JPH0687779B2 - Synthetic structural gene - Google Patents

Synthetic structural gene

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JPH0687779B2
JPH0687779B2 JP59170492A JP17049284A JPH0687779B2 JP H0687779 B2 JPH0687779 B2 JP H0687779B2 JP 59170492 A JP59170492 A JP 59170492A JP 17049284 A JP17049284 A JP 17049284A JP H0687779 B2 JPH0687779 B2 JP H0687779B2
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salmon calcitonin
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precursor
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サケカルシトニンの合成構造遺伝子とその製
造法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a salmon calcitonin synthetic structural gene and a method for producing the same.

（従来の技術） カルシトニンは、Ｃ末端がアミド化された32個のアミノ
酸からなるペプチドであり、高カルシウム血症、Paget
（ページェット）病について治療効果が認められてい
る。このポリペプチドには、骨吸収抑制作用、骨新生促
進作用も確認されており老人性の骨粗鬆症に対しても有
望視されている。現在すでにカルシトニンは、ブタ、ウ
シ、ヒト、ラット、サケ、ウナギから分離され、それぞ
れ構造が明らかにされている。(Prior Art) Calcitonin is a peptide consisting of 32 amino acids with an amidated C-terminal, which causes hypercalcemia, Paget
Therapeutic effect is recognized for (Paget) disease. This polypeptide has also been confirmed to have a bone resorption inhibitory action and an osteogenesis promoting action, and is also considered promising for senile osteoporosis. At present, calcitonin has been isolated from pig, cow, human, rat, salmon, and eel, and the structure of each has been clarified.

由来する生物種間におけるカルシトニンの血中での生理
活性を比較すると魚類の鰓後腺から得られるものは、哺
乳類の甲状腺由来のものに比較して約30倍の比活性を示
し、効力の持続時間も長い。この理由としてサケカルシ
トニンにおいては、他のカルシトニンと較べて血中で不
活性化されにくいことが、例えば、H.Copp等、Calciton
in,Proc.2nd.Int.Sympo.London Heinemann.281（1981）
により報告されている。このため、サケカルシトニンが
特に医薬として使用するのに有利である。現在治療用の
カルシトニンとして市販されているものは、ブタ、サ
ケ、ウナギのカルシトニンであるが、これらは生体から
抽出したりまたは化学的に合成することによって得られ
ている。しかしその生産量はわずかでありまた高価であ
る。従ってサケカルシトニンを経済的、且つ大量に製造
することができる新規な方法の開発が強く望まれてい
る。Comparing the physiological activities of calcitonin in the blood among the derived species, the one obtained from the posterior gill gland of fish showed about 30 times the specific activity as compared with the one derived from the thyroid gland of mammals, and the sustained efficacy. It takes a long time. The reason for this is that salmon calcitonin is less likely to be inactivated in the blood than other calcitonins, for example, H. Copp, Calciton.
in, Proc.2nd.Int.Sympo.London Heinemann.281 (1981)
Reported by. For this reason, salmon calcitonin is particularly advantageous for use as a medicament. Commercially available therapeutic calcitonin is porcine, salmon or eel calcitonin, which are obtained by extraction from living organisms or by chemical synthesis. However, its production is small and expensive. Therefore, development of a new method capable of producing salmon calcitonin economically and in large quantities is strongly desired.

このような目的を達成するためには遺伝子操作技術を用
いる方法が最も好ましい。特開昭58-203953にはヒトカ
ルシトニンの化学合成遺伝子と大腸菌におけるその発現
が記載されている。しかしながらサケカルシトニン遺伝
子の合成、又は生体からの抽出について記載した文献は
存在しない。In order to achieve such an object, a method using a gene manipulation technique is most preferable. JP 58-203953 A describes a chemically synthesized gene of human calcitonin and its expression in E. coli. However, there is no document that describes the synthesis of the salmon calcitonin gene or the extraction from the living body.

