JPH0692873A - 診断および治療物質としての作用を併せ持つ３機能性抗体様化合物 - Google Patents

診断および治療物質としての作用を併せ持つ３機能性抗体様化合物

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JPH0692873A
JPH0692873A JP3068823A JP6882391A JPH0692873A JP H0692873 A JPH0692873 A JP H0692873A JP 3068823 A JP3068823 A JP 3068823A JP 6882391 A JP6882391 A JP 6882391A JP H0692873 A JPH0692873 A JP H0692873A
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クラレンス・エヌ・アーレム
Ann E Huang
アン・イー・ハング
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、組織、器官、細胞または分子特異
性を有する３機能性抗体-様化合物であって、その特異
性を示す組織、器官、細胞または分子に結合を介して固
定化されれば２機能性を示すことのできる化合物に関す
る。さらに、本発明は本発明化合物を利用する疾患の処
置法および診断法に関する。 【効果】 本発明の化合物は、処置、治療、および処置
および治療双方に使用するための医薬製剤として利用す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、診断および／または治療に使用
され得る３機能性抗体-様化合物を含有する医薬組成物
に関する。より詳細には、本発明は、２から３の異なる
特異性(機能性)を有する３つのＦab'-様フラグメントを
含有する３機能性抗体-様化合物に関する。３機能性抗
体-様化合物中における第１のＦab'フラグメントは、そ
の化合物に組織、器官または腫瘍の特異性を付与する抗
原または抗原性部位に指向するものである。残りの２つ
のＦab'-様フラグメントは、診断および／または治療物
質またはそれらの混合体、またはＴ細胞レセプター／レ
セプター複合体およびＴ細胞表面の補助分子(accessory
molecule)に対する特異性を有している。本発明の化合
物は医薬活性物質として有用であり、それは１つまたは
それ以上の標的担持細胞に結合し、それによって臨床医
が、標的細胞を画像化(イメージング)し、かつイメージ
ングされた標的細胞に関連する疾患を選択的に処置する
ことを可能にするものである。あるいは、本発明化合物
は標的細胞と結合でき、治療物質の混合体を標的細胞の
近傍に局在化させることができ、さらに結合してＴ細胞
を活性化し、これも特異性を示す標的担持細胞を死滅さ
せることができる。
【０００２】抗体とは、外来物として宿主に認知される
抗原に応答して生物の免疫系によって生成される複合体
タンパク質分子である。動物の免疫能力の範囲は極めて
柔軟であり、かつ変化に富むものなので、非常に多い抗
原の数と同じだけ、多くの雑多な抗体分子を産生させる
ことができる。しかし、個々の抗体分子は、それらが単
一特異性、すなわち単一機能性であることであるという
問題を伴う。
【０００３】標的抗原に対する抗体分子の天然親和性
は、細胞毒性分子、放射性核種、イメージング物質(画
像物質)、または他のレポーターグループなどの個々の
薬学的組成物を腫瘍、感染症の病原体および実体を有す
る他の抗原における特異的な抗原性部位にインビボター
ゲッティングさせるのに利用されている。例えば、ニコ
ロッチ(Nicolotti)およびディーン(Dean)は金属キレー
ト剤に架橋連結したＦab'フラグメントを含有する医薬
組成物を開示している[米国特許第4,659,839号]。ニコ
ロッチは、癌胎児性抗原に特異的なＦab'を、放射性核
種または常磁性金属イオンをキレート化できる金属キレ
ート剤に共有結合した。
【０００４】メアレス(Meares)は、２機能性分子の一部
が腫瘍(すなわち、組織)特異性を付与し、別の部分が金
属-キレート錯体に対する特異性を付与する、２機能性
抗体を含有する医薬組成物を開示している[米国特許第
4,722,892号]。
【０００５】米国特許第4,814,438号[アーマー(Armour)
ら]には、アルカン二酸連結基を介した２'-２'-ジフル
オロヌクレオシドの基への抗体分子の架橋連結が記載さ
れている。この抗体の唯一の機能は、組織特異性の付与
である。さらに、米国特許第4,671,958号[ロドウェル(R
odwell)ら]には、インビトロ標的部位に化合物をデリバ
ー(供給)するための抗体コンジュゲート体の使用が開示
されている。ロドウェルによれば、その抗体は組織特異
性を付与している。ペプチドリンカー基はアミドまたは
エステル結合を介して抗体を目的化合物に共有結合させ
る。ロドウェルは無傷の(そのままの)抗体分子を使用し
ているので、その固定化抗体は補体を活性化することも
できる。ロドウェルは、補体活性化を使用すればペプチ
ドリンカーを酵素学的に開裂することができ、それによ
り医薬活性物質を局所に放出させることができる、と教
示している。しかし、本発明の目的は、補体を活性化せ
ず、またＦcレセプターを保持する細胞と相互作用しな
い、抗体の抗原結合能を有する医薬活性物質の提供にあ
る。
【０００６】上記の抗体試薬は２機能性であるにもかか
わらず、これら２機能性抗体分子は作用部位において効
果的に１機能を発揮するうえで、すなわち単一の薬物ま
たはレポーターグループのみを腫瘍の抗原結合部位また
は実体を有する他の抗原にターゲッティングするうえ
で、本質的に制限を受ける。したがって、本発明の他の
目的は、作用部位において２機能性であり得る組織また
は器官特異性を有する医薬組成物を開発することにあ
る。本発明の別の目的は、診断と処置の双方を可能にす
る組織または器官特異性を有する医薬組成物の開発にあ
る。
【０００７】本発明は多くの局面をもっている。本発明
は第１に、組織、器官、細胞、腫瘍または分子特異性を
有し、かつ特異性を示すその組織、器官、細胞、腫瘍ま
たは分子に結合を介して固定化された場合に２機能性で
あることのできる化合物を目的とするものである。具体
的には、本発明は、[化７]：
【化７】 [式中、ＬはＦ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'を共有結合的
に架橋連結するための１つまたは２つの基であり、Ｆ1a
b'は目的とする器官、組織、細胞、腫瘍または分子から
発現される抗原に対する特異性を有するポリクローナル
またはモノクローナル抗体のＦab'-様フラグメントであ
り、Ｆ2ab'はＦ1ab'と同じ特異性を有するか、または目
的とする器官、組織、細胞、腫瘍もしくは分子から発現
される別の抗原または診断もしくは治療物質に対する特
異性を有するポリクローナルまたはモノクローナル抗体
のＦab'-様フラグメントであり、Ｆ3ab'は診断または治
療物質に対する特異性を有するポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体のＦab'-様フラグメントであり、ある
いはＦ2ab'およびＦ3ab'はそれぞれＴ細胞表面のレセプ
ター／レセプター複合体および補助分子に対する特異性
を有している]で示される化合物を目的とするものであ
る。
【０００８】本発明の第２の目的は、(a)[化７]で示さ
れる３機能性抗体-様化合物、および(b)１つまたはそれ
以上の製薬的に許容され得る担体からなる医薬組成物で
ある。
【０００９】本発明の第３の目的は、(ｉ)診断しようと
する器官、組織、細胞または腫瘍に対する特異性を有す
る少なくとも１つのＦab'-様の部分を有し、さらにイメ
ージング物質に対する特異性を有する少なくとも１つの
Ｆab'-様の部分をも有する[化７]で示される化合物、お
よび１つまたはそれ以上の製薬的に許容され得る担体を
含有する医薬製剤の診断学的有効量を、診断を要する哺
乳動物に投与し、そして(ii)疾患、臨床症状または生物
学的状態を診断できるように、イメージング物質の診断
学的有効量を診断を要する哺乳動物に投与すること、を
特徴とする哺乳動物、好ましくはヒトにおける疾患、臨
床症状または生物学的状態を診断するための方法であ
る。
【００１０】本発明は第４の目的として、(ｉ)処置しよ
うとする器官、組織、細胞または腫瘍に対する特異性を
有する少なくとも１つのＦab'-様の部分を有し、それに
より器官、組織、細胞または腫瘍に結合し、さらに治療
物質に対する特異性を有する少なくとも１つのＦab'-様
の部分をも有する[化７]で示される化合物、および１つ
またはそれ以上の製薬的に許容され得る担体を含有する
医薬製剤の治療学的有効量を、処置を要する哺乳動物に
投与し、そして(ii)器官、組織、細胞または腫瘍に関連
する疾患の処置が行えるように、[化７]で示される化合
物が特異性を有している治療物質の治療学的有効量を処
置を要する哺乳動物に投与すること、を特徴とする哺乳
動物、好ましくはヒトにおける疾患、症状または状態を
処置するための方法を包含している。
【００１１】本発明の第５の目的は、(ｉ)第１の特異性
が疾患、症状または状態があると疑わしい器官、組織ま
たは細胞に対するものであるという３つの特異性を有す
る、[化７]で示される３機能性抗体-様化合物および１
つまたはそれ以上の製薬的に許容され得る担体を含有す
る医薬製剤の診断学的有効量を、診断を要する哺乳動物
に投与し、(ii)[化７]の化合物が第２の特異性を有する
イメージング物質の診断学的有効量を、哺乳動物に投与
し、(iii)得られたイメージングによって哺乳動物の診
断を行い、そして(iv)工程(iii)での診断が正しい場合
には、[化７]で示される化合物が第３の特異性を有する
治療物質の治療学的有効量を哺乳動物に投与すること、
を特徴とする疾患、臨床症状または生物学的状態を診断
および処置するための方法である。
【００１２】本発明の第６の目的は、疾患に関連する標
的細胞に保持されている抗原と結合することのできる第
１のＦab'-様の部分を含有し、さらにＴ細胞表面のレセ
プター／レセプター複合体および補助分子に対する特異
性をそれぞれ有する第２および第３のＦab'-様の部分を
も有する[化７]で示される化合物、および１つまたはそ
れ以上の製薬的に許容され得る担体を含有する医薬製剤
の治療学的有効量を、処置を要する哺乳動物に投与する
ことを特徴とする、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞関
連疾患、臨床症状または生物学的状態を処置するための
方法であって、該Ｔ細胞は該レセプター／レセプター複
合体および該補助分子が第２および第３のＦab'-様の部
分と会合すると活性化されて該標的細胞を破壊するもの
であり、[化７]で示される化合物が該標的細胞と、該Ｔ
細胞レセプター／レセプター複合体および該補助分子と
の両者に結合した場合に、該Ｔ細胞は活性化され、該標
的細胞は該活性化Ｔ細胞の近傍に位置するので、それに
より該Ｔ細胞が該標的細胞を破壊することができるとい
う方法である。
【００１３】あるいは、哺乳動物の疾患、症状または生
物学的状態を処置するための方法は、処置を要する哺乳
動物に、診断した疾患、症状または生物学的状態を処置
するための１つまたはそれ以上の治療物質を結合させた
[化７]で示される化合物の治療学的有効量を投与するこ
とを特徴とするものである。
【００１４】第１の目的では、本発明は上記の[化７]の
化合物を目的としている。[化７]の化合物は構造的に
は、Ｆ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'の中から選ばれる少な
くとも２つのものと共有結合して架橋連結を形成する１
つまたは２つの連結剤すなわちカップリング剤から構成
される中心部分「Ｌ」を有している。本発明で利用する
連結剤は、２価および３価のカップリング剤、すなわち
Ｆ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'の中から選ばれる少なくと
も２つのもの、における遊離のスルフヒドリル(-ＳＨ)
基と共有結合することのできる分子である。好ましい２
価および３価カップリング剤は、それぞれビス-マレイ
ミドおよびトリス-マレイミドである。
【００１５】本明細書で使用する「ビス-マレイミド」
なる用語は、有機分子であって、２つの各マレイミド部
分がそれぞれその分子の実質的に反対側の末端部に、ま
たはその近くに配置している共有結合した２つのマレイ
ミド部分を有するものを意味する。代表的なビス-マレ
イミド分子としては、Ｎ,Ｎ'-o-フェニレンジマレイミ
ド、Ｎ,Ｎ'-m-フェニレンジマレイミド、Ｎ,Ｎ'-p-フェ
ニレンジマレイミド、Ｎ,Ｎ'-ビス(マレイミドプロピオ
ニル)-２-ヒドロキシ-１,３-プロパンジアミン(ＢＭ
Ｐ)、ビス-(マレイミド)-メチル エーテル(ＢＭＭＥ)な
どである。好ましいビス-マレイミド分子は、シグマ・
ケミカルＣo.[Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO.]から
市販されているＢＭＰ、およびベーリンガー・マンハイ
ム[BoehringerMannheim Corp.,Indianapolis,IN]から市
販されているＢＭＭＥである。本発明では、同一または
異なっていてもよい２つのビス-マレイミド化合物を３
つのＦab'-様フラグメントの遊離のスルフヒドリル基と
反応させ、[化７]で示される化合物の「Ｌ」要素を形成
させる。
【００１６】本明細書で使用する「トリス-マレイミ
ド」なる用語は、[化８]：
【化８】 [式中、Ｘは
【化９】 であり、ｋは１または０であり、ｑは１または０であ
り、Ｙ'は
【化１０】 であり、Ｚは
【化１１】 であり、ｓは１または０であり、ｎは１または０であ
り、Ｙは
【化１２】 であり、ｐおよびｍは同一または異なっていてもよく、
０から２０までの整数である。ただし、ｎが０の場合、
ｍとｐとの合計は１から２０であり、ｎが１の場合、ｐ
とｍとはそれぞれ少なくとも１の整数であり、その合計
は２から２０である。また、Ｒ１は炭素数１から６の直
鎖状または分枝鎖状低級アルキルまたは低級アルコキシ
であり、Ｒ２は水素、フェニル、-ＣＯＯＨ、または炭
素数１から６の直鎖状もしくは分枝鎖状低級アルキルで
ある。ただし、その低級アルキル基は-ＮＨ2、-ＯＨま
たは-ＣＯＯＨによってモノ置換されていてもよい。]で
示される化合物を意味する。
【００１７】本発明では、[化８]で示される１つまたは
２つのトリス-マレイミドが、Ｆab'-様フラグメントの
遊離のスルフヒドリル基と結合して要素「Ｌ」を形成し
ていればよい。例えば、１つのトリス-マレイミド化合
物は３つのＦab'-様フラグメント(例えば、Ｆ1ab'、Ｆ2
ab'およびＦ3ab')と互いに架橋連結することができる。
しかし、１つのトリス-マレイミドをその基の２つだけ
と互いに架橋連結するのに用い、２つのトリス-マレイ
