JPH0692815A - 抗病原体生物的防除剤,抗生物質の合成をコードしている遺伝子および該抗生物質の使用法 - Google Patents
抗病原体生物的防除剤,抗生物質の合成をコードしている遺伝子および該抗生物質の使用法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】抗真菌性の生物的防除剤,その真菌の成長を阻
害する抗生物質の合成をコードしている遺伝子および該
抗生物質の使用方法の提供 【構成】植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソラニ
(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P. ulti
mum)を阻害する抗生物質を生産するシュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 属の細菌ま
たは該抗生物質を含有する生物的防除剤並びにアシルア
ラニン系殺菌剤,例えばメタラキシルを更に含有する該
生物的防除剤,該細菌,該抗生物質の合成をコードして
いる遺伝子および作動できる該遺伝子を含有するシュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) 種により該抗生物質を生産し,抽出して取得する方
法。
害する抗生物質の合成をコードしている遺伝子および該
抗生物質の使用方法の提供 【構成】植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソラニ
(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P. ulti
mum)を阻害する抗生物質を生産するシュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 属の細菌ま
たは該抗生物質を含有する生物的防除剤並びにアシルア
ラニン系殺菌剤,例えばメタラキシルを更に含有する該
生物的防除剤,該細菌,該抗生物質の合成をコードして
いる遺伝子および作動できる該遺伝子を含有するシュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) 種により該抗生物質を生産し,抽出して取得する方
法。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は,有効な生物的防除剤で
ある新規の細菌株の同定,単離に関する。更に特別に
は,本発明は,植物真菌病原体の成長を阻害することが
見出された細菌株に関するものである。更に特別には,
本発明は,植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani)およびピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) を包含する真菌に対して有効である,
抗生物質のような抗真菌性代謝物を生産することが見出
されている,シュードモナス フルオレッセンス(Pseud
omonas fluorescens) を包含するシュードモナス(Pseud
omonas) 属の成員であるような今まで未知の細菌の菌株
に関する。更に,本発明は該抗生物質を生産するために
コードした遺伝子の同定,単離およびクローニングに関
する。更に特別には,本発明は植物病原性の真菌である
リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム
アルチマム(Pythium ultimum) に対して有効である抗
生物質の生合成に必要な物質のためにコードしてある遺
伝子に関する。更に本発明は農業的に受容できる担体と
共に,生物的病害を防除するシュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株または該菌株
から得られる生物的防除剤の一種またはそれ以上並びに
アシルアラニン系殺真菌剤の一種またはそれ以上を含有
する殺真菌組成物に関する。
ある新規の細菌株の同定,単離に関する。更に特別に
は,本発明は,植物真菌病原体の成長を阻害することが
見出された細菌株に関するものである。更に特別には,
本発明は,植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani)およびピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) を包含する真菌に対して有効である,
抗生物質のような抗真菌性代謝物を生産することが見出
されている,シュードモナス フルオレッセンス(Pseud
omonas fluorescens) を包含するシュードモナス(Pseud
omonas) 属の成員であるような今まで未知の細菌の菌株
に関する。更に,本発明は該抗生物質を生産するために
コードした遺伝子の同定,単離およびクローニングに関
する。更に特別には,本発明は植物病原性の真菌である
リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム
アルチマム(Pythium ultimum) に対して有効である抗
生物質の生合成に必要な物質のためにコードしてある遺
伝子に関する。更に本発明は農業的に受容できる担体と
共に,生物的病害を防除するシュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株または該菌株
から得られる生物的防除剤の一種またはそれ以上並びに
アシルアラニン系殺真菌剤の一種またはそれ以上を含有
する殺真菌組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】或る種の土壌中で成長した作物は或る種
の真菌による病害に対して本来抵抗性があることが知ら
れている。更に,これらの病害の発達を伝導する土壌
が,抑制的野原からの土壌の少量を添加することにより
抑制的または抵抗的な性質を付与され得る〔シーア他.
植物病理学(Phytopathology)70:421(1980)〕。逆に,抑
制的土壌は,オートクレーブにより真菌性病害に対して
伝導的になり得るということは,病害抑制の原因になる
因子は生物的であることを示している。次の研究は,根
部に集落化した細菌は,生物的病害抑制(BDC)とし
て知られているこの現象の原因になる因子であることを
示している〔ベーカー他.植物病害の生物的防除(Biol
ogical control of plant pathogens)フリーマン社出
版,サンフランシスコ(1974)〕。
の真菌による病害に対して本来抵抗性があることが知ら
れている。更に,これらの病害の発達を伝導する土壌
が,抑制的野原からの土壌の少量を添加することにより
抑制的または抵抗的な性質を付与され得る〔シーア他.
植物病理学(Phytopathology)70:421(1980)〕。逆に,抑
制的土壌は,オートクレーブにより真菌性病害に対して
伝導的になり得るということは,病害抑制の原因になる
因子は生物的であることを示している。次の研究は,根
部に集落化した細菌は,生物的病害抑制(BDC)とし
て知られているこの現象の原因になる因子であることを
示している〔ベーカー他.植物病害の生物的防除(Biol
ogical control of plant pathogens)フリーマン社出
版,サンフランシスコ(1974)〕。
【0003】多くの場合,病害を生物的に防除する細菌
の最も有効な菌株は蛍光性のシュードモナド(Pseudomon
ads)である。〔ウェラー他.,Phytopathology, 73:463
-469(1983)〕である。これらの細菌は,殆どの土壌中に
存在する有害な根圈の微生物相を抑制することにより特
定の真菌の病原体の不在下植物の成長を促進することも
示した〔クレーパー他,Phytopathology, 71,1020-1024
(1981)〕。これらの細菌による接種で効果的に抑制され
る重要な植物病害は,ガエウマノミセス グラミニス(G
aeumannomyces gramminis):コムギの立枯病の原因であ
る〔クック他.,Soil Biol. Biochem 8:269-273(1976)
およびピシウム(Pythium) とリゾクトニア(Rhizoctoni
a) 種:棉の立枯病に含まれる病原体〔ハウエル他,Phy
thopathology 69:480-482(1979)〕である。リゾクトニ
ア(Rhizoctonia)は特に若干の理由から問題のある植物
病原体である。第1に広範囲の作物に伝染できる。第2
にこの真菌を防除するのに有効な商業的に購入可能であ
る化学殺真菌剤がない。これらの環境下で,リゾクトニ
アソラニ(Rhizoctonia solani)に対する阻害剤は,この
病害の強力な防除手段として相当に興味のあるものとな
るであろう。
の最も有効な菌株は蛍光性のシュードモナド(Pseudomon
ads)である。〔ウェラー他.,Phytopathology, 73:463
-469(1983)〕である。これらの細菌は,殆どの土壌中に
存在する有害な根圈の微生物相を抑制することにより特
定の真菌の病原体の不在下植物の成長を促進することも
示した〔クレーパー他,Phytopathology, 71,1020-1024
(1981)〕。これらの細菌による接種で効果的に抑制され
る重要な植物病害は,ガエウマノミセス グラミニス(G
aeumannomyces gramminis):コムギの立枯病の原因であ
る〔クック他.,Soil Biol. Biochem 8:269-273(1976)
およびピシウム(Pythium) とリゾクトニア(Rhizoctoni
a) 種:棉の立枯病に含まれる病原体〔ハウエル他,Phy
thopathology 69:480-482(1979)〕である。リゾクトニ
ア(Rhizoctonia)は特に若干の理由から問題のある植物
病原体である。第1に広範囲の作物に伝染できる。第2
にこの真菌を防除するのに有効な商業的に購入可能であ
る化学殺真菌剤がない。これらの環境下で,リゾクトニ
アソラニ(Rhizoctonia solani)に対する阻害剤は,この
病害の強力な防除手段として相当に興味のあるものとな
るであろう。
【0004】多くの生物的に病害を防除するシュードモ
ナス(Pseudomonas)菌株は,真菌性の病原体の成長を阻
害する抗生物質を生産する〔ハウエル他,Phythopathol
ogy69:480-482(1979);ハウエル他,Phythopathology 7
0:712-715(1980)〕。それらは, 微生物相における真菌
性の病原体の抑制に関与している。若干数の過去の研究
は, 病害を防除する細菌または真菌がこれらの抗生物質
を合成できなくなる突然変異の効果に焦点を当てた〔ク
レーパー他,Phytopathology, 71,1020-1024(1981);ハ
ウエル他,Can.J.Microbiol.,29:321-324(1983) 〕。こ
れらの場合,その有機体の病原体を防除する能力は減少
するものの,除去はされない。特に,ハウエル他,Phyt
hopathology 69:480-482(1979)は,リゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani) に対して拮抗的である抗生物
質を生産すると示したシュードモナス フルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) の菌株を開示している。
ナス(Pseudomonas)菌株は,真菌性の病原体の成長を阻
害する抗生物質を生産する〔ハウエル他,Phythopathol
ogy69:480-482(1979);ハウエル他,Phythopathology 7
0:712-715(1980)〕。それらは, 微生物相における真菌
性の病原体の抑制に関与している。若干数の過去の研究
は, 病害を防除する細菌または真菌がこれらの抗生物質
を合成できなくなる突然変異の効果に焦点を当てた〔ク
レーパー他,Phytopathology, 71,1020-1024(1981);ハ
ウエル他,Can.J.Microbiol.,29:321-324(1983) 〕。こ
れらの場合,その有機体の病原体を防除する能力は減少
するものの,除去はされない。特に,ハウエル他,Phyt
hopathology 69:480-482(1979)は,リゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani) に対して拮抗的である抗生物
質を生産すると示したシュードモナス フルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) の菌株を開示している。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】ベーカー等〔Biologic
al Control of Plant Pathogens, (米国植物病理学会,
セントポール, ミネソタ州)(1982年),61-106頁〕は,生
物的防除の重要な因子は与えられた環境で競合できる能
力であると報告している。かくして,植物病原体,特に
リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム
アルチマム(Pythium ultimum) のような真菌の成長を
抑制するのに有効であり,そして植物の根圈に存在する
内在性の細菌と他の微生物相と攻撃的に競合することの
できる生物防除の菌株を取得することは望ましい。
al Control of Plant Pathogens, (米国植物病理学会,
セントポール, ミネソタ州)(1982年),61-106頁〕は,生
物的防除の重要な因子は与えられた環境で競合できる能
力であると報告している。かくして,植物病原体,特に
リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム
アルチマム(Pythium ultimum) のような真菌の成長を
抑制するのに有効であり,そして植物の根圈に存在する
内在性の細菌と他の微生物相と攻撃的に競合することの
できる生物防除の菌株を取得することは望ましい。
【0006】
【課題を解決するための手段】この目的を実行するため
には,リゾクトニア(Rhizoctonia)の成長を抑制する能
力を,他の植物病原体を抑制する能力および/または根
圈中で攻撃的に競合する能力と組み合わせている生物的
防除剤の遺伝子工学的菌株に使用できる,リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)に対する抵抗性を付与す
るのに有用なDNA配列を得ることは更に望ましい。
には,リゾクトニア(Rhizoctonia)の成長を抑制する能
力を,他の植物病原体を抑制する能力および/または根
圈中で攻撃的に競合する能力と組み合わせている生物的
防除剤の遺伝子工学的菌株に使用できる,リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)に対する抵抗性を付与す
るのに有用なDNA配列を得ることは更に望ましい。
【0007】従って,植物病原体, 特に, リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム
(Pythium ultimum) のようなリゾクトニア(Rhizoctoni
a)種とピシウム(Pythium)種を包含する卵菌網(Oomyce
tes) のような植物病原性の真菌から作物を防護するた
めの有効な殺真菌剤処理を提供するのが本発明の一つの
目的である。
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム
(Pythium ultimum) のようなリゾクトニア(Rhizoctoni
a)種とピシウム(Pythium)種を包含する卵菌網(Oomyce
tes) のような植物病原性の真菌から作物を防護するた
めの有効な殺真菌剤処理を提供するのが本発明の一つの
目的である。
【0008】植物好ましくは作物植物上への植物病原性
の攻撃を防除するのに使用できる細菌の生物的防除の菌
株を提供するのが本発明のもう一つの目的である。
の攻撃を防除するのに使用できる細菌の生物的防除の菌
株を提供するのが本発明のもう一つの目的である。
【0009】細菌株を,特に,植物病原体,好ましくは
植物病原性真菌,特に, リゾクトニア ソラニ(Rhizoct
onia solani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimu
m) のようなリゾクトニア(Rhizoctonia)種とピシウム
(Pythium)種を包含する卵菌網(Oomycetes) に対して阻
害的な抗生物質のような抗真菌性代謝物を生産するのに
有用なシュードモナス(Pseudomonas)属の細菌の新規の
菌株を提供するのが本発明の別の特徴である。これらの
新規の菌株は,純粋な形では,真菌性の植物病原体に対
して有効である生物的防除剤を表す。それらは有効成分
を表す抗生物質を生産する。これらの抗生物質も植物病
原体を防除するのに使用できる。
植物病原性真菌,特に, リゾクトニア ソラニ(Rhizoct
onia solani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimu
m) のようなリゾクトニア(Rhizoctonia)種とピシウム
(Pythium)種を包含する卵菌網(Oomycetes) に対して阻
害的な抗生物質のような抗真菌性代謝物を生産するのに
有用なシュードモナス(Pseudomonas)属の細菌の新規の
菌株を提供するのが本発明の別の特徴である。これらの
新規の菌株は,純粋な形では,真菌性の植物病原体に対
して有効である生物的防除剤を表す。それらは有効成分
を表す抗生物質を生産する。これらの抗生物質も植物病
原体を防除するのに使用できる。
【0010】かくして,本発明の別の目的は,下記のシ
ュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluores
cens) 菌株: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168); の一つから得られるまたは一つから選択された精製生物
的防除剤の殺真菌的に有効な量を含有する, 真菌病原体
に対して有効な精製生物的防除剤を提供することにあ
る。
ュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluores
cens) 菌株: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168); の一つから得られるまたは一つから選択された精製生物
的防除剤の殺真菌的に有効な量を含有する, 真菌病原体
に対して有効な精製生物的防除剤を提供することにあ
る。
【0011】植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソ
ラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(Pyt
hium ultimum) に対する有効な防護のための生物的防除
剤と殺真菌剤が提供されるのが本発明の一つの利点であ
る。
ラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(Pyt
hium ultimum) に対する有効な防護のための生物的防除
剤と殺真菌剤が提供されるのが本発明の一つの利点であ
る。
【0012】植物病原体に対して阻害的である抗生物質
の合成のためにコードするのに有用であるDNA配列を
提供するのが本発明の更に別の目的である。
の合成のためにコードするのに有用であるDNA配列を
提供するのが本発明の更に別の目的である。
【0013】生物的防除のために使用する細菌株の生物
的防除能を改善するのに使用できる遺伝子を提供するの
が,本発明の未だ別の目的である。
的防除能を改善するのに使用できる遺伝子を提供するの
が,本発明の未だ別の目的である。
【0014】DNA配列と遺伝子を提供して,植物病原
性の真菌であるリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia s
olani)に対して有効な抗生物質の生産において助けにな
るのが本発明の一つの特徴である。
性の真菌であるリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia s
olani)に対して有効な抗生物質の生産において助けにな
るのが本発明の一つの特徴である。
【0015】植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソ
ラニ(Rhizoctonia solani)に対して活性のある生物的防
除剤と遺伝子を提供するのが本発明の一つの目的であ
る。
ラニ(Rhizoctonia solani)に対して活性のある生物的防
除剤と遺伝子を提供するのが本発明の一つの目的であ
る。
【0016】より広いスペクトラムの植物病原体を阻害
することのできる生物的防除剤を生産してもよいのが本
発明の別の利点である。
することのできる生物的防除剤を生産してもよいのが本
発明の別の利点である。
【0017】植物根圈内で攻撃的に競合でき,そして植
物病原性の真菌であるリゾクトニアソラニ(Rhizoctonia
solani)に対して有効である抗生物質の生産において助
けになるDNA配列を含有する生物的防除剤を生産でき
るのが本発明の未だ別の利点である。
物病原性の真菌であるリゾクトニアソラニ(Rhizoctonia
solani)に対して有効である抗生物質の生産において助
けになるDNA配列を含有する生物的防除剤を生産でき
るのが本発明の未だ別の利点である。
【0018】本発明に従うと,上述の目的は,植物病原
性の真菌であるリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia sol
ani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimum) に対し
て有効な細菌性の生物的防除剤の新規の菌株の同定と単
離そして使用並びに植物病原性の真菌であるリゾクトニ
ア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマ
ム(Pythium ultimum) に対して有効な抗生物質の生産の
ためにコードしてある遺伝子の同定,単離−好ましくは
該生物的防除剤から−そして使用により実施され得る。
このような生物的防除剤の同定と単離は若干の理由から
重要である。第1にリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia
solani)は特に有害な植物病原体である。罹患する植物
は,マメ類,コムギ,トマトおよび馬鈴薯,それに追加
して棉である。第2に,リゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) から植物を防護するために購入できる環境的に安全
で有効な殺真菌剤の処理がないことである。従って,生
体代謝物または抗生物質−生産性の細菌または抗生物質
そのものの施用による作物植物におけるリゾクトニア
ソラニ(R. solani) の感染を防除または予防をするため
の抗生物質を含む生物的防除剤の使用は,この病原体の
防除の第1に環境的に安全でそして効果的な方法を提供
できる。更に,細菌はリゾクトニア ソラニ(R. solan
i) のような植物病原体の防除のために有効な化合物の
商業的な量を生産するのに使用できる。
性の真菌であるリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia sol
ani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimum) に対し
て有効な細菌性の生物的防除剤の新規の菌株の同定と単
離そして使用並びに植物病原性の真菌であるリゾクトニ
ア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマ
ム(Pythium ultimum) に対して有効な抗生物質の生産の
ためにコードしてある遺伝子の同定,単離−好ましくは
該生物的防除剤から−そして使用により実施され得る。
このような生物的防除剤の同定と単離は若干の理由から
重要である。第1にリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia
solani)は特に有害な植物病原体である。罹患する植物
は,マメ類,コムギ,トマトおよび馬鈴薯,それに追加
して棉である。第2に,リゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) から植物を防護するために購入できる環境的に安全
で有効な殺真菌剤の処理がないことである。従って,生
体代謝物または抗生物質−生産性の細菌または抗生物質
そのものの施用による作物植物におけるリゾクトニア
ソラニ(R. solani) の感染を防除または予防をするため
の抗生物質を含む生物的防除剤の使用は,この病原体の
防除の第1に環境的に安全でそして効果的な方法を提供
できる。更に,細菌はリゾクトニア ソラニ(R. solan
i) のような植物病原体の防除のために有効な化合物の
商業的な量を生産するのに使用できる。
【0019】更に,本発明の生物的防除剤は,他の方法
ではリゾクトニア ソラニ(R. solani) およびピシウム
アルチマム(P. ultimum)のための有効な生物的防除剤
ではない他の細菌株と混合して使用できそしてその際こ
れらの生物的防除菌株の有効範囲を増大させることがで
きる。他の根圈生物的防除剤の生物的防除の能力を改善
するために本発明の生物的防除剤を使用することも本発
明の一部分である。
ではリゾクトニア ソラニ(R. solani) およびピシウム
アルチマム(P. ultimum)のための有効な生物的防除剤
ではない他の細菌株と混合して使用できそしてその際こ
れらの生物的防除菌株の有効範囲を増大させることがで
きる。他の根圈生物的防除剤の生物的防除の能力を改善
するために本発明の生物的防除剤を使用することも本発
明の一部分である。
【0020】例えば,米国特許第4,456,684号
(ウエラー他)は,真菌のガエウマノミセス グラミニ
ス(Gaeumannomyces gramminis)が原因であるコムギの病
害である立枯病を, 播種の前にコムギの種子に, この病
害に対して阻害的である細菌を施用することにより, あ
る場合には防除できることを開示している。しかし,ガ
エウマノミセス グラミニス(G. gramminis)の成長が有
効に抑制されている場合, リゾクトニア ソラニ(R. so
lani) は問題が大きくなるコムギの病原体であろう(ジ
ェイ.クック,個人的連絡)。かくして,本発明の生物
的防除剤は,立枯病からコムギを防護し,かつリゾクト
ニア ソラニ(R. solani) およびピシウム アルチマム
(P. ultimum)を含めて有効な範囲を拡大することを意図
して他の生物的防除剤と混合して使用できる。
(ウエラー他)は,真菌のガエウマノミセス グラミニ
ス(Gaeumannomyces gramminis)が原因であるコムギの病
害である立枯病を, 播種の前にコムギの種子に, この病
害に対して阻害的である細菌を施用することにより, あ
る場合には防除できることを開示している。しかし,ガ
エウマノミセス グラミニス(G. gramminis)の成長が有
効に抑制されている場合, リゾクトニア ソラニ(R. so
lani) は問題が大きくなるコムギの病原体であろう(ジ
ェイ.クック,個人的連絡)。かくして,本発明の生物
的防除剤は,立枯病からコムギを防護し,かつリゾクト
ニア ソラニ(R. solani) およびピシウム アルチマム
(P. ultimum)を含めて有効な範囲を拡大することを意図
して他の生物的防除剤と混合して使用できる。
【0021】本発明の生物的防除剤は,細菌株と適合す
る,化学殺真菌剤のような化合物と組み合わせても使用
できる。化学殺真菌剤の間では,ピシウム アルチマム
(Pythium ultimum) に対して有効なメタラキシルが好ま
しい。
る,化学殺真菌剤のような化合物と組み合わせても使用
できる。化学殺真菌剤の間では,ピシウム アルチマム
(Pythium ultimum) に対して有効なメタラキシルが好ま
しい。
【0022】本発明の細菌性生物的防除剤は,植物病原
性の真菌の棲息箇所,好ましくは種子,葉へまたは土壌
へ施用する抗真菌組成物中の有効成分として使用できる
物質を生産するのに有用でもある。本発明の生物的防除
剤により生産された物質は,この物質の有効量を使用す
る種子被覆,またはこの物質の畝と畝との間の溝中にお
ける土壌中へ直接の施用を含むこの技術における如何な
る方法でも使用できる。生物的防除剤そのものも生物的
防除剤に致命的であることを証明しない程度に調製され
た組成物における有効成分として使用できる。
性の真菌の棲息箇所,好ましくは種子,葉へまたは土壌
へ施用する抗真菌組成物中の有効成分として使用できる
物質を生産するのに有用でもある。本発明の生物的防除
剤により生産された物質は,この物質の有効量を使用す
る種子被覆,またはこの物質の畝と畝との間の溝中にお
ける土壌中へ直接の施用を含むこの技術における如何な
る方法でも使用できる。生物的防除剤そのものも生物的
防除剤に致命的であることを証明しない程度に調製され
た組成物における有効成分として使用できる。
【0023】抗生物質の生合成を指向している遺伝子
は,他の細菌株,特にシュードモナス(Pseudomonas)菌
株,これはリゾクトニア ソラニ(R. solani) のために
は有効でない生物的防除剤であるのだが, この菌株に伝
達でき, そしてその際これらを有効な生物的防除菌株に
形質転換できることを我々は示した。根圈の生物的防除
菌株の他の菌株の生物的防除能を改善するためのこの遺
伝子の使用も, 本発明の部分である。例えば, 米国特許
第4,456,684号(ウエラー他)は,真菌のガエ
ウマノミセス グラミニス(Gaeumannomyces gramminis)
が原因であるコムギの病害である立枯病を, 播種の前に
コムギの種子に, この病害に対して阻害的である細菌を
施用することにより, ある場合には防除できることを開
示している。しかし, ガエウマノミセス グラミニス
(G. gramminis)の成長が有効に抑制されている場合, リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) は問題が大きくなるで
あろう, コムギの病原体である(ジェイ.クック,個人
的連絡)。このリゾクトニアソラニ(R.solani) に対し
て有効な抗生物質の合成のための遺伝子は, 立枯病から
コムギを防護するために最近使用された生物的防除菌株
にリゾクトニア ソラニ(R. solani) を含めてその有効
な範囲を拡大するために導入することができた。
は,他の細菌株,特にシュードモナス(Pseudomonas)菌
株,これはリゾクトニア ソラニ(R. solani) のために
は有効でない生物的防除剤であるのだが, この菌株に伝
達でき, そしてその際これらを有効な生物的防除菌株に
形質転換できることを我々は示した。根圈の生物的防除
菌株の他の菌株の生物的防除能を改善するためのこの遺
伝子の使用も, 本発明の部分である。例えば, 米国特許
第4,456,684号(ウエラー他)は,真菌のガエ
ウマノミセス グラミニス(Gaeumannomyces gramminis)
が原因であるコムギの病害である立枯病を, 播種の前に
コムギの種子に, この病害に対して阻害的である細菌を
施用することにより, ある場合には防除できることを開
示している。しかし, ガエウマノミセス グラミニス
(G. gramminis)の成長が有効に抑制されている場合, リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) は問題が大きくなるで
あろう, コムギの病原体である(ジェイ.クック,個人
的連絡)。このリゾクトニアソラニ(R.solani) に対し
て有効な抗生物質の合成のための遺伝子は, 立枯病から
コムギを防護するために最近使用された生物的防除菌株
にリゾクトニア ソラニ(R. solani) を含めてその有効
な範囲を拡大するために導入することができた。
【0024】本発明の組換えDNA配列は,土壌に施用
するための抗真菌組成物に有効成分として使用できる抗
生物質を生産するために使用できる。本発明の組換え生
物的防除剤は,生物的防除剤の有効量を使用する種子被
覆,または生物的防除剤の畝と畝との間の溝中における
土壌中へ直接の施用を含むこの技術における如何なる方
法でも使用できる。生物的防除剤そのものも生物的防除
剤に致命的であることを証明しない程度に調製された組
成物における有効成分として使用できる。
するための抗真菌組成物に有効成分として使用できる抗
生物質を生産するために使用できる。本発明の組換え生
物的防除剤は,生物的防除剤の有効量を使用する種子被
覆,または生物的防除剤の畝と畝との間の溝中における
土壌中へ直接の施用を含むこの技術における如何なる方
法でも使用できる。生物的防除剤そのものも生物的防除
剤に致命的であることを証明しない程度に調製された組
成物における有効成分として使用できる。
【0025】定義 本願で使用されたものとして,下記の術語は下に述べた
意味を持つ。プロモーターまたは調節DNA配列: タンパク質または
他のDNA生産物をコードしている会合した構造DNA
配列の転写,翻訳または発現を援助し,促進しまたは別
の方法で影響を与える非翻訳DNA配列。プロモーター
DNA配列は通常は翻訳DNA配列の5′末端に位置
し,翻訳の開始部位の5′末端への典型的には20ない
し100ヌクレオチドである。
意味を持つ。プロモーターまたは調節DNA配列: タンパク質または
他のDNA生産物をコードしている会合した構造DNA
配列の転写,翻訳または発現を援助し,促進しまたは別
の方法で影響を与える非翻訳DNA配列。プロモーター
DNA配列は通常は翻訳DNA配列の5′末端に位置
し,翻訳の開始部位の5′末端への典型的には20ない
し100ヌクレオチドである。
【0026】構造またはコードしているDNA配列:R
NA,タンパク質または他のDNA生産物を生産するた
めに有機体中で翻訳または転写されるDNA配列。
NA,タンパク質または他のDNA生産物を生産するた
めに有機体中で翻訳または転写されるDNA配列。
【0027】会合した/作動するように結合した:「会
合した」または「作動するように結合した」2個のDN
Aは物理的にまたは機能的に関与する。例えば,プロモ
ーターまたは調節DNA配列と,RNAまたはタンパク
質をコードしているDNA配列との二つの配列が作動す
るように結合しているか;または調節DNA配列が,コ
ードしているDNA配列または構造DNA配列の発現レ
ベルに影響を与えるように,これら二つの配列が位置付
けられているならば,前者のDNA配列は後者のDNA
配列に「会合している」と言うべきである。
合した」または「作動するように結合した」2個のDN
Aは物理的にまたは機能的に関与する。例えば,プロモ
ーターまたは調節DNA配列と,RNAまたはタンパク
質をコードしているDNA配列との二つの配列が作動す
るように結合しているか;または調節DNA配列が,コ
ードしているDNA配列または構造DNA配列の発現レ
ベルに影響を与えるように,これら二つの配列が位置付
けられているならば,前者のDNA配列は後者のDNA
配列に「会合している」と言うべきである。
【0028】キメラの共構造/キメラのDNA配列:m
RNAをコードしているかまたはタンパク質として発現
するDNA配列に;調節またはプロモーターDNA配列
が,会合した,または作動するように結合した結果,調
節DNA配列が会合したDNA配列の転写または発現を
調節することができるようになっている組換えDNA配
列。キメラ共構造の調節DNA配列は,自然界で見出さ
れるように通常は会合したDNA配列に作動するように
結合していない。「ヘテロロガウス(heterologous)」と
言う意味は,プロモーターまたは調節DNA配列および
会合したDNA配列が異なる種または属から単離された
ものである組換えDNA配列を示すのに使用される。
RNAをコードしているかまたはタンパク質として発現
するDNA配列に;調節またはプロモーターDNA配列
が,会合した,または作動するように結合した結果,調
節DNA配列が会合したDNA配列の転写または発現を
調節することができるようになっている組換えDNA配
列。キメラ共構造の調節DNA配列は,自然界で見出さ
れるように通常は会合したDNA配列に作動するように
結合していない。「ヘテロロガウス(heterologous)」と
言う意味は,プロモーターまたは調節DNA配列および
会合したDNA配列が異なる種または属から単離された
ものである組換えDNA配列を示すのに使用される。
【0029】アシルアラニン類:同一の作用機作換言す
れば卵菌網(藻菌類)を防除する性質により特徴付けら
れる殺真菌性のフェニルアミド誘導体。典型的な例は,
米国特許第4,742,079号,4,151,299
号,4,046,911号および研究開示(Research D
isclosure)(8月,1977年)40−41頁および研
究開示(Research Disclosure)(8月,1979年)6
32−633頁に記述されている。
れば卵菌網(藻菌類)を防除する性質により特徴付けら
れる殺真菌性のフェニルアミド誘導体。典型的な例は,
米国特許第4,742,079号,4,151,299
号,4,046,911号および研究開示(Research D
isclosure)(8月,1977年)40−41頁および研
究開示(Research Disclosure)(8月,1979年)6
32−633頁に記述されている。
【0030】メタラキシル(Metalaxyl) :化学名, メチ
ル=N−(2−メトキシアセチル)−N−(2,6−キ
シリル)−DL−アラニナートを持つアシルアラニン系
殺真菌剤の典型的な代表の一般名。その商標はリドミ
ル,アプロンそして(フボル=マンコゼッブとの混合
物)。メタラキシルは米国特許第4,151,299号
に記述されている。
ル=N−(2−メトキシアセチル)−N−(2,6−キ
シリル)−DL−アラニナートを持つアシルアラニン系
殺真菌剤の典型的な代表の一般名。その商標はリドミ
ル,アプロンそして(フボル=マンコゼッブとの混合
物)。メタラキシルは米国特許第4,151,299号
に記述されている。
【0031】フララキシル(Furalaxyl) :化学名,N−
(2−フロイル)−N−(2,6−キシリル)−DL−
アラニナートを持つアシルアラニン系殺真菌剤の別の典
型的代表の一般名。その商標はフォンガリドである。フ
ララキシルは英国特許第1,448,810に記述され
ている。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manual)
第8版(1987)(British Crop Protection Counci
l 出版) 6840頁にも記述されている。
(2−フロイル)−N−(2,6−キシリル)−DL−
アラニナートを持つアシルアラニン系殺真菌剤の別の典
型的代表の一般名。その商標はフォンガリドである。フ
ララキシルは英国特許第1,448,810に記述され
ている。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manual)
第8版(1987)(British Crop Protection Counci
l 出版) 6840頁にも記述されている。
【0032】オキサジキシル(Oxadixyl):化学名,2−
メトキシ−N−(2−オキソ−1,3−オキサゾリジン
−3−イル)−アセト−2′,6′−キシリジドを持つ
アシルアラニン系殺真菌剤の別の典型的な代表の一般
名。その商標は「サンドファン」である。オキサジキシ
ルは英国特許第2,058,059号に記述されてい
る。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manual)第8
版(1987)(BritishCrop Protection Council 出
版) 9175頁にも記述されている。
メトキシ−N−(2−オキソ−1,3−オキサゾリジン
−3−イル)−アセト−2′,6′−キシリジドを持つ
アシルアラニン系殺真菌剤の別の典型的な代表の一般
名。その商標は「サンドファン」である。オキサジキシ
ルは英国特許第2,058,059号に記述されてい
る。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manual)第8
版(1987)(BritishCrop Protection Council 出
版) 9175頁にも記述されている。
【0033】べナラキシル(Benalaxyl) :化学名,メチ
ル=N−フェニルアセチル−N−2,6−キシリル−D
L−アラニナートを持つアシルアラニン系殺真菌剤の別
の典型的代表の一般名。その商標はガルベンである。ベ
ナラキシルは***特許第2,903,612号に記述さ
れている。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manua
l)第8版(1987)(British Crop Protection Coun
cil 出版) 660頁にも記述されている。
ル=N−フェニルアセチル−N−2,6−キシリル−D
L−アラニナートを持つアシルアラニン系殺真菌剤の別
の典型的代表の一般名。その商標はガルベンである。ベ
ナラキシルは***特許第2,903,612号に記述さ
れている。これは「農薬マニュアル」(Pesticide Manua
l)第8版(1987)(British Crop Protection Coun
cil 出版) 660頁にも記述されている。
【0034】オフレイス(Ofurace):化学名,±−α−
2−クロロ−N−2,6−キシリル−γ−ブチロラクト
ンを持つアシルアラニン系殺真菌剤の典型的代表の一般
名。オフレイスは「農薬マニュアル」(Pesticide Manua
l)第8版(1987)(British Crop Protection Coun
cil 出版) 9130頁にも記述されている。
2−クロロ−N−2,6−キシリル−γ−ブチロラクト
ンを持つアシルアラニン系殺真菌剤の典型的代表の一般
名。オフレイスは「農薬マニュアル」(Pesticide Manua
l)第8版(1987)(British Crop Protection Coun
cil 出版) 9130頁にも記述されている。
【0035】次に図面について簡単に説明する。 図1: この図は,三つのコスミドクローン,pANT
5,pANT9およびpANT10の制限酵素地図を示
し,これらは突然変異体2−1のANT- 表現型を補足
することが見出されている。この図では,「B」はBa
mHIの切断部位を;「E」はEcoRIの切断部位
を;そして「H」はHindIII の切断部位を示してい
る。
5,pANT9およびpANT10の制限酵素地図を示
し,これらは突然変異体2−1のANT- 表現型を補足
することが見出されている。この図では,「B」はBa
mHIの切断部位を;「E」はEcoRIの切断部位
を;そして「H」はHindIII の切断部位を示してい
る。
【0036】図2:この図は,突然変異体2−1のAN
T- 表現型と野生型菌株の914と922を補足するた
めのシュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株915のpANT5から誘導したサブ
断片の能力を示している。3と標識したサブ断片は,E
11断片と命名することにした約11kbの領域であ
る。「+」は抗生物質の生産を示す。「−」は抗生物質
を生産しないことを示す。「ND」は,未定である。
T- 表現型と野生型菌株の914と922を補足するた
めのシュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株915のpANT5から誘導したサブ
断片の能力を示している。3と標識したサブ断片は,E
11断片と命名することにした約11kbの領域であ
る。「+」は抗生物質の生産を示す。「−」は抗生物質
を生産しないことを示す。「ND」は,未定である。
【0037】図3:この図は,抗生物質遺伝子領域のE
11断片中へのTn5トランスポゾン挿入の結果を示し
ている。各々のTn5挿入は垂直線として遺伝子地図上
のその大体の位置に示してある。各々の挿入上の数字は
挿入の同定番号を示している。各々の挿入の抗生物質の
生産への影響は,試験した場合には,遺伝子地図の上に
示してある。「−」は抗生物質を生産しないことを示
し,「+」は抗生物質を生産することを示し,「±」は
不定の結果を示している。
11断片中へのTn5トランスポゾン挿入の結果を示し
ている。各々のTn5挿入は垂直線として遺伝子地図上
のその大体の位置に示してある。各々の挿入上の数字は
挿入の同定番号を示している。各々の挿入の抗生物質の
生産への影響は,試験した場合には,遺伝子地図の上に
示してある。「−」は抗生物質を生産しないことを示
し,「+」は抗生物質を生産することを示し,「±」は
不定の結果を示している。
【0038】次に発明を更に詳細に説明する。本発明の
一つの実施態様では,リゾクトニア ソラニ(Rhizocton
ia solani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimum)