（発明が解決しようとする問題点） この発明は、前記のごとく最も有望視されているサケカ
ルシトニンを経済的、且つ大量に製造するための新規な
方法を開発する事を最終目的とし、その前提としてサケ
カルシトニン構造遺伝子を提供する事を目的とする。遺
伝子操作技術の分野においては、現在までのところ、魚
類の鰓後腺に由来するサケ型及びウナギ型のカルシトニ
ンに相当する人工合成遺伝子はいまだ合成されていな
い。その理由の１つは、構造遺伝子中に５つの反復する
ロイシン（Leu）を含む領域を持つことである。このよ
うに強いホモロジーを持つような二重鎖ポリヌクレオチ
ドは従来合成が困難であると言われていた（例えば、J.
Windass等、N.A.R.106639（1982）参照）。(Problems to be Solved by the Invention) The final object of the present invention is to develop a novel method for economically and in large-scale production of salmon calcitonin, which is the most promising as described above. The purpose of the present invention is to provide a salmon calcitonin structural gene. In the field of gene manipulation technology, to date, artificially synthesized genes corresponding to salmon-type and eel-type calcitonin derived from the posterior gill gland of fish have not been synthesized yet. One of the reasons is that it has a region containing five repeating leucines (Leu) in the structural gene. It has been said that it is difficult to synthesize a double-stranded polynucleotide having such a strong homology in the past (for example, J.
See Windass et al., NAR 10 6639 (1982)).

サケカルシトニンは、32個のアミノ酸からなることが知
られている。このアミノ酸配列には、遺伝暗号の縮重の
故に、この蛋白の暗号を構成するヌクレオチド配列が多
数存在する。この様な場合には大腸菌の中でよく使用さ
れている、あるいは高発現をしている蛋白質において好
んで用いられているトリヌクレオチドコドンを使用する
ことが一般にすすめられている。しかしサケカルシトニ
ンのように、同一アミノ酸が反復して存在する領域を持
つ構造遺伝子の場合には、特定のヌクレオチド配列の選
択では目的とする遺伝子を合成することはできない。従
ってこの発明は、サケカルシトニン構造遺伝子を製造す
る方法を提供するものである。Salmon calcitonin is known to consist of 32 amino acids. Due to the degeneracy of the genetic code, this amino acid sequence has many nucleotide sequences that make up the code of this protein. In such a case, it is generally recommended to use the trinucleotide codon which is often used in E. coli or is preferably used in highly expressed proteins. However, in the case of a structural gene such as salmon calcitonin, which has a region in which the same amino acid is repeated, the target gene cannot be synthesized by selecting a specific nucleotide sequence. Therefore, the present invention provides a method for producing a salmon calcitonin structural gene.

（問題点を解決するための手段） 前記の目的は、サケカルシトニン、及びその前駆体をコ
ードし、そして適当な宿主、例えば大腸菌（E.coli）の
ごとき微生物において発現され得る構造遺伝子を合成す
ることによって解決される。(Means for Solving Problems) The above-mentioned object is to synthesize a structural gene encoding salmon calcitonin, and a precursor thereof, and capable of being expressed in a suitable host, for example, a microorganism such as E. coli. Will be solved by

カルシトニンの活性の発現にはＣ末端をアミド化する事
が必要であると言われている〔たとえばS.Guttmann.Exc
erpta Medica Int.Cong.Ser.54011（1981）参照〕。発
明者らは、以下の二つの方法に依って活性のあるカルシ
トニンを製造する事を意図した。１つは、インシュリン
の豚型からの人型への転換において示されるようなペプ
チド合成技術の応用である〔たとえばK.Inove等J.A.C.
S.101751（1979）参照〕。酵素反応によってＣ末端をア
ミド基を含むジ又はオリゴペプチドで置き換える事によ
り活性のあるカルシトニンを作る事ができる。もう１つ
は生体内に存在するアミド化酵素を利用してＣ末端アミ
ド基を作り出す方法である。末端にGlyを含むトリペプ
チドを脳下垂体由来の酵素が消化してアミド基に替える
事は文献に報告されている〔たとえばA.Bradbury等、B.
B.R.C117289（1983）参照〕。It is said that it is necessary to amidate the C-terminus for the expression of calcitonin activity [eg S. Guttmann. Exc.
erpta Medica Int. Cong. Ser. 540 11 (1981)]. The inventors intended to produce active calcitonin by the following two methods. One is the application of peptide synthesis technology as shown in the conversion of insulin from pig to human form [eg K. Inove et al. JAC.
S. 101 751 (1979)]. Active calcitonin can be produced by replacing the C-terminal with a di- or oligopeptide containing an amide group by an enzymatic reaction. The other is a method of creating a C-terminal amide group by utilizing an amidating enzyme existing in the living body. It has been reported in the literature that an enzyme derived from the pituitary gland converts a tripeptide containing Gly at the end into an amide group (for example, A. Bradbury et al., B.
BRC 117 289 (1983)].

