JPH0694478B2 - Novel chitin-binding protein CB1, its production method and use - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、抗真菌性および殺虫性
を併せ有する新規なキチン結合性蛋白ＣＢ１およびその
製造法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel chitin-binding protein CB1 having both antifungal properties and insecticidal properties, and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】キチン質は真菌の細胞壁や昆虫の表皮な
どに含まれているが、高等動物や植物には通常存在しな
い。そこで、キチンの生合成や代謝を阻害する薬剤の開
発が試みられているが、キチン合成酵素阻害剤のポリオ
キシン（ジャーナル オブ アンティバイオティクス、
１８巻、１３１頁、１９６５年）やキチナーゼ阻害剤の
アロサミジン（ジャーナル オブ アンティバイオティ
クス、４０巻、２９６頁、１９８２年）などが報告され
ているにすぎない。Chitin is contained in the cell wall of fungi and the epidermis of insects, but it is not normally present in higher animals and plants. Therefore, attempts have been made to develop drugs that inhibit the biosynthesis and metabolism of chitin. However, the chitin synthase inhibitor polyoxin (Journal of Antibiotics,
18: 131, 1965) and the chitinase inhibitor allosamidin (Journal of Antibiotics, 40: 296, 1982).

【０００３】さらに、バチルス属細菌が生産する抗菌性
物質（物質名の記載はない）であって糸状菌に対して抗
菌性を有する物質が報告されている（日本農薬学会誌、
１５巻、１頁、１９９０年）が、この物質はブタノール
ではほとんど抽出されず、水層に大部分が残留すること
（日本農薬学会誌、１５巻、７頁、１９９０年）、分子
量が約５2,０００であること（日本農芸化学大会講演要
旨、３０８頁、１９８９年）から、本発明の蛋白ＣＢ１
とは別物質である。また、「バチルス・スブチリス由来
の抗菌物質」（米特許５０６１４９５）は、ＣＢ１と比
べ、分子量が約１万以上大きく、含まれる脂肪酸組成も
大きく異なる。Further, it has been reported that an antibacterial substance produced by Bacillus bacteria (no substance name is described) and having an antibacterial property against filamentous fungi (Journal of Agrochemical Society of Japan,
Volume 15, p. 1, 1990), but this substance is hardly extracted with butanol, and most of it remains in the aqueous layer (Journal of the Pesticides Society of Japan, vol. 15, p. 7, 1990), and the molecular weight is about 52. It is 1,000 (Agricultural Chemistry Conference abstract, p. 308, 1989).
Is another substance. The "antibacterial substance derived from Bacillus subtilis" (US Pat. No. 5,061,495) has a molecular weight of about 10,000 or more as compared with CB1 and the fatty acid composition contained therein is also significantly different.

【０００４】バチルス属細菌が生産する抗真菌性のリポ
ペプチドとしては、バシロマイシン（ザ ジャーナル
オブ アンティバイオティクス、３７巻、１６００頁、
１９８４年）などがあるが、いずれも分子量が１万以下
と低く、構成脂肪酸組成の比較からも、本発明の蛋白Ｃ
Ｂ１と異なるものである。The antifungal lipopeptides produced by Bacillus bacteria include basilomycin (The Journal
Of Antibiotics, 37, 1600 pages,
1984) and the like, but all have a low molecular weight of 10,000 or less.
It is different from B1.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】高等動物や植物には作
用せず、真菌や昆虫に特異的に作用する薬剤として、キ
チン関連の抗真菌性および殺虫性を持つ新しい物質が常
に求められている。本発明の目的は、抗真菌性と殺虫性
を併せ持つキチン結合性の新規蛋白ＣＢ１とその製造法
を提供することにある。As a drug which does not act on higher animals or plants but specifically on fungi or insects, new substances having antifungal and insecticidal properties related to chitin are always required. . An object of the present invention is to provide a novel chitin-binding protein CB1 having both antifungal properties and insecticidal properties, and a method for producing the same.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属す
る菌株の培養液中に、真菌や昆虫の生育を阻害する物質
を見出した。この物質はブタノールにより抽出すること
ができ、単離精製の結果、本物質はキチンに結合する
が、キチン分解活性を持たない蛋白性の物質であり、種
々の理化学的および生物学的諸性質から、新規な蛋白で
あることを確認し、ＣＢ１と称することとした。As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found a substance that inhibits the growth of fungi and insects in the culture solution of strains belonging to the genus Bacillus. It was This substance can be extracted with butanol, and as a result of isolation and purification, this substance is a proteinaceous substance that binds to chitin but does not have chitin-degrading activity. Due to various physicochemical and biological properties, After confirming that it was a novel protein, it was named CB1.