ミドを３つすべてのＦab'フラグメントの架橋連結に要
求するのが好ましい。本発明の３機能性抗体-様化合物
の形成反応における要素「Ｌ」としての２つのトリス-
マレイミドの使用を以下の反応式１[化１４]で説明す
る。同様に、本明細書の反応式２[化１５]では、要素
「Ｌ」の生成反応に２つのビス-マレイミドを使用する
ことを説明している。
【００１８】本発明の３機能性抗体-様化合物の形成
に、トリス-マレイミド化合物とビス-マレイミドとを併
用することも本発明の範囲内である。[化８]で示される
トリス-マレイミド化合物の合成には、化学分野で周知
の反応を利用している。通常の３価カップリング剤はト
リス-(２-Ｎ-マレイミドエチル)アミン(ＴＭＡ)、また
はトリス[２-Ｎ-(マレオイルグリシル)アミノエチル]ア
ミン(ＴＭＧ)であり、それぞれ実施例１および２に説明
するようにして製造される。
【００１９】本発明では、ビス-およびトリス-マレイミ
ドは共に、それらマレイミド部分が、Ｆ1ab'、Ｆ2ab'お
よびＦ3ab'の中から選ばれる少なくとも２つの基の遊離
のスルフヒドリル基に共有結合させる際には架橋連結剤
として機能する。以下に示すカップリング反応では、マ
レイミド部分(V)をＦab'-様フラグメント(VI)における
遊離のスルフヒドリルとカップリングさせてスクシンイ
ミド部分(VII)に変換する。
【化１３】 したがって、架橋連結が終了したなら、ビス-マレイミ
ド化合物はビス-スクシンイミド部分を形成する。同様
に、架橋連結を行えば、トリス-マレイミド化合物はト
リス-スクシンイミド部分になる。したがって、Ｆ1a
b'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'と共有結合し、本発明の要素
「Ｌ」を構成するものは、(VII)に類似したビス-スクシ
ンイミドおよびトリス-スクシンイミドである。
【００２０】[化７]の要素であるＦ1ab'、Ｆ2ab'および
Ｆ3ab'はそれぞれＦab'-様フラグメントであって、２つ
のフラグメントは同じ抗原特異性を有していてもよい
が、好ましくは各フラグメントが他のフラグメントと比
較して独自の抗原特異性を有しているものである。本明
細書で使用する「Ｆab'-様フラグメント」なる用語は、
天然、化学的修飾または遺伝子操作の由来のいかんにか
かわらず重鎖の１-３個の遊離スルフヒドリル基を有す
るＦabおよび／またはＦab'フラグメント、および／ま
たは遺伝子操作によって重鎖または軽鎖のいずれか、ま
たはその両方の鎖の組合わせに１−３個のスルフヒドリ
ル基を有するＦvフラグメントを包含する意味を有す
る。抗体、Ｆab'フラグメント、またはＦabフラグメン
トのいずれか由来の「Ｆvフラグメント」は、目的の抗
原に対する特異性を付与する領域である、抗体、Ｆab'
フラグメントまたはＦabフラグメントの可変(v)領域を
含有している。
【００２１】本発明に使用することのできるＦab、Ｆa
b'および／またはＦvフラグメントを遺伝子的に操作す
るに当たっては、フラグメントの抗原結合能を実質的に
妨害しないように、フラグメント内で操作される１−３
個のスルフヒドリル基を配置させなければならない。当
業者ならば、１つまたはそれ以上のスルフヒドリル基含
有アミノ酸をどのようにしてＦab、Ｆab'またはＦvフラ
グメントに遺伝的に挿入し、本発明での使用に適したＦ
ab'-様フラグメントを製造するかは、理解できるであろ
う。Ｆab'フラグメントなどの、タンパク質内の遊離の
スルフヒドリル基の数の測定は、当業界周知である[198
7年4月21日発行の米国特許第4,659,839号(Nicolotti
ら)]。
【００２２】遊離のスルフヒドリル基を含有するＦab'-
様フラグメントは、全抗体のヒンジ領域を酵素学的に開
裂することにより、製造される。通常は、抗体のヒンジ
領域またはその近傍での酵素学的開裂は、ペプシンまた
はパパインによって行う。当業界における規定では、Ｉ
gＧ1などの抗体を丸ごとペプシン開裂すれば、１つのＦ
(ab')2フラグメントと１つのＦc'フラグメントとが得ら
れる。次いで、このペプシン開裂により得られたＦ(a
b')2フラグメントを還元的に開裂させると、２つのＦa
b'フラグメントが生成される。
【００２３】当業界の規定によれば、還元条件下におけ
る全抗体のパパイン開裂は、２つのＦabフラグメントと
１つのＦcフラグメントを与える。Ｆabフラグメントは
Ｆab'フラグメントと構造的に類似しており、両フラグ
メントは抗体前駆体の無傷の抗原結合領域を含有してい
る。しかし、Ｆab'フラグメントはより重鎖を有してお
り、若干大きい点がＦabフラグメントと異なっている。
通常は、Ｆab'フラグメントはさらに、重鎖に１つまた
はそれ以上のスルフヒドリル基を有している点からもＦ
abフラグメントと異なっている。
【００２４】抗体の供給源である種に応じて、ヒンジ領
域における２つの重鎖間のジスルフィド架橋の数は変動
し得る。その結果、ＦabおよびＦab'フラグメントにお
ける遊離のスルフヒドリル(-ＳＨ)基の数も種によって
異なっている場合がある。例えば、マウスのＩgＧ1、Ｉ
gＧ2aおよびＩgＧ2b抗体をペプシン開裂し、次いで還元
すると、遊離の-ＳＨ基を３つ有するマウスＦab'フラグ
メントが得られる。これに対し、ヒトＩgＧ1抗体をペプ
シン開裂して還元すると、２つの遊離-ＳＨ基しか有し
ないＦab'フラグメントが得られる。ヒトＩgＧ1はＦab'
１つ当たり遊離のスルフヒドリル(-ＳＨ)を２つ有して
いるので、注目に値するものである。
【００２５】本発明の３機能性抗体-様化合物は多くの
経路によって合成することができる。選択される経路は
３つのＦab'-様部分の最終的な多様性に依存するところ
が大きい。例えば、３機能性抗体-様化合物は３つのＦa
b'-様フラグメントを有することができるが、例えばＦ1
ab'およびＦ2ab'は同じ組織、細胞または腫瘍抗原を目
的とし、Ｆ3ab'は治療またはイメージング物質のいずれ
かを目的し(実施例６)、あるいはＦ1ab'は組織、細胞ま
たは腫瘍抗原を目的し、Ｆ2ab'およびＦ3ab'は共に同じ
イメージング物質または同じ治療物質を目的とする場合
など、そのうちの２つしか多様性でない。
【００２６】本発明の化合物は、それぞれ独自の特異性
を備えた３つのＦab'-様フラグメントをも有することが
できる。選択する合成経路に関係無く、本発明の化合物
は、１−３個のスルフヒドリル基をそれぞれ独立して有
し、そのうち少なくとも２つのＦab'-様フラグメントが
異なる特異性を有している３つのＦab'-様フラグメント
の結合によって合成されるが、最後に、それら３つのＦ
ab'-様フラグメントを２つの２価もしくは２つの３価カ
ップリング剤、またはそれらを組合わせたものと反応さ
せる。しかし、本発明の化合物、すなわち[化７]で示さ
れる化合物は、それぞれが２つの遊離スルフヒドリル基
を有するＦab'-様フラグメントと、[化８]で示される３
価カップリング剤の２つとの一連の反応によって製造す
るのが好ましい。このような反応を以下の反応式１[化
１４]に示す。ここに、Ｆ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'は
完全に異なっていてもよく、またはＦ1ab'、Ｆ2ab'およ
びＦ3ab'のうち２つが同じであってもよい。
【００２７】以下の反応式１では、第１のＦab'-様フラ
グメントであるＦ1ab'を、pＨ５-８の水性緩衝液中、好
ましくはpＨ５-７の緩衝液中で、過剰量のトリス-マレ
イミド化合物ＸIと反応させる。
【化１４】 トリス-(またはビス)マレイミド化合物ＸIを少量(水性
反応物の容量の＜１０％)の有機溶媒に溶解し、それに
誘導体化しようとするＦab'-様フラグメントを加えれば
よい。必要な有機溶媒の量および性質は、架橋連結剤Ｘ
の疎水性によって左右される。得られた生成物は、突き
出た単一の反応性マレイミドを有する２価共有結合Ｆ1a
b'-トリス-マレイミド複合体ＸIIである。pＨ５−８、
好ましくはpＨ５−７ではＸIのマレイミド部分は遊離の
スルフヒドリル(-ＳＨ)基とのみ結合する一方で、pＨ＞
８では、ＸIのマレイミド部分はＦ1ab'のリシン残基の
アミノ基とも反応し得るので、反応のpＨは重要であ
る。反応pＨは、クエン酸緩衝化食塩水[５０mＭ クエン
酸アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ジエチレン
トリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、pＨ６.３]を水性緩衝液
として使用し、制御するのが好ましい。
【００２８】反応式１における次の反応では、ＸII由来
の１つのマレイミドをさらに、少なくとも２個の遊離-
ＳＨ基を含有する第２のＦab'-様フラグメント、Ｆ2ab'
とカップリングさせる。ＸIIに対して過剰量のＦ2ab'を
使用することにより、２つの特異性を有する２機能性抗
体-様化合物ＸＩＶが、２つのＦ1ab'フラグメントを有
する３抗体-様化合物(記載していない)よりも多く生成
するようにする。しかし、ある場合には、２つのＦab'
部分を有する３機能性抗体を生成させるの望ましいとき
があり、例えば２つのＦab'部分が同じ抗原、同じイメ
ージング剤または同じ治療物質を目的とする場合などで
ある。
【００２９】反応式１における第３の別の反応では、Ｆ
2ab'と同一のまたは異なる特異性を有することのできる
第３のＦab'-様フラグメント、Ｆ3ab'をトリス-マレイ
ミド化合物ＸIと共有結合させ、複合体ＸＶを生成させ
る。このカップリングは、pＨ５−８の、好ましくは５
−７の水性緩衝液中で行う。既述のように、水性緩衝液
は、トリス-マレイミドＸIを溶解するに有効な量の適当
な水-混和性有機溶媒(例えば、アセトニトリル、ＤＭＦ
など)を含有することもできる。第３のカップリングに
利用するトリス-マレイミド化合物ＸIは、第１の上記カ
ップリングで利用したトリス-マレイミド化合物ＸIと同
じであっても、異なっていてもよい。この第３のカップ
リングで得られた生成物ＸＶは突き出た単一の反応性マ
レイミド部分を有している。単一の反応性マレイミドを
有する化合物ＸＶ、および単一の遊離-ＳＨを有するＸ
ＩＶをpＨ５−８、好ましくはpＨ５−７の水性緩衝液中
で結合させる。既述のようにしてトリス-(またはビス)
マレイミド化合物を、誘導体化するＦab'-フラグメント
を加えた有機溶媒の少量(水性反応物容量の＜１０％)に
溶解することができる。ＸＶおよびＸＩＶをpＨ５−
８、好ましくはpＨ５−７の水性緩衝液中で混合すれ
ば、これら２つの化合物が共有結合して３機能性抗体-
様分子ＸＶIIが生成される。得られた生成物ＸＶIIは、
本発明の医薬製剤の活性成分としての利用性を有する、
[化７]で示される化合物である。
【００３０】反応式１で利用されるＦab'-様フラグメン
トは、ヒトＩgＧ1をペプシン開裂し、次いで得られたＦ
(ab')2フラグメントを還元することにより、得ることが
できる。さらに、ヒンジ領域に２つの遊離スルフヒドリ
ル基を有するＦab'-様フラグメントは、適当なヒト-マ
ウスのキメラ抗体からも得ることができる。適当なヒト
-マウスのキメラ抗体とは、マウス可変領域およびＩgＧ
1などから得られるヒト不変領域を有する抗体を意味す
る。ヒト不変領域はその内部にセグメントとしてのヒン
ジ領域を本来的に包含しているので、これらの抗体によ
り、ヒンジ領域に２つのスルフヒドリル基を有するＦa
b'-様フラグメントが得られる。ヒト不変領域は、その
キメラ抗体をヒトに投与したときにおける免疫応答の機
会を最小限に抑えるので、ヒト不変領域を有するこれら
キメラＦab'-様フラグメントは非-ヒト由来のＦab'-フ
ラグメントよりも医薬製剤として使用するのに好ましい
ものである。
【００３１】反応式２[化１５]は一般に、[化７]で示さ
れる化合物を製造するための他の好ましい反応を説明す
るものである。反応式２では、２つのビス-マレイミド
化合物、およびそれぞれが３つの遊離の-ＳＨ基を有す
る３つのＦab'-様フラグメントから、本発明の３機能性
抗体-様化合物を合成する。反応式２における第１のＦa
b'-様フラグメントＸＩＸaは３つの遊離の-ＳＨ基を有
しているので、それは酸化することができ、あるいは酸
化してＸＩＸb(ジスルフィド(-Ｓ-Ｓ-)架橋と、カップ
リングに適している単一の遊離の-ＳＨとを有するフラ
グメント)を生成させることができる。しかし、反応式
２は第１の反応として、還元したＦ1ab'、ＸＩＸaまた
は酸化したＦ1ab'、ＸＩＸbをpＨ５−８、好ましくはp
Ｈ５−７の水性緩衝液中でビス-マレイミド、ＸＸとカ
ップリングさせれば、それぞれカップリングされた生成
物、ＸＸIaおよびＸＸIbが得られることを示しており、
それらは機能的に等価である。ビス-(またはトリス)マ
レイミド化合物を、少量(水性反応物容量の＜１０％)の
有機溶媒に溶解し、それに誘導体化するＦab'-様フラグ
メントを添加すればよい。適当な水混和性有機溶媒はＤ
ＭＦ、アセトニトリルなどである。ＸＸIaでは、スルフ
ヒドリルのうちの２つを第１のビス-マレイミド分子の
反対側の末端に共有結合させる。同様に、ＸＸIbでは、
スルフヒドリルのうちの２つを分子内ジスルフィド架橋
(-Ｓ-Ｓ-)の生成によって結合させる。ＸＸIaおよびＸ
ＸIbは共にスルフヒドリルとカップリングしたビス-マ
レイミド部分の一方の末端を有しており、したがって反
応性マレイミドをその端に有するビス-マレイミドの別
の末端がそこから伸びている。
【化１５】
【００３２】反応式２の第１の反応は別の態様として
(図示していない)、ＸＩＸaは、ＸＩＸbにおけるような
ジスルフィド形成またはＸＸIbにおけるようなビス-マ
レイミド架橋の必要性を排除できるような単一のスルフ
ヒドリル基しか有していない、同様にＦab'-様フラグメ
ントであってもよい。
【００３３】明瞭にするため、反応式２[化１５]におけ
る次の反応として、分子内の３つのスルフヒドリルのう
ちの２つと分子内架橋するビス-マレイミド部分を有す
るＸＩＸbから得られる化合物のみを示している。その
次の反応では、突き出た反応性マレイミド部分を有する
ＸＸIb化合物を、pＨ５−８、好ましくは５−７の水性
緩衝液中で、３つの遊離スルフヒドリル基を有する第２
のＦab'-様フラグメント、Ｆ2ab'の好ましくは等モル量
以下の量と混合する。得られたカップリング生成物ＸＸ
IIは、残った２つの遊離スルフヒドリル基を有する２機
能性抗体-様化合物であり、以後のカップリングにはそ
のうちの一方のみが必要となる。反応式２に示す別の反
応では、第３のＦab'-様フラグメント、Ｆ3ab'を反応式
２の第１の反応のようしてpＨ５−８、好ましくはpＨ５
−７の水性緩衝液中でカップリングさせることにより、
突き出た単一のマレイミドを有する、共有結合した複合
体ＸＸIIIを得る。反応式２に示すＦ3ab'は単一のビス-
マレイミドによって架橋された、３つの遊離スルフヒド
リル基の２つを有するＦab'-様フラグメントであるが、
その３つのスルフヒドリルのうち２つは、酸化されてジ
スルフィドを形成していてもよい。さらに、反応式２の