サケカルシトニンのアミノ酸配列は次の通りである。The amino acid sequence of salmon calcitonin is as follows.

サケカルシトニンの前駆体のアミノ酸配列は次の通りで
ある。 The amino acid sequence of the salmon calcitonin precursor is as follows:

一般にアミノ酸配列が既に知られている構造遺伝子を人
工的に製造しようとする場合、まず二本鎖ヌクレオチド
配列の決定を行う。 Generally, in the case of artificially producing a structural gene whose amino acid sequence is already known, the double-stranded nucleotide sequence is first determined.

サケカルシトニンにおいては、特定のヌクレオチド配列
の選択だけでは目的とする遺伝子が合成できないため
に、本発明者らは、第一に構造遺伝子の合成に係るオリ
ゴヌクレオチド相互のハイブリダイゼーションの強さを
理論的に求め、第二に好ましくないハイブリダイゼーシ
ョンの自由エネルギーを上回るような値を、オリゴヌク
レオチドの正しい相補的な接続部位に与えるようにアミ
ノ酸のコドンを選択することによって好ましいヌクレオ
チド配列を決定した。すなわち、本発明の第１の発明
は、酵素によるペプチド変換（トランスペプチゼーショ
ン）を考慮した配列であって、次のように表わされるサ
ケカルシトニン合成構造遺伝子である。In salmon calcitonin, the target gene cannot be synthesized only by selecting a specific nucleotide sequence.Therefore, the present inventors firstly investigated the theoretical strength of hybridization between oligonucleotides involved in the synthesis of a structural gene. Secondly, the preferred nucleotide sequence was determined by selecting the codons of the amino acids to give values at the correct complementary junctions of the oligonucleotides that exceeded the free energy of unfavorable hybridization. That is, the first invention of the present invention is a salmon calcitonin synthetic structural gene represented by the following sequence, which is a sequence considering peptide conversion (transpeptization) by an enzyme.

正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACT− 負鎖:ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCT CCAAGACCATGTGGA また本発明の第２の発明は、酵素によるアミデーション
サイトのin vitro変換を考慮した配列であって、アミド
化ペプチドの前駆体として、次の配列で表わされるペプ
チド鎖のＣ末端にグリシンを付加したサケカルシトニン
合成構造遺伝子である。Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACT- Negative chain: ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCT CCAAGACCATGTGGA The second invention of the present invention is a sequence which takes into consideration the in vitro conversion of an amidation site by an enzyme, and which is a precursor of an amidated peptide, has glycine at the C-terminal of the peptide chain represented by the following sequence: It is a salmon calcitonin synthesis structural gene added with.

正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACT− 負鎖:ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCTGGT CCAAGACCATGTGGACCA この遺伝子のヌクレオチド配列の最初にメチオニンのコ
ドンを、末端に終止コドンを付加することが好ましく、
特に終止コドンは複数使用することが好ましい。また配
列の両端及び内部にいくつかの制限酵素認識部位及び切
断部位を組み入れることが好ましい。上流側末端の制限
酵素切断部位のヌクレオチド配列を選択することによ
り、構造遺伝子を効果的にmRNAへ転写させることができ
る。制限酵素切断部位を付加した好ましい具体例を第1A
及びＢ図に示す。Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACT- Negative chain: ACGAGGTTAGAGAGATGATGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTACGCAA
GACCCCTTCAACTCACAGGAATTACATAAGCTGCAAGTCCTTAATGTATT
CGACGTTACTTACCCGCGTACCAACACTTGAATGGGCGCATGGTTGTGAG
GTTCTGGTACACCTGGT CCAAGACCATGTGGACCA It is preferable to add a methionine codon at the beginning of the nucleotide sequence of this gene and add a stop codon at the end,
In particular, it is preferable to use a plurality of stop codons. It is also preferable to incorporate several restriction enzyme recognition sites and cleavage sites at both ends and inside of the sequence. The structural gene can be effectively transcribed into mRNA by selecting the nucleotide sequence of the restriction enzyme cleavage site at the upstream end. A preferred specific example in which a restriction enzyme cleavage site is added is 1A
And shown in FIG.

