JPH068817B2 - 白血球弁別用組成物および弁別方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液学の分野に関し、さらに詳しくは白血球の
サブクラスの弁別に関する。

人の白血球はリンパ球、単球および多形核細胞（ＰＭ
Ｎ）に分類される。ＰＭＮはその細胞質顆粒の染色特性
によつて好中球、好酸球または好塩基球のサブクラスに
分類される。

白血球の弁別は通常種々の染色法によつて行なわれてき
た。数種のフタロシアニン化合物をこのような用途に使
用することが知られている。これらのうち最初に発見さ
れたものはアルシアンブルーと呼ばれる。アルシアンブ
ルーは好塩基球の弁別的染色に使用されてきた。銅フタ
ロシアニンカチオン染料は、ポリヌクレオチド例えばＤ
ＮＡおよびＲＮＡを有する他の細胞をも染色するため、
単独で使用の場合好塩基球を選択的に染色し得る程十分
には特異的でない。しかも、好塩基球が染色されるの
は、その中に硫酸化された多糖であるヘパリンが存在す
るという独特の性質のためである。所望の選択性を確保
する一つの方法は、ポリヌクレオチドのリン酸基を遮蔽
してフタロシアニン陰イオンとの結合を防止する塩化ラ
ンタンをこれと組合わせることである。

アルシアンブルーを使用するには精密に調節された高い
酸性pHが必要であり、またこのものは熱に不安定であ
る。アルカリ性のpHで加熱されるとアルシアンブルーは
粒状物（不溶性染料）を生ずる。この沈殿する傾向はア
ルシアンブルー含有試薬において永い間問題となつてき
た。自動分析機器にはこれらの沈殿を集める部品例えば
過器が含まれている。これは測定の信頼性を損うばか
りでなくこの方法を使用する分析機器の運転にまで支障
を来たす恐れがある。それにもかゝわらずこの染料はそ
の特異性とはつきりした色とから優れた染料と考えられ
てきた。アルシアンブルーに関するさらに詳しい予備知
識については、Gilbertらの「アルシアンブルーを使用
する新染色法による好塩基球計数」、〔Blood、46：279
−286（1975）〕を参照のこと。

以後その他のフタロシアニン染料も開発された。例えば
Bloomら〔Histochemie，2：48-57(1960)〕は誘導体化さ
れていないアストラブルー（遊離塩基）を使用してムコ
多糖を含有する生物学的組織特に肥満細胞を染色するこ
とを報告している。アストラブルー遊離塩基は、これに
正の電荷を与える０．５NHCl中で使用される。この低い
pHによつて選択性が得られるのは、pH０．３でイオン化
される硫酸誘導体、例えばヘパリンの固有の強さのため
で、これは低pHでイオン化されないリン酸誘導体例えば
ＤＮＡが弱いのと対照的である。

稲垣〔Acta Hematologica Japonica，32(4)：642−647
（1969）〕は、０．５ＭNaClを含有するメタノール中の
アクリジンオレンジの固定液とアストラブルー遊離塩基
とを使用する好塩基球および肥満細胞顆粒の染色方法を
報告している。稲垣はセチルピリジニウムクロリドの無
水メタノール飽和溶液とアクリジンの無水メタノール飽
和溶液とによる末梢血液および骨髄塗抹標本の固定を検
討した。セチルピリジニウムクロリドは好基球顆粒およ
び肥満細胞顆粒を確実に保存したアストラブルー染色は
妨害される傾向があった。アクリジンは上記の操作にお
いてこれらの細胞顆粒を十分に保存し得なかった。

総括すれば、アルシアンブルーとアストラブル−遊離塩
基およびその第四球誘導体が好塩基球をそれ以外の白血
球から弁別することが知られているこの種の唯一の化合
物群であつた。アルシアンブルー試薬の不安定性は永い
間の問題であつた。従つてこの分野の研究者は、好塩基
球のみをそれ以外の白血球と区別して選択的に染色する
化合の探索を続けてきた。さらに、染料の染着度は個々
の使用者は染色技術によつて異なる。

細胞の成熟は連続的な過程であるので、その過程におけ
る逐次段階を弁別するのは困難である。しかし、ライト
（Wright）またはジームザ(Ciemsa)の染色法によつて染
色された全血塗抹標本においては個別の段階を認識する
ことができる。この分類は各細胞の細胞質的および核的
特性と顆粒の存在、その性質および数に基いている。白
血球のこれらの分類およびその弁別の技術は公知であ
る。例えばAnsleyら米国特許第3,741,875号参照。しか
し、染色された無傷の細胞の細胞質的および核的知見に
基いての分類は試験担当者の主観的判定に著しく左右さ
れる。