の真菌性病原体の生育を阻害する精製した生物的防除剤
を提供する。これらの生物的防除剤は好ましくは精製し
た細菌株,そして更に好ましくはシュードモナド(Pseud
omonads)のようなグラム陰性の細菌株である。生物的防
除剤として最も好ましいものはシュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) の種の菌株であ
る。本発明は細菌株の混合物も包含し,この場合細菌株
の少なくとも一種は精製した生物的防除剤である。本発
明の精製した生物的防除剤は, 有益な抗生物質の活性を
導入するために他の細菌株と組み合わせてもよい。
一つの実施態様では,リゾクトニア ソラニ(Rhizocton
ia solani)とピシウム アルチマム(Pythium ultimum)
の真菌性病原体の生育を阻害する精製した生物的防除剤
を提供する。これらの生物的防除剤は好ましくは精製し
た細菌株,そして更に好ましくはシュードモナド(Pseud
omonads)のようなグラム陰性の細菌株である。生物的防
除剤として最も好ましいものはシュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) の種の菌株であ
る。本発明は細菌株の混合物も包含し,この場合細菌株
の少なくとも一種は精製した生物的防除剤である。本発
明の精製した生物的防除剤は, 有益な抗生物質の活性を
導入するために他の細菌株と組み合わせてもよい。
【0039】生物的防除剤は細菌株で種子または土壌を
処理するために公知のどの方法で施用してもよい。例え
ば,米国特許第4,863,866号を参照。これらの
方法は土壌接種,種子接種そして種子被覆を包含する。
菌株は細菌が生きていないとしても生物的防除のために
有効である。しかしながら,好ましいのは生きている細
菌の施用である。
処理するために公知のどの方法で施用してもよい。例え
ば,米国特許第4,863,866号を参照。これらの
方法は土壌接種,種子接種そして種子被覆を包含する。
菌株は細菌が生きていないとしても生物的防除のために
有効である。しかしながら,好ましいのは生きている細
菌の施用である。
【0040】本発明の別の実施態様は,リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) のような卵菌網を包含する植物病原性
の真菌の成長を阻害する方法を提供する。本発明の方法
においては,精製した生物的防除剤は,リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) のような真菌性病原体の阻害のために
有効であるべきこの技術でのいかなる公知の方法でも施
用でき,有効な生物的防除菌株になる。
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) のような卵菌網を包含する植物病原性
の真菌の成長を阻害する方法を提供する。本発明の方法
においては,精製した生物的防除剤は,リゾクトニア
ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマム(P
ythium ultimum) のような真菌性病原体の阻害のために
有効であるべきこの技術でのいかなる公知の方法でも施
用でき,有効な生物的防除菌株になる。
【0041】本発明は抗真菌組成物とその製法を包含
し,この組成物中では有効成分は本発明の組換え生物的
防除剤(詳細は下記を参照)により生産される抗生物質
または精製した生物的防除菌株そのもののいずれかであ
る。本発明は抗真菌組成物とその製法を包含し,この組
成物中では有効成分は本発明の精製した生物的防除菌株
により生産される抗真菌性の代謝物または抗生物質であ
る。
し,この組成物中では有効成分は本発明の組換え生物的
防除剤(詳細は下記を参照)により生産される抗生物質
または精製した生物的防除菌株そのもののいずれかであ
る。本発明は抗真菌組成物とその製法を包含し,この組
成物中では有効成分は本発明の精製した生物的防除菌株
により生産される抗真菌性の代謝物または抗生物質であ
る。
【0042】有効成分が生物的防除の細菌株である場
合,生物的防除の調製は細菌株による種子または土壌処
理のための公知の如何なる方法でも施用できる。細菌株
はここに記述した化合物の群の一種またはそれ以上の化
合物と均一に混合できるが,このような化合物は細菌株
と適合することを条件とする。好ましい化合物はアシル
アラニン系の殺真菌剤と農業的に受容できる担体であ
る。本発明は,植物,好ましくは作物植物を処理する方
法にも関係し,この方法は細菌株またはその菌株によっ
て生産される抗生物質,または細菌株またはその細菌株
により生産される抗生物質を含有する殺真菌剤を植物へ
施用することを包含する。
合,生物的防除の調製は細菌株による種子または土壌処
理のための公知の如何なる方法でも施用できる。細菌株
はここに記述した化合物の群の一種またはそれ以上の化
合物と均一に混合できるが,このような化合物は細菌株
と適合することを条件とする。好ましい化合物はアシル
アラニン系の殺真菌剤と農業的に受容できる担体であ
る。本発明は,植物,好ましくは作物植物を処理する方
法にも関係し,この方法は細菌株またはその菌株によっ
て生産される抗生物質,または細菌株またはその細菌株
により生産される抗生物質を含有する殺真菌剤を植物へ
施用することを包含する。
【0043】本発明の有効成分は,本発明の生物的防除
剤により生産される抗生物質のような抗真菌性代謝物で
もある。本発明は,植物を処理する方法にも関してい
て,この方法は,抗生物質のような抗真菌性代謝物,ま
たはその代謝物を含有する抗真菌組成物を植物へ施用す
ることを包含する。
剤により生産される抗生物質のような抗真菌性代謝物で
もある。本発明は,植物を処理する方法にも関してい
て,この方法は,抗生物質のような抗真菌性代謝物,ま
たはその代謝物を含有する抗真菌組成物を植物へ施用す
ることを包含する。
【0044】該代謝物を含有する本発明の有効成分は,
通常は組成物の形で施用され,他の化合物と同時にまた
は連続して,処理すべき栽培地または植物に,他の化合
物と同時にまたは続いて施用されうる。これらの化合物
は肥料または微量養素または植物の成長に影響を与える
他の製剤でありうる。それらは所望により製剤技術にお
いて慣用的に使用される担体,界面活性剤または施用促
進助剤を含む選択的除草剤,殺虫剤,殺菌剤(好ましく
はアシルアラニン系殺真菌剤),殺バクテリア剤,殺線
虫剤,殺軟体動物剤またはこれらの製剤のいくつかの混
合物でありうる。適する担体及び助剤は固体または液体
であることができ,製剤技術で通常使用される物質,例
えば天然または再生鉱物物質,溶媒,分散剤,湿潤剤,
粘着剤,増粘剤,結合剤および肥料である。
通常は組成物の形で施用され,他の化合物と同時にまた
は連続して,処理すべき栽培地または植物に,他の化合
物と同時にまたは続いて施用されうる。これらの化合物
は肥料または微量養素または植物の成長に影響を与える
他の製剤でありうる。それらは所望により製剤技術にお
いて慣用的に使用される担体,界面活性剤または施用促
進助剤を含む選択的除草剤,殺虫剤,殺菌剤(好ましく
はアシルアラニン系殺真菌剤),殺バクテリア剤,殺線
虫剤,殺軟体動物剤またはこれらの製剤のいくつかの混
合物でありうる。適する担体及び助剤は固体または液体
であることができ,製剤技術で通常使用される物質,例
えば天然または再生鉱物物質,溶媒,分散剤,湿潤剤,
粘着剤,増粘剤,結合剤および肥料である。
【0045】本発明の有効成分または本発明の細菌株に
より生産される抗真菌性の代謝物の少なくとも一種を含
有する本発明の農薬組成物の好ましい施用法は葉面散
布,種子被覆および土壌処理である。施用回数と施用量
は該当する病原体(菌の種類)による感染の危険度によ
る。とは言うものの有効成分は,液剤で植物の生育部分
を浸漬することにより,または固形例えば粒剤の形で土
壌中に施用すること(土壌施用)により,土壌を介して
根部を通って植物に浸透させること(浸透作用)もでき
る。水田のイネ作物では,このような粒剤を湛水した稲
田に計量して施用してもよい。有効成分は,有効成分の
液剤で種子を浸漬することによりまたはそれらを固体製
剤で被覆することによっても種子に施用(被覆)するこ
とができる。特殊な場合は,別の型の施用,例えば植物
の茎または芽の選択的処理も可能である。
より生産される抗真菌性の代謝物の少なくとも一種を含
有する本発明の農薬組成物の好ましい施用法は葉面散
布,種子被覆および土壌処理である。施用回数と施用量
は該当する病原体(菌の種類)による感染の危険度によ
る。とは言うものの有効成分は,液剤で植物の生育部分
を浸漬することにより,または固形例えば粒剤の形で土
壌中に施用すること(土壌施用)により,土壌を介して
根部を通って植物に浸透させること(浸透作用)もでき
る。水田のイネ作物では,このような粒剤を湛水した稲
田に計量して施用してもよい。有効成分は,有効成分の
液剤で種子を浸漬することによりまたはそれらを固体製
剤で被覆することによっても種子に施用(被覆)するこ
とができる。特殊な場合は,別の型の施用,例えば植物
の茎または芽の選択的処理も可能である。
【0046】更に,驚くべきことに病害を生物的に防除
するシュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株または該菌株から得られる生物的防除
剤の一種またはそれ以上とアシルアラニン系殺真菌剤の
一種またはそれ以上の組み合わせによる施用は,ピシウ
ム アルチマム(Pythium ultimum) とリゾクトニアソラ
ニ(Rhizoctonia solani)種を含む卵菌網(藻菌類)の植
物病原体に対して著しく強化された活性を発揮すること
が見出された。
するシュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株または該菌株から得られる生物的防除
剤の一種またはそれ以上とアシルアラニン系殺真菌剤の
一種またはそれ以上の組み合わせによる施用は,ピシウ
ム アルチマム(Pythium ultimum) とリゾクトニアソラ
ニ(Rhizoctonia solani)種を含む卵菌網(藻菌類)の植
物病原体に対して著しく強化された活性を発揮すること
が見出された。
【0047】該組み合わせにより発揮される活性は,成
分各々の活性を一緒にして加算することにより期待され
るべき活性よりも決定的に高い(相乗作用)。
分各々の活性を一緒にして加算することにより期待され
るべき活性よりも決定的に高い(相乗作用)。
【0048】かくして,本発明は農業的に受容できる担
体と共に,病害を生物的に防除するシュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株または
該菌株から得られる生物的防除剤の一種またはそれ以上
並びにアシルアラニン系殺真菌剤の一種またはそれ以上
を含有する殺真菌組成物に関する。
体と共に,病害を生物的に防除するシュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株または
該菌株から得られる生物的防除剤の一種またはそれ以上
並びにアシルアラニン系殺真菌剤の一種またはそれ以上
を含有する殺真菌組成物に関する。
【0049】2種の有効成分:シュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株(=I)と
アシルアラニン系殺真菌剤(=II)の好ましい混合比
は,I:II=100:1ないし1:100,好ましくは
10:1ないし1:10である。強化された活性は,化
学殺真菌剤が普通の濃度でそして細菌株がヘクタール当
り50gないし5kgの量で添加された時に既に達成され
る。
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株(=I)と
アシルアラニン系殺真菌剤(=II)の好ましい混合比
は,I:II=100:1ないし1:100,好ましくは
10:1ないし1:10である。強化された活性は,化
学殺真菌剤が普通の濃度でそして細菌株がヘクタール当
り50gないし5kgの量で添加された時に既に達成され
る。
【0050】かくして,本明細書および特許請求の範囲
で施用される「生物的防除剤」は精製した,生物的に病
害を防除するシュードモナス フルオレッセンス(Pseud
omonas fluorescens) 菌株単独または一種またはそれ以
上のアシルアラニン系殺真菌剤との組み合わせも包含す
る。これは更に抗生物質のような抗真菌性代謝物を包含
する活性成分単独または一種またはそれ以上のアシルア
ラニン系殺真菌剤との組み合わせも包含する。この明細
書の中で好ましいシュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) は,CGA266446,C
GA266447,CGA267356,CGA270
293,CGA270294およびCGA281836
である。好ましいアシルアラニン系殺真菌剤は,メタラ
キシル(metalaxyl) ,フララキシル(furalaxyl) ,オキ
サジキシル(oxadixyl),ベナラキシル(benalaxyl) およ
びオフレイス(ofrace)である。特に好ましいものはメタ
ラキシルとの組み合わせである。
で施用される「生物的防除剤」は精製した,生物的に病
害を防除するシュードモナス フルオレッセンス(Pseud
omonas fluorescens) 菌株単独または一種またはそれ以
上のアシルアラニン系殺真菌剤との組み合わせも包含す
る。これは更に抗生物質のような抗真菌性代謝物を包含
する活性成分単独または一種またはそれ以上のアシルア
ラニン系殺真菌剤との組み合わせも包含する。この明細
書の中で好ましいシュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) は,CGA266446,C
GA266447,CGA267356,CGA270
293,CGA270294およびCGA281836
である。好ましいアシルアラニン系殺真菌剤は,メタラ
キシル(metalaxyl) ,フララキシル(furalaxyl) ,オキ
サジキシル(oxadixyl),ベナラキシル(benalaxyl) およ
びオフレイス(ofrace)である。特に好ましいものはメタ
ラキシルとの組み合わせである。
【0051】有効成分は,そのままの形態で,或いは好
ましくは,適当な農業的に受容できる担体と共に使用さ
れる。このような担体は,農薬製剤技術で慣用の補助剤
である。従って,公知の方法により乳剤原液,被覆可能
のペースト,直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液,希
釈乳剤,水和剤,水溶剤,粉剤,粒剤,および例えばポ
リマー物質によるカプセル化剤に製剤化される。組成物
の性質と同様,散布,噴霧,散粉,ばらまきまたは注水
のような施用法は,目的とする対象および使用環境に合
わせて選ばれる。施用の有利な量は通常, ヘクタール当
り50gないし2kgの有効成分(a.i.)( ヘクター
ル, 約2.471エーカー),好ましくはヘクタール当
り100gないし2kgの有効成分(a.i.),最も好
ましくはヘクタール当り200gないし500gの有効
成分(a.i.)である。
ましくは,適当な農業的に受容できる担体と共に使用さ
れる。このような担体は,農薬製剤技術で慣用の補助剤
である。従って,公知の方法により乳剤原液,被覆可能
のペースト,直接噴霧可能なまたは希釈可能な溶液,希
釈乳剤,水和剤,水溶剤,粉剤,粒剤,および例えばポ
リマー物質によるカプセル化剤に製剤化される。組成物
の性質と同様,散布,噴霧,散粉,ばらまきまたは注水
のような施用法は,目的とする対象および使用環境に合
わせて選ばれる。施用の有利な量は通常, ヘクタール当
り50gないし2kgの有効成分(a.i.)( ヘクター
ル, 約2.471エーカー),好ましくはヘクタール当
り100gないし2kgの有効成分(a.i.),最も好
ましくはヘクタール当り200gないし500gの有効
成分(a.i.)である。
【0052】有効成分,および適当な場合には固体また
は液体の補助剤を含む組成物,製剤または混合物は,公
知の方法により,例えば有効成分を溶媒,固体担体およ
び適当な場合には表面活性化合物(界面活性剤)のよう
な増量剤と均一に混合および/または摩砕することによ
り製造される。
は液体の補助剤を含む組成物,製剤または混合物は,公
知の方法により,例えば有効成分を溶媒,固体担体およ
び適当な場合には表面活性化合物(界面活性剤)のよう
な増量剤と均一に混合および/または摩砕することによ
り製造される。
【0053】本発明の生物的防除菌株により生産される
抗真菌性代謝物を含有する組成物を包含するそれらのた
めの適当な溶媒は次のものである:芳香族炭化水素,好
ましくは炭素原子数8ないし12の部分,例えばキシレ
ン混合物または置換ナフタレン;ジブチルフタレートま
たはジオクチルフタレートのようなフタレート;シクロ
ヘキサンまたはパラフィンのような脂肪族炭化水素;エ
タノール,エチレングリコール,エチレングリコールモ
ノメチルまたはモノエチルエーテルのようなアルコール
およびグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステ
ル;シクロヘキサノンのようなケトン;N−メチル−2
−ピロリドン,ジメチルスルホキシドまたはジメチルホ
ルムアミドのような強極性溶媒;並びにエポキシ化ココ
ナッツ油または大豆油のようなエポキシ植物油;または
水。
抗真菌性代謝物を含有する組成物を包含するそれらのた
めの適当な溶媒は次のものである:芳香族炭化水素,好
ましくは炭素原子数8ないし12の部分,例えばキシレ
ン混合物または置換ナフタレン;ジブチルフタレートま
たはジオクチルフタレートのようなフタレート;シクロ
ヘキサンまたはパラフィンのような脂肪族炭化水素;エ
タノール,エチレングリコール,エチレングリコールモ
ノメチルまたはモノエチルエーテルのようなアルコール
およびグリコール並びにそれらのエーテルおよびエステ
ル;シクロヘキサノンのようなケトン;N−メチル−2
−ピロリドン,ジメチルスルホキシドまたはジメチルホ
ルムアミドのような強極性溶媒;並びにエポキシ化ココ
ナッツ油または大豆油のようなエポキシ植物油;または
水。
【0054】例えば粉剤および分散性粉末に使用できる
固体担体は通常,方解石,タルク,カオリン,モンモリ
ロナイトまたはアタパルジャイトのような天然鉱物充填
剤である。物性を改良するために,高分散ケイ酸または
高分散吸収性ポリマーを加えることも可能である。適当
な粒状化吸収性担体は多孔性型のもので,例えば軽石,
破砕レンガ,セピオライトまたはベントナイトであり;
そして適当な非吸収性担体は方解石または砂のような物
質である。更に非常に多くの予備粒状化した無機質およ
び有機質の物質,特にドロマイトまたは粉状化植物残
骸,例えばコルク粉末及びおがくずが使用し得る。
固体担体は通常,方解石,タルク,カオリン,モンモリ
ロナイトまたはアタパルジャイトのような天然鉱物充填
剤である。物性を改良するために,高分散ケイ酸または
高分散吸収性ポリマーを加えることも可能である。適当
な粒状化吸収性担体は多孔性型のもので,例えば軽石,
破砕レンガ,セピオライトまたはベントナイトであり;
そして適当な非吸収性担体は方解石または砂のような物
質である。更に非常に多くの予備粒状化した無機質およ
び有機質の物質,特にドロマイトまたは粉状化植物残
骸,例えばコルク粉末及びおがくずが使用し得る。
【0055】製剤化されるべき有効成分の性質によっ
て,適当な表面活性化合物は良好な乳化性,分散性およ
び湿潤性を有する非イオン性,カチオン性および/また
はアニオン性界面活性剤である。“界面活性剤”の用語
は界面活性剤の混合物をも含むものと理解されたい。
て,適当な表面活性化合物は良好な乳化性,分散性およ
び湿潤性を有する非イオン性,カチオン性および/また
はアニオン性界面活性剤である。“界面活性剤”の用語
は界面活性剤の混合物をも含むものと理解されたい。
【0056】適当なアニオン性界面活性剤は,水溶性石
鹸および水溶性合成表面活性化合物の両者であり得る。
鹸および水溶性合成表面活性化合物の両者であり得る。
【0057】適当な石鹸は高級脂肪酸(10ないし22
個の炭素原子鎖)のアルカリ金属塩,アルカリ土類金属
塩,または非置換または置換のアンモニウム塩,例えば
オレイン酸またはステアリン酸,或いは例えばココナッ
ツ油または獣脂から得られる天然脂肪酸混合物のナトリ
ウムまたはカリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩
にも使用できる。
個の炭素原子鎖)のアルカリ金属塩,アルカリ土類金属
塩,または非置換または置換のアンモニウム塩,例えば
オレイン酸またはステアリン酸,或いは例えばココナッ
ツ油または獣脂から得られる天然脂肪酸混合物のナトリ
ウムまたはカリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩
にも使用できる。
【0058】しかしながら,いわゆる合成界面活性剤,
特に脂肪族スルホネート,脂肪族サルフェート,スルホ
ン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルアリール
スルホネートが更に頻繁に使用される。
特に脂肪族スルホネート,脂肪族サルフェート,スルホ
ン化ベンズイミダゾール誘導体またはアルキルアリール
スルホネートが更に頻繁に使用される。
【0059】脂肪族スルホネートまたはサルフェートは
通常アルカリ金属塩,アルカリ土類金属塩或いは非置換
または置換のアンモニウム塩の形態にあり,そしてアシ
ル基のアルキル部分をも含む炭素原子数8ないし22の
アルキル基を含み,例えばリグノスルホン酸,ドデシル
サルフェートまたは天然脂肪酸から得られる脂肪族アル
コールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシ
ウム塩である。これらの化合物には硫酸エステルの塩及
び脂肪族アルコールサルフェートの混合物のナトリウム
またはカルシウム塩である。これらの化合物には硫酸エ
ステルの塩および脂肪族アルコール/エチレンオキシド
付加物のスルホン酸の塩も含まれる。スルホン化ベンズ
イミダゾール誘導体は,好ましくは二つのスルホン酸基
と8ないし22個の炭素原子を含む一つの脂肪族基とを
含む。アルキルアリールスルホネートの例は,ドデシル
ベンゼンスルホン酸,ジブチルナフタレンスルホン酸,
またはナフタレンスルホン酸/ホルムアルデヒド縮合生
成物のナトリウム,カルシウムまたはトリエタノールア
ミン塩である。
通常アルカリ金属塩,アルカリ土類金属塩或いは非置換
または置換のアンモニウム塩の形態にあり,そしてアシ
ル基のアルキル部分をも含む炭素原子数8ないし22の