またオリゴヌクレオチドを段階的に集合、連結していく
本発明の第３の発明においても前記の方法を用いること
が好ましい。好ましいサブブロック集合法として選ばれ
た具体例を以下に示す。Further, it is preferable to use the above method also in the third invention of the present invention in which oligonucleotides are assembled and linked stepwise. A specific example selected as a preferable sub-block set method is shown below.

以下に構造遺伝子の人工合成における配列の確立及び製
造法についてさらに詳細に述べる。 The method for establishing the sequence and the method for producing the artificially synthesized structural gene will be described in more detail below.

大腸菌内で、高発現される蛋白質において好んで用いら
れるトリプレットコドン（例えば、R.Gran-tham等N.A.
R.９r43（1981）参照）をサケカルシトニンのアミノ酸
配列にあてはめて好ましい二本鎖ヌクレオチド配列を選
び、さらにその両末端にmRNAの転写を制御する開始と終
止のコドン、及びプラスミドベクターに挿入するための
ヌクレオチド配列を付加した。この二本鎖ヌクレオチド
配列を適当な長さのオリゴヌクレオチドに分割した。Triplet codons that are preferred for use in highly expressed proteins in E. coli (eg NA by R. Gran-tham et al.
R. 9 r43 (1981)) is applied to the amino acid sequence of salmon calcitonin to select a preferred double-stranded nucleotide sequence, and the start and stop codons for controlling the transcription of mRNA are inserted at both ends thereof and a plasmid vector. The nucleotide sequence for This double-stranded nucleotide sequence was divided into oligonucleotides of suitable length.

本発明者らは、オリゴヌクレオチドの接着と結合にかか
わる反応、Annealing反応とligation反応、を常に好結
果に導く構造遺伝子のヌクレオチド配列を見い出した。
また、結合を行うために集合された複数のオリゴヌクレ
オチド相互において、設定された接着部位のハイブリダ
イゼーションの自由エネルギーが他のすべての好ましく
ないクロスハイブリダイゼーションの与える自由エネル
ギーより充分に負の値であれば反応において常に好結果
が得られることを本発明者らは見い出した。The present inventors have found a nucleotide sequence of a structural gene that always leads to successful reactions involving oligonucleotide adhesion and binding, an annealing reaction and a ligation reaction.
In addition, in a plurality of oligonucleotides assembled to perform binding, the free energy of hybridization at the set adhesion site should be sufficiently negative than the free energy of all other unfavorable cross-hybridizations. The present inventors have found that a good result is always obtained in the reaction.

ハイブリダイゼーションの自由エネルギーの値は、RNA
のヌクレオチド配列におけるアテェニュエーター構造の
ハイブリダイゼーションの強さを推定する計算方法（例
えば、I.Tinoco.Jr等Nature New Biology24640（1973）
参照）を用いて求められる数値で代替することが行なわ
れているようである。本発明者らは、コンピューターを
用いて第一に上記に設定した７塩基からなるオリゴヌク
レオチドの接着部位についてハイブリダイゼーションの
数値を求め、次に前記のようにして選んだ二本鎖ヌクレ
オチド配列を構成するオリゴヌクレオチド相互のクロス
ハイブリダイゼーションについて数値を求めた。両者の
数値の比較により、クロスハイブリダイゼーションが正
しい接着に優先すると判定された部分について、アミノ
酸のトリプレットコドンを縮重する他のコドンに置き換
え、二本鎖ヌクレオチド配列を修正した。このような修
正操作を繰り返すことにより好ましいヌクレオチド配列
を設定した。The value of free energy of hybridization is RNA
Method for estimating the strength of hybridization of an attenuator structure in the nucleotide sequence of Escherichia coli (for example, I. Tinoco. Jr et al. Nature New Biology 246 40 (1973))
It seems that it is being replaced by the numerical value obtained using (see). The present inventors first calculated the numerical value of hybridization for the adhesion site of the oligonucleotide consisting of 7 bases set above using a computer, and then constructed the double-stranded nucleotide sequence selected as described above. Numerical values were obtained for cross-hybridization of the oligonucleotides. The double-stranded nucleotide sequence was corrected by replacing the triplet codon of the amino acid with another degenerate codon for the part determined by comparison of the numerical values of the two in which cross-hybridization was prioritized for correct adhesion. A preferable nucleotide sequence was set by repeating such a correction operation.