Ｆ3ab'は同様に、単一の遊離スルフヒドリル基しか有し
ていないＦab'-様フラグメントであってもよい。反応式
２における最終反応では、反応性末端マレイミド部分を
有する複合体ＸＸIIIを、少なくとも１つの遊離スルフ
ヒドリル基を有する複合体ＸＸIIと、pＨ５−８、好ま
しくはpＨ５−７の水性緩衝液中でカップリングさせ
る。得られたカップリング生成物は、[化７]で示される
３機能性抗体-様化合物ＸＸＩＶである。
【００３４】このように、反応式２では、第１および第
３のＦab'-様フラグメントが始めに奇数個、すなわち１
または３個の遊離スルフヒドリル基を有している場合
に、本発明の３機能性抗体-様化合物を製造することが
できる。
【００３５】反応式３[化１６]は、Ｆ2ab'と命名される
Ｆab'-様フラグメントが３つではなく２つの遊離スルフ
ヒドリル基を有している点を除き、実質的に反応式２と
同様である。反応式２で示しているように、マレイミド
部分とスルフヒドリル基との間のすべてのカップリング
は、pＨ５−８、好ましくはpＨ５−７の水性緩衝液中で
行う。反応式１および２と同様、反応式３で使用する水
性緩衝液は、クエン酸緩衝化食塩水[５０mＭ クエン酸
アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ジエチレント
リアミン五酢酸、pＨ６.３]が好ましい。反応式１およ
び２のように、ビス-(またはトリス)マレイミド化合物
を、少量(水性反応物容量の＜１０％)の有機溶媒に溶解
し、それに誘導体化するＦab'-フラグメントを添加すれ
ばよい。したがって、反応式１−３で行う場合、遊離ス
ルフヒドリル基の種々の組合わせを有するＦab'-様フラ
グメントを混合して、本発明の３機能性抗体-様化合物
を製造することができるであろう。
【００３６】本発明の３機能性抗体-様化合物は、診
断、治療および／またはその双方への利用性を有する医
薬製剤として使用するのに特に好適である。本明細書で
使用する「診断」なる用語は、哺乳動物、好ましくはヒ
トにおける疾患または生物学的状態(例えば、妊娠、不
妊)をインビトロまたはインビボで診断することに関連
する試験を意味する。本明細書で使用する「治療」およ
び「治療／診断の双方(組合わせ)」なる用語はそれぞ
れ、疾患または生物学的状態の処置、または診断および
処置を意味する。
【化１６】
【００３７】３機能性抗体-様化合物は、医薬活性物質
として特に有用とする幾つかの態様を包含する。本発明
の医薬活性物質としての態様は、診断／治療物質として
使用するのに特に適している。診断／治療の組合わせ物
質として使用できる１つの態様では、[化７]でも示され
る本発明の医薬活性物質は３つの異なる特異性を有する
３つのＦab'-様の基(部分)を有している。
【００３８】Ｆ1ab'と命名される第１のＦab'-様部分
は、目的とする器官、組織または細胞の抗原、ハプテン
またはエピトープ(以下、「抗原」と総称する)に対する
特異性を有しており、それらと結合する。[化７]におい
てＦ2ab'と命名される第２のＦab'-様部分は、第１のＦ
ab'-様フラグメントが特異性を示す器官、組織または細
胞のイメージング、および／またはその器官、組織もし
くは細胞に関連する癌などの状態の診断、および／また
は得られたイメージングに基づいて投与すべき治療物質
の投与量の決定を可能にする、診断用イメージングまた
は線量測定／アイソトープ複合体(例えば、キレート化
した核種または常磁性物質)に対する特異性を有してい
る。[化７]においてＦ3ab'と命名される第３のＦab'-様
部分は、その固定化されたＦ2ab'およびその固定化抗原
によって器官、組織または細胞がイメージングされるこ
とにより期待された状態が提示されたなら、臨床医が所
望により患者に投与することができる治療物質に対する
特異性を有している。この利用性では、本発明の医薬活
性物質は、その作用部位において２機能性を有する(す
なわち、診断および治療)。
【００３９】あるいは、純粋な診断物質として使用する
場合には、[化７]で示される医薬活性物質の第２および
第３のＦab'-様部分は、直接または間接的に、同一また
は異なった診断用イメージングまたは線量測定用錯体に
対する特異性を有している。同様に、純粋な治療物質と
して使用する場合には、本発明の医薬活性物質における
第２および第３のＦab'-様部分は共に、直接または間接
的に、同一または異なった治療物質に対する特異性を有
している。
【００４０】２つの異なる腫瘍抗原に対する特異性を有
する本発明の医薬活性物質が有用である場合がある。例
えば、黒色腫はp９６.５またはgp２４０抗原、またはそ
の両者を発現し得るという幾つかの証拠がある。それが
事実とすれば、本発明の化合物がこれら２つの抗原に対
する結合特異性を有するＦ1ab'およびＦ2ab'部分、およ
び診断目的のイメージング物質または治療目的の医療用
もしくは治療用同位元素に対する特異性を有するＦ3ab'
部分を有する場合には、それは有用である。乳癌におい
ても同様のことがあり得、ＫＳ１/４抗原またはＣＥ
Ａ、またはその両者を発現する腫瘍が幾つか存在する。
したがって、Ｆ1ab'およびＦ2ab'部分を介してＫＳ１/
４およびＣＥＡに対する特異性を有し、かつＦ3ab'を介
して診断または治療物質に対する特異性を有する本発明
の化合物も同様に有用である。本発明の医薬活性物質は
他の２元抗原系に同様に適用できると類推される。
【００４１】上記の利用性にかかわらず、本発明の３機
能性抗体-様化合物は、目的とする器官、組織、細胞ま
たは分子の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つ
のＦab'-様フラグメント(以下、第１のＦab'-様フラグ
メントという)を有している。本明細書で使用する「組
織」なる用語は、正常組織および異常組織の両者を意味
する。例えば、「異常組織」には、腫瘍、癌、前癌、悪
性新生物、壊死組織などが包含される。
【００４２】多くの腫瘍関連抗原が当業者に知られてい
る。それら腫瘍抗原を例示すれば、α-フェトプロテイ
ン、c-erbＢ-２、癌抗原１５-３(ＣＡ １５-３)、ＣＡ
１９-９、ＣＡ １２５、ＣＡ １９５、ＣＡ ５４９、癌
胎児性抗原(ＣＥＡ)、カテプシンＤ(cathＤ)、サイトケ
ラチン類、ＤＵ-ＰＡＮ-２、上皮性成長因子レセプター
(ＥＧＦ-Ｒ)、エストロゲンレセプター、c-myc、Ｎ-my
c、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ラス、腫瘍関連抗原-７
２(ＴＡＧ-７２)、腫瘍関連抗原-４(ＴＡ-４)、および
ＫＳ１/４などがあるが、それらに限定されない。これ
らおよび他の多くの腫瘍抗原に対するモノクローナル抗
体が既に産生されている。これらのモノクローナル抗体
の産生についての記載が1989年3月21日発行の米国特許
第4,814,438号で表にされている。
【００４２】好ましくは、Ｆ2ab'および／またはＦ3ab'
が有し得る特異性の対象であるイメージング物質によ
り、あらゆる疾患に関連する器官または組織のインビボ
診断のための特別の身体イメージングが可能になる。代
表的なイメージング物質は、キレート剤と放射性核種、
またはキレート剤と常磁性金属イオンとで形成される生
理学的に適合し得るキレート錯体である。放射性核種に
より、ガンマ線シンチレーション測光法に基づいて組織
および／または器官のイメージングが可能であり、また
常磁性金属イオンにより、磁気共鳴イメージング(ＭＲ
Ｉ)に基づいて器官および／または組織の視覚化が可能
である。イメージング法はインビボイメージング分野で
は周知である。本明細書で使用する「生理学的に適合し
得るキレート錯体」とは、キレート剤と常磁性金属イオ
ンまたは放射性核種との錯体であって、生理学的に適合
できない量の常磁性金属イオンまたは放射性核種をイン
ビボにおいてその錯体から解離させることのないものを
意味する。生理学的に適合し得るキレート錯体の解離定
数は小さいので、有害作用を伴って哺乳動物の体の種々
の組織に吸収され得る重金属イオンまたは放射性核種の
放出は、たとえあったとしても、ほとんど僅かにしてい
る。生理学的に適合し得るキレート錯体の解離定数は１
０-16またはそれ以下が好ましく、より好ましくは１０
-18またはそれ以下であり、１０-20またはそれ以下が最
も好ましい。
【００４３】放射性核種および／または常磁性金属イオ
ンにとって適切なキレート剤は、有機窒素、リン、酸素
または硫黄をさらに含有する多重酸の有機分子である。
適切なキレート剤を例示すれば、エチレンジアミン四酢
酸(ＥＤＴＡ)、エタノールアミンチオ尿素ベンジル-Ｅ
ＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)、ジエチレントリアミン五酢酸
(ＤＴＰＡ)、メチルチオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴ
ＵＢＤ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-
Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、Ｌ-アミノ
ベンジル-ＥＤＴＡ、１,５,９,１３-テトラアザシクロ
ヘキサデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＨＥＴＡ)、
１,４,７,１０-テトラアザシクロトリデカン-Ｎ,Ｎ',
Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＲＩＴＡ)、１,４,８,１１-テト
ラアザシクロテトラデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸
(ＴＥＴＡ)などがあるが、これらに限定されない。ＥＤ
ＴＡ、ＤＴＰＡおよびそれらの同族体の２機能性誘導体
の製造方法は、1986年11月11日のMearesらの米国特許第
4,622,420号に記載されている。ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴ
Ａ、ＨＥＴＡおよびＴＥＴＡの２機能性誘導体を製造す
るための方法は、1987年7月7日発行のMearesらの米国特
許第4,678,667号、およびMoiらのJ.Am.Chem.Soc.,110:6
266(1988)に記載されている。上記のキレート剤はすべ
て種々の金属イオンと生理学的に適合し得るキレート錯
体を形成する。他の適当な有機キレート剤は、米国特許
第4,647,447号[Griesら]に開示されている。
【００４４】診断用ガンマシンチレーション測光法によ
って器官および組織をインビボにおいてイメージングす
るのに適した放射性核種には、ガンマ線放出放射性核種
である111Ｉn、113mＩn、67Ｇa、68Ｇa、99mＴc、51Ｃ
r、197Ｈg、203Ｈg、169Ｙb、85Ｓr、および87Ｓrがあ
る。これらの放出放射性核種はイオン形態のときにキレ
ート化され得る。これらの放射性核種の中では、111Ｉn
(III)が好ましい。Ｆab'フラグメントに結合されるのに
適したキレート化放射性核種の製造法は、米国特許第4,
659,839号(Nicolettiら)に記載されている。
【００４５】ＭＲＩにイメージング物質として使用する
のに適した常磁性金属イオンは、原子番号５７−７０の
ランタニド元素、または原子番号２１−２９、４２もし
くは４４の遷移金属である。米国特許第4,647,447号(Gr
iesら)には、キレート化常磁性金属イオンによるＭＲＩ
イメージング法が教示されている。
【００４６】本発明の３機能性抗体-様化合物の１成分
である第３のＦab'-様フラグメントは治療物質に対する
特異性を有している。本明細書で使用する「治療物質」
とは、臨床医の目的に応じて、それ自身明白な疾患、症
状、または生物学的状態を処置するために投与される物
質を広く意味する。
【００４７】別の態様では、第２および／または第３の
Ｆab'-様フラグメントは、１つまたはそれ以上の治療物
質に対する特異性を直接または間接的に、個別に有する
ことができる。治療物質に対する特異性が「直接的」と
は、Ｆab'フラグメントが治療物質自体に対して特異的
である場合をいう。第２および／または第３のＦab'-様
フラグメントに「直接的に」結合される治療物質には、
キレート剤とβ-エミッターである放射性核種とによっ
て生成されるキレート錯体がある。「β-エミッター」
とは、本明細書では、疾患、症状または生物学的状態を
処置するうえで有益な作用を及ぼすに充分なエネルギー
と振動数を備えたβ-粒子を放出する、キレート化可能
な放射性核種を意味する。適当なβ-エミッターには、
67Ｃu、186Ｒh、188Ｒh、189Ｒh、153Ｓm、90Ｙおよび
111Ｉn(Aaoger)がある。β-エミッターはイオン形態の
とき、特に酸化数＋１から＋４のときにキレート化す
る。β-エミッターの選択は、疾患、症状のタイプ、患
者の年齢、疾患の程度、処置に基づく予後、局在部位な
どによって左右される。特に好ましいβ-エミッターは
90Ｙ(III)である。
【００４８】イオン形態にあるβ-エミッターにとって
適切なキレート剤は、有機窒素、リン、酸素または硫黄
を含有する多重酸の有機分子である。適切なキレート剤
を例示すれば、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、エ
タノールアミンチオ尿素ベンジル-ＥＤＴＡ(ＥＯＴＵＢ
Ｅ)、ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)、メチル
チオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴＵＢＤ)、１,４,７,
１０-テトラアザシクロドデカン-Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',
Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、Ｌ-アミノベンジル-ＥＤＴ
Ａ、１,５,９,１３-テトラアザシクロヘキサデカン-Ｎ,
Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＨＥＴＡ)、１,４,７,１０-テ
トラアザシクロトリデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸
(ＴＲＩＴＡ)、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラ
デカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＥＴＡ)などがあ
るが、これらに限定されない。これらの化合物の合成に
ついては本明細書で既述した。他の適当な有機キレート
剤は、1987年3月3日発行の米国特許第4,647,447号[Grie
sら]に開示されている。
【００４９】Ｆab'-様部分または本発明の化合物と直接