Kimの米国特許第4,099,917号には未染色白血球の種類を
その細胞の大きさおよび顆粒的特性によつて識別するた
めの血液試料の調製法が開示されている。血液試料を、
赤血球は溶解するが白血球は溶解しない界面活性剤で処
理し、固定剤を加え、この液をインキユベートする。得
られた細胞懸濁液により、低角および高角光散乱特性を
有する光学系を使用して未染料の固定された無傷の白血
球を弁別することができると云われる。しかしこれには
大型複雑な測定器が必要であり、従つて視覚観察では実
施できない。

Ledisらの米国特許第4,286,963号には、赤血球を溶解し
て白血球のリンパ性および骨髄性集団の識別を可能とす
るための、(a)少くとも一種の長鎖アルキルトリメチル
第四球アンモニウム塩、例えばヘキサデシルトリメチル
アンモニウムブロミドと(b)(i)フエニル基またはフエノ
キシ基で置換された短鎖アルカノール例えば２−フエノ
キシエタノールおよび(ii)ポリヒドロキシ化合物例えば
ソルビトールから選ばれる少くとも一種の添加剤とから
成る組成物が開示されている。

以上の通り、この弁別のための公知の技術の多くは染色
試験の調製および使用を必要とするものであつたり、赤
血球の溶解のみの手段を与えるものである。またあるも
のは複雑な機器が必要である。またさもなければ、全血
球の識別で報告される結果は、染色されたものにせよさ
れてないものにせよ、主観的な判定に著しく左右され
る。同じ処理血液試料において染色を行わずに、孔塩基
球の正確な数と葉状性指数とを同時に測定し得る確実な
方法についての文献記載は全くない。

Gronerら〔Blood Cells，6：141-157(1980)〕は光学的
散乱、染色性その他の技術を使用する白血球サブクラス
の識利について論じている、好中球集団における、より
未熟なすなわちより葉状化されていない形態の方向への
傾向を「レフトシフト（left Shift）と呼んでこれにつ
いて論じている。全血試料の強力な陽イオン界面活性剤
とマレイン酸とで処理すると核の境界において屈折率の
著しい変化が生じた。その結果、赤血球は溶解され、白
血球の細胞質の大部分は浸出され、核は若干収縮した。
この文献の論議からすると、白血球の細胞膜は（赤血球
について述べたようには）破壊ないし溶解されず、白血
球細胞質は大部分は取除かれるが完全には除かれずに、
核の外形をゆがませる人為構造を残すと思われ、さらに
この処理の影響が白血球のあるサブクラスとその他のサ
ブクラスとの間で差異があるか否かについては全く述べ
られていない。

従前技術による方法とは対照的に本発明によれば、ＰＭ
Ｎのあるサブクラスの細胞質は取除くが他のサブクラス
のものは除かないということに基いてＰＭＮのサブクラ
スを弁別し、核の形態（葉状性）を正確に特性づけるこ
とが可能となる。本発明の組成物は白血球中のある分類
のもののみの細胞質を選択的に除く。さらに詳しくは云
えば、本組成物はリンパ球、単球、好酸球および好中球
から細胞質を除去するが、孔塩基球からは除去しない。
従つて、好塩基球はその顆粒および細胞質膜を保持する
ことにより他のＰＭＮサブクラスから弁別される。さら
に、有核の赤血球が検出されるので、本発明によりその
定量も可能となる。

細胞質人為構造が孔塩基球以外のすべての血球の核に附
着して核の外形を変化させることにより誤差を生ずると
いう危険は、本発明の組成物によつて細胞質をそれらの
核か完全にはぎ取ることにより防止することができる。
従つて、芽細胞、有核赤血球と種々の成熟段階の好中球
とをそれらの核の形態学に基いて確実に弁別することが
できる。重要な利点として、本発明の組成物および方法
は、染料調製の必要が全くなく、また従つて染色技術に
よる不確実性を避け得ることが挙げられる。本組成物は
手動的測定にも機器による測定にも使用し得る。

試料中の白血球弁別用の本発明の組成物は、白血球の選
ばれたサブクラスからのみ細胞膜および細胞質を取除く
のに有効な少くとも一種の希薄酸および少くとも一種の
水溶性界面活性剤を含有してなり、かつpHが約１．８な
いし約２．３である。界面活性剤の例としては、ポリア
ルキレングリコールのＣ_６−６₁₆脂肪族アルコールエー
テル、Ｃ_６−６₁₆アルキル基を有する第四球アンモニウ
ム化合物、またはアルキルベンゼンスルホネートを挙げ
ることができる。酸は好ましくは、スルホン酸、カルボ
ン酸または塩酸である。