第２図は一般的にすすめられている方法によって選択し
た二本鎖ヌクレオチド配列であり、第１図はそれを修正
した本発明による二本鎖ヌクレオチド配列である。FIG. 2 is a double-stranded nucleotide sequence selected by the generally recommended method, and FIG. 1 is a double-stranded nucleotide sequence modified according to the present invention.

具体的にはオリゴヌクレオチドU3及びU4を、U31及びU41
に修正した。これらのオリゴヌクレオチドは次の様な関
係にある。Specifically, the oligonucleotides U3 and U4 are replaced with U31 and U41
Fixed to. These oligonucleotides have the following relationships.

対応する負鎖L3及びL4についても対合するようにL31及
びL41に修正している。 The corresponding negative chains L3 and L4 are also modified to L31 and L41 so as to be paired.

第２図のヌクレオチド配列に基づいてサケカルシトニン
遺伝子を合成する事は不可能である。この配列において
は５つの反復するロイシンを含む領域の遺伝子を実質的
に得る事ができない。It is impossible to synthesize the salmon calcitonin gene based on the nucleotide sequence of FIG. In this sequence, the gene for the region containing five repeating leucines cannot be obtained substantially.

また構造遺伝子は、クロスハイブリダイゼーションを少
なくするためにサブブロックを作製して段階的に集合、
連結することができる。サブブロック相互の接着部位と
しては、自由エネルギーの負の値の大きい部位を選ぶこ
とが好ましい。In addition, structural genes are assembled in stages by creating sub-blocks to reduce cross-hybridization.
Can be connected. It is preferable to select a site having a large negative value of free energy as a site of adhesion between the sub-blocks.

第５図のように従来の方法に従っても目的とする遺伝子
を得る事はできるが、この方法においては合成収率が非
常に低い。Although the target gene can be obtained by the conventional method as shown in FIG. 5, the synthetic yield is very low in this method.

合成が困難な５つの反復するLeuを含むサケカルシトニ
ン遺伝子について本発明の有用性を実施例において例示
する。The utility of the present invention is illustrated in the examples for a salmon calcitonin gene containing 5 repeating Leu's that are difficult to synthesize.

設計されたオリゴヌクレオチドをホスホトリエステル法
により小ユニットから作り上げる方法、及び酵素を用い
てオリゴヌクレオチドを連結していく方法は公知である
（例えば、H.Hsivng等、N.A.R.６1371（1979）、および
K.Agarwal等、Nature22727（1970）参照）。オリゴヌク
レオチドを合成するためには固相ホスホトリエステル法
を用いることが好ましい。Methods for making designed oligonucleotides from small units by the phosphotriester method and ligating oligonucleotides using enzymes are known (eg, H. Hsivng et al., NAR 6 1371 (1979), and
See K. Agarwal et al., Nature 227 27 (1970)). The solid phase phosphotriester method is preferably used to synthesize the oligonucleotide.

簡単なグラスフィルター（たとえばT.Tanaka等NAR10324
9（1982）参照）内で縮合反応を行った。Simple glass filter (eg T. Tanaka et al. NAR 10 324
9 (see 1982)).

オリゴヌクレオチドL-31を合成する方法を示せば、まず
樹脂担体上に３′位の水酸基を用いて固定されたベンゾ
イルシチジンの５′位の水酸基と、核酸塩基、インター
ヌクレオチドリン酸基と５′位の水酸基が保護されたダ
イマーユニットシチジン−グアノシン（CG）のグアノシ
ンの３′位の水酸基とを、リン酸基の活性化剤を用いて
縮合させる。The method for synthesizing the oligonucleotide L-31 is as follows. First, the 5'-hydroxyl group of benzoylcytidine, which is immobilized on the resin carrier using the 3'-hydroxyl group, the nucleobase, the internucleotide phosphate group and the 5'-hydroxyl group. The dimer unit cytidine-guanosine (CG) in which the hydroxyl group at the position is protected is condensed with the hydroxyl group at the 3'position of guanosine using a phosphoric acid group activator.