結合できる、特に好ましい治療物質は90Ｙ-ＭeＴＵＢ
Ｄ、90Ｙ-ＤＴＰＡ、90Ｙ-ＤＯＴＡ、およびそれらのダ
ンベル型誘導体である。
【００５０】本発明の３機能性抗体-様化合物は、新規
なクラスの２機能性「ダンベル型」キレート剤から形成
される製薬的に許容し得るキレート錯体と共に使用する
こともできる。これらのダンベル型キレート剤は、リン
カーアームの第１末端部にＥＤＴＡまたはその誘導体
を、およびそのリンカーアームの別の(反対の)末端部に
それと同一または別のキレート剤を有している。そのリ
ンカーアームの反対末端部に使用するうえで好ましいキ
レート剤は、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＭeＴＵＢＤ、
ＤＯＴＡ、Ｌ-アミノベンジル-ＥＤＴＡ、ＨＥＴＡ、Ｔ
ＲＩＴＡ、およびＴＥＴＡである。
【００５１】このダンベル型キレート剤は、抗体の特異
性を変える必要性もなく、診断または治療用の金属イオ
ンを標的部位において変化させるための単純な方法に使
用することができる。例えば、本発明の３機能性抗体-
様化合物をＦ1ab'を介して標的部位に固定化し、Ｆ2ab'
がＩn-ＥＤＴＡ錯体に対する特異性を有する場合を想定
すればよい。Ｆ2ab'部分はしたがってイメージング物
質、111Ｉn-ＥＤＴＡ、または基底状態(または非-放射
活性)Ｉn-ＥＤＴＡ錯体と結合することができる。Ｉn-
ＥＤＴＡ錯体をその第１の末端部に有するダンベル型キ
レート剤を投与すると、Ｉn-ＥＤＴＡ末端はＦ2ab'に結
合される。このダンベルの別の末端部のキレート剤を変
えると、種々のイメージング物質(例えば、放射活性ま
たは常磁性金属イオン)または種々の治療用金属イオン
(例えば、β-エミッター)に対するキレート剤の特異性
も変動される。これらのダンベル型キレート剤の製造お
よび用途は、欧州特許公開第0136835号に充分に記載さ
れている。このように、ダンベル型キレート剤と共に単
一の本発明３機能性抗体-様化合物を使用するだけで、
当業者ならば、すべての種類のイメージング用および／
または治療物質を製造することができる。
【００５２】ダンベル型キレート剤はさらに、２つの放
射活性90Ｙ(III)イオンを単一のＦab'-様部分に結合さ
せるのに有用であり、標的部位に結合される３機能性抗
体-様化合物の量を２倍にする必要もなく、局在量を有
効に２倍にすることができる。
【００５３】既述のように本発明の化合物は治療物質に
対する直接的な特異性を有することとは対照的に、治療
物質に対する間接的な特異性を有することもできる。治
療物質に対する本発明の化合物の特異性が「間接的」と
は、少なくとも１つのＦab'-様部分が酵素に対する特異
性を有する場合を意味する。本明細書で使用する「酵
素」とは、天然に存在するか、または遺伝子的に操作し
た酵素またはその活性フラグメントを意味する。
【００５４】ある場合には、Ｆab'-様部分によって既に
結合されている酵素と共に[化７]で示される化合物を投
与することを望む場合がある。この場合、本発明の化合
物は少なくとも１つのＦab'-様部分(基)によって作用部
位、すなわち腫瘍に結合する。その作用部位にＦab'-様
部分の１つによって固定化された酵素はその基質を、好
ましくは開裂によって産物に変換することができる。投
与した基質が治療物質と結合すれば、酵素はその基質を
開裂し、作用部位、例えば腫瘍において治療物質を局所
的に放出させる。
【００５５】治療物質はその基質から開裂されるまで、
生物学的活性を殆ど、または全く示さないのが好まし
い。この態様では、当業者ならば、あらゆる個々の酵素
基質に結合する治療物質の数およびタイプを容易に改変
することができる。このような多様性は、症状、重篤
度、具体的な薬物に対する患者の感受性、および既に投
与した薬物に対する応答などの因子に応じた、個々の患
者の要求に対する投与量および処置法の臨床医による管
理方法を可能にするものである。臨床医は、同じまたは
類似した基質に結合する、または同じ酵素基質に同時-
結合して目的とする器官、組織もしくは腫瘍に相乗的な
局在効果を付与するための２つまたはそれ以上の治療物
質の同時投与さえも行えるであろう。その結果、体の他
の(健康な)部位における、放出された治療物質による悪
い作用が作用部位からの距離が開くに連れて一般に最小
限に抑えられる。全身性の悪い作用が最小限に抑えられ
ることは、健康および疾患性の組織、器官または細胞を
区別できない細胞毒性物質などの治療物質の場合は特に
重要である。
【００５６】この態様では、酵素基質を細胞毒性物質と
コンジュゲートして下記の[化１７]で示される治療物質
を製造するのが好ましい。
【化１７】基質−細胞毒性物質 [式中、基質は酵素またはその活性フラグメントに対す
る基質であり、その酵素と基質-細胞毒性物質との反応
により、細胞毒性物質がその基質から放出され、そして
基質と細胞毒性物質とは、基質における適当な反応性基
から生成されるエーテル、チオエーテル、エステル、ア
ミド、アミノ、ヒドラジド、カルボネート、カルバメー
ト、チオカルバメート、チオエステル、チオアミドまた
はチオカルボネート基、および細胞毒性物質におけるヒ
ドロキシ、チオエーテル、アミン、アミド、ヒドラジ
ド、カルボキシまたはカルバメート基を介して互いに結
合されている。あるいは、基質は細胞毒性物質の前駆体
であってもよい。例えば、チェン(Chen)らの欧州特許公
開第0382411号を参照のこと。]
【００５７】[化１７]で示される基質成分は最も広範な
範囲では、[化１７]の治療物質を投与する患者と生理学
的に適合し得る酵素によってインビボで開裂され得るあ
らゆる酵素基質である。循環する酵素は、[化７]で示さ
れる化合物によって補足されて局在化する前に[化１７]
を開裂して細胞毒性物質を放出してしまうので、好まし
くは、酵素は本質的に患者体内を循環すべきでない。
[化１７]の酵素成分にとって好ましい基質は、β-ラク
タマーゼ、Ｌ-ピログルタメート アミノペプチダー
ゼ、β-ガラクトシダーゼまたはＤ-アミノ酸ペプチダー
ゼなどの非-哺乳動物酵素に対する基質である。特に好
ましい基質は、ペニシリン、ペネム、カルバペネム、セ
ファロスポリン、１-カルバデチアセファロスポリン、
または１-オキサデチアセファロスポリンなどのβ-ラク
タム部分を有する化合物である。対応する特に好ましい
酵素はβ-ラクタマーゼであり、最も好ましいものは、
エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)
から得られるβ-ラクタマーゼである。
【００５８】本明細書で使用する「細胞毒性物質」なる
用語は、良性または悪性を問わず、新生組織(ネオプラ
ズム)の処置に有用である化合物を意味する。このよう
な薬物としては一般に、アルキル化剤、抗増殖剤、チュ
ーブリン結合剤、一般の細胞毒などがある。このような
化合物の中で好ましい種は、ナイトロジェンマスタード
物質、ビンカアルカロイド、ダウノマイシン族、マイト
マイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシド、プ
テリジン族薬物、ポドフィオフィルロトキシン、スルホ
ニル尿素(1987年3月20日公開の欧州特許公開第222,475
号に記載されている)、ならびにトリコテセン類(tricho
thecenes)およびコルヒチン類などの低分子量毒素など
である。特に好ましいものは例えば、ドキソルビシン、
ダウノルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、
メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイ
シンＣ、ポルフィロマイシン、５-フルオロウラシル、
６-メルカプトプリン、シトシン・アラビノシド、ポド
フィルロトキシン、エトポシド、メルファラン、ビンブ
ラスチン、ビンクリスチン、ラウロシジン、ビンデシ
ン、ラウロシン、トリコテセン、デスアセチルコリヒシ
ンなどである。基質と細胞毒性物質とのコンジュゲート
を容易にするため、当業界の化学者は、上記の好ましい
および一般的に記載した化合物に対して、重要でない化
学的修飾を施すことができる。[化１７]で示される好ま
しい基質-細胞毒性物質は、上記の好ましい細胞毒性物
質および酵素基質から製造される。
【００５９】他の態様として、本発明の化合物はＴ細胞
に指向し、Ｔ細胞を活性化し、またはそうでなくても、
死滅させようとする標的細胞に対してＴ細胞を感作する
ことができる。この態様では、[化７]における要素は、
以下のように表される：ＬはＦ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3a
b'を架橋連結するための１つまたは２つの部分であり、
ここに、Ｆ1ab'は、目的とする細胞または腫瘍から発現
される抗原の特異性を有するポリクローナルまたはモノ
クローナル抗体のＦab'-様フラグメントであり、Ｆ2ab'
およびＦ3ab'は、それぞれＴ細胞表面上のＴ細胞レセプ
ター／レセプター複合体および補助分子(accessory mol
ecule)に対する特異性を有している。補助分子はＣＤ
２、ＣＤ４、ＣＤ５または他のＴ細胞表面マーカーであ
ってよい。この態様では、Ｆ2ab'およびＦ3ab'によって
Ｔ細胞に付着する本発明の化合物は、Ｌに取り巻かれる
リンカーアームの末端に位置するＦ1ab'によって、標的
細胞または腫瘍(細胞)から発現される抗原と結合するこ
とができる。
【００６０】Ｔ細胞レセプター／レセプター複合体およ
び補助分子に対するモノクローナル抗体を生産すること
は、当業者の技術範囲内であり、種々の細胞性および腫
瘍抗原に対するモノクローナル抗体が従来記載されてい
るように当業界では生産されている。
【００６１】本発明の教示に従えば、抗原を発現する種
々の細胞および／または腫瘍に対する特異性を有する一
連の全Ｔ細胞活性化物質は当業者によって製造すること
ができる。Ｆ2ab'およびＦ3ab'を製造したなら、Ｆ1ab'
を改変させるだけでよい。カップリングは、２つの２価
もしくは２つの３価カップリング剤またはそれらを併用
して、本明細書に記載のように行う。
【００６２】本発明の別の目的は、[化７]で示される３
機能性抗体-様化合物を医薬製剤の活性成分として使用
することに関する。より具体的には、本発明の第２の目
的として、(a)本明細書に記載の[化７]で示される化合
物、および(b)１つまたはそれ以上の製薬的に許容され
得る担体、を含有する医薬組成物を提供することにあ
る。本発明の医薬組成物は、製薬業界既知の剤形および
方法によって、腸管外注射、すなわち血管内、腹腔内、
皮下、筋肉内または局所に投与することができる。本発
明の腸管外投与用医薬組成物およびその調製方法として
は、[化７]で示される活性成分は通常、目的とする投与
剤形および製薬業界のプラクティスに則って適切に選択
された適当な製薬的希釈剤、賦形剤または担体(以下、
総称して「担体」という)との混合物として投与され
る。
【００６３】黒色腫に対するなどの、局所投与では、治
療学的有効量の１つまたはそれ以上の本発明の化合物を
製薬的に許容され得るクリーム、オイル、ワックス、ゲ
ルなどと混合すればよい。選択した投与経路に関係無
く、本発明の化合物は当業界既知の常法によって製薬的
に許容され得る投与剤形に製剤化する。また、[化７]で
示される化合物は１つまたはそれ以上の製薬的に許容さ
れ得る塩基付加塩を使用して医薬活性物質とすることも
できる。さらに、[化７]で示される化合物またはその塩
は適当な水和物または凍結乾燥品として使用することが
できる。好ましくは、本発明の化合物は単位投与剤形と
して投与する。
【００６４】本発明の目的はさらに、本発明の医薬製剤
を利用して、疾患の診断、処置および処置と診断の両方
を行うための方法に関する。このように、本発明は第３
の目的として、(ｉ)診断しようとする器官、組織、細胞
または腫瘍に対する特異性を有する少なくとも１つのＦ
ab'-様の部分を有し、さらにイメージング物質に対する
特異性を有する少なくとも１つのＦab'-様の部分をも有
する[化７]で示される化合物、および１つまたはそれ以
上の製薬的に許容され得る担体を含有する医薬製剤の診
断学的有効量を、診断を要する哺乳動物に投与し、そし
て(ii)疾患、臨床症状または生物学的状態を診断できる
ように、イメージング物質の診断学的有効量を診断を要
する哺乳動物に投与すること、を特徴とする哺乳動物、
好ましくはヒトにおける疾患、臨床症状または生物学的
状態を診断するための方法を提供するものである。
【００６５】上記の診断方法では、[化７]で示される化
合物は１つまたは２つのＦab'-様部分によって、目的と
する組織、器官、細胞または腫瘍から発現される１つま
たは２つの抗原に体する特異性を有することができる。
これらの抗原は既述のように同一または異なっていても
よい。あるいは、[化７]の化合物における２つのＦab'-
様部分は同一または異なっていてもよいが、目的とする
組織、器官、細胞または腫瘍から発現される同じ抗原に
対する特異性を有している。２つのＦab'-様部分を同じ
モノクローナル抗体から誘導すれば、それらは同じであ
り、同じ特異性を有することになる。２つのＦab'-様フ
ラグメントは、同じ抗原に対する異なるポリクローナル
抗体から、好ましくは同じ抗原に対する異なるモノクロ
ーナル抗体から誘導すれば、異なるものとなるが、同じ
特異性を有している。後者のモノクローナル抗体の例と
しては、実施例３に記載の共に癌胎児性抗原(ＣＥＡ)に
対する特異性を有するＣＥＭおよびＺＣＥが挙げられ
る。
【００６６】既述した方法の種々の態様では、[化７]で
示される化合物は同一または異なっている１つまたは２
つのイメージング物質に対する特異性を有することがで
きる。種々のタイプの医療用のイメージング物質を本明
細書において説明している。当業者には、これらの使用
は通常のものである。
【００６７】本発明は第４の目的として、(ｉ)処置しよ
うとする器官、組織、細胞または腫瘍に結合すべく、そ
れら器官、組織、細胞または腫瘍に対する特異性を有す
る少なくとも１つのＦab'-様部分を有し、さらに治療物
質に対する特異性を有する少なくとも１つのＦab'-様の
部分をも有する[化７]で示される化合物、および１つま
たはそれ以上の製薬的に許容され得る担体を含有する医
薬製剤の治療学的有効量を、処置を要する哺乳動物に投
与し、そして(ii)器官、組織、細胞または腫瘍に関連す
る疾患の処置が行えるように、[化７]で示される化合物
が特異性を有している治療物質の治療学的有効量を処置
を要する哺乳動物に投与すること、を特徴とする哺乳動
物、好ましくはヒトにおける疾患、症状または状態を処
置するための方法を包含している。
【００６８】この疾患の処置方法では、[化７]で示され
る化合物は、処置が望まれる器官、組織、細胞または腫
瘍から発現される１つまたは２つの抗原に対する特異性
を有し得る。この２つの抗原は同一または異なっていて
もよい。さらに、上記診断方法において説明したよう
に、同じ抗原(しかしエピトープは異なり得る)に対する
特異性を有する異なる抗体から誘導される２つのＦab'-