アルキル基を含み,例えばリグノスルホン酸,ドデシル
サルフェートまたは天然脂肪酸から得られる脂肪族アル
コールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカルシ
ウム塩である。これらの化合物には硫酸エステルの塩及
び脂肪族アルコールサルフェートの混合物のナトリウム
またはカルシウム塩である。これらの化合物には硫酸エ
ステルの塩および脂肪族アルコール/エチレンオキシド
付加物のスルホン酸の塩も含まれる。スルホン化ベンズ
イミダゾール誘導体は,好ましくは二つのスルホン酸基
と8ないし22個の炭素原子を含む一つの脂肪族基とを
含む。アルキルアリールスルホネートの例は,ドデシル
ベンゼンスルホン酸,ジブチルナフタレンスルホン酸,
またはナフタレンスルホン酸/ホルムアルデヒド縮合生
成物のナトリウム,カルシウムまたはトリエタノールア
ミン塩である。
【0060】対応するホスフェートも適当である。例え
ば塩は,ハライド,メチルスルフェートまたはエチルス
ルフェート,例えばステアリルトリメチルアンモニウム
=クロライドまたはベンジルジ(2−クロロエチル)エ
チルアンモニウム=ブロマイドまたは4ないし14モル
のエチレンオキシドを含むp−ノニルフェノール付加物
のリン酸エステルの塩の形が好ましい。
ば塩は,ハライド,メチルスルフェートまたはエチルス
ルフェート,例えばステアリルトリメチルアンモニウム
=クロライドまたはベンジルジ(2−クロロエチル)エ
チルアンモニウム=ブロマイドまたは4ないし14モル
のエチレンオキシドを含むp−ノニルフェノール付加物
のリン酸エステルの塩の形が好ましい。
【0061】非イオン性界面活性剤は,好ましくは脂肪
族または脂環式アルコール,または飽和または不飽和脂
肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテ
ル誘導体であり,該誘導体は3ないし30個のグリコー
ルエーテル基,(脂肪族)炭化水素部分に8ないし20
個の炭素原子,そしてアルキルフェノールのアルキル部
分に6ないし18個の炭素原子を含む。
族または脂環式アルコール,または飽和または不飽和脂
肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテ
ル誘導体であり,該誘導体は3ないし30個のグリコー
ルエーテル基,(脂肪族)炭化水素部分に8ないし20
個の炭素原子,そしてアルキルフェノールのアルキル部
分に6ないし18個の炭素原子を含む。
【0062】他の適当な非イオン性界面活性剤は,ポリ
エチレンオキシドとポリプロピレングリコール,エチレ
ンジアミンポリプロピレングリコールおよびアルキル鎖
中に1ないし10個の炭素原子を含むアルキルポリプロ
ピレングリコールとの水溶性付加物であり,その付加物
は20ないし250個のエチレングリコールエーテル基
および10ないし100個のプロピレングリコールエー
テル基を含む。これらの化合物は通常プロピレングリコ
ール単位当たり1ないし5個のエチレングリコール単位
を含む。
エチレンオキシドとポリプロピレングリコール,エチレ
ンジアミンポリプロピレングリコールおよびアルキル鎖
中に1ないし10個の炭素原子を含むアルキルポリプロ
ピレングリコールとの水溶性付加物であり,その付加物
は20ないし250個のエチレングリコールエーテル基
および10ないし100個のプロピレングリコールエー
テル基を含む。これらの化合物は通常プロピレングリコ
ール単位当たり1ないし5個のエチレングリコール単位
を含む。
【0063】非イオン性界面活性剤の代表例は,ノニル
フェノール−ポリエトキシエタノール,ヒマシ油ポリグ
リコールエーテル,ポリプロピレン/ポリエチレンオキ
シド付加物,トリブチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール,ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキ
シエトキシエタノールである。
フェノール−ポリエトキシエタノール,ヒマシ油ポリグ
リコールエーテル,ポリプロピレン/ポリエチレンオキ
シド付加物,トリブチルフェノキシポリエトキシエタノ
ール,ポリエチレングリコールおよびオクチルフェノキ
シエトキシエタノールである。
【0064】ポリオキシエチレンソルビタン,例えばポ
リオキシエチレンソルビタントリオレートの脂肪酸エス
テルもまた適当な非イオン性界面活性剤である。
リオキシエチレンソルビタントリオレートの脂肪酸エス
テルもまた適当な非イオン性界面活性剤である。
【0065】カチオン性界面活性剤は,好ましくはN−
置換基として少なくとも一つの炭素原子数8ないし22
のアルキル基と,他の置換基として低級非置換またはハ
ロゲン化アルキル基,ベンジル基または低級ヒドロキシ
アルキル基とを含む第四アンモニウム塩である。該塩は
好ましくはハライド,メチル硫酸塩またはエチル硫酸塩
の形態にあり,例えばステアリルトリメチルアンモニウ
ムクロリドまたはベンジルジ−(2−クロロエチル)エ
チルアンモニウムブロミドである。
置換基として少なくとも一つの炭素原子数8ないし22
のアルキル基と,他の置換基として低級非置換またはハ
ロゲン化アルキル基,ベンジル基または低級ヒドロキシ
アルキル基とを含む第四アンモニウム塩である。該塩は
好ましくはハライド,メチル硫酸塩またはエチル硫酸塩
の形態にあり,例えばステアリルトリメチルアンモニウ
ムクロリドまたはベンジルジ−(2−クロロエチル)エ
チルアンモニウムブロミドである。
【0066】製剤業界で慣用的に使用される界面活性剤
は,特に下記の刊行物に記載されている:
は,特に下記の刊行物に記載されている:
【0067】“マクカッチャンズ デタージェンツ ア
ンド エマルジファイアーズ アニュアル (McCutcheo
n's Detergents and Emulsifiers)",マック出版社, リ
ングウッド ニュー ジャーシー, 1979年(Mc Publishi
ng Corp.,Ringwood, New Jersey), 1979; およびシセリ
アンド ウッド,「界面活性剤百科辞典」(Encyclop
edia of Surface Active Agents), ケミカル出版会社(C
hemical Publishing Co., Inc.), ニューヨーク,19
80年。
ンド エマルジファイアーズ アニュアル (McCutcheo
n's Detergents and Emulsifiers)",マック出版社, リ
ングウッド ニュー ジャーシー, 1979年(Mc Publishi
ng Corp.,Ringwood, New Jersey), 1979; およびシセリ
アンド ウッド,「界面活性剤百科辞典」(Encyclop
edia of Surface Active Agents), ケミカル出版会社(C
hemical Publishing Co., Inc.), ニューヨーク,19
80年。
【0068】農薬組成物は通常約0.1ないし約99
%,好ましくは約0.1ないし約95%,そして最も好
ましくは約3ないし90%の有効成分,約1ないし約9
9.9%,好ましくは約1ないし約99%,そして最も
好ましくは約5ないし約95%の固体又は液体助剤,並
びに約0ないし約25%,好ましくは0.1ないし約2
5%,そして最も好ましくは約0.1ないし約20%の
界面活性剤を含有する。
%,好ましくは約0.1ないし約95%,そして最も好
ましくは約3ないし90%の有効成分,約1ないし約9
9.9%,好ましくは約1ないし約99%,そして最も
好ましくは約5ないし約95%の固体又は液体助剤,並
びに約0ないし約25%,好ましくは0.1ないし約2
5%,そして最も好ましくは約0.1ないし約20%の
界面活性剤を含有する。
【0069】商業製品が好ましくは濃縮液として製剤化
されている場合,末端使用者は通常希釈した製剤を使用
する。
されている場合,末端使用者は通常希釈した製剤を使用
する。
【0070】植物病原性の真菌であるリゾクトニア ソ
ラニ(Rhizoctonia solani)に対して有効である抗生物質
の生合成のために要求される特徴をコードしている遺伝
子を含むDNAの断片はクローン化され,特定されてい
る。DNA断片は,シュードモナス フルオレッセンス
(Pseudomonas fluorescens) 菌株915から誘導され
た。この菌株は,テキサスの棉畑中で生育した棉植物の
根部から単離され,そしてピシウム アルチマム(Pythi
um ultimum) とリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia sol
ani)が誘発する棉の立枯病の有効な生物的防除菌株とし
て同定された。
ラニ(Rhizoctonia solani)に対して有効である抗生物質
の生合成のために要求される特徴をコードしている遺伝
子を含むDNAの断片はクローン化され,特定されてい
る。DNA断片は,シュードモナス フルオレッセンス
(Pseudomonas fluorescens) 菌株915から誘導され
た。この菌株は,テキサスの棉畑中で生育した棉植物の
根部から単離され,そしてピシウム アルチマム(Pythi
um ultimum) とリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia sol
ani)が誘発する棉の立枯病の有効な生物的防除菌株とし
て同定された。
【0071】これらの遺伝子を含有するDNA断片を,
2種の異なるシュードモナス フルオレッセンス(P. fl
uorescens)の菌株に伝達した。そしてこれらの菌株はリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) に対して有効な抗生物
質を生産することは知られていなくそしてリゾクトニア
ソラニ(R. solani) が誘発する棉における立枯病のた
めの有効な生物的防除剤ではない。各々の場合におい
て, 抗生物質の遺伝子断片を持っているシュードモナス
フルオレッセンス(P. fluorescens)は, 寒天板上のリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) の成長の阻害に基づく
抗生物質のinvitroでの生産を示した。更に, こ
の菌株は温室内で試験され, リゾクトニア ソラニ(R.
solani) が誘発する棉における立枯病に有効な生物的防
除剤であることが示された。
2種の異なるシュードモナス フルオレッセンス(P. fl
uorescens)の菌株に伝達した。そしてこれらの菌株はリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) に対して有効な抗生物
質を生産することは知られていなくそしてリゾクトニア
ソラニ(R. solani) が誘発する棉における立枯病のた
めの有効な生物的防除剤ではない。各々の場合におい
て, 抗生物質の遺伝子断片を持っているシュードモナス
フルオレッセンス(P. fluorescens)は, 寒天板上のリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) の成長の阻害に基づく
抗生物質のinvitroでの生産を示した。更に, こ
の菌株は温室内で試験され, リゾクトニア ソラニ(R.
solani) が誘発する棉における立枯病に有効な生物的防
除剤であることが示された。
【0072】本発明の一つの実施態様では,組換えDN
A配列が得られ,この配列は真菌のリゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害する抗生物質の生
産をコードしている構造DNA配列を含有している。こ
のDNA配列は,リゾクトニア(Rhizoctonia)の成長を
阻害するのに有効な生物的防除剤から誘導してもよい。
好ましくはこのDNA配列は,シュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) から単離された
クローンpANT5から誘導してもよい。更に好ましく
は,DNA配列はpANT5の約11kbのE11断片
を包含することができる。クローンpANT5はATC
Cに寄託され,ATCC受託番号40868号と指名さ
れている。pANT5の11kbのE11断片を含むプ
ラスミドはATCCに寄託され,ATCC受託番号40
869と指名されている。
A配列が得られ,この配列は真菌のリゾクトニア ソラ
ニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害する抗生物質の生
産をコードしている構造DNA配列を含有している。こ
のDNA配列は,リゾクトニア(Rhizoctonia)の成長を
阻害するのに有効な生物的防除剤から誘導してもよい。
好ましくはこのDNA配列は,シュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) から単離された
クローンpANT5から誘導してもよい。更に好ましく
は,DNA配列はpANT5の約11kbのE11断片
を包含することができる。クローンpANT5はATC
Cに寄託され,ATCC受託番号40868号と指名さ
れている。pANT5の11kbのE11断片を含むプ
ラスミドはATCCに寄託され,ATCC受託番号40
869と指名されている。
【0073】本発明の組換えDNA配列は,キメラであ
ってよく,ヘテロロガウス(heterologous)またはホモロ
ガウス(homologous)であってよい。本発明の組換えDN
A配列は, 上述の構造DNA配列に作動するように結合
した, 一つまたはそれ以上の, 調節DNA配列を包含す
る。このような調節DNA配列は, プロモーター配列,
リーダー配列, そして調節DNA配列の発現に影響して
よい他のDNA配列,並びにそのような影響に作動でき
る調節DNA配列のそれらの断片を含む。
ってよく,ヘテロロガウス(heterologous)またはホモロ
ガウス(homologous)であってよい。本発明の組換えDN
A配列は, 上述の構造DNA配列に作動するように結合
した, 一つまたはそれ以上の, 調節DNA配列を包含す
る。このような調節DNA配列は, プロモーター配列,
リーダー配列, そして調節DNA配列の発現に影響して
よい他のDNA配列,並びにそのような影響に作動でき
る調節DNA配列のそれらの断片を含む。
【0074】本発明の実施態様では,リゾクトニア ソ
ラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害することのでき
る生物的防除剤が提供される。これらの生物的防除剤
は,細菌,植物細胞または動物細胞であってもよいが,
好ましくは細菌株であり,そして更に好ましくはシュー
ドモナス(Pseudomonas)のようなグラム陰性の細菌株で
ある。生物的防除剤として最も好ましいものは,シュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) の属の菌株である。
ラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害することのでき
る生物的防除剤が提供される。これらの生物的防除剤
は,細菌,植物細胞または動物細胞であってもよいが,
好ましくは細菌株であり,そして更に好ましくはシュー
ドモナス(Pseudomonas)のようなグラム陰性の細菌株で
ある。生物的防除剤として最も好ましいものは,シュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) の属の菌株である。
【0075】本発明の他の実施態様は,真菌であるリゾ
クトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害す
る方法を提供する。本発明のこの方法においては,病原
体の阻害のためにコードしてある組換えDNA配列は,
病原体のリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)の
阻害剤として通常は有効でない細菌株のような生物的防
除剤のゲノムに導入されて,有効な生物的防除菌株を形
成する。
クトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害す
る方法を提供する。本発明のこの方法においては,病原
体の阻害のためにコードしてある組換えDNA配列は,
病原体のリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)の
阻害剤として通常は有効でない細菌株のような生物的防
除剤のゲノムに導入されて,有効な生物的防除菌株を形
成する。
【0076】プラスミド型のDNAは,接合と言われる
性的過程により一つの細菌から他の細菌に伝達させるこ
とができる。接合伝達のできるプラスミドは接合線毛の
合成のためにコードした遺伝子を含有する。接合線毛は
中空の細管であって,これはプラスミドを含む細菌(供
与菌)ともう一つの細菌(受容菌)を連結し,それを通
してプラスミドの複製コピーが供与菌から受容菌へ伝達
される。この過程は自然界では自然に起こり,実験室で
は遺伝子を一つの細菌からもう一つの細菌に伝達する方
法として利用される。シュードモナス(Pseudomonas)の
ようなある種の細菌株にとっては,DNAの接合伝達は
好ましい方法である。というのはこれらの細菌は外来の
DNAにより容易に形質転換されないからである。
性的過程により一つの細菌から他の細菌に伝達させるこ
とができる。接合伝達のできるプラスミドは接合線毛の
合成のためにコードした遺伝子を含有する。接合線毛は
中空の細管であって,これはプラスミドを含む細菌(供
与菌)ともう一つの細菌(受容菌)を連結し,それを通
してプラスミドの複製コピーが供与菌から受容菌へ伝達
される。この過程は自然界では自然に起こり,実験室で
は遺伝子を一つの細菌からもう一つの細菌に伝達する方
法として利用される。シュードモナス(Pseudomonas)の
ようなある種の細菌株にとっては,DNAの接合伝達は
好ましい方法である。というのはこれらの細菌は外来の
DNAにより容易に形質転換されないからである。
【0077】更に本発明の別の実施態様では,リゾクト
ニア ソラニ(Rhizoctonia solani)を阻害するのに有効
な抗生物質を取得する方法が提供される。この方法は,
本発明の組換えDNA配列を,形質転換した生物的防除
剤を形成するために生物的防除剤のゲノム内に導入し,
形質転換した生物的防除剤に抗生物質を生産させ,そし
て形質転換した生物的防除剤から抗生物質を抽出するこ
とを包含する。
ニア ソラニ(Rhizoctonia solani)を阻害するのに有効
な抗生物質を取得する方法が提供される。この方法は,
本発明の組換えDNA配列を,形質転換した生物的防除
剤を形成するために生物的防除剤のゲノム内に導入し,
形質転換した生物的防除剤に抗生物質を生産させ,そし
て形質転換した生物的防除剤から抗生物質を抽出するこ
とを包含する。
【0078】
【実施例】本発明は,その特定の実施態様を参考にして
下に記述されるが,多数の変換,応用,そして実施態様
が可能であり,従って,これらの変換,応用および実施
態様は本発明の精神と範囲内にあるものとして見做すべ
きである。
下に記述されるが,多数の変換,応用,そして実施態様
が可能であり,従って,これらの変換,応用および実施
態様は本発明の精神と範囲内にあるものとして見做すべ
きである。
【0079】実施例 実施例1:植物と土壌試料の蒐集: 植物と土壌をテキサ
ス州の活発に棉が成長している区域から蒐集する。植物
試料は播種から約3ないし4週間後に直接畑から採取す
る。植物試料をプラスチック製の袋に入れ,実験室に帰
るまで氷箱に貯蔵する。土壌試料を5ガロンのプラスチ
ック製の蓋付きの容器に入れ25℃で保存する。新鮮な
植物試料を得ることが不可能な場合は,試料採取のため
の幼植物を得るために,畑からの土壌に棉の種を播種
し,生育室で保育する。
ス州の活発に棉が成長している区域から蒐集する。植物
試料は播種から約3ないし4週間後に直接畑から採取す
る。植物試料をプラスチック製の袋に入れ,実験室に帰
るまで氷箱に貯蔵する。土壌試料を5ガロンのプラスチ
ック製の蓋付きの容器に入れ25℃で保存する。新鮮な
植物試料を得ることが不可能な場合は,試料採取のため
の幼植物を得るために,畑からの土壌に棉の種を播種
し,生育室で保育する。
【0080】実施例2:抗生物活性の試料の予備的スク
リーニング 根系からの希釈工程をし,棉の幼植物に付着していた土
壌の濃度を10-7にまで下げる。そして1mLの液体を
アリコート(aliquot) を下記の培地の融解した寒天9m
Lと混合する:トリプチカーゼ−ダイズ・寒天,普通寒
天,馬鈴薯−デキストロース寒天,キング’ス培地B寒
天,そして土壌抽出寒天。幼植物の洗浄した部分も直接
に寒天板に植え付ける。
リーニング 根系からの希釈工程をし,棉の幼植物に付着していた土
壌の濃度を10-7にまで下げる。そして1mLの液体を
アリコート(aliquot) を下記の培地の融解した寒天9m
Lと混合する:トリプチカーゼ−ダイズ・寒天,普通寒
天,馬鈴薯−デキストロース寒天,キング’ス培地B寒
天,そして土壌抽出寒天。幼植物の洗浄した部分も直接
に寒天板に植え付ける。
【0081】3または4日の保温期間の後,寒天板にリ
ゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)で感染した乾
燥粉砕した小麦糠またはピシウム アルチマム(Pythium
ultimum) の寒天釘で接種する。寒天板を定期的に観察
して,細菌コロニー周辺の真菌生育における透明な領域
の存在を確認する。阻害的または抗生物的活性を示した
これらのコロニーを画線−精製し,その抗生物的活性を
確認するために真菌病原体と対峙培養にかける。
ゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)で感染した乾
燥粉砕した小麦糠またはピシウム アルチマム(Pythium
ultimum) の寒天釘で接種する。寒天板を定期的に観察
して,細菌コロニー周辺の真菌生育における透明な領域
の存在を確認する。阻害的または抗生物的活性を示した
これらのコロニーを画線−精製し,その抗生物的活性を
確認するために真菌病原体と対峙培養にかける。
【0082】かくの如く同定した推定上の拮抗体を普通
寒天(高栄養)と土壌抽出寒天(低栄養)上, リゾクト
ニア ソラニ(R. solani) とピシウム アルチマム(P.
ultimum)に対するそれらの抗生物的活性に関する相対的
尺度で級分けする。一つまたはそれ以上の培地上で優れ
た阻害活性を示した菌株は,その遺伝子的純度を保つた
めに5℃における0.85%の生理的食塩水中と滅菌土
壌培地中保存する。
寒天(高栄養)と土壌抽出寒天(低栄養)上, リゾクト
ニア ソラニ(R. solani) とピシウム アルチマム(P.