【０００７】本発明は、後述する諸性質を有し、抗真菌
性と殺虫性を併せ持つキチン結合性蛋白ＣＢ１、該蛋白
ＣＢ１生産能を有するバチルス属細菌を培養し、その培
養物から蛋白ＣＢ１を採取することを特徴とする蛋白Ｃ
Ｂ１の製造法並びに該蛋白ＣＢ１を有効成分として含有
する抗真菌剤，殺虫剤に関する。The present invention cultivates a chitin-binding protein CB1 having the antifungal and insecticidal properties and a Bacillus bacterium having the ability to produce the protein CB1 having the properties described below, and the protein CB1 is obtained from the culture. Protein C characterized by being collected
It relates to a method for producing B1 and an antifungal agent or insecticide containing the protein CB1 as an active ingredient.

【０００８】以下に本発明を詳細に説明する。本発明に
用いる微生物は、バチルス属に属し、蛋白ＣＢ１生産能
を有するものであれば特に限定されないが、一例として
本発明者が分離したバチルス・リケニフォルミス ＣＢ
１株が挙げられる。その菌学的性質は以下の通りであ
る。The present invention will be described in detail below. The microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it belongs to the genus Bacillus and has the protein CB1 producing ability, but as an example, the Bacillus licheniformis CB isolated by the present inventor.
One strain is mentioned. Its bacteriological properties are as follows.

【０００９】（１） 形態学的特徴 肉汁寒天培地において培養した菌体を用いた。細胞の形
は桿菌状で、大きさは0.５〜1.０μｍ×2.０〜7.０μ
ｍ、鎖状に連なる場合がある。運動性が有り、鞭毛は周
毛である。球または楕円形の胞子を形成し、その大きさ
は、0.５〜1.０μｍ×0.５〜1.０μｍである。グラム染
色陽性である。(1) Morphological characteristics Bacteria cultured in a broth agar medium were used. The cell shape is rod-shaped, and the size is 0.5-1.0 μm × 2.0-7.0 μ
m, sometimes chained. It is motile, and flagella are pericardium. It forms spherical or elliptical spores, the size of which is 0.5 to 1.0 μm × 0.5 to 1.0 μm. Gram stain is positive.

【００１０】（２）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：生育は良好、白色でラフ形のコロニ
ーを形成する。コロニー表面に光沢はなく、しわができ
る。拡散性色素は認められない。 肉汁液体培地：表面発育し、皮膜を形成。 肉汁ゼラチン穿刺培養：表面発育し、層状液化が認めら
れる。 リトマスミルク培地：ペプトン化およびリトマスの還元
により、培地はほぼ無色透明になる。(2) Growth state in each medium Meat broth agar plate culture: Good growth, forming white and rough colonies. The surface of the colony is not glossy and wrinkles are formed. No diffusible dye is found. Broth liquid medium: Surface growth and film formation. Meat broth gelatin stab culture: Surface growth and lamellar liquefaction are observed. Litmus milk medium: Peptonization and reduction of litmus make the medium almost colorless and transparent.

【００１１】（３）生理生化学的性状 硝酸塩の還元 陽性 脱窒反応 陰性 ＭＲテスト 陽性 ＶＰテスト 陽性 インドールの生成 陰性 硫化水素の生成 陰性 デンプンの加水分解 陽性 クエン酸の利用 コーザーの培地 陽性 クリステンセンの培地 陽性 無機窒素源の利用 硝酸塩（硝酸ナトリウム） 陽性 アンモニウム塩（硫酸アンモニウム） 陽性 色素の生成 陰性 ウレアーゼ 陽性 オキシダーゼ 陰性 カタラーゼ 陽性(3) Physiological and biochemical properties Nitrate reduction Positive Denitrification reaction Negative MR test Positive VP test Positive Indole formation Negative Hydrogen sulfide formation Negative starch hydrolysis Positive Use of citric acid Coser medium Positive Christensen's medium Positive Use of inorganic nitrogen source Nitrate (sodium nitrate) positive Ammonium salt (ammonium sulfate) positive Dye formation Negative urease Positive oxidase negative Catalase positive

【００１２】生育の範囲 ｐＨ ４ 生育しない ｐＨ ５ 生育する ｐＨ ６ 生育する ｐＨ ７ 生育する ｐＨ ８ 生育する ｐＨ ９ 生育する １５℃ 生育しない ２０℃ 生育する ３０℃ 生育する ４０℃ 生育する ５０℃ 生育する ５５℃ 生育する ６０℃ 生育しないRange of growth pH 4 No growth pH 5 Growth pH 6 Growth pH 7 Growth pH 8 Growth pH 9 Growth 15 ° C No growth 20 ° C Growth 30 ° C Growth 40 ° C Growth 50 ° C Growth 55 ℃ grows 60 ℃ does not grow