次に新しく付加したシチジンの５′位の水酸基の保護基
を除去してダイマーユニットアデノシン−アデノシン
（AA）と縮合させる。このようにして以下、AG、CC、C
C、TT、ACのダイマーユニットを順次縮合させることに
よって保護基を含むオリゴヌクレオチドL-31が合成され
る。Next, the protecting group for the hydroxyl group at the 5'-position of the newly added cytidine is removed and condensed with the dimer unit adenosine-adenosine (AA). In this way, AG, CC, C
Oligonucleotide L-31 containing a protecting group is synthesized by sequentially condensing dimer units of C, TT, and AC.

オリゴヌクレオチドL-31は、担体樹脂につながるベンゾ
イルシチジンの３′位、核酸塩基、インターヌクレオチ
ドリン酸基とオリゴヌクレオチド鎖の先端のアデノシン
の５′位に存在する保護基をすべて除去することによっ
て得られる。Oligonucleotide L-31 was obtained by removing all the protecting groups existing at the 3'position of benzoylcytidine, the nucleobase, the internucleotide phosphate group and the 5'position of adenosine at the tip of the oligonucleotide chain, which are linked to the carrier resin. To be

オリゴヌクレオチドを連結して構造遺伝子を合成するた
めには、酵素反応を用いることが好ましい。酵素ポリヌ
クレオチドキナーゼとアデノシントリリン酸（ATP）を
用いてオリゴヌクレオチドにリン酸基を付加する。この
オリゴヌクレオチドの複数を一旦加熱しさらに再冷却す
ることによって物理的に凝集させ、酵素、T4ポリヌクレ
オチドリガーゼを作用させて、オリゴヌクレオチド相互
の５′末端のリン酸基と３′末端の水酸基とを縮合させ
ると遺伝子の一部を構成するサブブロックを合成するこ
とができる。構造遺伝子はサブブロック相互を同様に縮
合させることにより製造できる。An enzymatic reaction is preferably used for ligating the oligonucleotides to synthesize the structural gene. A phosphate group is added to an oligonucleotide using the enzymes polynucleotide kinase and adenosine triphosphate (ATP). A plurality of these oligonucleotides are heated and then re-cooled to physically agglomerate, and the enzyme, T4 polynucleotide ligase, is allowed to act, and the 5'-terminal phosphate group and the 3'-terminal hydroxyl group of the oligonucleotides interact with each other. Can be condensed to synthesize a subblock constituting a part of a gene. Structural genes can be produced by similarly condensing sub-blocks.

目的とする遺伝子はサブブロック相互を連結方式（Ｉ）
及び（II）によって同様に縮合させる事により製造でき
る。Target gene is a method of connecting sub-blocks (I)
And (II) in the same manner.

なお、この発明において、サケカルシトニンの遺伝子を
CT1、サケカルシトニン前駆体の遺伝子をCT2と称する。In the present invention, the gene for salmon calcitonin is
CT1 and salmon calcitonin precursor gene are called CT2.

上記の合成構造遺伝子は公知の方法でプラスミドベクタ
ーに挿入することができる。挿入した部位の上流かつ隣
接した位置に微生物プロモーターを導入すれば、挿入さ
れた遺伝子は、このプロモーターの制御下に正しい位相
でmRNAへの転写が行なわれる。The above synthetic structural gene can be inserted into a plasmid vector by a known method. If a microbial promoter is introduced upstream and adjacent to the inserted site, the inserted gene is transcribed into mRNA in the correct phase under the control of this promoter.

プラスミドpHT2にサケカルシトニン構造遺伝子を挿入し
て造成されたプラスミドのうち、サケカルシトニン遺伝
子CT1を含有するプラスミドをpSCT1と称し、サケカルシ
トニン前駆体遺伝子CT2を含有するプラスミドをpSCT2と
称する。Among the plasmids constructed by inserting the salmon calcitonin structural gene into the plasmid pHT2, the plasmid containing the salmon calcitonin gene CT1 is called pSCT1, and the plasmid containing the salmon calcitonin precursor gene CT2 is called pSCT2.