本発明はさらに、白血球のサブクラスの弁別方法を提供
するものである。血液試料を処理して、選択されたサブ
クラスの白血球から細胞膜および細胞質を除いた後、核
の形態に基いてサブクラスの弁別を行なう。さらに詳し
くいえば、白血球のうち好塩基球以外のすべてのサブク
ラスのものから細胞膜および細胞質を完全に取除く。

以下の記述において特定の態様について使用する特定の
用語は、特記しない限り他のすべての態様にも適用され
るものである。

先に記した通り、本発明の組成物は白血球のある分類の
もの、細胞質のみを選択的に除く。リンパ球、単球、好
酸球および好中球は細胞質をはぎ取られる。すなわち、
それらの細胞膜および細胞質はその核から完全に除か
れ、核は影響を受けずにそのまゝ、かつ随伴細胞質の無
い状態であとに残る。従つてその核の形態をはつきりと
識別できる。以上の細胞質除去と対照的に、好塩基球は
その顆粒および細胞質膜を保持する。

本発明の新規組成物は種々の型の血球の手動および流動
血球計数系による検出に適用し得る。こゝに開示した組
成物は水溶性界面活性剤と希酸とを含有して成り、pH範
囲は約１．８ないし約２．３である。この組成物はまた
必要に応じ酸化防止剤を含有することができる。検定実
施のためには界面活性剤成分と希酸成分とが存在しなけ
ればならず、どちらの成分を欠いても有効な組成物は得
られない。連鎖停止性酸化防止剤は界面活性剤の自動酸
化的分解を防止し、それによる細胞質除去機能の低下を
防ぐ。酸化防止剤が存在しない場合は本組成物の25℃に
おける貯蔵可能期間は２ケ月であるが、酸化防止剤が存
在する25℃で少くとも１年となる。酸化防止剤は本組成
物の正常な作用を妨害しない。

水溶性界面活性剤としては血球に対する下記の所要の作
用を与える任意の界面活性剤であつてよい：すなわち赤
血球と血小板との完全な溶解、好中球、好酸球、リンパ
球および単球の細胞質および細胞質膜の除去、および好
塩基球の顆粒と細胞膜との保持である。例として、(i)
ポリアルキレングリコール好ましくはポリオキシエチレ
ンまたはポリオキシプロピレングリコールのＣ_６−Ｃ₁₆
脂肪族アルコールエーテル、例えばブリツジ（Brij）−
３５（ICIアメリカ社、ウイルミントン、デラウエア州
の製品であるポリオキシエチレンエーテルの商標）、(i
i)Ｃ_６−Ｃ₁₆脂肪族N,N−ジアルキルＮ−オキシド、例
えばドデシル−N,N−ジメチルアミンＮ−オキンド、(ii
i)Ｃ_６−Ｃ₁₆脂肪族アンモニウム塩、例えばテトラデシ
ルアンモニウムブロミド、(iv)Ｃ_６−Ｃ₁₆アルキル基を
有する第四球アンモニウム化合物、例えばセチルトリメ
チルアンモニウムブロミドまたはセチルピリジニウムク
ロリド、(v)アルキルベンゼンスルホネート、例えばド
テシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、および(vi)これ
らの混合物が挙げられる。

本発明には、さらに少くとも一種の希酸の存在が必要で
ある。希酸の例としては、(i)有機スルホン酸例えばメ
タンスルホン酸またはエタンスルホン酸、(ii)カルボン
酸例えばマレイン酸、フタル酸、シユウ酸、マロン酸、
グリシン、ジクロロ酢酸および乳酸、および(iii)これ
らの混合物が挙げられる。少くとも一種の希薄無機酸を
使用することも有利である。例として塩酸、臭化水素
酸、硫酸およびリン酸が挙げられる。本発明の目的に対
しては「希薄」とは約30mM以下の濃度を指す。特に有用
なのは鉱酸とカルボン酸との組合せ例えばフタル酸−HC
lである。

本試薬組成物は試料と接触してその分析に使用される場
合のpHが約１．８ないし約２．３の範囲内にある必要が
ある。このpH範囲は狭いが本発明の一つの重要な面であ
る。このpHは希薄酸の存在のみによつて確保すること
も、追加の酸を加えてこのpHを得ることもできる。

本組成物はまた必要に応じ、界面活性剤の自動酸化によ
る分解を遅延させて貯蔵寿命を増大させる連鎖停止性酸
化防止剤を含有し得る。酸化防止剤は、防止剤がない場
合に連鎖反応に関与するであろう過酸化ラジカルを破壊
する。例としてジ第三級ブチル−４−メチルフエノール
（BHT）、ｐ−メトキシフエノール（MEHQ）またはジ第
三級ブチル−４−メトキシフエノール（BHA）が挙げら
れる。