【００１３】酸素に対する反応
通性嫌気性 Ｏ−Ｆテスト 発酵型 糖からの酸生成 Ｌ−アラビノース 陽性 Ｄ−キシロース 陽性 Ｄ−グルコース 陽性 Ｄ−マンノース 陽性 Ｄ−フラクトース 陽性 Ｄ−ガラクトース 陰性 麦芽糖 陽性 ショ糖 陽性 乳糖 陰性 トレハロース 陽性 Ｄ−ソルビット 陽性 Ｄ−マンニット 陽性 イノシット 陽性 グリセリン 陽性 デンプン 陽性 なお、いずれの糖についてもガス生成は認められない。Reaction to oxygen
Facultative anaerobic OF test Fermentation type Acid production from sugar L-arabinose positive D-xylose positive D-glucose positive D-mannose positive D-fructose positive D-galactose negative maltose positive sucrose positive lactose negative trehalose positive D- Sorbit positivity D-mannite positivity Inosit positivity Glycerin positivity Starch positivity Gas production was not observed for any sugar.

【００１４】本菌株はグラム陽性の桿菌で、周毛を有
し、好気的に生育すること、内生胞子を形成するとい
う、バチルス（Bacillus) 属細菌に特徴的な性状を有す
る。さらに、バージェーズ マニュアル オブ システ
マティク バクテリオロジー、第２巻に記載されている
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformi
s)の諸性状と上に掲げた本菌株の性状とを比較したとこ
ろ、結果が一致したことから、本菌はバチルス・リケニ
フォルミス（Bacillus licheniformis)に帰属させるの
が適当であると判断された。本菌株は、工業技術院微生
物工業技術研究所にバチルス・リケニフォルミス（Baci
llus licheniformis)ＣＢ１（微工研条寄第４００８
号）として寄託されている。本菌株の自然もしくは人工
的な変異株であっても蛋白ＣＢ１の生産能を有する限り
本発明に用いることができる。This strain is a Gram-positive bacillus, has pericillium, grows aerobically, and forms endospores, which are characteristic of Bacillus bacteria. In addition, the Bacillus licheniformi described in the Burgese Manual of Systematic Bacteriology, Volume 2
When the various properties of (s) were compared with the properties of the above-mentioned strain of the present invention, the results were in agreement, so it was judged that the present strain should be properly attributed to Bacillus licheniformis. This strain was produced by the Bacillus licheniformis (Baci
llus licheniformis) CB1
No.) has been deposited. Natural or artificial mutants of this strain can be used in the present invention as long as they have the ability to produce protein CB1.

【００１５】ＣＢ１生産菌の培養に際しては、炭素源と
してグルコース，マルトース，デンプン等の糖類が適宜
用いられる。窒素源としては、酵母エキス，肉エキス，
麦芽エキス，ペプトン，硫酸アンモニウム，塩化アンモ
ニウム，尿素などの有機窒素化合物や無機窒素化合物が
単独または２種以上を組み合わせて用いられる。その他
必要に応じて、鉄やマンガンなどの種々の重金属塩やビ
タミンＢ₁ ，ビオチンなどのビタミン類なども添加する
ことができる。In culturing the CB1 producing bacterium, sugars such as glucose, maltose and starch are appropriately used as a carbon source. As nitrogen sources, yeast extract, meat extract,
Organic nitrogen compounds such as malt extract, peptone, ammonium sulfate, ammonium chloride and urea, and inorganic nitrogen compounds are used alone or in combination of two or more. In addition, if necessary, various heavy metal salts such as iron and manganese, vitamins such as vitamin B ₁ and biotin can be added.

【００１６】ＣＢ１生産菌の培養方法としては、振とう
培養，通気攪拌培養などの好気条件下で行うのがよく、
培養温度は２５〜４５℃、培地ｐＨは６〜９が好まし
い。培養時間は１５〜１２０時間、好ましくは７２〜９
６時間である。As a method for culturing the CB1 producing bacterium, it is preferable to carry out under aerobic conditions such as shaking culture and aeration stirring culture.
The culture temperature is preferably 25 to 45 ° C, and the medium pH is preferably 6 to 9. Cultivation time is 15 to 120 hours, preferably 72 to 9
6 hours.