ultimum)に対するそれらの抗生物的活性に関する相対的
尺度で級分けする。一つまたはそれ以上の培地上で優れ
た阻害活性を示した菌株は,その遺伝子的純度を保つた
めに5℃における0.85%の生理的食塩水中と滅菌土
壌培地中保存する。
【0083】実施例3:新規の分離物の次のスクリーニ
ング 阻害する菌株を,形態的,生理的かつ抗生物的特徴で検
定する。他の分離物と重複していないことが判ったこれ
らの分離物を生理的食塩水からとって普通寒天上画線培
養し3日間保温する。次に,細菌を3枚の寒天板から3
0mLの水で洗い出す。
ング 阻害する菌株を,形態的,生理的かつ抗生物的特徴で検
定する。他の分離物と重複していないことが判ったこれ
らの分離物を生理的食塩水からとって普通寒天上画線培
養し3日間保温する。次に,細菌を3枚の寒天板から3
0mLの水で洗い出す。
【0084】リゾクトニア ソラニ(R. solani) の接種
源は,真菌を湿った滅菌した小麦糠またはキビの穀粒
中,約1ないし2週間にわたり生育し,その材料を風乾
し,次いでその接種源をウィレイ(Wiley) 粉砕器
で20メッシュに粉砕することにより調製する。
源は,真菌を湿った滅菌した小麦糠またはキビの穀粒
中,約1ないし2週間にわたり生育し,その材料を風乾
し,次いでその接種源をウィレイ(Wiley) 粉砕器
で20メッシュに粉砕することにより調製する。
【0085】ピシウム アルチマム(P. ultimum)の接種
源は,真菌を湿った滅菌キビ種子上1週間にわたり生育
することにより製造する。風乾後,その材料を各々の種
子に破砕する。別の方法では,ピシウム アルチマム
(P. ultimum)の接種源をコレステロール−V8ジュース
培地の静置液体培地中,約10日間にわたり生育し,菌
蓋を水洗し,waring- 混合器中水に浸して柔らかくし卵
胞子だけを採取する。
源は,真菌を湿った滅菌キビ種子上1週間にわたり生育
することにより製造する。風乾後,その材料を各々の種
子に破砕する。別の方法では,ピシウム アルチマム
(P. ultimum)の接種源をコレステロール−V8ジュース
培地の静置液体培地中,約10日間にわたり生育し,菌
蓋を水洗し,waring- 混合器中水に浸して柔らかくし卵
胞子だけを採取する。
【0086】胚芽体のけん濁液を土壌と混合して2,0
00卵胞子/1g土壌の割合にする。次に,使用する前
に土壌を約6週間保温し,新鮮な卵胞子に伴う休眠の因
子を排除する。
00卵胞子/1g土壌の割合にする。次に,使用する前
に土壌を約6週間保温し,新鮮な卵胞子に伴う休眠の因
子を排除する。
【0087】生物的防除の有効性の試験のために使用す
る土壌は,pH5.7のルフキン(Lufkin)微細砂質ロー
ムである。土壌を1/4インチ篩に通し,15%湿度レ
ベルに調節する。接種源と土壌を一緒にセメント混合機
中20分間にわたり混合し,約0.15ないし0.4g
の接種源/(13.6kgのリゾクトニア ソラニ(R.sol
ani) のための土壌),そして20.4gの接種源/
(13.6kgのピシウム アルチマム(P. ultimum)のた
めの土壌)の割合にすることにより,土壌に病原体を接
種する。新鮮な材料を調製する前約3週間にわたりこの
材料を使用するのが最適である。
る土壌は,pH5.7のルフキン(Lufkin)微細砂質ロー
ムである。土壌を1/4インチ篩に通し,15%湿度レ
ベルに調節する。接種源と土壌を一緒にセメント混合機
中20分間にわたり混合し,約0.15ないし0.4g
の接種源/(13.6kgのリゾクトニア ソラニ(R.sol
ani) のための土壌),そして20.4gの接種源/
(13.6kgのピシウム アルチマム(P. ultimum)のた
めの土壌)の割合にすることにより,土壌に病原体を接
種する。新鮮な材料を調製する前約3週間にわたりこの
材料を使用するのが最適である。
【0088】接種した土壌を,20オンスのプラスチッ
ク製のコップに入れる。このコップには底面中の5/
8″の孔を通した2″×10″の木綿製の荒織薄地のロ
ウソク芯が付けてある。このロウソク芯は土壌の表面ま
で伸びている。各々のコップ中の土壌中に5個の2cmの
深さの穴をロウソク芯の周りに堀り,ストーンヴィレ(S
toneville)213種の棉の種を各々の穴中に置く。
ク製のコップに入れる。このコップには底面中の5/
8″の孔を通した2″×10″の木綿製の荒織薄地のロ
ウソク芯が付けてある。このロウソク芯は土壌の表面ま
で伸びている。各々のコップ中の土壌中に5個の2cmの
深さの穴をロウソク芯の周りに堀り,ストーンヴィレ(S
toneville)213種の棉の種を各々の穴中に置く。
【0089】別の方法としては,リゾクトニア ソラニ
(R. solani) で接種した約13.6kgの土壌を平面状に
おき四つの部分に分割する。各々の畝に10個の種子
を,各々の部分に分けて播種する。各々の種子は,種子
上約0.5mLの細菌のけん濁液で処理し,土壌表面を
0.5mLで処理する。そしてこの平面状のものを25
℃で,12時間の光周期で約14日間にわたり保温す
る。各々の部分を約250mLの脱イオン化した水で1
日おきに注水する。この期間の最終に,発芽したおよび
生き残っている幼植物を数える。
(R. solani) で接種した約13.6kgの土壌を平面状に
おき四つの部分に分割する。各々の畝に10個の種子
を,各々の部分に分けて播種する。各々の種子は,種子
上約0.5mLの細菌のけん濁液で処理し,土壌表面を
0.5mLで処理する。そしてこの平面状のものを25
℃で,12時間の光周期で約14日間にわたり保温す
る。各々の部分を約250mLの脱イオン化した水で1
日おきに注水する。この期間の最終に,発芽したおよび
生き残っている幼植物を数える。
【0090】ピシウム アルチマム(P. ultimum)の卵胞
子で接種した土壌は,約0.75mLの水または細菌の
けん濁液を含む試験管中に5gのロットで置いてよく,
次に一個の棉の種子を各々の中央部に播種する。10個
の試験管を細菌株で処理し,そしてその試験管を約15
℃で暗所中約7日間にわたり保温する。次いでその試験
管を25℃に移し,12時間の光周期で約3ないし5日
間にわたり保温する。発芽したおよび生き残っている幼
植物を数える。その処理が3個の試験の平均値として5
0%またはそれより良い幼植物の生存率をもたらした細
菌株を0.375mLの普通ブイヨンと0.125mL
のグリセリン中,−70℃で保存する。種を同定したこ
れらの菌株の培地は別の試験に供する。
子で接種した土壌は,約0.75mLの水または細菌の
けん濁液を含む試験管中に5gのロットで置いてよく,
次に一個の棉の種子を各々の中央部に播種する。10個
の試験管を細菌株で処理し,そしてその試験管を約15
℃で暗所中約7日間にわたり保温する。次いでその試験
管を25℃に移し,12時間の光周期で約3ないし5日
間にわたり保温する。発芽したおよび生き残っている幼
植物を数える。その処理が3個の試験の平均値として5
0%またはそれより良い幼植物の生存率をもたらした細
菌株を0.375mLの普通ブイヨンと0.125mL
のグリセリン中,−70℃で保存する。種を同定したこ
れらの菌株の培地は別の試験に供する。
【0091】種子と土壌の処理は,選択した細菌株から
の0.5mLの細菌けん濁液を各々の種子上に置き,種
子を接種した土壌で被覆し,次いで3mLの細菌のけん
濁液をコップ中の土壌の全表面に散布することを包含す
る。次いで,土壌表面を水で僅かに散布し,次いでコッ
プを0.5mlのプラスチックで単層に包装し,ゴムバ
ンドで止める。対照は水で処理する。
の0.5mLの細菌けん濁液を各々の種子上に置き,種
子を接種した土壌で被覆し,次いで3mLの細菌のけん
濁液をコップ中の土壌の全表面に散布することを包含す
る。次いで,土壌表面を水で僅かに散布し,次いでコッ
プを0.5mlのプラスチックで単層に包装し,ゴムバ
ンドで止める。対照は水で処理する。
【0092】処理したそして対照のコップを20℃12
時間の光周期および16℃の暗周期で生育室に置く。補
充の水のない約4日後に,プラスチック製包装をはづ
し,コップの底部の下側2.5インチの水溜中にロウソ
ク芯を置く。更に6日間保温した後,発芽したおよび生
き残っている幼植物を数える。生き残ったものを土壌中
より採り,病害と植物毒の胚軸と根系に与える影響を検
査する。
時間の光周期および16℃の暗周期で生育室に置く。補
充の水のない約4日後に,プラスチック製包装をはづ
し,コップの底部の下側2.5インチの水溜中にロウソ
ク芯を置く。更に6日間保温した後,発芽したおよび生
き残っている幼植物を数える。生き残ったものを土壌中
より採り,病害と植物毒の胚軸と根系に与える影響を検
査する。
【0093】その処理が65%以上の健康な幼植物をも
たらす菌株を保持し,そして,可能ならば,「バーゲイ
の分類決定細菌学」(Bergey's Manual of Determinativ
e Bacteriology) に提供されている形態的および生理的
記述に従う種類により並びに同定試験, 例えば迅速NF
T(API Analytab Product)を使
用して同定する。この試験法は細菌を分類するのに使用
される若干数のキーになる生化学特徴を測定する。この
特別な道具一式は,グラム陰性,オキシダーゼ陽性,シ
ュードモナス(Pseudomonas)の細菌であることを区別す
るのに指名されている。
たらす菌株を保持し,そして,可能ならば,「バーゲイ
の分類決定細菌学」(Bergey's Manual of Determinativ
e Bacteriology) に提供されている形態的および生理的
記述に従う種類により並びに同定試験, 例えば迅速NF
T(API Analytab Product)を使
用して同定する。この試験法は細菌を分類するのに使用
される若干数のキーになる生化学特徴を測定する。この
特別な道具一式は,グラム陰性,オキシダーゼ陽性,シ
ュードモナス(Pseudomonas)の細菌であることを区別す
るのに指名されている。
【0094】実施例4:有効な生物的防除菌株の同定 a)与えられた区域における試料を,異なる土壌の型,
成長した異なる棉品種,そして前作物の歴史を基準にし
て採取する。試料は棉植物が幼植物の段階にある時に採
取するのが理想的であるが,もっと遅い段階でも採取で
きる。
成長した異なる棉品種,そして前作物の歴史を基準にし
て採取する。試料は棉植物が幼植物の段階にある時に採
取するのが理想的であるが,もっと遅い段階でも採取で
きる。
【0095】第1番目のスクリーニングでは,五つの異
なる区域からの試料から22の植物と土壌の試料を得
る。実施例2に従ってこれらの試料から作製した希釈検
定板から,リゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウ
ム アルチマム(P. ultimum)に対して活性のある化合物
を生産する,合計で114種の細菌と20種のアクチノ
ミセテス(Actinomycetes) が単離される。
なる区域からの試料から22の植物と土壌の試料を得
る。実施例2に従ってこれらの試料から作製した希釈検
定板から,リゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウ
ム アルチマム(P. ultimum)に対して活性のある化合物
を生産する,合計で114種の細菌と20種のアクチノ
ミセテス(Actinomycetes) が単離される。
【0096】細菌の全数で,103個の菌株は普通寒天
上リゾクトニア ソラニ(R. solani) に対して活性があ
り,一方59種の菌株が土壌抽出寒天上活性がある。後
の群では,8種は土壌抽出寒天上でもリゾクトニア ソ
ラニ(R. solani) に対して活性があるが,普通寒天上で
は活性がない。これは,単離された細菌の全数の約50
%が普通寒天上でのみ活性があるが,一方他の50%は
両方の培地で活性がある。
上リゾクトニア ソラニ(R. solani) に対して活性があ
り,一方59種の菌株が土壌抽出寒天上活性がある。後
の群では,8種は土壌抽出寒天上でもリゾクトニア ソ
ラニ(R. solani) に対して活性があるが,普通寒天上で
は活性がない。これは,単離された細菌の全数の約50
%が普通寒天上でのみ活性があるが,一方他の50%は
両方の培地で活性がある。
【0097】ピシウム アルチマム(P. ultimum)に対し
て活性を示す単離体の内,79種は普通寒天上でそして
53種は土壌抽出寒天上で活性がある。これらの二つの
群内では,39種が普通寒天上だけ活性があり,9種は
土壌抽出寒天上だけ活性があり,そして84種は両方の
培地上活性がある。
て活性を示す単離体の内,79種は普通寒天上でそして
53種は土壌抽出寒天上で活性がある。これらの二つの
群内では,39種が普通寒天上だけ活性があり,9種は
土壌抽出寒天上だけ活性があり,そして84種は両方の
培地上活性がある。
【0098】b)第2番目のスクリーニングでは,試料
希釈板から135単離体が採取され,in vitro
でリゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム アル
チマム(P. ultimum)に対する活性が試験される。これら
の内,35種が両方の病原体に対して活性がある。
希釈板から135単離体が採取され,in vitro
でリゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム アル
チマム(P. ultimum)に対する活性が試験される。これら
の内,35種が両方の病原体に対して活性がある。
【0099】全部で230種の菌株を,棉の幼植物の立
枯病を起こすピシウム(Pythium) またはリゾクトニア(R
hizoctonia)の生物的防除剤としての有効性のために,
生育室で検定した。これらの単離体の内,29種がリゾ
クトニア ソラニ(R. solani) で接種した土壌中で65
%より良い生き残りを与え,12種がピシウム アルチ
マム(P. ultimum)で接種した土壌中で65%より良い生
き残りを与えた。これらの菌株は,抗生物的および生物
的防除試験そして他の生理的特徴付けを基礎にすると重
複すると見做すべきである。6個のシュードモナド(Pse
udomonad)菌株が10個の抗生物質を生産するアクチノ
ミセテスと共に更に研究された。全てのシュードモナド
(Pseudomonad)菌株がシュードモナス フルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) に属していると同定され
る。
枯病を起こすピシウム(Pythium) またはリゾクトニア(R
hizoctonia)の生物的防除剤としての有効性のために,
生育室で検定した。これらの単離体の内,29種がリゾ
クトニア ソラニ(R. solani) で接種した土壌中で65
%より良い生き残りを与え,12種がピシウム アルチ
マム(P. ultimum)で接種した土壌中で65%より良い生
き残りを与えた。これらの菌株は,抗生物的および生物
的防除試験そして他の生理的特徴付けを基礎にすると重
複すると見做すべきである。6個のシュードモナド(Pse
udomonad)菌株が10個の抗生物質を生産するアクチノ
ミセテスと共に更に研究された。全てのシュードモナド
(Pseudomonad)菌株がシュードモナス フルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) に属していると同定され
る。
【0100】c)第3番目のスクリーニングでは,希釈
板でスクリーニングした全数で359種の単離体を保持
する。そして生物的防除効果のための生育室内での検定
のために遺伝子的に安定化する。これらの単離体の15
8種をリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)また
はピシウム アルチマム(P. ultimum)の生物的防除のた
めに完全に試験する。これらの内,13種はリゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) またはピシウム アルチマム
(P. ultimum)またはその両者によって起こされる幼植物
の病害を良く防除することを示す。これらの単離体は種
が同定され,−70℃でグリセリンのもとで保存され,
そして別の試験に進められる。
板でスクリーニングした全数で359種の単離体を保持
する。そして生物的防除効果のための生育室内での検定
のために遺伝子的に安定化する。これらの単離体の15
8種をリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)また
はピシウム アルチマム(P. ultimum)の生物的防除のた
めに完全に試験する。これらの内,13種はリゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) またはピシウム アルチマム
(P. ultimum)またはその両者によって起こされる幼植物
の病害を良く防除することを示す。これらの単離体は種
が同定され,−70℃でグリセリンのもとで保存され,
そして別の試験に進められる。
【0101】実施例5:スクリーニング検定のための細
菌と真菌の培養 a)細菌株の培養 細菌株は使用する前は,−80℃で50%グリセリン中
に保存される。貯蔵したものからの一つのループ(loop)
を5mLのルリア培地(Luria broth)〔LB:10gの
バクト−トリプトン(Bacto-Trypton) ,ジフコ(Difco)
製;5gの酵母抽出物,オキソイド(Oxoid) 製;0.2
5gのMgSO4 ・H2 O;8gのNaCl;そして1
Lの蒸留水;pH7〕にけん濁し,150rpmおよび
25℃で一夜攪拌する。100mLのLBを1mLの前
培地で接種し,同じ条件で保温する。10mLの後培地
を遠心分離(10分間,10,000rpm)し,そし
てペレットを200mLの生理的食塩水(0.8%Na
Cl)にけん濁して約108 cfu/mLの濃度にす
る。
菌と真菌の培養 a)細菌株の培養 細菌株は使用する前は,−80℃で50%グリセリン中
に保存される。貯蔵したものからの一つのループ(loop)
を5mLのルリア培地(Luria broth)〔LB:10gの
バクト−トリプトン(Bacto-Trypton) ,ジフコ(Difco)
製;5gの酵母抽出物,オキソイド(Oxoid) 製;0.2
5gのMgSO4 ・H2 O;8gのNaCl;そして1
Lの蒸留水;pH7〕にけん濁し,150rpmおよび
25℃で一夜攪拌する。100mLのLBを1mLの前
培地で接種し,同じ条件で保温する。10mLの後培地
を遠心分離(10分間,10,000rpm)し,そし
てペレットを200mLの生理的食塩水(0.8%Na
Cl)にけん濁して約108 cfu/mLの濃度にす
る。
【0102】正確な定量のために,ミクロ滴定板中で希
釈シリーズ(100 ないし10-8,180μl中20μ
L)を調製し,エッペンドルフ・ピペットでルリア寒天
(1.5%のバクト(Bacto) −寒天,ジフコ(Difco)
製)へ10μL滴をスポットする。cfu(コロニー形
成単位)を28℃で保温24時間後に計数する。
釈シリーズ(100 ないし10-8,180μl中20μ
L)を調製し,エッペンドルフ・ピペットでルリア寒天
(1.5%のバクト(Bacto) −寒天,ジフコ(Difco)
製)へ10μL滴をスポットする。cfu(コロニー形
成単位)を28℃で保温24時間後に計数する。
【0103】b)リゾクトニア ソラニ(R. solani) の
培養リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani) を,ペトリ
皿中pH5.6で馬鈴薯・デキストロース寒天(PD
A,ジフコ製)上生育する。25gのキビ(millet) と
50mLの蒸留水の各々を入れた300mLのエルレン
マイヤーフラスコをオートクレーブし,リゾクトニア
ソラニ(R. solani) のPDA培地からの寒天釘(直径5
mm)と共に保温する。3週間にわたり暗所で20℃で
保温した後,伸び過ぎたキビを風乾し,クラッチ(Cula
tti)粉砕器(1mm篩,6000rpm)で粉砕する。
培養リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani) を,ペトリ
皿中pH5.6で馬鈴薯・デキストロース寒天(PD
A,ジフコ製)上生育する。25gのキビ(millet) と
50mLの蒸留水の各々を入れた300mLのエルレン
マイヤーフラスコをオートクレーブし,リゾクトニア
ソラニ(R. solani) のPDA培地からの寒天釘(直径5
mm)と共に保温する。3週間にわたり暗所で20℃で
保温した後,伸び過ぎたキビを風乾し,クラッチ(Cula
tti)粉砕器(1mm篩,6000rpm)で粉砕する。
【0104】c)ピシウム アルチマム(P. ultimum)の
培養ピシウム アルチマム(P. ultimum) を,ペトリ皿中,p
H5.6のマルト寒天上〔Malt Agar(0xoid)〕培養す
る。この培地から一個の寒天釘(直径6mm)を傾斜面
の8mLのオートミール寒天〔150gのオートミー
ル,3mLのエタノール中の1.5%コレステリン液,
そして1Lの蒸留水〕に移す。2時間後に,13mLの
滅菌水を添加し,その板を暗所で10ないし14日間保
温する。寒天の表面から水中へ成長している菌糸体を混
合器に移し小片に切断する。卵胞子の濃度をトーマ(Tho
ma) 室で計数し,蒸留水で2×104 /mLに調節す
る。
培養ピシウム アルチマム(P. ultimum) を,ペトリ皿中,p
H5.6のマルト寒天上〔Malt Agar(0xoid)〕培養す
る。この培地から一個の寒天釘(直径6mm)を傾斜面
の8mLのオートミール寒天〔150gのオートミー
ル,3mLのエタノール中の1.5%コレステリン液,
そして1Lの蒸留水〕に移す。2時間後に,13mLの
滅菌水を添加し,その板を暗所で10ないし14日間保
温する。寒天の表面から水中へ成長している菌糸体を混
合器に移し小片に切断する。卵胞子の濃度をトーマ(Tho
ma) 室で計数し,蒸留水で2×104 /mLに調節す
る。
【0105】実施例6:スクリーニング検定の実施 a)リゾクトニア ソラニ(R. solani) −棉の病系 プラスチック製の鉢(280mL)を,初めにヴェメッ
クス(Vemex) Fの厚い底部層(1cm)で, 次いで水蒸
気加熱したが, 再コロニー化したSt.Aubin土壌(篩分,
3mm)とヴェルメックス(Vermex)Fの混合物(7:3
v/v)で満たす。予め表面を滅菌した棉の種子〔コシ
ッピウム ヒルシュタム,シーヴィ.デルタ・パイン(C
ossypium hirsutum,cv.Delta Pine)〕を手の暖かさの水
に30分間保ち,1ないし1.5cmの深さで土中に播
種する。リゾクトニア ソラニ(R. solani) (2.1.
