JPH0692994A - 新規ポリペプチド - Google Patents
新規ポリペプチドInfo
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- JPH0692994A JPH0692994A JP4214376A JP21437692A JPH0692994A JP H0692994 A JPH0692994 A JP H0692994A JP 4214376 A JP4214376 A JP 4214376A JP 21437692 A JP21437692 A JP 21437692A JP H0692994 A JPH0692994 A JP H0692994A
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒト顆粒球コロニー刺戟因子ポリペプチドの
一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換されるか、およ
び/または一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有
する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするD
NA、該DNAを組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いる該ポリペ
プチドの製造法。 【効果】 活性の高いヒト顆粒球コロニー刺戟因子ポリ
ペプチドが大量に安価に供給される。
一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換されるか、およ
び/または一部のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有
する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするD
NA、該DNAを組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いる該ポリペ
プチドの製造法。 【効果】 活性の高いヒト顆粒球コロニー刺戟因子ポリ
ペプチドが大量に安価に供給される。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は表1のアミノ酸配列を有
するヒト顆粒球コロニー刺戟因子(以下hG−CSFと
略記する)ポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミ
ノ酸で置換されるか、および/または一部のアミノ酸が
欠失したアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド(以下
hG−CSFポリペプチド誘導体とも称する)、該hG
−CSFポリペプチド誘導体をコードするDNA、該D
NA断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミ
ドを含む微生物および該微生物を用いるhG−CSFポ
リペプチド誘導体の製造法に関する。
するヒト顆粒球コロニー刺戟因子(以下hG−CSFと
略記する)ポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミ
ノ酸で置換されるか、および/または一部のアミノ酸が
欠失したアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド(以下
hG−CSFポリペプチド誘導体とも称する)、該hG
−CSFポリペプチド誘導体をコードするDNA、該D
NA断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミ
ドを含む微生物および該微生物を用いるhG−CSFポ
リペプチド誘導体の製造法に関する。
【0002】hG−CSFは、造血幹細胞を増殖・分化
させ種々の血球を形成させる際に必須なポリペプチドの
1種で、主として顆粒球、なかでも好中球の増加を促進
する効果をもつ。好中球は生体の感染防御において重要
な役割を担っているが寿命が短く、前駆細胞の恒常的な
増殖・分化によって常に補給されていなければならな
い。近年広く行われている増殖性腫瘍に対する治療は、
同時に好中球前駆細胞の増殖を阻止するため、担癌患者
の感染防御機能を低下させるという重篤副作用をもつ。
hG−CSFは、好中球の増加を促進することにより、
この副作用を軽減し、他方、感染症を予防・治療する効
果をもつものと期待される。さらに、hG−CSFに
は、白血病細胞株を in vitro において分化させる活性
があり、白血病に対する治療薬となる可能性もあるもの
とみられる。本発明のhG−CSFポリペプチド誘導体
は、既知のhG−CSFよりすぐれたhG−CSF活性
を有しており、医薬品としての利用が期待される。
させ種々の血球を形成させる際に必須なポリペプチドの
1種で、主として顆粒球、なかでも好中球の増加を促進
する効果をもつ。好中球は生体の感染防御において重要
な役割を担っているが寿命が短く、前駆細胞の恒常的な
増殖・分化によって常に補給されていなければならな
い。近年広く行われている増殖性腫瘍に対する治療は、
同時に好中球前駆細胞の増殖を阻止するため、担癌患者
の感染防御機能を低下させるという重篤副作用をもつ。
hG−CSFは、好中球の増加を促進することにより、
この副作用を軽減し、他方、感染症を予防・治療する効
果をもつものと期待される。さらに、hG−CSFに
は、白血病細胞株を in vitro において分化させる活性
があり、白血病に対する治療薬となる可能性もあるもの
とみられる。本発明のhG−CSFポリペプチド誘導体
は、既知のhG−CSFよりすぐれたhG−CSF活性
を有しており、医薬品としての利用が期待される。
【0003】
【従来の技術】近年急速に発展してきた組換えDNA技
術により、血球の増殖・分化に係わるタンパク質性の因
子の遺伝子が次々と単離されてきた。それらの因子は、
微生物や動物細胞を利用して遺伝子工学の手法で生産さ
れている。hG−CSFは、長田らがヒト扁平上皮癌細
胞株CHU−IIよりcDNAを単離してその塩基配列を
決定し、COS細胞での発現を報告している〔長田ら:
ネイチャー(Nature)319, 415(1986)〕。また、スー
ザ(Souza) らはヒト膀胱癌細胞株5637よりcDNAを単
離してその塩基配列を決定し、大腸菌での発現を報告し
ている〔スーザら:サイエンス(Science)232, 61(19
86)〕。
術により、血球の増殖・分化に係わるタンパク質性の因
子の遺伝子が次々と単離されてきた。それらの因子は、
微生物や動物細胞を利用して遺伝子工学の手法で生産さ
れている。hG−CSFは、長田らがヒト扁平上皮癌細
胞株CHU−IIよりcDNAを単離してその塩基配列を
決定し、COS細胞での発現を報告している〔長田ら:
ネイチャー(Nature)319, 415(1986)〕。また、スー
ザ(Souza) らはヒト膀胱癌細胞株5637よりcDNAを単
離してその塩基配列を決定し、大腸菌での発現を報告し
ている〔スーザら:サイエンス(Science)232, 61(19
86)〕。
【0004】上記2つのcDNAによってコードされる
タンパク質のアミノ酸配列と本発明者が正常人末梢血マ
クロファージより単離したcDNAによってコードされ
るタンパク質のアミノ酸配列(表1)とは一致してい
る。
タンパク質のアミノ酸配列と本発明者が正常人末梢血マ
クロファージより単離したcDNAによってコードされ
るタンパク質のアミノ酸配列(表1)とは一致してい
る。
【0005】
【表1】 1 10 20 30 40 50 ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAAGTGCTTAGAG ThrProLeuGlyProAlaSerSerLeuProGlnSerPheLeuLeuLysCysLeuGlu 1 60 70 80 90 100 110 CAAGTGAGGAAGATCCAGGGCGATGGCGCAGCGCTCCAGGAGAAGCTGTGTGCCACC GlnValArgLysIleGlnGlyAspGlyAlaAlaLeuGlnGluLysLeuCysAlaThr 120 130 140 150 160 170 TACAAGCTGTGCCACCCCGAGGAGCTGGTGCTGCTCGGACACTCTCTGGGCATCCCC TyrLysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeuGlyIlePro 180 190 200 210 220 TGGGCTCCCCTGAGCAGCTGCCCCAGCCAGGCCCTGCAGCTGGCAGGCTGCTTG TrpAlaProLeuSerSerCysProSerGlnAlaLeuGlnLeuAlaGlyCysLeu 230 240 250 260 270 280 AGCCAACTCCATAGCGGCCTTTTCCTCTACCAGGGGCTCCTGCAGGCCCTGGAAGGG SerGlnLeuHisSerGlyLeuPheLeuTyrGlnGlyLeuLeuGlnAlaLeuGluGly 290 300 310 320 330 ATCTCCCCCGAGTTGGGTCCCACCTTGGACACACTGCAGCTGGACGTCGCCGAC IleSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGlnLeuAspValAlaAsp 340 350 360 370 380 390 TTTGCCACCACCATCTGGCAGCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCCTGCCCTGCAG PheAlaThrThrIleTrpGlnGlnMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGln 400 410 420 430 440 450 CCCACCCAGGGTGCCATGCCGGCCTTCGCCTCTGCTTTCCAGCGCCGGGCAGGAGGG ProThrGlnGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGlnArgArgAlaGlyGly 460 470 480 490 500 GTCCTAGTTGCCTCCCATCTGCAGAGCTTCCTGGAGGTGTCGTACCGCGTTCTACGC ValLeuValAlaSerHisLeuGlnSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArg 510 520 CACCTTGCCCAGCCCTGA HisLeuAlaGlnPro*** 174
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、比活
性が高く、血中での安定性の高いhG−CSFポリペプ
チド誘導体を安価に大量に製造する手段を提供すること
にある。
性が高く、血中での安定性の高いhG−CSFポリペプ
チド誘導体を安価に大量に製造する手段を提供すること
にある。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、表1に示
されたhG−CSFのcDNAを改変し、改変したcD
NAを組み込んだプラスミドを担う大腸菌を培養するこ
とにより、またプロテアーゼを用いるポリペプチドの限
定分解により比活性の高いhG−CSFポリペプチド誘
導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至
った。
されたhG−CSFのcDNAを改変し、改変したcD
NAを組み込んだプラスミドを担う大腸菌を培養するこ
とにより、またプロテアーゼを用いるポリペプチドの限
定分解により比活性の高いhG−CSFポリペプチド誘
導体を製造できることを見出し、本発明を完成するに至
った。
【0008】本発明によれば、新規なhG−CSFポリ
ペプチド誘導体、該ポリペプチド誘導体をコードするD
NA、該DNAを組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いる新規なh
G−CSFポリペプチド誘導体の製造法が提供される。
本発明のhG−CSFポリペプチド誘導体は、表1のア
ミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチドの一部の
アミノ酸が他種アミノ酸で置換されるか、および/また
は一部のアミノ酸が欠失したものである。置換されるア
ミノ酸はN末端近傍のアミノ酸であり、N末端から第1
〜17番目のアミノ酸のうち少なくとも1個であることが
望ましい。欠失するアミノ酸はN末端近傍のアミノ酸で
あり、N末端から1−11番目のアミノ酸のうち少なくと
も1個であることが望ましい。
ペプチド誘導体、該ポリペプチド誘導体をコードするD
NA、該DNAを組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いる新規なh
G−CSFポリペプチド誘導体の製造法が提供される。
本発明のhG−CSFポリペプチド誘導体は、表1のア
ミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチドの一部の
アミノ酸が他種アミノ酸で置換されるか、および/また
は一部のアミノ酸が欠失したものである。置換されるア
ミノ酸はN末端近傍のアミノ酸であり、N末端から第1
〜17番目のアミノ酸のうち少なくとも1個であることが
望ましい。欠失するアミノ酸はN末端近傍のアミノ酸で
あり、N末端から1−11番目のアミノ酸のうち少なくと
も1個であることが望ましい。
【0009】本発明の組換え体プラスミドは、上記hG
−CSFポリペプチド誘導体をコードするDNA断片が
DNAの発現機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれ
たものである。本発明のhG−CSFポリペプチド誘導
体をコードするDNA断片としては、表1に示されるh
G−CSFをコードするDNAの塩基配列の第1〜51番
目の塩基のうち少なくとも1個が置換した配列を有する
ものが好ましい。
−CSFポリペプチド誘導体をコードするDNA断片が
DNAの発現機能を持つ適当なプラスミドに組み込まれ
たものである。本発明のhG−CSFポリペプチド誘導
体をコードするDNA断片としては、表1に示されるh
G−CSFをコードするDNAの塩基配列の第1〜51番
目の塩基のうち少なくとも1個が置換した配列を有する
ものが好ましい。
【0010】表1に示されるhG−CSFをコードする
DNAとしては、hG−CSFをコードするメッセンジ
ャーRNAから組換えDNA技術で逆転写して得られる
cDNA(hG−CSFcDNA)または染色体DNA
から得られるhG−CSFをコードするDNAなどが利
用できる。hG−CSFcDNAとしては、hG−CS
Fをコードしているものであればいかなるものも用いる
ことができるが、具体的にはpCSF1−2を用いるこ
とができる。pCSF1−2は、本発明者によって製造
されたものであり、その製造法は参考例1に記載されて
いる。
DNAとしては、hG−CSFをコードするメッセンジ
ャーRNAから組換えDNA技術で逆転写して得られる
cDNA(hG−CSFcDNA)または染色体DNA
から得られるhG−CSFをコードするDNAなどが利
用できる。hG−CSFcDNAとしては、hG−CS
Fをコードしているものであればいかなるものも用いる
ことができるが、具体的にはpCSF1−2を用いるこ
とができる。pCSF1−2は、本発明者によって製造
されたものであり、その製造法は参考例1に記載されて
いる。
【0011】pCSF1−2中のhG−CSFcDNA
は、M13ファージを用いたディデオキシ・シークエンス
(dideoxy sequence) 法〔ジェイ・メシング(J. Messin
g)ら:ジーン (Gene) 19, 269 (1982)〕により決定され
た表1に示す塩基配列を有している。pCSF1−2は
図1に示した制限酵素地図を有するプラスミドで、それ
を含む大腸菌は Escherichia coli ECSF 1-2(FEMR BP-
1220) として昭和61年11月27日付で工業技術院微生物工
業技術研究所(微工研)に寄託されている。
は、M13ファージを用いたディデオキシ・シークエンス
(dideoxy sequence) 法〔ジェイ・メシング(J. Messin
g)ら:ジーン (Gene) 19, 269 (1982)〕により決定され
た表1に示す塩基配列を有している。pCSF1−2は
図1に示した制限酵素地図を有するプラスミドで、それ
を含む大腸菌は Escherichia coli ECSF 1-2(FEMR BP-
1220) として昭和61年11月27日付で工業技術院微生物工
業技術研究所(微工研)に寄託されている。
【0012】hG−CSFポリペプチド誘導体をコード
するDNAを組み込むプラスミドとしては、大腸菌で該
DNAが発現できるものならいかなるプラスミドでも使
うことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例
えば、trp系、lac系のプロモーターの下流に外来
DNAを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガ
ノ配列(以下SD配列と略記する)と開始コドン (AT
G) の間を適当な距離、例えば6〜18塩基対に調節した
プラスミドを用いることができる。
するDNAを組み込むプラスミドとしては、大腸菌で該
DNAが発現できるものならいかなるプラスミドでも使
うことができる。好ましくは、適当なプロモーター、例
えば、trp系、lac系のプロモーターの下流に外来
DNAを挿入することができ、しかもシャイン−ダルガ
ノ配列(以下SD配列と略記する)と開始コドン (AT
G) の間を適当な距離、例えば6〜18塩基対に調節した
プラスミドを用いることができる。
【0013】具体的に好適なプラスミドとしては、pK
YP10(特開昭58−110600) 、pLSA1(参考例
3)、pGEL1〔関根ら:プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci.)、USA 82, 4306 (1985) 〕、pKY
P26(特開昭62−48699) 、pBR322 〔ボリバー(Boli
var) ら:ジーン (Gene) 2,95 (1977) 〕などがあげ
られる。
YP10(特開昭58−110600) 、pLSA1(参考例
3)、pGEL1〔関根ら:プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.
Natl. Acad. Sci.)、USA 82, 4306 (1985) 〕、pKY
P26(特開昭62−48699) 、pBR322 〔ボリバー(Boli
var) ら:ジーン (Gene) 2,95 (1977) 〕などがあげ
られる。
【0014】hG−CSFポリペプチドおよびその誘導
体をコードするDNAとベクターDNAとの組換えは、
制限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガー
ゼを用いて結合する一般的組換えDNA技法を用いて行
うことができる。結合に際しては、制限酵素を用いて消
化したDNA断片の末端を、DNAポリメラーゼI・ク
レノー断片を用いる埋め込み反応、T4DNAポリメラ
ーゼを用いる埋め込み反応または削り込み反応を利用し
て加工する方法やDNAリンカーを用いる方法によって
も行うことができる。
体をコードするDNAとベクターDNAとの組換えは、
制限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガー
ゼを用いて結合する一般的組換えDNA技法を用いて行
うことができる。結合に際しては、制限酵素を用いて消
化したDNA断片の末端を、DNAポリメラーゼI・ク
レノー断片を用いる埋め込み反応、T4DNAポリメラ
ーゼを用いる埋め込み反応または削り込み反応を利用し
て加工する方法やDNAリンカーを用いる方法によって
も行うことができる。
【0015】hG−CSFcDNAとしてpCSF1−
2を、該DNAを組み込むためのプラスミドとしてpG
EL1,pKYP10,pKYP26,pBR322, pLS
A1を用い、また必要な場合には、化学合成したDNA
リンカーや部位特異的変異を用いて、hG−CSFポリ
ペプチド誘導体をコードするDNAを組み込んだ組換え
体プラスミドを造成する例を以下に述べる。
2を、該DNAを組み込むためのプラスミドとしてpG
EL1,pKYP10,pKYP26,pBR322, pLS
A1を用い、また必要な場合には、化学合成したDNA
リンカーや部位特異的変異を用いて、hG−CSFポリ
ペプチド誘導体をコードするDNAを組み込んだ組換え
体プラスミドを造成する例を以下に述べる。
【0016】図1に示したようにしてpCSF1−2
〔約4.5キロベース(以下kbと略記する)〕をApaI
とBamHIで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動
法(LGT法)〔エル・ウィスランダー (L. Wieslande
r):アナリティカル・バイオケミストリイ(Analytica
l Biochemistry)98,305 (1979)〕にて約1.5kbのD
NA断片を精製する。
〔約4.5キロベース(以下kbと略記する)〕をApaI
とBamHIで切断し、低融点アガロースゲル電気泳動
法(LGT法)〔エル・ウィスランダー (L. Wieslande
r):アナリティカル・バイオケミストリイ(Analytica
l Biochemistry)98,305 (1979)〕にて約1.5kbのD
NA断片を精製する。
【0017】次いで、pLSA1をBanIIIとBam
HIで切断した後、LGT法にて約2.8kbのDNA断片
を精製する。このようにして得られた両DNA断片と、
図1に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより結
合しpCfTA1を得る。次いで、図2に示したように
して、pCfTA1をBamHIで切断後、クレノー断
片で処理することにより突出末端を平滑末端に変換し、
さらにEcoRIで切断後、約2.5kbのDNA断片をL
GT法により精製する。別にpCfTA1をEcoRI
とDraIで切断後、約1.0kbのDNA断片をLGT法
により精製する。このようにして得たDNA断片をT4
DNAリガーゼにより結合し、pCfTB20を得る。
HIで切断した後、LGT法にて約2.8kbのDNA断片
を精製する。このようにして得られた両DNA断片と、
図1に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより結
合しpCfTA1を得る。次いで、図2に示したように
して、pCfTA1をBamHIで切断後、クレノー断
片で処理することにより突出末端を平滑末端に変換し、
さらにEcoRIで切断後、約2.5kbのDNA断片をL
GT法により精製する。別にpCfTA1をEcoRI
とDraIで切断後、約1.0kbのDNA断片をLGT法
により精製する。このようにして得たDNA断片をT4
DNAリガーゼにより結合し、pCfTB20を得る。
【0018】さらに、図3のように、pCSF1−2を
ApaIとBamHIで切断後、約1.5kbのDNA断片
をLGT法により精製する。また、pGEL1をHin
dIII、BamHIおよびPstIで切断後、約1.7kbの
DNA断片をLGT法により精製する。一方、pKYP
10をPstIとBanIIIで切断後、約1.1kbのDNA断
片をLGT法により精製する。これら3つのDNA断片
と図3に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより
結合し、pCfTL23,pCfTL38,pCfTL35,
pCfTL41を得、また、これら3つのDNA断片と図
4に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより結合
し、pCfTM14,pCfTM17,pCfTM113を得
る。
ApaIとBamHIで切断後、約1.5kbのDNA断片
をLGT法により精製する。また、pGEL1をHin
dIII、BamHIおよびPstIで切断後、約1.7kbの
DNA断片をLGT法により精製する。一方、pKYP
10をPstIとBanIIIで切断後、約1.1kbのDNA断
片をLGT法により精製する。これら3つのDNA断片
と図3に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより
結合し、pCfTL23,pCfTL38,pCfTL35,
pCfTL41を得、また、これら3つのDNA断片と図
4に示した合成DNAをT4DNAリガーゼにより結合
し、pCfTM14,pCfTM17,pCfTM113を得
る。
【0019】さらに、図5に示すように、pCfTA1
をBanIIIとStuIで切断後、hG−CSFcDN
Aを含む約1.3kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。また、pKYP26をBamHIで切断後、DNAポ
リメラーゼI・クレノー断片で処理することにより突出
末端を平滑末端に変換し、さらにPstIで切断後、L
GT法にて約1.8kbのDNA断片を精製する。一方、p
GEL1をBanIIIとPstIで切断後、約1.0kbのD
NA断片をLGT法により精製する。こうして得られた
3つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合すること
により、pCfWD1を得る。
をBanIIIとStuIで切断後、hG−CSFcDN
Aを含む約1.3kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。また、pKYP26をBamHIで切断後、DNAポ
リメラーゼI・クレノー断片で処理することにより突出
末端を平滑末端に変換し、さらにPstIで切断後、L
GT法にて約1.8kbのDNA断片を精製する。一方、p
GEL1をBanIIIとPstIで切断後、約1.0kbのD
NA断片をLGT法により精製する。こうして得られた
3つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合すること
により、pCfWD1を得る。
【0020】さらに、図6に示すように、pCfTL38
をHindIIIとBglIIで切断後約2.6kbのDNA断片
をLGT法により精製する。また、pCfTL38をHi
ndIIIとDpnIで切断後、約300bpのDNA断片をL
GT法により精製する。一方、pCfTB20をAvaI
で切断後、クレノー断片で処理することにより突出末端
を削り、さらにBglIIで切断後、約480bpのDNA断
片をLGT法により精製する。こうして得た3つのDN
A断片をT4DNAリガーゼで結合することによりpC
fT95K19を得る。さらに、同じく図6に示すようにし
て、pCfT95K19をBanIIIとBglIで切断後約
1.0kbのDNA断片を、またBglIのみで切断後約1.8
kbのDNA断片を、LGT法により精製する。一方、p
CfT95K19をBglIとSau3Aで切断後、約350b
pのDNA断片をLGT法により精製する。こうして得
られる3つのDNA断片と、図6中段に示した合成DN
AをT4DNAリガーゼで結合し、pCfAA1を得
る。さらに、同じく図6に示すようにして、pCfAA
1をXhoIとBglIで切断後、約3.0kbのDNA断
片をLGT法により精製する。このDNA断片と上記p
CfT95K19のBglI−Sau3A断片(約350bp)お
よび図6下段に示す合成DNAをT4DNAリガーゼで
結合し、pCfAB5およびpCfAB14を得る。さら
に、図7に示すように、pCfAB5をAvaIとBg
lIIで切断後、約2.8kbのDNA断片をLGT法により
精製する。また、pCfWD1をBglIIとAvaIで
切断後、約1.3kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。こうして得られた両DNA断片をT4DNAリガー
ゼで結合し、pCfBA8を得る。また、pCfAB14
をAvaIとBglIIで切断後LGT法により精製され
る約2.8kbのDNA断片と、前記pCfWD1のBgl
II、AvaI断片約1.3kbとをT4DNAリガーゼで結
合し、pCfBA32を得る。さらに、同じく図7に示す
ように、pCfBA8をBanIII、BglII、Xho
Iで切断後、約1.4kbと約2.7kbのDNA断片をLGT法
により精製する。こうして得られる2つのDNA断片と
図7に示した合成DNAリンカーをT4DNAリガーゼ
で結合させ、pCfBB101、pCfBC52、pCfB
C59、pCfBD28、pCfBD56、pCfBC42B
1、pCfBC45、pCfBC76、pCfBC77、pC
fBC93、pCfBC95、pCfBC97、pCfBD82
を得る。図8に示すように、pBR322をPstIで切
断後、T4DNAポリメラーゼで突出末端を削り、T4
DNAリガーゼを用いてBglIIリンカーを挿入し、さ
らにEcoRIとBglIIで切断後、約3.6kbのDNA
断片をLGT法により精製する。
をHindIIIとBglIIで切断後約2.6kbのDNA断片
をLGT法により精製する。また、pCfTL38をHi
ndIIIとDpnIで切断後、約300bpのDNA断片をL
GT法により精製する。一方、pCfTB20をAvaI
で切断後、クレノー断片で処理することにより突出末端
を削り、さらにBglIIで切断後、約480bpのDNA断
片をLGT法により精製する。こうして得た3つのDN
A断片をT4DNAリガーゼで結合することによりpC
fT95K19を得る。さらに、同じく図6に示すようにし
て、pCfT95K19をBanIIIとBglIで切断後約
1.0kbのDNA断片を、またBglIのみで切断後約1.8
kbのDNA断片を、LGT法により精製する。一方、p
CfT95K19をBglIとSau3Aで切断後、約350b
pのDNA断片をLGT法により精製する。こうして得
られる3つのDNA断片と、図6中段に示した合成DN
AをT4DNAリガーゼで結合し、pCfAA1を得
る。さらに、同じく図6に示すようにして、pCfAA
1をXhoIとBglIで切断後、約3.0kbのDNA断
片をLGT法により精製する。このDNA断片と上記p
CfT95K19のBglI−Sau3A断片(約350bp)お
よび図6下段に示す合成DNAをT4DNAリガーゼで
結合し、pCfAB5およびpCfAB14を得る。さら
に、図7に示すように、pCfAB5をAvaIとBg
lIIで切断後、約2.8kbのDNA断片をLGT法により
精製する。また、pCfWD1をBglIIとAvaIで
切断後、約1.3kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。こうして得られた両DNA断片をT4DNAリガー
ゼで結合し、pCfBA8を得る。また、pCfAB14
をAvaIとBglIIで切断後LGT法により精製され
る約2.8kbのDNA断片と、前記pCfWD1のBgl
II、AvaI断片約1.3kbとをT4DNAリガーゼで結
合し、pCfBA32を得る。さらに、同じく図7に示す
ように、pCfBA8をBanIII、BglII、Xho
Iで切断後、約1.4kbと約2.7kbのDNA断片をLGT法
により精製する。こうして得られる2つのDNA断片と
図7に示した合成DNAリンカーをT4DNAリガーゼ
で結合させ、pCfBB101、pCfBC52、pCfB
C59、pCfBD28、pCfBD56、pCfBC42B
1、pCfBC45、pCfBC76、pCfBC77、pC
fBC93、pCfBC95、pCfBC97、pCfBD82
を得る。図8に示すように、pBR322をPstIで切
断後、T4DNAポリメラーゼで突出末端を削り、T4
DNAリガーゼを用いてBglIIリンカーを挿入し、さ
らにEcoRIとBglIIで切断後、約3.6kbのDNA
断片をLGT法により精製する。
【0021】一方、上記で得られるpCfBB101、p
CfBC52、pCfBC59、pCfBD28、pCfBD
56をEcoRIとBglIIで切断後、約1.8kbのDNA
断片を各々LGT法により精製する。こうして得られる
約3.6kbと約1.8kbのDNA断片を各々T4DNAリガー
ゼで結合することにより、各々、pCfCB101、pC
fCC52、pCfCC59、pCfCD28、pCfCD56
を得る。
CfBC52、pCfBC59、pCfBD28、pCfBD
56をEcoRIとBglIIで切断後、約1.8kbのDNA
断片を各々LGT法により精製する。こうして得られる
約3.6kbと約1.8kbのDNA断片を各々T4DNAリガー
ゼで結合することにより、各々、pCfCB101、pC
fCC52、pCfCC59、pCfCD28、pCfCD56
を得る。
【0022】他方、pCfBA8をBanIII、BglI
I、XhoIで切断後、約1.4kbと約2.7kbのDNA断片
をLGT法により精製する。こうして得られる2つの断
片と図14に示した合成DNAリンカーをT4DNAリガ
ーゼで結合させ、pCfTNS7およびpCfTAAr
g4Sを得る。加えて、図15に示すようにpCfTNS
7をPvuI、XhoIで切断後、約1kbのDNA断片
をLGT法により精製する。またpCfBA32をPvu
I、XhoIで切断後、約3kbのDNA断片をLGT法
により精製する。こうして得られる2つの断片をT4D
NAリガーゼで結合させ、pCfTN205を得る。同様
に、pCfTAArg4SをPvuI、XhoIで切断
後、LGT法で精製して得られる約1kbの断片と、前記
pCfBA32をPvuI、XhoIで切断して得られる
約3kbのDNA断片とをT4DNAリガーゼで結合させ
pCfTAArg4を得る。また、pCfBA8をBa
nIII、BglII、HindIIIで切断後、約1.4kbと約
2.7kbのDNA断片をLGT法により精製する。こうし
て得られる2つの断片と図16に示した合成DNAリンカ
ーをT4DNAリガーゼで結合させ、pCfTNS30
1、pCfTNS401を得る。さらに図12に示すようにp
CfBA8をXhoIで切断後、クレノー断片で処理す
ることにより突出末端を平滑末端に変換し、さらにPv
uIで切断後、約3kbのDNA断片をLGT法により精
製する。別に、ATGベクターpTrS20(参考例4)
をSacIで切断後、クレノー断片で処理して突出末端
を平滑末端に変換し、さらにPvuIで切断後、LGT
法により約1kbのDNA断片を精製する。こうして得ら
れる2つの断片をT4DNAリガーゼで結合させ、pC
fTNS501を得る。
I、XhoIで切断後、約1.4kbと約2.7kbのDNA断片
をLGT法により精製する。こうして得られる2つの断
片と図14に示した合成DNAリンカーをT4DNAリガ
ーゼで結合させ、pCfTNS7およびpCfTAAr
g4Sを得る。加えて、図15に示すようにpCfTNS
7をPvuI、XhoIで切断後、約1kbのDNA断片
をLGT法により精製する。またpCfBA32をPvu
I、XhoIで切断後、約3kbのDNA断片をLGT法
により精製する。こうして得られる2つの断片をT4D
NAリガーゼで結合させ、pCfTN205を得る。同様
に、pCfTAArg4SをPvuI、XhoIで切断
後、LGT法で精製して得られる約1kbの断片と、前記
pCfBA32をPvuI、XhoIで切断して得られる
約3kbのDNA断片とをT4DNAリガーゼで結合させ
pCfTAArg4を得る。また、pCfBA8をBa
nIII、BglII、HindIIIで切断後、約1.4kbと約
2.7kbのDNA断片をLGT法により精製する。こうし
て得られる2つの断片と図16に示した合成DNAリンカ
ーをT4DNAリガーゼで結合させ、pCfTNS30
1、pCfTNS401を得る。さらに図12に示すようにp
CfBA8をXhoIで切断後、クレノー断片で処理す
ることにより突出末端を平滑末端に変換し、さらにPv
uIで切断後、約3kbのDNA断片をLGT法により精
製する。別に、ATGベクターpTrS20(参考例4)
をSacIで切断後、クレノー断片で処理して突出末端
を平滑末端に変換し、さらにPvuIで切断後、LGT
法により約1kbのDNA断片を精製する。こうして得ら
れる2つの断片をT4DNAリガーゼで結合させ、pC
fTNS501を得る。
【0023】部位特異的変異を用いる例としては、図17
に示すように、pCfBD28をBanIIIとPstIで
切断後、約210bpのDNA断片をLGT法により精製す
る。また、M13ファージベクターのM13mp19RFDN
AをAccIとPstIで切断後、約7.24kbのDNA断
片をLGT法により精製する。こうして得られる2つの
DNA断片をT4DNAリガーゼにより結合し、pt19
BD28Nを得る。ついで、このpt19BD28Nを大腸菌
JM105にトランスフェクションし、得られたファージ
より一本鎖pt19BD28Nを得る。同じく図17に示すよ