このようにして得たプラスミドpSCT1、及びpSCT2をE.コ
リ菌株RRIに形質転換することによって、それぞれ形質
転換株を得た。プラスミドpSCT1を含有する形質転換株
をRRI/pSCT1と称し、pSCT2を含有するそれをRRI/pSCT2
と称する。これらの菌株RRI/pSCT1は微工研菌寄第7774
号（FERM-P No.7774）として、RRI/pSCT2は微工研菌寄
第7775号（FERM-P No.7775）として工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託され、微工研条寄第866号（FERM BP
-866）としてブダペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。By transforming the plasmids pSCT1 and pSCT2 thus obtained into E. coli strain RRI, transformants were obtained. The transformant containing the plasmid pSCT1 is called RRI / pSCT1 and that containing pSCT2 is called RRI / pSCT2.
Called. These strains RRI / pSCT1 were produced by Micro Inst.
(FERM-P No.7774), RRI / pSCT2 was deposited at the Institute of Microbial Science and Technology, Institute of Industrial Science and Technology, as Microorganism Research Institute No. 7775 (FERM-P No.7775). No. 866 (FERM BP
-866) was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty.

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

サケカルシトニン遺伝子フラグメントの化学合成 第1A及びＢ図に本発明のサケカルシトニン遺伝子の配列
を、第２図に比較の為の配列を示した。これら第1A及び
Ｂ図及び２図に示した23個のオリゴヌクレオチドの化学
合成は、ホスホトリエステル、固相法を用いて行った。
すなわちオリゴヌクレオチドL-31の完全に保護されたオ
リゴヌクレオシドを合成するためには、40mg、2.2μmol
のシトシンヌクレオシドに15mgずつのCG、AAと、10mgず
つのAG、CC、CC、TT、ATのダイマーユニットを順次反応
させた。Chemical Synthesis of Salmon Calcitonin Gene Fragment FIGS. 1A and 1B show the sequence of the salmon calcitonin gene of the present invention, and FIG. 2 shows the sequence for comparison. The 23 oligonucleotides shown in FIGS. 1A and 1B and 2 were chemically synthesized by using the phosphotriester solid phase method.
Thus to synthesize a fully protected oligonucleoside of oligonucleotide L-31, 40 mg, 2.2 μmol
15 mg each of CG and AA and 10 mg each of dimer units of AG, CC, CC, TT, and AT were sequentially reacted with the cytosine nucleoside.

一回の縮合操作を示せば、縮合には20mgの2,4,16−トリ
メチルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド
（MSNT）を用い350μｌの無水ピリジン中で室温１時間
反応した。反応後、固型物をピリジンで洗浄し、ジメチ
ルアミノピリジンを触媒として用いて10％の無水酢酸ピ
リジン溶液中で室温３分間キャッピング反応を行った。
ピリジン、ジクロルメタン溶液でそれぞれ洗浄後、３％
TCAのジクロルメタン溶液10mlで固型物を洗う事により
５′末端の保護基であるジメトキシトリチル（DMTr）基
を除去した。このあと、ジクロルメタン、テトラヒドロ
フラン（THF）で洗浄し、ピリジンと共沸脱水を行う事
によって反応容器中の水分を完全に除き、次の回の縮合
反応へと続ける。DMTr基の除去率によって算出した平均
の縮合収率は91％であった。To show one condensation operation, 20 mg of 2,4,16-trimethylbenzenesulfonyl-3-nitrotriazolide (MSNT) was used for the condensation, and the reaction was carried out in 350 μl of anhydrous pyridine at room temperature for 1 hour. After the reaction, the solid product was washed with pyridine, and a capping reaction was performed in a 10% acetic anhydride pyridine solution at room temperature for 3 minutes using dimethylaminopyridine as a catalyst.
3% after washing with pyridine and dichloromethane solution respectively
The solid product was washed with 10 ml of a TCA solution of dichloromethane to remove the dimethoxytrityl (DMTr) group, which is a protective group at the 5'end. After that, it is washed with dichloromethane and tetrahydrofuran (THF), and azeotropic dehydration with pyridine is performed to completely remove the water content in the reaction vessel, and the next condensation reaction is continued. The average condensation yield calculated based on the DMTr group removal rate was 91%.