様部分を使用することができる。
【００６９】疾患の処置方法における種々の態様では、
[化７]で示される化合物は既述のように直接または間接
的に１つまたは２つの治療物質に対する特異性を有する
ことができる。少なくとも１つのＦab'-様フラグメント
が間接的に治療物質に対する特異性を有する場合、例え
ば基質-治療物質複合体から治療物質を遊離することの
できる酵素に対する特異性を有するような場合には、１
回以上の投与量の基質-治療物質複合体を投与すれば、
工程(ｉ)を繰り返す必要もなく、すなわち[化７]の化合
物を再度投与することなく、酵素に基づく作用を行わし
めることができる。基質に結合する治療物質を変えて多
重治療物質処置を行う処置方法も、本発明の範囲内に属
される。種々の基質-治療物質複合体は、患者の年齢お
よび状態、疾患のタイプ、状態または症状に応じて、ま
た従来の処置に対する応答、有り得る薬物-薬物相互作
用および担当医に応じて、一緒に、または別々に投与す
ることができる。
【００７０】哺乳動物患者の診断および処置の双方を行
う方法も本発明の範囲に属する。この方法は、(ｉ)診断
しようとする器官、組織、細胞または腫瘍に対する特異
性を有する第１のＦab'-様部分、イメージング物質に対
する特異性を有する第２のＦab'-様部分、および治療物
質に対する第３のＦab'-様部分を有する[化７]で示され
る化合物、および１つまたはそれ以上の製薬的に許容さ
れ得る担体を含有する医薬製剤の診断学的有効量を、診
断を要する哺乳動物に投与し、(ii)[化７]の化合物が第
２の特異性を有しているイメージング物質の診断学的有
効量を、哺乳動物に投与し、(iii)得られた画像(イメー
ジング)に基づいて哺乳動物の診断を行い、そして(iv)
工程(iii)の診断が保証的であった場合には、[化７]で
示される化合物が第３の特異性を有する治療物質の治療
学的有効量を哺乳動物に投与すること、を特徴とする方
法である。
【００７１】上記の工程(iii)に加えて、またはそれに
替えて、処置または診断医は、治療物質の投与量、例え
ば患者に投与すべき投与量の計算のために得られたイメ
ージングを使用することができる。このイメージングに
より、[化７]の化合物の取り込み、疾患の程度および局
在性を調査するための情報が得られる。
【００７２】本発明はさらに、疾患に関連する標的細胞
に保持されている抗原と結合することのできる第１のＦ
ab'-様の部分を有し、さらにＴ細胞表面のレセプター／
レセプター複合体および補助分子に対する特異性をそれ
ぞれ有する第２および第３のＦab'-様部分をも有する
[化７]で示される化合物、および１つまたはそれ以上の
製薬的に許容され得る担体を含有する医薬製剤の治療学
的有効量を、処置を要する哺乳動物に投与することを特
徴とする、哺乳動物患者の細胞関連疾患を処置するため
の方法を包含している：ここに、該Ｔ細胞は活性化され
ると該標的細胞を破壊するものであり、該Ｔ細胞は該Ｔ
細胞レセプター／レセプター複合体および該補助分子の
両者がそれぞれ第２および第３のＦab'-様部分と会合す
ると活性化され、[化７]で示される化合物が該標的細
胞、該Ｔ細胞レセプター／レセプター複合体および該補
助分子と結合すると、該活性化Ｔ細胞および該標的細胞
が近傍に配置され、それにより該活性化Ｔ細胞が該標的
細胞を破壊することができる。
【００７３】この方法は、患者自身のＴ細胞をインビボ
またはインビトロで活性化するために使用することがで
きる。あるいは、本発明の化合物は、通常の製薬的担体
中、外来性Ｔ細胞と別々に、またはそれと同時に投与す
ることができる。Ｔ細胞抗原レセプターのα-およびγ-
サブユニットの核酸配列、およびそのアミノ酸配列はそ
れぞれ米国特許第4,873,190号および第4,874,845号に開
示されている。本発明の教示に従えば、当業者は、これ
らＴ細胞レセプター複合体タンパク質のいずれかに対す
る特異性を有するＦab'-様フラグメントを調製すること
ができる。
【００７４】上記いずれの方法においても、選択する投
与経路にかかわりなく、毒性でないが、診断学的および
／または治療学的有効量の１つまたはそれ以上の本発明
化合物をそれぞれ診断および／または処置に使用する。
本発明の化合物を使用して疾患、症状または状態を診断
および処置するための投与計画は、患者のタイプ、年
齢、体重、性別および臨床状態、症状の重篤度、投与経
路、ならびに処置に使用する最終的な化合物など、種々
の因子に応じて選択される。通常の臨床医または獣医
は、疾患の診断または症状の経過を追うために必要な医
薬活性物質の有効量を容易に決定し、予想することがで
きる。それを行う場合、臨床医または獣医は、最初は比
較的低用量を使用し、次に最大応答が得られるまで用量
を増加させることができるであろう。本発明の３機能性
抗体-様化合物は治療物質を局在化させるので、従来の
投与法よりも遥かに低用量でも、有効となるであろう。
【００７５】診断および処置の双方の方法を包含する後
者の方法を実施する場合、臨床医または獣医またはそれ
らの指揮下にある者は、診断を要する患者に本発明化合
物の診断学的有効量を投与するであろう。本発明化合物
は、それが目的とする器官、組織または細胞の抗原に対
する特異性を有する(すなわち、それと結合し得る)Ｆa
b'-様フラグメントを含有するように選択する。本発明
の医薬活性物質を結合させるためのインキュベート時間
の経過後ならば、臨床医は本発明の医薬活性物質が第２
の特異性を有するイメージング物質を投与するであろ
う。得られたイメージングに基づいて患者の疾患、状態
または症状の診断を行う。処置が確実に必要な患者で
は、臨床医または獣医またはそれらの指揮下にある者は
その疾患、症状または状態を処置するに適した治療物質
の治療学的有効量を投与する。処置を要すると保証され
た疾患、症状または状態が存在しない場合は、治療物質
を投与する必要はない。
【００７６】本明細書で使用する「治療学的有効量」な
る用語は一般に、本発明の３機能性抗体-様化合物が結
合する標的器官、組織または細胞の全体または一部で所
望の応答を引き起こすに充分な治療物質の量を意味す
る。より具体的には、「治療学的有効量」なる用語は、
[化１７]で示される基質-細胞毒性物質、またはβ-放出
放射性核種のキレート錯体のいずれかが、ある種の標的
新生組織細胞を死に至らしめるに充分な量、または新生
組織疾患を緩解させるに充分な量、一般には予防するに
充分な量を意味する。
【００７７】本発明に特に特徴的な特性は、臨床医また
は獣医がイメージング物質を介することにより、どこに
治療物質が[化７]で示される固定化された化合物によっ
て局在化されるかを正確に認識できることである。これ
は、イメージング物質と結合する[化７]の固定化された
化合物が治療物質とも結合するからである。この特性に
より、処置する臨床医は処置(例えば、治療物質)を変え
ることができ、または疾患の程度もしくは特に感受性な
器官への侵入に応じて処置を行わないことを選択するこ
とができる。
【００７８】以下に記載する実施例によれば、結腸の腺
癌を診断および処置するうえで、この方法を使用するこ
とができよう。具体的には、[化７]の化合物の第１のＦ
ab'-様フラグメント(または部分)は癌胎児性抗原(ＣＥ
Ａ)に対する特異性を有し、第２のＦab'-様フラグメン
トはイメージング物質、例えば111Ｉn-ＥＤＴＡもしく
は111Ｉn-ＥＯＴＵＢＥなどのキレート化111Ｉn(III)錯
体に対する特異性を有し、第３のＦab'-様フラグメント
は治療物質、例えば90Ｙ-ＤＴＰＡもしくは90Ｙ-ＭeＴ
ＵＢＤなどのキレート化90Ｙ(III)錯体に対する特異性
を有しているものが挙げられる。以下に実施例を挙げて
本発明を説明するが、これらは本発明の思想および範囲
を限定するものと解してはならない。
【００７９】実施例１ トリス-(２-Ｎ-マレイミドエチル)アミン[ＴＭＡ]
【化１８】 ２５０ml エーレンマイヤーフラスコ内のＮaＨＣＯ３１
５ｇに冷水１００mlを加え、その混合物を氷浴中で、そ
の反応混合物の温度が０℃になるまで撹拌した。１００
０ml 丸底フラスコ内の上清溶液８０ml に、トリス(２-
アミノエチル)アミン１.８ml を加え、得られた混合物
を氷浴中で０℃に冷却した。この冷却した反応混合物
に、微細なＮ-メトキシカルボニルマレイミド６.２ｇを
撹拌下に加え、得られた混合物を氷浴中でさらに１０分
間撹拌した。次いで、この混合物に水２４０ml を加
え、室温で３０分間撹拌した。次に、得られた溶液のp
Ｈを濃塩酸を使用してpＨ６−７に調節し、減圧蒸留に
よってその容量を１００ml にまで減少させた。得られ
た溶液のpＨを飽和炭酸ナトリウム溶液を使用して１０
に調節した。その溶液を酢酸エチル２００ml で３回抽
出し、有機層をまとめ、水１００ml で２回洗浄した。
有機層を硫酸ナトリウム３０ｇで乾燥し、濾過し、減圧
下に蒸発乾固した。得られた残留物を温酢酸エチル４０
ml に溶解し、濾過(ブフナー漏斗)し、減圧下に蒸発乾
固した。得られた残留物を酢酸エチル：塩化メチレン
(１：３v/v)を使用して５ml／ｇ(残留物)の割合で溶解
した。２容量の酢酸エチル：塩化メチレン(１：３v/v)
で前もって平衡化しておいたローバーシルカゲル(Lobar
silica gel)カラム１５０ml にその溶解した残留物５m
l を加えた。そのカラムを同じ溶媒を用いて４ml／分で
溶出し、Ａ280でモニターしてＴＭＡ画分を５００ml 丸
底フラスコ中に採取した。このＴＭＡ画分を蒸発乾固し
た。さらに上記溶解残留物５ml を同様に処理し、対応
するＴＭＡ画分を蒸発乾固した。得られたＴＭＡ残留物
を溶出溶媒１０ml に溶解し、それらをまとめてプール
し、減圧下に蒸発乾固した。６０℃の水浴を使用し、ま
とめた残留物を酢酸エチル：イソプロピルエーテル
(３：１v/v)４０ml に溶解し、濾過し、ＴＭＡが黄色の
針状結晶として析出するまで充分に冷却した。得られた
ＴＭＡ結晶を焼結ガラス漏斗で集め、イソプロピルエー
テル５ml で２回洗浄し、減圧下に一晩乾燥した。
【００８０】融点：１３２℃−１３３℃。 元素分析(Ｃ18Ｈ18Ｎ4Ｏ6として)[分子量＝３８６.３
６] 理論値：Ｃ，５５.９５、Ｈ，４.７０、Ｎ，１４.５０ 実測値：Ｃ，５５.５４、Ｈ，４.６９、Ｎ，１４.４
５。1 Ｈ ＮＭＲTMSＣＤＣl3(３００ＭＨz)：６.６５(６Ｈ,
ｓ)，３.４９(６Ｈ,ｔ)、２.６８(６Ｈ,ｔ)。 ＩＲ(ＫＢr)：１７００cm-1(Ｃ＝Ｏ)。 Ｕ.Ｖ.(ＤＭＦ)：２７２にピーク。モル吸光係数＝１９
２０。
【００８１】実施例２ トリス-[２-Ｎ-(マレオイルグリシル)アミノエチル]ア
ミン[ＴＭＧ]
【化１９】 飽和重炭酸ナトリウム(１００ml)中、グリシン(１.５
ｇ、２０mmol)を微細なＮ-メトキシカルボニルマレイミ
ド(３.１ｇ、２０mmol)と共に０℃で激しく撹拌した。
１０分後、その溶液を水４００ml で希釈し、室温で４
０分間撹拌した。濃塩酸を使用してそのpＨを〜７に調
節し、減圧下に蒸発させて容量約５０ml とした。３Ｎ
塩酸を使用してその溶液のpＨを〜２にまで酸性にし、
酢酸エチル１００ml で２回抽出した。酢酸エチル抽出
液をまとめ、水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥
し、蒸発乾固した。得られた粗製の生成物を３つに分
け、３０％メタノール／水で溶出するローバー(Lobar)
逆相Ｃ18カラム１５０ml で精製した。収量：１.８５
ｇ、マレイミド酢酸６０％、融点：１１０℃。1 Ｈ ＮＭＲ(Ｄ2Ｏ)：４.３０(２Ｈ,ｓ)，６.９５(２Ｈ,
ｓ)。 ＩＲ(ＫＢr)：１７１０cm-1(Ｃ＝Ｏ)。
【００８２】ジグリム(diglyme)５ml 中、マレイミド酢
酸(１５５mｇ、１.０mmol)を０℃においてＮ-ヒドロキ
シスクシンイミド(１２７mｇ、１.１mmol)およびジシク
ロヘキシルカルボジイミド(２２７mｇ、１.１mmol)で処
理した。０℃で１時間、室温で３時間経過後、得られた
反応混合物を濾過し、蒸発乾固して、粗製のマレイミド
酢酸Ｎ-スクシンイミジルエステル０.２５ｇを得た。
【００８３】マレイミド酢酸Ｎ-スクシンイミジルエス
テル(０.２５ｇ、１.０mmol)をアセトニトリル５ml に
溶解し、その溶液に撹拌下、アセトニトリル２００μl
中のトリス(２-アミノエチル)アミン(３３mｇ、０.２２
mmol)を滴加した。室温で３０分間撹拌した後、得られ
た溶液を蒸発乾固した。酢酸エチル２０ml 中の残留物
を飽和重炭酸ナトリウム溶液５ml、５Ｍ ＮaＣl ３ml
で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。蒸発後、得
られた残留物をトリエチルアンモニウム(ＴＥＡ)ホルメ
ート溶液(０.１Ｍ、pＨ４.１)５ml に溶解し、ローバー
逆相Ｃ18カラム１５０ml に供し、２０％メタノール／
８０％ＴＥＡホルメートから５０％メタノール／５０％
ＴＥＡホルメートへの段階的グラジエントで溶出して精
製した。標題生成物、トリス-[２-Ｎ-(マレオイルグリ
シル)アミノエチル]アミン[ＴＭＧ]の収量は４７mｇ(３
８％)であった(マレイミド滴定による)。
【００８４】実施例３ 抗体の調製 (a)抗体-Ｉn-ＥＤＴＡ(ＣＨＡ) 本明細書において「ＣＨＡ」と命名される抗体は、エチ
レンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)とインジウム(III)イオ
ンとから形成される錯体に対する特異性を有するモノク
ローナル抗-ハプテン抗体である。イメージングの目的
で、インジウム(III)のアイソトープ111Ｉnを使用す
る。本発明では、ＥＤＴＡ誘導体であるエタノールアミ
ンチオ尿素ベンジルＥＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)をキレート
剤として使用した。ＣＨＡ２５５抗体は以下のようにし
て調製した。抗原を用いて多重免疫したＢＡＬＢ/cマウ
ス由来の脾臓細胞を、Ｐ３.６５３骨髄腫セルラインの
変異体と融合させた。GerhardのMonoclonal Antibodie
s,Kennethら編,プレノーン・プレス,ニューヨーク(198
0)参照。得られたハイブリドーマを固相の第２抗体ラジ
オイムノアッセイによってそのインジウム アミノベン
ジル-ＥＤＴＡの結合能についてスクリーニングした[Wa
ngらのJournal of Immunological Methods,18,157(197
7)]。非標識化抗原による結合阻害によって測定され
た、高い力価および相対的に高い親和性に基づき、ＣＨ
Ａ２５５と命名されるモノクローナル抗体を以後の試験
のために選択し、腹水産生のためにＢＡＬＢ/cマウスに
腹腔内注射した。ParhamらのJ.Immunol.Meth.,53,133(1
982)に記載されているようにして、ＤＥＡＥ-セルロー
スのイオン交換クロマトグラフィーによってマウス腹水
からモノクローナル抗体を精製した。モノクローナル抗
体ＣＨＡ２５５はReardon,D.T.らのNature,316,265-268