うにして、M13mp19RFDNAをHindIIIとEc
oRIで切断後、約7.2kbのDNA断片をLGT法によ
り精製する。この約7.2kbのDNA断片と上記で得られ
た一本鎖pt19BD28Nを混合し、変性処理の後再びア
ニールさせることによりギャップト・デュプレックスD
NAを生成させ、LGT法によりこれを精製する。つい
でこのギャップト・デュプレックスDNAに図17に示し
た合成DNAをアニールさせた後、クレノー断片とT4
DNAリガーゼにより環状化する。この環状化DNAを
大腸菌JM105株にトランスフェクションし、部位特異
的変異が導入されたpt19BD28NA17,pt19BD28
NT17を得る。さらに同じく図17に示すようにしてpt
19BD28NA17,pt19BD27NT17をAvaIとXh
oIで切断後、約110bpのDNA断片を各々LGT法に
より精製する。一方、pCfBD28をXhoIとBgl
IIで切断後、約2.74kbのDNA断片をLGT法により精
製する。また、pCfBD28をBglIIとAvaIで切
断後、約1.29kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。こうして得られる約110bp,約2.74kb,約1.29kbの
DNA断片を各々T4DNAリガーゼで結合することに
より、各々pCfBD28 A17,pCfBD28T17を得
る。
に示すように、pCfBD28をBanIIIとPstIで
切断後、約210bpのDNA断片をLGT法により精製す
る。また、M13ファージベクターのM13mp19RFDN
AをAccIとPstIで切断後、約7.24kbのDNA断
片をLGT法により精製する。こうして得られる2つの
DNA断片をT4DNAリガーゼにより結合し、pt19
BD28Nを得る。ついで、このpt19BD28Nを大腸菌
JM105にトランスフェクションし、得られたファージ
より一本鎖pt19BD28Nを得る。同じく図17に示すよ
うにして、M13mp19RFDNAをHindIIIとEc
oRIで切断後、約7.2kbのDNA断片をLGT法によ
り精製する。この約7.2kbのDNA断片と上記で得られ
た一本鎖pt19BD28Nを混合し、変性処理の後再びア
ニールさせることによりギャップト・デュプレックスD
NAを生成させ、LGT法によりこれを精製する。つい
でこのギャップト・デュプレックスDNAに図17に示し
た合成DNAをアニールさせた後、クレノー断片とT4
DNAリガーゼにより環状化する。この環状化DNAを
大腸菌JM105株にトランスフェクションし、部位特異
的変異が導入されたpt19BD28NA17,pt19BD28
NT17を得る。さらに同じく図17に示すようにしてpt
19BD28NA17,pt19BD27NT17をAvaIとXh
oIで切断後、約110bpのDNA断片を各々LGT法に
より精製する。一方、pCfBD28をXhoIとBgl
IIで切断後、約2.74kbのDNA断片をLGT法により精
製する。また、pCfBD28をBglIIとAvaIで切
断後、約1.29kbのDNA断片をLGT法により精製す
る。こうして得られる約110bp,約2.74kb,約1.29kbの
DNA断片を各々T4DNAリガーゼで結合することに
より、各々pCfBD28 A17,pCfBD28T17を得
る。
【0024】上記組換え技法における反応の条件は、一
般的に下記のとおりである。DNAの制限酵素による消
化反応は通常0.1〜20μgのDNAを2〜200mM(好ま
しくは10〜40mM)のTris−HCl(pH6.0〜9.5好ま
しくはpH7.0〜8.0)、0〜200mMのNaCl、2〜20mM
(好ましくは5〜10mM)のMgCl2 を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位(好ましくは1μgのDNA
に対して1〜3単位)を用い、20〜70℃(至適温度は用
いる制限酵素により異なる)において、15分間〜24時間
行う。反応の停止は、通常55〜75℃で、5〜30分間加熱
することによるが、フェノールまたはジエチルピロカー
ボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。
般的に下記のとおりである。DNAの制限酵素による消
化反応は通常0.1〜20μgのDNAを2〜200mM(好ま
しくは10〜40mM)のTris−HCl(pH6.0〜9.5好ま
しくはpH7.0〜8.0)、0〜200mMのNaCl、2〜20mM
(好ましくは5〜10mM)のMgCl2 を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位(好ましくは1μgのDNA
に対して1〜3単位)を用い、20〜70℃(至適温度は用
いる制限酵素により異なる)において、15分間〜24時間
行う。反応の停止は、通常55〜75℃で、5〜30分間加熱
することによるが、フェノールまたはジエチルピロカー
ボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる方法も
用いることができる。
【0025】制限酵素消化によって生じたDNA断片あ
るいはギャップト・デュプレックスDNAの精製は、L
GT法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・エ
ム・マキサム(A. M. Maxam )ら:プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.), USA 74, 560 (1977)〕
などによって行う。
るいはギャップト・デュプレックスDNAの精製は、L
GT法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法〔エイ・エ
ム・マキサム(A. M. Maxam )ら:プロシーディング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス
(Proc. Natl. Acad. Sci.), USA 74, 560 (1977)〕
などによって行う。
【0026】DNA断片の結合反応は、2〜200mM(好
ましくは10〜40mM) のTris−HCl(pH6.1〜9.5、
好ましくはpH7.0〜8.0)、2〜20mM(好ましくは5〜10
mM)のMgCl2 、0.1〜10mM(好ましくは0.5〜2.0m
M)のATP、1〜50mM(好ましくは5〜10mM)のジチ
オスレイトールを含む反応液中で、T4DNAリガーゼ
0.3〜10単位を用い、1〜37℃(好ましくは3〜20℃)
で15分間〜72時間(好ましくは2〜20時間)行う。
ましくは10〜40mM) のTris−HCl(pH6.1〜9.5、
好ましくはpH7.0〜8.0)、2〜20mM(好ましくは5〜10
mM)のMgCl2 、0.1〜10mM(好ましくは0.5〜2.0m
M)のATP、1〜50mM(好ましくは5〜10mM)のジチ
オスレイトールを含む反応液中で、T4DNAリガーゼ
0.3〜10単位を用い、1〜37℃(好ましくは3〜20℃)
で15分間〜72時間(好ましくは2〜20時間)行う。
【0027】結合反応によって生じた組換え体プラスミ
ドDNAは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S. N. Cohen)ら:プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 69, 2110(197
2)〕によって、大腸菌に導入する。結合反応によって
生じた組み換え体M13ファージRFDNAは、必要によ
り公知のトランスフェクション法〔口野嘉幸ら:蛋白質
・核酸・酵素 29, 294(1984) 〕によって、大腸菌JM
105株〔ジェイ・メシング(J. Messing) ら:ジーン(G
ene) 33, 103(1985)〕に導入する。
ドDNAは、必要によりコーエンらの形質転換法〔エス
・エヌ・コーエン(S. N. Cohen)ら:プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエ
ンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 69, 2110(197
2)〕によって、大腸菌に導入する。結合反応によって
生じた組み換え体M13ファージRFDNAは、必要によ
り公知のトランスフェクション法〔口野嘉幸ら:蛋白質
・核酸・酵素 29, 294(1984) 〕によって、大腸菌JM
105株〔ジェイ・メシング(J. Messing) ら:ジーン(G
ene) 33, 103(1985)〕に導入する。
【0028】組換え体プラスミドDNAおよび組み換え
体M13ファージRFDNAを持つ大腸菌から該DNAの
単離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーン
ボイム (H. C. Birnboim) ら:ヌクレイック・アシッド
・リサーチ (Nucleic AcidsRes.) 7,1513 (1979) 〕
などを用いて行う。組み換え体M13ファージからの一本
鎖DNAの単離は公知の方法〔口野嘉幸ら:蛋白質・核
酸・酵素 29, 294(1984)〕に従って行う。
体M13ファージRFDNAを持つ大腸菌から該DNAの
単離は、バーンボイムらの方法〔エイチ・シー・バーン
ボイム (H. C. Birnboim) ら:ヌクレイック・アシッド
・リサーチ (Nucleic AcidsRes.) 7,1513 (1979) 〕
などを用いて行う。組み換え体M13ファージからの一本
鎖DNAの単離は公知の方法〔口野嘉幸ら:蛋白質・核
酸・酵素 29, 294(1984)〕に従って行う。
【0029】プラスミドDNAを1〜10種類の制限酵素
で消化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリル
アミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。さらにD
NAの塩基配列を決定する必要があるときはM13ファー
ジを用いたディデオキシ・シークエンス(dideoxy sequ
ence) 法〔ジェイ・メシング(J. Messing)ら: ジーン
(Gene) 19, 269(1982) 〕によって決定する。
で消化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリル
アミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。さらにD
NAの塩基配列を決定する必要があるときはM13ファー
ジを用いたディデオキシ・シークエンス(dideoxy sequ
ence) 法〔ジェイ・メシング(J. Messing)ら: ジーン
(Gene) 19, 269(1982) 〕によって決定する。
【0030】以上のような条件で組換え体プラスミドD
NAを製造することができる。本発明のhG−CSFポ
リペプチド誘導体は以下のとおりに製造できる。すなわ
ち、プラスミド(例えばpCfBD28)を用いて大腸菌
K−12HB101を形質転換させ、アンピシリン耐性(A
pr 以下同じ)のコロニーの中からプラスミド(例えば
pCfBD28)を有する大腸菌を選びだす。プラスミド
(例えばpCfBD28)を有する大腸菌を培地に培養す
ることにより培養物中にhG−CSFポリペプチド誘導
体を生成させることができる。
NAを製造することができる。本発明のhG−CSFポ
リペプチド誘導体は以下のとおりに製造できる。すなわ
ち、プラスミド(例えばpCfBD28)を用いて大腸菌
K−12HB101を形質転換させ、アンピシリン耐性(A
pr 以下同じ)のコロニーの中からプラスミド(例えば
pCfBD28)を有する大腸菌を選びだす。プラスミド
(例えばpCfBD28)を有する大腸菌を培地に培養す
ることにより培養物中にhG−CSFポリペプチド誘導
体を生成させることができる。
【0031】ここで用いる培地としては大腸菌の生育な
らびにhG−CSFポリペプチド誘導体の生産に好適な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど
が、窒素源としては、NH4Cl、 (NH4 )2SO4、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バク
トトリプトン、コーン・スティープ・リカーなどが、そ
の他の栄養源としてはK2HPO4、KH 2PO4 、Na
Cl、MgSO4 、ビタミンB1 、MgCl2 などが使
用できる。
らびにhG−CSFポリペプチド誘導体の生産に好適な
ものならば合成培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなど
が、窒素源としては、NH4Cl、 (NH4 )2SO4、カ
ザミノ酸、酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス、バク
トトリプトン、コーン・スティープ・リカーなどが、そ
の他の栄養源としてはK2HPO4、KH 2PO4 、Na
Cl、MgSO4 、ビタミンB1 、MgCl2 などが使
用できる。
【0032】培養はpH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気攪
拌培養により行われる。培養5〜90時間で培養菌体中に
hG−CSFポリペプチド誘導体が蓄積するので、培養
物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、
遠心して菌体残渣を得る。この菌体残渣からマーストン
らの方法〔F. A. O. Marstonら:BIO/TECHNOLOGY 2,8
00(1984) 〕によりhG−CSFポリペプチド誘導体を
抽出・精製・可溶化・再生し、該誘導体でマウス骨髄細
胞を処理し、軟寒天中に形成されるコロニー数を指標と
したアッセイ法によりhG−CSFポリペプチド誘導体
の定量を行う。
拌培養により行われる。培養5〜90時間で培養菌体中に
hG−CSFポリペプチド誘導体が蓄積するので、培養
物から菌体を集菌し、菌体を超音波処理により破砕し、
遠心して菌体残渣を得る。この菌体残渣からマーストン
らの方法〔F. A. O. Marstonら:BIO/TECHNOLOGY 2,8
00(1984) 〕によりhG−CSFポリペプチド誘導体を
抽出・精製・可溶化・再生し、該誘導体でマウス骨髄細
胞を処理し、軟寒天中に形成されるコロニー数を指標と
したアッセイ法によりhG−CSFポリペプチド誘導体
の定量を行う。
【0033】本発明におけるG−CSF活性の測定は以
下のように行う。8〜12週令のC3H/He雄マウス
(静岡実験動物協同組合)の大腿骨より骨髄細胞を無菌
的にとり出し、牛胎児血清(FBS)を10%添加したα
−Minimum Essential Medium (Flow Laboratories,以
下α−MEM培地と略す)に懸濁する。この細胞(約5
×107 個)懸濁液1.5mlを、ナイロン・ウール(Nylon w
ool) (和光純薬、NylonFiber 146-04231)をつめたカ
ラム(0.3g)に浸漬し、5%CO2 インキュベーター
内にて37℃,90分間反応させる。次いで予め37℃に加温
したα−MEM培地をカラムに流し、溶出してくるナイ
ロン・ウール非吸着性の骨髄細胞を得る。この細胞をα
−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度に調製する。
下のように行う。8〜12週令のC3H/He雄マウス
(静岡実験動物協同組合)の大腿骨より骨髄細胞を無菌
的にとり出し、牛胎児血清(FBS)を10%添加したα
−Minimum Essential Medium (Flow Laboratories,以
下α−MEM培地と略す)に懸濁する。この細胞(約5
×107 個)懸濁液1.5mlを、ナイロン・ウール(Nylon w
ool) (和光純薬、NylonFiber 146-04231)をつめたカ
ラム(0.3g)に浸漬し、5%CO2 インキュベーター
内にて37℃,90分間反応させる。次いで予め37℃に加温
したα−MEM培地をカラムに流し、溶出してくるナイ
ロン・ウール非吸着性の骨髄細胞を得る。この細胞をα
−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度に調製する。
【0034】次いで、岡部らの方法〔Okabe T. et al.,
Cancer Research 44、4503−4506(1986)〕に準じて
骨髄造血幹細胞コロニー形成能を測定する。すなわち、
α−MEM0.2ml、FBS0.4mlおよび2段階稀釈した各
サンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細
胞(2×106 個/ml)の0.2mlを混和する。これに42℃
に保温した0.6%寒天 (Difco, Agar purified # 0560
−01) 溶液を等量(1.0ml)混和し、その0.5mlを24穴マ
ルチディッシュ(Nunc社製、# 143982 )に播種する
(5×104 個/dish, n=3)。5%CO2 インキュベ
ーター中で37℃,7日間培養し、40個以上の細胞からな
るコロニーの数を顕微鏡 (Olympus 社製、X40) で計数
する。コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にと
り出し、アセトン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Ku
botaらの方法〔Kubota K., et al.,Exp. Hematology.
8,339 −344 (1980)〕でエステラーゼ2重染色を施
し、各コロニーの同定を行う。
Cancer Research 44、4503−4506(1986)〕に準じて
骨髄造血幹細胞コロニー形成能を測定する。すなわち、
α−MEM0.2ml、FBS0.4mlおよび2段階稀釈した各
サンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細
胞(2×106 個/ml)の0.2mlを混和する。これに42℃
に保温した0.6%寒天 (Difco, Agar purified # 0560
−01) 溶液を等量(1.0ml)混和し、その0.5mlを24穴マ
ルチディッシュ(Nunc社製、# 143982 )に播種する
(5×104 個/dish, n=3)。5%CO2 インキュベ
ーター中で37℃,7日間培養し、40個以上の細胞からな
るコロニーの数を顕微鏡 (Olympus 社製、X40) で計数
する。コロニー計数後、注意深くスライドグラス上にと
り出し、アセトン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Ku
botaらの方法〔Kubota K., et al.,Exp. Hematology.
8,339 −344 (1980)〕でエステラーゼ2重染色を施
し、各コロニーの同定を行う。
【0035】各サンプルの力価は、コロニー形成試験の
2段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出する。
スタンダードとして用いたインタクトG−CSFのコロ
ニー形成の最大値の1/2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価(単位)とする。比活
性は、単位蛋白質(mg)当りの力価(単位/mg)で表示
する。
2段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出する。
スタンダードとして用いたインタクトG−CSFのコロ
ニー形成の最大値の1/2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価(単位)とする。比活
性は、単位蛋白質(mg)当りの力価(単位/mg)で表示
する。
【0036】hG−CSFポリペプチドのN末端側のア
ミノ酸が欠失したhG−CSFポリペプチド誘導体は酵
素的分解方法により製造することもできる。該誘導体は
天然のhG−CSFを原料物質として用い酵素分解によ
り製造することもできるが、天然のhG−CSFは酵素
(プロテアーゼ)に対する反応性が低いので、プロテア
ーゼに対して反応性の高められた改変hG−CSFを用
いた方が高活性を有する誘導体を収率よく製造すること
ができる。
ミノ酸が欠失したhG−CSFポリペプチド誘導体は酵
素的分解方法により製造することもできる。該誘導体は
天然のhG−CSFを原料物質として用い酵素分解によ
り製造することもできるが、天然のhG−CSFは酵素
(プロテアーゼ)に対する反応性が低いので、プロテア
ーゼに対して反応性の高められた改変hG−CSFを用
いた方が高活性を有する誘導体を収率よく製造すること
ができる。
【0037】原料物質としては、hG−CSFポリペプ
チドのN末端側アミノ酸が表2のように置換した改変h
G−CSF(a)、(b)、(c)および(d)が好適に用いられる。
(a)、(b)、(c)および(d)は、対応する塩基配列を有するプ
ラスミドpCfBC59(NC59)、pCfBD28(ND
28)、pCfBC95(NC95)およびpCfTAArg
4S(Arg4S)をそれぞれ保有する菌株を培養し公
知の方法で精製単離することにより得ることができる。
チドのN末端側アミノ酸が表2のように置換した改変h
G−CSF(a)、(b)、(c)および(d)が好適に用いられる。
(a)、(b)、(c)および(d)は、対応する塩基配列を有するプ
ラスミドpCfBC59(NC59)、pCfBD28(ND
28)、pCfBC95(NC95)およびpCfTAArg
4S(Arg4S)をそれぞれ保有する菌株を培養し公
知の方法で精製単離することにより得ることができる。
【0038】酵素としては、セリンプロテアーゼ、チオ
ールプロテアーゼなどのエンドプロテアーゼが好適に用
いられる。具体的には、例えば、ズブチリシンA、ズブ
チリシンBPN’、ズブチリシンカールスバーグ、ズブ
チリシンノボ、プロティナーゼK、ナガーゼ、サーモラ
イシン、エンドプロテイナーゼArg−C、トリプシ
ン、α−キモトリプシンなどがあげられる。酵素は、原
料物質の1mgに対して3.4×10-6〜8.5×10-3単位の割合
で用いる。
ールプロテアーゼなどのエンドプロテアーゼが好適に用
いられる。具体的には、例えば、ズブチリシンA、ズブ
チリシンBPN’、ズブチリシンカールスバーグ、ズブ
チリシンノボ、プロティナーゼK、ナガーゼ、サーモラ
イシン、エンドプロテイナーゼArg−C、トリプシ
ン、α−キモトリプシンなどがあげられる。酵素は、原
料物質の1mgに対して3.4×10-6〜8.5×10-3単位の割合
で用いる。
【0039】
【表2】
【0040】酵素反応は、原料物質をトリス塩酸緩衝液
あるいはリン酸緩衝液などの水性溶液に溶かし、酵素を
加えて、10〜37℃で30分間〜3日間行う。本発明におけ
る総蛋白質量、蛋白質量は以下に記載する方法によって
測定する。総蛋白質量の測定はエム・エム・ブラッドフ
ォードの方法〔M. M. Bradford:アナリティカル・バイ
オケミストリィ (Anal. Biochem.) 72, 248 (1976)〕
により行う。
あるいはリン酸緩衝液などの水性溶液に溶かし、酵素を
加えて、10〜37℃で30分間〜3日間行う。本発明におけ
る総蛋白質量、蛋白質量は以下に記載する方法によって
測定する。総蛋白質量の測定はエム・エム・ブラッドフ
ォードの方法〔M. M. Bradford:アナリティカル・バイ
オケミストリィ (Anal. Biochem.) 72, 248 (1976)〕
により行う。
【0041】蛋白質量はレムリの方法〔U. K. Laemml
i:ネイチャー (Nature) 227, 680 (1970) 〕によりS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ク
ロマトスキャナー(CS−930島津製作所)で測定す
る。酵素切断後に得られるペプチドのN末端アミノ酸配
列は自動アミノ酸配列測定機“ガスーフェーズ・プロテ
イン・シークエンサー・モデル470A”(アプライド・
バイオシステムズ社製)とスペクトラ・フィジクス(Sp
ectra−Physics)社製高速液体クロマトグラフィーの組
み合せによって測定する。
i:ネイチャー (Nature) 227, 680 (1970) 〕によりS
DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ク
ロマトスキャナー(CS−930島津製作所)で測定す
る。酵素切断後に得られるペプチドのN末端アミノ酸配
列は自動アミノ酸配列測定機“ガスーフェーズ・プロテ
イン・シークエンサー・モデル470A”(アプライド・
バイオシステムズ社製)とスペクトラ・フィジクス(Sp
ectra−Physics)社製高速液体クロマトグラフィーの組
み合せによって測定する。
【0042】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。 実施例1. hG−CSF発現プラスミドpCfTA1の造成(図1
参照):参考例1により得られたpCSF1−2DNA
2μgを10mM Tris−HCl(pH7.5)、7mM Mg
Cl2 、6mM 2−メルカプトエタノールおよび100mMN
aClを含む全量20μlの溶液(以下“Y−100緩衝
液”と略す)に溶かし、制限酵素ApaI〔ベーリンガ
ー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社製〕とBa
mHI(宝酒造社製、以下制限酵素については特記しな
い限りすべて宝酒造社製)それぞれ10単位を加え、37℃
で4時間反応を行った。この反応液からLGT法により
1.5kbのDNA断片0.4μgを精製、回収した。
参照):参考例1により得られたpCSF1−2DNA
2μgを10mM Tris−HCl(pH7.5)、7mM Mg
Cl2 、6mM 2−メルカプトエタノールおよび100mMN
aClを含む全量20μlの溶液(以下“Y−100緩衝
液”と略す)に溶かし、制限酵素ApaI〔ベーリンガ
ー・マンハイム(Boehringer Mannheim)社製〕とBa
mHI(宝酒造社製、以下制限酵素については特記しな
い限りすべて宝酒造社製)それぞれ10単位を加え、37℃
で4時間反応を行った。この反応液からLGT法により
1.5kbのDNA断片0.4μgを精製、回収した。
【0043】別に参考例3の方法で調製したプラスミド
pLSA12μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、制限
酵素BanIII(東洋紡績社製)とBamHIそれぞれ1
0単位を加え、37℃で4時間反応を行った。この反応液
からLGT法により2.8kbのDNA断片0.8μgを精製、
回収した。一方、成熟hG−CSFポリペプチドのN末
端第1〜5番目までのアミノ酸〔スレオニン1 (ACA
またはACT)、プロリン2 (CCAまたはCCT)、
ロイシン3 (CTA)、グリシン4 (GGC)、プロリ
ン5 (CCC)〕をコードするコドンと発現に必要な開
始コドン(ATG)を付与する必要があること、また、
トリプトファンプロモーター(Ptrp)の下流のSD
−配列とATGとの距離を、6〜18bpの間の適当な長さ
にする必要があることなどの理由から、下記のDNAリ
ンカーを合成した。
pLSA12μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、制限
酵素BanIII(東洋紡績社製)とBamHIそれぞれ1
0単位を加え、37℃で4時間反応を行った。この反応液
からLGT法により2.8kbのDNA断片0.8μgを精製、
回収した。一方、成熟hG−CSFポリペプチドのN末
端第1〜5番目までのアミノ酸〔スレオニン1 (ACA
またはACT)、プロリン2 (CCAまたはCCT)、
ロイシン3 (CTA)、グリシン4 (GGC)、プロリ
ン5 (CCC)〕をコードするコドンと発現に必要な開
始コドン(ATG)を付与する必要があること、また、
トリプトファンプロモーター(Ptrp)の下流のSD
−配列とATGとの距離を、6〜18bpの間の適当な長さ
にする必要があることなどの理由から、下記のDNAリ
ンカーを合成した。
【0044】
【化1】
【0045】まず一本鎖DNA、26merと20merを通常の
トリエステル法〔アール・クレア(R. Crea)ら:プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) 、USA 75,
5765 (1978) 〕により合成した。26mer、 20merのそれぞ
れ2μgを50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mMMg
Cl2 、5mM ジチオスレイトール、0.1mM EDTAお
よび1mM ATPを含む緩衝液(以下この緩衝液を“T
4キナーゼ緩衝液”と略記する)40μlに溶かし、T4
ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製:以下同
じ)を加えて、37℃,60分間リン酸化反応を行った。
トリエステル法〔アール・クレア(R. Crea)ら:プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) 、USA 75,
5765 (1978) 〕により合成した。26mer、 20merのそれぞ
れ2μgを50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mMMg
Cl2 、5mM ジチオスレイトール、0.1mM EDTAお
よび1mM ATPを含む緩衝液(以下この緩衝液を“T
4キナーゼ緩衝液”と略記する)40μlに溶かし、T4
ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製:以下同
じ)を加えて、37℃,60分間リン酸化反応を行った。
【0046】上記で得たpCSF1−2由来のApaI
−BamHI断片(1.5kb)0.4μgとpLSA1由来の
BanIII−BamHI断片(2.8kb) 0.2μgとを20mM
Tris−HCl(pH7.6)、10mM MgCl2 、10mM
ジチオスレイトールおよび1mM ATPを含む緩衝液
(以下この緩衝液を“T4リガーゼ緩衝液”と略記す
る)25μlに溶かし、この混合液に上記DNAリンカー
を0.1μg加えた。この混合溶液にさらにT4DNAリ
ガーゼ(宝酒造社製:以下同じ)6単位を加え、4℃,
18時間結合反応を行った。
−BamHI断片(1.5kb)0.4μgとpLSA1由来の
BanIII−BamHI断片(2.8kb) 0.2μgとを20mM
Tris−HCl(pH7.6)、10mM MgCl2 、10mM
ジチオスレイトールおよび1mM ATPを含む緩衝液
(以下この緩衝液を“T4リガーゼ緩衝液”と略記す
る)25μlに溶かし、この混合液に上記DNAリンカー
を0.1μg加えた。この混合溶液にさらにT4DNAリ
ガーゼ(宝酒造社製:以下同じ)6単位を加え、4℃,
18時間結合反応を行った。
【0047】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株〔ボリバー(Bolivar)ら:ジーン
(Gene) 2,75 (1977) 〕をコーエンらの方法〔エス・
エヌ・コーエン(S. N. Cohen)ら:プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス (Proc. Natl. Acad. Sci.)USA,69, 2110 (1972)〕
(以下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる)により
形質転換し、Aprのコロニーを得た。このコロニーの
培養菌体から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム
(H. C. Birnboim) ら: ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Nucleic Acids Res.) 7, 1513 (1979)〕(以下
プラスミドDNAの分離はこの方法を用いる)に従って
プラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドの構
造は、BanIII、RsaI、PstI、HindIII、 B
glIIで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。このプラスミドをpCfTA1とよぶ。pCfTA
1のBanIII、HindIII付近の塩基配列は下記のと
おりであることを、M13ファージを用いたディデオキシ
・シークエンス法で確認した。
いて大腸菌HB101株〔ボリバー(Bolivar)ら:ジーン
(Gene) 2,75 (1977) 〕をコーエンらの方法〔エス・
エヌ・コーエン(S. N. Cohen)ら:プロシーディング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス (Proc. Natl. Acad. Sci.)USA,69, 2110 (1972)〕
(以下大腸菌の形質転換にはこの方法を用いる)により
形質転換し、Aprのコロニーを得た。このコロニーの
培養菌体から公知の方法〔エイチ・シー・バーンボイム
(H. C. Birnboim) ら: ヌクレイック・アシッド・リサ
ーチ(Nucleic Acids Res.) 7, 1513 (1979)〕(以下
プラスミドDNAの分離はこの方法を用いる)に従って
プラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドの構
造は、BanIII、RsaI、PstI、HindIII、 B
glIIで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認し
た。このプラスミドをpCfTA1とよぶ。pCfTA
1のBanIII、HindIII付近の塩基配列は下記のと
おりであることを、M13ファージを用いたディデオキシ
・シークエンス法で確認した。
【0048】
【化2】
【0049】実施例2. hG−CSFcDNAの3'−非翻訳領域の1部を欠失
したプラスミドpCfTB20の造成(図2参照):実施
例1で得られたhG−CSF発現プラスミミドpCfT
A1(4.3kb) 2μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、
制限酵素BamHI 4単位を加えて37℃,4時間消化
反応を行った。フェノール−クロロホルム等量混合液に
よる抽出(以下フェノール−クロロホルム抽出と略記す
る)の後、エタノール沈澱により、DNA断片1.8μg
を回収した。このDNA断片を50mM Tris−HCl
(pH7.8)、7mM MgCl2 および6mM メルカプトエ
タノールを含む緩衝液(以下この緩衝液を“クレノー緩
衝液”と略記する)20μlに溶かし、dATP、dTT
P、dCTP、dGTPをそれぞれ1mMになるように加
え、さらに4単位のDNAポリメラーゼI・クレノー断
片(宝酒造社製:以下同じ)を加えて、室温で1時間反
応させ、突出末端を平滑末端に変換した。フェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈澱により、DNA断
片1.6μgを回収した。該DNA断片をY−100緩衝液20
μlに溶かし、10単位のEcoRIを加え、37℃,4時
間切断反応を行った。この反応液からLGT法により2.
5kbのDNA断片(BamHI(Blunt)−EcoRI断
片)1μgを得た。
したプラスミドpCfTB20の造成(図2参照):実施
例1で得られたhG−CSF発現プラスミミドpCfT
A1(4.3kb) 2μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、
制限酵素BamHI 4単位を加えて37℃,4時間消化
反応を行った。フェノール−クロロホルム等量混合液に
よる抽出(以下フェノール−クロロホルム抽出と略記す
る)の後、エタノール沈澱により、DNA断片1.8μg
を回収した。このDNA断片を50mM Tris−HCl
(pH7.8)、7mM MgCl2 および6mM メルカプトエ
タノールを含む緩衝液(以下この緩衝液を“クレノー緩
衝液”と略記する)20μlに溶かし、dATP、dTT
P、dCTP、dGTPをそれぞれ1mMになるように加
え、さらに4単位のDNAポリメラーゼI・クレノー断
片(宝酒造社製:以下同じ)を加えて、室温で1時間反
応させ、突出末端を平滑末端に変換した。フェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈澱により、DNA断
片1.6μgを回収した。該DNA断片をY−100緩衝液20
μlに溶かし、10単位のEcoRIを加え、37℃,4時
間切断反応を行った。この反応液からLGT法により2.
