を示している。
の試験管アツセイにおける発色速度を示している。比較
のため点Ｄはトリス（0.1M、pH9.8、50mM MgCl2含有）
中緩衝された基質の発色速度を示している。
各基質組成物をルベラアツセイを用いて分析した。ルベ
ラに対する高濃度抗体をもつ（高陽性）血清又はルベラ
に対する抗体に陰性な血清をマトリツクスにとおした。
このあと実施例４におけるとおり抗体に結合した抗−人
間アルカリ性ホスフアターゼによつて処理した。適当に
洗い基質を加え２分間で発色した。水洗して過剰の基質
を除いて発色を停止しレフレクタンス読みとりによつて
色強度を測定した。曲線Ｂは高陽性試料によつて生じた
信号を示しておりまた曲線Ｃは陰性試料によつて生じた
シグナルを示している。点ＥとＦは0.1Mトリス、50mM M
gCl2（pH9.6、1.4mM BCIP、0.24mM NBT）中で緩衝され
た基質を用い生成した点のレフレクタンスを示してい
る。
ラに対する高濃度抗体をもつ（高陽性）血清又はルベラ
に対する抗体に陰性な血清をマトリツクスにとおした。
このあと実施例４におけるとおり抗体に結合した抗−人
間アルカリ性ホスフアターゼによつて処理した。適当に
洗い基質を加え２分間で発色した。水洗して過剰の基質
を除いて発色を停止しレフレクタンス読みとりによつて
色強度を測定した。曲線Ｂは高陽性試料によつて生じた
信号を示しておりまた曲線Ｃは陰性試料によつて生じた
シグナルを示している。点ＥとＦは0.1Mトリス、50mM M
gCl2（pH9.6、1.4mM BCIP、0.24mM NBT）中で緩衝され
た基質を用い生成した点のレフレクタンスを示してい
る。
図２に示したとおり2A2M1Pで緩衝された基質の最適pHは
試験管アツセイとルベラアツセイの双方において0.1M溶
液中で9.8であつた。2A2M1P濃度を1.0Mに増しても追加
シグナルは認められなかつた。
試験管アツセイとルベラアツセイの双方において0.1M溶
液中で9.8であつた。2A2M1P濃度を1.0Mに増しても追加
シグナルは認められなかつた。
本発明による基質組成物の成分はBCIPとNBTのちがつた
濃度において実施例２による試験管アツセイ（基質1.0m
l/結合物20μｌ）で試験されている。
濃度において実施例２による試験管アツセイ（基質1.0m
l/結合物20μｌ）で試験されている。
表７は0.1M 2A2M1P（pH9.8）、1.0mM MgCl2および0.24m
M NBT中の種々の濃度のBCIPについての結果を示してい
る。
M NBT中の種々の濃度のBCIPについての結果を示してい
る。
表７ BCIP濃度 ΔA575／分 1.0mM 0.192 2.5mM 0.244 5.0mM 0.209 10.0mM 0.098 表８は0.1M 2A2M1P（pH9.8）、1.0mM MgCl2、および2.3
mM BCIP中の種々の濃度のNBTに対する結果をあらわして
いる。
mM BCIP中の種々の濃度のNBTに対する結果をあらわして
いる。
表８ BCIP濃度 ΔA575／分 0.05mM 0.267 0.10mM 0.360 0.25mM 0.382 0.50mM 0.340 表７に示すとおり1.0乃至10mM濃度のBCIPが適当である
ことがわかつた。表８に示すとおりNBT濃度0.05乃至0.5
mMも適当であるとわかつた。2A2M1Pはこれら実施例で0.
1Mと1.0Mにおいてのみ使われたが、この緩衝剤は他の濃
度においても十分作用する。
ことがわかつた。表８に示すとおりNBT濃度0.05乃至0.5
mMも適当であるとわかつた。2A2M1Pはこれら実施例で0.