2を参照)で感染したキビの粉末の5mgを表面下1c
mの鉢中央部に添加する。全ての鉢を60mLの水で注
水する。
クス(Vemex) Fの厚い底部層(1cm)で, 次いで水蒸
気加熱したが, 再コロニー化したSt.Aubin土壌(篩分,
3mm)とヴェルメックス(Vermex)Fの混合物(7:3
v/v)で満たす。予め表面を滅菌した棉の種子〔コシ
ッピウム ヒルシュタム,シーヴィ.デルタ・パイン(C
ossypium hirsutum,cv.Delta Pine)〕を手の暖かさの水
に30分間保ち,1ないし1.5cmの深さで土中に播
種する。リゾクトニア ソラニ(R. solani) (2.1.
2を参照)で感染したキビの粉末の5mgを表面下1c
mの鉢中央部に添加する。全ての鉢を60mLの水で注
水する。
【0106】2時間後に,各々のポットを20mLの細
菌のけん濁液(108 cfu/mL,2.1.1を参
照)または20mLのモンセルン(Moncern)(1mgW
P25/mL)の各々で浸し,約7×106 cfu/m
L土壌または20ppm のモンセルンにする。全ての鉢を
ランダム化し,昼間23℃(14時間)および夜間18
℃(10時間)そして50%の相対湿度に設定した生育
室内で保温する。土壌は湿潤に維持する。
菌のけん濁液(108 cfu/mL,2.1.1を参
照)または20mLのモンセルン(Moncern)(1mgW
P25/mL)の各々で浸し,約7×106 cfu/m
L土壌または20ppm のモンセルンにする。全ての鉢を
ランダム化し,昼間23℃(14時間)および夜間18
℃(10時間)そして50%の相対湿度に設定した生育
室内で保温する。土壌は湿潤に維持する。
【0107】発芽を5,9および13日後に記録する。
20日後に病害の発生率を,植物が健康(「1」)であ
るかまたは発芽していないかまたはもしも根または胚軸
が褐色に見えるならば腐っていて罹病している
(「0」)かを見積もることによって評価する。5個の
種子を持つ各々の鉢については,見積もりは「0」(全
ての植物が罹病しているか発芽しない。),「1」,
「2」,「3」,「4」または「5」(全ての植物が健
康である。)の数で纏める。処理当りの5鉢からの数を
平均化する。実験における各々の処理の生物的防除効果
は,無処理と無病原体の対照(NT.NP,100%の
生物的防除として定義する。)と罹病だけの対照(N
T.P,0%生物的防除と定義される。)と比較して%
で表される。
20日後に病害の発生率を,植物が健康(「1」)であ
るかまたは発芽していないかまたはもしも根または胚軸
が褐色に見えるならば腐っていて罹病している
(「0」)かを見積もることによって評価する。5個の
種子を持つ各々の鉢については,見積もりは「0」(全
ての植物が罹病しているか発芽しない。),「1」,
「2」,「3」,「4」または「5」(全ての植物が健
康である。)の数で纏める。処理当りの5鉢からの数を
平均化する。実験における各々の処理の生物的防除効果
は,無処理と無病原体の対照(NT.NP,100%の
生物的防除として定義する。)と罹病だけの対照(N
T.P,0%生物的防除と定義される。)と比較して%
で表される。
【0108】棉におけるリゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) に対して試験した6個の菌株の生物的防除効果を表
1に示す。菌株CGA267356およびCGA281
836は高い水準の防除を示す(各々,80%と76
%)。他の4個の菌株は若干活性が少ないが優れた生物
的防除活性を示している。
ni) に対して試験した6個の菌株の生物的防除効果を表
1に示す。菌株CGA267356およびCGA281
836は高い水準の防除を示す(各々,80%と76
%)。他の4個の菌株は若干活性が少ないが優れた生物
的防除活性を示している。
【0109】b)ピシウム アルチマム(P. ultimum)−
棉の病系 土壌と種子を上述のa)部で述べたのと同じにして調製
し,各々を50mLの蒸留水で注水する。1時間後に,
20mLの卵胞子けん濁液(2×104 /mL,2.
1.3を参照)を,土壌(約1400cfu/cm3 )
中に浸す。次の2時間後に細菌のけん濁液(108 cf
u/cm3 ,2.1.1を参照)20mLまたはリドミ
ル(WP25,1mg/mL)20mLを各々の鉢に添
加し,各々約7×106 cfu/cm3 土壌または20
ppm のリドミルにする。鉢を上述と同じに保温し,病害
の発生率を上述(上述のa)部を参照)と同じにして記
録する。
棉の病系 土壌と種子を上述のa)部で述べたのと同じにして調製
し,各々を50mLの蒸留水で注水する。1時間後に,
20mLの卵胞子けん濁液(2×104 /mL,2.
1.3を参照)を,土壌(約1400cfu/cm3 )
中に浸す。次の2時間後に細菌のけん濁液(108 cf
u/cm3 ,2.1.1を参照)20mLまたはリドミ
ル(WP25,1mg/mL)20mLを各々の鉢に添
加し,各々約7×106 cfu/cm3 土壌または20
ppm のリドミルにする。鉢を上述と同じに保温し,病害
の発生率を上述(上述のa)部を参照)と同じにして記
録する。
【0110】表2は,ピシウム アルチマム(P. ultimu
m)に対する同じ菌株の生物的防除効果を示している。菌
株CGA266446は最も効果的な(56%の生物的
防除)菌株である。菌株の残りはより少ない有益な効果
を(30ないし44%の生物的防除)を示している。
m)に対する同じ菌株の生物的防除効果を示している。菌
株CGA266446は最も効果的な(56%の生物的
防除)菌株である。菌株の残りはより少ない有益な効果
を(30ないし44%の生物的防除)を示している。
【0111】c)リゾクトニア ソラニ(R. solani) −
トマトの病系 細菌(120mL/6kg)を水蒸気殺菌したプロ−ミッ
クスBXに機械タンブラー中で添加し,5分間にわたり
回転混合する。細菌を入れたプロ−ミックスBXを緩や
かに覆ったバケツの中に3日間置き病原体の接種源
(0.02%のコロニー化したオート穀粒)を添加す
る。次いで、混合物を追加の5分間回転混合し,鉢に入
れる。各々の処理について,5個の鉢に10個のトマト
の種子(cv.ボニーベスト(Bonny Best))を播種す
る。細菌の処理のない対照としてテラクロール(Terracl
or(wp75,10.3k ai/ha)を添加し, 播種の直ぐ後に浸す程
に添加する。各々の処理を4回繰り返す。播種後,ヘッ
ドハウス(headhouse) に4日間にわたり入れ(〜23
℃),次いで試験の残期間温室に移す。15日後に健康
な植物の数を計数する。病原体で処理したが細菌で処理
してない対照の処理を,病原体のチェック処理として準
備する。
トマトの病系 細菌(120mL/6kg)を水蒸気殺菌したプロ−ミッ
クスBXに機械タンブラー中で添加し,5分間にわたり
回転混合する。細菌を入れたプロ−ミックスBXを緩や
かに覆ったバケツの中に3日間置き病原体の接種源
(0.02%のコロニー化したオート穀粒)を添加す
る。次いで、混合物を追加の5分間回転混合し,鉢に入
れる。各々の処理について,5個の鉢に10個のトマト
の種子(cv.ボニーベスト(Bonny Best))を播種す
る。細菌の処理のない対照としてテラクロール(Terracl
or(wp75,10.3k ai/ha)を添加し, 播種の直ぐ後に浸す程
に添加する。各々の処理を4回繰り返す。播種後,ヘッ
ドハウス(headhouse) に4日間にわたり入れ(〜23
℃),次いで試験の残期間温室に移す。15日後に健康
な植物の数を計数する。病原体で処理したが細菌で処理
してない対照の処理を,病原体のチェック処理として準
備する。
【0112】表3は4種のリゾ細菌(rhizobacterial)株
の試験の結果を示す。CGA266446とCGA26
7356は顕著に病害を減少する。CGA266447
とCGA270294は若干活性が低いがこれも有益な
効果を示している。
の試験の結果を示す。CGA266446とCGA26
7356は顕著に病害を減少する。CGA266447
とCGA270294は若干活性が低いがこれも有益な
効果を示している。
【0113】d)リゾクトニア ソラニ(R. solani) −
キュウリの病系 土壌を,細菌細胞を生の市販の鉢入れ用の土壌細胞1m
Lの割合で添加して,10gの土壌当り約109 細胞/
mLの密度になるようにすることにより調製する。同時
に,リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した粉末
状の破砕キビ種子を,10gの土壌当り10mLの率で
土壌中に混合する。土壌を市販の播種平箱に入れ,この
播種平箱は各々約10gの土壌を保持する3cm2 の1
2個の小さい鉢から成る。一つのキユウリの種子を,各
々の播種平箱中の12個の各々の中に播種する。土壌に
添加した病原体または細菌を持たない感染してない対照
と,そして病原体を持つが細菌を持たない感染した対照
は各々の試験に包含される。平箱は28℃の一定温度が
保持されている生育室に置かれ,頭上のスプリンクラー
から日に2回注水することにより湿潤状態に維持され
る。播種12日後に,生き残りの植物の数を各々の処理
に就いて記録する。
キュウリの病系 土壌を,細菌細胞を生の市販の鉢入れ用の土壌細胞1m
Lの割合で添加して,10gの土壌当り約109 細胞/
mLの密度になるようにすることにより調製する。同時
に,リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した粉末
状の破砕キビ種子を,10gの土壌当り10mLの率で
土壌中に混合する。土壌を市販の播種平箱に入れ,この
播種平箱は各々約10gの土壌を保持する3cm2 の1
2個の小さい鉢から成る。一つのキユウリの種子を,各
々の播種平箱中の12個の各々の中に播種する。土壌に
添加した病原体または細菌を持たない感染してない対照
と,そして病原体を持つが細菌を持たない感染した対照
は各々の試験に包含される。平箱は28℃の一定温度が
保持されている生育室に置かれ,頭上のスプリンクラー
から日に2回注水することにより湿潤状態に維持され
る。播種12日後に,生き残りの植物の数を各々の処理
に就いて記録する。
【0114】表4は3種のリゾ細菌(rhizobacterial)株
の試験の結果を示す。CGA267356とCGA27
0293は顕著に病害を減少する。CGA266447
は活性が低い。
の試験の結果を示す。CGA267356とCGA27
0293は顕著に病害を減少する。CGA266447
は活性が低い。
【0115】実施例7:抗病原性菌株の単離と効能 a)シュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株CGA266446 菌株CGA266446は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,バールソン
会社(Burleson Co.)内の砂質粘土ロームにおける成熟棉
植物の根圈から単離される。前作はトウモロコシ(co
rn)であった。この菌株は普通寒天上ではリゾクトニ
ア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマ
ム(Pythium ultimum) の両方に対して活性があるが,土
壌抽出寒天上では低い活性を持つのみである。リゾクト
ニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,71%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,56%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中のト
マトの処理は,123%の病害防除率をもたらす(表
3)。
luorescens) 菌株CGA266446 菌株CGA266446は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,バールソン
会社(Burleson Co.)内の砂質粘土ロームにおける成熟棉
植物の根圈から単離される。前作はトウモロコシ(co
rn)であった。この菌株は普通寒天上ではリゾクトニ
ア ソラニ(Rhizoctonia solani)とピシウム アルチマ
ム(Pythium ultimum) の両方に対して活性があるが,土
壌抽出寒天上では低い活性を持つのみである。リゾクト
ニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,71%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,56%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中のト
マトの処理は,123%の病害防除率をもたらす(表
3)。
【0116】b)シュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) 菌株CGA266447 菌株CGA266447は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonas fluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,菌株266446と同じ
区域から単離され,そして同じ活性を持つ。リゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,70%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,30%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani)で感染した土壌中のト
マトの処理は,54%の病害防除率をもたらす(表
3)。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土
壌中のキュウリの処理は,10%の病害防除率をもたら
す(表4)。
seudomonas fluorescens) 菌株CGA266447 菌株CGA266447は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonas fluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,菌株266446と同じ
区域から単離され,そして同じ活性を持つ。リゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,70%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,30%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani)で感染した土壌中のト
マトの処理は,54%の病害防除率をもたらす(表
3)。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土
壌中のキュウリの処理は,10%の病害防除率をもたら
す(表4)。
【0117】c)シュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) 菌株CGA267356 菌株CGA267356は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,ヒルガウン
ティ,アキラの近くの農場からの,黒土(blackland) 土
壌中の「GP3774」の品種の棉の根圈から単離され
る。前作はコムギであった。この菌株は普通寒天上と土
壌抽出寒天上の両方でリゾクトニア ソラニ(Rhizocton
ia solani)に対して活性がある。これは普通寒天上だけ
でピシウム アルチマム(Pythiumultimum) に活性があ
る。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌
中の棉の処理は,80%の病害防除率をもたらす(表
1)。ピシウム アルチマム(P. ultimum)で感染した土
壌中における棉の処理は,44%の病害防除率をもたら
す(表2)。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染
した土壌中のトマトの処理は,131%の病害防除率を
もたらす(表3)。この菌株は,リゾクトニアソラニ
(R. solani) とピシウム アルチマム(P. ultimum)に対
して有効な抗生物質を生産し,この抗生物質は米国特許
出願番号570,184号(出願日1990年8月20
日)に記載されており,この出願の明細書はここでは参
考文献として包含される。リゾクトニア ソラニ(R. so
lani) で感染した土壌中のキュウリの処理は,67%の
病害防除率をもたらす(表4)。
seudomonas fluorescens) 菌株CGA267356 菌株CGA267356は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,ヒルガウン
ティ,アキラの近くの農場からの,黒土(blackland) 土
壌中の「GP3774」の品種の棉の根圈から単離され
る。前作はコムギであった。この菌株は普通寒天上と土
壌抽出寒天上の両方でリゾクトニア ソラニ(Rhizocton
ia solani)に対して活性がある。これは普通寒天上だけ
でピシウム アルチマム(Pythiumultimum) に活性があ
る。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌
中の棉の処理は,80%の病害防除率をもたらす(表
1)。ピシウム アルチマム(P. ultimum)で感染した土
壌中における棉の処理は,44%の病害防除率をもたら
す(表2)。リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染
した土壌中のトマトの処理は,131%の病害防除率を
もたらす(表3)。この菌株は,リゾクトニアソラニ
(R. solani) とピシウム アルチマム(P. ultimum)に対
して有効な抗生物質を生産し,この抗生物質は米国特許
出願番号570,184号(出願日1990年8月20
日)に記載されており,この出願の明細書はここでは参
考文献として包含される。リゾクトニア ソラニ(R. so
lani) で感染した土壌中のキュウリの処理は,67%の
病害防除率をもたらす(表4)。
【0118】d)シュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) 菌株CGA270293 菌株CGA270293は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,ブラゾスカ
ウンティ在のテキサスA&M試験農場からの,ノーウッ
ド沈泥ローム(Norwood silty loam)中の「ストーンヴィ
レ(Stoneville)213」品種の棉の根圈から単離され
る。前作は棉であった。この菌株は普通寒天上と土壌抽
出寒天上の両方でリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia s
olani)に対して活性がある。これは普通寒天上だけでピ
シウム アルチマム(Pythium ultimum) に活性がある。
リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の
棉の処理は,68%の病害防除率をもたらす(表1)。
ピシウム アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中に
おける棉の処理は,33%の病害防除率をもたらす(表
2)。リゾクトニアソラニ(R. solani) で感染した土壌
中のキュウリの処理は,53%の病害防除率をもたらす
(表4)。
seudomonas fluorescens) 菌株CGA270293 菌株CGA270293は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,ブラゾスカ
ウンティ在のテキサスA&M試験農場からの,ノーウッ
ド沈泥ローム(Norwood silty loam)中の「ストーンヴィ
レ(Stoneville)213」品種の棉の根圈から単離され
る。前作は棉であった。この菌株は普通寒天上と土壌抽
出寒天上の両方でリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia s
olani)に対して活性がある。これは普通寒天上だけでピ
シウム アルチマム(Pythium ultimum) に活性がある。
リゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の
棉の処理は,68%の病害防除率をもたらす(表1)。
ピシウム アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中に
おける棉の処理は,33%の病害防除率をもたらす(表
2)。リゾクトニアソラニ(R. solani) で感染した土壌
中のキュウリの処理は,53%の病害防除率をもたらす
(表4)。
【0119】e)シュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) 菌株CGA270294 菌株CGA270294は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,チリコセか
らのマイルス(Miles) 微細砂質ローム中の「ストーンヴ
ィレ(Stoneville)213」品種の棉の根圈から単離され
る。前作は「ペイマスター(Paymaster)145」の品種
の棉であった。この菌株は普通寒天上と土壌抽出寒天上
でリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)に対して
活性があり,普通寒天上でピシウム アルチマム(Pythi
um ultimum) に活性がある。この菌株は,感染した土壌
中でリゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム ア
ルチマム(P. ultimum)の両方に活性がある。リゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,40%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,34%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中のト
マトの処理は,46%の病害防除率をもたらす(表
3)。
seudomonas fluorescens) 菌株CGA270294 菌株CGA270294は,シュードモナス フルオレ
ッセンス(Pseudomonasfluorescens) 種に属するものと
して同定される。この菌株は,テキサス州,チリコセか
らのマイルス(Miles) 微細砂質ローム中の「ストーンヴ
ィレ(Stoneville)213」品種の棉の根圈から単離され
る。前作は「ペイマスター(Paymaster)145」の品種
の棉であった。この菌株は普通寒天上と土壌抽出寒天上
でリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)に対して
活性があり,普通寒天上でピシウム アルチマム(Pythi
um ultimum) に活性がある。この菌株は,感染した土壌
中でリゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム ア
ルチマム(P. ultimum)の両方に活性がある。リゾクトニ
ア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中の棉の処理
は,40%の病害防除率をもたらす(表1)。ピシウム
アルチマム(P. ultimum)で感染した土壌中における棉
の処理は,34%の病害防除率をもたらす(表2)。リ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) で感染した土壌中のト
マトの処理は,46%の病害防除率をもたらす(表
3)。
【0120】f)シュードモナス フルオレッセンス(P
seudomonas fluorescens) 菌株CGA281836 更に菌株CGA266447の試料を更に培養すると,
2種の別個の細菌株が存在することが見出される。2番
目の細菌は,CGA281836と命名され,CGA2
66447と形態的に異なり,優れた生物的防除活性を
発揮する。CGA281836は,シュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 種に属する
のもとして同定される。リゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) で感染した土壌中の棉の処理は,76%の病害防除
率をもたらす(表1)。ピシウムアルチマム(P. ultimu
m)で感染した土壌中における棉の処理は,39%の病害
防除率をもたらす(表2)。
seudomonas fluorescens) 菌株CGA281836 更に菌株CGA266447の試料を更に培養すると,