5kbのDNA断片(BamHI(Blunt)−EcoRI断
片)1μgを得た。
【0050】別に、pCfTA12μgを20μlのY−10
0緩衝液に溶かし、10単位のEcoRIを加え、37℃4
時間切断反応を行った後、NaCl濃度が150mMとなる
ようにNaClを添加し、10単位のDraIを加え、37
℃,4時間切断反応を行った。アガロースゲル電気泳動
にて完全な分解を確認した後、hG−CSFcDNAを
含む1.0kbのDNA断片(EcoRI−DraI断片)
0.2μgを、LGT法により精製、回収した。
0緩衝液に溶かし、10単位のEcoRIを加え、37℃4
時間切断反応を行った後、NaCl濃度が150mMとなる
ようにNaClを添加し、10単位のDraIを加え、37
℃,4時間切断反応を行った。アガロースゲル電気泳動
にて完全な分解を確認した後、hG−CSFcDNAを
含む1.0kbのDNA断片(EcoRI−DraI断片)
0.2μgを、LGT法により精製、回収した。
【0051】上記で得たBamHI(Blunt)−Eco
RI断片(2.5kb)0.2μgとEcoRI−DraI断片
(1.0kb) 0.2μgをT4リガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液にT4DNAリガーゼ6単位を加え、4
℃,18時間結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、
Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体より
プラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドの構
造は、HindIII、PstIで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動により確認した。このプラスミドをpCfT
B20と呼ぶ。 実施例3. hG−CSFのN末端アミノ酸を置換したポリペプチド
をコードするプラスミドpCfTL23,pCfTL38,
pCfTL35,pCfTL41の造成(図3参照):参考
例1の方法によって得たpCSF1−2(4.5kb)3μ
gを60μlY−100緩衝液に溶かし、制限酵素ApaI
(ベーリンガー・マンハイム社製)と制限酵素BamH
Iそれぞれ8単位ずつを加え、37℃で3時間切断反応を
行った。この反応液からLGT法によりhG−CSF遺
伝子の大部分を含む約1.5kbのDNA断片(ApaI−
BamHI断片)約0.4μgを得た。
RI断片(2.5kb)0.2μgとEcoRI−DraI断片
(1.0kb) 0.2μgをT4リガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液にT4DNAリガーゼ6単位を加え、4
℃,18時間結合反応を行った。得られた組換え体プラス
ミドの混合物を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、
Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養菌体より
プラスミドDNAを回収した。得られたプラスミドの構
造は、HindIII、PstIで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動により確認した。このプラスミドをpCfT
B20と呼ぶ。 実施例3. hG−CSFのN末端アミノ酸を置換したポリペプチド
をコードするプラスミドpCfTL23,pCfTL38,
pCfTL35,pCfTL41の造成(図3参照):参考
例1の方法によって得たpCSF1−2(4.5kb)3μ
gを60μlY−100緩衝液に溶かし、制限酵素ApaI
(ベーリンガー・マンハイム社製)と制限酵素BamH
Iそれぞれ8単位ずつを加え、37℃で3時間切断反応を
行った。この反応液からLGT法によりhG−CSF遺
伝子の大部分を含む約1.5kbのDNA断片(ApaI−
BamHI断片)約0.4μgを得た。
【0052】一方、pGEL1〔関根ら:プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 4306 (198
5) 〕(E. coli IGEL1 FERM BP−629の培養物から常法
により採取)(3.4kb) 2μgをY−100緩衝液40μlに
溶かし、制限酵素HindIII,BamHIおよびPs
tIそれぞれ4単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を
行った。この反応液からLGT法により、リポプロテイ
ン由来ターミネーターを含む約1.7kbのDNA断片(P
stI−BamHI断片)約0.5μgを得た。
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 4306 (198
5) 〕(E. coli IGEL1 FERM BP−629の培養物から常法
により採取)(3.4kb) 2μgをY−100緩衝液40μlに
溶かし、制限酵素HindIII,BamHIおよびPs
tIそれぞれ4単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を
行った。この反応液からLGT法により、リポプロテイ
ン由来ターミネーターを含む約1.7kbのDNA断片(P
stI−BamHI断片)約0.5μgを得た。
【0053】別に、特開昭58−110600号公報記載の方法
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液60μlに
溶かし、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)と制限酵
素PstIをそれぞれ6単位ずつ加え37℃で3時間切断
反応を行った。この反応液からLGT法によりトリプト
ファンプロモーター(Ptrp)を含む約1.1kbのDN
A断片(BanIII−PstI断片)約0.5μgを得た。
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液60μlに
溶かし、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)と制限酵
素PstIをそれぞれ6単位ずつ加え37℃で3時間切断
反応を行った。この反応液からLGT法によりトリプト
ファンプロモーター(Ptrp)を含む約1.1kbのDN
A断片(BanIII−PstI断片)約0.5μgを得た。
【0054】一方、成熟hG−CSFのN末端のアミノ
酸であるThrをSer,Cys,ArgまたはGly
のうちのいずれかに置換し、発現に必要な開始コドン
(ATG)を付与する必要があること、またPtrpの
下流のSD配列とATGとの距離は、6〜18bpの間の適
当な長さにする必要があることなどの理由から、下記の
DNAリンカーを合成した。
酸であるThrをSer,Cys,ArgまたはGly
のうちのいずれかに置換し、発現に必要な開始コドン
(ATG)を付与する必要があること、またPtrpの
下流のSD配列とATGとの距離は、6〜18bpの間の適
当な長さにする必要があることなどの理由から、下記の
DNAリンカーを合成した。
【0055】
【化3】
【0056】まず、一本鎖DNA、26−merと20−merを
通常のトリエステル法により合成した。26−merおよび2
0−merの各々20ピコモルを40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社
製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たpCSF1−2由来のApaI−B
amHI断片(約1.5kb)0.3μgとpGEL1由来の
PstI−BamHI断片(約1.7kb)0.2μgおよび発
現ベクターpKYP10のBanIII−PstI断片(約
1.1kb)0.2μgを全量30μlのT4リガーゼ緩衝液に溶
かし、この混合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル
加えた。この混合液にさらに6単位のT4DNAリガー
ゼを加えて4℃,18時間結合反応を行った。
通常のトリエステル法により合成した。26−merおよび2
0−merの各々20ピコモルを40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社
製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たpCSF1−2由来のApaI−B
amHI断片(約1.5kb)0.3μgとpGEL1由来の
PstI−BamHI断片(約1.7kb)0.2μgおよび発
現ベクターpKYP10のBanIII−PstI断片(約
1.1kb)0.2μgを全量30μlのT4リガーゼ緩衝液に溶
かし、この混合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル
加えた。この混合液にさらに6単位のT4DNAリガー
ゼを加えて4℃,18時間結合反応を行った。
【0057】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌C600SF8株(FERM BP−1070) 〔カメロン
(Cameron)ら:プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci.), USA 72, 3416 (1975) 〕を形質転換し、A
pr のコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
DNAを公知の方法に従って分離・精製した。該プラス
ミドDNAの構造はPstI,EcoRI,BanIII
で切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認
した。これらのプラスミドを図3に示したとおりpCf
TL23,pCfTL38,pCfTL35, pCfTL41と
よぶ。上記プラスミド中のhG−CSF誘導体遺伝子の
N末端付近の配列はそれぞれ、
いて大腸菌C600SF8株(FERM BP−1070) 〔カメロン
(Cameron)ら:プロシーディング・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci.), USA 72, 3416 (1975) 〕を形質転換し、A
pr のコロニーを得た。この形質転換株よりプラスミド
DNAを公知の方法に従って分離・精製した。該プラス
ミドDNAの構造はPstI,EcoRI,BanIII
で切断後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認
した。これらのプラスミドを図3に示したとおりpCf
TL23,pCfTL38,pCfTL35, pCfTL41と
よぶ。上記プラスミド中のhG−CSF誘導体遺伝子の
N末端付近の配列はそれぞれ、
【0058】
【化4】 であることをM13ファージを用いたデイデオキシ・シー
クエンス法により確認した。
クエンス法により確認した。
【0059】pCfTL23によりコードされるhG−C
SF誘導体(本誘導体をhG−CSF〔Gly1 〕とよ
ぶ)は、成熟hG−CSFのN末端のThrがGlyに
置換していることが確認された。同様に、pCfTL38
によりコードされるhG−CSF誘導体(本誘導体をh
G−CSF〔Ser1 〕とよぶ)はSerに、pCfT
L35によりコードされるhG−CSF誘導体(本誘導体
をhG−CSF〔Cys1 〕とよぶ)はCysに、pC
fTL41 によりコードされるhG−CSF誘導体(本
誘導体をhG−CSF〔Arg1 〕とよぶ)はArgに
それぞれN末端のアミノ酸が置換していることが確認さ
れた。
SF誘導体(本誘導体をhG−CSF〔Gly1 〕とよ
ぶ)は、成熟hG−CSFのN末端のThrがGlyに
置換していることが確認された。同様に、pCfTL38
によりコードされるhG−CSF誘導体(本誘導体をh
G−CSF〔Ser1 〕とよぶ)はSerに、pCfT
L35によりコードされるhG−CSF誘導体(本誘導体
をhG−CSF〔Cys1 〕とよぶ)はCysに、pC
fTL41 によりコードされるhG−CSF誘導体(本
誘導体をhG−CSF〔Arg1 〕とよぶ)はArgに
それぞれN末端のアミノ酸が置換していることが確認さ
れた。
【0060】実施例4. hG−CSFのN末端および3番目のアミノ酸を置換し
たポリペプチドをコードするプラスミドpCfTM14,
pCfTM17およびpCfTM113 の造成(図4参
照):参考例1の方法によって得たpCSF1−2(4.
5kb)3μgをY−100緩衝液60μlに溶かし、ApaI
とBamHIをそれぞれ8単位ずつ加え、37℃で3時間
切断反応を行った。この反応液からLGT法によりhG
−CSF遺伝子の大部分を含む約1.5kbのDNA断片
(ApaI−BamHI断片)約0.4μgを得た。
たポリペプチドをコードするプラスミドpCfTM14,
pCfTM17およびpCfTM113 の造成(図4参
照):参考例1の方法によって得たpCSF1−2(4.
5kb)3μgをY−100緩衝液60μlに溶かし、ApaI
とBamHIをそれぞれ8単位ずつ加え、37℃で3時間
切断反応を行った。この反応液からLGT法によりhG
−CSF遺伝子の大部分を含む約1.5kbのDNA断片
(ApaI−BamHI断片)約0.4μgを得た。
【0061】一方、pGEL1(3.4kb)2μgをY−
100緩衝液40μlに溶かし、制限酵素HindIII,Ba
mHIおよびPstIそれぞれ4単位ずつを加え37℃で
3時間切断反応を行った。この反応液からLGT法によ
り、リポプロテイン由来ターミネーターを含む約1.7kb
のDNA断片(PstI−BamHI断片)約0.5μgを
得た。
100緩衝液40μlに溶かし、制限酵素HindIII,Ba
mHIおよびPstIそれぞれ4単位ずつを加え37℃で
3時間切断反応を行った。この反応液からLGT法によ
り、リポプロテイン由来ターミネーターを含む約1.7kb
のDNA断片(PstI−BamHI断片)約0.5μgを
得た。
【0062】別に、特開昭58-110600号公報記載の方法
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液60μlに
溶かし、制限酵素BanIIIとPstIそれぞれ6単位ず
つを加え37℃で3時間切断反応を行った。この反応液か
らLGT法によりPtrpを含む約1.1kbのDNA断片
(BanIII−PstI断片)約0.5μgを得た。一方、
成熟hG−CSFのN末端のアミノ酸であるThrをS
erに、3番目のアミノ酸であるLeuをGly,Se
r,CysまたはArgのうちいずれかに置換し、発現
に必要な開始コドン(ATG)を付与する必要があるこ
と、またPtrpの下流のSD配列とATGとの距離
は、6〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のDNAリンカーを合成した。
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液60μlに
溶かし、制限酵素BanIIIとPstIそれぞれ6単位ず
つを加え37℃で3時間切断反応を行った。この反応液か
らLGT法によりPtrpを含む約1.1kbのDNA断片
(BanIII−PstI断片)約0.5μgを得た。一方、
成熟hG−CSFのN末端のアミノ酸であるThrをS
erに、3番目のアミノ酸であるLeuをGly,Se
r,CysまたはArgのうちいずれかに置換し、発現
に必要な開始コドン(ATG)を付与する必要があるこ
と、またPtrpの下流のSD配列とATGとの距離
は、6〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のDNAリンカーを合成した。
【0063】
【化5】
【0064】まず、一本鎖DNA、26−mer と20−mer
を通常のトリエステル法により合成した。26− merおよ
び20−mer の各々20ピコモルを40μlのT4キナーゼ緩
衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ6単位を
加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次に上記
で得たpCSF1−2由来のApaI−BamHI断片
(約1.5kb)0.3μgとpGEL1由来のPstI−B
amHI断片(約1.7kb) 0.2μgおよび発現ベクター
pKYP10のBanIII−PstI断片(約1.1kb)0.
2μgを30μlのT4リガーゼ緩衝液に溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル加えた。この
混合液にさらに6単位のT4DNAリガーゼを加えて4
℃,18時間結合反応を行った。
を通常のトリエステル法により合成した。26− merおよ
び20−mer の各々20ピコモルを40μlのT4キナーゼ緩
衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ6単位を
加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次に上記
で得たpCSF1−2由来のApaI−BamHI断片
(約1.5kb)0.3μgとpGEL1由来のPstI−B
amHI断片(約1.7kb) 0.2μgおよび発現ベクター
pKYP10のBanIII−PstI断片(約1.1kb)0.
2μgを30μlのT4リガーゼ緩衝液に溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル加えた。この
混合液にさらに6単位のT4DNAリガーゼを加えて4
℃,18時間結合反応を行った。
【0065】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌C600SF8(FERM BP-1070) 株をコーエン
らの方法により形質転換し、Apr のコロニーを得た。
この形質転換株よりプラスミドDNAを公知の方法に従
って分離・精製した。該プラスミドDNAの構造はPst
I,EcoRI,BanIIIで切断後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により確認した。これらのプラスミド
を図4に示したとおり、pCfTM14,pCfTM17,
pCfTM113とよぶ。上記プラスミド中のhG−CS
F誘導体遺伝子のN末端付近の配列はそれぞれ、
いて大腸菌C600SF8(FERM BP-1070) 株をコーエン
らの方法により形質転換し、Apr のコロニーを得た。
この形質転換株よりプラスミドDNAを公知の方法に従
って分離・精製した。該プラスミドDNAの構造はPst
I,EcoRI,BanIIIで切断後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により確認した。これらのプラスミド
を図4に示したとおり、pCfTM14,pCfTM17,
pCfTM113とよぶ。上記プラスミド中のhG−CS
F誘導体遺伝子のN末端付近の配列はそれぞれ、
【0066】
【化6】
【0067】であることをM13ファージを用いたデイデ
オキシ・シークエンス法により確認した。pCfTM14
によりコードされる誘導体(本誘導体をhG−CSF
〔Ser1,Cys3〕とよぶ)は、成熟hG−CSFの
N末端のThrがSerに、3番目のアミノ酸であるL
euがCysに置換していることが確認された。同様に
pCfTM17によりコードされる誘導体(本誘導体をh
G−CSF〔Ser1,Arg 3 〕とよぶ) は、N末端の
ThrがSerに、3番目のLeuがArgに、pCf
TM113によりコードされる誘導体(本誘導体をhG−
CSF〔Ser1,Ser3 〕とよぶ)は、N末端のTh
rがSerに、3番目のLeuがSerに置換している
ことが確認された。実施例5. (1) 組換え体プラスミドpCfWD1の造成(図5参
照):実施例1の方法で得たpCfTA1 5μgを50
μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素StuI10単
位と、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)10単位を加
えて、37℃で1時間消化反応を行った。反応液からLG
T法によりhG−CSFcDNAを含む約1.3kbのDN
A断片(BanIII−StuI断片)約0.5μgを得た。
別に、参考例2の方法で製造したpKYP26 3μgを5
0μlのY−100緩衝液に溶かし、BamHI6単位を加
えて、30℃で1時間消化反応を行った。
オキシ・シークエンス法により確認した。pCfTM14
によりコードされる誘導体(本誘導体をhG−CSF
〔Ser1,Cys3〕とよぶ)は、成熟hG−CSFの
N末端のThrがSerに、3番目のアミノ酸であるL
euがCysに置換していることが確認された。同様に
pCfTM17によりコードされる誘導体(本誘導体をh
G−CSF〔Ser1,Arg 3 〕とよぶ) は、N末端の
ThrがSerに、3番目のLeuがArgに、pCf
TM113によりコードされる誘導体(本誘導体をhG−
CSF〔Ser1,Ser3 〕とよぶ)は、N末端のTh
rがSerに、3番目のLeuがSerに置換している
ことが確認された。実施例5. (1) 組換え体プラスミドpCfWD1の造成(図5参
照):実施例1の方法で得たpCfTA1 5μgを50
μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素StuI10単
位と、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)10単位を加
えて、37℃で1時間消化反応を行った。反応液からLG
T法によりhG−CSFcDNAを含む約1.3kbのDN
A断片(BanIII−StuI断片)約0.5μgを得た。
別に、参考例2の方法で製造したpKYP26 3μgを5
0μlのY−100緩衝液に溶かし、BamHI6単位を加
えて、30℃で1時間消化反応を行った。
【0068】これに10mMTris−HCl(pH7.5),1m
M EDTAで飽和したフェノールを等量加え、激しく攪
拌した後、低速遠心分離法(3300rpm,10分間,以下同条
件)により水層を集めた。等量のクロロホルムを加え、
激しく攪拌した後、低速遠心分離法により水層を集め
た。1/10容の3M酢酸ナトリウムを加え、2.5倍容の
エタノールを加え、−20℃,1時間静置した。冷却遠心
分離法(4℃,11000rpm, 10分間)で沈殿を集めた。こ
の沈殿を30μlのクレノー緩衝液に溶かし、dATP,
dTTP,dCTP,dGTPをそれぞれ100μMにな
るように加え、DNAポリメラーゼI・クレノー断片を
2単位加え17℃で15分間反応を行った。68℃で10分間処
理してDNAポリメラーゼI・クレノー断片を失活させ
た後、NaClを100mMとなるように加え、制限酵素P
stIを5単位加え37℃で1時間消化反応を行った。反
応液からLGT法によりlppターミネーターを含む約
1.8kbのDNA断片〔BamHI(Blunt)−PstI断
片〕約0.6μgを得た。これとは別に、pGEL1 4μ
gを40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BanI
II(東洋紡績社製)10単位とPstI10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行い、反応液から、LGT法でトリ
プトファン系プロモーターを含む約1kbのDNA断片
(BanIII−PstI断片)を0.4μg得た。
M EDTAで飽和したフェノールを等量加え、激しく攪
拌した後、低速遠心分離法(3300rpm,10分間,以下同条
件)により水層を集めた。等量のクロロホルムを加え、
激しく攪拌した後、低速遠心分離法により水層を集め
た。1/10容の3M酢酸ナトリウムを加え、2.5倍容の
エタノールを加え、−20℃,1時間静置した。冷却遠心
分離法(4℃,11000rpm, 10分間)で沈殿を集めた。こ
の沈殿を30μlのクレノー緩衝液に溶かし、dATP,
dTTP,dCTP,dGTPをそれぞれ100μMにな
るように加え、DNAポリメラーゼI・クレノー断片を
2単位加え17℃で15分間反応を行った。68℃で10分間処
理してDNAポリメラーゼI・クレノー断片を失活させ
た後、NaClを100mMとなるように加え、制限酵素P
stIを5単位加え37℃で1時間消化反応を行った。反
応液からLGT法によりlppターミネーターを含む約
1.8kbのDNA断片〔BamHI(Blunt)−PstI断
片〕約0.6μgを得た。これとは別に、pGEL1 4μ
gを40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BanI
II(東洋紡績社製)10単位とPstI10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行い、反応液から、LGT法でトリ
プトファン系プロモーターを含む約1kbのDNA断片
(BanIII−PstI断片)を0.4μg得た。
【0069】上記で得たpCfTA1由来のBanIII
−StuI断片(約1.3kb)約0.2μg,pKYP26由来
のBamHI(Blunt)−PstI断片(約1.8kb)約0.1
μg,pGEL1由来のBanIII−PstI断片(約
1kb)約0.1μgを30μlのT4DNAリガーゼ緩衝液
に溶かし、4単位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,
18時間結合反応を行った。
−StuI断片(約1.3kb)約0.2μg,pKYP26由来
のBamHI(Blunt)−PstI断片(約1.8kb)約0.1
μg,pGEL1由来のBanIII−PstI断片(約
1kb)約0.1μgを30μlのT4DNAリガーゼ緩衝液
に溶かし、4単位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,
18時間結合反応を行った。
【0070】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図5に示したpCfWD1を得た。 (2) pCfT95K19の造成(図6参照):実施例3の方
法で得たpCfTL38 5μgを50μlのY−100緩衝液
に溶かし、制限酵素HindIIIとBglIIを10単位ず
つ加え、37℃で1時間消化反応を行った。反応液からL
GT法によりトリプトファン・プロモーターを含む約2.
6kbのDNA断片(HindIII−BglII断片)約0.7μ
gを得た。別にpCfTL38,100μgを1.5mlのY−10
0緩衝液に溶かし、制限酵素BamHIとHindIIIを
80単位ずつ加え、37℃で6時間消化反応を行った。反応
液からLGT法によりhG−CSFcDNAを含むDN
A断片を回収し、ELUTIPTM−d(Schleicher & S
chuell社製)で精製した。このDNA断片を10mM Tr
is−HCl(pH7.5),7mM MgCl2, 150mMNaC
l,6mM 2−メルカプトエタノール(以下、“Y−150
緩衝液”と略記する)を含む全量90μlの溶液に溶か
し、制限酵素DpnI(Boehringer Mannheim社製)3
単位を加え37℃で15分間消化反応を行った。反応液から
ポリアクリルアミド電気泳動法で、hG−CSFcDN
Aを含む約300bpのDNA断片(HindIII−DpnI
断片)約1μgを得た。
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図5に示したpCfWD1を得た。 (2) pCfT95K19の造成(図6参照):実施例3の方
法で得たpCfTL38 5μgを50μlのY−100緩衝液
に溶かし、制限酵素HindIIIとBglIIを10単位ず
つ加え、37℃で1時間消化反応を行った。反応液からL
GT法によりトリプトファン・プロモーターを含む約2.
6kbのDNA断片(HindIII−BglII断片)約0.7μ
gを得た。別にpCfTL38,100μgを1.5mlのY−10
0緩衝液に溶かし、制限酵素BamHIとHindIIIを
80単位ずつ加え、37℃で6時間消化反応を行った。反応
液からLGT法によりhG−CSFcDNAを含むDN
A断片を回収し、ELUTIPTM−d(Schleicher & S
chuell社製)で精製した。このDNA断片を10mM Tr
is−HCl(pH7.5),7mM MgCl2, 150mMNaC
l,6mM 2−メルカプトエタノール(以下、“Y−150
緩衝液”と略記する)を含む全量90μlの溶液に溶か
し、制限酵素DpnI(Boehringer Mannheim社製)3
単位を加え37℃で15分間消化反応を行った。反応液から
ポリアクリルアミド電気泳動法で、hG−CSFcDN
Aを含む約300bpのDNA断片(HindIII−DpnI
断片)約1μgを得た。
【0071】別に実施例2の方法で得たpCfTB20 1
0μgを100μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素A
vaI10単位を加え、37℃で1時間消化反応を行った。
フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で
DNAを回収し、30μlのクレノー緩衝液に溶かし、D
NAポリメラーゼI・クレノー断片を2単位加え、17℃
で30分間反応を行った。68℃で10分間処理しDNAポリ
メラーゼI・クレノー断片を失活させ、NaClを100m
Mになるように加え制限酵素BglII10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行った。反応液からLGT法でlp
pターミネーター部分を含む約480bpのDNA断片〔A
vaI(Blunt) −BglII〕約0.3μgを得た。
0μgを100μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素A
vaI10単位を加え、37℃で1時間消化反応を行った。
フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿で
DNAを回収し、30μlのクレノー緩衝液に溶かし、D
NAポリメラーゼI・クレノー断片を2単位加え、17℃
で30分間反応を行った。68℃で10分間処理しDNAポリ
メラーゼI・クレノー断片を失活させ、NaClを100m
Mになるように加え制限酵素BglII10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行った。反応液からLGT法でlp
pターミネーター部分を含む約480bpのDNA断片〔A
vaI(Blunt) −BglII〕約0.3μgを得た。
【0072】上記で得た、pCfTL38由来のHind
III −BglII断片(約2.6kb)約0.1μg, pCfT
L38由来のHindIII−DpnI断片(約300bp)約0.
2μg,pCfTB20由来のAvaI(Blunt)−BglII
断片(約480bp)約0.15μgを30μlのT4DNAリガー
ゼ緩衝液に溶かし、4単位のT4DNAリガーゼを加
え、4℃で18時間結合反応を行った。該反応液を用いて
大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニーを
得、このコロニーより前記バーンボイムらの方法により
プラスミドDNAを回収し、図6に示したpCfT95K
19を得た。 (3) pCfAA1の造成(図6参照):前項で得たpC
fT95K19 5μgを50μlのY−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)7単位とBgl
I(日本ジーン社製)2単位を加え、37℃で1時間消化
反応を行った。反応液からLGT法によりトリプトファ
ン・プロモーター部分を含む約1kbのDNA断片(Ba
nIII−BglI断片)約00.6μgと、lppターミネ
ーター部分を含む約1.8kbのDNA断片(BglI−B
glI断片)約1μgを得た。
III −BglII断片(約2.6kb)約0.1μg, pCfT
L38由来のHindIII−DpnI断片(約300bp)約0.