頁(1985)および1988年2月2日発行のMearesらの米国特許
第4,722,892号にさらに記載されている。以下、このＣ
ＨＡ２５５抗体は「ＣＨＡ」と称する。
【００８５】(b)抗-Ｙ-ＤＴＰＡ(ＣＹＡ)「 ＣＹＡ」と命名される抗体は、キレート剤、ジエチレン
トリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)とイットリウム(III)イオ
ンとから形成される錯体に対する特異性を有するモノク
ローナル抗-ハプテン抗体である。治療目的のために、
イットリウム(III)のアイソトープ90Ｙを使用する。医
薬的な許容性を増大させるため、メチルチオ尿素ベンジ
ルジエチレントリアミン-五酢酸(ＭeＴＵＢＤ)として知
られている、ＤＴＰＡのメチルチオ尿素ベンジル誘導体
を使用した。ＣＹＡ３１６抗体(以下ＣＹＡという)を、
ReardonらのNature,316:265-267(1985),Antibodies Aga
inst Metal Chelates,およびMearesらの米国特許第4,72
2,892号に記載の一般的方法によって調製した。
【００８６】(c)抗-ＣＥＡ(ＺＣＥ) 本明細書において「ＺＣＥ」と命名される抗体は、癌胎
児性抗原に対する特異性を有するモノクローナル抗体で
ある。この「ＺＣＥ」抗体は、Jean Pierre Mach[スイ
ス,ローザンナ,ローザンナ大学]から市販されている。M
ach博士はその著書の中でＺＣＥ抗体をＭab３５と呼ん
でいる。
【００８７】(d)キメラ抗-ＣＥＡ(xＣＥＭ) 本明細書において「xＣＥＭ」と命名される抗体は、癌
胎児性抗原に対する特異性を有するマウス／ヒトのキメ
ラ抗体である。「xＣＥＭ」抗体は、BiedlerらのJ.Immu
nol.,141,4053-4060(1988)に教示の操作法にしたがって
クローンし、発現させた。
【００８８】(e)キメラ抗-Ｉn-ＥＤＴＡ(xＣＨＡ) 本明細書において「xＣＨＡ」と命名される抗体は、Ｉn
-ＥＤＴＡキレート錯体に対する特異性を有するマウス
／ヒトのキメラ抗体である。「xＣＨＡ」抗体は、「xＣ
ＨＡ」の産生においてネズミ抗体ＣＥＭ-２３１由来の
可変領域の代わりにネズミ抗体ＣＨＡ-２５５由来の可
変領域を使用する以外は実質的に上記「xＣＥＭ」の産
生方法と同じ方法によって調製した。xＣＨＡの合成は
さらに、M.J.Johnsonの7版,International Congress of
Immunology,ベルリン,1989年8月1日の発表書に記載さ
れている。
【００８９】実施例４ ３機能性抗体-様化合物の調製 本明細書においてＡb1、Ａb2およびＡb3と命名される、
所望の特異性および親和定数を有する３つの異なる無傷
の抗体を選択する。実施例５(a)に記載の操作法などの
常法によって、それらの抗体をペプシンで消化し、それ
ぞれＦ1(ab')2、Ｆ2(ab')2、およびＦ3(ab')2と命名さ
れるＦ(ab')2フラグメントを得る。
【００９０】３つの抗体それぞれから誘導したＦ(ab')2
フラグメントを実施例５(b)に記載のような常法によっ
て、システイン(または他の同様の還元剤)でそのＦab'
フラグメント、すなわちＦ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'に
まで還元する。
【００９１】３つの還元Ｆab'フラグメントを以下の操
作法によって選択的に互いにカップリングし、３機能性
カップリング剤を介する３機能性抗体-様化合物を生成
させる。この実施例では、実施例２で得たトリス[２-Ｎ
-(マレオイルグリシル)アミノエチル]アミン(ＴＭＧ)が
利用する３機能性カップリング剤である。操作的には、
Ｆ1ab'-ＳＨを、ＤＭＦに溶解した３０倍過剰モルのＴ
ＭＧ(好ましくはpＨ５−７)に加える。得られた反応混
合物を室温で１０分間インキュベートする。次いで、そ
の反応混合物を、クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ クエ
ン酸アンモニウム(またはナトリウム)、１００mＭ Ｎa
Ｃl、１mＭ ＤＴＰＡ、pＨ６.３)を溶出させて前もって
平衡化させておいたＰ-６カラム[Biorad Laboratories,
Richmond,CA]に適用する。得られた溶出液の２８０nm
(Ａ280)における吸光度をモニターすることによって、
このカラムからのタンパク質画分の溶出を決定する。Ｐ
-６カラム[Biorad Laboratories,Richmond,CA]由来のタ
ンパク質画分は、第２の還元Ｆab'フラグメントと結合
することのできる少なくとも１つのマレイミド部分を有
する、精製されたＦ1ab'-ＴＭＧを含有している。
【００９２】Ｆ1ab'-ＴＭＧを含有する溶出液を、Ｐ-６
の溶出に使用したものと同じクエン酸緩衝液に溶解した
第２の還元Ｆab'フラグメント、Ｆ2ab'-ＳＨに滴加す
る。この第２のカップリング反応は室温で３時間行う。
次いで、Ｆ2ab'ＳＨ分子に残っているスルフヒドリルを
ＤＴＮＢ(５,５'-ジチオ-ビス-(２-ニトロ安息香酸))な
どの可逆的な保護剤によって保護する。保護は、始め
に、Ｆ1ab'-ＴＭＧ-Ｆ2ab'ＳＨを含有するクエン酸緩衝
液液[５０mＭ クエン酸アンモニウム、１００mＭＮaＣ
l、１mＭ ＤＴＰＡ、pＨ６.３]中、約１mＭ の終濃度と
するに充分なＤＴＮＢを加えることによって行う。次い
で、その反応混合物を室温で１０分間インキュベートす
る。得られた保護中間体、Ｆ1ab'-ＴＭＧ-Ｆ2ab'-Ｓ-阻
害剤を、Fast Flow S[ファルマシア,NJ,ピスカッタウェ
イ]またはＴＳＫ-ＧＥＬ ＳＰ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬR６
５０ｓ[Tosoh Corp.,日本]のいずれかからなるマトリッ
クスを使用する高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬ
Ｃ)、またはセファデックスR(SephadexR)Ｇ-１５０ブラ
ンド品超微細樹脂[ファルマシア]を含有するカラムなど
の調製用ゲル濾過によって精製する。
【００９３】精製したなら、その保護中間体を、過剰モ
ルのシステイン(例えば、１mＭ)、ＤＴＴ(ジチオトレイ
トール)、または有効な当量の同様の還元剤を加えたホ
ウ酸緩衝化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウム、５０mＭ
ＮaＣl、pＨ８.２]中で脱ブロックする。反応混合物を
上記クエン酸緩衝化食塩水(pＨ６.３)で溶出して前もっ
て平衡化しておいたＰ-６カラム[Biorad Laboratories,
Richmond,CA]に適用することにより、脱ブロックされて
還元された２機能性中間体をさらに精製する。これで、
還元２機能性中間体、Ｆ1ab'-ＴＭＧ-Ｆ2ab'-ＳＨは誘
導体化する第３のＦab'フラグメントとのカップリング
用に準備される。
【００９４】第３のＦab'フラグメントを有機溶媒(ＤＭ
Ｆ)に溶解した３０倍過剰モルのＴＭＧ(または本明細書
に記載しているようなその他の３価カップリング剤)に
加えて、誘導体化する。その反応混合物を室温で１０分
間インキュベートする。次いで、得られた反応混合物を
上記のクエン酸緩衝化食塩水(pＨ６.３)で溶出して前も
って平衡化しておいたＰ-６カラム[Biorad Laboratorie
s,Richmond,CA]に適用することにより、反応混合物中の
Ｆ2ab'-ＴＭＧを精製する。
【００９５】本発明の３価抗体-様化合物を製造するた
めの最終的なカップリング反応は、Ｆ3ab'-ＴＭＧを、
Ｆ1ab'-ＴＭＧ-Ｆ2ab'ＳＨを含有する上記クエン酸緩衝
化食塩水(pＨ６.３)の溶液に加え、次いで室温で３時間
反応を行わせることにより行う。次に、その反応混合物
にアルキル化剤Ｎ-エチルマレイミドを添加するなどし
て、その反応を停止させる。３機能性抗体-様化合物の
精製は、当業界周知の操作法である、ＨＰＬＣまたは調
製用ゲル濾過(例えば、ファルマシア・セファロースRブ
ランドＧ-１５０超微細樹脂)(superfine resin)によっ
て行う。
【００９６】実施例５ ３機能性抗体-様化合物、ＣＨＡ-ＢＭＰ-ＣＹＡ-ＢＭＰ
-ＺＣＥの製造 ３つの種々の抗体が、２つの３価カップリング剤によっ
て結合されて３機能性抗体-様化合物を形成するＦab'フ
ラグメントの供給源である。この実施例では、「ＣＨ
Ａ」、「ＣＹＡ」および「ＺＣＥ」と命名されるモノク
ローナル抗体を実施例３に記載のようにして調製する
か、または入手した。
【００９７】(a)無傷の抗体からのＦ(ab')2フラグメン
トの調製 ＣＨＡ-Ｆ(ab')2、ＣＹＡ-Ｆ(ab')2およびＺＣＥ-Ｆ(a
b')2と命名される、ＣＨＡ、ＣＹＡおよびＺＣＥのＦ(a
b')2フラグメントを、それぞれの抗体を以下の操作に従
ってペプシンで消化することにより調製した。
【００９８】２８０nmにおける吸光度(Ａ280)によって
測定すると抗体濃度が５−１５mｇ/ml である抗体溶液
を酢酸緩衝化食塩水(０.１Ｍ 酢酸ナトリウム、０.１Ｍ
ＮaＣl、pＨ４.１)に対して４℃で一晩透析する。次い
で、濃縮したペプシン溶液、すなわち２％の抗体塊に対
して当量のペプシンを含有する溶液を、その透析した溶
液に加えた。次いで、その反応混合物を３７℃で４−４
８時間インキュベートした。重炭酸ナトリウムによって
pＨを約８に調節することにより、反応を停止させた。
セファロースRＧ-１５０カラム[ファルマシア]のゲル濾
過、Ｆast ＦlowＳ[ファルマシア,NJ,ピスカッタウェ
イ]またはＴＳＫ-ＧＥＬ ＳＰ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬR６
５０s陽イオン交換樹脂[Tosoh Corp.,日本]のいずれか
からなるマトリックスを使用する高速液体クロマトグラ
フィーなどの種々の方法によって、Ｆ(ab')2フラグメン
トを精製した。Ｆ(ab')2フラグメントを単離した後、そ
れをホウ酸緩衝化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウム、
５０mＭ ＮaＣl、pＨ８.２]中で透析した。それぞれの
Ｆ(ab')2フラグメントを含有する透析した溶液を以後の
反応に使用した。
【００９９】(b)ＣＹＡ-Ｆ(ab')2からＣＹＡ-Ｆab'ＳＨ
への還元 ８.１mｇ/ml ＣＹＡ316Ｆ(ab')2を含有するホウ酸緩衝
化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウム、５０mＭ ＮaＣ
l、pＨ８.２]１.０ml に０.５Ｍ ジエチレン-トリアミ
ン五酢酸(ＤＴＰＡ)２μl および０.５Ｍ システイン４
０μl を加えた。その反応混合物を３７℃で１０分間反
応させた。次いで、得られた反応混合物を、クエン酸緩
衝化食塩水(５０mＭ クエン酸アンモニウム、１００mＭ
ＮaＣl、１mＭ ＤＴＰＡ、pＨ６.３)を溶出させて前も
って平衡化させておいたＰ-６カラム[Biorad Laborator
ies,Richmond,CA]に適用する。そのカラムからタンパク
質を含有する画分３.０ml を採取し、それを２８０nm
(Ａ280)における吸光度によって測定すると、濃度４８
μＭのタンパク質(還元Ｆab')を有していた。過剰の５,
５'-ジチオビス-(２-ニトロ安息香酸)、すなわちＤＴＮ
Ｂおよびホウ酸緩衝化食塩水を反応混合物の一部に加
え、ＤＴＮＢを含有する標本とブランクとの間の４１２
nmにおける吸光度の差を測定することによって、そのタ
ンパク質画分内の遊離スルフヒドリル基の濃度を算定し
た。次いで、Ｆab'フラグメント１つ当たりの遊離のス
ルフヒドリル基の数は２.５と計算された。
【０１００】(c)ＣＨＡ-Ｆ(ab')2からＣＨＡ-Ｆab'ＳＨ
への還元 １０mｇ/ml ＣＨＡ-Ｆ(ab')2を含有する、上記工程(a)
で得られた最終的透析溶液５ml を還元し、上記工程(b)
の操作法にしたがってＰ-６カラムで精製した。Ｐ-６カ
ラム[Biorad Laboratories,Richmond,CA]での溶出によ
り、タンパク質画分１２ml を採取した。その画分の２
８０nmにおける吸光度に基づいて、Ｆ(ab')フラグメン
トの濃度は８６μＭと測定された。そのタンパク質画分
のスルフヒドリル濃度は、５,５'-ジチオビス-(２-ニト
ロ安息香酸)[ＤＴＮＢ]を使用し、４１２nmにおける吸
光度の差を測定することにより、１６３μＭと算定され
た。ＣＨＡ-Ｆab'ＳＨについて、Ｆab'フラグメントに
対するスルフヒドリル基のモル比は１.９と計算され
た。
【０１０１】(d)ＣＨＡ-Ｆab'ＳＨのＢＭＰ誘導化 ＤＭＦ／水の５０：５０溶液１ml にＮ,Ｎ'-ビス(３-マ
レイミドプロピオニル)-２-ヒドロキシ-１,３-プロパン
ジアミン(以下、ＢＭＰという。これはシグマ・ケミカ
ルＣo.,セントルイス,MOから市販されている。)１３mｇ
を加えた。ＢＭＰを溶解した後、ＣＨＡ-Ｆab'ＳＨを混
合した上記工程(c)で得られた８６μＭタンパク質画分
１２ml をＢＭＰ溶液に加えた。この反応混合物を室温
で１０分間反応させた。次いで、得られた反応混合物を
Ｐ-６カラム[Biorad Laboratories,Richmond,CA]２００
ml に適用し、ＣＨＡ-Ｆab'ＢＭＰを含有するタンパク
質画分２７ml を採取した。Ａ280によれば、ＣＨＡ-Ｆa
b'ＢＭＰの濃度は３３μＭであった。
【０１０２】逆滴定によって、タンパク質画分のマレイ
ミド含量を測定した。詳細には、上記５(d)のタンパク
質画分２７ml のうち３００μl に０.１mＭ システイン
２０μl を加えた。得られた混合物を室温に５分間放置
した。次いで、１０mＭ ５,５'-ジチオビス-(２-ニトロ
安息香酸)、すなわちＤＴＮＢ１０μl およびホウ酸緩
衝化食塩水(５０mＭ ホウ酸アンモニウム、５０mＭ Ｎa
Ｃl、pＨ８.２)６７０μl を反応混合物に加えた。この
反応混合物を４１２nmにおいて分光学的に測定し、Ｆa
b'-ＢＭＰのない標品と比較し、両者の４１２nmにおけ
る吸光度の差を使用し、マレイミド含量を測定すると、
この場合３３μＭと測定された。ＣＨＡ-Ｆab'１つ当た
り利用し得るマレイミド部分の数は１.０と計算され
た。
【０１０３】(e)ＺＣＥ-Ｆ(ab')2からＺＣＥ-Ｆab'ＳＨ
への還元 Jean Pierre Mach,Lausanne大学,Lausanne,スイスから
ライセンスを受けた、本明細書ではＺＣＥと命名した、
ＣＥＡに対する市販のモノクローナル抗体を、上記実施
例５(a)の操作法にしたがってペプシンで消化し、ＺＣ
Ｅ-Ｆ(ab')2と命名される、対応するＦ(ab')2フラグメ
ントを調製した。
【０１０４】１０mｇ/ml ＺＣＥ-Ｆ(ab')2を含有する、
上記ペプシン消化から得られた最終的透析溶液４ml に
０.５Ｍ ＤＴＰＡ１０μl を加え、得られた反応混合物
を３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、０.