2種の別個の細菌株が存在することが見出される。2番
目の細菌は,CGA281836と命名され,CGA2
66447と形態的に異なり,優れた生物的防除活性を
発揮する。CGA281836は,シュードモナス フ
ルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 種に属する
のもとして同定される。リゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) で感染した土壌中の棉の処理は,76%の病害防除
率をもたらす(表1)。ピシウムアルチマム(P. ultimu
m)で感染した土壌中における棉の処理は,39%の病害
防除率をもたらす(表2)。
【0121】実施例8:リゾクトニア ソラニ(Rhizoct
onia solani)の防除 活性のある抗真菌性代謝物は,阻害性の抗生物質を生産
する菌株の生育培地から抽出できる。例えばこれを,菌
株CGA267356を使用して,80%のアセトンで
培地を抽出し,蒸発によりアセトンを除き,そしてジエ
チルエーテルで2番目の抽出をすることにより実施でき
る。ジエチルエーテルを蒸発により除き,乾燥した抽出
物を少量の水中にけん濁する。抗生物質の抽出物の少量
のアリコートを小さい滅菌した寒天板上に置いた濾紙デ
ィスクに使用するとリゾクトニアソラニ(R. solani) の
生育が阻害され,これは活性のある抗生物質の存在を示
している。この抗生物質は有機溶媒により容易に抽出さ
れるので,他のシュードモナド(Pseudomonad)により生
産されると知られている多くの抗生物質に普通である構
造中の環式のまたは芳香族の基を持っているようであ
る。
onia solani)の防除 活性のある抗真菌性代謝物は,阻害性の抗生物質を生産
する菌株の生育培地から抽出できる。例えばこれを,菌
株CGA267356を使用して,80%のアセトンで
培地を抽出し,蒸発によりアセトンを除き,そしてジエ
チルエーテルで2番目の抽出をすることにより実施でき
る。ジエチルエーテルを蒸発により除き,乾燥した抽出
物を少量の水中にけん濁する。抗生物質の抽出物の少量
のアリコートを小さい滅菌した寒天板上に置いた濾紙デ
ィスクに使用するとリゾクトニアソラニ(R. solani) の
生育が阻害され,これは活性のある抗生物質の存在を示
している。この抗生物質は有機溶媒により容易に抽出さ
れるので,他のシュードモナド(Pseudomonad)により生
産されると知られている多くの抗生物質に普通である構
造中の環式のまたは芳香族の基を持っているようであ
る。
【0122】実施例9:リゾクトニア ソラニ(R. sola
ni) またはピシウム アルチマム(P.ultimum)で感染し
た土壌中の棉の立枯病を防除するための,シュードモナ
ス フルオレッセンス(P. fluorescens)とアシルアラニ
ン系の殺真菌剤メタラキシルの相乗的組み合わせ 菌株CGA281836,CGA267356およびC
GA270293を各々滅菌してない土壌に,2×10
8 cfu/mL土壌の割合のドレンチとして施用する。
一方,殺真菌剤メタラキシル(リドミル,0.02,
0.5または2ppm の濃度で)で浸すかまたは種子上
(アプロン,35gの有効成分(10 0kgの種
子))被覆する。ピシウム アルチマム(P. ultimum)を
卵胞子けん濁液(1400胞子/mL土壌)として導入
する。リゾクトニア ソラニ(R. solani)をペレット化
したキビの粉末(各々の鉢の中央部に5mg)として導
入する。温室内で19日間保温した後,棉幼植物の胚軸
を観察尺度に基づく病害のために評価する。
ni) またはピシウム アルチマム(P.ultimum)で感染し
た土壌中の棉の立枯病を防除するための,シュードモナ
ス フルオレッセンス(P. fluorescens)とアシルアラニ
ン系の殺真菌剤メタラキシルの相乗的組み合わせ 菌株CGA281836,CGA267356およびC
GA270293を各々滅菌してない土壌に,2×10
8 cfu/mL土壌の割合のドレンチとして施用する。
一方,殺真菌剤メタラキシル(リドミル,0.02,
0.5または2ppm の濃度で)で浸すかまたは種子上
(アプロン,35gの有効成分(10 0kgの種
子))被覆する。ピシウム アルチマム(P. ultimum)を
卵胞子けん濁液(1400胞子/mL土壌)として導入
する。リゾクトニア ソラニ(R. solani)をペレット化
したキビの粉末(各々の鉢の中央部に5mg)として導
入する。温室内で19日間保温した後,棉幼植物の胚軸
を観察尺度に基づく病害のために評価する。
【0123】ほぼ完全な立枯病の防除は,菌株CGA2
67356を,2ppm でのリドミルと一緒に施用した時
に達成される。リドミルの代わりにアプロンを施用する
と同水準の防除をもたらす。菌株CGA267356単
独では,まだ,両方の病害を顕著に防除する。殺真菌剤
メタラキシル単独では,複合した病害の防除に失敗す
る。
67356を,2ppm でのリドミルと一緒に施用した時
に達成される。リドミルの代わりにアプロンを施用する
と同水準の防除をもたらす。菌株CGA267356単
独では,まだ,両方の病害を顕著に防除する。殺真菌剤
メタラキシル単独では,複合した病害の防除に失敗す
る。
【0124】0.02ppm のリドミル単独では,ピシウ
ム アルチマム(P. ultimum)の40%の防除をもたら
す。菌株CGA267356との0.02ppm のリドミ
ルの組み合わせは防除の水準を60%以上に上げる。菌
株CGA281836は,菌株CGA276356と同
様に本質的に優れている。菌株CGA270293は幼
植物の病状を顕著に抑制しない。
ム アルチマム(P. ultimum)の40%の防除をもたら
す。菌株CGA267356との0.02ppm のリドミ
ルの組み合わせは防除の水準を60%以上に上げる。菌
株CGA281836は,菌株CGA276356と同
様に本質的に優れている。菌株CGA270293は幼
植物の病状を顕著に抑制しない。
【0125】上述の結果は,生物的防除の細菌株と施用
率を減らした殺真菌剤メタラキシルを組み合わせて施用
すると,リゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム
アルチマム(P. ultimum)により起こされる棉における
幼植物の複合病害を殆ど完全に防除をする。
率を減らした殺真菌剤メタラキシルを組み合わせて施用
すると,リゾクトニア ソラニ(R. solani) とピシウム
アルチマム(P. ultimum)により起こされる棉における
幼植物の複合病害を殆ど完全に防除をする。
【0126】実施例10:抗生物的遺伝子の単離 野生型のシュードモナス フルオレッセンス(P. fluore
scens)菌株11c−1−38(菌株915)を,突然誘
発物質であるN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジンに暴露することにより突然変異させる。普通
寒天上,ピシウム アルチマム(P. ultimum)とリゾクト
ニア ソラニ(R. solani) の成長を阻害するそれらの能
力で各々の突然変異体をスクリーニングすることにより
抗生物質によって影響される約2ダースの変異体を同定
する。これらの殆どは,1または2種の植物病原性の真
菌に対して減少したまたは無の抗生物的活性を持つが,
他の真菌のそれらの阻害において影響を受けない。
scens)菌株11c−1−38(菌株915)を,突然誘
発物質であるN−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソ
グアニジンに暴露することにより突然変異させる。普通
寒天上,ピシウム アルチマム(P. ultimum)とリゾクト
ニア ソラニ(R. solani) の成長を阻害するそれらの能
力で各々の突然変異体をスクリーニングすることにより
抗生物質によって影響される約2ダースの変異体を同定
する。これらの殆どは,1または2種の植物病原性の真
菌に対して減少したまたは無の抗生物的活性を持つが,
他の真菌のそれらの阻害において影響を受けない。
【0127】しかし,一つの突然変異体が,これを我々
は突然変異体2−1と命名したのであるが,両方の試験
真菌に対して抗生物的活性に欠如することが見出され
る。これらの結果は,シュードモナス フルオレッセン
ス(P. fluorescens)菌株11c−1−38が,両方の真
菌に対して有効である一つの抗生物質を生産するという
よりはむしろ;一つはピシウム アルチマム(P. ultimu
m)に有効でありそして他の一つはリゾクトニア ソラニ
(R. solani) に対して有効である2種の別種の抗生物質
を生産することを示している。
は突然変異体2−1と命名したのであるが,両方の試験
真菌に対して抗生物的活性に欠如することが見出され
る。これらの結果は,シュードモナス フルオレッセン
ス(P. fluorescens)菌株11c−1−38が,両方の真
菌に対して有効である一つの抗生物質を生産するという
よりはむしろ;一つはピシウム アルチマム(P. ultimu
m)に有効でありそして他の一つはリゾクトニア ソラニ
(R. solani) に対して有効である2種の別種の抗生物質
を生産することを示している。
【0128】親株から単離された全てのDNAの遺伝子
ライブラリーは,そのDNAのSalIによる部分的制
限分解,20−30kbの断片を得るための容量分別,
そしてXhoIで制限分解したベクターpVK100へ
のリゲーションにより構成された〔クナウフ他(Knauf e
t al.), Plasmid 8:45-54(1982) 〕。この遺伝子ライブ
ラリーは,抗生物的突然変異体2−1へ,E.coli
が持っているtra+プラスミドpRK2013による
三親由来接合(triparental conjugation) により伝達さ
れる〔ジッタ他(Ditta et al.), Proc. Natl. Acad.Sc
i.USA 77:7347-7351(1980) 〕。遺伝子伝導した外来接
合個体について, ピシウム アルチマム(P. ultimum)と
リゾクトニア ソラニ(R. solani) の成長阻害を測定す
ることにより抗生物質の生産性を検定する。三個の重複
するクローンは, 突然変異体2−1にリゾクトニア ソ
ラニ(R. solani) に対する活性を復活させたが,ピシウ
ムアルチマム(P. ultimum)に対する活性は復活させなか
ったことが同定された。これらのクローンの制限酵素地
図は決められ,図1に示される。
ライブラリーは,そのDNAのSalIによる部分的制
限分解,20−30kbの断片を得るための容量分別,
そしてXhoIで制限分解したベクターpVK100へ
のリゲーションにより構成された〔クナウフ他(Knauf e
t al.), Plasmid 8:45-54(1982) 〕。この遺伝子ライブ
ラリーは,抗生物的突然変異体2−1へ,E.coli
が持っているtra+プラスミドpRK2013による
三親由来接合(triparental conjugation) により伝達さ
れる〔ジッタ他(Ditta et al.), Proc. Natl. Acad.Sc
i.USA 77:7347-7351(1980) 〕。遺伝子伝導した外来接
合個体について, ピシウム アルチマム(P. ultimum)と
リゾクトニア ソラニ(R. solani) の成長阻害を測定す
ることにより抗生物質の生産性を検定する。三個の重複
するクローンは, 突然変異体2−1にリゾクトニア ソ
ラニ(R. solani) に対する活性を復活させたが,ピシウ
ムアルチマム(P. ultimum)に対する活性は復活させなか
ったことが同定された。これらのクローンの制限酵素地
図は決められ,図1に示される。
【0129】実施例11:抗生物的遺伝子領域の特徴付
け 突然変異体2−1における抗生物的生合成の機能的補足
に必要な遺伝子領域は,より大きい領域の部分をサブク
ローニングし,抗生物性のために突然変異体2−1を補
足するそれらの能力を検定することに決められる(図
2)。突然変異体を補足すると示した最も小さい断片
は,4.9kbのHindIII /EcoRI断片であ
り,これはサブクローニングしたDNA断片6として図
2に示してあり,サブ断片H/E4.9と命名されてい
る。抗生物的遺伝子の親クローンから誘導されたサブク
ローニングしたDNA断片のあるものは,これはpAN
T5と命名されるのであるが,2種の野生型のシュード
モナス フルオレッセンス(P. fluorescens)菌株,11
c−1−33(菌株914)および11−1−6(菌株
922)(これらは,普通ではリゾクトニア ソラニ
(R. solani) に対する抗生物質を生産することができな
かった。)に伝達される。
け 突然変異体2−1における抗生物的生合成の機能的補足
に必要な遺伝子領域は,より大きい領域の部分をサブク
ローニングし,抗生物性のために突然変異体2−1を補
足するそれらの能力を検定することに決められる(図
2)。突然変異体を補足すると示した最も小さい断片
は,4.9kbのHindIII /EcoRI断片であ
り,これはサブクローニングしたDNA断片6として図
2に示してあり,サブ断片H/E4.9と命名されてい
る。抗生物的遺伝子の親クローンから誘導されたサブク
ローニングしたDNA断片のあるものは,これはpAN
T5と命名されるのであるが,2種の野生型のシュード
モナス フルオレッセンス(P. fluorescens)菌株,11
c−1−33(菌株914)および11−1−6(菌株
922)(これらは,普通ではリゾクトニア ソラニ
(R. solani) に対する抗生物質を生産することができな
かった。)に伝達される。
【0130】図2に示した結果は,11kbのEcoR
Iサブ断片は,これは図2中ではサブ断片3として示さ
れそしてサブ断片E11と命名されているが,両方の菌
株にリゾクトニア ソラニ(R. solani) に活性な抗生物
性を付与している。この現象の遺伝子的境界をより良く
決めるために,抗生物的遺伝子の機能的地図を得るため
にトランスポゾンマッピングを使用する。
Iサブ断片は,これは図2中ではサブ断片3として示さ
れそしてサブ断片E11と命名されているが,両方の菌
株にリゾクトニア ソラニ(R. solani) に活性な抗生物
性を付与している。この現象の遺伝子的境界をより良く
決めるために,抗生物的遺伝子の機能的地図を得るため
にトランスポゾンマッピングを使用する。
【0131】25個の独立したトランスポゾンTn5挿
入を,11kbのEcoRI断片に起こさせる(図
3)。これら全ての殆どについて,2種の試験菌株にリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) −活性の抗生物性を付
与する能力が決められ,図3に示してある。この結果
は,11kbのEcoRI断片の右側上の4.9kbの
HindIII /EcoRI断片の殆どは抗生物質の合成
に関与しており,これはHindIII 部位の左側に相当
する領域についても同じである。しかし,HindIII
部位の直ぐ右側の短い領域にある2か所のTn5挿入は
抗生物質の合成に影響していない。これは,この領域は
抗生物性に必要でないDNAを含むことを示している。
入を,11kbのEcoRI断片に起こさせる(図
3)。これら全ての殆どについて,2種の試験菌株にリ
ゾクトニア ソラニ(R. solani) −活性の抗生物性を付
与する能力が決められ,図3に示してある。この結果
は,11kbのEcoRI断片の右側上の4.9kbの
HindIII /EcoRI断片の殆どは抗生物質の合成
に関与しており,これはHindIII 部位の左側に相当
する領域についても同じである。しかし,HindIII
部位の直ぐ右側の短い領域にある2か所のTn5挿入は
抗生物質の合成に影響していない。これは,この領域は
抗生物性に必要でないDNAを含むことを示している。
【0132】実施例12:リゾクトニア ソラニ(R. so
lani) の阻害 活性のある抗生物質は,この抗生物質を生産する形質転
換したシュードモナスフルオレッセンス(P. fluorescen
s)の生育培地から抽出できる。これは,80%アセトン
による培地の抽出,それに次ぐ蒸発によるアセトンの除
去そしてジエチルエーテルによる2番目の抽出により実
施される。ジエチルエーテルを蒸発により除き,乾燥し
た抽出物を少量の水中にけん濁する。抗生物質の抽出物
の少量のアリコートを小さい滅菌した寒天板上に置いた
濾紙ディスクに使用するとリゾクトニア ソラニ(R. so
lani) の生育が阻害され,これは活性のある抗生物質の
存在を示している。この抗生物質は有機溶媒により容易
に抽出されるので,他のシュードモナド(Pseudomonad)
により生産されると知られている多くの抗生物質に普通
である構造中の環式のまたは芳香族の基を持っているよ
うである。
lani) の阻害 活性のある抗生物質は,この抗生物質を生産する形質転
換したシュードモナスフルオレッセンス(P. fluorescen
s)の生育培地から抽出できる。これは,80%アセトン
による培地の抽出,それに次ぐ蒸発によるアセトンの除
去そしてジエチルエーテルによる2番目の抽出により実
施される。ジエチルエーテルを蒸発により除き,乾燥し
た抽出物を少量の水中にけん濁する。抗生物質の抽出物
の少量のアリコートを小さい滅菌した寒天板上に置いた
濾紙ディスクに使用するとリゾクトニア ソラニ(R. so
lani) の生育が阻害され,これは活性のある抗生物質の
存在を示している。この抗生物質は有機溶媒により容易
に抽出されるので,他のシュードモナド(Pseudomonad)
により生産されると知られている多くの抗生物質に普通
である構造中の環式のまたは芳香族の基を持っているよ
うである。
【0133】実施例13:液体組成分を使用する抗真菌
組成物の製剤化 下記の実施例において,組成物の%は重量による。そし
て有効成分* は, a)標的病原体に対して阻害的な抗生物質を生産する形
質転換したシュードモナス フルオレッセンス(Pseudom
onas fluorescens) 細菌であるか,または b)標的病原体に対して阻害的なシュードモナス フル
オレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 細菌により生
産された抗真菌性の代謝物であるか,または c)シュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株であるCGA266446,CGA2
66447,CGA267356,CGA27029
3,CGA270294またはCGA281836とメ
タラキシルとの1:1の組み合わせである。
組成物の製剤化 下記の実施例において,組成物の%は重量による。そし
て有効成分* は, a)標的病原体に対して阻害的な抗生物質を生産する形
質転換したシュードモナス フルオレッセンス(Pseudom
onas fluorescens) 細菌であるか,または b)標的病原体に対して阻害的なシュードモナス フル
オレッセンス(Pseudomonas fluorescens) 細菌により生
産された抗真菌性の代謝物であるか,または c)シュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonas f
luorescens) 菌株であるCGA266446,CGA2
66447,CGA267356,CGA27029
3,CGA270294またはCGA281836とメ
タラキシルとの1:1の組み合わせである。
【0134】1.乳剤原液 a b c 有効成分* 20% 40% 50% ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム 5% 8% 6% ヒマシ油ポリエチレングリコールエーテル 5% - - (エチレンオキシド36モル) トリブチルフェノールポリエチレングリコールエーテル - 12% 4% (エチレンオキサイド4〜5モル) シクロヘキサノン - 15% 20% キシレン混合物 70% 25% 20% これらの原液を水で希釈することにより所望濃度の乳化
液が得られる。
液が得られる。
【0135】2.溶液: a b c d 有効成分* 80% 10% 5% 95% エチレングリコールモノメチルエーテル 20% - - - ポリエチレングリコール400 - 70% - - N−メチル−2−ピロリドン - 20% - - エポキシ化ココナット油 - - 1% 5% 石油留分(沸点範囲:160−190℃) - - 94% - これらの溶液は微滴型で施用するのに適している。
【0136】3.粒剤: a b 有効成分* 5% 10% カオリン 94% - 高分散珪酸 1% - アタパルジャイト - 90% 有効成分を塩化メチレンに溶解し, 溶液を担体上に散布
し, 次いで溶媒を減圧下蒸発する。
し, 次いで溶媒を減圧下蒸発する。
【0137】4.粉剤: 直ぐ使用できる粉剤は, 担体を有効成分と均一に混合す
ることに製造できる。
ることに製造できる。
【0138】実施例14:固形組成分を使用する抗真菌
組成物の製剤化 下記の実施例において,組成物の%は重量による。そし
て有効成分* は,標的病原体に対して阻害的な抗生物質
を生産する形質転換したシュードモナスフルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) 細菌の1種またはそれ以
上であり得るか,または標的病原体に対して阻害的なシ
ュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonasfluoresc
ens) 細菌により生産された抗真菌性の代謝物であり得
る。 1.水和剤 a b c 有効成分* 20% 60% 75% リグノスルホン酸ナトリウム 5% 5% - ラウリル硫酸ナトリウム 3% - - ジイソブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム - 6% 10% オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル - 2% - (エチレンオキサイド7 〜8 モル) 高分散ケイ酸 5% 27% 10% カオリン 67% - - 食塩 − − 59.5% 有効成分を助剤と完全に混合し、混合物を適当なミル中
で完全に摩砕して、水で希釈することにより所望の濃度
の懸濁液を得ることのできる水和剤が得られる。
組成物の製剤化 下記の実施例において,組成物の%は重量による。そし
て有効成分* は,標的病原体に対して阻害的な抗生物質
を生産する形質転換したシュードモナスフルオレッセン
ス(Pseudomonas fluorescens) 細菌の1種またはそれ以
上であり得るか,または標的病原体に対して阻害的なシ
ュードモナス フルオレッセンス(Pseudomonasfluoresc
ens) 細菌により生産された抗真菌性の代謝物であり得
る。 1.水和剤 a b c 有効成分* 20% 60% 75% リグノスルホン酸ナトリウム 5% 5% - ラウリル硫酸ナトリウム 3% - - ジイソブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム - 6% 10% オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル - 2% - (エチレンオキサイド7 〜8 モル) 高分散ケイ酸 5% 27% 10% カオリン 67% - - 食塩 − − 59.5% 有効成分を助剤と完全に混合し、混合物を適当なミル中
で完全に摩砕して、水で希釈することにより所望の濃度
の懸濁液を得ることのできる水和剤が得られる。
【0139】2.乳剤原液 有効成分* 10% オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテル 3% (エチレンオキサイド4〜5モル) ドデシルベンゼンスルホン酸カルシウム 3% ヒマシ油ポリエチレングリコールエーテル 4% (エチレンオキシド36モル) シクロヘキサノン 30% キシレン混合物 50% これらの原液を水で希釈することにより所望濃度の乳化
液が得られる。
液が得られる。
【0140】3.粉剤: 直ぐ使用できる粉剤は, 担体を有効成分と均一に混合
し, 適当なミル中でこの混合物を粉砕することにより製
造できる。
し, 適当なミル中でこの混合物を粉砕することにより製
造できる。
【0141】4.押出し粒剤: 有効成分* 10% リグニンスルホン酸ナトリウム 2% カルボキシメチルセルロース 1% カオリン 87% 有効成分を混合し,助剤と混合し,次いでこの混合物を
水で湿らす。その混合物を押し出し,次に空気流中乾燥
する。
水で湿らす。その混合物を押し出し,次に空気流中乾燥
する。
【0142】5.被覆粒剤: 有効成分* 3% ポリエチレングリコール200 3% カオリン 94% 混合機中,微粉砕した有効成分をポリエチレングリコー
ルで湿らしたカオリンに均一に散布する。無粉塵性の被
覆粒剤がこの方法で得られる。
ルで湿らしたカオリンに均一に散布する。無粉塵性の被
覆粒剤がこの方法で得られる。
【0143】6.けん濁原液: 有効成分* 40% エチレングリコール 10% ノニルフェノールポリエチレングリコール 6% (エチレンオキシド15モル) リグニンスルホン酸ナトリウム 10% カルボキシメチルセルロース 1% 37%水性ホルマリン溶液 0.