2μg,pCfTB20由来のAvaI(Blunt)−BglII
断片(約480bp)約0.15μgを30μlのT4DNAリガー
ゼ緩衝液に溶かし、4単位のT4DNAリガーゼを加
え、4℃で18時間結合反応を行った。該反応液を用いて
大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニーを
得、このコロニーより前記バーンボイムらの方法により
プラスミドDNAを回収し、図6に示したpCfT95K
19を得た。 (3) pCfAA1の造成(図6参照):前項で得たpC
fT95K19 5μgを50μlのY−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素BanIII(東洋紡績社製)7単位とBgl
I(日本ジーン社製)2単位を加え、37℃で1時間消化
反応を行った。反応液からLGT法によりトリプトファ
ン・プロモーター部分を含む約1kbのDNA断片(Ba
nIII−BglI断片)約00.6μgと、lppターミネ
ーター部分を含む約1.8kbのDNA断片(BglI−B
glI断片)約1μgを得た。
【0073】これとは別に15μgのpCfT95K19を15
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BglI(日
本ジーン社製)6単位とSau3A 10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行った。反応液からポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によりhG−CSFcDNA部分を
含む約350 bpのDNA断片(BglI−Sau3A断
片)約0.3μgを得た。
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BglI(日
本ジーン社製)6単位とSau3A 10単位を加え37℃
で1時間消化反応を行った。反応液からポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によりhG−CSFcDNA部分を
含む約350 bpのDNA断片(BglI−Sau3A断
片)約0.3μgを得た。
【0074】これとは別に、下記のDNAリンカーを合
成した。
成した。
【0075】
【化7】
【0076】まず、一本鎖DNA、39−mer と41−mer
を通常のトリエステル法により合成した。39−mer およ
び41−mer の各々20ピコモルを全量40μlのT4キナー
ゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝
酒造社製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応
を行った。次に上記で得たpCfT95K19由来のBan
III−BglI断片(約1kb)0.1μg,BglI−Bg
lI断片(約1.8kb)0.05μg,BglI−Sau3A
断片(約350bp)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25
μlに溶かし、この混合液に上記DNAリンカーを約2
ピコモル加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加
え、4℃で18時間結合反応を行った。
を通常のトリエステル法により合成した。39−mer およ
び41−mer の各々20ピコモルを全量40μlのT4キナー
ゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝
酒造社製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応
を行った。次に上記で得たpCfT95K19由来のBan
III−BglI断片(約1kb)0.1μg,BglI−Bg
lI断片(約1.8kb)0.05μg,BglI−Sau3A
断片(約350bp)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25
μlに溶かし、この混合液に上記DNAリンカーを約2
ピコモル加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加
え、4℃で18時間結合反応を行った。
【0077】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図6に示したpCfAA1を得た。前記デイデオキ
シ・シークエンス法でpCfAA1のDNAリンカー部
分の塩基配列を決定したところ、4番目のアミノ酸であ
るLeuをコードするコドンの3番目の塩基はAである
ことが判明した。このpCfAA1ではhG−CSFの
10番目のProから23番目のLysまでの14アミノ酸を
コードするDNA部分が欠失している。また、hG−C
SFの6番目のAlaがAsnに変化する変異が導入さ
れており、新たにXhoIサイトが生じる。 (4) pCfAB5の造成(図6参照):前項で得たpC
fAA1 3μgを30μlのY−100緩衝液に溶かし、
制限酵素XhoIを5単位加え、37℃で1時間消化反応
を行った。アガロースゲル電気泳動法でXhoI切断が
完全に行われていることを確認したのち、制限酵素Bg
lI(日本ジーン社製)を1単位加え、37℃で25分間部
分消化反応を行った。反応液からLGT法によりトリプ
トファン・プロモーター部分およびlppターミネータ
ー部分を含む約3kbのDNA断片(XhoI−BglI
断片)約1μgを得た。これとは別に、下記のDNAリ
ンカーを合成した。
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図6に示したpCfAA1を得た。前記デイデオキ
シ・シークエンス法でpCfAA1のDNAリンカー部
分の塩基配列を決定したところ、4番目のアミノ酸であ
るLeuをコードするコドンの3番目の塩基はAである
ことが判明した。このpCfAA1ではhG−CSFの
10番目のProから23番目のLysまでの14アミノ酸を
コードするDNA部分が欠失している。また、hG−C
SFの6番目のAlaがAsnに変化する変異が導入さ
れており、新たにXhoIサイトが生じる。 (4) pCfAB5の造成(図6参照):前項で得たpC
fAA1 3μgを30μlのY−100緩衝液に溶かし、
制限酵素XhoIを5単位加え、37℃で1時間消化反応
を行った。アガロースゲル電気泳動法でXhoI切断が
完全に行われていることを確認したのち、制限酵素Bg
lI(日本ジーン社製)を1単位加え、37℃で25分間部
分消化反応を行った。反応液からLGT法によりトリプ
トファン・プロモーター部分およびlppターミネータ
ー部分を含む約3kbのDNA断片(XhoI−BglI
断片)約1μgを得た。これとは別に、下記のDNAリ
ンカーを合成した。
【0078】
【化8】
【0079】このリンカーDNAはpCfAA1のhG
−CSFcDNAで欠失していたhG−CSFの10番目
のProから23番目のLysまでの14アミノ酸をコード
するDNA部分を含んでいる。まず、一本鎖DNA、27
−mer と25−mer (2種)と23−mer を通常のトリエス
テル法により合成した。たがいに相補的な27−merと25
−mer および25−merと23−mer のDNA20ピコモルず
つを各々全量40μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T
4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)6単位を加え
て、37℃で60分間リン酸化反応を行った。
−CSFcDNAで欠失していたhG−CSFの10番目
のProから23番目のLysまでの14アミノ酸をコード
するDNA部分を含んでいる。まず、一本鎖DNA、27
−mer と25−mer (2種)と23−mer を通常のトリエス
テル法により合成した。たがいに相補的な27−merと25
−mer および25−merと23−mer のDNA20ピコモルず
つを各々全量40μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T
4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社製)6単位を加え
て、37℃で60分間リン酸化反応を行った。
【0080】次に上記で得たpCfAA1由来のXho
I−BglI断片(約3kb)0.1μg、前項で得たpC
fT95K19由来のBglI−Sau3A断片(約350b
p)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液30μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを2ピコモルずつ
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
I−BglI断片(約3kb)0.1μg、前項で得たpC
fT95K19由来のBglI−Sau3A断片(約350b
p)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液30μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを2ピコモルずつ
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
【0081】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図6に示したpCfAB5とpCfAB14を得た。
前記デイデオキシ・シークエンス法でpCfAB5とp
CfAB14のDNAリンカー部分の塩基配列を決定した
ところ、17番目のアミノ酸をコードするコドンの1番目
の塩基はpCfAB5ではAであり、pCfAB14では
Tであって各々Serのコドン(AGC)およびCys
のコドン(TGC) であり成熟型hG−CSFの17番目
のCysが、pCfAB5ではSerに置換し、pCf
AB14では置換していないことが判明した。
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図6に示したpCfAB5とpCfAB14を得た。
前記デイデオキシ・シークエンス法でpCfAB5とp
CfAB14のDNAリンカー部分の塩基配列を決定した
ところ、17番目のアミノ酸をコードするコドンの1番目
の塩基はpCfAB5ではAであり、pCfAB14では
Tであって各々Serのコドン(AGC)およびCys
のコドン(TGC) であり成熟型hG−CSFの17番目
のCysが、pCfAB5ではSerに置換し、pCf
AB14では置換していないことが判明した。
【0082】実施例6. (1) pCfBA8およびpCfBA32の造成(図7参
照):前項で得たpCfAB5、3μgを40μlのY−
100緩衝液に溶かし、制限酵素AvaI5単位とBglI
I5単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液
からLGT法により、トリプトファンプロモーター部分
とlppターミネーター部分を含む約2.8kbのDNA断
片(AvaI−BglII断片)を約1μg得た。
照):前項で得たpCfAB5、3μgを40μlのY−
100緩衝液に溶かし、制限酵素AvaI5単位とBglI
I5単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液
からLGT法により、トリプトファンプロモーター部分
とlppターミネーター部分を含む約2.8kbのDNA断
片(AvaI−BglII断片)を約1μg得た。
【0083】これとは別に、第1項で得たpCfWD1
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
glIIを5単位加え、37℃で1時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でBglII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素AvaIを3単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らLGT法により、hG−CSFcDNAの大部分を含
む約1.3kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を
0.4μg得た。
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
glIIを5単位加え、37℃で1時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でBglII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素AvaIを3単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らLGT法により、hG−CSFcDNAの大部分を含
む約1.3kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を
0.4μg得た。
【0084】次に上記で得たpCfAB5由来のAva
I−BglII断片(約2.8kb)の0.1μgとpCfWD1
由来のBglII−AvaI断片(約1.3kb)0.3μgをT
4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4
DNAリガーゼを加え、4℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap
r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドDNAを回収し、図7に示し
たpCfBA8を得た。
I−BglII断片(約2.8kb)の0.1μgとpCfWD1
由来のBglII−AvaI断片(約1.3kb)0.3μgをT
4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4
DNAリガーゼを加え、4℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap
r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドDNAを回収し、図7に示し
たpCfBA8を得た。
【0085】pCfBA8のコードするhG−CSF誘
導体のアミノ酸配列は、成熟型hG−CSFの6番目の
AlaがAsnに、17番目のCysがSerに置換して
いる。以後、本誘導体をhG−CSF〔NA8〕と呼
ぶ。他方前項で得たpCfAB14、3μgを40μlのY
−100 緩衝液に溶かし、制限酵素AvaI5単位とBg
lII5単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応
液からLGT法により、トリプトファンプロモーター部
分とlppターミネーター部分を含む約2.8kbのDNA
断片(AvaI−BglII断片)を約1μg得た。
導体のアミノ酸配列は、成熟型hG−CSFの6番目の
AlaがAsnに、17番目のCysがSerに置換して
いる。以後、本誘導体をhG−CSF〔NA8〕と呼
ぶ。他方前項で得たpCfAB14、3μgを40μlのY
−100 緩衝液に溶かし、制限酵素AvaI5単位とBg
lII5単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応
液からLGT法により、トリプトファンプロモーター部
分とlppターミネーター部分を含む約2.8kbのDNA
断片(AvaI−BglII断片)を約1μg得た。
【0086】これとは別に、第1項で得たpCfWD1
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
glIIを5単位加え、37℃で1時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でBglII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素AvaIを3単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らLGT法により、hG−CSFcDNAの大部分を含
む約1.3kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を
0.4μg得た。
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
glIIを5単位加え、37℃で1時間消化反応を行った。
アガロースゲル電気泳動法でBglII切断が完全に行わ
れていることを確認した後に、制限酵素AvaIを3単
位加え、37℃で20分間部分切断反応を行った。反応液か
らLGT法により、hG−CSFcDNAの大部分を含
む約1.3kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を
0.4μg得た。
【0087】次に上記で得たpCfAB14由来のAva
I−BglII断片(約2.8kb)の0.1μgとpCfWD1
由来のBglII−AvaI断片(約1.3kb)0.3μgをT
4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4
DNAリガーゼを加え、4℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap
r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドDNAを回収し、図7に示し
たpCfBA32を得た。
I−BglII断片(約2.8kb)の0.1μgとpCfWD1
由来のBglII−AvaI断片(約1.3kb)0.3μgをT
4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4
DNAリガーゼを加え、4℃18時間結合反応を行った。
該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換し、Ap
r のコロニーを得、このコロニーより前記バーンボイム
らの方法によりプラスミドDNAを回収し、図7に示し
たpCfBA32を得た。
【0088】pCfBA32のコードするhG−CSF誘
導体のアミノ酸配列は、成熟型hG−CSFの6番目の
AlaがAsnに置換している。 (2) pCfBB101の造成:前項で得たpCfBA8
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
anIII(東洋紡績社製)10単位、BglII8単位、X
hoI8単位を加え、37℃,1時間消化反応を行った。
反応液からLGT法によりhG−CSFcDNAを含む
約1.4kbのDNA断片(XhoI−BglII断片)約0.6
μgとトリプトファンプロモーター部分を含む約2.7kb
のDNA断片(BanIII−BglII断片)約0.8μgを
得た。これとは別に、下記のDNAリンカーを合成し
た。
導体のアミノ酸配列は、成熟型hG−CSFの6番目の
AlaがAsnに置換している。 (2) pCfBB101の造成:前項で得たpCfBA8
6μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素B
anIII(東洋紡績社製)10単位、BglII8単位、X
hoI8単位を加え、37℃,1時間消化反応を行った。
反応液からLGT法によりhG−CSFcDNAを含む
約1.4kbのDNA断片(XhoI−BglII断片)約0.6
μgとトリプトファンプロモーター部分を含む約2.7kb
のDNA断片(BanIII−BglII断片)約0.8μgを
得た。これとは別に、下記のDNAリンカーを合成し
た。
【0089】
【化9】
【0090】まず一本鎖DNA、31−merと33−mer を
通常のトリエステル法により合成した。31−merおよび3
3−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒
造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たpCfBA8由来のBanIII−B
glII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくpCfBA
8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)0.1μ
lをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加えた。さら
にT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18時間結合
反応を行った。
通常のトリエステル法により合成した。31−merおよび3
3−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒
造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に上記で得たpCfBA8由来のBanIII−B
glII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくpCfBA
8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)0.1μ
lをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加えた。さら
にT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18時間結合
反応を行った。
【0091】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、図7に示したpCfBB101を得た。pCf
BB101のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸配
列は、成熟型hG−CSFの1番目のThrがAla
に、3番目のLeuがThrに、4番目のGlyがAr
gに、5番目のProがSerに、17番目のCysがS
erに置換されている。以後、本誘導体をhG−CSF
〔NB101〕と呼ぶ。 (3) pCfBC42B1、pCfBC45、pCfBC5
2、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、pC
fBC93、pCfBC95、pCfBC97の造成(図8参
照):まず、下記のDNAリンカーを合成した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、図7に示したpCfBB101を得た。pCf
BB101のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸配
列は、成熟型hG−CSFの1番目のThrがAla
に、3番目のLeuがThrに、4番目のGlyがAr
gに、5番目のProがSerに、17番目のCysがS
erに置換されている。以後、本誘導体をhG−CSF
〔NB101〕と呼ぶ。 (3) pCfBC42B1、pCfBC45、pCfBC5
2、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、pC
fBC93、pCfBC95、pCfBC97の造成(図8参
照):まず、下記のDNAリンカーを合成した。
【0092】
【化10】
【0093】この合成DNAリンカーは、3ケ所の塩基
がG,A,T,Cのうちのいずれかであり、1ケ所の塩
基がGかA(31−merの場合)、あるいはCかT(33−m
erの場合)のいずれかであり、合計128種類のDNAリン
カーの混合物として得られる。その結果、このDNAリ
ンカーのコードするhG−CSFのN末端のアミノ酸配
列としてはMetの次のアミノ酸としては16種類、Pr
oの次のアミノ酸としては8種類の可能性があり全体と
して128種類のアミノ酸配列が可能であるようにデザイ
ンされている。
がG,A,T,Cのうちのいずれかであり、1ケ所の塩
基がGかA(31−merの場合)、あるいはCかT(33−m
erの場合)のいずれかであり、合計128種類のDNAリン
カーの混合物として得られる。その結果、このDNAリ
ンカーのコードするhG−CSFのN末端のアミノ酸配
列としてはMetの次のアミノ酸としては16種類、Pr
oの次のアミノ酸としては8種類の可能性があり全体と
して128種類のアミノ酸配列が可能であるようにデザイ
ンされている。
【0094】まず一本鎖DNA、31−merと33−merを通
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社
製)30単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例6で得たpCfBA8由来のBanIII
−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μl、同じくpCf
BA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)
0.1μlをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、
この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加え
た。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18
時間結合反応を行った。
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造社
製)30単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例6で得たpCfBA8由来のBanIII
−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μl、同じくpCf
BA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)
0.1μlをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、
この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加え
た。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18
時間結合反応を行った。
【0095】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、pCfBC42B1、pCfBC45、pCfB
C52、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、p
CfBC93、pCfBC95、pCfBC97を得た。前記
デイデオキシ・シークエンス法でDNAリンカー部分の
塩基配列を決定したところ、hG−CSF誘導体のN末
端側の塩基配列は下記の通りであることが判明した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、pCfBC42B1、pCfBC45、pCfB
C52、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、p
CfBC93、pCfBC95、pCfBC97を得た。前記
デイデオキシ・シークエンス法でDNAリンカー部分の
塩基配列を決定したところ、hG−CSF誘導体のN末
端側の塩基配列は下記の通りであることが判明した。
【0096】
【化11】 これらのプラスミドがコードするhG−CSF誘導体
は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。
は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。
【0097】
【表3】
【0098】pCfBC42B1、pCfBC45、pCf
BC52、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、
pCfBC93、pCfBC95、pCfBC97にコードさ
れるhG−CSF誘導体を以後、それぞれhG−CSF
〔NC42B1〕、hG−CSF〔NC45〕、hG−CS
F〔NC52〕、hG−CSF〔NC59〕、hG−CSF
〔NC76〕、hG−CSF〔NC77〕、hG−CSF
〔NC93〕、hG−CSF〔NC95〕およびhG−CS
F〔NC97〕と呼ぶ。 (4) pCfBD28、pCfBD56、pCfBD82の造
成:まず、下記のDNAリンカーを合成した。
BC52、pCfBC59、pCfBC76、pCfBC77、
pCfBC93、pCfBC95、pCfBC97にコードさ
れるhG−CSF誘導体を以後、それぞれhG−CSF
〔NC42B1〕、hG−CSF〔NC45〕、hG−CS
F〔NC52〕、hG−CSF〔NC59〕、hG−CSF
〔NC76〕、hG−CSF〔NC77〕、hG−CSF
〔NC93〕、hG−CSF〔NC95〕およびhG−CS
F〔NC97〕と呼ぶ。 (4) pCfBD28、pCfBD56、pCfBD82の造
成:まず、下記のDNAリンカーを合成した。
【0099】
【化12】
【0100】このDNAリンカーは、4ケ所の塩基が
G,A,T, Cのうちのいずれかであり、合計256種類
のDNAリンカーの混合物として得られる。その結果、
このDNAリンカーのコードするhG−CSFのN末端
のアミノ酸配列としては4ヶ所に4種類のアミノ酸の可
能性があり、全体として256種類のアミノ酸配列が可能
であるようにデザインされている。
G,A,T, Cのうちのいずれかであり、合計256種類
のDNAリンカーの混合物として得られる。その結果、
このDNAリンカーのコードするhG−CSFのN末端
のアミノ酸配列としては4ヶ所に4種類のアミノ酸の可
能性があり、全体として256種類のアミノ酸配列が可能
であるようにデザインされている。
【0101】まず一本鎖DNA、31−merと33−merを通
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
にとかし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒
造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例6で得たpCfBA8由来のBanIII
−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくpCf
BA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)
0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、
この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加え
た。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18
時間結合反応を行った。
常のトリエステル法により合成した。31−merおよび33
−merの各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ緩衝液
にとかし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位(宝酒
造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行っ
た。次に実施例6で得たpCfBA8由来のBanIII
−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくpCf
BA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断片)
0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶かし、
この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加え
た。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で18
時間結合反応を行った。
【0102】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfBD28,pCfBD56, pCfBD82を得
た。前記デイデオキシ・シークエンス法でDNAリンカ
ー部分の塩基配列を決定したところ、hG−CSF誘導
体のN末端側の塩基配列は下記の通りであることが判明
した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfBD28,pCfBD56, pCfBD82を得
た。前記デイデオキシ・シークエンス法でDNAリンカ
ー部分の塩基配列を決定したところ、hG−CSF誘導
体のN末端側の塩基配列は下記の通りであることが判明
した。
【0103】
【化13】 これらのプラスミドがコードするhG−CSF誘導体
は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。
は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べて次のようにア
ミノ酸残基が置換されている。
【0104】
【表4】
【0105】pCfBD28,pCfBD56,pCfBD
82にコードされるhG−CSF誘導体を以後、それぞれ
hG−CSF〔ND28〕、hG−CSF〔ND56〕およ
びhG−CSF〔ND82〕と呼ぶ。pCfBD56を含む
大腸菌菌株はEscherichia coli ECfBD56 (FERM BP
-1221) として、pCfBD28を含む大腸菌菌株はEsche
richia coli ECfBD28(FERM BP-1479)として微工
研にそれぞれ寄託してある。 (5) pCfTNS7の造成(図14):下記のDNAリン
カーを合成した。
82にコードされるhG−CSF誘導体を以後、それぞれ
hG−CSF〔ND28〕、hG−CSF〔ND56〕およ
びhG−CSF〔ND82〕と呼ぶ。pCfBD56を含む
大腸菌菌株はEscherichia coli ECfBD56 (FERM BP
-1221) として、pCfBD28を含む大腸菌菌株はEsche
richia coli ECfBD28(FERM BP-1479)として微工
研にそれぞれ寄託してある。 (5) pCfTNS7の造成(図14):下記のDNAリン
カーを合成した。
【0106】
【化14】
【0107】このDNAリンカーのコードするhG−C
SFのN末端のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から4番目のGlyまでの4アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、18−mer と20−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。18−mer および20−mer の各々2μgを全
量40μlのT4キナーゼ緩衝液にとかし、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
SFのN末端のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から4番目のGlyまでの4アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、18−mer と20−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。18−mer および20−mer の各々2μgを全
量40μlのT4キナーゼ緩衝液にとかし、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
【0108】次に実施例6で得たpCfBA8由来のB
anIII−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じく
pCfBA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4k
b)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加
えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で
18時間結合反応を行った。
anIII−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じく
pCfBA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4k
b)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加
えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で
18時間結合反応を行った。
【0109】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfTNS7を得た。pCfTNS7にコードさ
れるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF〔△1−
4S〕と呼ぶ。 (6) pCfTAArg4Sの造成(図14):下記のDN
Aリンカーを合成した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfTNS7を得た。pCfTNS7にコードさ
れるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF〔△1−
4S〕と呼ぶ。 (6) pCfTAArg4Sの造成(図14):下記のDN
Aリンカーを合成した。
【0110】
【化15】
【0111】このDNAリンカーは、2ヶ所の塩基がA
かGのいづれかであり、合計4種類のDNAリンカーの
混合物として得られる。その結果、このDNAリンカー
のコードするhG−CSFのN末端のアミノ酸配列とし
ては、4番目のアミノ酸が4種類可能であるようにデザ
インされている。まず一本鎖DNA、31−mer と33−me
r を通常のトリエステル法により合成した。31−mer お
よび33−mer の各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ
緩衝液にとかし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位
(宝酒造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。
かGのいづれかであり、合計4種類のDNAリンカーの
混合物として得られる。その結果、このDNAリンカー
のコードするhG−CSFのN末端のアミノ酸配列とし
ては、4番目のアミノ酸が4種類可能であるようにデザ
インされている。まず一本鎖DNA、31−mer と33−me
r を通常のトリエステル法により合成した。31−mer お
よび33−mer の各々2μgを全量40μlのT4キナーゼ
緩衝液にとかし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位
(宝酒造社製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。
【0112】次に第1項で得たpCfBA8由来のBan
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断
片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加
えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で
18時間結合反応を行った。
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のXhoI−BglII断片(約1.4kb断
片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル加
えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃で
18時間結合反応を行った。
【0113】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfTAArg4Sを得た。前記デイデオキシ・
シークエンス法でDNAリンカー部分の塩基配列を決定
したところ、hG−CSF誘導体のN末端側の塩基配列
は下記の通りであることが判明した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドを回収
し、pCfTAArg4Sを得た。前記デイデオキシ・
シークエンス法でDNAリンカー部分の塩基配列を決定
したところ、hG−CSF誘導体のN末端側の塩基配列
は下記の通りであることが判明した。
【0114】
【化16】
【0115】pCfTAArg4Sによりコードされる
hG−CSF誘導体を以後hG−CSF〔Arg4,S
er17 〕と呼ぶ。 (7) pCfTN205の造成(図15):第5項で得たpC
fTNS7、3μgを40μlのK−150緩衝液(Y−100
緩衝液の100mM NaClを150mM KClにおきかえたも
の)に溶かし、制限酵素PvuI 5単位とXhoI 5
単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液から
LGT法により、トリプトファンプロモーター部分を含
む約1.0kbのDNA断片(PvuI−XhoI断片)を
約0.5μg得た。
hG−CSF誘導体を以後hG−CSF〔Arg4,S
er17 〕と呼ぶ。 (7) pCfTN205の造成(図15):第5項で得たpC
fTNS7、3μgを40μlのK−150緩衝液(Y−100
緩衝液の100mM NaClを150mM KClにおきかえたも
の)に溶かし、制限酵素PvuI 5単位とXhoI 5
単位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液から
LGT法により、トリプトファンプロモーター部分を含
む約1.0kbのDNA断片(PvuI−XhoI断片)を
約0.5μg得た。
【0116】これとは別に、第1項で得たpCfBA32
3μgを40μlのK−150緩衝液に溶かし、制限酵素Pv
uI 5単位とXhoI 5単位を加え、37℃で1時間消
化反応を行った。反応液からLGT法により、hG−C
SFcDNAの大部分を含む約3.0kbのDNA断片(X
hoI−PvuI断片)を2μg得た。次に上記で得た
pCfTNS7由来のPvuI−XhoI断片(約1.0k
b) の0.1μgとpCfBA32由来のXhoI−PvuI
断片(約3.0kb)0.3μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25
μlに溶かし、3単位のT4DNAリガーゼを加え、4
℃,18時間結合反応を行った。
3μgを40μlのK−150緩衝液に溶かし、制限酵素Pv
uI 5単位とXhoI 5単位を加え、37℃で1時間消
化反応を行った。反応液からLGT法により、hG−C
SFcDNAの大部分を含む約3.0kbのDNA断片(X
hoI−PvuI断片)を2μg得た。次に上記で得た
pCfTNS7由来のPvuI−XhoI断片(約1.0k
b) の0.1μgとpCfBA32由来のXhoI−PvuI
断片(約3.0kb)0.3μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25
μlに溶かし、3単位のT4DNAリガーゼを加え、4
℃,18時間結合反応を行った。
【0117】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図15に示したpCfTN205を得た。pCfTN205
のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸配列は、成
熟型hG−CSFの1〜4番目のアミノ酸が欠失してい
る。以後本誘導体をhG−CSF〔△1−4〕と呼ぶ。 (8) pCfTAArg4の造成(図15):第6項で得た
pCfTAArg4S、3μgを40μlのK−150緩衝
液に溶かし、制限酵素PvuI 5単位とXhoI 5単
位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液からL
GT法により、トリプトファンプロモーター部分を含む
約1.0kbのDNA断片(PvuI−XhoI断片)を約
0.5μg得た。
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図15に示したpCfTN205を得た。pCfTN205
のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸配列は、成
熟型hG−CSFの1〜4番目のアミノ酸が欠失してい
る。以後本誘導体をhG−CSF〔△1−4〕と呼ぶ。 (8) pCfTAArg4の造成(図15):第6項で得た
pCfTAArg4S、3μgを40μlのK−150緩衝
液に溶かし、制限酵素PvuI 5単位とXhoI 5単
位を加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液からL
GT法により、トリプトファンプロモーター部分を含む
約1.0kbのDNA断片(PvuI−XhoI断片)を約
0.5μg得た。
【0118】これとは別に、第1項で得たpCfBA32
3μgを40μlのK−150緩衝液に溶かし、制限酵素Pv
uI 5単位とXhoI 5単位を加え、37℃で1時間消
化反応を行った。反応液からLGT法により、hG−C
SFcDNAの大部分を含む約3.0kbのDNA断片(X
hoI−PvuI断片)を2μg得た。次に上記で得た
pCfTAArg4S由来のPvuI−XhoI断片
(約1.0kb)の0.1μgとpCfBA32由来のXhoI−
PvuI断片(約3.0kb)0.3μgをT4DNAリガーゼ
緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4DNAリガーゼを
加え、4℃,18時間結合反応を行った。
3μgを40μlのK−150緩衝液に溶かし、制限酵素Pv
uI 5単位とXhoI 5単位を加え、37℃で1時間消
化反応を行った。反応液からLGT法により、hG−C
SFcDNAの大部分を含む約3.0kbのDNA断片(X
hoI−PvuI断片)を2μg得た。次に上記で得た
pCfTAArg4S由来のPvuI−XhoI断片
(約1.0kb)の0.1μgとpCfBA32由来のXhoI−
PvuI断片(約3.0kb)0.3μgをT4DNAリガーゼ
緩衝液25μlに溶かし、3単位のT4DNAリガーゼを
加え、4℃,18時間結合反応を行った。
【0119】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図15に示したpCfTAArg4を得た。pCfT
AArg4のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸
配列は、成熟型hG−CSFの4番目のGlyがArg
に置換している。以後本誘導体をG−CSF〔Arg
4〕と呼ぶ。 (9) pCfTNS301の造成(図16):第1項で得たp
CfBA8、6μgを50μlのY−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素HindIII 10単位、BglII 8単位を
加え、37℃,1時間消化反応を行った。反応液からLG
T法によりhG−CSFcDNAを含む約1.4kbのDN
A断片(HindIII−BglII断片)約0.6μgを得
た。
転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーより前記
バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを回収
し、図15に示したpCfTAArg4を得た。pCfT
AArg4のコードするhG−CSF誘導体のアミノ酸
配列は、成熟型hG−CSFの4番目のGlyがArg
に置換している。以後本誘導体をG−CSF〔Arg
4〕と呼ぶ。 (9) pCfTNS301の造成(図16):第1項で得たp
CfBA8、6μgを50μlのY−100 緩衝液に溶か
し、制限酵素HindIII 10単位、BglII 8単位を
加え、37℃,1時間消化反応を行った。反応液からLG
T法によりhG−CSFcDNAを含む約1.4kbのDN
A断片(HindIII−BglII断片)約0.6μgを得
た。
【0120】次に下記のDNAリンカーを合成した。
【0121】
【化17】
【0122】このDNAリンカーのコードするhG−C
SFのN末端のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から11番目のGlnまでの11アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、27−mer と29−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。27−mer および29−mer の各々2μgを全
量40μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
SFのN末端のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から11番目のGlnまでの11アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、27−mer と29−mer を通常のトリエステル法によ
り合成した。27−mer および29−mer の各々2μgを全
量40μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌク
レオチドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
【0123】次に上記で得たpCfBA8由来のBan
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のHindIII−BglII断片(約1.4kb
断片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶
かし、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のHindIII−BglII断片(約1.4kb
断片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶
かし、この混合液に上記DNAリンカーを約2ピコモル
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
【0124】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、pCfTNS301を得た。pCfTNS301に
コードされるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF
〔△1−11S〕と呼ぶ。 (10)pCfTNS401の造成(図16):下記のDNAリ
ンカーを合成した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し、pCfTNS301を得た。pCfTNS301に
コードされるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF
〔△1−11S〕と呼ぶ。 (10)pCfTNS401の造成(図16):下記のDNAリ
ンカーを合成した。
【0125】
【化18】
【0126】このDNAリンカーのコードするhG−C
SFのN端末のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から7番目のSerまでの7アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、39−merと41−merを通常のトリエステル法により
合成した。39−merおよび41−merの各々2μgを全量40
μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃で60
分間リン酸化反応を行った。
SFのN端末のアミノ酸配列としては、1番目のThr