1Mと1.0Mにおいてのみ使われたが、この緩衝剤は他の濃
度においても十分作用する。
上記表１の条件のもとでその実験と平行して2A2M1Pの最
適pH範囲をしらべて表９の結果をえた。
適pH範囲をしらべて表９の結果をえた。
表９ ΔA575／分 pH 0.1M 2A2M1P 9.0 測定せず 9.2 0.114 9.4 0.152 9.6 0.180 9.8 0.221 10.0 0.200 表９に報告した結果に基づいて本発明の2A2M1P基質組成
物は9.7乃至9.9のpH範囲内に調節するとよい。
物は9.7乃至9.9のpH範囲内に調節するとよい。
基質溶液中のマグネシウムの役割は決定されない。マグ
ネシウム塩は高pHにおいて非常に溶解度小さく、pH10.3
において約1.4mMである。微量（10乃至1000μＭ）のマ
グネシウム添加はこれらの基質によつて出るシグナルに
影響をもたなかつた。しかし1mM MgCl2の添加は基質が4
5℃の高温とされたときクロモーゲン沈澱を抑制する。
ネシウム塩は高pHにおいて非常に溶解度小さく、pH10.3
において約1.4mMである。微量（10乃至1000μＭ）のマ
グネシウム添加はこれらの基質によつて出るシグナルに
影響をもたなかつた。しかし1mM MgCl2の添加は基質が4
5℃の高温とされたときクロモーゲン沈澱を抑制する。
組成物の重要な問題は基質の安定性である。2A2M1Pへの
変更は安定性を増すが、実施例７に報告された高温度研
究ではBCIPとNBTの濃度減少が安定性増加を示してい
る。したがつて現在では本発明による基質組成物にBCIP
1.2mMとNBT 0.17mMの濃度の使用が好ましい。
変更は安定性を増すが、実施例７に報告された高温度研
究ではBCIPとNBTの濃度減少が安定性増加を示してい
る。したがつて現在では本発明による基質組成物にBCIP
1.2mMとNBT 0.17mMの濃度の使用が好ましい。
上記結果に基づいて本発明による好ましいアルカリ性ホ
スフアターゼ基質組成物は100mM 2A2M1P（pH9.8）;1.2m
M BCIP;0.17mM NBT;1.0mM mgCl2；および0.02％ナトリ
ウム アザイドを含む。１の溶液に対し140mgNBTを約
475mlの蒸留水と混合し暗所で30分間攪拌し溶液Ａとす
る。次に攪拌中の蒸留水450mlに10mlが2A2M1Pを加え少
なくも５分間混合して溶液Ｂとする。溶液Ｂに520mgのB
CIPを加え暗所で少なくも20分間攪拌する。溶液ＢのpH
を6.0NHClでpH9.8（9.7乃至9.9）に調節する。溶液Ａと
Ｂをしづかに混合攪拌する。1.0mM MgCl2水溶液1mlを混
合物に加えた後200mgのナトリウムアザイトを加え固体
がすべてとけるまで攪拌する。水を加えて全容を１と
し、0.2μｍナルゲン フイルターで過し2-8℃の暗所
に貯える。この基質製造でNBTの0.1M 2A2M1Pに不溶な問
題を避けるため2A2M1Pを加える前蒸留水にとかす必要が
ある。
スフアターゼ基質組成物は100mM 2A2M1P（pH9.8）;1.2m
M BCIP;0.17mM NBT;1.0mM mgCl2；および0.02％ナトリ
ウム アザイドを含む。１の溶液に対し140mgNBTを約
475mlの蒸留水と混合し暗所で30分間攪拌し溶液Ａとす
る。次に攪拌中の蒸留水450mlに10mlが2A2M1Pを加え少
なくも５分間混合して溶液Ｂとする。溶液Ｂに520mgのB
CIPを加え暗所で少なくも20分間攪拌する。溶液ＢのpH
を6.0NHClでpH9.8（9.7乃至9.9）に調節する。溶液Ａと
Ｂをしづかに混合攪拌する。1.0mM MgCl2水溶液1mlを混
合物に加えた後200mgのナトリウムアザイトを加え固体
がすべてとけるまで攪拌する。水を加えて全容を１と
し、0.2μｍナルゲン フイルターで過し2-8℃の暗所
に貯える。この基質製造でNBTの0.1M 2A2M1Pに不溶な問
題を避けるため2A2M1Pを加える前蒸留水にとかす必要が
ある。
実施例９ 実施例８の再調製したアルカリ性ホスフアターゼ基質溶
液の安定性を試験した。基質溶液を大気温、2-8℃、37
℃および45℃で貯えた。表10に示した日数貯蔵後の試料
を実施例４のHCGアツセイによつて検べた。
液の安定性を試験した。基質溶液を大気温、2-8℃、37
℃および45℃で貯えた。表10に示した日数貯蔵後の試料
を実施例４のHCGアツセイによつて検べた。
実施例10 本発明による2A2M1Pで緩衝された基質生成物とトリスで
緩衝された基質生成物との分光測光比較を図３に示して
いる。
緩衝された基質生成物との分光測光比較を図３に示して
いる。
図３に基質とアルカリ性ホスフアターゼの反応による生
成物の吸収スペクトルをあらわしている。線Ａは1.2mM