2% 75%水性乳濁液のシリコン油 0.
8% 水 32% 微粉砕した有効成分を助剤と混合して,水で希釈するこ
とにより所望の濃度のけん濁液が得られるけん濁原液を
得る。
2% 75%水性乳濁液のシリコン油 0.
8% 水 32% 微粉砕した有効成分を助剤と混合して,水で希釈するこ
とにより所望の濃度のけん濁液が得られるけん濁原液を
得る。
【0144】実施例15:生物的防除菌株の圃場試験 生物的防除菌株は, −80℃で50%グリセリン中に保
存される。貯蔵したものから一つのループ(loop)を5m
Lのルリア培地(Luria broth)〔LB:10gのバクト
−トリプトン(Bacto-Trypton) ,ジフコ(Difco) 製;5
gの酵母抽出物,オキソイド(Oxoid) 製;0.25gの
MgSO4 xH2 O;8gのNaCl;そして1Lの蒸
留水;pH7〕にけん濁し,150rpmおよび25℃
で24時間攪拌する。100mLのLBに1mLの前培
地を接種し,同じ条件下で培養する。16時間後に,培
地を10分間,10,000rpmで遠心分離し,そし
てペレットを生理的食塩水(0.8%NaCl)にけん
濁して3×109 cfu/mL(OD2)に調節する。
かくして,100mLの培地は,OD2の約200−3
00mLのドレンチ(drench)を与える。
存される。貯蔵したものから一つのループ(loop)を5m
Lのルリア培地(Luria broth)〔LB:10gのバクト
−トリプトン(Bacto-Trypton) ,ジフコ(Difco) 製;5
gの酵母抽出物,オキソイド(Oxoid) 製;0.25gの
MgSO4 xH2 O;8gのNaCl;そして1Lの蒸
留水;pH7〕にけん濁し,150rpmおよび25℃
で24時間攪拌する。100mLのLBに1mLの前培
地を接種し,同じ条件下で培養する。16時間後に,培
地を10分間,10,000rpmで遠心分離し,そし
てペレットを生理的食塩水(0.8%NaCl)にけん
濁して3×109 cfu/mL(OD2)に調節する。
かくして,100mLの培地は,OD2の約200−3
00mLのドレンチ(drench)を与える。
【0145】ドレンチ(drench)中の細菌の濃度を調節す
るために,血球計数器と分光光度計が使用される。別法
では,既知のOD〔例えば,登録商標「フィリップスの
マグネシアの乳濁液」"Milk of Magnesia"=Mg(O
H)2 〕の標準塩溶液を,ドレンチ(drench)のODを調
節するのに使用できる。遠心分離機を使用できないとき
は,すべての培地を使用すべきである;その時は,血球
計数器をcfu/mLを決めるために使用する。
るために,血球計数器と分光光度計が使用される。別法
では,既知のOD〔例えば,登録商標「フィリップスの
マグネシアの乳濁液」"Milk of Magnesia"=Mg(O
H)2 〕の標準塩溶液を,ドレンチ(drench)のODを調
節するのに使用できる。遠心分離機を使用できないとき
は,すべての培地を使用すべきである;その時は,血球
計数器をcfu/mLを決めるために使用する。
【0146】正確な定量のために,ミクロ滴定板中で希
釈シリーズ(100 ないし10-8,180μL中20μ
L)を調製し,エッペンドルフ・ピペットでルリア寒天
(1.5%のバクト(Bacto) −寒天,ジフコ(Difco)
製)へ10μL滴をスポットする。cfu(コロニー形
成単位)を28℃で保温24時間後に計数する。
釈シリーズ(100 ないし10-8,180μL中20μ
L)を調製し,エッペンドルフ・ピペットでルリア寒天
(1.5%のバクト(Bacto) −寒天,ジフコ(Difco)
製)へ10μL滴をスポットする。cfu(コロニー形
成単位)を28℃で保温24時間後に計数する。
【0147】10′(=1回繰り返し(rep) )当り25
0mLの細菌のけん濁液を被覆した種子(繰り返し当り
200種子)上にドレンチ(drench)する。農薬の残って
いない手で持つ散布用または注水用の罐を使用して, 狭
い幅または約1.5インチ幅でドレンチする。
0mLの細菌のけん濁液を被覆した種子(繰り返し当り
200種子)上にドレンチ(drench)する。農薬の残って
いない手で持つ散布用または注水用の罐を使用して, 狭
い幅または約1.5インチ幅でドレンチする。
【0148】リゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solan
i)およびピシウム アルチマム(Pythium ultimum) は上
述の実施例5と同様に接種する。
i)およびピシウム アルチマム(Pythium ultimum) は上
述の実施例5と同様に接種する。
【0149】発芽を, 発芽前の立枯病を検定するために
播種10日後に記録する。立ち木(stand) を, 発芽後の
立枯病を検定するために播種21または28日後に記録
する。
播種10日後に記録する。立ち木(stand) を, 発芽後の
立枯病を検定するために播種21または28日後に記録
する。
【0150】 表1 棉植物中のリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)に対するスクリーニン グで使用される菌株の生物的防除活性(%) 菌株 生物的防除活性の平均% 1 CGA266446 71 CGA266447 70 CGA267356 80 CGA270293 68 CGA270294 40 CGA281836 76 1=感染させてない対照を100%の生物的防除とし,
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
【0151】 表2 棉植物中のピシウム アルチマム(Pythium ultimum) に対するスクリーニング で使用される菌株の生物的防除活性(%) 菌株 生物的防除活性の平均% 1 CGA266446 56 CGA266447 30 CGA267356 44 CGA270293 33 CGA270294 34 CGA281836 39 1=感染させてない対照を100%の生物的防除とし,
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
【0152】 表3 トマト植物中のリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)に対するスクリー ニングで使用される菌株の生物的防除活性(%) 立ち木(15DAPa ) 繰り返し 平均値 生物的防除活性処理 1回目 2回目 3回目 4回目 (%)1 NP.NTb 9 10 5 10 8.500 100 P.NTc 5 4 6 6 5.255 0 テラクロール 10 10 9 10 9.755 138 CGA 266446 9 9 10 9 9.255 123 CGA 266447 7 5 6 10 7.000 54 CGA 267356 9 10 10 9 9.500 131 CGA 270294 7 6 6 7 6.755 46 a=播種後日数 b=無病原体,無処理(無感染対照)。 c=病原体,無処理(感染対照)。 1=感染させてない対照を100%の生物的防除とし,
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
【0153】 表4 キュウリ植物中のリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)に対するスクリ ーニングで使用される菌株の生物的防除活性(%) 立ち木(12DAPa ) 繰り返し 平均値 生物的防除活性処理 1回目 2回目 3回目 (%)1 NP.NTb 12 11 12 11.67 100 P.NTc 7 10 9 8.67 0 CGA 266447 9 9 9 9.00 10 CGA 267356 10 11 11 10.67 67 CGA 270293 9 11 11 10.33 53 a=播種後日数 b=無病原体,無処理(無感染対照)。 c=病原体,無処理(感染対照)。 1=感染させてない対照を100%の生物的防除とし,
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
感染させた対照を0%の生物的防除とする。
【0154】ブダペスト条約に従うATCC(American
Type Culture Collection)への寄託 クローンpANT5は,ATCCに1990年8月17
日に寄託され,ATCC受託番号40868と命名され
ている。pANT5の11kb(の)E11を含有する
プラスミドは,同日に寄託され,ATCC受託番号40
869と命名されている。
Type Culture Collection)への寄託 クローンpANT5は,ATCCに1990年8月17
日に寄託され,ATCC受託番号40868と命名され
ている。pANT5の11kb(の)E11を含有する
プラスミドは,同日に寄託され,ATCC受託番号40
869と命名されている。
【0155】下記のシュードモナス フルオレッセンス
(Pseudomonas fluorescens) 菌株は,ブタぺスト条約に
従って,出願人により1991年4月24日にメリーラ
ンド20852,ロックヴィレ,パークローンドライブ
12301(12301 Parklawn Drive, Rockville,Md.2
0852) のATCCに寄託されている: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168) 。
(Pseudomonas fluorescens) 菌株は,ブタぺスト条約に
従って,出願人により1991年4月24日にメリーラ
ンド20852,ロックヴィレ,パークローンドライブ
12301(12301 Parklawn Drive, Rockville,Md.2
0852) のATCCに寄託されている: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168) 。
【図1】この図は,三つのコスミドクローン,pANT
5,pANT9およびpANT10の制限酵素地図を示
し,これらは突然変異体2−1のANT- 表現型を補足
することが見出されている。
5,pANT9およびpANT10の制限酵素地図を示
し,これらは突然変異体2−1のANT- 表現型を補足
することが見出されている。
この図では,「B」はBamHIの切断部位を;「E」
はEcoRIの切断部位を;そして「H」はHindII
I の切断部位を示している。
はEcoRIの切断部位を;そして「H」はHindII
I の切断部位を示している。
【図2】この図は,突然変異体2−1のANT- 表現型
と野生型菌株の914と922を補足するためのシュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) 菌株915のpANT5から誘導したサブ断片の能
力を示している。
と野生型菌株の914と922を補足するためのシュー
ドモナス フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescen
s) 菌株915のpANT5から誘導したサブ断片の能
力を示している。
3と標識したサブ断片は,E11断片と命名することに
した約11kbの領域である。「+」は抗生物質の生産
を示す。「−」は抗生物質を生産しないことを示す。
「ND」は,未定である。
した約11kbの領域である。「+」は抗生物質の生産
を示す。「−」は抗生物質を生産しないことを示す。
「ND」は,未定である。
【図3】この図は,抗生物質遺伝子領域のE11断片中
へのTn5トランスポゾン挿入の結果を示している。
へのTn5トランスポゾン挿入の結果を示している。
各々のTn5挿入は垂直線として遺伝子地図上のその大
体の位置に示してある。各々の挿入上の数字は挿入の同
定番号を示している。各々の挿入の抗生物質の生産への
影響は,試験した場合には,遺伝子地図の上に示してあ
る。「−」は抗生物質を生産しないことを示し,「+」
は抗生物質を生産することを示し,「±」は不定の結果
を示している。
体の位置に示してある。各々の挿入上の数字は挿入の同
定番号を示している。各々の挿入の抗生物質の生産への
影響は,試験した場合には,遺伝子地図の上に示してあ
る。「−」は抗生物質を生産しないことを示し,「+」
は抗生物質を生産することを示し,「±」は不定の結果
を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/52 //(C12N 1/20 C12R 1:39) (71)出願人 591201756 ユー.エス.デパートメント オブ アグ リカルチャーアグリカルチュラル リサー チ サービス U.S.DEPARTMENT OF A GRICULTURE AGRICULT URAL RESEARCH SERVI CE アメリカ合衆国,20250 ワシントン デ ィー.シー.(番地表示なし) (72)発明者 ジェイムズ エム. リゴン アメリカ合衆国,エヌシー 27513,カリ ー,マークェッテ ドライブ 120 (72)発明者 ドワイト スチーブン ヒル アメリカ合衆国,エヌシー 27511,カリ ー,メラニー レイン 311 (72)発明者 ジェフリー アイ. スタイン アメリカ合衆国,エヌシー 27278,ヒル スボロー,サリー トレイル 3725 (72)発明者 チャールズ アール. ホウェル アメリカ合衆国,ティーエックス 77802, ブラゾス,ブライアン,アヴォンデイル 805 (72)発明者 イォット.オレ ベッカー ドイツ連邦共和国,7854 インツリンゲ ン,イン デア アウ 1アー (72)発明者 ステフェン ティー. ラム アメリカ合衆国,エヌシー 27613,ラレ イ,ジーニュー コート 8900
Claims (18)
- 【請求項1】下記のシュードモナス フルオレッセンス
(Pseudomonas fluorescens) 菌株: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168); の一つから得られるまたは一つから選択された精製生物
的防除剤の殺真菌的に有効な量を含有する, 真菌病原体
に対して有効な精製生物的防除剤。 - 【請求項2】真菌病原体がリゾクトニア ソラニ(Rhizo
ctonia solani)およびピシウム アルチマム(Pythium u
ltimum) から成る群から選択されている請求項1記載の
真菌病原体に対して有効な精製生物的防除剤。 - 【請求項3】農業的に受容できる担体と共に,病害を生
物的に防除するシュードモナス フルオレッセンス(Pse
udomonas fluorescens) 菌株の一種またはそれ以上また
は該菌株から得られる生物的防除剤並びにアシルアラニ
ン系殺真菌剤の一種またはそれ以上を含有する殺真菌組
成物。 - 【請求項4】シュードモナス フルオレッセンス(Pseud
omonas fluorescens) 菌株が,シュードモナス フルオ
レッセンス(Pseudomonas fluorescens) 菌株: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168); から成る群から選択されている請求項3記載の組成物。 - 【請求項5】アシルアラニン系殺真菌剤がメタラキシル
(metalaxyl) ,フララキシル(furalaxyl) ,オキサジキ
シル(oxadixyl),ベナラキシル(benalaxyl)およびオフ
レイス(ofrace)から成る群から選択されている請求項3
または4のいずれか一つに記載に組成物。 - 【請求項6】生物的防除剤が請求項1または請求項2の
それである請求項3ないし5のいずれか一つに記載の組
成物。 - 【請求項7】植物病原性の真菌を防除すべき環境内に,
請求項1ないし2のいずれか一つの生物的防除剤の殺真
菌的に有効な量を,または請求項3ないし6のいずれか
一つの殺真菌剤組成物の殺真菌的に有効な量を導入する
ことを包含する植物病原性真菌の防除方法。 - 【請求項8】抗生物質を生産するのち充分な条件下で請
求項1の精製した生物的防除剤を培養し;そしてその抗
生物質を通常の手段により抽出することを包含する,真
菌病原体の成長を効果的に阻害する抗生物質を取得する
方法。 - 【請求項9】抗生物質の合成のために必要な一種または
それ以上の酵素をコードしている組換えDNA配列であ
って,該抗生物質が真菌であるリゾクトニアソラニ(Rhi
zoctonia solani)の成長を阻害する配列。 - 【請求項10】該DNA配列がクローンpANT5から
取得できる請求項9記載の組換えDNA配列。 - 【請求項11】該DNA配列が約11kbE11断片を
包含する請求項10記載の組換えDNA配列。 - 【請求項12】請求項9ないし11のいずれか一つの中
で請求したのと同じDNA配列から成る群から選択され
た組換えDNA配列を包含する生物的防除剤。 - 【請求項13】生物防除剤が細菌株である請求項12記
載の生物的防除剤。 - 【請求項14】細菌株がシュードモナド(Pseudomonad)
である請求項13記載の生物的防除剤。 - 【請求項15】細菌株がシュードモナス フルオレッセ
ンス(Pseudomonas fluorescens) 属からである請求項1
4記載の生物的防除剤。 - 【請求項16】a)形質転換した生物的防除剤を形成す
るために生物的防除剤のゲノム内に請求項9ないし11
のいずれか一つに記載の組換えDNA配列を導入し; b)真菌であるリゾクトニア ソラニ(Rhizoctonia sol
ani)を阻害すべき環境内に形質転換した生物的防除剤を
施用することを包含する,真菌であるリゾクトニア ソ
ラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害する方法。 - 【請求項17】a)形質転換した生物的防除剤を形成す
るために生物的防除剤のゲノム内に請求項9ないし11
のいずれか一つに記載の組換えDNA配列を導入し; b)その形質転換した生物的防除剤に抗生物質を生産さ
せ;そして c)通常の手段により形質転換した生物的防除剤からそ
の抗生物質を抽出することを包含する,真菌であるリゾ
クトニア ソラニ(Rhizoctonia solani)の成長を阻害す
るのに有効である抗生物質を取得するための方法。 - 【請求項18】菌株: CGA 266446(ATCC 受託番号No. 55171); CGA 266447(ATCC 受託番号No. 55170); CGA 267356(ATCC 受託番号No. 55169); CGA 270293(ATCC 受託番号No. 55175); CGA 270294(ATCC 受託番号No. 55174); および CGA 281836(ATCC 受託番号No. 55168); から成る群から選択されたシュードモナス フルオレッ
センス(Pseudomonas fluorescens) 。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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