本組成物はまた、必要に応じ、混入生物例えばかびの生
長を遅らせまたは防止する抗微生物防腐剤を含有するこ
とができる。

本発明の好ましい態様においては、使用する成分の割合
は次の範囲である： a) 界面活性剤 10−20g/ b) 希薄酸 ０．０２０−０．０２４M/ c) 連鎖停止性酸化防止剤 ０．１−０．２g/ d) 抗微生物防腐剤 ０．２−０．６g/ 本方法が手動式、自動式のいずれにも最適化し得るよう
に、反応速度を調節し得ることが望ましい。この点に関
し、ブリツジ−35、マレイン酸およびBHTを含有して成
る組成物は特に興味がある。マレイン酸は０．０２５％
−１％（０．００２２−０．０８６Ｍ）の濃度にわたつ
て使用することができる。マレイン酸濃度を変化さるこ
とにより速度を約10倍も増加させることができる。

マレイン酸の低い範囲の濃度は手動式顕微鏡的作業に特
に有用である。反応速度は操作を２分以内に完了し得る
程度に十分に緩徐である。これに対し濃度範囲のうち高
い方の端においては反応は本質的に瞬間的で、自動式機
器測定法に適当である。

本発明の方法を実施する場合、全血試料を界面活性剤お
よび希薄酸の溶液と混合すると、先ずあとに赤血球の構
造を全く残さない赤血球溶解から始まり、次にやはりあ
とに構造を残さない血小板溶解、さらに、好塩基球以外
のすべての白血球の裸の核を残し好塩基球のみが処理後
の血液試料中唯一の観察可能な完全細胞として実質的に
無傷で残る白血球細胞質除去といつた一連の細胞膜およ
び細胞破壊が生ずる。白血球の核と、細胞質膜および顆
粒性を保持する好塩基球とは、視覚的観察または機器検
出系によつて弁別することができる。

流動式血球計数計中の導管ないし分析流路内を流れてい
る流体流中に細胞試料を導入することが好ましい。これ
は好ましくは、導管ないし分析流路内に鞘液の流れをつ
くり、次で試料を流れている鞘流中に導入することによ
つて行われる。この鞘流は通常、細胞試料懸濁媒体と実
質的に同じ屈折率を持つ流体からなる。鞘流キヤリヤー
流体を使用するこの種流動式血球計数計の一つがテクニ
コン（Technicon）ヘマログ（Hemalog）ＤおよびH-6000
系に使用されており、この系はあらゆる日常的な血液学
的試験を行うことができる。ヘマログＤおよびＨ6000系
の詳細な情報はテクニコンインスツルメント社（タリタ
ウン、ニユーヨーク州）から入手することができる。

以下の実施例は本発明を完成するに当つて実施した実験
を記述するものである。総括すればこれら実施例の結果
は本発明の組成物および方法によつて(a)好塩基球を正
確に計数すること、(b)与えられた任意の試料に存在す
るレフトシフトの程度および平均ローブ（葉状体）計数
または量の指標を与えること、(c)芽細胞の他の単核細
胞と正確に弁別すること、(d)有核赤血球を定量、同定
すること、および(e)全白血球の計数を得ることが可能
であることを実証している。可能な場合は常に標準の市
販試薬球薬品を使用した。

例 １ 白血球の手動式弁別的計数 白血球(WBC)の弁別的計数は種々の病態、特に感染性ま
たは免疫的疾患関係の病態の弁別的診断における最も重
要な識別パラメータである。本実施例に報告の実験にお
いては、好塩基球をそれ以外のすべての血球と、また単
核白血球を多形核白血球と弁別するために本発明組成物
を調製し使用した。

本発明の組成物は蒸留水97ml中にマレイン酸０．２０
ｇ、ブリッジ−35 ３ml（蒸留水中30％w/v（重量／容
積）としたもの）を加えて調製した。

新鮮なヒト全血試料８．０μを上記の通り調製した組
成物500μと混合した。１分後反応した全血試料のア
リコートをピペツトで清浄な顕微鏡スライドガラス上に
とり、ニコン顕微鏡で40倍で観察した。

このアリコートを顕微鏡で調べたところ、赤血球および
血小板は破壊され、好塩基球以外の白血球は完全に細胞
質を除かれていることが認められた。好塩基性ＰＭＮの
細胞質膜および顆粒は影響を受けずそのまゝであつた。