【００１７】ＣＢ１は培養液の遠心上清に存在し、菌体
表面や菌体内には認められない。したがって、培養液か
らＣＢ１を精製単離するには、微生物の菌体外蛋白を精
製するのに通常用いられる分離方法が適宜利用される。
例えば、遠心分離による菌体除去，硫安塩析，限外濾
過，透析，各種のイオン交換性担体や分子ふるい性担体
によるクロマトグラフィー，ゲル電気泳動などである。CB1 is present in the supernatant of the culture broth and is not found on the surface or inside the cells. Therefore, in order to purify and isolate CB1 from the culture broth, a separation method usually used for purifying extracellular protein of a microorganism is appropriately used.
For example, bacterial cell removal by centrifugation, ammonium sulfate salting out, ultrafiltration, dialysis, chromatography with various ion-exchange carriers or molecular sieving carriers, gel electrophoresis and the like.

【００１８】また、培養液にｎ−ブタノールまたはイソ
ブタノールを添加し攪拌すると、培養液のＣＢ１はほぼ
全量がブタノール層に移行する。このブタノール層を採
取し、これにヘキサンなどの有機溶媒をさらに添加して
攪拌すると、ブタノール層に混和していた水が排出され
て、少量の水層が新たに生じ、ＣＢ１もこの水層に移行
するため、高度に濃縮される。この水層中には、ＣＢ１
以外の高分子性物質はほとんど含まれないため、この水
層を採取し、次に分子ふるい性担体たとえばセファクリ
ルＳ−３００ＨＲ（スウェーデン、ファルマシア社製）
などを用い、適当な緩衝液、例えば酢酸アンモニウム緩
衝液を使用するクロマトグラフィーに供することより、
ＣＢ１が十分に精製される。後述の実施例で得られたＣ
Ｂ１の諸性質は以下の通りである。When n-butanol or isobutanol is added to the culture solution and stirred, almost all CB1 of the culture solution is transferred to the butanol layer. When this butanol layer was collected, and an organic solvent such as hexane was further added and stirred, the water mixed in the butanol layer was discharged, and a small amount of water layer was newly formed, and CB1 was also present in this water layer. Highly concentrated due to migration. In this water layer, CB1
Since it contains almost no other polymeric substances, the aqueous layer is collected, and then a molecular sieving carrier such as Sephacryl S-300HR (Pharmacia, Sweden)
By subjecting it to chromatography using an appropriate buffer, for example, ammonium acetate buffer,
CB1 is fully purified. C obtained in the examples described below
The various properties of B1 are as follows.

【００１９】１）外観：白色粉末 ２）融点：約１３７℃ ３）構成元素：Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ ４）元素分析値： Ｃ ６0.９０％ Ｈ 9.６１％ Ｎ １2.１９％ Ｓ 0.２９％ ５）分子量：約４5,０００（ゲル濾過法による） ６）等電点ｐＨ：約4.３ ７）紫外線吸収スペクトル：λ_max １９６，２７５ｎ
ｍ ８）赤外線吸収スペクトル（ｃｍ^-1）： ３３１０，２９５０，１７３０，１６６０，１５４０，
１４７０，１３９０，１２００，６５０ ９）溶解性：水，メタノール，エタノール，ブタノール
に可溶。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキ
サンなどに不溶。 10）溶媒抽出：ｎ−ブタノール，イソブタノールによっ
てほぼ完全に抽出される。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼンによっ
て抽出されない。 11）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性 フェノール硫酸反応陰性 12）多糖類への結合性：キチンおよびキトサンに結合
し、この結合はキトトリオース，Ｎ−アセチルグルコサ
ン，グルコサミンなどによって阻害されない。また、セ
ルロースなどには結合しない。 13）キチナーゼおよびキトサナーゼ活性を有しない。 14）抗真菌性を有する 15）殺虫性を有する 16) 脂肪酸を以下の比率で含有する。 Ｃ_14:0 ４％ Ｃ_15:0 ０％ Ｃ_15:0（メチル基分鎖） １１％ Ｃ_16:0 ２１％ Ｃ_16:0（メチル基分鎖） ０％ Ｃ_17:0 ０％ Ｃ_17:0（メチル基分鎖） ９％ Ｃ_18:0 ３１％ Ｃ_18:1 ２３％ Ｃ_18:2 ０％ Ｃ_18:3 ０％1) Appearance: white powder 2) Melting point: about 137 ° C. 3) Constituent elements: C, H, N, O, S 4) Elemental analysis value: C 60.90% H 9.61% N 12.19 % S 0.29% 5) Molecular weight: about 45,000 (by gel filtration method) 6) Isoelectric point pH: about 4.3 7) Ultraviolet absorption spectrum: λ _max 196,275n
m 8) Infrared absorption spectrum (cm ⁻¹ ): 3310, 2950, 1730, 1660, 1540,
1470, 1390, 1200, 650 9) Solubility: Soluble in water, methanol, ethanol, butanol. Insoluble in ethyl acetate, chloroform, ether, benzene, hexane, etc. 10) Solvent extraction: Almost completely extracted with n-butanol and isobutanol. Not extracted by ethyl acetate, chloroform, ether, benzene. 11) Color reaction: ninhydrin reaction positive, phenol sulfate negative 12) Polysaccharide binding: It binds to chitin and chitosan, and this binding is not inhibited by chitotriose, N-acetylglucosan, glucosamine and the like. Also, it does not bind to cellulose or the like. 13) It has no chitinase or chitosanase activity. 14) It has antifungal properties 15) It has insecticidal properties 16) It contains fatty acids in the following ratios. C _{14: 0} 4% C _{15: 0} 0% C _{15: 0} (methyl group branched) 11% C _{16: 0} 21% C _{16: 0} (methyl group branched) 0% C _{17: 0} 0% C _{17 : 0} (Methyl group branching) 9% C _{18: 0} 31% C _{18: 1} 23% C _{18: 2} 0% C _18:30 0%