から7番目のSerまでの7アミノ酸が欠失したアミノ
酸配列となるようにデザインされている。まず一本鎖D
NA、39−merと41−merを通常のトリエステル法により
合成した。39−merおよび41−merの各々2μgを全量40
μlのT4キナーゼ緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼ30単位(宝酒造社製)を加えて、37℃で60
分間リン酸化反応を行った。
【0127】次に上記で得たpCfBA8由来のBan
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のHindIII−BglII断片(約1.4kb
断片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶
かし、この混合液に上記DNAリンカー約2ピコモルを
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
III−BglII断片(約2.7kb断片)0.1μg、同じくp
CfBA8由来のHindIII−BglII断片(約1.4kb
断片)0.1μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶
かし、この混合液に上記DNAリンカー約2ピコモルを
加えた。さらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4℃
で18時間結合反応を行った。
【0128】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Aprのコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNAを
回収し、pCfTNS401を得た。pCfTNS401にコ
ードされるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF
〔△1−7S〕と呼ぶ。 (11)pCfTNS501の造成(図12):第1項で得ら
れたpCfBA8、6μgを40μlのY−100緩衝液に
溶かし、制限酵素XhoI10単位を加え、37℃、1時間
消化反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およ
びエタノール沈澱でDNAを回収し、30μlのクレノー
緩衝液に溶かし、DNAポリメラーゼI・クレノー断片
を2単位加え、17℃で30分間反応を行った。68℃で10分
間処理しDNAポリメラーゼI・クレノー断片を失活さ
せ、KClを150mMになるように加え制限酵素PvuI
を8単位加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液か
らLGT法でhG−CSFcDNAを含む約3kbのDN
A断片〔XhoI(Blunt)−PvuI〕約2μg
を得た。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、Aprのコロニーを
得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNAを
回収し、pCfTNS401を得た。pCfTNS401にコ
ードされるhG−CSF誘導体を以後、hG−CSF
〔△1−7S〕と呼ぶ。 (11)pCfTNS501の造成(図12):第1項で得ら
れたpCfBA8、6μgを40μlのY−100緩衝液に
溶かし、制限酵素XhoI10単位を加え、37℃、1時間
消化反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およ
びエタノール沈澱でDNAを回収し、30μlのクレノー
緩衝液に溶かし、DNAポリメラーゼI・クレノー断片
を2単位加え、17℃で30分間反応を行った。68℃で10分
間処理しDNAポリメラーゼI・クレノー断片を失活さ
せ、KClを150mMになるように加え制限酵素PvuI
を8単位加え37℃で1時間消化反応を行った。反応液か
らLGT法でhG−CSFcDNAを含む約3kbのDN
A断片〔XhoI(Blunt)−PvuI〕約2μg
を得た。
【0129】別に、参考例4の方法によって得たATG
ベクターpTrS20(3.8kb)5μgを50μlのY−0
緩衝液(Y−100緩衝液より100mM NaClを除いたも
の)に溶かし、16単位の制限酵素SacIを加え、37℃
で3時間切断反応を行った。フェノール−クロロホルム
抽出の後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、30μ
lのクレノー緩衝液に溶かし、DNAポリメラーゼI・
クレノー断片を2単位加え、17℃で30分間反応を行っ
た。68℃で10分間処理しDNAポリメラーゼI・クレノ
ー断片を失活させ、KClを150mMになるように加え、
制限酵素PvuIを8単位加え37℃で1時間消化反応を
行った。反応液からLGT法でPtrpを含む約1kbの
DNA断片〔SacI(Blunt)−PvuI〕約0.5μg
を得た。
ベクターpTrS20(3.8kb)5μgを50μlのY−0
緩衝液(Y−100緩衝液より100mM NaClを除いたも
の)に溶かし、16単位の制限酵素SacIを加え、37℃
で3時間切断反応を行った。フェノール−クロロホルム
抽出の後、エタノール沈澱によりDNAを回収し、30μ
lのクレノー緩衝液に溶かし、DNAポリメラーゼI・
クレノー断片を2単位加え、17℃で30分間反応を行っ
た。68℃で10分間処理しDNAポリメラーゼI・クレノ
ー断片を失活させ、KClを150mMになるように加え、
制限酵素PvuIを8単位加え37℃で1時間消化反応を
行った。反応液からLGT法でPtrpを含む約1kbの
DNA断片〔SacI(Blunt)−PvuI〕約0.5μg
を得た。
【0130】次に上記で得たpCfBA8由来のXho
I(Blunt) −PvuI断片(約3kb)0.1μgとpTr
S20由来のSacI(Blunt) −PvuI断片(約1kb)
0.2 μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、3単位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,18時間
結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株
を形質転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーよ
り前記バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを
回収し、図12に示したpCfTNS501を得た。
I(Blunt) −PvuI断片(約3kb)0.1μgとpTr
S20由来のSacI(Blunt) −PvuI断片(約1kb)
0.2 μgをT4DNAリガーゼ緩衝液25μlに溶か
し、3単位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,18時間
結合反応を行った。該反応液を用いて大腸菌HB101株
を形質転換し、Apr のコロニーを得、このコロニーよ
り前記バーンボイムらの方法によりプラスミドDNAを
回収し、図12に示したpCfTNS501を得た。
【0131】pCfTNS501のコードするhG−CS
F誘導体は、成熟型hG−CSFのN末端6番目までの
アミノ酸が欠失し、17番目のCysがSerに置換して
いる。pCfTNS501 にコードされるhG−CSF誘
導体を以後、hG−CSF〔△1−6S〕と呼ぶ。 実施例7. (1) pCfCB101,pCfCC52,pCfCC59,C
fCD28,pCfCD56の造成(図8):まず、pBR
322〔ボリバー(Bolivar)ら:ジーン (Gene) 2, 95 (19
77)〕3μgを40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵
素PstIを5単位加え、37℃,1時間消化反応を行っ
た。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿でDNAを回収し、33mMトリスー酢酸(pH7.9)、66m
M酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、5mMジチオス
レイトール、および0.4mMのdATP、dCTP、dG
TP、dTTPを含む溶液(以下、T4DNAポリメラ
ーゼ緩衝液と略記する)20μlに溶かし、T4DNAポ
リメラーゼ(宝酒造社製)1単位を加え、37℃,30分間
反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿でDNAを回収し、20μlのT4DNAリ
ガーゼ緩衝液に溶かした。これにBglIIリンカーDN
A(宝酒造社製:d(pC−A−G−A−T−C−T−
G)を約8ピコモル加え、さらにT4DNAリガーゼを
6単位加え、4℃,18時間結合反応を行った。フェノー
ル−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿でDNAを
回収し、40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素E
coRIを10単位、BglIIを8単位加え、37℃で1時
間消化反応を行った。反応液からLGT法でテトラサイ
クリン耐性遺伝子部分を含む約3.6kbのDNA断片(E
coRI−BglII断片)約0.9μgを得た。
F誘導体は、成熟型hG−CSFのN末端6番目までの
アミノ酸が欠失し、17番目のCysがSerに置換して
いる。pCfTNS501 にコードされるhG−CSF誘
導体を以後、hG−CSF〔△1−6S〕と呼ぶ。 実施例7. (1) pCfCB101,pCfCC52,pCfCC59,C
fCD28,pCfCD56の造成(図8):まず、pBR
322〔ボリバー(Bolivar)ら:ジーン (Gene) 2, 95 (19
77)〕3μgを40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵
素PstIを5単位加え、37℃,1時間消化反応を行っ
た。フェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈
殿でDNAを回収し、33mMトリスー酢酸(pH7.9)、66m
M酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、5mMジチオス
レイトール、および0.4mMのdATP、dCTP、dG
TP、dTTPを含む溶液(以下、T4DNAポリメラ
ーゼ緩衝液と略記する)20μlに溶かし、T4DNAポ
リメラーゼ(宝酒造社製)1単位を加え、37℃,30分間
反応を行った。フェノール−クロロホルム抽出およびエ
タノール沈殿でDNAを回収し、20μlのT4DNAリ
ガーゼ緩衝液に溶かした。これにBglIIリンカーDN
A(宝酒造社製:d(pC−A−G−A−T−C−T−
G)を約8ピコモル加え、さらにT4DNAリガーゼを
6単位加え、4℃,18時間結合反応を行った。フェノー
ル−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿でDNAを
回収し、40μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素E
coRIを10単位、BglIIを8単位加え、37℃で1時
間消化反応を行った。反応液からLGT法でテトラサイ
クリン耐性遺伝子部分を含む約3.6kbのDNA断片(E
coRI−BglII断片)約0.9μgを得た。
【0132】これとは別に、実施例6−(2)で得たpC
fBB101、実施例6−(3)で得たpCfBC52あるいは
pCfBC59、実施例6−(4)で得たpCfBD28ある
いはpCfBD56をそれぞれ3μg別々に10倍濃度のY
−100緩衝液にとかし、制限酵素EcoRIを5単位、
BglIIを6単位加え、37℃で1時間消化反応を行っ
た。反応液からLGT法で、hG−CSFcDNA部分
を含む約1.8kbのDNA断片(EcoRI−BglII断
片)をそれぞれ約0.4μg得た。
fBB101、実施例6−(3)で得たpCfBC52あるいは
pCfBC59、実施例6−(4)で得たpCfBD28ある
いはpCfBD56をそれぞれ3μg別々に10倍濃度のY
−100緩衝液にとかし、制限酵素EcoRIを5単位、
BglIIを6単位加え、37℃で1時間消化反応を行っ
た。反応液からLGT法で、hG−CSFcDNA部分
を含む約1.8kbのDNA断片(EcoRI−BglII断
片)をそれぞれ約0.4μg得た。
【0133】上記で得た、pBR322由来のEcoRI
−BglII断片(約3.6kb)約0.05μgを20μlのT4
DNAリガーゼ緩衝液にとかしたものを5本調製した。
これに上記で得たpCfBB101あるいはpCfBC52
あるいはpCfBC59あるいはpCfBD28あるいはp
CfBD56由来のEcoRI−BglII断片(約1.8kb
断片)約0.1μgずつを別々に加え、さらにT4DNA
リガーゼを4単位加え、4℃18時間結合反応を行った。
−BglII断片(約3.6kb)約0.05μgを20μlのT4
DNAリガーゼ緩衝液にとかしたものを5本調製した。
これに上記で得たpCfBB101あるいはpCfBC52
あるいはpCfBC59あるいはpCfBD28あるいはp
CfBD56由来のEcoRI−BglII断片(約1.8kb
断片)約0.1μgずつを別々に加え、さらにT4DNA
リガーゼを4単位加え、4℃18時間結合反応を行った。
【0134】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株を形質転換し、TcR のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し図8に示したpCfCB101,pCfCC52,
pCfCC59,pCfCD52,pCfCD56を得た。こ
れらのプラスミドにコードされるhG−CSF誘導体の
アミノ酸配列はそれぞれpCfBB101,pCfBC5
2,pCfBC59,pCfBD28,pCfBD56にコー
ドされるhG−CSF誘導体のアミノ酸配列と同じであ
る。 実施例8. hG−CSF誘導体の生産および精製:実施例3,4,
6および7で得た組換え体プラスミドpCfTL23,p
CfTL35, pCfTL38, pCfTL41,pCfTM
14,pCfTM17,pCfTM113, pCfBB101, p
CfBC42B1,pCfBC45, pCfBC52, pCf
BC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93,
pCfBC95,pCfBC97, pCfBD28, pCfB
D56,pCfBD82,pCfTNS7,pCfAArg
4S, pCfTNS301 ,pCfTNS401 , pCfT
NS501,pCfBD28A17, pCfBD28T17をもつ大
腸菌W3110 strA株(それぞれECfTL23, EC
fTL35, ECfTL38,ECfTL41, ECfTM1
4, ECfTM17, ECfTM113,ECfBB101,E
CfBC42B1,ECfBC45, ECfBC52, ECf
BC59,ECfBC76,ECfBC77, ECfBC93,
ECfBC95, ECfBC97,ECfBD28, ECfB
D56, ECfBD82, ECfTNS7,ECfTAAr
g4S,ECfTNS301 ,ECfTNS401 , ECf
TNS501,ECfBD28A17, ECfBD28T17とよ
ぶ)をLG培地〔バクトトリプトン10g、酵母エキス5
g、NaCl5g、グルコース1gを水1lに溶かし、
NaOHにてpHを7.0とする。〕で37℃、18時間培養
し、この培養液5mlを25μg/mlのトリプトファンと50
μg/mlのアンピシリンを含むMCG培地〔Na2HP
O4 0.6%、KH2PO4 0.3%、NaCl 0.5%、カザ
ミノ酸 0.5%、MgSO4 1mM、ビタミンB1 4μg/
ml、pH7.2〕100mlに接種し、30℃で4〜8時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である3β−インドールアク
リル酸(3β−indoleacrylic acid, 以下IAAと略
す)を10μg/ml加え、さらに2〜12時間培養を続け
た。培養液を8000rpm 、10分間遠心して集菌し、30mM
NaCl、30mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液で洗
浄した。洗浄菌体を上記緩衝液30mlに懸濁し、0℃で超
音波破砕 (BRANSON SONIC POWER COMPANY 社 SONIFIERC
ELL DISRUPTOR200 、OUTPUT CONTROL2、10分間処理) し
た。これを9000rpm 、30分間遠心して菌体残渣を得た。
この菌体残渣からマーストンらの方法〔F. A. O. Marst
onら: BIO/TECHNOLOGY2,800(1984) 〕によりhG
−CSF誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。蛋白
量の測定は、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社プ
ロティン・アッセイキット(スタンダードアッセイ法)
〔M. M. Bradford:Anal. Biochem., 72 ,248 (1976)〕
により行った。G−CSF活性の測定は以下のように行
った。8〜12週令のC3H/He雄マウス(静岡実験動
物協同組合)の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出
し、牛胎児血清(FBS)を10%添加したα−Minimum
Essential Medium (Flow Laboratories,以下α−MEM
培地と略す)に懸濁した。この細胞 (約5×107 個)懸
濁液1.5mlを、ナイロン・ウール(Nylon wool) (和光
純薬、Nylon Fiber 146-04231)をつめたカラム(0.3
g)に浸漬し、5%CO2インキュベーター内にて37
℃,90分間反応させた。次いで予め37℃に加温したα−
MEM培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウ
ール非吸着性の骨髄細胞を得た。この細胞をα−MEM
培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整した。
いて大腸菌HB101株を形質転換し、TcR のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収し図8に示したpCfCB101,pCfCC52,
pCfCC59,pCfCD52,pCfCD56を得た。こ
れらのプラスミドにコードされるhG−CSF誘導体の
アミノ酸配列はそれぞれpCfBB101,pCfBC5
2,pCfBC59,pCfBD28,pCfBD56にコー
ドされるhG−CSF誘導体のアミノ酸配列と同じであ
る。 実施例8. hG−CSF誘導体の生産および精製:実施例3,4,
6および7で得た組換え体プラスミドpCfTL23,p
CfTL35, pCfTL38, pCfTL41,pCfTM
14,pCfTM17,pCfTM113, pCfBB101, p
CfBC42B1,pCfBC45, pCfBC52, pCf
BC59, pCfBC76, pCfBC77, pCfBC93,
pCfBC95,pCfBC97, pCfBD28, pCfB
D56,pCfBD82,pCfTNS7,pCfAArg
4S, pCfTNS301 ,pCfTNS401 , pCfT
NS501,pCfBD28A17, pCfBD28T17をもつ大
腸菌W3110 strA株(それぞれECfTL23, EC
fTL35, ECfTL38,ECfTL41, ECfTM1
4, ECfTM17, ECfTM113,ECfBB101,E
CfBC42B1,ECfBC45, ECfBC52, ECf
BC59,ECfBC76,ECfBC77, ECfBC93,
ECfBC95, ECfBC97,ECfBD28, ECfB
D56, ECfBD82, ECfTNS7,ECfTAAr
g4S,ECfTNS301 ,ECfTNS401 , ECf
TNS501,ECfBD28A17, ECfBD28T17とよ
ぶ)をLG培地〔バクトトリプトン10g、酵母エキス5
g、NaCl5g、グルコース1gを水1lに溶かし、
NaOHにてpHを7.0とする。〕で37℃、18時間培養
し、この培養液5mlを25μg/mlのトリプトファンと50
μg/mlのアンピシリンを含むMCG培地〔Na2HP
O4 0.6%、KH2PO4 0.3%、NaCl 0.5%、カザ
ミノ酸 0.5%、MgSO4 1mM、ビタミンB1 4μg/
ml、pH7.2〕100mlに接種し、30℃で4〜8時間培養後、
トリプトファンの誘導物質である3β−インドールアク
リル酸(3β−indoleacrylic acid, 以下IAAと略
す)を10μg/ml加え、さらに2〜12時間培養を続け
た。培養液を8000rpm 、10分間遠心して集菌し、30mM
NaCl、30mM Tris−HCl(pH7.5)緩衝液で洗
浄した。洗浄菌体を上記緩衝液30mlに懸濁し、0℃で超
音波破砕 (BRANSON SONIC POWER COMPANY 社 SONIFIERC
ELL DISRUPTOR200 、OUTPUT CONTROL2、10分間処理) し
た。これを9000rpm 、30分間遠心して菌体残渣を得た。
この菌体残渣からマーストンらの方法〔F. A. O. Marst
onら: BIO/TECHNOLOGY2,800(1984) 〕によりhG
−CSF誘導体を抽出・精製・可溶化・再生した。蛋白
量の測定は、日本バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社プ
ロティン・アッセイキット(スタンダードアッセイ法)
〔M. M. Bradford:Anal. Biochem., 72 ,248 (1976)〕
により行った。G−CSF活性の測定は以下のように行
った。8〜12週令のC3H/He雄マウス(静岡実験動
物協同組合)の大腿骨より骨髄細胞を無菌的にとり出
し、牛胎児血清(FBS)を10%添加したα−Minimum
Essential Medium (Flow Laboratories,以下α−MEM
培地と略す)に懸濁した。この細胞 (約5×107 個)懸
濁液1.5mlを、ナイロン・ウール(Nylon wool) (和光
純薬、Nylon Fiber 146-04231)をつめたカラム(0.3
g)に浸漬し、5%CO2インキュベーター内にて37
℃,90分間反応させた。次いで予め37℃に加温したα−
MEM培地をカラムに流し、溶出してくるナイロン・ウ
ール非吸着性の骨髄細胞を得た。この細胞をα−MEM
培地で一回洗浄し、所定の濃度に調整した。
【0135】次いで、岡部らの方法〔Okabe T. et al.,
CancerResearch 44 ,4503-4506 (1986)〕に準じて骨
髄造血幹細胞コロニー形成能を測定した。すなわち、α
−MEM0.2ml、FBS0.4mlおよび2段階稀釈した各サ
ンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細胞
(2×106 個/ml)の0.2mlを混和した。これに42℃に
保温した0.6%寒天(Difco, Agar purified # 0560-01)
溶液を等量(1.0ml)混和し、その0.5mlを24穴マルチ
ディッシュ(Nunc社製、# 143982) に播種した(5×10
4 個/dish ,n=3)。5%CO2 インキュベーター中
で37℃, 7日間培養し、40個以上の細胞からなるコロニ
ーの数を顕微鏡(Olympus社製、X40)で計数した。コロニ
ー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出し、アセ
トン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Kubotaらの方法
〔Kubota K.,et al., Exp.Hematology. 8,339-344 (1
980)〕でエステラーゼ2重染色を施し、各コロニーの同
定を行った。
CancerResearch 44 ,4503-4506 (1986)〕に準じて骨
髄造血幹細胞コロニー形成能を測定した。すなわち、α
−MEM0.2ml、FBS0.4mlおよび2段階稀釈した各サ
ンプル0.2mlの混液に、上記の方法で調製した骨髄細胞
(2×106 個/ml)の0.2mlを混和した。これに42℃に
保温した0.6%寒天(Difco, Agar purified # 0560-01)
溶液を等量(1.0ml)混和し、その0.5mlを24穴マルチ
ディッシュ(Nunc社製、# 143982) に播種した(5×10
4 個/dish ,n=3)。5%CO2 インキュベーター中
で37℃, 7日間培養し、40個以上の細胞からなるコロニ
ーの数を顕微鏡(Olympus社製、X40)で計数した。コロニ
ー計数後、注意深くスライドグラス上にとり出し、アセ
トン・ホルマリン混液で30秒間固定後、Kubotaらの方法
〔Kubota K.,et al., Exp.Hematology. 8,339-344 (1
980)〕でエステラーゼ2重染色を施し、各コロニーの同
定を行った。
【0136】各サンプルの力価は、コロニー形成試験の
2段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出した。
スタンダードとして用いたインタクトG−CSFのコロ
ニー形成の最大値の1/2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価(単位)とした。比活
性は、単位蛋白質(mg)当りの力価(単位/mg)で表示
した。
2段階稀釈に於ける計数結果から以下の様に算出した。
スタンダードとして用いたインタクトG−CSFのコロ
ニー形成の最大値の1/2値を与える活性を50単位と定義
し、これに各サンプルの稀釈率および単位ml当りの活性
に換算するため、20を乗じて力価(単位)とした。比活
性は、単位蛋白質(mg)当りの力価(単位/mg)で表示
した。
【0137】インタクトのG−CSFおよびG−CSF
誘導体の力価を表5に示す。
誘導体の力価を表5に示す。
【0138】
【表5】
【0139】実施例9. ヒト骨髄細胞に対するhG−CSF誘導体の活性測定:
20〜30才の健常人の腸骨より骨髄液をとりだし、これに
等量のα−MEM培地を加え混和した。フィコール−パ
ーク(Ficoll−Paque)液(ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル社、比重1.077)3mlの上に上記骨髄液4mlを重層
し、400×g、30分間遠心分離し、中間層にくる細胞を
分離した。細胞をPBS(NaCl 8g,KCl 0.2
g,Na2HPO4 1.15gおよびKH2PO4 0.2gを水
に溶かして1lとしたもの)で2回洗浄後、10%ウシ胎
児血清(FBS)を添加したα−MEM培地に懸濁し、
2×106/ml以下の細胞濃度に調整した。プラスチック
・ディッシュ〔ファルコン (Falcon)3003 〕に10ml播種
し、5%CO2 インキュベーターにて37℃,90分間培養
し、プラスチック・ディッシュに非付着性の細胞を回収
した。細胞をα−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度
に調整して以下のヒト骨髄幹細胞増殖促進活性およびコ
ロニー形成試験に供した。すなわち、96穴平型マイクロ
プレート(NUNC, 167008)の各ウエルに10%FBS添加α
−MEM培地を100 μl注入し、次いで実施例8の方法
で得たhG−CSFおよびhG−CSF誘導体の各サン
プル100μlを第一列に添加した。よく混和した液100μ
lを第2列目に移し2倍稀釈とし、以下12列まで同様に
2段階稀釈した(n=3)。陰性対照として、α−ME
M培地だけの群を設けた。
20〜30才の健常人の腸骨より骨髄液をとりだし、これに
等量のα−MEM培地を加え混和した。フィコール−パ
ーク(Ficoll−Paque)液(ファルマシア・ファイン・ケ
ミカル社、比重1.077)3mlの上に上記骨髄液4mlを重層
し、400×g、30分間遠心分離し、中間層にくる細胞を
分離した。細胞をPBS(NaCl 8g,KCl 0.2
g,Na2HPO4 1.15gおよびKH2PO4 0.2gを水
に溶かして1lとしたもの)で2回洗浄後、10%ウシ胎
児血清(FBS)を添加したα−MEM培地に懸濁し、
2×106/ml以下の細胞濃度に調整した。プラスチック
・ディッシュ〔ファルコン (Falcon)3003 〕に10ml播種
し、5%CO2 インキュベーターにて37℃,90分間培養
し、プラスチック・ディッシュに非付着性の細胞を回収
した。細胞をα−MEM培地で一回洗浄し、所定の濃度
に調整して以下のヒト骨髄幹細胞増殖促進活性およびコ
ロニー形成試験に供した。すなわち、96穴平型マイクロ
プレート(NUNC, 167008)の各ウエルに10%FBS添加α
−MEM培地を100 μl注入し、次いで実施例8の方法
で得たhG−CSFおよびhG−CSF誘導体の各サン
プル100μlを第一列に添加した。よく混和した液100μ
lを第2列目に移し2倍稀釈とし、以下12列まで同様に
2段階稀釈した(n=3)。陰性対照として、α−ME
M培地だけの群を設けた。
【0140】次に、各ウエルに上述のごとく調製した骨
髄細胞懸濁液100μl(有核細胞数、5×104 個)を播
種し、5%CO2 インキュベーターにて、37℃、3日間
培養した。最後の18〜20時間に6−3H−チミジン〔ア
マーシャム日本(Amersham Japan), CodeTRK61, 107mci/
mg〕10μlを添加して培養した。セル・ハーベスター(C
ell harvester) (ラボサイエンス社)にて各細胞をガ
ラスフィルター上に回収し乾燥後、細胞にとり込まれた
放射能を液体シンチレーションカウンター〔パッカード
社(Packard), Tricarb 3320)〕で計測した。
髄細胞懸濁液100μl(有核細胞数、5×104 個)を播
種し、5%CO2 インキュベーターにて、37℃、3日間
培養した。最後の18〜20時間に6−3H−チミジン〔ア
マーシャム日本(Amersham Japan), CodeTRK61, 107mci/
mg〕10μlを添加して培養した。セル・ハーベスター(C
ell harvester) (ラボサイエンス社)にて各細胞をガ
ラスフィルター上に回収し乾燥後、細胞にとり込まれた
放射能を液体シンチレーションカウンター〔パッカード
社(Packard), Tricarb 3320)〕で計測した。
【0141】一方、ヒト骨髄造血幹細胞コロニー形成試
験および各コロニーの同定は実施例8の方法に従って行
った。各サンプルの力価は、コロニー形成試験におい
て、1個のコロニーを形成しうる活性を1単位と定義し
た。すなわち、2段階稀釈に於ける計数結果の直線性を
与える投与量応答直線(Dose-response-curve)よりHa
lf Max値(最大取り込み値の1/2の値)を求め、
各サンプルの力価を算出した。
験および各コロニーの同定は実施例8の方法に従って行
った。各サンプルの力価は、コロニー形成試験におい
て、1個のコロニーを形成しうる活性を1単位と定義し
た。すなわち、2段階稀釈に於ける計数結果の直線性を
与える投与量応答直線(Dose-response-curve)よりHa
lf Max値(最大取り込み値の1/2の値)を求め、
各サンプルの力価を算出した。
【0142】比活性は単位蛋白質(mg)当りの力価(uni
t/mg)で表示した。インタクトのhG−CSFおよび
hG−CSF誘導体の力価を表6に示す。
t/mg)で表示した。インタクトのhG−CSFおよび
hG−CSF誘導体の力価を表6に示す。
【0143】
【表6】
【0144】実施例10. N末端第1〜7番目欠失、17番セリンhG−CSF誘導
体(以後M−7Sと略す)の製造:実施例6で得た組換
え体プラスミドpCfBC59をもつ大腸菌(ECfBC
59)を実施例8に記したように培養、精製して得た表2
の誘導体(a)(132μg/ml)を含む10mM Tris−H
Cl−100mM NaCl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズ
ブチリンBPN' (8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社
製)を0.7μg添加し、25℃,40時間インキュベートし
た。10mM Tris−HCl(pH8.0)で3倍稀釈のの
ち、10mM Tris−HCl(pH8.0)で充たされたDE
AE−トヨパール650M(東洋曹達工業社製)(1.7cm×
4.4cm)に10ml/時の流速で通塔した。次いで10mM Tr
is−HCl(pH8.0)20mlを5ml/時の流速で通塔
後、10mM Tris−HCl(pH8.0)の緩衝液系に直線
勾配でNaClを0Mから0.4Mまで総容量50mlかけて
加え、同流速で溶出を行なった。M−7S誘導体はNa
Cl濃度100〜150mMで溶出された(収量0.7mg、収率10
%)。純度は90%以上であった。 実施例11. M−7Sの製造:実施例6で得た組換え体プラスミドp
CfBC59をもつ大腸菌(ECfBC59)を実施例8に
記したように培養、精製して得た表2の誘導体(b)(132
μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM Na
Cl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズブチリンBPN'
(8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添加し、
25℃, 14時間インキュベートした。10mM Tris−H
Cl(pH8.0)で3倍稀釈したのち、10mM Tris−H
Cl(pH8.0)で充たされたDEAE−トヨパール650M
(東洋曹達工業社製)(1.7cm×4.4cm)に10ml/時の流
速で通塔した。次いで10mM Tris−HCl(pH8.0)
20mlを5ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−HC
l(pH8.0)の緩衝液系に直線勾配でNaClを0Mか
ら0.4Mまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行
った。M−7S誘導体はNaCl濃度100〜150mMで溶出
された(収量4.2mg、収率63%)。純度は90%以上であ
った。 実施例12. M−7Sの製造:実施例6で得た組換え体プラスミドp
CfTAArg4Sを持つ大腸菌(ECfTAArg4
S)を実施例8に記したように培養、精製して得た表2
の誘導体(d)(132μg/ml)を含む10mM Tris−H
Cl−100mM NaCl溶液(pH8.0)50mlに対してズブ
チリシンBPN’(8.5単位/mg−蛋白質)(シグマ社
製)を0.7μg添加し、25℃,40時間インキュベートし
た。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM Tris−H
Cl(pH8.0)−0.5M NaClで充されたZnキレー
ト セファロース(ファルマシア・ファインケミカル社
製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で通塔した。次
いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5MNaC
l12mlを3ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−H
Cl−0.5mM NaClの緩衝液を直線勾配でpH8.0からp
H6.0まで総容量30mlかけて、同流速で溶出を行った。M
−7S誘導体はpH7.0付近で溶出された(収量0.6mg、収
率9%)。純度は90%であった。 実施例13. N末端第1〜6番目欠失、17番セリンhG−CSF誘導
体(以後M−6Sと略す)の製造:表2の誘導体(a)(1
32μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM N
aCl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズブチリシンBP
N′(8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添
加し、25℃, 2時間インキュベートした。10mM Tri
s−HCl(pH8.0)で3倍稀釈したのち、10mM Tri
s−HCl(pH8.0)で充たされたDEAE−トヨパー
ル650M(東洋曹達工業社製)(1.7cm×4.4cmに10ml/
時の流速で通塔した。次いで10mM Tris−HCl(p
H8.0)20mlを5ml/時の流速で通塔後、10mM Tris
−HCl(pH8.0) の緩衝液系に直線匂配でNaClを
0Mから0.4Mまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶
出を行った。M−6S誘導体はNaCl濃度100〜150mM
で溶出された(収量2.6mg,収率40%)。純度は90%以
上であった。
体(以後M−7Sと略す)の製造:実施例6で得た組換
え体プラスミドpCfBC59をもつ大腸菌(ECfBC
59)を実施例8に記したように培養、精製して得た表2
の誘導体(a)(132μg/ml)を含む10mM Tris−H
Cl−100mM NaCl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズ
ブチリンBPN' (8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社
製)を0.7μg添加し、25℃,40時間インキュベートし
た。10mM Tris−HCl(pH8.0)で3倍稀釈のの
ち、10mM Tris−HCl(pH8.0)で充たされたDE
AE−トヨパール650M(東洋曹達工業社製)(1.7cm×
4.4cm)に10ml/時の流速で通塔した。次いで10mM Tr
is−HCl(pH8.0)20mlを5ml/時の流速で通塔
後、10mM Tris−HCl(pH8.0)の緩衝液系に直線
勾配でNaClを0Mから0.4Mまで総容量50mlかけて
加え、同流速で溶出を行なった。M−7S誘導体はNa
Cl濃度100〜150mMで溶出された(収量0.7mg、収率10
%)。純度は90%以上であった。 実施例11. M−7Sの製造:実施例6で得た組換え体プラスミドp
CfBC59をもつ大腸菌(ECfBC59)を実施例8に
記したように培養、精製して得た表2の誘導体(b)(132
μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM Na
Cl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズブチリンBPN'
(8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添加し、
25℃, 14時間インキュベートした。10mM Tris−H
Cl(pH8.0)で3倍稀釈したのち、10mM Tris−H
Cl(pH8.0)で充たされたDEAE−トヨパール650M
(東洋曹達工業社製)(1.7cm×4.4cm)に10ml/時の流
速で通塔した。次いで10mM Tris−HCl(pH8.0)
20mlを5ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−HC
l(pH8.0)の緩衝液系に直線勾配でNaClを0Mか
ら0.4Mまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行
った。M−7S誘導体はNaCl濃度100〜150mMで溶出
された(収量4.2mg、収率63%)。純度は90%以上であ
った。 実施例12. M−7Sの製造:実施例6で得た組換え体プラスミドp
CfTAArg4Sを持つ大腸菌(ECfTAArg4
S)を実施例8に記したように培養、精製して得た表2
の誘導体(d)(132μg/ml)を含む10mM Tris−H
Cl−100mM NaCl溶液(pH8.0)50mlに対してズブ
チリシンBPN’(8.5単位/mg−蛋白質)(シグマ社
製)を0.7μg添加し、25℃,40時間インキュベートし
た。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM Tris−H
Cl(pH8.0)−0.5M NaClで充されたZnキレー
ト セファロース(ファルマシア・ファインケミカル社
製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で通塔した。次
いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5MNaC
l12mlを3ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−H
Cl−0.5mM NaClの緩衝液を直線勾配でpH8.0からp
H6.0まで総容量30mlかけて、同流速で溶出を行った。M
−7S誘導体はpH7.0付近で溶出された(収量0.6mg、収
率9%)。純度は90%であった。 実施例13. N末端第1〜6番目欠失、17番セリンhG−CSF誘導
体(以後M−6Sと略す)の製造:表2の誘導体(a)(1
32μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM N
aCl溶液(pH8.0)50mlに対して、ズブチリシンBP
N′(8.5単位/mg蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添
加し、25℃, 2時間インキュベートした。10mM Tri
s−HCl(pH8.0)で3倍稀釈したのち、10mM Tri
s−HCl(pH8.0)で充たされたDEAE−トヨパー
ル650M(東洋曹達工業社製)(1.7cm×4.4cmに10ml/
時の流速で通塔した。次いで10mM Tris−HCl(p
H8.0)20mlを5ml/時の流速で通塔後、10mM Tris
−HCl(pH8.0) の緩衝液系に直線匂配でNaClを
0Mから0.4Mまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶
出を行った。M−6S誘導体はNaCl濃度100〜150mM
で溶出された(収量2.6mg,収率40%)。純度は90%以
上であった。
【0145】実施例14. M−6S製造:表2の誘導体(a) (132 μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対して、エポルザイム(4120単位/mg蛋白
質) 協和発酵工業社製)を0.7μg添加し、25℃, 20時
間インキュベートした。NaCl濃度を0.5Mにした
後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl
で充たされたZnキレート セファロース(ファルマシ
ア・ファイン・ケミカル社製) (1.7cm×2.6cm)に6ml
/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tris−HC
l(pH8.0) −0.5M NaCl 12mlを3ml/時の流速で
通塔後、10mM Tris−HCl−0.5M NaClの緩
衝液を直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30mlかけて
同流速で溶出を行った。M−6S誘導体はpH7.0付近で
溶出された(収量2.5mg、収率38%)。純度は90%以上
であった。
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対して、エポルザイム(4120単位/mg蛋白
質) 協和発酵工業社製)を0.7μg添加し、25℃, 20時
間インキュベートした。NaCl濃度を0.5Mにした
後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl
で充たされたZnキレート セファロース(ファルマシ
ア・ファイン・ケミカル社製) (1.7cm×2.6cm)に6ml
/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tris−HC
l(pH8.0) −0.5M NaCl 12mlを3ml/時の流速で
通塔後、10mM Tris−HCl−0.5M NaClの緩
衝液を直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30mlかけて
同流速で溶出を行った。M−6S誘導体はpH7.0付近で
溶出された(収量2.5mg、収率38%)。純度は90%以上
であった。
【0146】実施例15. M−6Sの製造:表2の誘導体(b)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl100mM NaCl溶液(pH8.0)
50mlに対してズブチリシンアミロサッカリティカスを0.
7μg添加し、25℃,20時間インキュベートした。Na
Cl濃度を0.5Mにした後、10mMTris−HCl(pH
8.0)−0.5M NaClで充たされたZnキレート セフ
ァロース(ファルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.
7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10
mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12ml
を3ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH
8.0)−0.5M NaClの緩衝液系に直線勾配でpH8.0か
らpH6.0まで容 量30mlかけて同流速で溶出を行なっ
た。M−6S誘導体はpH7.0付近で溶出された(収量2.5
mg、収率38%)。純度は90%以上であった。 実施例16. M−6Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対してズブチリシン・カールスバーグ(0.034
単位/mg蛋白質)(NOVO社)を0.7μg添加し、25
℃,20時間インキュベートし た。NaCl濃度を0.5
Mにした後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M
NaClで充たされたZnキレート セファロース(フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6c
m)に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tri
s−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12mlを3ml/時
の流速で通塔後、10mMTris−HCl−0.5M NaC
lの緩衝液系に直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30
mlかけて同流速で溶出を行なった。M−6S誘導体はpH
7.0付近で溶出された(収量3mg、収率45%)。純度は9
0%以上であった。 実施例17. M−6Sの製造:表2の誘導体(a)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対して、プロテイナーゼK(0.027単位/mg−
蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添加し、25℃,40時
間インキュベートした。10mM Tris−HCl(pH8.
0)で3倍稀釈ののち、10mM Tris−HCl(pH8.
0)で充たされたDEAE−トヨパール650M(東洋曹達
工業社製)(1.7cm×4.4cm)に10ml/時の流速で通塔し
た。次いで10mM Tris−HCl(pH8.0)20mlを5ml
/時の流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH8.0)
の緩衝液系に直線勾配で0M NaClから0.4M Na
Clまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行なっ
た。M−6S誘導体はNaCl濃度100〜150mMで溶出さ
れた(収量2.6mg、収率39%)。純度は90%以上であっ
た。 実施例18. N末端第1〜5番欠失、17番セリンhG−CSF誘導体
(以後M−5Sと略す)の製造:表2の誘導体(b)(132
μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM Na
Cl溶液(pH8.0) 50mlに対して、トリプシン(267単位
/mg−蛋白質)(シグマ社製)を0.5μg添加し、25
℃,10時間インキュベートした。NaCl濃度を0.5M
にした後、10mM Tris−HCl(pH8.0) −0.5M N
aClで充たされたZnキレート セファロース(ファ
ルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)
に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tris
−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12mlを3ml/時の
流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5
M NaClの緩衝液系に直線勾配で0M から0.3Mま
でのイミダゾールを総容量30mlかけて加え、同流速で溶
出を行なった。M−5S誘導体は0.1M イミダゾールで
溶出された(収量2.7mg、収率41%)。純度は90%以上
であった。 実施例19. M−4Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0) 50mlに対して、トリプシン 267単位/mg−蛋白質
(シグマ社製)を5μg添加し、25℃, 20時間インキュ
ベートした。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM Tr
is−HCl(pH8.0)−0.5M NaClで充たされた
Znキレート セファロース(ファルマシア・ファイン
・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で
通塔した。次いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)−
0.5M NaCl 12ml を3ml/時の流速で通塔後、10mM
Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaClの緩衝液
系に直線勾配で0M から0.3M までのイミダゾールを
総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。M−
4S誘導体は0.1M イミダゾールで溶出された(収量2.
7mg、収率41%)。純度は90%以上であった。 実施例20. M−4Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0) 50mlに対してα−キモトリプシン267単位/mg−蛋白
質(シグマ社製)を5μg添加し、25℃,20時間インキ
ュベートした。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM T
ris−HCl(pH8.0)−0.5M NaClで充たされ
たZnキレート セファロース(ファルマシア・ファイ
ン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速
で通塔した。次いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)
−0.5M NaCl 12ml を3ml/時の流速で通塔後、10
mM Tris−HCl(pH8.0) −0.5M NaClの緩衝
液系に直線勾配で0M から0.3M までのイミダゾール
を総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。M
−4S誘導体は0.1M イミダゾールで溶出された(収量
2.3mg、収率35%)。純度は90%以上であった。
む10mM Tris−HCl100mM NaCl溶液(pH8.0)
50mlに対してズブチリシンアミロサッカリティカスを0.