またマレイン酸を含まぬ以外は上記と同様な組成物も調
製した。この組成物を上記と同様に血液試料の試験に使
用したが血液成分の溶解は認められなかつた。さらに、
マレイン酸を含有するが界面活性剤のブリツジ−35を省
いた組成物も調製した。細胞凝集が生ずることが認めら
れ、これは好塩基球の認識および白血球の葉状性の認識
を不明瞭にする。すなわちどちらの組成物も、本発明の
組成物で行い得るように弁別を可能とする力が無かつ
た。

例 ２ 白血球の自動式弁別的計数 本実施例に報告する実験は本発明の組成物を使用する好
塩基球の正確な計数を示すものである。好塩基球、単核
細胞（未成熟顆粒球、リンパ球および単求）およびＰＭ
Ｎ（好中球および好酸球）を測定した。これらを、H-60
00測定機器系（テクニコン、上出）において使用される
既存技術による同じ測定と比較した。未成熟顆粒球の存
在の測定を例示する。また本発明の組成物を使用してレ
フトシフト、例えば平均中球葉状体計数の減少を測定し
た。

本発明に従つて、フタル酸３．６ｇ、ブリツジ−35 10
ｇ、BHT０．１ｇ、１ＮHCl１．０mlを蒸留水（pH２．
０）で１として試薬組成物を調製した。

多勢の患者集団のそれぞれからの血液試料をそれぞれ同
一試験法によつて調べた。各血液試料８μを別々の試
験管に上記試薬組成物500μと共に加えた。混合50秒
後、反応混合物を蠕動ポンプによつて鞘流流動セル中を
流速０．１ml／分で通過させた。

細胞ごとの光散乱信号の二次元分布を得るのに使用した
光学系はテクニコンＨ−6000流動式血球計数系（テクニ
コン、上出）の改造RBC/PLTチヤンネルである。この系
で得られる出力の横軸に沿つて高角散乱を、縦軸に沿つ
て低角散乱を測定した。血球の種々の型を識別するため
にクラスタ−分析（cluster analysis）を使用してコン
ピユーターにより分界闘直線を設定し、細胞残片等によ
る信号はすべて無視するように系をプログラムした。使
用した光学系の完全な記述はテクニコン社（上出）から
入手し得る。光学系からの出力信号は増幅し二次元分布
図に変換した。各点は単一の細胞についての測定座標軸
を表わす。

患者の集団からとつた各試料は本発明に従つて前記の組
成物および操作を使用して分析した。第１Ａ図から第１
Ｅ図までは、正常な試料提供者からのかゝる試料の一つ
に対し上記分析操作によつて得た、反応開始から種々の
時間後における反応段階を示す。第１Ａ図（15秒）は破
壊されたRBCおよびPLT(R)ならびに膨潤王したWBC（Ｗ）
を示す。第１Ｂ図（20〜25秒）は、細胞質を失い始めＹ
軸に沿つて原点方向へ動き始めたリンパ球(Ｌ)を示す。
第１Ｃ図（30〜35秒）においては顆粒球（Ｇ）のあるも
のは細胞質を失い始め、すべてのリンパ球（Ｌ）は完全
に細胞質を除かれている。第１Ｄ図（40−45秒）におい
ては顆粒球（Ｇ）の大部分とリンパ球全部が完全に細胞
質を除去され、従つてその最終的のＸ−Ｙ位置に移動し
てしまつている。少数のWBC（Ｗ）は、大部分は単球で
あるが、無傷で残つている。第１Ｅ図（80秒）は好基球
以外のすべての白血球が細胞質を取除かれて裸の核のみ
を残し、その最終的なＸ−Ｙ位置にあることを示す。PM
N（Ｐ）、単核細胞（MN）、好塩基(Ｂ)および細胞残片
(Ｒ)の明瞭な集団が示されている。

患者の集団から採取した試料はまた、通常の市販テクニ
コンＨ−6000系を使用しメーカーの取扱い説明書に従つ
て試験した。好塩基球、単核細胞（MN）、およびPMN集
団のそれぞれについて結果の相関をそれぞれ第２〜第４
図に示す。

第２図は正常および異常の98試料からのデータについて
のRumpkeの卵形を示し、好塩基球の百分率について本発
明の方法とテクニコンＨ−6000好塩基球測定法とを比較
するものである。本図は両結果が極めてよく一致するこ
と、また95％以上の点が卵形内に来ることを示してい
る。相関係数は０．８１であつた。

第３図は本発明の分析法を使用した場合の単核細胞（M
N）と、テクニコンＨ−6000ペルオキシダー法を使用し
た場合の単核細胞〔リンパ球（Ｌ）、単球（Ｍ）および
大型非染色細胞（LUC）を含む〕とに対する優れた精度
と相関性とを示す。本発明の方法が正常試料について如
何によく一致するかを示すために試料数を減らして異常
な（白血病性）試料を除いた。相関数系は０．９６であ
つた。