【００２０】上記のＣＢ１の諸性質のうち、多糖類への
結合性，キチナーゼおよびキトサナーゼ活性の有無，抗
真菌性，殺虫性についてはさらに詳しく以下に示す。1.
５ml容遠心管に、キチンパウダー，キトサンパウダーお
よびセルロースパウダーをそれぞれ２０mgずつ取り、Ｃ
Ｂ１の0.１mg／ml溶液１００μｌを添加し、十分浸潤さ
せた後、１0,０００rpm で５分間遠心し、上清をポリア
クリルアミドゲル電気泳動に供した。蛋白の確認は銀染
色キット（和光純薬工業社製）によって行った。その結
果、キチンパウダーおよびキトサンパウダーで処理した
ものはＣＢ１のバンドがほとんど認められないのに対
し、セルロースパウダー処理では原液と同程度の濃さの
バンドが検出された。また、Ｎ−アセチルグルコサミン
およびそのトリマーであるキトトリオースをＣＢ１溶液
に添加して、同様にキチンへの吸着を調べたが、ＣＢ１
とキチンの結合は全く阻害されなかった。Among the various properties of CB1 described above, the binding properties to polysaccharides, the presence or absence of chitinase and chitosanase activities, antifungal properties and insecticidal properties will be described in more detail below. 1.
Put 20 mg each of chitin powder, chitosan powder and cellulose powder into a 5 ml centrifuge tube, and add C
100 μl of a 0.1 mg / ml solution of B1 was added and allowed to sufficiently infiltrate, followed by centrifugation at 10000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis. The protein was confirmed with a silver staining kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). As a result, the bands treated with chitin powder and chitosan powder showed almost no CB1 band, whereas the bands treated with cellulose powder detected a band having a similar thickness to the stock solution. Further, N-acetylglucosamine and its trimer, chitotriose, were added to the CB1 solution, and adsorption to chitin was examined in the same manner.
The binding of and chitin was not inhibited at all.

【００２１】次に、ＣＢ１とコロイダルキチン（キチン
パウダーから調製），エチレングリコールキチン（生化
学工業社製），グリコールキトサン（和光純薬工業社
製）をそれぞれ混合し、ｐＨ５（酢酸緩衝液），ｐＨ７
（リン酸緩衝液），ｐＨ９（トリス塩酸緩衝液）の条件
で２５℃で１２時間反応させた。反応液にフェリシアン
化カリウムのアルカリ性溶液を添加して煮沸したが、４
００ｎｍの波長の吸収は対照と差がなかった。つまり、
還元糖の生成が認められなかったことから、本ＣＢ１に
はキチナーゼおよびキトサナーゼ活性が存在しないと判
断された。Next, CB1 and colloidal chitin (prepared from chitin powder), ethylene glycol chitin (manufactured by Seikagaku Corporation) and glycol chitosan (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were mixed to obtain pH 5 (acetic acid buffer), pH 7
(Phosphate buffer solution) and pH 9 (Tris-hydrochloric acid buffer solution) were reacted at 25 ° C for 12 hours. An alkaline solution of potassium ferricyanide was added to the reaction solution and boiled.
The absorption at the wavelength of 00 nm did not differ from the control. That is,
Since the production of reducing sugar was not observed, it was judged that this CB1 does not have chitinase and chitosanase activities.