５Ｍ システイン１６０μl を加え、得られた反応混合
物を室温でさらに１０分間インキュベートした。次い
で、この反応混合物を、クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ
クエン酸アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ Ｄ
ＴＰＡ、pＨ６.３)を溶出させて前もって平衡化させて
おいたＰ-６カラム[Biorad Laboratories,Richmond,CA]
４０ml に適用した。タンパク質画分１１.３ml を採取
し、それを２８０nm(Ａ280)における吸光度によって測
定すると、濃度７９μＭの還元タンパク質を有してい
た。そのタンパク質画分のスルフヒドリル含量を上記実
施例５(b)に記載のようにしてＤＴＮＢを使用して測定
すると、１４９μＭであった。ＺＣＥ-Ｆab'フラグメン
ト１つ当たりのスルフヒドリル基の比率は１.９と計算
された。得られたフラグメントはＺＣＥ-Ｆab'ＳＨと命
名される。
【０１０５】(f)ＣＨＡ-Ｆab'ＢＭＰのＺＣＥ-Ｆab'Ｓ
Ｈへのコンジュゲート 上記工程(e)のＺＣＥ-Ｆab'ＳＨの７９μＭ溶液に、Ｃ
ＨＡ-Ｆab'ＢＭＰの３３μＭ溶液を反応性マレイミドに
対するスルフヒドリル基の比率が１：１となるに充分な
量で滴加した。この反応混合物を４℃で一晩放置した。
次いで、ＤＴＮＢ１６mｇを反応混合物に加えてＤＴＮ
Ｂ濃度を約１mＭ とし、未反応のスルフヒドリルをブロ
ックした。
【０１０６】Ｆast Ｆlow Ｓ[ファルマシア]またはＴＳ
Ｋ-ＧＥＬ ＳＰ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬR６５０Ｓ陽イオン
交換樹脂[Tosoh Corp.,日本]のいずれかからなるマトリ
ックスを使用する高速液体クロマトグラフィー、または
セファデックスRＧ-１５０カラム[ファルマシア]のゲル
濾過などの種々の方法によって、反応混合物からＣＨＡ
-ＢＭＰ-ＺＣＥと命名される得られた２機能性抗体-様
化合物を精製した。当業者ならば、ＨＰＬＣまたはゲル
濾過によるタンパク質の精製法は理解している。
【０１０７】(g)ＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥを脱ブロックす
ることによるＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥ-ＳＨの製造 ホウ酸緩衝化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウム、５０m
Ｍ ＮaＣl、pＨ８.２]中、３.９mｇ/ml の精製したブロ
ック化ＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥを含有する２.５ml 溶液に
０.５Ｍ ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)５μl
を加えた。得られた反応混合物を３７℃で１５分間イン
キュベートした後、続いて０.５Ｍ システイン１００μ
l を添加した。その反応混合物を３７℃でさらに１０分
間インキュベートし、脱ブロックを行った。次いで、そ
の反応混合物を、クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ クエ
ン酸アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＰ
Ａ、pＨ６.３)を溶出させて前もって平衡化させておい
たＰ-６カラム[Biorad Laboratories,Richmond,CA]４０
ml に適用した。タンパク質画分５.８ml を採取し、そ
の２８０nm(Ａ280)の吸光度に基づいて測定すると、濃
度１５μＭのタンパク質(還元２機能性抗体)を有してい
た。次いで、そのタンパク質画分のスルフヒドリル濃度
を上記実施例５(a)に記載のようにして測定した。
【０１０８】(h)ＣＹＡ-ＢＭＰとＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥ
-ＳＨとのカップリングによるＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥ-Ｂ
ＭＰ-ＣＹＡの製造 ＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥ-ＳＨ(実施例５(g))が１５μＭで
あるクエン酸緩衝化食塩水溶液５.５ml に当量のＣＹＡ
-ＢＭＰ(上記工程(c)および(d)に記載のように製造し、
クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ クエン酸ナトリウム、
１００mＭ ＮaＣl、pＨ６.３)に同様に溶解した)を加え
た。その反応物を室温で３時間反応させ、次いで実施例
４に記載のようにしてＮ-エチルマレイミドで反応を停
止させた。ＣＨＡ-ＢＭＰ-ＺＣＥ-ＢＭＰ-ＣＹＡと命名
される、得られた３機能性抗体-様化合物をセファデッ
クスRＧ-１５０[ファルマシア]のゲル濾過によって精製
した。画分３８−４３をまとめ、プールしてその精製さ
れた生成物を０.６６mｇ/ml で含有する溶液３.２ml を
得た。次いで、このプールした画分２.０ml を０.１７
Ｍ 酢酸ナトリウム(pＨ４.５)中で一晩透析し、次いで
Ｍono Ｓ マトリックス[ファルマシア]のＨＰＬＣ精製
を行った。プールした０.６６mｇ/ml 画分中のＣＨＡ-
ＢＭＰ-ＺＣＥ-ＢＭＰ-ＣＹＡによるＩn-ＥＯＴＵＢＥ
錯体に対する未補正結合能を測定すると、理論値の７６
％であった。同じ工程を対照について行うと、結合能は
４％であることが判明した。ＣＹＡについての結合能は
理論値の８２％であった。
【０１０９】実施例６ ３価抗体-様化合物、xＣＥＭ-ＴＭＧ-xＣＨＡ-ＴＭＧ-x
ＣＥＭの合成 (a)「xＣＨＡ」および「xＣＥＭ」のそれぞれxＣＨＡ-
Ｆ(ab')2およびxＣＥＭ-Ｆ(ab')2への消化 Ｉn-ＥＤＴＡ錯体に対する無傷のキメラ性モノクローナ
ル抗体を、本明細書では「xＣＨＡ」と呼ぶ。この抗体
の調製法は実施例３で説明している。無傷のxＣＨＡお
よびxＣＥＭ抗体をそれぞれ、酢酸緩衝化食塩水[１００
mＭ 酢酸ナトリウム、１００mＭ 塩化ナトリウム、pＨ
４.１]中、３７℃で５時間、３％ペプシン(ペプシン：
抗体)と共にインキュベートすることにより消化し、そ
れぞれＦ(ab')2フラグメントとした。そのpＨを中性に
して、消化を停止させた。次いで、得られた消化物をホ
ウ酸緩衝化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウム、１００m
Ｍ 塩化ナトリウム、pＨ８.２]中で透析し、それぞれx
ＣＨＡ-Ｆ(ab')2およびxＣＥＭ-Ｆ(ab')2と命名される
対応するＦ(ab')2フラグメントを得た。
【０１１０】(b)xＣＥＭ-Ｆ(ab')2からxＣＥＭ-Ｆab'Ｓ
Ｈへの還元 上記実施例６(a)で得たxＣＥＭ-Ｆ(ab')2(１７mｇ/ml)
６ml にホウ酸緩衝化食塩水[５０mＭ ホウ酸ナトリウ
ム、１００mＭ 塩化ナトリウム、pＨ８.２]２mlおよび
ジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)１６μlを加
え、ＤＴＰＡの終濃度１mＭ とした。この反応混合物を
３７℃で１０分間インキュベートした後、０.５Ｍ シス
テイン３６０μl を添加し、３７℃でさらに１０分間イ
ンキュベートした。クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ ク
エン酸アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＰ
Ａ、pＨ６.３)を溶出させて前もって平衡化させておい
た２.５×１９cm Ｐ-６ ＤＧカラム[Biorad Laboratori
es,Richmond,CA]でのゲル濾過によりシステインを除去
した。溶出により、タンパク質画分１９.６ml を採取
し、その画分の２８０nmにおける吸光度に基づいて、還
元Ｆab'フラグメント、xＣＥＭ-Ｆab'ＳＨの濃度が９０
μＭと測定された。そのタンパク質画分の遊離のスルフ
ヒドリル濃度は、実施例５(b)に記載のようにしてＤＴ
ＮＢとの反応によって測定し、１５９μＭと算定され
た。還元Ｆab'フラグメント１個当たりの遊離のスルフ
ヒドリル基の比率は１.８と計算された。
【０１１１】(c)xＣＥＭ-Ｆab'ＳＨのＴＭＧによる誘導 ３０倍過剰モルのトリス(２-マレオイルグリシルアミノ
エチル)アミン(ＴＭＧ)を用いて、還元Ｆab'フラグメン
ト、xＣＥＭ-Ｆab'ＳＨを誘導体化した。具体的には、
上記実施例６(b)のクエン酸緩衝化食塩水中、xＣＥＭ-
Ｆab'ＳＨ(１.８μmol)１９.５ml を撹拌下にＤＭＦ中
の３１４mＭ ＴＭＧ１７６μl に加えた。２３℃で１０
分経過後、クエン酸緩衝化食塩水(５０mＭ クエン酸ア
ンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、１mＭ ＤＴＰＡ、pＨ
６.３)を溶出させて前もって平衡化させておいた２.５
×４５cm Ｐ-６ ＤＧカラム[Biorad Laboratories]によ
って、過剰のＴＭＧを除去した。タンパク質画分２６.
８ml を採取し、その画分の２８０nmにおける吸光度(Ａ
280)に基づいて、誘導化フラグメント、xＣＥＭ-Ｆab'
ＴＭＧを３.３mｇ/ml 含有し、６７μＭであると測定さ
れた。逆滴定(実施例５(d)に記載)により、活性マレイ
ミドを測定すると、Ｆab'フラグメント当たり１.１６活
性マレイミドを示した。
【０１１２】(d)xＣＨＡ-Ｆ(ab')2からxＣＨＡ-Ｆab'Ｓ
Ｈへの還元 xＣＨＡ-Ｆ(ab')2(９.２mｇ/ml)２.７ml を３７℃で１
０分間１mＭ ＤＴＰＡと共にインキュベートした。次い
で、この反応混合物に０.５Ｍ ジチオトレイトール(Ｄ
ＴＴ)６μl 加え、得られた反応混合物を３７℃でさら
に１０分間インキュベートした。クエン酸緩衝化食塩水
(５０mＭ クエン酸アンモニウム、１００mＭ ＮaＣl、
１mＭ ＤＴＰＡ、pＨ６.３)を溶出させて前もって平衡
化させておいた１.５×２５cmＰ-６ ＤＧ カラム[Biora
d Laboratories]のケル濾過によって、ＤＴＴを除去し
た。タンパク質画分７.６ml を採取し、それを２８０nm
(Ａ280)における吸光度によって測定すると、所望のxＣ
ＨＡ-Ｆab'ＳＨは５９μＭであった。その画分の遊離の
スルフヒドリル濃度は２３６μＭと測定された。還元Ｆ
ab'フラグメント当たりの遊離のスルフヒドリル基の比
率は４.７と計算された。
【０１１３】(e)xＣＨＡ-Ｆab'ＳＨとxＣＥＭ-Ｆab'Ｔ
ＭＧとのコンジュゲート 上記６(d)のxＣＨＡ-Ｆab'ＳＨの７.５μl に、上記６
(c)のxＣＥＭ-Ｆab'ＴＭＧの２６.２ml を加え、得られ
た反応混合物を２３℃で１００分間インキュベートし
た。１Ｍ Ｎ-エチルマレイミド、アルキル化剤３４μl
を加えて反応を停止させた。次いで、限外濾過によって
反応混合物を１２ml にまで濃縮した。得られた濃縮反
応混合物を２.６×９６cmＧ-１５０超微細カラム[ファ
ルマシア]のケル濾過によって精製した。流速は約０.２
ml／分であった。溶出パターンをＡ280によりトレース
し、３つの主要な生成物を得た。本明細書においてxＣ
ＥＭ-ＴＭＧ-xＣＨＡ-ＴＭＧ-xＣＥＭと命名される所望
の３価抗体-様化合物は、画分３８−４１の中央の生成
物であることが見いだされた。このxＣＥＭ-ＴＭＧ-xＣ
ＨＡ-ＴＭＧ-xＣＥＭの同定は、高速液体クロマトグラ
フィー(ＨＰＬＣ)ゲル濾過およびドデシル硫酸ナトリウ
ム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ-ＰＡＧ
Ｅ、７.５％アクリルアミド)によって確定した。
【０１１４】実施例７ ３機能性抗体-様化合物ＣＨＡ-ＺＣＥ-ＣＹＡの抗原結
合能 当業界周知の方法により、90イットリウム-ＭeＴＵＢＤ
錯体(すなわち、治療物質)および111インジウム-ＥＯＴ
ＵＢＥ(すなわち、診断物質)に対する３機能性抗体-様
化合物ＣＨＡ-ＺＣＥ-ＣＹＡの抗原結合能を試験した。
具体的には、既知濃度のＹ-ＭeＴＵＢＤを既知濃度の90
Ｙ-ＭeＴＵＢＤと混合してトレース用標識化90Ｙ-ＭeＴ
ＵＢＤを調製した。同様にして、既知濃度のＩn-ＥＯＴ
ＵＢＥを既知濃度の111Ｉn-ＥＯＴＵＢＥと混合した。
各トレース用標識化錯体に対するＣＹＡおよびＣＨＡの
結合％を測定した。
【０１１５】これらの検定結果は３機能性抗体-様化合
物ＣＨＡ-ＺＣＥ-ＣＹＡのＣＹＡ部分がその最大理論値
の８２％に相当する量のイットリウム-ＭeＴＵＢＤと結
合することを示した。同様に、ＣＨＡ-ＺＣＥ-ＣＹＡの
ＣＨＡ部分におけるインジウム-ＥＯＴＵＢＥ錯体に対
する結合能の検定により、その最大理論値の７６％と結
合できることが判明した。さらに、同様の検定により、
ＣＨＡがＹ-ＭeＴＵＢＤの１％としか架橋結合しないの
で、ＣＨＡ部分はインジウム-ＥＯＴＵＢＥ錯体に対し
て特異的であることが証明された。インジウム-ＥＯＴ
ＵＢＥは対照によっては４％しか取り込まれなかったの
で、同じく、ＣＹＡ結合性はイットリウム-ＭeＴＵＢＤ
錯体に対して特異的であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/14 8517−4Ｈ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ (72)発明者 アン・イー・ハング アメリカ合衆国92009カリフォルニア州、 カールスバッド、ジャカランダ・アベニュ ー2616番

Claims (61)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 [化１]： 【化１】 [式中、ＬはＦ1ab'、Ｆ2ab'およびＦ3ab'を架橋結合す
    るための１つまたは２つの基であり、 Ｆ1ab'は目的とする器官、組織、細胞、腫瘍または分子
    から発現される抗原に対する特異性を有するＦab'-様の
    部分であり、 Ｆ2ab'はＦ1ab'と同じ特異性を有するか、または目的と
    する器官、組織、細胞、腫瘍または分子から発現される
    別の抗原に対する特異性を有するか、または診断もしく
    は治療物質に対する特異性を有するＦab'-様の部分であ
    り、 Ｆ3ab'は診断または治療物質に対する特異性を有するＦ
    ab'-様の部分であり、あるいはＦ2ab'およびＦ3ab'はそ
    れぞれＴ細胞表面のレセプター／レセプター複合体およ
    び補助分子に対する特異性を有している]で示される化
    合物からなる３機能性抗体-様化合物。
  2. 【請求項２】 Ｌが２つのビス-スクシンイミド基であ
    る請求項１に記載の３機能性抗体-様化合物。
  3. 【請求項３】 Ｌが[化２]： 【化２】 [式中、Ｘは 【化３】 であり、 ｋは１または０であり、 ｑは１または０であり、 Ｙ'は 【化４】 であり、 Ｚは 【化５】 であり、 ｓは１または０であり、 ｎは１または０であり、 Ｙは 【化６】 であり、 ｐおよびｍは同一または異なっていてもよく、０から２
    ０までの整数である。ただし、ｎが０の場合、ｍとｐと
    の合計は１から２０であり、ｎが１の場合、ｐとｍとは
    それぞれ少なくとも１の整数であり、その合計は２から
    ２０である。また、Ｒ１は炭素数１から６の直鎖状また
    は分枝鎖状低級アルキルまたは低級アルコキシであり、 Ｒ２は水素、フェニル、-ＣＯＯＨ、または炭素数１か
    ら６の直鎖状もしくは分枝鎖状低級アルキルである。た
    だし、その低級アルキル基は-ＮＨ2、-ＯＨまたは-ＣＯ
    ＯＨによってモノ置換されていてもよい。]で示される
    １つまたはそれ以上の部分からなる請求項１に記載の３
    機能性抗体-化合物。
  4. 【請求項４】 Ｌが２つの[化２]からなる請求項３に記
    載の３機能性抗体-様化合物。
  5. 【請求項５】 Ｆ1ab'がモノクローナル抗体のＦab'-様
    の部分である請求項１または請求項４に記載の３機能性
    抗体様化合物。
  6. 【請求項６】 Ｆ1ab'が組織から発現される抗原に対す
    る特異性を有している請求項５に記載の３機能性抗体-
    様化合物。
  7. 【請求項７】 抗原を発現する組織が腫瘍、癌、前癌状
    態の組織または壊死性組織である、請求項６に記載の３
    機能性抗体-様化合物。
  8. 【請求項８】 組織から発現される抗原が、α-フェト
    プロテイン、c-erbＢ-２、癌抗原１５-３(ＣＡ １５-
    ３)、ＣＡ １９-９、ＣＡ １２５、ＣＡ １９５、ＣＡ
    ５４９、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、カテプシンＤ(cath
    Ｄ)、サイトケラチン類、ＤＵ-ＰＡＮ-２、上皮性成長
    因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、エストロゲンレセプタ
    ー、c-myc、Ｎ-myc、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ラ
    ス、腫瘍関連抗原-７２(ＴＡＧ-７２)、腫瘍関連抗原-
    ４(ＴＡ-４)、およびＫＳ１/４抗原の中から選ばれる、
    請求項７に記載の３機能性抗体-様化合物。
  9. 【請求項９】 Ｆ2ab'が、診断物質に対する特異性を有
    している請求項１または４に記載の３機能性抗体-様化
    合物。
  10. 【請求項１０】 診断物質が、常磁性金属イオンまたは
    ガンマ線放出放射性核種のいずれかと錯体化しているキ
    レート剤からなる生理学的に適合し得るキレート錯体で
    ある、請求項９に記載の３機能性抗体様化合物。
  11. 【請求項１１】 キレート剤が、エチレンジアミン四酢
    酸(ＥＤＴＡ)、エタノールアミンチオ尿素ベンジル-Ｅ
    ＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)、ジエチレントリアミン五酢酸
    (ＤＴＰＡ)、メチルチオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴ
    ＵＢＤ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-
    Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、１,５,９,
    １３-テトラアザシクロヘキサデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',
    Ｎ'''-四酢酸(ＨＥＴＡ)、１,４,７,１０-テトラアザシ
    クロトリデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＲＩＴ
    Ａ)、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン-
    Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＥＴＡ)、Ｌ-アミノベン
    ジル-ＥＤＴＡ、およびそれらのダンベル型誘導体の中
    から選ばれるもの、またはその誘導体である、請求項１
    ０に記載の３機能性抗体様化合物。
  12. 【請求項１２】 常磁性金属イオンが原子番号５７-７
    ０のランタニド元素、または原子番号２１-２９、４２
    もしくは４４の遷移金属である、請求項１０に記載の３
    機能性抗体様化合物。
  13. 【請求項１３】 ガンマ線放出放射性核種が、イオン形
    態にある111Ｉn、11 3mＩn、67Ｇa、68Ｇa、99mＴc、51
    Ｃr、197Ｈg、203Ｈg、169Ｙb、85Ｓr、および87mＳrの
    中から選ばれる、請求項１０または請求項１１に記載の
    ３機能性抗体様化合物。
  14. 【請求項１４】 ガンマ線放出放射性核種が、イオン形
    態にある111Ｉnである請求項１３に記載の３機能性抗体
    様化合物。
  15. 【請求項１５】 Ｆ3ab'が、治療物質に対する特異性を
    有しているモノクローナル抗体から誘導されたＦab'-様
    の部分である請求項１または請求項１３に記載の３機能
    性抗体-様化合物。
  16. 【請求項１６】 治療物質が、キレート剤とβ-線放出
    放射性核種とからなる生理学的に適合し得るキレート錯
    体である、請求項１５に記載の３機能性抗体様化合物。
  17. 【請求項１７】 キレート剤が、エチレンジアミン四酢
    酸(ＥＤＴＡ)、エタノールアミンチオ尿素ベンジル-Ｅ
    ＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)、ジエチレントリアミン五酢酸
    (ＤＴＰＡ)、メチルチオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴ
    ＵＢＤ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-
    Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、１,５,９,
    １３-テトラアザシクロヘキサデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',
    Ｎ'''-四酢酸(ＨＥＴＡ)、１,４,７,１０-テトラアザシ
    クロトリデカン-Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＲＩＴ
    Ａ)、１,４,８,１１-テトラアザシクロテトラデカン-
    Ｎ,Ｎ',Ｎ'',Ｎ'''-四酢酸(ＴＥＴＡ)、Ｌ-アミノベン
    ジル-ＥＤＴＡ、およびそれらのダンベル型誘導体の中
    から選ばれるもの、またはその誘導体である、請求項１
    ６に記載の３機能性抗体様化合物。
  18. 【請求項１８】 β-線放出放射性核種が、イオン形態
    にある67Ｃu、186Ｒh、188Ｒh、189Ｒh、153Ｓm、およ
    び90Ｙの中から選ばれる請求項１７に記載の３機能性抗
    体様化合物。
  19. 【請求項１９】 治療物質が90Ｙ-ＭeＴＵＢＤ、90Ｙ-
    ＤＰＴＡ、90Ｙ-ＤＯＴＡ、またはそれらのダンベル型
    誘導体である請求項１８に記載の３機能性抗体-様化合
    物。
  20. 【請求項２０】 治療物質が酵素の基質と結合した細胞
    毒性物質からなる請求項１５に記載の３機能性抗体様化
    合物。
  21. 【請求項２１】 該酵素が、β-ラクタマーゼ、Ｌ-ピロ
    グルタメート・アミノペプチダーゼ、β-ガラクトシダ
    ーゼ、およびＤ-アミノ酸ペプチダーゼの中から選ばれ
    る請求項２０に記載の３機能性抗体様化合物。
  22. 【請求項２２】 酵素がβ-ラクタマーゼである請求項
    ２１に記載の３機能性抗体様化合物。
  23. 【請求項２３】 酵素がエンテロバクター・クロアカエ
    から得られるものである請求項２２に記載の３機能性抗
    体様化合物。
  24. 【請求項２４】 該酵素の基質が、ペニシリン、ペネ
    ム、カルバペネム、セファロスポリン、１-カルバデチ
    アセファロスポリン、または１-オキサデチアセファロ
    スポリンの中から選ばれるβ-ラクタムである請求項２
    ３に記載の３機能性抗体様化合物。
  25. 【請求項２５】 基質が、細胞毒性活性を有する治療物
    質と共有結合している請求項２４に記載の３機能性抗体
    様化合物。
  26. 【請求項２６】 細胞毒性活性を有する治療物質が、ナ
    イトロジェンマスタード物質、ビンカアルカロイド、ダ
    ウノマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞
    毒性ヌクレオシド、プテリジン、ポドフィロフィルロト
    キシン、スルホニル尿素、トリコテセン、およびコルヒ
    チンの中から選ばれる請求項２５に記載の３機能性抗体
    様化合物。
  27. 【請求項２７】 (a)[化１]で示される３機能性抗体様
    化合物、および(b)１つまたはそれ以上の製薬的に許容
    され得る担体からなる医薬製剤。
  28. 【請求項２８】 単位投与剤形にある請求項２７に記載
    の医薬製剤。
  29. 【請求項２９】 [化１]におけるＬが２つのビス-スク
    シンイミド基である請求項２８に記載の医薬製剤。
  30. 【請求項３０】 Ｌが１つまたは２つのトリス-スクシ
    ンイミド基である請求項２８に記載の医薬製剤。
  31. 【請求項３１】 Ｌが２つのトリス-スクシンイミド基
    である請求項３０に記載の医薬製剤。
  32. 【請求項３２】 Ｆ1ab'が、目的とする器官または組織
    から発現される抗原に対する特異性を有するモノクロー
    ナル抗体のＦab'-様の部分である請求項２７または請求
    項３１に記載の医薬製剤。
  33. 【請求項３３】 組織から発現される抗原が、α-フェ
    トプロテイン、c-erbＢ-２、癌抗原１５-３(ＣＡ １５-
    ３)、ＣＡ １９-９、ＣＡ １２５、ＣＡ １９５、ＣＡ
    ５４９、癌胎児性抗原(ＣＥＡ)、カテプシンＤ(cath
    Ｄ)、サイトケラチン類、ＤＵ-ＰＡＮ-２、上皮性成長
    因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)、エストロゲンレセプタ
    ー、c-myc、Ｎ-myc、前立腺特異的抗原(ＰＳＡ)、ラ
    ス、腫瘍関連抗原-７２(ＴＡＧ-７２)、腫瘍関連抗原-
    ４(ＴＡ-４)、およびＫＳ１/４抗原の中から選ばれる、
    請求項３２に記載の医薬製剤。
  34. 【請求項３４】 Ｆ2ab'が、診断物質に対する特異性を
    有しているモノクローナル抗体のＦab-様の部分である
    請求項２７または請求項３３に記載の医薬製剤。
  35. 【請求項３５】 診断物質が、常磁性金属イオンまたは
    ガンマ線放出放射性核種のいずれかと錯体化しているキ
    レート剤からなる生理学的に適合し得るキレート錯体で
    ある、請求項３４に記載の医薬製剤。
  36. 【請求項３６】 キレート剤が、エチレンジアミン四酢
    酸(ＥＤＴＡ)、エタノールアミンチオ尿素ベンジル-Ｅ
    ＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)、ジエチレントリアミン五酢酸
    (ＤＴＰＡ)、メチルチオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴ
    ＵＢＤ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-
    Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、およびＬ-
    アミノベンジル-ＥＤＴＡ、またはそれらの誘導体の中
    から選ばれる、請求項３５に記載の医薬製剤。
  37. 【請求項３７】 常磁性金属イオンが原子番号５７-７
    ０のランタニド元素、または原子番号２１-２９、４２
    もしくは４４の遷移金属である、請求項３６に記載の医
    薬製剤。
  38. 【請求項３８】 ガンマ線放出放射性核種が、イオン形
    態にある111Ｉn、113mＩn、67Ｇa、68Ｇa、99mＴc、51
    Ｃr、197Ｈg、203Ｈg、169Ｙb、85Ｓr、および87mＳrの
    中から選ばれる、請求項３６に記載の医薬製剤。
  39. 【請求項３９】 キレート剤がＥＯＴＵＢＥであり、ガ
    ンマ線放出放射性核種が111Ｉnである請求項３８に記載
    の医薬製剤。
  40. 【請求項４０】 Ｆ3ab'が、治療物質に対する特異性を
    有しているモノクローナル抗体のＦab'-様フラグメント
    である請求項２８または請求項３９に記載の医薬製剤。
  41. 【請求項４１】 治療物質が、キレート剤とβ-線放出
    放射性核種とからなる生理学的に適合し得るキレート錯
    体である、請求項４０に記載の医薬製剤。
  42. 【請求項４２】 キレート剤が、エチレンジアミン四酢
    酸(ＥＤＴＡ)、エタノールアミンチオ尿素ベンジル-Ｅ
    ＤＴＡ(ＥＯＴＵＢＥ)、ジエチレントリアミン五酢酸
    (ＤＴＰＡ)、メチルチオ尿素ベンジル-ＤＴＰＡ(ＭeＴ
    ＵＢＤ)、１,４,７,１０-テトラアザシクロドデカン-
    Ｎ',Ｎ'',Ｎ''',Ｎ''''-四酢酸(ＤＯＴＡ)、Ｌ-アミノ
    ベンジル-ＥＤＴＡ、およびそれらのダンベル型誘導体
    の中から選ばれるもの、またはその誘導体である請求項
    ４１に記載の医薬製剤。
  43. 【請求項４３】 β-線放出放射性核種が、イオン形態
    にある67Ｃu、186Ｒh、188Ｒh、189Ｒh、153Ｓm、およ
    び90Ｙの中から選ばれる請求項４２に記載の医薬製剤。
  44. 【請求項４４】 治療物質が90Ｙ-ＭeＴＵＢＤ、90Ｙ-
    ＤＴＰＡ、90Ｙ-ＤＯＴＡ、またはそれらのダンベル型
    誘導体である請求項４３に記載の医薬製剤。
  45. 【請求項４５】 治療物質が酵素の基質と結合した細胞
    毒性物質からなる請求項４０に記載の医薬製剤。
  46. 【請求項４６】 該酵素が、β-ラクタマーゼ、Ｌ-ピロ
    グルタメート・アミノペプチダーゼ、β-ガラクトシダ
    ーゼ、およびＤ-アミノ酸ペプチダーゼの中から選ばれ
    る請求項４５に記載の医薬製剤。
  47. 【請求項４７】 酵素がβ-ラクタマーゼである請求項
    ４６に記載の医薬製剤。
  48. 【請求項４８】 酵素がエンテロバクター・クロアカエ
    から得られるものである請求項４７に記載の医薬製剤。
  49. 【請求項４９】 該酵素の基質が、ペニシリン、ペネ
    ム、カルバペネム、セファロスポリン、１-カルバデチ
    アセファロスポリン、または１-オキサデチアセファロ
    スポリンの中から選ばれるβ-ラクタムである請求項４
    ８に記載の医薬製剤。
  50. 【請求項５０】 細胞毒性物質が、ナイトロジェンマス
    タード物質、ビンカアルカロイド、ダウノマイシン、マ
    イトマイシン、ブレオマイシン、細胞毒性ヌクレオシ
    ド、プテリジン、ポドフィロフィルロトキシン、スルホ
    ニル尿素、トリコテセン、およびコルヒチンの中から選
    ばれる請求項４９に記載の医薬製剤。
  51. 【請求項５１】 (ｉ)診断しようとする器官、組織、細
    胞または腫瘍に対する特異性を有する少なくとも１つの
    Ｆab'-様の部分を有し、さらにイメージング物質に対す
    る特異性を有する少なくとも１つのＦab'-様の部分をも
    有する[化１]で示される化合物および１つまたはそれ以
    上の製薬的に許容され得る担体を含有する医薬製剤の診
    断学的有効量を、診断を要する哺乳動物に投与し、そし
    て(ii)疾患、臨床症状または生物学的状態を診断できる
    ように、[化１]で示される化合物に結合され得るイメー
    ジング物質の診断学的有効量を診断を要する哺乳動物に
    投与すること、を特徴とする哺乳動物における疾患、臨
    床症状または生物学的状態を診断するための方法。
  52. 【請求項５２】 哺乳動物がヒトである請求項５１に記
    載の方法。
  53. 【請求項５３】 [化１]で示される化合物の少なくとも
    １つのＦab'-様の基が、ガンマ線放出放射性核種または
    常磁性金属イオンと錯体化したキレート剤からなる生理
    学的に適合するキレート錯体に対する特異性を有してい
    る請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 (ｉ)処置しようとする器官、組織、細
    胞または腫瘍に対する特異性を有する少なくとも１つの
    Ｆab'-様の部分を有し、それにより器官、組織、細胞ま
    たは腫瘍に結合し、さらに治療物質に対する特異性を有
    する少なくとも１つのＦab-様の部分をも有する[化１]
    で示される化合物および１つまたはそれ以上の製薬的に
    許容され得る担体を含有する医薬製剤の治療学的有効量
    を、処置を要する哺乳動物に投与し、そして(ii)器官、
    組織、細胞または腫瘍に関連する疾患の処置が行えるよ
    うに、[化１]で示される化合物が特異性を有している治
    療物質の治療学的有効量を処置を要する哺乳動物に投与
    すること、を特徴とする哺乳動物における疾患、症状ま
    たは状態を処置するための方法。
  55. 【請求項５５】 哺乳動物がヒトである請求項５４に記
    載の方法。
  56. 【請求項５６】 疾患に関連する標的細胞に保持されて
    いる抗原と結合することのできる第１のＦab'-様の部分
    を有し、さらにＴ細胞レセプター／レセプター複合体お
    よびＴ細胞表面の補助分子それぞれに対する特異性を有
    する第２および第３のＦab'-様の部分をも有する[化１]
    で示される化合物および１つまたはそれ以上の製薬的に
    許容され得る担体を含有する医薬製剤の治療学的有効量
    を処置を要する哺乳動物に投与すること、を特徴とする
    哺乳動物の疾患に関連する細胞を処置するための方法で
    あって、 該Ｔ細胞はそれぞれ第２および第３のＦab'-様の基に対
    する特異性を有する該レセプター／レセプター複合体お
    よび該補助分子の両者の会合によって活性化され、該Ｔ
    細胞が活性化されると該標的細胞を破壊するものであ
    り、該活性化されたＴ細胞および該標的細胞は、[化１]
    で示される化合物が該標的細胞、該Ｔ細胞レセプター／
    レセプター複合体および該補助分子と結合した場合に近
    傍に位置し、それにより活性化された該Ｔ細胞は標的細
    胞を破壊することができる方法。
  57. 【請求項５７】 [化１]で示される化合物をＴ細胞と一
    緒に哺乳動物に投与する、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 [化１]で示される化合物およびＴ細胞
    を通常の製薬的に許容され得る担体と共に同時に投与す
    るものである請求項５７に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 (ｉ)第１の特異性が疾患、症状または
    状態があると疑わしい器官、組織または細胞に対するも
    のである、３つの特異性を有する[化１]で示される３機
    能性抗体-様化合物、および１つまたはそれ以上の製薬
    的に許容され得る担体を含有する医薬製剤の診断学的有
    効量を、診断を要する哺乳動物に投与し、 (ii)[化１]の化合物が第２の特異性を有するイメージン
    グ物質の診断学的有効量を、診断を要する哺乳動物に投
    与し、 (iii)得られたイメージングによって哺乳動物の診断を
    行い、そして (iv)工程(iii)での診断が正しい場合に、[化１]で示さ
    れる化合物が第３の特異性を有している治療物質の治療
    学的有効量を哺乳動物に投与すること、 を特徴とする哺乳動物における疾患、臨床症状または生
    物学的状態を診断および処置するための方法。
  60. 【請求項６０】 疾患が結腸の腺癌である請求項５９に
    記載の方法。
  61. 【請求項６１】 [化１]で示される化合物において、Ｆ
    ab'1が癌胎児性抗原(ＣＥＡ)に対する特異性を有してい
    る請求項６０に記載の方法。
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