第４図は同一試料のＰＭＮについて本発明の方法（Ｐ）
と、ＰＭＮを好中球（Ｎ）および好酸球（Ｅ）として報
告するＨ−6000系による方法とを使用したときの優れた
精度と相関性とを示すものである。相関係数は０．９７
であつた。

第５Ａ図、および第５Ｂ図は本発明の方法と従来のＨ−
6000系ペルオキシダーゼ法をそれぞれ使用した。未成熟
顆粒球を含有することが既知の異常試料の二次分布図で
ある。第５Ａ図においては、ペルオキシダーゼ法による
リンパ球、単球プラス大型非染色細胞から予想されるよ
りもより密集した単核細胞集団が認められる。上記二つ
の方法のそれぞれを使用して得られる各細胞型の百分比
および手動式に観測して得られるその値を第１表に示
す。

本発明の方法とＨ−6000法とで得られる単核細胞数のか
なり大きな差は、手動式法で観測される未成熟顆粒球の
数に対応している。従つて、相当数の未成熟顆粒球を含
有する試料を正常試料から識別することができる。

本発明の方法が好中球の核のみを温存することにより今
一つの利点は、レフトシフト（すなわち、より多数の帯
状核細胞数が存在することによる平均好中球ローブ計数
の減少）の存在を指示し得ることである。これは平均ロ
ーブ計数の減少に伴つてＰＭＮ集団(P)の最頻値が減少
する事実によつて実証される。第６図〜第６Ｃ図は帯状
核細胞計数が順次増加し平均ローブ計数が順次減少する
３種の試料についてのH-6000法の結果を示す。この３試
料にはどの試料がレフトシフトを有するかを示唆するよ
うな弁別的特徴は存在しないことがわかる。第６Ｄ図〜
第６Ｆ図は同じ試料につき本発明の方法を使用した場合
の結果を示す。平均ローブ計数が減少するにつれて、PM
N集団(Ｐ)の最頻値が対応して減少することがわかる。P
MN集団最頻値のこの左方への移動から、本発明の方法で
はレフトシフトの存在を予測することができる。第２表
はこれら試料に対する手動式の帯状核細胞計数および手
動式の平均好中球ローブ計数とPMN集団(Ｐ)最頻値とを
帯状核細胞０〜20、平均ローブ計数３．３８〜２．３１
の範囲で対比して示すものある。

例 ３ 本例に報告する実験は、芽細胞を他の単核細胞から弁別
するために例２に記したのと同じ本発明の組成物および
分析方法を使用する例を示すものである。Ｈ−6000系ペ
ルオキシダーゼ法を使用して観測される大型非染色細胞
のうち相当の部分は異常単核細胞の存在に帰せられてい
た。かゝる方法ではこれらの細胞が芽細胞であるか非定
型リンパ球であるかを同定することはでなかった。

全血試料を急性骨髄芽球性白血病の供血者（試料Ａ）、
正常供血者（試料Ｂ）および慣性リンパ球性白血病の供
血者（試料Ｃ）から得た。本発明の組成物を使用してそ
れぞれの試料を分析した場合の細胞集団のパタンをそれ
ぞれ第７Ａ図〜第７Ｃ図に示す。

上記と同じ３種の試料のそれぞれから別のアリコートを
とつてペルオキシダーゼ活性用に染色し、Ｈ-6000系に
より通常のペルオキシダーゼ試薬およびチヤンネルを使
用して分析した。得られた結果は第７Ｄ図〜第７Ｆ図に
それぞれ示す。

第７Ａ図および第７Ｃ図には共に、大型非染色細胞（LU
C）のかなりの集団がみられる。これらはそれ自体、異
常単核細胞の存在を示し、正常な集団分布を示す第７Ｂ
図と弁別することができる。しかし第７Ａ図、第７Ｃ図
は実質的に外見が同一で、従つてこのＬＵＣ集団の増加
が急性芽球性白血病を示す芽球細胞の増加によるものか
慢性リンパ球性白血病を示す非定型リンパ球によるもの
かを決定する手段となり得ない。

第７Ｄ図と第７Ｆ図とでは、単核（MN）集団が現れる位
置がＸ軸上で相当異なつている。原点方向に左側に移動
している第７Ｄ図のＭＮ集団は芽球細胞を含んでいる。
これに対し、第７Ｆ図のＭＮ集団は正常供血者からの試
料である第７Ｅ図のＭＮ集団と同じ位置に留つている。
一定の垂直な芽球閾値線（BT）を設けることによつてそ
の正確な割合を求めることができる。