【００２２】ＣＢ１の各種微生物に対する抗菌性は下表
に示す通りである。糸状菌の場合は、多段階の濃度のＣ
Ｂ１を含む、ＭＹＧ（麦芽エキス１％，酵母エキス0.４
％，グルコース0.４％、ｐＨ6.３）寒天（1.５％）平板
培地に、スラントから切り取った約１mm³ 角の菌糸片を
接種して、２５℃または３０℃で３〜７日間培養したと
きのコロニーの直径が半分になる濃度をＩＣ₅₀として表
示した。細菌には肉汁液体培地、酵母にはＭＹＧ液体培
地を用い、それぞれＣＢ１を数段階の濃度で添加した後
に菌を接種し、３０℃または３７℃で１〜２日間培養
し、５９０ｎｍの濁度が半分になるＣＢ１の濃度をＩＣ
₅₀として表１に示した。ＣＢ１の抗菌力の安定性に関し
ては、種々のｐＨに調整した緩衝液にＣＢ１を溶解し
て、２５℃で２４時間保温した後、上記の通り培地に添
加したが、コルティシウム・ロルフシー ＭＡＦＦ ０
７−１２０４３株に対する抗菌力は、ｐＨ４〜９の間で
差は認められなかった。また、ｐＨ７でオートクレーブ
を用いて１５分間加熱したところ、少なくとも１２０℃
までは抗菌力が低下しなかった。The antibacterial properties of CB1 against various microorganisms are shown in the table below. In the case of filamentous fungi, there are multiple levels of C
MYG containing B1 (malt extract 1%, yeast extract 0.4
%, Glucose 0.4%, pH 6.3) Agar (1.5%) plate medium is inoculated with about 1 mm ³ square mycelium pieces cut from slants and cultured at 25 ° C or 30 ° C for 3 to 7 days. The concentration at which the diameter of the colony at that time was halved was expressed as IC ₅₀ . A broth liquid medium was used for bacteria, and a MYG liquid medium was used for yeast. After adding CB1 at several levels of concentration, the bacteria were inoculated and cultured at 30 ° C or 37 ° C for 1 to 2 days, and the turbidity at 590 nm was increased. Concentrate CB1 in half to IC
_It is shown in Table 1 as ₅₀ . Regarding the stability of the antibacterial activity of CB1, CB1 was dissolved in buffer solutions adjusted to various pHs, incubated at 25 ° C. for 24 hours, and then added to the medium as described above. Cortisium lorphushi MAFF 0
Regarding the antibacterial activity against the 7-12043 strain, no difference was observed between pH 4 and 9. When heated at pH 7 using an autoclave for 15 minutes, at least 120 ° C
Until the antibacterial activity did not decrease.

【００２３】[0023]

【表１】 [Table 1]

【００２４】次に、コクゾウムシ（シトフィルス・ツィ
アマイズ、Sitophilus zeamais) の生育に対するＣＢ１
の効果を表２に示す。玄米粉にＣＢ１を１〜０％の濃度
になるように添加し、水で練り合わせ、錠剤状にして乾
燥したものに、コクゾウムシを産卵させてその後の生育
を見た。Next, CB1 for the growth of weevil (Sitophilus zeamais)
The effect of is shown in Table 2. CB1 was added to brown rice flour so as to have a concentration of 1 to 0%, kneaded with water, made into a tablet, and dried, and a weevil was laid to lay eggs, and the subsequent growth was observed.

【００２５】[0025]

【表２】 [Table 2]

【００２６】前述したように、本発明のＣＢ１は、バチ
ルス属細菌が生産する抗菌性物質とは別異のものであ
る。また、キチン結合性レクチン蛋白がこれまでに植物
などで多数見出されているが、これらのレクチンのキチ
ンへの結合は、キチンを構成する単糖やオリゴ糖たとえ
ばＮ−アセチルグルコサミンやキトトリオースなどによ
って阻害される。それ故、本発明のＣＢ１と異なる。さ
らに、抗真菌活性を有するキチン結合性レクチンとして
報告されたＵＤＡ（サイエンス、２４５巻、１１００
頁、１９８９年），ヘベイン（プランタ、１８３巻、２
５８頁、１９９１年）およびキチン結合性ペプチドのＡ
ｃ−ＡＭＰ１，Ａｃ−ＡＭＰ２（バイオケミストリー、
３１巻、４３０８頁、１９９２年）が報告されている
が、これらは分子量がいずれも１万以下で、ＣＢ１とは
大きく異なる。したがって、本キチン結合性蛋白ＣＢ１
は新規物質であることが確認された。As described above, the CB1 of the present invention is different from the antibacterial substance produced by Bacillus bacteria. In addition, many chitin-binding lectin proteins have been found in plants so far, and the binding of these lectins to chitin is dependent on the monosaccharides and oligosaccharides constituting chitin such as N-acetylglucosamine and chitotriose. Be hindered. Therefore, it differs from CB1 of the present invention. Furthermore, UDA (Science, 245, 1100) reported as a chitin-binding lectin having antifungal activity.
Page, 1989), Hevein (Planter, 183, 2)
58, 1991) and the chitin-binding peptide A.
c-AMP1, Ac-AMP2 (Biochemistry,
31, 4308, 1992), all of which have a molecular weight of 10,000 or less, which is significantly different from CB1. Therefore, the chitin-binding protein CB1
Was confirmed to be a new substance.