BCIPと0.17mM NBTを含む0.1M 2A2M1P（pH9.6）水溶液と
1.0mM MgCl2中につくられた基質の結果をあらわしてい
る。線Ｔは1.4mM BCIPと0.24mM NBTを含む0.1Mトリス
（pH9.6）と50mM MgCl2中につくられた基質の結果を示
している。
成物の吸収スペクトルをあらわしている。線Ａは1.2mM
BCIPと0.17mM NBTを含む0.1M 2A2M1P（pH9.6）水溶液と
1.0mM MgCl2中につくられた基質の結果をあらわしてい
る。線Ｔは1.4mM BCIPと0.24mM NBTを含む0.1Mトリス
（pH9.6）と50mM MgCl2中につくられた基質の結果を示
している。
図３の結果が示すとおり両組成物の生成物は本質的に同
じである。
じである。
実施例11 本発明は固相アツセイにも使用できる。固相アツセイの
１例は実施例４に記載した種類であるが標準尿試料の代
りに未知試料を用いるHCGのアツセイである。このアツ
セイの粒子はHCGに特定の抗体で被覆されておりガラス
繊維マトリツクスにとらえられる。患者からの尿試料は
マトリツクスをとおされる。尿中にHCGがあればHCGはHC
Gに特定の抗体と結合する。
１例は実施例４に記載した種類であるが標準尿試料の代
りに未知試料を用いるHCGのアツセイである。このアツ
セイの粒子はHCGに特定の抗体で被覆されておりガラス
繊維マトリツクスにとらえられる。患者からの尿試料は
マトリツクスをとおされる。尿中にHCGがあればHCGはHC
Gに特定の抗体と結合する。
HCGに特定な第２抗体はアルカリ性ホスフアターゼに共
役する。第２抗体溶液をマトリツクスにとおすことによ
つて第２抗体はそこにあるHCGと結合する。
役する。第２抗体溶液をマトリツクスにとおすことによ
つて第２抗体はそこにあるHCGと結合する。
マトリツクスを洗い本発明による基質組成物と共に培養
した後マトリツクスから過剰基質を洗浄して反応を中止
させる。
した後マトリツクスから過剰基質を洗浄して反応を中止
させる。
HCGの存在でHCGに結合したアルカリ性フオスフアターゼ
と共役した抗体は基質組成物と反応して暗緑黒点を生ず
る。HCGがなければ共役した抗体は洗い流されて点を生
成しない。
と共役した抗体は基質組成物と反応して暗緑黒点を生ず
る。HCGがなければ共役した抗体は洗い流されて点を生
成しない。
実施例12 本発明による基質組成物は血液試料中の抗体の存在を検
べるための酵素結合したインミユノソーベント アツセ
イに使用できる。このアツセイで特定抗原はニトロセル
ロース上につけられる。ニトロセルロースは患者試料と
培養され次いで人の抗体に対するアルカリ性ホスフアタ
ーゼと共役した抗体と培養される。つづいて本発明によ
る基質組成物とニトロセルロースの培養は、試料中につ
けた抗原に特定の抗体があれば、青黒色点を生成する。
この抗体がなければ点はできない。
べるための酵素結合したインミユノソーベント アツセ
イに使用できる。このアツセイで特定抗原はニトロセル
ロース上につけられる。ニトロセルロースは患者試料と
培養され次いで人の抗体に対するアルカリ性ホスフアタ
ーゼと共役した抗体と培養される。つづいて本発明によ
る基質組成物とニトロセルロースの培養は、試料中につ
けた抗原に特定の抗体があれば、青黒色点を生成する。
この抗体がなければ点はできない。
実施例13 本発明による基質組成物はウエスターン ブロツト ア
ツセイに使用できる。この種のアツセイの蛋白質は電気
泳動性ゲルからニトロセルロースに移される。ニトロセ
ルロースをアルカリ性ホスフアターゼと共役した特定蛋
白質に対する抗体と培養した後本発明による基質組成物
と培養することによつて特定蛋白質についてしらべるこ
とができる。蛋白質があれば共役抗体はそれと結合して
アルカリ性ホスフアターゼと基質の反応生成物は蛋白質
の位置に沈澱する。
ツセイに使用できる。この種のアツセイの蛋白質は電気
泳動性ゲルからニトロセルロースに移される。ニトロセ
ルロースをアルカリ性ホスフアターゼと共役した特定蛋
白質に対する抗体と培養した後本発明による基質組成物
と培養することによつて特定蛋白質についてしらべるこ
とができる。蛋白質があれば共役抗体はそれと結合して
アルカリ性ホスフアターゼと基質の反応生成物は蛋白質
の位置に沈澱する。
本発明による緩衝されたホスフアターゼ基質は２目的：
第１の安定性増進と第２の信号又は信号対ノイズ比率の
向上を達成する。2A2M1Pの信号対ノイズ比率のトリスよ
りも向上することは実施例５の試験管アツセイのより高
い信号と実施例８のルベラ アツセイのより強い色によ
つて示されている。
第１の安定性増進と第２の信号又は信号対ノイズ比率の
向上を達成する。2A2M1Pの信号対ノイズ比率のトリスよ