7μg添加し、25℃,20時間インキュベートした。Na
Cl濃度を0.5Mにした後、10mMTris−HCl(pH
8.0)−0.5M NaClで充たされたZnキレート セフ
ァロース(ファルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.
7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10
mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12ml
を3ml/時の流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH
8.0)−0.5M NaClの緩衝液系に直線勾配でpH8.0か
らpH6.0まで容 量30mlかけて同流速で溶出を行なっ
た。M−6S誘導体はpH7.0付近で溶出された(収量2.5
mg、収率38%)。純度は90%以上であった。 実施例16. M−6Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対してズブチリシン・カールスバーグ(0.034
単位/mg蛋白質)(NOVO社)を0.7μg添加し、25
℃,20時間インキュベートし た。NaCl濃度を0.5
Mにした後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5M
NaClで充たされたZnキレート セファロース(フ
ァルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6c
m)に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tri
s−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12mlを3ml/時
の流速で通塔後、10mMTris−HCl−0.5M NaC
lの緩衝液系に直線勾配でpH8.0からpH6.0まで総容量30
mlかけて同流速で溶出を行なった。M−6S誘導体はpH
7.0付近で溶出された(収量3mg、収率45%)。純度は9
0%以上であった。 実施例17. M−6Sの製造:表2の誘導体(a)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0)50mlに対して、プロテイナーゼK(0.027単位/mg−
蛋白質)(シグマ社製)を0.7μg添加し、25℃,40時
間インキュベートした。10mM Tris−HCl(pH8.
0)で3倍稀釈ののち、10mM Tris−HCl(pH8.
0)で充たされたDEAE−トヨパール650M(東洋曹達
工業社製)(1.7cm×4.4cm)に10ml/時の流速で通塔し
た。次いで10mM Tris−HCl(pH8.0)20mlを5ml
/時の流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH8.0)
の緩衝液系に直線勾配で0M NaClから0.4M Na
Clまで総容量50mlかけて加え、同流速で溶出を行なっ
た。M−6S誘導体はNaCl濃度100〜150mMで溶出さ
れた(収量2.6mg、収率39%)。純度は90%以上であっ
た。 実施例18. N末端第1〜5番欠失、17番セリンhG−CSF誘導体
(以後M−5Sと略す)の製造:表2の誘導体(b)(132
μg/ml)を含む10mM Tris−HCl−100mM Na
Cl溶液(pH8.0) 50mlに対して、トリプシン(267単位
/mg−蛋白質)(シグマ社製)を0.5μg添加し、25
℃,10時間インキュベートした。NaCl濃度を0.5M
にした後、10mM Tris−HCl(pH8.0) −0.5M N
aClで充たされたZnキレート セファロース(ファ
ルマシア・ファイン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)
に6ml/時の流速で通塔した。次いで、10mM Tris
−HCl(pH8.0)−0.5M NaCl 12mlを3ml/時の
流速で通塔後、10mM Tris−HCl(pH8.0)−0.5
M NaClの緩衝液系に直線勾配で0M から0.3Mま
でのイミダゾールを総容量30mlかけて加え、同流速で溶
出を行なった。M−5S誘導体は0.1M イミダゾールで
溶出された(収量2.7mg、収率41%)。純度は90%以上
であった。 実施例19. M−4Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0) 50mlに対して、トリプシン 267単位/mg−蛋白質
(シグマ社製)を5μg添加し、25℃, 20時間インキュ
ベートした。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM Tr
is−HCl(pH8.0)−0.5M NaClで充たされた
Znキレート セファロース(ファルマシア・ファイン
・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速で
通塔した。次いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)−
0.5M NaCl 12ml を3ml/時の流速で通塔後、10mM
Tris−HCl(pH8.0)−0.5M NaClの緩衝液
系に直線勾配で0M から0.3M までのイミダゾールを
総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。M−
4S誘導体は0.1M イミダゾールで溶出された(収量2.
7mg、収率41%)。純度は90%以上であった。 実施例20. M−4Sの製造:表2の誘導体(d)(132μg/ml)を含
む10mM Tris−HCl−100mM NaCl溶液(pH8.
0) 50mlに対してα−キモトリプシン267単位/mg−蛋白
質(シグマ社製)を5μg添加し、25℃,20時間インキ
ュベートした。NaCl濃度を0.5Mにした後、10mM T
ris−HCl(pH8.0)−0.5M NaClで充たされ
たZnキレート セファロース(ファルマシア・ファイ
ン・ケミカル社製)(1.7cm×2.6cm)に6ml/時の流速
で通塔した。次いで、10mM Tris−HCl(pH8.0)
−0.5M NaCl 12ml を3ml/時の流速で通塔後、10
mM Tris−HCl(pH8.0) −0.5M NaClの緩衝
液系に直線勾配で0M から0.3M までのイミダゾール
を総容量30mlかけて加え、同流速で溶出を行なった。M
−4S誘導体は0.1M イミダゾールで溶出された(収量
2.3mg、収率35%)。純度は90%以上であった。
【0147】実施例21.実施例10−20に認められたよ
うに、17番目がセリンに置換し、しかもN末端アミノ酸
が、4個欠失(M−4S)、5個欠失(M−5S)、6
個欠失(M−6S)、そして7個欠失(M−7S)され
たhG−CSF誘導体が得られる。一般に組換えDNA
技術を用いる場合、N末端にメチオニンが付加される。
これが、組換え型産物の1つの欠点である。しかし、本
発明の酵素切断法を用いれば、N末端にメチオニンが付
加されずに製造できるので有利である。
うに、17番目がセリンに置換し、しかもN末端アミノ酸
が、4個欠失(M−4S)、5個欠失(M−5S)、6
個欠失(M−6S)、そして7個欠失(M−7S)され
たhG−CSF誘導体が得られる。一般に組換えDNA
技術を用いる場合、N末端にメチオニンが付加される。
これが、組換え型産物の1つの欠点である。しかし、本
発明の酵素切断法を用いれば、N末端にメチオニンが付
加されずに製造できるので有利である。
【0148】このように取得された誘導体のG−CSF
活性を測定し比較した。結果を表7に示す。
活性を測定し比較した。結果を表7に示す。
【0149】
【表7】
【0150】表7の結果より、N末端側アミノ酸4〜7
欠失体については、すべて、インタクトhG−CSFに
比べ、in vitroの評価において2〜4倍の高活性が見い
出された。したがって、本発明より製造できるN末端側
アミノ酸欠失体はN末端側にメチオニンが付加されず、
しかもインタクトより2〜4倍高活性を有するものであ
る。
欠失体については、すべて、インタクトhG−CSFに
比べ、in vitroの評価において2〜4倍の高活性が見い
出された。したがって、本発明より製造できるN末端側
アミノ酸欠失体はN末端側にメチオニンが付加されず、
しかもインタクトより2〜4倍高活性を有するものであ
る。
【0151】N末端部の変異による加水分解酵素に対す
る切断反応性(感受性)の獲得について以下の例で示
す。 実験例1. インタクトのhG−CSFとN末端変異hG−CSFと
のズブチリシン・カールスバーグに対する反応性の比較 実施例16と同様にして、表2の誘導体とインタクトのh
G−CSFをズブチリシン・カールスバーグ(NOVO
社)3.6×10-4単位/mg−G−CSF存在下に14時間、2
5℃でインキュベートしたところ、表2の誘導体からは
M−6S誘導体が得られたが、インタクトhG−CSF
は未反応であった。さらに、酵素量100倍(3.6×10-2単
位/mg−G−CSF)にしても、インタクトでは、M−
6Sの生成はなく全体的な分解反応が優先した。 実験例2. インタクトのhG−CSFとN末端変異hG−CSFと
のトリプシンに対する反応性の比較 実施例19と同様にして、表2の誘導体(a)とインタクト
hG−CSFをトリプシン(シグマ社)0.22単位/mg−
G−CSFの存在下に20時間,25℃でインキュベートし
たところ、表2の誘導体(a)からはM−4S誘導体が得
られたが、インタクトhG−CSFは未反応であった。
さらに、酵素量100倍(22単位/mg−G−CSF)にし
ても、インタクトhG−CSFではM−4Sの生成はな
く全体的な分解反応が優先した。 実験例3. hG−CSF誘導体の熱安定性:表8に示した本発明の
各種誘導体20μgをリン酸緩衝液−生理食塩水(PB
S)(pH7.2)または10%牛胎児血清(FBS)添加α
−MEM培地1mlに溶解させた。56℃でインキュベート
し、経時的にサンプル採取を行い、そのCSF活性を、
マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成試験(前記岡部ら
の方法)で測定した。
る切断反応性(感受性)の獲得について以下の例で示
す。 実験例1. インタクトのhG−CSFとN末端変異hG−CSFと
のズブチリシン・カールスバーグに対する反応性の比較 実施例16と同様にして、表2の誘導体とインタクトのh
G−CSFをズブチリシン・カールスバーグ(NOVO
社)3.6×10-4単位/mg−G−CSF存在下に14時間、2
5℃でインキュベートしたところ、表2の誘導体からは
M−6S誘導体が得られたが、インタクトhG−CSF
は未反応であった。さらに、酵素量100倍(3.6×10-2単
位/mg−G−CSF)にしても、インタクトでは、M−
6Sの生成はなく全体的な分解反応が優先した。 実験例2. インタクトのhG−CSFとN末端変異hG−CSFと
のトリプシンに対する反応性の比較 実施例19と同様にして、表2の誘導体(a)とインタクト
hG−CSFをトリプシン(シグマ社)0.22単位/mg−
G−CSFの存在下に20時間,25℃でインキュベートし
たところ、表2の誘導体(a)からはM−4S誘導体が得
られたが、インタクトhG−CSFは未反応であった。
さらに、酵素量100倍(22単位/mg−G−CSF)にし
ても、インタクトhG−CSFではM−4Sの生成はな
く全体的な分解反応が優先した。 実験例3. hG−CSF誘導体の熱安定性:表8に示した本発明の
各種誘導体20μgをリン酸緩衝液−生理食塩水(PB
S)(pH7.2)または10%牛胎児血清(FBS)添加α
−MEM培地1mlに溶解させた。56℃でインキュベート
し、経時的にサンプル採取を行い、そのCSF活性を、
マウス骨髄細胞を用いたコロニー形成試験(前記岡部ら
の方法)で測定した。
【0152】各サンプルは40ng/mlより2段階稀釈法で
10段階の稀釈を行い、各段階の測定を行い、良好な用量
反応(Dose response) を与える任意の濃度での活性を加
熱前(0分)と比較することにより残存活性を求めた。
PBS中または10%FBS添加α−MEM培地中での残
存活性(熱安定性に対応する)をそれぞれ表8(A)お
よび(B)に示す。
10段階の稀釈を行い、各段階の測定を行い、良好な用量
反応(Dose response) を与える任意の濃度での活性を加
熱前(0分)と比較することにより残存活性を求めた。
PBS中または10%FBS添加α−MEM培地中での残
存活性(熱安定性に対応する)をそれぞれ表8(A)お
よび(B)に示す。
【0153】
【表8】
【0154】実施例22. 部位特異的変異を用いたpCfBD28A17,pCfBD
28T17の造成(図17参照): (a) 鋳型一本鎖DNA(一本鎖pt19BD28N)の造
成:実施例6(4) の方法で得たpCfBD28 3μgを5
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BanIII
(東洋紡績社製)とPstIをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で2時間切断反応を行った。この反応液からL
GT法により、hG−CSF誘導体(ND28)のN末部
分をコードする約210bpのDNA断片(BanIII−Ps
tI断片)約0.1μgを得た。
28T17の造成(図17参照): (a) 鋳型一本鎖DNA(一本鎖pt19BD28N)の造
成:実施例6(4) の方法で得たpCfBD28 3μgを5
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素BanIII
(東洋紡績社製)とPstIをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で2時間切断反応を行った。この反応液からL
GT法により、hG−CSF誘導体(ND28)のN末部
分をコードする約210bpのDNA断片(BanIII−Ps
tI断片)約0.1μgを得た。
【0155】一方、M13ファージベクターであるM13m
p19RFDNA(宝酒造社製)1μgを全量50μlのY
−50緩衝液に溶かし、制限酵素AccI(東洋紡績社
製)を10単位加え、37℃,2時間切断反応を行った。そ
の後、NaCl濃度が100mMになるようにNaClを添
加し、制限酵素PstIを10単位加え37℃,2時間切断
反応を行った。この反応液からLGT法により約7.24kb
のDNA断片(AccI−PstI断片)約0.8μgを
得た。
p19RFDNA(宝酒造社製)1μgを全量50μlのY
−50緩衝液に溶かし、制限酵素AccI(東洋紡績社
製)を10単位加え、37℃,2時間切断反応を行った。そ
の後、NaCl濃度が100mMになるようにNaClを添
加し、制限酵素PstIを10単位加え37℃,2時間切断
反応を行った。この反応液からLGT法により約7.24kb
のDNA断片(AccI−PstI断片)約0.8μgを
得た。
【0156】上記で得たBanIII−PstI断片(約2
10bp)0.2μgと、AccI−PstI断片(約7.24k
b)0.05μgをT4リガーゼ緩衝液50μlに溶かし、こ
の混合液にT4DNAリガーゼ10単位を加え12℃,16時
間結合反応を行った。次に、公知の方法に従い、上記反
応液を用いて大腸菌JM105株をトランスフェクション
し、組換え体ファージを得た。この組換え体ファージの
感染した大腸菌JM105株の培養菌体より、プラスミド
DNA回収法に準じて、組換え体M13ファージRFDN
Aを回収した。このRFDNA(これをpt19BD28N
と呼ぶ)の構造は、PstI,EcoRI,AvaI,
XhoIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より確認した。そこでこの組換え体ファージより、公知
の方法に従って一本鎖pt19BD28Nを回収し鋳型とし
た。 (b) ギャップト・デュプレックスDNA(Gapped Duple
x DNA)の造成:M13mp19RFDNA(宝酒造社
製)3μgを30μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵
素EcoRIとHindIIIをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で2時間切断反応を行った。この反応液からL
GT法により約7.2kbのDNA断片(EcoRI−Hi
ndIII断片)約2.5μgを得た。
10bp)0.2μgと、AccI−PstI断片(約7.24k
b)0.05μgをT4リガーゼ緩衝液50μlに溶かし、こ
の混合液にT4DNAリガーゼ10単位を加え12℃,16時
間結合反応を行った。次に、公知の方法に従い、上記反
応液を用いて大腸菌JM105株をトランスフェクション
し、組換え体ファージを得た。この組換え体ファージの
感染した大腸菌JM105株の培養菌体より、プラスミド
DNA回収法に準じて、組換え体M13ファージRFDN
Aを回収した。このRFDNA(これをpt19BD28N
と呼ぶ)の構造は、PstI,EcoRI,AvaI,
XhoIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より確認した。そこでこの組換え体ファージより、公知
の方法に従って一本鎖pt19BD28Nを回収し鋳型とし
た。 (b) ギャップト・デュプレックスDNA(Gapped Duple
x DNA)の造成:M13mp19RFDNA(宝酒造社
製)3μgを30μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵
素EcoRIとHindIIIをそれぞれ10単位ずつ加
え、37℃で2時間切断反応を行った。この反応液からL
GT法により約7.2kbのDNA断片(EcoRI−Hi
ndIII断片)約2.5μgを得た。
【0157】このmp19RFDNA由来のEcoRI−
HindIII断片(約7.2kb)と前項で得た鋳型一本鎖D
NA,pt19BD28N1μgをクレノー緩衝液27μlに
溶かし、100℃で6分間煮沸することによりDNAを変
性させた。その後、65℃で10分間、37℃で40分間,4℃
で40分間、氷中で10分間放置し、アニール反応を行い鋳
型中のG−SCF遺伝子部分だけが一本鎖となったギャ
ップト・デュプレックスDNAを生成させた。生成した
ギャップト・デュプレックスDNAはLGT法により回
収した。 (c) 突然変異誘発(pt19BD28NA17,pt19BD28
NT17の造成):実施例6で得たhG−CSF誘導体
〔ND28〕のN末端から17番目のアミノ酸であるSer
をAlaに置換するために必要な一本鎖DNA(これを
D−1と呼ぶ)および同SerをThrに置換するため
に必要な一本鎖DNA(これをD−2と呼ぶ)を通常の
トリエステル法により合成した。D−1(33−mer)およ
びD−2(33−mer)の塩基配列を下に示す。
HindIII断片(約7.2kb)と前項で得た鋳型一本鎖D
NA,pt19BD28N1μgをクレノー緩衝液27μlに
溶かし、100℃で6分間煮沸することによりDNAを変
性させた。その後、65℃で10分間、37℃で40分間,4℃
で40分間、氷中で10分間放置し、アニール反応を行い鋳
型中のG−SCF遺伝子部分だけが一本鎖となったギャ
ップト・デュプレックスDNAを生成させた。生成した
ギャップト・デュプレックスDNAはLGT法により回
収した。 (c) 突然変異誘発(pt19BD28NA17,pt19BD28
NT17の造成):実施例6で得たhG−CSF誘導体
〔ND28〕のN末端から17番目のアミノ酸であるSer
をAlaに置換するために必要な一本鎖DNA(これを
D−1と呼ぶ)および同SerをThrに置換するため
に必要な一本鎖DNA(これをD−2と呼ぶ)を通常の
トリエステル法により合成した。D−1(33−mer)およ
びD−2(33−mer)の塩基配列を下に示す。
【0158】
【化19】
【0159】D−1を用いた突然変異誘発によりStu
Iサイトが、D−2を用いた突然変異誘発によりXba
Iサイトが新たに生じるようにデザインされているた
め、突然変異が導入されたものをこれらの制限酵素によ
る切断で確認することができる。D−1,D−2それぞ
れ1μgを別個に50μlのT4キナーゼ緩衝液に溶か
し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加えて37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
Iサイトが、D−2を用いた突然変異誘発によりXba
Iサイトが新たに生じるようにデザインされているた
め、突然変異が導入されたものをこれらの制限酵素によ
る切断で確認することができる。D−1,D−2それぞ
れ1μgを別個に50μlのT4キナーゼ緩衝液に溶か
し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ30単位を加えて37℃
で60分間リン酸化反応を行った。
【0160】次に、このリン酸化したD−1あるいはD
−2の0.2μgと前項で得たギャップト・デュプレック
スDNA0.1μgを6.5mM Tris−HCl(pH7.5),
8mMMgCl2,1mM 2−メルカプトエタノールおよび1
00mM NaClを含む緩衝液34μlに溶かし、65℃で60
分間、室温で30分間放置し、D−1あるいはD−2をギ
ャップト・デュプレックスDNAにアニールさせた。
−2の0.2μgと前項で得たギャップト・デュプレック
スDNA0.1μgを6.5mM Tris−HCl(pH7.5),
8mMMgCl2,1mM 2−メルカプトエタノールおよび1
00mM NaClを含む緩衝液34μlに溶かし、65℃で60
分間、室温で30分間放置し、D−1あるいはD−2をギ
ャップト・デュプレックスDNAにアニールさせた。
【0161】この溶液にdATP,dTTP,dCT
P,dGTPをそれぞれ0.5mMになるように加えた後、
1.5単位のDNAポリメラーゼI・クレノー断片と10単
位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,16時間の伸長反
応を行った。該反応液を用いて大腸菌JM105をトラン
スフェクションし、変異導入ファージを得た。変異導入
ファージの感染した大腸菌JM105よりRFDNAを回
収し、AvaI,XhoI,StuI(D−1を用いた
場合)あるいはXbaI(D−2を用いた場合)で切断
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
D−1により変異を導入したRFDNAをpt19BD28
NA17,D−2により変異を導入したRFDNAをpt
19BD28NT17とよぶ。pt19BD28NA17のStuI
サイト付近およびpt19BD28NT17のXbaIサイト
付近の塩基配列は下記のとおりであることを、M13ファ
ージを用いたデイデオキシ・シークエンス法で確認し
た。
P,dGTPをそれぞれ0.5mMになるように加えた後、
1.5単位のDNAポリメラーゼI・クレノー断片と10単
位のT4DNAリガーゼを加え、4℃,16時間の伸長反
応を行った。該反応液を用いて大腸菌JM105をトラン
スフェクションし、変異導入ファージを得た。変異導入
ファージの感染した大腸菌JM105よりRFDNAを回
収し、AvaI,XhoI,StuI(D−1を用いた
場合)あるいはXbaI(D−2を用いた場合)で切断
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
D−1により変異を導入したRFDNAをpt19BD28
NA17,D−2により変異を導入したRFDNAをpt
19BD28NT17とよぶ。pt19BD28NA17のStuI
サイト付近およびpt19BD28NT17のXbaIサイト
付近の塩基配列は下記のとおりであることを、M13ファ
ージを用いたデイデオキシ・シークエンス法で確認し
た。
【0162】
【化20】
【0163】(d) pCfBD28A17およびpCfBD28
T17Tの造成:前項で得たpt19BD28NA17あるいは
pt19BD28NT173μgを50μlのY−100緩衝液に溶
かし、制限酵素AvaIおよびXhoIをそれぞれ10単
位加え37℃で2時間切断反応を行った。反応液からLG
T法により、前項で導入した変異部位を含む約110bpの
DNA断片(AvaI−XhoI断片)を0.05μg得
た。
T17Tの造成:前項で得たpt19BD28NA17あるいは
pt19BD28NT173μgを50μlのY−100緩衝液に溶
かし、制限酵素AvaIおよびXhoIをそれぞれ10単
位加え37℃で2時間切断反応を行った。反応液からLG
T法により、前項で導入した変異部位を含む約110bpの
DNA断片(AvaI−XhoI断片)を0.05μg得
た。
【0164】一方、実施例6の(4)で得たpCfBD28
2μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素X
hoIとBglIIをそれぞれ10単位ずつ加え37℃で2時
間切断反応を行った。この反応液からLGT法により、
トリプトファンプロモーター部分を含む約2.74kbのDN
A断片(XhoI−BglII断片)を約1μg得た。ま
た、pCfBD282μgを50μlのY−100緩衝液に溶か
し、制限酵素BglIIを10単位加え37℃で2時間切断反
応を行った。アガロースゲル電気泳動でBglII切断が
完全に行われていることを確認した後に、制限酵素Av
aIを5単位加え37℃で10分間部分切断反応を行った。
この反応液からLGT法により、成熟型hG−CSFc
DNAの大部分とlppターミネーター部分を含む約1.
29kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を0.4μ
g得た。
2μgを50μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素X
hoIとBglIIをそれぞれ10単位ずつ加え37℃で2時
間切断反応を行った。この反応液からLGT法により、
トリプトファンプロモーター部分を含む約2.74kbのDN
A断片(XhoI−BglII断片)を約1μg得た。ま
た、pCfBD282μgを50μlのY−100緩衝液に溶か
し、制限酵素BglIIを10単位加え37℃で2時間切断反
応を行った。アガロースゲル電気泳動でBglII切断が
完全に行われていることを確認した後に、制限酵素Av
aIを5単位加え37℃で10分間部分切断反応を行った。
この反応液からLGT法により、成熟型hG−CSFc
DNAの大部分とlppターミネーター部分を含む約1.
29kbのDNA断片(BglII−AvaI断片)を0.4μ
g得た。
【0165】次に上記で得たpCfBD28由来のXho
I−BglII断片(約2.74kb)0.1μgおよびBglII−
AvaI断片(約1.29kb)とpt19BD28NA17あるい
はpt19BD28NT17のAvaI−XhoI断片(約11
0bp)0.02μgをT4リガーゼ緩衝液60μlに溶かし、1
0単位のT4DNAリガーゼを加え、12℃で16時間結合
反応を行った。
I−BglII断片(約2.74kb)0.1μgおよびBglII−
AvaI断片(約1.29kb)とpt19BD28NA17あるい
はpt19BD28NT17のAvaI−XhoI断片(約11
0bp)0.02μgをT4リガーゼ緩衝液60μlに溶かし、1
0単位のT4DNAリガーゼを加え、12℃で16時間結合
反応を行った。
【0166】該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質
転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養
菌体よりプラスミドDNAを回収した。pt19BD28N
A17を用いて造成したプラスミドをpCfBD28A17,
pt19BD28NT17を用いて造成したプラスミドをpC
fBD28T17と呼ぶ。pCfBD28A17の構造は、Av
aI,XhoI,BglII,StuIで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動により確認した。また、pCfBD28
T17の構造はAvaI,XhoI,BglII,XbaI
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
転換し、Apr のコロニーを得た。このコロニーの培養
菌体よりプラスミドDNAを回収した。pt19BD28N
A17を用いて造成したプラスミドをpCfBD28A17,
pt19BD28NT17を用いて造成したプラスミドをpC
fBD28T17と呼ぶ。pCfBD28A17の構造は、Av
aI,XhoI,BglII,StuIで切断後、アガロ
ースゲル電気泳動により確認した。また、pCfBD28
T17の構造はAvaI,XhoI,BglII,XbaI
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
【0167】これら2つのプラスミドがコードするhG
−CSF誘導体は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べ
て以下のようにアミノ酸残基が置換されている。
−CSF誘導体は、それぞれ成熟型hG−CSFに比べ
て以下のようにアミノ酸残基が置換されている。
【0168】
【表9】
【0169】pCfBD28A17およびpCfBD28T17
にコードされるhG−CSF誘導体を以後、それぞれh
G−CSF〔ND28A17〕,hG−CSF〔ND28T1
7〕と呼ぶ。 参考例1. hG−CSFcDNAを運ぶプラスミドpCSF1−2
の単離 (1) 正常人末梢血マクロファージからのポリ(A)RN
Aの調製:正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球
をプラスチックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄
・除去することにより、接着性の細胞であるマクロファ
ージを単離した。このマクロファージより、チオシアン
酸グアニジン−塩化リチウム法〔カサラ(Cathala) ら:
ディーエヌエイ(DNA)2, 329 (1983) 〕に従い、ポ
リ(A)を有するRNAを下記のごとく調製した。
にコードされるhG−CSF誘導体を以後、それぞれh
G−CSF〔ND28A17〕,hG−CSF〔ND28T1
7〕と呼ぶ。 参考例1. hG−CSFcDNAを運ぶプラスミドpCSF1−2
の単離 (1) 正常人末梢血マクロファージからのポリ(A)RN
Aの調製:正常人の末梢血より遠心分離して得た白血球
をプラスチックボトルで培養し、非接着性の細胞を洗浄
・除去することにより、接着性の細胞であるマクロファ
ージを単離した。このマクロファージより、チオシアン
酸グアニジン−塩化リチウム法〔カサラ(Cathala) ら:
ディーエヌエイ(DNA)2, 329 (1983) 〕に従い、ポ
リ(A)を有するRNAを下記のごとく調製した。
【0170】正常人の末梢血400mlをHitachi RPR10 ロ
ーターにて1800rpm 、20分間遠心して血球を沈殿させ、
これを50mlリン酸緩衝食塩水〔NaCl 8g/l、K
Cl0.2g/l、無水Na2HPO4 1.15g/l、KH2
PO4 0.2g/l(pH7.2);以下PBSと略記する〕に
懸濁した。この懸濁液25mlをリンパ球分離液〔ビオネテ
ィクス(BIONETICS)社製〕25mlに重層し、Hitachi RPR1
0 ローターにて1800rpm 、30分間遠心した。中間層の白
血球を分取し、等量のPBSで洗浄(HitachiRPR10 ロ
ーターにて1500rpm 、10分間)した後、5%の仔牛胎児
血清を含む20mlのRPMI1640培地 (日水製薬社製)
に、懸濁し培養した。培養には組織培養用フラスコ(コ
ーニング社製)を用いた。37℃で1.5時間培養した後、
培養上清を非接着性の細胞とともに除去した。新たに20
mlの同培地と大腸菌リポ多糖(LPS)を0.3mg/mlとなる
ように加え、さらに37℃で4時間培養した。次いで、培
養液より 1100×g、4℃、10分間の遠心によって細胞
を集め、80mlのPBSで洗浄した後、5Mチオシアン酸
グアニジン、10mM EDTA、50mM Tris−HCl
(pH7.0)および8%(v/v)2−メルカプトエタノール
からなる溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可
溶化した。この可溶化物を遠心管に移し4M LiCl
溶液80mlを加えて攪拌した後、4℃、20時間静置した。
Hitach- i RPR10ローターにて9000rpm 、90分間遠心
後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈殿を4M
尿素および2M塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁
し、Hitachi RPR10 ローターにて9000rpm、60分間遠心
後、再びRNAを沈殿として回収した。
ーターにて1800rpm 、20分間遠心して血球を沈殿させ、
これを50mlリン酸緩衝食塩水〔NaCl 8g/l、K
Cl0.2g/l、無水Na2HPO4 1.15g/l、KH2
PO4 0.2g/l(pH7.2);以下PBSと略記する〕に
懸濁した。この懸濁液25mlをリンパ球分離液〔ビオネテ
ィクス(BIONETICS)社製〕25mlに重層し、Hitachi RPR1
0 ローターにて1800rpm 、30分間遠心した。中間層の白
血球を分取し、等量のPBSで洗浄(HitachiRPR10 ロ
ーターにて1500rpm 、10分間)した後、5%の仔牛胎児
血清を含む20mlのRPMI1640培地 (日水製薬社製)
に、懸濁し培養した。培養には組織培養用フラスコ(コ
ーニング社製)を用いた。37℃で1.5時間培養した後、
培養上清を非接着性の細胞とともに除去した。新たに20
mlの同培地と大腸菌リポ多糖(LPS)を0.3mg/mlとなる
ように加え、さらに37℃で4時間培養した。次いで、培
養液より 1100×g、4℃、10分間の遠心によって細胞
を集め、80mlのPBSで洗浄した後、5Mチオシアン酸
グアニジン、10mM EDTA、50mM Tris−HCl
(pH7.0)および8%(v/v)2−メルカプトエタノール
からなる溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可
溶化した。この可溶化物を遠心管に移し4M LiCl
溶液80mlを加えて攪拌した後、4℃、20時間静置した。
Hitach- i RPR10ローターにて9000rpm 、90分間遠心
後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈殿を4M
尿素および2M塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁
し、Hitachi RPR10 ローターにて9000rpm、60分間遠心
後、再びRNAを沈殿として回収した。
【0171】RNAの沈殿を0.1%ラウリル硫酸ナトリ
ウム、1mM EDTA、10mM Tris−HCl(pH7.
5)からなる溶液10mlに溶解し、フェノール−クロロホ
ルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られ
たRNA約0.8mgを10mM Tris−HCl(pH8.0)お
よび1mM EDTAからなる溶液1mlに溶かした。65
℃,5分間インキュベートし、0.1mlの5M NaClを
加えた。混合物をオリゴ(dT)セルロース・カラム
〔ピー・エル・バイオケミカル(P−L Biochemical)
社製〕クロマトグラフィー(カラム体積0.5ml)にかけ
た。吸着したポリ(A)を有するmRNAを10mM Tr
is−HCl(pH7.5)および1mM EDTAからなる溶
液で溶出し、ポリ(A)を有するmRNA約30μgを得
た。 (2) cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入:オカ
ヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.Cell.Biol.),
2,161 (1982)〕に従い、cDNAの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の
概略を図9に示す。
ウム、1mM EDTA、10mM Tris−HCl(pH7.