【００２７】以下に実施例により本発明を詳述するが、
これらは本発明を何ら限定するものではない。The present invention is described in detail below with reference to examples.
These do not limit the invention in any way.

【実施例】【Example】

実施例１ ペプトン１％，酵母エキス0.５％，食塩１％からなる液
体培地（ｐＨ7.２）１０mlを含む１００ml容三角フラス
コに、バチルス・リケニフォルミスＣＢ１（微工研条寄
第４００８号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４００８号）の培養ス
ラントの菌体を接種し、３７℃で２４時間培養した。次
に、ペプトン１％，酵母エキス0.５％，Na₂HPO₄ ・12H₂
O 1.５％, KH₂PO₄ 0. ２％, グルコース１％からなる液
体培地（ｐＨ7.２）0.1 リットルを含む0.５リットル容
坂口フラスコ１０本に、上記の前培養液約１mlずつを接
種し、３７℃で７２時間振とう培養した。振とう幅は７
cmで、回転数は１４０rpm である。Example 1 A 100 ml Erlenmeyer flask containing 10 ml of a liquid medium (pH 7.2) consisting of 1% peptone, 0.5% yeast extract and 1% salt was placed in a 100 ml Erlenmeyer flask Bacillus licheniformis CB1 (Mikiko Kenjojo 4008, FERM BP-4008) cultured slant cells were inoculated and cultured at 37 ° C for 24 hours. Next, peptone 1%, yeast extract 0.5%, Na ₂ HPO ₄・ 12H ₂
Approximately 1 ml each of the above preculture liquid was added to 10 0.5 liter Sakaguchi flasks containing 0.1 liter of liquid medium (pH 7.2) consisting of O 1.5%, KH ₂ PO ₄ 0.2% and glucose 1%. Was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C. for 72 hours. Shaking width is 7
In cm, the rotation speed is 140 rpm.

【００２８】上記の培養液約１リットルにｎ−ブタノー
ル0.２リットルを加えて攪拌した後、遠心分離する。上
層のブタノール層約0.１５リットルを採取し、これに0.
２リットルのヘキサンを加えて攪拌する。遠心分離で上
層のブタノール：ヘキサン層を除去し、下層の水層約１
６mlを得る。次に、これをセファクリルＳ−３００ＨＲ
（ファルマシア社製）分子ふるいカラムクロマトグラフ
ィーに付した。緩衝液には、５０ｍＭ酢酸アンモニウム
緩衝液ｐＨ6.５を用いた。溶出液の２８０ｎｍの吸収を
モニターし、最初に溶出する画分、すなわち最も高分子
の画分を採取した。この画分を純水に対して透析した
後、凍結乾燥したところ、４８mgの結晶が得られた。こ
のようにして得られたＣＢ１は上記した理化学的および
生物学的性質を有していた。0.2 liter of n-butanol was added to about 1 liter of the above culture solution, and the mixture was stirred and then centrifuged. Approximately 0.15 liters of the butanol layer in the upper layer was collected, and 0.1
Add 2 liters of hexane and stir. The upper butanol: hexane layer was removed by centrifugation, and the lower aqueous layer was about 1
Obtain 6 ml. Next, this is Sephacryl S-300HR
It was subjected to molecular sieve column chromatography (manufactured by Pharmacia). As the buffer, 50 mM ammonium acetate buffer pH 6.5 was used. The absorption of the eluate at 280 nm was monitored, and the fraction that eluted first, that is, the fraction with the highest molecular weight, was collected. This fraction was dialyzed against pure water and then freeze-dried to obtain 48 mg of crystals. The CB1 thus obtained had the physicochemical and biological properties described above.

【００２９】[0029]

【発明の効果】本発明のキチン結合性蛋白ＣＢ１は、特
定の微生物を用いて培養することにより、効率よく製造
することができる。この蛋白ＣＢ１は、抗真菌性と殺虫
性を併せ持ち、農薬および木材防腐剤等として有用であ
る。INDUSTRIAL APPLICABILITY The chitin-binding protein CB1 of the present invention can be efficiently produced by culturing using a specific microorganism. This protein CB1 has antifungal properties and insecticidal properties, and is useful as an agricultural chemical, a wood preservative, and the like.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 水に溶解したＣＢ１の紫外部吸収スペクトル
を示す。FIG. 1 shows an ultraviolet absorption spectrum of CB1 dissolved in water.