手動式方法および本発明の方法を使用した観測した芽球
細胞の百分率、およびＨ-6000分析法を使用した大型非
染色細胞の百分率を第３表に示す。

以上の通り、本発明の組成物を使用することにより芽球
細胞と非定型リンパ球との識別が可能となつたことが実
証された。これは重要な意義のある白血病の異る種類を
識別するための方法を提供するものである。

例 ４ 本実施例に報告の実験には例２に記したと同様の組成物
および分析方法を使用した。有核赤血球（NRBC）の定量
的測定のためには、循環血液中の未成熟有核赤血球の存
在は重大な異常所見であるが従来これは機器分析によつ
ては測定できなかつた。

有核赤血球を含有する全血試料を本発明の組成物と混合
し分析した。結果を第８Ａ図に示す。細胞の密集集団が
ＰＭＮ流域（P）に現れている。同じ試料の別のアリコ
ートをペルオキシダーゼ活性用に染色し、Ｈ-6000系に
より通常のペルオキシダーゼ試薬およびチヤンネルを使
用して分析した。結果は第８Ａ図に示す通りである。好
中球(Ｎ)および好酸球(Ｅ)が通常現れる領域に、まばら
に細胞が現れたのみである。

すなわち、従来のペルオキシダーゼ法ではPMNはほとん
ど検出されないのに対し、本発明の方法ではかなりのPM
N集団が検出され、これは視覚検査による確認により有
核赤血球であることが判明した。これは従来のＨ−6000
系測定法を使用したPMN計数と本発明の方法を使用したP
MN計数との間のラムダ（0.001cm³）当り細胞絶対数の相
違であることがわかつた。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図〜第１Ｅ図は本発明の組成物を使用し流動式血
球計数計で血球懸濁を分析した場合の個々の白血球の分
散パタンの二次元分布図である。各白血球は黒点で示さ
れる。各々の図は実施例２の実験において行つた反応の
各逐次段階において観測されたパタンを示す。 第２図は実施例２で試験した試料中の芽球細胞計数（個
々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図である。 第３図は実施例２で試験した試料における単核細胞計数
（個々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図であ
る。 第４図は実施例２で試験した試料における多形核細胞計
数（個々の細胞ではない）の分布を示す二次元分布図で
ある。 第５Ａ図〜第５Ｂ図は本発明の組成物および従来の方法
をそれぞれ使用して得た、未成熟顆粒球を含むことが既
知である異常全血試料の二次元分布図である。 第６Ａ図〜第６Ｆ図は本発明の方法がレフトシフトを示
す能力を従来法と比較して示す二次元分布図である。 第７Ａ図〜第７Ｃ図は、流動式血球計数計において本発
明の組成物を使用して分析した個々の血液試料の二次元
分布図である。これらは実施例３の急性骨髄芽球性白血
病の供血者、正常供血者および慢性リンパ球性白血病の
供血者からの試料についての実験で得られた結果をそれ
ぞれ示す。 第７Ｄ図〜第７Ｆ図は従来法を使用して実施例３で行つ
た実験の二次元分布図である。 第８Ａ図〜第８Ｂ図は実施例４に記載の通り、本発明の
組成物および従来のペルオキシダーゼ試薬を使用し流動
式血球計数計を通過させた血球懸濁液中の個々の白血球
の分散パタンの二次元分布図である。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】好塩基球以外の白血球から細胞膜および細
   胞質を取除くのに有効な、少くとも一種類の希薄酸およ
   び少くとも一種類の水溶性界面活性剤を含有して成りか
   つpHが約１．８ないし約２．３であることを特徴とす
   る、試料中の白血球の弁別用組成物。
2. 【請求項２】界面活性剤がポリアルキレングリコールの
   Ｃ_６−Ｃ₁₆脂肪族アルコールエーテルである前項（１）
   に記載の組成物。
3. 【請求項３】ポリアルキレングリコールがポリオキシエ
   チレンまたはポリオキシプロピレングリコールから選ば
   れる前項（１）に記載の組成物。
4. 【請求項４】界面活性剤がＣ_６−Ｃ₁₆脂肪族Ｎ，Ｎ−ジ
   アルキルＮ−オキシドを含む前項（１）に記載の組成
   物。
5. 【請求項５】Ｃ_６−Ｃ₁₆脂肪族Ｎ，Ｎ−ジアルキルＮ−
   オキシドがドデシルＮ，Ｎ−ジメチルアミンＮ−オキシ
   ドである前項（４）に記載の組成物。
6. 【請求項６】界面活性剤がＣ_６−Ｃ₁₆脂肪族アンモニウ