5)からなる溶液10mlに溶解し、フェノール−クロロホ
ルムで抽出後、エタノール沈殿により回収した。得られ
たRNA約0.8mgを10mM Tris−HCl(pH8.0)お
よび1mM EDTAからなる溶液1mlに溶かした。65
℃,5分間インキュベートし、0.1mlの5M NaClを
加えた。混合物をオリゴ(dT)セルロース・カラム
〔ピー・エル・バイオケミカル(P−L Biochemical)
社製〕クロマトグラフィー(カラム体積0.5ml)にかけ
た。吸着したポリ(A)を有するmRNAを10mM Tr
is−HCl(pH7.5)および1mM EDTAからなる溶
液で溶出し、ポリ(A)を有するmRNA約30μgを得
た。 (2) cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入:オカ
ヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.Cell.Biol.),
2,161 (1982)〕に従い、cDNAの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程の
概略を図9に示す。
【0172】pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ(O
kayama & Berg):モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジィ(Mol.Cell.Biol.),3,280 (1983)〕400μ
gを10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2
および10mM NaClからなる溶液300μlに加え、さら
に500単位のKpnIを加えて、37℃,6時間反応さ
せ、プラスミド中のKpnI部位で切断した。フェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を回収した。KpnI切断した該DNA約200μgを40m
M カコジル酸ナトリウム,30mM Tris−HCl(pH
6.8) ,1mM CaCl2 および0.1mM ジチオスレイトー
ル(以下DTTと略記する)からなる緩衝液(以下Td
T緩衝液と略記する)にdTTPを0.25mM となるよう
加えた溶液200μlに加え、さらに81単位のターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(以下Td
Tと略記する) (P-L Bioche-micals社製)を加えて、3
7℃,11分間反応させた。ここで、pCDV1のKpn
I切断部位の3'末端にポリ(dT)鎖が約67個付加さ
れた。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により、ポリ(dT)鎖の付加したpCDV
1DNA約100μgを回収した。該DNAを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2,100mM NaC
lからなる緩衝液150μlに加え、さらに360単位のEc
oRIを加え、37℃, 2時間反応させた。該反応物をL
GT法で処理後、約3.1kb のDNA断片を回収し、約60
μgのポリ(dT)鎖付加pCDV1を得た。該DNA
を10mM Tris−HCl(pH8.0)および1mM EDT
Aからなる溶液500μlに溶解し、65℃, 5分間インキ
ュベート後、氷冷して50μlの5M NaClを加え
た。混合物をオリゴ(dA)セルロースカラム(コラボ
ラティブリサーチ社製)クロマトグラフィーにかけた。
ポリ(dT)鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これ
を10mM Tris−HCl(pH8.0)および1mM EDT
Aからなる溶液で溶出し、ポリ(dT)鎖の付加したp
CD1(以下ベクタープライマーと略記する)27μgを
得た。
kayama & Berg):モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジィ(Mol.Cell.Biol.),3,280 (1983)〕400μ
gを10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2
および10mM NaClからなる溶液300μlに加え、さら
に500単位のKpnIを加えて、37℃,6時間反応さ
せ、プラスミド中のKpnI部位で切断した。フェノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を回収した。KpnI切断した該DNA約200μgを40m
M カコジル酸ナトリウム,30mM Tris−HCl(pH
6.8) ,1mM CaCl2 および0.1mM ジチオスレイトー
ル(以下DTTと略記する)からなる緩衝液(以下Td
T緩衝液と略記する)にdTTPを0.25mM となるよう
加えた溶液200μlに加え、さらに81単位のターミナル
デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(以下Td
Tと略記する) (P-L Bioche-micals社製)を加えて、3
7℃,11分間反応させた。ここで、pCDV1のKpn
I切断部位の3'末端にポリ(dT)鎖が約67個付加さ
れた。該溶液からフェノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により、ポリ(dT)鎖の付加したpCDV
1DNA約100μgを回収した。該DNAを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2,100mM NaC
lからなる緩衝液150μlに加え、さらに360単位のEc
oRIを加え、37℃, 2時間反応させた。該反応物をL
GT法で処理後、約3.1kb のDNA断片を回収し、約60
μgのポリ(dT)鎖付加pCDV1を得た。該DNA
を10mM Tris−HCl(pH8.0)および1mM EDT
Aからなる溶液500μlに溶解し、65℃, 5分間インキ
ュベート後、氷冷して50μlの5M NaClを加え
た。混合物をオリゴ(dA)セルロースカラム(コラボ
ラティブリサーチ社製)クロマトグラフィーにかけた。
ポリ(dT)鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これ
を10mM Tris−HCl(pH8.0)および1mM EDT
Aからなる溶液で溶出し、ポリ(dT)鎖の付加したp
CD1(以下ベクタープライマーと略記する)27μgを
得た。
【0173】次にリンカーDNAの調製を行った。pL
1〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okayama & Berg):
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.
Cell. Biol.), 3, 280 (1983)〕約14μgを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および50mM Na
Clからなる緩衝液200μlに加え、さらに50単位のP
stIを加え、37℃, 4時間反応させ、pL1DNA中
のPstI部位で切断させた。該反応物をフェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、PstI
で切断したpL1DNA約13μgを回収した。該DNA
約13μgをTdT緩衝液に終濃度0.25mM のdGTPを
含む溶液50μlに加え、さらにTdT(P-L Biochemica
ls社製)54単位を加えて37℃13分間インキュベートし、
pL1のPstI切断部位3’末端に(dG)鎖を約14
個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノー
ル沈殿にてDNAを回収した。該DNAを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM M gCl2および60mM N
aClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位の
HindIIIを加えて37℃, 3時間インキュベートし、
pL1DNAのHindIII部位で切断した。該反応物
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb のDN
A断片をDEAEペーパー法〔ドレツェン(Dretzen)
ら:アナリティカル・バイオケミストリィ(Anal.Bioch
em.),112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ(dG)
鎖付きのリンカーDNA(以下単にリンカーDNAと略
記する)を得た。
1〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okayama & Berg):
モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol.
Cell. Biol.), 3, 280 (1983)〕約14μgを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および50mM Na
Clからなる緩衝液200μlに加え、さらに50単位のP
stIを加え、37℃, 4時間反応させ、pL1DNA中
のPstI部位で切断させた。該反応物をフェノール−
クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、PstI
で切断したpL1DNA約13μgを回収した。該DNA
約13μgをTdT緩衝液に終濃度0.25mM のdGTPを
含む溶液50μlに加え、さらにTdT(P-L Biochemica
ls社製)54単位を加えて37℃13分間インキュベートし、
pL1のPstI切断部位3’末端に(dG)鎖を約14
個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタノー
ル沈殿にてDNAを回収した。該DNAを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM M gCl2および60mM N
aClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位の
HindIIIを加えて37℃, 3時間インキュベートし、
pL1DNAのHindIII部位で切断した。該反応物
をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb のDN
A断片をDEAEペーパー法〔ドレツェン(Dretzen)
ら:アナリティカル・バイオケミストリィ(Anal.Bioch
em.),112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ(dG)
鎖付きのリンカーDNA(以下単にリンカーDNAと略
記する)を得た。
【0174】上記で調製したポリ(A)RNA約3μ
g,ベクタープライマー約1.4μgを50mM Tris−H
Cl(pH8.3),8mM MgCl2, 30mM KCl,0.3mM D
TT,2mM dNTP(dATP,dTTP,dGTP
およびdCTP)および10単位のリボヌクレアーゼイン
ヒビター(P-L Biochemicals社製)からなる溶液22.3μ
lに溶解し、10単位の逆転写酵素(生化学工業社製)を
加え、41℃90分間インキュベートし、mRNAに相補的
なDNAを合成させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、RNA−DNA二
重鎖の付加したベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを66μM dCTPおよび0.2μgポリ(A)を
含むTdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のTdT(P-
L Bio-chemicals 社製)を加えて37℃2分間インキュベ
ートし、cDNA3’末端に20個の(dC)鎖を付加し
た。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈殿により(dC)鎖の付加したcDNA−ベク
タープライマーDNAを回収した。該DNAを10mM T
ris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および60mM
NaClからなる液400μlに溶かし、20単位のHin
dIIIを加え、37℃, 2時間インキュベートし、Hin
dIII部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモルの(dC)
鎖付加cDNA−ベクタープライマーDNAを得た。
該DNA0.2ピコモルおよび前記のリンカーDNA 0.4
ピコモルを10mM Tris−HCl(pH7.5), 0.1M Na
Clおよび1mM EDTAからなる溶液100μlに溶か
し、65℃,42℃,0℃でそれぞれ10分,25分,30分間イ
ンキュベートした。20mM Tris−HCl(pH7.5),
4mMMgCl2,10mM (NH4)2SO4,0.1M KClお
よび0.1mM β−NADの組成で、全量1000μlとなるよ
う反応液を調製した。該反応液に25単位の大腸菌DNA
リガーゼ(ニューイングランド・バイオラブズ社製)を
加え、11℃, 18時間インキュベートした。該反応液を各
40μMのdNTP,0.15mM β−NADとなるよう成分
を追加調製し、10単位の大腸菌DNAリガーゼ,20単位
の大腸菌DNAポリメラーゼI(P-L Biochemicals社
製)および10単位の大腸菌リボヌクレアーゼH(P-L Bi
ochemicals社製)を加え、12℃,25℃で順次1時間ずつ
インキュベートした。上記反応で、cDNAを含む組換
えDNAの環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部
分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換え体
プラスミドが生成した。 (3) hG−CSFcDNAを含む組換えDNAの選択:
(2)で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌C600
SF8株をスコット(Scott) らの方法〔重定勝哉:細胞
工学 2 ,616(1983)〕に従い形質転換した。得られた約9
200個のコロニーをニトロセルロース・フィルター上に
固定した。長田ら〔長田(Nagata)ら: ネイチャー(Natur
e) 319 , 415(1986)〕が単離したhG−CSFの成熟タ
ンパク質のN末端9アミノ酸に相当する27塩基の合成D
NA5’−ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG −3’を32P
で標識したプローブに60℃で強く会合した1菌株を選ん
だ〔グルンステイン・ホグネス(Grunstein-Hogness)の
方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)
USA 72, 3961(1975)〕。この菌株がもつプラスミドpC
SF1−2が有するcDNAの全塩基配列を、M13ファ
ージを用いたディデオキシ・シークエンス法により決定
した(表1)。その結果、pCSF1−2が有するcD
NAは、hG−CSFをコードしていることが判明し
た。
g,ベクタープライマー約1.4μgを50mM Tris−H
Cl(pH8.3),8mM MgCl2, 30mM KCl,0.3mM D
TT,2mM dNTP(dATP,dTTP,dGTP
およびdCTP)および10単位のリボヌクレアーゼイン
ヒビター(P-L Biochemicals社製)からなる溶液22.3μ
lに溶解し、10単位の逆転写酵素(生化学工業社製)を
加え、41℃90分間インキュベートし、mRNAに相補的
なDNAを合成させた。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿を行い、RNA−DNA二
重鎖の付加したベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを66μM dCTPおよび0.2μgポリ(A)を
含むTdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のTdT(P-
L Bio-chemicals 社製)を加えて37℃2分間インキュベ
ートし、cDNA3’末端に20個の(dC)鎖を付加し
た。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈殿により(dC)鎖の付加したcDNA−ベク
タープライマーDNAを回収した。該DNAを10mM T
ris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および60mM
NaClからなる液400μlに溶かし、20単位のHin
dIIIを加え、37℃, 2時間インキュベートし、Hin
dIII部位で切断した。該反応物をフェノール−クロロ
ホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモルの(dC)
鎖付加cDNA−ベクタープライマーDNAを得た。
該DNA0.2ピコモルおよび前記のリンカーDNA 0.4
ピコモルを10mM Tris−HCl(pH7.5), 0.1M Na
Clおよび1mM EDTAからなる溶液100μlに溶か
し、65℃,42℃,0℃でそれぞれ10分,25分,30分間イ
ンキュベートした。20mM Tris−HCl(pH7.5),
4mMMgCl2,10mM (NH4)2SO4,0.1M KClお
よび0.1mM β−NADの組成で、全量1000μlとなるよ
う反応液を調製した。該反応液に25単位の大腸菌DNA
リガーゼ(ニューイングランド・バイオラブズ社製)を
加え、11℃, 18時間インキュベートした。該反応液を各
40μMのdNTP,0.15mM β−NADとなるよう成分
を追加調製し、10単位の大腸菌DNAリガーゼ,20単位
の大腸菌DNAポリメラーゼI(P-L Biochemicals社
製)および10単位の大腸菌リボヌクレアーゼH(P-L Bi
ochemicals社製)を加え、12℃,25℃で順次1時間ずつ
インキュベートした。上記反応で、cDNAを含む組換
えDNAの環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部
分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換え体
プラスミドが生成した。 (3) hG−CSFcDNAを含む組換えDNAの選択:
(2)で得られた組換え体プラスミドを用い、大腸菌C600
SF8株をスコット(Scott) らの方法〔重定勝哉:細胞
工学 2 ,616(1983)〕に従い形質転換した。得られた約9
200個のコロニーをニトロセルロース・フィルター上に
固定した。長田ら〔長田(Nagata)ら: ネイチャー(Natur
e) 319 , 415(1986)〕が単離したhG−CSFの成熟タ
ンパク質のN末端9アミノ酸に相当する27塩基の合成D
NA5’−ACCCCCCTGGGCCCTGCCAGCTCCCTG −3’を32P
で標識したプローブに60℃で強く会合した1菌株を選ん
だ〔グルンステイン・ホグネス(Grunstein-Hogness)の
方法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミイ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)
USA 72, 3961(1975)〕。この菌株がもつプラスミドpC
SF1−2が有するcDNAの全塩基配列を、M13ファ
ージを用いたディデオキシ・シークエンス法により決定
した(表1)。その結果、pCSF1−2が有するcD
NAは、hG−CSFをコードしていることが判明し
た。
【0175】この菌株は、前記のように Escherichia c
oli ECSF1−2〔FERM BP-1220〕として、微工研に
寄託されている。 参考例2. プラスミドpKYP26の分離精製 pKYP26を含む大腸菌〔Escherichia coli IKYP26 (F
ERM BP- 863)〕を50μg/mlのアンピシリンを含むL培
地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%N
aCl,pH7.5)10mlで37℃、18時間培養した。この培
養液全量を50μg/mlのアンピシリンを含むL培地1l
に植菌し、37℃で培養した。4時間後に、クロラムフェ
ニコールを170μg/mlとなるように加え、さらに37
℃、16時間培養した。遠心分離法(5000rpm 10分間)に
より集菌を行い、0.8%NaClで菌体を洗浄した後、5
0mM Tris−HCl(pH8.0)20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg/mlのリゾチームを8ml加え氷中に10分間静置
した後、0.5M EDTAを9.6ml加え、氷中に10分間静
置し、2%トリトンX−100(和光純薬工業社製)を2.3
ml 加え氷中にさらに1時間静置した。50000×gで4
℃、1時間超遠心分離を行い、上清約40mlを得た。次に
この上清に3MNaOHを加えpHを12.5として、室温で
10分間静かに攪拌した。2M Tris−HCl(pH7.
5)を加え、pHを8.5にもどし、さらに3分間攪拌した。
この時点で液の容量は約55mlであった。1/9容の5M
NaClを加えた後、フェノール抽出をを行った。1
/250容の5mg/mlRNase A(シグマ社製)を加
え、37℃、1時間RNA分解反応を行った後、1/5容
の5M NaClを加え、1/3容の30%PEG6000
(半井化学薬品社製)を加え−20℃に2時間静置した。
遠心分離法で沈殿を集め、10mMTris−HCl(pH7.
5)および1mM EDTAからなる液2mlに溶かし、ソジ
ウム・ドデシル・サルフェイト(SDS)を0.5%とな
るように加え、プロティナーゼK(シグマ社製)を50μ
g/mlとなるように加えて、37℃、1時間蛋白質分解反
応を行った。フェノール抽出を3回繰り返し行った後、
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱でDNAを回収
し、10mM Tris−HCl(pH7.5)および1mM ED
TAからなる液1mlに溶かした。このようにしてpKY
P26を800μg得ることができた。pKYP26の構造
は、EcoRI,KpnI,BamHI,BglII,P
stIで切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。 参考例3. 1) ヒトLTcDNAを運ぶプラスミドpLT1の単
離: (1) LukII細胞よりのポリ(A)RNAの調製:ヒト
リンパ芽球様細胞株LukIIより、チオシアン酸グアニ
ジン−塩化リチウム法〔カサラ(Cathala)ら:ディーエ
ヌエイ(DNA)2,329 (1983)〕に従い、ポリ(A)
を有するRNAを下記のごとく調製した。
oli ECSF1−2〔FERM BP-1220〕として、微工研に
寄託されている。 参考例2. プラスミドpKYP26の分離精製 pKYP26を含む大腸菌〔Escherichia coli IKYP26 (F
ERM BP- 863)〕を50μg/mlのアンピシリンを含むL培
地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%N
aCl,pH7.5)10mlで37℃、18時間培養した。この培
養液全量を50μg/mlのアンピシリンを含むL培地1l
に植菌し、37℃で培養した。4時間後に、クロラムフェ
ニコールを170μg/mlとなるように加え、さらに37
℃、16時間培養した。遠心分離法(5000rpm 10分間)に
より集菌を行い、0.8%NaClで菌体を洗浄した後、5
0mM Tris−HCl(pH8.0)20mlに懸濁し、氷冷し
た。10mg/mlのリゾチームを8ml加え氷中に10分間静置
した後、0.5M EDTAを9.6ml加え、氷中に10分間静
置し、2%トリトンX−100(和光純薬工業社製)を2.3
ml 加え氷中にさらに1時間静置した。50000×gで4
℃、1時間超遠心分離を行い、上清約40mlを得た。次に
この上清に3MNaOHを加えpHを12.5として、室温で
10分間静かに攪拌した。2M Tris−HCl(pH7.
5)を加え、pHを8.5にもどし、さらに3分間攪拌した。
この時点で液の容量は約55mlであった。1/9容の5M
NaClを加えた後、フェノール抽出をを行った。1
/250容の5mg/mlRNase A(シグマ社製)を加
え、37℃、1時間RNA分解反応を行った後、1/5容
の5M NaClを加え、1/3容の30%PEG6000
(半井化学薬品社製)を加え−20℃に2時間静置した。
遠心分離法で沈殿を集め、10mMTris−HCl(pH7.
5)および1mM EDTAからなる液2mlに溶かし、ソジ
ウム・ドデシル・サルフェイト(SDS)を0.5%とな
るように加え、プロティナーゼK(シグマ社製)を50μ
g/mlとなるように加えて、37℃、1時間蛋白質分解反
応を行った。フェノール抽出を3回繰り返し行った後、
クロロホルム抽出およびエタノール沈澱でDNAを回収
し、10mM Tris−HCl(pH7.5)および1mM ED
TAからなる液1mlに溶かした。このようにしてpKY
P26を800μg得ることができた。pKYP26の構造
は、EcoRI,KpnI,BamHI,BglII,P
stIで切断してアガロースゲル電気泳動で確認した。 参考例3. 1) ヒトLTcDNAを運ぶプラスミドpLT1の単
離: (1) LukII細胞よりのポリ(A)RNAの調製:ヒト
リンパ芽球様細胞株LukIIより、チオシアン酸グアニ
ジン−塩化リチウム法〔カサラ(Cathala)ら:ディーエ
ヌエイ(DNA)2,329 (1983)〕に従い、ポリ(A)
を有するRNAを下記のごとく調製した。
【0176】ヒトリンパ芽球様細胞株LukII〔ベリッ
シュ・ワイ・ルビン(Berish Y.Rubin) ら:プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 6637 (19
85) 〕を、5%の仔牛胎児血清と1mM N−2−ヒドロ
キシエチルピペラジン−N' −2−エタンスルフォン酸
(HEPES)を含む1lのRPMI1640培地(日水製
薬社製)に、8×105/mlとなるように接種し、増殖さ
せた。培養にはスピンナー・カルチャー・ボトルを用い
た。37℃で48時間培養した後、遠心によって細胞を集
め、10ng/mlのフォルボール・ミリステート・アセテー
ト(PMA;Phorbol myristate acetate)と5%の仔牛
胎児血清と1mM HEPESを含む、新しい1lのRP
MI1640培地に移し、さらに37℃で48時間培養した。続
いて、この細胞懸濁液の一部(250ml)から1100×g,
4℃,10分間の遠心によって細胞を集め、80mlのリン酸
塩バッファーで洗浄した後、5Mチオシアン酸グアニジ
ン,10mM EDTA,50mM Tris−HCl(pH7.0)
および8%(V/V) 2−メルカプトエタノールからなる
溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可溶化し
た。この可溶化物を遠心管に移し、4M LiCl溶液8
0mlを加えて攪拌した後、4℃,20時間静置した。Hitac
hi RPR10ローターにて9000rpm, 90分間遠心後、RN
Aを沈殿として回収した。RNAの沈殿を4M尿素およ
び2M塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁し、Hitach
i RPR10ローターにて9000rpm,60分間遠心後、再び
RNAを沈殿として回収した。RNAの沈殿を0.1%ラ
ウリル硫酸ナトリウム,1mM EDTA,10mM Tris
−HCl(pH7.5)からなる溶液10mlに溶解し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回
収した。得られたRNA約2.5mgを10mM Tris−HC
l(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液1mlに溶
かした。65℃,5分間インキュベートし、0.1ml の5M
NaClを加えた。混合物をオリゴ(dT)セルロース
・カラム〔ピー・エル・バイオケミカル(P-L Biochemi
cal) 社製〕クロマトグラフィー (カラム体積0.5ml)に
かけた。吸着したポリ(A)を有するmRNAを10mM
Tris−HCl(pH7.5)および1mM EDTAからな
る溶液で溶出し、ポリ(A)を有するmRNA約100μ
gを得た。 (2) cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入:オカ
ヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol. Cell. Biol.),
2, 161 (1982) 〕に従い、cDNAの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を図9に示す。
シュ・ワイ・ルビン(Berish Y.Rubin) ら:プロシーデ
ィング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.) USA 82, 6637 (19
85) 〕を、5%の仔牛胎児血清と1mM N−2−ヒドロ
キシエチルピペラジン−N' −2−エタンスルフォン酸
(HEPES)を含む1lのRPMI1640培地(日水製
薬社製)に、8×105/mlとなるように接種し、増殖さ
せた。培養にはスピンナー・カルチャー・ボトルを用い
た。37℃で48時間培養した後、遠心によって細胞を集
め、10ng/mlのフォルボール・ミリステート・アセテー
ト(PMA;Phorbol myristate acetate)と5%の仔牛
胎児血清と1mM HEPESを含む、新しい1lのRP
MI1640培地に移し、さらに37℃で48時間培養した。続
いて、この細胞懸濁液の一部(250ml)から1100×g,
4℃,10分間の遠心によって細胞を集め、80mlのリン酸
塩バッファーで洗浄した後、5Mチオシアン酸グアニジ
ン,10mM EDTA,50mM Tris−HCl(pH7.0)
および8%(V/V) 2−メルカプトエタノールからなる
溶液10ml中でボルテックス・ミキサーを用い可溶化し
た。この可溶化物を遠心管に移し、4M LiCl溶液8
0mlを加えて攪拌した後、4℃,20時間静置した。Hitac
hi RPR10ローターにて9000rpm, 90分間遠心後、RN
Aを沈殿として回収した。RNAの沈殿を4M尿素およ
び2M塩化リチウムからなる溶液50mlに懸濁し、Hitach
i RPR10ローターにて9000rpm,60分間遠心後、再び
RNAを沈殿として回収した。RNAの沈殿を0.1%ラ
ウリル硫酸ナトリウム,1mM EDTA,10mM Tris
−HCl(pH7.5)からなる溶液10mlに溶解し、フェノ
ール−クロロホルムで抽出後、エタノール沈殿により回
収した。得られたRNA約2.5mgを10mM Tris−HC
l(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液1mlに溶
かした。65℃,5分間インキュベートし、0.1ml の5M
NaClを加えた。混合物をオリゴ(dT)セルロース
・カラム〔ピー・エル・バイオケミカル(P-L Biochemi
cal) 社製〕クロマトグラフィー (カラム体積0.5ml)に
かけた。吸着したポリ(A)を有するmRNAを10mM
Tris−HCl(pH7.5)および1mM EDTAからな
る溶液で溶出し、ポリ(A)を有するmRNA約100μ
gを得た。 (2) cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入:オカ
ヤマ−バーグ(Okayama-Berg)の方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol. Cell. Biol.),
2, 161 (1982) 〕に従い、cDNAの合成とそれを組
み込んだ組換え体プラスミドの造成を行った。その工程
の概略を図9に示す。
【0177】pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ
(Okayama & Berg) :モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジィ(Mol. Cell. Biol.),3,280 (1983)〕
400μgを10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM Mg
Cl2 および10mM NaClからなる溶液300μlに加
え、さらに500単位のKpnIを加えて、37℃,6時間
反応させ、プラスミド中のKpnI部位で切断した。フ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
DNAを回収した。KpnI切断した該DNA約200μ
gをTdT緩衝液にdTTPを0.25mM となるよう加え
た溶液200μlに加え、さらに81単位のTdT(P-L Bioc
hemicals 社製) を加えて、37℃、11分間反応させた。
ここで、pCDV1のKpnI切断部位の3' 末端にポ
リ(dT)鎖が約67個付加された。該溶液からフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ
(dT)鎖の付加したpCDV1DNA約100μgを回
収した。該DNAを10mM Tris−HCl(pH7.5),
6mM MgCl2,100mM NaClからなる緩衝液150μ
lに加え、さらに360単位のEcoRIを加え、37℃,
2時間反応させた。該反応物をLGT法で処理後、約3.
1kb のDNA断片を回収し、約60μgのポリ(dT)鎖
付加pCDV1を得た。該DNAを10mM Tris−H
Cl(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液500μ
lに溶解し、65℃, 5分間インキュベート後、氷冷して
50μlの5M NaClを加えた。混合物をオリゴ(d
A)セルロースカラム(コラボラティブリサーチ社製)
クロマトグラフィーにかけた。ポリ(dT)鎖長が充分
なものはカラムに吸着し、これを10mM Tris−HC
l(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液で溶出
し、ポリ(dT)鎖の付加したpCDV1(以下ベクタ
ープライマーと略記する)27μgを得た。
(Okayama & Berg) :モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジィ(Mol. Cell. Biol.),3,280 (1983)〕
400μgを10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM Mg
Cl2 および10mM NaClからなる溶液300μlに加
え、さらに500単位のKpnIを加えて、37℃,6時間
反応させ、プラスミド中のKpnI部位で切断した。フ
ェノール−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
DNAを回収した。KpnI切断した該DNA約200μ
gをTdT緩衝液にdTTPを0.25mM となるよう加え
た溶液200μlに加え、さらに81単位のTdT(P-L Bioc
hemicals 社製) を加えて、37℃、11分間反応させた。
ここで、pCDV1のKpnI切断部位の3' 末端にポ
リ(dT)鎖が約67個付加された。該溶液からフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿により、ポリ
(dT)鎖の付加したpCDV1DNA約100μgを回
収した。該DNAを10mM Tris−HCl(pH7.5),
6mM MgCl2,100mM NaClからなる緩衝液150μ
lに加え、さらに360単位のEcoRIを加え、37℃,
2時間反応させた。該反応物をLGT法で処理後、約3.
1kb のDNA断片を回収し、約60μgのポリ(dT)鎖
付加pCDV1を得た。該DNAを10mM Tris−H
Cl(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液500μ
lに溶解し、65℃, 5分間インキュベート後、氷冷して
50μlの5M NaClを加えた。混合物をオリゴ(d
A)セルロースカラム(コラボラティブリサーチ社製)
クロマトグラフィーにかけた。ポリ(dT)鎖長が充分
なものはカラムに吸着し、これを10mM Tris−HC
l(pH8.0)および1mM EDTAからなる溶液で溶出
し、ポリ(dT)鎖の付加したpCDV1(以下ベクタ
ープライマーと略記する)27μgを得た。
【0178】次にリンカーDNAの調製を行った。pL
1〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okayama & Berg):モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol. C
ell. Biol.),3,280 (1983)〕約14μgを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および50mM N
aClからなる緩衝液200μlに加え、さらに50単位の
PstIを加え、37℃, 4時間反応させ、pL1DNA
中のPstI部位で切断させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Pst
Iで切断したpL1DNA約13μgを回収した。該DN
A約13μgをTdT緩衝液に終濃度0.25mM のdGTP
を含む溶液50μlに加え、さらにTdT(P-L Biochemi
cals社製)54単位を加えて37℃, 13分間インキュベート
し、pL1のPstI切断部位3’末端に(dG)鎖を
約14個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタ
ノール沈殿にてDNAを回収した。該DNAを10mM T
ris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および60mM
NaClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位
のHindIIIを加えて37℃, 3時間インキュベート
し、pL1DNAのHindIII部位で切断した。該反
応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb の
DNA断片をDEAEペーパー法〔ドレツェン(Dretze
n)ら:アナリティカル・バイオケミストリィ(Anal. Bi
ochem.),112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ(d
G)鎖付きのリンカーDNA(以下単にリンカーDNA
と略記する)を得た。
1〔オカヤマ・アンド・バーグ(Okayama & Berg):モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジィ(Mol. C
ell. Biol.),3,280 (1983)〕約14μgを10mM Tri
s−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および50mM N
aClからなる緩衝液200μlに加え、さらに50単位の
PstIを加え、37℃, 4時間反応させ、pL1DNA
中のPstI部位で切断させた。該反応物をフェノール
−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、Pst
Iで切断したpL1DNA約13μgを回収した。該DN
A約13μgをTdT緩衝液に終濃度0.25mM のdGTP
を含む溶液50μlに加え、さらにTdT(P-L Biochemi
cals社製)54単位を加えて37℃, 13分間インキュベート
し、pL1のPstI切断部位3’末端に(dG)鎖を
約14個付加した。フェノール−クロロホルム抽出後エタ
ノール沈殿にてDNAを回収した。該DNAを10mM T
ris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 および60mM
NaClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位
のHindIIIを加えて37℃, 3時間インキュベート
し、pL1DNAのHindIII部位で切断した。該反
応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、約0.5kb の
DNA断片をDEAEペーパー法〔ドレツェン(Dretze
n)ら:アナリティカル・バイオケミストリィ(Anal. Bi
ochem.),112, 295 (1981) 〕にて回収し、オリゴ(d
G)鎖付きのリンカーDNA(以下単にリンカーDNA
と略記する)を得た。
【0179】上記で調製したポリ(A)RNA約2μ
g,ベクタープライマー約1.4μgを50mM Tris−H
Cl(pH8.3),8mM MgCl2,30mM KCl,0.3mM
DTT,2mM dNTP(dATP,dTTP,dGT
PおよびdCTP)および10単位のリボヌクレアーゼイ
ンヒビター(P-L Biochemicals社製)からなる溶液22.3
μlに溶解し、10単位の逆転写酵素(生化学工業社製)
を加え、41℃,90分間インキュベートし、mRNAに相
補的なDNAを合成させた。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、RNA−DN
A二重鎖の付加したベクタープライマーDNAを回収し
た。該DNAを66μMdCTPおよび0.2μgポリ
(A)を含むTdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のT
dT(P-L Biochemicals社製)を加えて37℃,2分間イ
ンキュベートし、cDNA3’末端に20個の(dC)鎖
を付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により(dC)鎖の付加したcDN
A−ベクタープライマーDNAを回収した。該DNAを
10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 お
よび60mM NaClからなる液400μlに溶かし、20単位
のHindIIIを加え、37℃, 2時間インキュベート
し、HindIII部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモ
ルの(dC)鎖付加cDNA−ベクタープライマーDN
Aを得た。該DNA0.2ピコモルおよび前記のリンカー
DNA0.4ピコモルを10mM Tris−HCl(pH7.