りも向上することは実施例５の試験管アツセイのより高
い信号と実施例８のルベラ アツセイのより強い色によ
つて示されている。
トリスから微量のMg++を使う2A2M1Pへの変更は組成物安
定性を向上している。更に2A2M1P中につくられた基質は
試験管アツセイにおいてより大きなΔA/分値とアツセイ
において少なくもトリスで緩衝されて基質に匹敵する信
号をもつていた。
定性を向上している。更に2A2M1P中につくられた基質は
試験管アツセイにおいてより大きなΔA/分値とアツセイ
において少なくもトリスで緩衝されて基質に匹敵する信
号をもつていた。
本発明を好ましい実施態様について記述しているが、修
正法や改良法は当業界の技術者に考えられるものであ
る。例えばBCIPが好ましい実施態様に使われているが、
K3Fe(CN)6の様な適当な酸化剤が供給されるならばイン
ドリル ホスフエートを含む他のインジゴ同族体が本発
明に使用できると期待される。また他のテトラゾリウム
塩も本発明に使用できると期待され、事実ニトロブルー
テトラゾリウムは実施例４のHCGアツセイに指示薬とし
て便利に着色点を生ずることが認められた。したがつて
本発明の特許請求範囲は本発明の範囲内にはいる様なす
べての同様な変更法を包含するものと考える。
正法や改良法は当業界の技術者に考えられるものであ
る。例えばBCIPが好ましい実施態様に使われているが、
K3Fe(CN)6の様な適当な酸化剤が供給されるならばイン
ドリル ホスフエートを含む他のインジゴ同族体が本発
明に使用できると期待される。また他のテトラゾリウム
塩も本発明に使用できると期待され、事実ニトロブルー
テトラゾリウムは実施例４のHCGアツセイに指示薬とし
て便利に着色点を生ずることが認められた。したがつて
本発明の特許請求範囲は本発明の範囲内にはいる様なす
べての同様な変更法を包含するものと考える。
図１は2A2M1P緩衝液又はトリス緩衝液のいづれか中で示
された様なアルカリ性ホスフアターゼアツセイにおける
基質色生成速度の図である。 図２は2A2M1P緩衝液中種々のpHにおけるアツセイ結果の
図である。 図３は2A2M1P緩衝液又はトリス緩衝液のいづれかにおけ
る基質とアルカリ性ホスフアターゼの反応により生成さ
れた生成物の吸収スペクトル図である。
された様なアルカリ性ホスフアターゼアツセイにおける
基質色生成速度の図である。 図２は2A2M1P緩衝液中種々のpHにおけるアツセイ結果の
図である。 図３は2A2M1P緩衝液又はトリス緩衝液のいづれかにおけ
る基質とアルカリ性ホスフアターゼの反応により生成さ
れた生成物の吸収スペクトル図である。
Claims (9)
- 【請求項１】５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル
ホスフェート；該ホスフェートと反応して検出可能なシ
グナルを生ずるために有効な濃度のテトラゾリウム塩；
および水溶液中での該ホスフェートと該テトラゾリウム
塩との反応を反応を進行させるpHの範囲内に緩衝化する
ために有効な濃度の２−アミノ−２−メチル−１−プロ
パノールよりなるアルカリ性ホスファターゼアッセイ用
の基質組成物。 - 【請求項２】５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル
ホスフェートが1.0〜10mMの濃度である特許請求の範囲
第１項記載の基質組成物。 - 【請求項３】テトラゾリウム塩がニトロブルーテトラゾ
リウムである特許請求の範囲第１項記載の基質組成物。 - 【請求項４】ニトロブルーテトラゾリウムが0.05〜0.5m
Mの濃度である特許請求の範囲第３項記載の基質組成
物。 - 【請求項５】２−アミノ−２−メチル−１−プロパノー
ルが0.1〜1.0Mの濃度である特許請求の範囲第１項記載
の基質組成物。 - 【請求項６】1.0〜10mMの濃度をもつ５−ブロモ−４−
クロル−３−インドリルホスフェート;0.05〜0.5mMの濃
度をもつニトロブルーテトラゾリウム；および0.1〜1.0
Mの濃度をもつ２−アミノ−２−メチル−１−プロパノ
ールよりなる特許請求の範囲第１項記載の基質組成物。 - 【請求項７】1.0mMの濃度のMgCl2をさらに含む特許請求
の範囲第６項記載の基質組成物。 - 【請求項８】５−ブロモ−４−クロル−３−インドリル
ホスフェートが濃度1.2mMであり、ニトロブルーテトラ
ゾリウムが濃度0.17mMであり、かつ２−アミノ−２−メ
チル−１−プロパノールが濃度100mMである特許請求の
範囲第７項記載の基質組成物。 - 【請求項９】濃度0.02％のナトリウムアジドをさらに含
む特許請求の範囲第８項記載の基質組成物。
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