   ム塩を含む前項（１）に記載の組成物。
7. 【請求項７】Ｃ_６−Ｃ₁₆脂肪族アンモニウム塩がテトラ
   デシルアンモニウムブロミドである前項（６）に記載の
   組成物。
8. 【請求項８】界面活性剤がＣ_６−Ｃ₁₆アルキル基を有す
   る第四球アンモニウム化合物を含む前項（１）に記載の
   組成物。
9. 【請求項９】第四級アンモニウム化合物がセチルトリメ
   チルアンモニウムブロミドおよびセチルピリジニウムク
   ロリドから選ばれる前項（８）に記載の組成物。
10. 【請求項１０】界面活性剤がアルキルベンゼンスルホネ
    ートを含む前項（１）に記載の組成物。
11. 【請求項１１】アルキルベンゼンスルホネートがドデシ
    ルベンゼンスルホン酸ナトリウムである前項（10）に記
    載の組成物。
12. 【請求項１２】希薄酸がスルホン酸を含む前項（１）に
    記載の組成物。
13. 【請求項１３】スルホン酸がメタンスルホン酸およびエ
    タンスルホン酸から選ばれる前項（12）に記載の組成
    物。
14. 【請求項１４】少くとも一種の希薄酸がカルボン酸を含
    む前項（１）に記載の組成物。
15. 【請求項１５】カルボン酸がマレイ酸、フタル酸、シユ
    ウ酸、マロン酸、ジクロロ酢酸および乳酸およびグリシ
    ンから選ばれる前項（14）に記載の組成物。
16. 【請求項１６】希薄酸が塩酸である前項（１）に記載の
    組成物。
17. 【請求項１７】少くとも一種の希薄酸がジカルボン酸お
    よび鉱酸を含む前項（１）に記載の組成物。
18. 【請求項１８】ジカルボン酸がフタル酸であり鉱酸が塩
    酸である前項（17）に記載の組成物。
19. 【請求項１９】さらに連鎖停止性酸化防止剤を含有して
    成る前項（１）に記載の組成物。
20. 【請求項２０】連鎖停止性酸化防止剤がジ−第三級ブチ
    ル−４−メチルフエノールおよびジ−第三級ブチル−４
    −メトキシフエノールから選ばれる前項（19）に記載の
    組成物。
21. 【請求項２１】希薄酸として、スルホン酸たとえばメタ
    ンスルホン酸またはエタンスルホン酸、カルボン酸たと
    えばマレイン酸、フタル酸、シユウ酸、マロン酸、ジク
    ロロ酢酸、乳酸またはグリシン、ジカルボン酸たとえば
    フタル酸および鉱酸たとえば塩酸から選ばれたものを、
    そして界面活性剤として、ポリアルキレングリコールた
    とえばポリオキシエチレまたはポリオキシプロピレング
    リコールのＣ_６−Ｃ₁₆脂肪族アルコールエーテル、Ｃ_６
    −Ｃ₁₆脂肪族Ｎ，Ｎ−ジアルキルＮ−オキシドたとえば
    ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミンＮ−オキシド、Ｃ_６
    −Ｃ₁₆脂肪族アンモニウム塩たとえばテトラデシルアン
    モニウムブロミド、Ｃ_６−Ｃ₁₆アルキル基を有する第四
    級アンモニウム化合物たとえばセチルトリメチルアンモ
    ニウムブロミドまたはセチルピリジニウムクロリドおよ
    びアルキルベンゼンスルホネートたとえばドデシルベン
    ゼンスルホン酸ナトリウムから選ばれたものを、そして
    さらに連鎖停止性酸化防止剤たとえばジ−第三級ブチル
    −４−メチルフエノールまたはジ−第三級ブチル−４−
    メトキシフエノールを含有して成る前項（１）に記載の
    組成物。
22. 【請求項２２】血液試料を、好塩基球以外の白血球から
    細胞膜および細胞質を取除くのに有効な、少くとも一種
    類の希薄酸および少くとも一種類の水溶性界面活性剤を
    含有して成りかつpHが約１．８ないし約２．３である組
    成物と混合して、好塩基球以外の白血球から細胞膜およ
    び細胞質を取除く工程と、その後、好塩基球以外の白血
    球サブクラスをその細胞核の形態に基いて弁別する工程
    とから成ることを特徴とする、白血球のサブクラスの弁
    別方法。
23. 【請求項２３】界面活性剤としてポリアルキレングリコ
    ールのＣ_６−Ｃ₁₆脂肪族アルコールエーテルを用いる前
    項（22）に記載の方法。
24. 【請求項２４】界面活性剤としてＣ_６−Ｃ₁₆アルキル基
    を有する第四球アンモニウム化合物を用いる前項（22）
    に記載の方法。
25. 【請求項２５】界面活性剤としてアルキルベンゼンスル
    ホネートを用いる前項（22）に記載の方法。