5),0.1M NaClおよび1mM EDTAからなる溶液
100μlに溶かし、65℃,42℃,0℃でそれぞれ10分,2
5分, 30分間インキュベートした。20mM Tris−HC
l(pH7.5),4mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,
0.1M KClおよび0.1mM β−NADの組成で、全量10
0μlとなるよう反応液を調製した。該反応液に25単位
の大腸菌DNAリガーゼ(ニューイングランド・バイオ
ラブズ社製)を加え、11℃,18時間インキュベートし
た。該反応液を各40μMのdNTP,0.15mM β−NA
Dとなるよう成分を追加調製し、10単位の大腸菌DNA
リガーゼ,20単位の大腸菌DNAポリメラーゼI(P-L
Biochemicals社製)および10単位の大腸菌リボヌクレア
ーゼH(P-L Biochemicals社製)を加え、12℃,25℃で
順次1時間ずつインキュベートした。上記反応で、cD
NAを含む組換えDNAの環状化と、RNA−DNA二
重鎖のRNA部分がDNAに置換され、完全な二重鎖D
NAの組換え体プラスミドが生成した。 (3) ヒトLTcDNAを含む組換えDNAの選択:(2)
で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌C600SF8
株〔カメロン(Cameron):プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Pro
c. Natl. Acad.Sci.) USA 72, 3416 (1975) 〕を Scot
tらの方法〔重定勝哉:細胞工学2,616 (1983)〕に従
い形質転換した。得られた約30000個のコロニーをニト
ロセルロース・フィルター上に固定した。ジェネンテク
(Genentech)社が単離したヒトLTcDNA〔パトリッ
ク・ダブリュー・グレイ(PatrickW.Gray)ら:ネイチ
ャー(Nature)312, 721 (1984) 〕の5' 非翻訳領域の
一部の塩基配列と一致する17塩基の合成DNA5'−G
ATCCCCGGCCTGCCTG−3'を32Pで標識
したプローブに52℃で強く会合した1菌株を選んだ〔グ
ルンステイン・ホグネス(Grunstein−Hogness)の方
法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.) USA
72, 3961 (1975)〕。この菌株が持つプラスミドpLT
1のcDNAの全塩基配列を、M13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法により決定した。その結
果、pLT1のcDNAはヒトLTをコードしているこ
とが判明した。 2) 組換え体プラスミドpLA1の造成:前項の方法に
よって得たpLT1(4.7kb)5μgを10mM Tris−
HCl(pH7.5),7mM MgCl2,6mM 2−メルカプト
エタノールを含む全量50μlの溶液(以下“Y−0緩衝
液”と略記する)に溶かし、制限酵素 XhoII(ベー
リンガーマンハイム社製)10単位を加えて、37℃で2時
間切断反応を行った。次いで、NaClを終濃度150mM
となるように加え、制限酵素NsiI(ニューイングラ
ンド・バイオラブズ社製)10単位を加え、37℃でさらに
3時間切断反応を行った。反応液からLGT法によりヒ
トLTDNAの大部分を含む約750bpのDNA断片(X
hoII−NsiI断片)約0.3μgを得た。
g,ベクタープライマー約1.4μgを50mM Tris−H
Cl(pH8.3),8mM MgCl2,30mM KCl,0.3mM
DTT,2mM dNTP(dATP,dTTP,dGT
PおよびdCTP)および10単位のリボヌクレアーゼイ
ンヒビター(P-L Biochemicals社製)からなる溶液22.3
μlに溶解し、10単位の逆転写酵素(生化学工業社製)
を加え、41℃,90分間インキュベートし、mRNAに相
補的なDNAを合成させた。該反応物をフェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈殿を行い、RNA−DN
A二重鎖の付加したベクタープライマーDNAを回収し
た。該DNAを66μMdCTPおよび0.2μgポリ
(A)を含むTdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のT
dT(P-L Biochemicals社製)を加えて37℃,2分間イ
ンキュベートし、cDNA3’末端に20個の(dC)鎖
を付加した。該反応物をフェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿により(dC)鎖の付加したcDN
A−ベクタープライマーDNAを回収した。該DNAを
10mM Tris−HCl(pH7.5),6mM MgCl2 お
よび60mM NaClからなる液400μlに溶かし、20単位
のHindIIIを加え、37℃, 2時間インキュベート
し、HindIII部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルム抽出、エタノール沈殿して0.5ピコモ
ルの(dC)鎖付加cDNA−ベクタープライマーDN
Aを得た。該DNA0.2ピコモルおよび前記のリンカー
DNA0.4ピコモルを10mM Tris−HCl(pH7.
5),0.1M NaClおよび1mM EDTAからなる溶液
100μlに溶かし、65℃,42℃,0℃でそれぞれ10分,2
5分, 30分間インキュベートした。20mM Tris−HC
l(pH7.5),4mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,
0.1M KClおよび0.1mM β−NADの組成で、全量10
0μlとなるよう反応液を調製した。該反応液に25単位
の大腸菌DNAリガーゼ(ニューイングランド・バイオ
ラブズ社製)を加え、11℃,18時間インキュベートし
た。該反応液を各40μMのdNTP,0.15mM β−NA
Dとなるよう成分を追加調製し、10単位の大腸菌DNA
リガーゼ,20単位の大腸菌DNAポリメラーゼI(P-L
Biochemicals社製)および10単位の大腸菌リボヌクレア
ーゼH(P-L Biochemicals社製)を加え、12℃,25℃で
順次1時間ずつインキュベートした。上記反応で、cD
NAを含む組換えDNAの環状化と、RNA−DNA二
重鎖のRNA部分がDNAに置換され、完全な二重鎖D
NAの組換え体プラスミドが生成した。 (3) ヒトLTcDNAを含む組換えDNAの選択:(2)
で得た組換え体プラスミドを用い、大腸菌C600SF8
株〔カメロン(Cameron):プロシーディング・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Pro
c. Natl. Acad.Sci.) USA 72, 3416 (1975) 〕を Scot
tらの方法〔重定勝哉:細胞工学2,616 (1983)〕に従
い形質転換した。得られた約30000個のコロニーをニト
ロセルロース・フィルター上に固定した。ジェネンテク
(Genentech)社が単離したヒトLTcDNA〔パトリッ
ク・ダブリュー・グレイ(PatrickW.Gray)ら:ネイチ
ャー(Nature)312, 721 (1984) 〕の5' 非翻訳領域の
一部の塩基配列と一致する17塩基の合成DNA5'−G
ATCCCCGGCCTGCCTG−3'を32Pで標識
したプローブに52℃で強く会合した1菌株を選んだ〔グ
ルンステイン・ホグネス(Grunstein−Hogness)の方
法、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミィ・オブ・サイエンス(Proc. Natl. Acad.Sci.) USA
72, 3961 (1975)〕。この菌株が持つプラスミドpLT
1のcDNAの全塩基配列を、M13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法により決定した。その結
果、pLT1のcDNAはヒトLTをコードしているこ
とが判明した。 2) 組換え体プラスミドpLA1の造成:前項の方法に
よって得たpLT1(4.7kb)5μgを10mM Tris−
HCl(pH7.5),7mM MgCl2,6mM 2−メルカプト
エタノールを含む全量50μlの溶液(以下“Y−0緩衝
液”と略記する)に溶かし、制限酵素 XhoII(ベー
リンガーマンハイム社製)10単位を加えて、37℃で2時
間切断反応を行った。次いで、NaClを終濃度150mM
となるように加え、制限酵素NsiI(ニューイングラ
ンド・バイオラブズ社製)10単位を加え、37℃でさらに
3時間切断反応を行った。反応液からLGT法によりヒ
トLTDNAの大部分を含む約750bpのDNA断片(X
hoII−NsiI断片)約0.3μgを得た。
【0180】別に、pLT120μgを200μlのY−50
緩衝液に溶かし、制限酵素HaeIII40単位を加えて、3
7℃で2時間切断反応を行った。次いで、NaClを終
濃度150mMとなるように加え、NsiI40単位を加え、3
7℃でさらに3時間切断反応を行った。反応液からポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により、ヒトLTのN末
端部分を含む約50bpのDNA断片(HaeIII−Nsi
I断片)約40ngを得た。
緩衝液に溶かし、制限酵素HaeIII40単位を加えて、3
7℃で2時間切断反応を行った。次いで、NaClを終
濃度150mMとなるように加え、NsiI40単位を加え、3
7℃でさらに3時間切断反応を行った。反応液からポリ
アクリルアミドゲル電気泳動法により、ヒトLTのN末
端部分を含む約50bpのDNA断片(HaeIII−Nsi
I断片)約40ngを得た。
【0181】一方、pGEL1(3.4kb)3μgを全量3
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素StuIと制
限酵素BglIIそれぞれ6単位ずつを加え37℃で3時間
切断反応を行った。この反応液からLGT法によりAp
r 遺伝子を含む約2.3kbのDNA断片(StuI−Bg
lII断片)約1.0μgを得た。
0μlのY−100緩衝液に溶かし、制限酵素StuIと制
限酵素BglIIそれぞれ6単位ずつを加え37℃で3時間
切断反応を行った。この反応液からLGT法によりAp
r 遺伝子を含む約2.3kbのDNA断片(StuI−Bg
lII断片)約1.0μgを得た。
【0182】次に上記で得たpLT1由来のXhoII−
NsiI断片(約750bp)0.2 μgおよびHaeIII−N
siI断片(約50bp)20ngとpGEL1由来のStuI
−BglII断片(約2.3kb)0.6μgを全量20μlのT4
リガーゼ緩衝液に溶かし、この混合溶液にさらに2単位
のT4DNAリガーゼ(宝酒造社製)を加え4℃,18時
間反応を行った。
NsiI断片(約750bp)0.2 μgおよびHaeIII−N
siI断片(約50bp)20ngとpGEL1由来のStuI
−BglII断片(約2.3kb)0.6μgを全量20μlのT4
リガーゼ緩衝液に溶かし、この混合溶液にさらに2単位
のT4DNAリガーゼ(宝酒造社製)を加え4℃,18時
間反応を行った。
【0183】このようにして得た組換え体プラスミドD
NAを用い、Escherichia coli KM430株をコーエンら
の方法により形質転換し、Apr のコロニーを得た。こ
の形質転換株よりプラスミドDNAを公知の方法に従っ
て分離精製し、該プラスミドDNAをStuI等の制限
酵素で切断することによりプラスミドの構造解析を行っ
た。その結果、目的のプラスミドが得られたことを確認
した。この組換え体プラスミドをpLA1と呼ぶ。 3) LT発現プラスミドpLSA1の造成:前項により
得られたpLA1(3.1kb)をもつ大腸菌KM430株を培
養し、培養菌体から常法によりpLA1DNAを調製し
た。得られたpLA1DNA3μgをY−100緩衝液30
μlに溶かし、StuIとBglIIそれぞれ3単位ずつ
を加え37℃で3時間切断反応を行った。この反応液から
LGT法によりヒトLT遺伝子の大部分を含む約790bp
のDNA断片(StuI−BglII断片)約0.5μgを
得た。
NAを用い、Escherichia coli KM430株をコーエンら
の方法により形質転換し、Apr のコロニーを得た。こ
の形質転換株よりプラスミドDNAを公知の方法に従っ
て分離精製し、該プラスミドDNAをStuI等の制限
酵素で切断することによりプラスミドの構造解析を行っ
た。その結果、目的のプラスミドが得られたことを確認
した。この組換え体プラスミドをpLA1と呼ぶ。 3) LT発現プラスミドpLSA1の造成:前項により
得られたpLA1(3.1kb)をもつ大腸菌KM430株を培
養し、培養菌体から常法によりpLA1DNAを調製し
た。得られたpLA1DNA3μgをY−100緩衝液30
μlに溶かし、StuIとBglIIそれぞれ3単位ずつ
を加え37℃で3時間切断反応を行った。この反応液から
LGT法によりヒトLT遺伝子の大部分を含む約790bp
のDNA断片(StuI−BglII断片)約0.5μgを
得た。
【0184】別に、特開昭58-110600号公報記載の方法
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液30μlに
溶かし、制限酵素BanIIIと制限酵素PstIをそれ
ぞれ6単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を行った。
この反応液からLGT法によりトリプトファンプロモー
ター(Ptrp)を含む約1.1kbのDNA断片(BanI
II−PstI断片)約0.6μgを得た。また、pGEL
1(3.4kb)2μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、制
限酵素HindIII,BamHIおよびPstIそれぞ
れ4単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を行った。こ
の反応液からLGT法によりリポプロテイン由来ターミ
ネーターを含む約1.7kbのDNA断片(PstI−Ba
mHI断片)約0.7μgを得た。
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液30μlに
溶かし、制限酵素BanIIIと制限酵素PstIをそれ
ぞれ6単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を行った。
この反応液からLGT法によりトリプトファンプロモー
ター(Ptrp)を含む約1.1kbのDNA断片(BanI
II−PstI断片)約0.6μgを得た。また、pGEL
1(3.4kb)2μgをY−100緩衝液20μlに溶かし、制
限酵素HindIII,BamHIおよびPstIそれぞ
れ4単位ずつを加え37℃で3時間切断反応を行った。こ
の反応液からLGT法によりリポプロテイン由来ターミ
ネーターを含む約1.7kbのDNA断片(PstI−Ba
mHI断片)約0.7μgを得た。
【0185】一方、成熟ヒトLTポリペプチドのN末端
であるLeu(CTA)から、5番目のアミノ酸である
Gly(GGC)の2番目の塩基(GG)までと、発現
に必要な開始コドン(ATG)を付与する必要があるこ
と、またPtrpの下流のSD配列とATGとの距離
は、6〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のDNAリンカーを合成した。
であるLeu(CTA)から、5番目のアミノ酸である
Gly(GGC)の2番目の塩基(GG)までと、発現
に必要な開始コドン(ATG)を付与する必要があるこ
と、またPtrpの下流のSD配列とATGとの距離
は、6〜18bpの間の適当な長さにする必要があることな
どの理由から、下記のDNAリンカーを合成した。
【0186】
【化21】
【0187】まず、一本鎖DNA、27−merと25−merを
通常のトリエステル法により合成した。27−merおよび2
5−mer の各々20ピコモルを全量40μlのT4キナーゼ
緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒
造社製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。次に上記で得たpLA1由来のStuI−Bg
lII断片(約790bp)0.3μgと発現ベクターpKYP10
のBanIII−PstI断片(約1.1kb)0.4μgおよび
pGEL1由来のPstI−BamHI断片(約1.7k
b)0.6μgをT4リガーゼ緩衝液25μl溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル加えた。この
混合溶液にさらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4
℃で18時間結合反応を行った。
通常のトリエステル法により合成した。27−merおよび2
5−mer の各々20ピコモルを全量40μlのT4キナーゼ
緩衝液に溶かし、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒
造社製)6単位を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を
行った。次に上記で得たpLA1由来のStuI−Bg
lII断片(約790bp)0.3μgと発現ベクターpKYP10
のBanIII−PstI断片(約1.1kb)0.4μgおよび
pGEL1由来のPstI−BamHI断片(約1.7k
b)0.6μgをT4リガーゼ緩衝液25μl溶かし、この混
合液に上記DNAリンカーを約1ピコモル加えた。この
混合溶液にさらにT4DNAリガーゼ6単位を加え、4
℃で18時間結合反応を行った。
【0188】組換え体プラスミドを含む反応混合物を用
いて大腸菌KM430株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ec
oRI,BanIII,PstI,HindIII,BglII
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。こ
のプラスミドをpLSA1とよぶ。pLSA1のBan
III,HindIII付近の塩基配列は下記のとおりである
ことをマキサム・ギルバートの方法〔エイ・エム・マキ
サム(A. M. Maxam)ら:プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Proc. Na
tl. Acad. Sci.), USA 74,560(1977)〕で確認した。
いて大腸菌KM430株を形質転換し、Apr のコロニー
を得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDNA
を回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素Ec
oRI,BanIII,PstI,HindIII,BglII
で切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。こ
のプラスミドをpLSA1とよぶ。pLSA1のBan
III,HindIII付近の塩基配列は下記のとおりである
ことをマキサム・ギルバートの方法〔エイ・エム・マキ
サム(A. M. Maxam)ら:プロシーディング・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミィ・オブ・サイエンス(Proc. Na
tl. Acad. Sci.), USA 74,560(1977)〕で確認した。
【0189】
【化22】
【0190】参考例4. ATGベクターpTrS20の造成:図13に示した手順に
従い、SD配列とATG開始コドンの間の距離が14塩基
で、かつATGコドンの直後にSacIサイトを有する
ATGベクターpTrS20を造成した。
従い、SD配列とATG開始コドンの間の距離が14塩基
で、かつATGコドンの直後にSacIサイトを有する
ATGベクターpTrS20を造成した。
【0191】まず、特開昭58−110600号公報記載の方法
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液30μlに
溶かし、制限酵素BanIIIと制限酵素NruI(ニュ
ーイングランド・バイオラブズ社製)をそれぞれ6単位
ずつ加え、37℃で3時間切断反応を行った。この反応液
からLGT法によりPtrpを含む約3.8kbのDNA断
片(BanIII−NruI断片)約0.5 μgを得た。
で調製したpKYP10 3μgをY−100緩衝液30μlに
溶かし、制限酵素BanIIIと制限酵素NruI(ニュ
ーイングランド・バイオラブズ社製)をそれぞれ6単位
ずつ加え、37℃で3時間切断反応を行った。この反応液
からLGT法によりPtrpを含む約3.8kbのDNA断
片(BanIII−NruI断片)約0.5 μgを得た。
【0192】一方、Ptrpの下流にATG開始コドン
を付与するために下記のDNAリンカーをトリエステル
法により合成した。
を付与するために下記のDNAリンカーをトリエステル
法により合成した。
【0193】
【化23】
【0194】19−merと17−merの合成DNA(各々10ピ
コモルずつ)を50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM
MgCl2 ,5mM ジチオスレイトール,0.1 mM ED
TAおよび1mM ATPを含む全量20μlの溶液に溶か
し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ3単位(宝酒造社
製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次
に上記で得たpKYP10由来のBanIII−NruI断
片(約3.8kb) 0.1μgと上記のDNAリンカー約0.5ピ
コモルをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶かし、さらにT
4DNAリガーゼ2単位を加え、4℃で18時間結合反応
を行った。
コモルずつ)を50mM Tris−HCl(pH7.5),10mM
MgCl2 ,5mM ジチオスレイトール,0.1 mM ED
TAおよび1mM ATPを含む全量20μlの溶液に溶か
し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ3単位(宝酒造社
製)を加えて、37℃で60分間リン酸化反応を行った。次
に上記で得たpKYP10由来のBanIII−NruI断
片(約3.8kb) 0.1μgと上記のDNAリンカー約0.5ピ
コモルをT4リガーゼ緩衝液20μlに溶かし、さらにT
4DNAリガーゼ2単位を加え、4℃で18時間結合反応
を行った。
【0195】得られた組換え体プラスミドの混合物を用
いて大腸菌HB101株〔ボリバー(Boliver) ら:ジーン
(Gene) 2, 75 (1977)〕を形質転換し、Apr のコロニ
ーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDN
Aを回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素E
coRI,BanIII,HindIII, SacI,Nru
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
このプラスミドをpTrS20と名付けた(図13)。pT
rS20のBanIII,HindIII サイト付近の塩基配
列は下記のとおりであることをM13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法を用い確認した。
いて大腸菌HB101株〔ボリバー(Boliver) ら:ジーン
(Gene) 2, 75 (1977)〕を形質転換し、Apr のコロニ
ーを得た。このコロニーの培養菌体からプラスミドDN
Aを回収した。得られたプラスミドの構造は制限酵素E
coRI,BanIII,HindIII, SacI,Nru
Iで切断後、アガロースゲル電気泳動により確認した。
このプラスミドをpTrS20と名付けた(図13)。pT
rS20のBanIII,HindIII サイト付近の塩基配
列は下記のとおりであることをM13ファージを用いたデ
ィデオキシ・シークエンス法を用い確認した。
【0196】
【化24】
【0197】
【発明の効果】本発明によればCSF活性の高いポリペ
プチドを大量に安価に供給することができる。
プチドを大量に安価に供給することができる。
【図1】プラスミドpCfTA1の造成工程を示す。
【図2】プラスミドpCfTB20の造成工程を示す。
【図3】プラスミドpCfTL23,38,35,41の造成工
程を示す。
程を示す。
【図4】プラスミドpCfTM14,17,113の造成工程
を示す。
を示す。
【図5】プラスミドpCfWD1の造成工程を示す。
【図6】プラスミドpCfT95K19,pCfAA1およ
びpCfAB5の造成工程を示す。
びpCfAB5の造成工程を示す。
【図7】プラスミドpCfBA8,pCfBB101,p
CfBC52,59, 42B1,45,76,77, 93, 95, 97およ
びpCfBD28, 56,82の造成工程を示す。
CfBC52,59, 42B1,45,76,77, 93, 95, 97およ
びpCfBD28, 56,82の造成工程を示す。
【図8】プラスミドpCfCB101,pCfCC52,5
9,pCfCD28,56の造成工程を示す。
9,pCfCD28,56の造成工程を示す。
【図9】(1) および(2)は、オカヤマ・バーグ法による
cDNA合成と該DNAを含む組換え体プラスミドの造
成過程の概略を示す。
cDNA合成と該DNAを含む組換え体プラスミドの造
成過程の概略を示す。
【図10】プラスミドpLA1の造成工程を示す。
【図11】プラスミドpLSA1の造成工程を示す。
【図12】プラスミドpCfTNS501の造成工程を示
す。
す。
【図13】プラスミドpTrS20の造成工程を示す。
【図14】プラスミドpCfTNS7およびpCfTA
Arg4Sの造成工程を示す。
Arg4Sの造成工程を示す。
【図15】プラスミドpCfTN205およびpCfTA
Arg4の造成工程を示す。
Arg4の造成工程を示す。
【図16】プラスミドpCfTNS301およびpCfT
NS401の造成工を示す。
NS401の造成工を示す。
【図17】(1)および(2)はプラスミドpCfBD28A1
7,pCfBD28T17の造成工程を示す。
7,pCfBD28T17の造成工程を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12P 21/02 ZNA H 8214−4B //(C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72)発明者 岡部 正実 静岡県駿東郡長泉町納米里410−1 (72)発明者 森本 真 静岡県駿東郡長泉町下土狩203−5 (72)発明者 伊藤 菁莪 神奈川県相模原市相原字八幡西218−14 (72)発明者 山崎 基生 東京都町田市旭町3−6−6 (72)発明者 横尾 義春 神奈川県相模原市横山3−4−17 (72)発明者 山口 和夫 神奈川県相模原市磯部2121−8
Claims (29)
- 【請求項1】 表1のアミノ酸配列を有するヒト顆粒球
コロニー刺戟因子(以下hG−CSFと略記する)ポリ
ペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置換され
たアミノ酸配列を有する新規ポリペプチド(但し、表1
のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチドの
内、第1番目のアミノ酸残基がアラニン(Ala)に、
第3番目のアミノ酸残基がスレオニン(Thr)に、第
4番目のアミノ酸残基がチロシン(Tyr)に、第5番
目のアミノ酸残基がアルギニン(Arg)に、第17番目
のアミノ酸残基がセリン(Ser)に、それぞれ置換さ
れたポリペプチドを除く。)。 - 【請求項2】 hG−CSFポリペプチドのN末端側の
アミノ酸が他種のアミノ酸で置換された請求項1記載の
新規ポリペプチド。 - 【請求項3】 hG−CSFポリペプチドのN末端側第
1〜17番目のアミノ酸のうち少なくとも1個のアミノ酸
が他種のアミノ酸で置換された請求項1記載の新規ポリ
ペプチド。 - 【請求項4】 N末端の1〜6番目のアミノ酸のうち少
なくとも1個と17番目のアミノ酸とがhG−CSFポリ
ペプチドの相当する位置のアミノ酸とは異なることを特
徴とする請求項1記載の新規ポリペプチド。 - 【請求項5】 表1のアミノ酸配列を有するhG−CS
Fポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(但し、表
1のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチドの
内、第1番目のアミノ酸残基がアラニン(Ala)に、
第3番目のアミノ酸残基がスレオニン(Thr)に、第
4番目のアミノ酸残基がチロシン(Tyr)に、第5番
目のアミノ酸残基がアルギニン(Arg)に、第17番目
のアミノ酸残基がセリン(Ser)に、それぞれ置換さ
れたポリペプチドを除く。)をコードするDNA。 - 【請求項6】 表1のアミノ酸配列を有するhG−CS
Fポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で置
換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(但し、表
1のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチドの
内、第1番目のアミノ酸残基がアラニン(Ala)に、
第3番目のアミノ酸残基がスレオニン(Thr)に、第
4番目のアミノ酸残基がチロシン(Tyr)に、第5番
目のアミノ酸残基がアルギニン(Arg)に、第17番目
のアミノ酸残基がセリン(Ser)に、それぞれ置換さ
れたポリペプチドを除く。)をコードするDNA断片が
プラスミドDNAに組み込まれた組換え体プラスミド。 - 【請求項7】 プラスミドDNAとしてトリプトファン
プロモーターを有するプラスミドDNAを用い、該DN
A断片がプラスミドDNAのトリプトファンプロモータ
ーの下流に組み込まれたことを特徴とする請求項6記載
の組換え体プラスミド。 - 【請求項8】 該DNA断片が表1の塩基配列の第1〜
51番目の塩基のうち少なくとも1個が他の塩基で置換さ
れた配列を有することを特徴とする請求項6または7記
載の組換え体プラスミド。 - 【請求項9】 pCfTL38,pCfTL41,pCfT
L23,pCfTL35,pCfBB101,pCfBC42B
1,pCfBC45,pCfBC52,pCfBC59,pC
fBC76,pCfBC77,pCfBC93, pCfBC9
5,pCfBC97,pCfBD56,pCfBD82,pC
fTM14,pCfTM17,pCfTM113,pCfTA
Arg4S,pCfTAArg4,pCfBD28A17お
よびpCfBD28T17から選ばれる請求項6〜8のいず
れか1項に記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項10】 表1のアミノ酸配列を有するhG−C
SFポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(但し、
表1のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチド
の内、第1番目のアミノ酸残基がアラニン(Ala)
に、第3番目のアミノ酸残基がスレオニン(Thr)
に、第4番目のアミノ酸残基がチロシン(Tyr)に、
第5番目のアミノ酸残基がアルギニン(Arg)に、第
17番目のアミノ酸残基がセリン(Ser)に、それぞれ
置換されたポリペプチドを除く。)をコードするDNA
断片がプラスミドDNAに組み込まれた組換え体プラス
ミドを含む微生物。 - 【請求項11】 該微生物が大腸菌に属する請求項10記
載の微生物。 - 【請求項12】 該組換え体プラスミドがpCfTL3
8,pCfTL41, pCfTL23,pCfTL35,pC
fBB101,pCfBC42B1,pCfBC45,pCf
BC52,pCfBC59,pCfBC76,pCfBC77,
pCfBC93,pCfBC95,pCfBC97,pCfB
D56,pCfBD82,pCfTM14,pCfTM17,p
CfTM113,pCfTAArg4S,pCfTAAr
g4,pCfBD28A17およびpCfBD28T17から選
ばれる請求項10記載の微生物。 - 【請求項13】 表1のアミノ酸配列を有するhG−C
SFポリペプチドの一部のアミノ酸が他種のアミノ酸で
置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド(但し、
表1のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリペプチド
の内、第1番目のアミノ酸残基がアラニン(Ala)
に、第3番目のアミノ酸残基がスレオニン(Thr)
に、第4番目のアミノ酸残基がチロシン(Tyr)に、
第5番目のアミノ酸残基がアルギニン(Arg)に、第
17番目のアミノ酸残基がセリン(Ser)に、それぞれ
置換されたポリペプチドを除く。)をコードするDNA
断片がプラスミドDNAに組み込まれた組換え体プラス
ミドを含む微生物を培地に培養し、培養物中に該ポリペ
プチドを生成蓄積させ、該培養物から該ポリペプチドを
採取することを特徴とするポリペプチドの製造法。 - 【請求項14】 該微生物が大腸菌に属する請求項13記
載の方法。 - 【請求項15】 該組換え体プラスミドがpCfTL3
8,pCfTL41, pCfTL23,pCfTL35,pC
fBB101, pCfBC42B1,pCfBC45,pCf
BC52,pCfBC59,pCfBC76,pCfBC77,
pCfBC93,pCfBC95,pCfBC97,pCfB
D56,pCfBD82,pCfTM14,pCfTM17,p
CfTM113,pCfTAArg4S,pCfTAAr
g4,pCfBD28A17およびpCfBD28T17から選
ばれる請求項13記載の方法。 - 【請求項16】 hG−CSFポリペプチドの一部のア
ミノ酸が欠失したポリペプチド。 - 【請求項17】 hG−CSFポリペプチドのN末端側
第1〜11番目のアミノ酸のうちの少なくとも1個のアミ
ノ酸が欠失した請求項16記載のポリペプチド。 - 【請求項18】 hG−CSFポリペプチドのN末端
側、第1−4、1−5、1−6、1−7および1−11の
ペプチドから選ばれるペプチドが欠失した請求項17記載
のポリペプチド。 - 【請求項19】 hG−CSFポリペプチドの一部のア
ミノ酸が欠失したポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項20】 hG−CSFポリペプチドのN末端側
第1−11番目のアミノ酸のうち少なくとも1個のアミノ
酸が欠失したポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項21】 hG−CSFポリペプチドのN末端
側、第1−4、1−5、1−6、1−7および1−11の
ペプチドから選ばれるペプチドが欠失したポリペプチド
をコードするDNAであることを特徴とする請求項20記
載のDNA。 - 【請求項22】 hG−CSFポリペプチドの一部のア
ミノ酸が欠失したポリペプチドをコードするDNA断片
がプラスミドDNAに組み込まれた組換え体プラスミ
ド。 - 【請求項23】 hG−CSFポリペプチドのN末端側
第1−11番目のアミノ酸のうち少なくとも1個のアミノ
酸が欠失したポリペプチドをコードするDNA断片がプ
ラスミドDNAに組み込まれたことを特徴とする請求項
22記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項24】 hG−CSFポリペプチドのN末端
側、第1−4、1−5、1−6、1−7および1−11の
ペプチドから選ばれるペプチドが欠失したポリペプチド
をコードするDNA断片がプラスミドDNAに組み込ま
れたことを特徴とする請求項23記載の組換え体プラスミ
ド。 - 【請求項25】 プラスミドDNAとしてトリプトファ
ンプロモーターを有するプラスミドDNAを用い、該D
NA断片がプラスミドDNAのトリプトファンプロモー
ターの下流に組み込まれたことを特徴とする請求項24記
載の組換え体プラスミド。 - 【請求項26】 pCfTNS7,pCfTNS301,
pCfTNS401およびpCfTNS501からなる群から
選ばれる請求項25記載の組換え体プラスミド。 - 【請求項27】 アミノ酸の欠失に加え、hG−CSF
ポリペプチドの第17番目のアミノ酸システイン(Cy
s)がセリン(Ser)に置換されたことを特徴とする
請求項16記載のポリペプチド。 - 【請求項28】 hG−CSFポリペプチドの一部のア
ミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするDNA断片がプラスミドDNAに組み込まれ
た組換え体プラスミドを含む微生物を培地に培養し、培
養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から
該ポリペプチドを採取することを特徴とするポリペプチ
ドの製造法。 - 【請求項29】 表1のアミノ酸配列を有するhG−C
SFポリペプチドの17番目のアミノ酸(システィン)が
セリンに置換され、かつN末端側第1〜6番目のアミノ
酸のうち少なくとも1個が他種アミノ酸に置換されたポ
リペプチドに水性媒体中プロテアーゼを作用させ、反応
溶液中に表1のアミノ酸配列を有するhG−CSFポリ
ペプチドの17番目のアミノ酸(システィン)がセリンに
置換され、かつN末端側のアミノ酸が4〜7個欠失した
アミノ酸配列を有する新規ポリペプチドを生成させ、該
反応溶液から該ポリペプチドを採取することからなる新
規ポリペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4214376A JP2628961B2 (ja) | 1986-12-23 | 1992-08-11 | 新規ポリペプチド |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP61-306799 | 1986-12-23 | ||
JP30679986 | 1986-12-23 | ||
JP4214376A JP2628961B2 (ja) | 1986-12-23 | 1992-08-11 | 新規ポリペプチド |
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JPS63500636A (ja) * | 1985-08-23 | 1988-03-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするdna |
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