【図２】 ＣＢ１の臭化カリウム錠での赤外部吸収スペ
クトルを示す。FIG. 2 shows an infrared absorption spectrum of a potassium bromide tablet of CB1.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:10） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification code Office reference number FI technical display area // (C12P 21/00 C12R 1:10)

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 下記の性質を有することを特徴とする新
規キチン結合性蛋白ＣＢ１。 １）外観：白色粉末 ２）融点：約１３７℃ ３）構成元素：Ｃ，Ｈ，Ｎ，Ｏ，Ｓ ４）元素分析値： Ｃ ６0.９０％ Ｈ 9.６１％ Ｎ １2.１９％ Ｓ 0.２９％ ５）分子量：約４5,０００（ゲル濾過法による） ６）等電点ｐＨ：約4.３ ７）紫外線吸収スペクトル：λ_max １９６，２７５ｎｍ ８）赤外線吸収スペクトル（ｃｍ^-1）： ３３１０，２９５０，１７３０，１６６０，１５４０，
１４７０，１３９０，１２００，６５０ ９）溶解性：水，メタノール，エタノール，ブタノール
に可溶。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼン，ヘキ
サンなどに不溶。 10）溶媒抽出：ｎ−ブタノール，イソブタノールによっ
てほぼ完全に抽出される。 酢酸エチル，クロロホルム，エーテル，ベンゼンによっ
て抽出されない。 11）呈色反応：ニンヒドリン反応陽性 フェノール硫酸反応陰性 12）多糖類への結合性：キチンおよびキトサンに結合
し、この結合はキトトリオース，Ｎ−アセチルグルコサ
ン，グルコサミンなどによって阻害されない。また、セ
ルロースなどには結合しない。 13）キチナーゼおよびキトサナーゼ活性を有しない。 14）抗真菌性を有する 15）殺虫性を有する 16) 脂肪酸を以下の比率で含有する。 Ｃ_14:0 ４％ Ｃ_15:0 ０％ Ｃ_15:0（メチル基分鎖） １１％ Ｃ_16:0 ２１％ Ｃ_16:0（メチル基分鎖） ０％ Ｃ_17:0 ０％ Ｃ_17:0（メチル基分鎖） ９％ Ｃ_18:0 ３１％ Ｃ_18:1 ２３％ Ｃ_18:2 ０％ Ｃ_18:3 ０％1. A novel chitin-binding protein CB1 having the following properties. 1) Appearance: White powder 2) Melting point: about 137 ° C 3) Constituent elements: C, H, N, O, S 4) Elemental analysis value: C 60.90% H 9.61% N 12.19% S 0 .29% 5) Molecular weight: about 45,000 (by gel filtration method) 6) Isoelectric point pH: about 4.3 7) Ultraviolet absorption spectrum: λ _max 196,275 nm 8) Infrared absorption spectrum (cm ^-1 ): 3310, 2950, 1730, 1660, 1540,
1470, 1390, 1200, 650 9) Solubility: Soluble in water, methanol, ethanol, butanol. Insoluble in ethyl acetate, chloroform, ether, benzene, hexane, etc. 10) Solvent extraction: Almost completely extracted with n-butanol and isobutanol. Not extracted by ethyl acetate, chloroform, ether, benzene. 11) Color reaction: ninhydrin reaction positive, phenol sulfate negative 12) Polysaccharide binding: It binds to chitin and chitosan, and this binding is not inhibited by chitotriose, N-acetylglucosan, glucosamine and the like. Also, it does not bind to cellulose or the like. 13) It has no chitinase or chitosanase activity. 14) It has antifungal properties 15) It has insecticidal properties 16) It contains fatty acids in the following ratios. C _{14: 0} 4% C _{15: 0} 0% C _{15: 0} (methyl group branched) 11% C _{16: 0} 21% C _{16: 0} (methyl group branched) 0% C _{17: 0} 0% C _{17 : 0} (Methyl group branching) 9% C _{18: 0} 31% C _{18: 1} 23% C _{18: 2} 0% C _18:30 0% 【請求項２】 バチルス属に属し、請求項１記載のキチ
ン結合性蛋白ＣＢ１を生産する能力を有する細菌を培養
し、その培養物から該蛋白ＣＢ１を採取することを特徴
とする新規キチン結合性蛋白ＣＢ１の製造法。2. A novel chitin-binding property characterized by culturing a bacterium belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce the chitin-binding protein CB1 according to claim 1, and collecting the protein CB1 from the culture. Method for producing protein CB1. 【請求項３】 請求項１記載のキチン結合性蛋白ＣＢ１
を有効成分として含有する抗真菌剤。3. The chitin-binding protein CB1 according to claim 1.
An antifungal agent containing as an active ingredient. 【請求項４】 請求項１記載のキチン結合性蛋白ＣＢ１
を有効成分として含有する殺虫剤。4. The chitin-binding protein CB1 according to claim 1.
An insecticide containing as an active ingredient.