次に40mgのヌクレオシドレジンより連続縮合反応によっ
て合成したL-31の保護基を含むオリゴヌクレオチドに対
して、0.5Mのピリジンアルドキシムとテトラメチルグア
ニジン（TMG）の50％ジオキサン水溶液を1.5ml加え、30
℃で２日間反応した。濃縮して溶媒を回収した後、封管
中で22％アンモニアを含むピリジン水溶液2mlと55℃で
５時間反応した。Next, to the oligonucleotide containing a protective group of L-31 synthesized by a continuous condensation reaction from 40 mg of nucleoside resin, 1.5 ml of a 50% dioxane aqueous solution of 0.5 M pyridinealdoxime and tetramethylguanidine (TMG) was added, 30
Reacted at ℃ for 2 days. After concentrating and recovering the solvent, the reaction was carried out in a sealed tube with 2 ml of an aqueous pyridine solution containing 22% ammonia at 55 ° C. for 5 hours.

これらの反応により、スクレオシドとレジンとの結合が
切断され、インターヌクレオチド結合のリン酸基の保護
基と核酸塩基の保護基が除去された。By these reactions, the bond between the nucleoside and the resin was cleaved, and the phosphate-protecting group and the nucleobase-protecting group of the internucleotide bond were removed.

レジンを別により取り除き、減圧濃縮によってアンモ
ニアを除去した後、得られた５′末端に保護基を含むオ
リゴヌクレオチドをC-18ディスポーザブルカラムSeppak
（Waters）にかけた。15％の濃度のアセトニトリル水溶
液20mlをカラムに流した後、30％のアセトニトリル水溶
液2mlをカラムに加えると目的物が溶離、流出する。After removing the resin separately and removing the ammonia by concentration under reduced pressure, the resulting oligonucleotide containing a protecting group at the 5'end was separated with a C-18 disposable column Seppak.
(Waters). After 20 ml of 15% aqueous acetonitrile solution is passed through the column, 2 ml of 30% aqueous acetonitrile solution is added to the column to elute and flow out the desired product.

溶離した画分に等量の酢酸を加え半時間室温で反応して
DMTr基を除去した。エーテル抽出、共沸脱水によって酢
酸を除去した後溶媒をエタノールに置換し、3,000回転
で10分間遠心する事によりオリゴヌクレオチドを沈下さ
せた。上清を除去した後、減圧によってエタノールを除
き、蒸留水100μｌに溶解した。Add an equal amount of acetic acid to the eluted fractions and react at room temperature for half an hour.
The DMTr group was removed. After removing acetic acid by ether extraction and azeotropic dehydration, the solvent was replaced with ethanol and the oligonucleotide was precipitated by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes. After removing the supernatant, ethanol was removed by reduced pressure and the residue was dissolved in 100 μl of distilled water.

HPLCによる精製はμBondpak C-18（Waters）カラムを用
いて0.1Mトリエチルアミンアセテート水溶液と、アセト
ニリルの溶媒系で行った。アセトニトリル濃度を10％よ
り開始し、１分毎に0.6％の勾配で60分間上昇させた。
溶出は１分間あたり1mlの流速で行い目的とするピーク
のものをフラクションコレクター（Gilson）で集めて凍
結乾燥した。Purification by HPLC was performed using a μBondpak C-18 (Waters) column in a 0.1 M triethylamine acetate aqueous solution and an acetoniryl solvent system. Acetonitrile concentration was started from 10%, and the gradient was raised to 0.6% every minute for 60 minutes.
Elution was carried out at a flow rate of 1 ml per minute, and target peaks were collected by a fraction collector (Gilson) and freeze-dried.

３回に分けて分取操作を行う事により、精製されたL-31
のオリゴヌクレオチドを21OD（260mμで測定）得た。Purified L-31 by performing preparative operation in three steps
21 OD (measured at 260 mμ) were obtained.

同様にして、他のオリゴヌクレオチドも合成した。合成
したフラグメントに対しては１次元ホモクロマトグラフ
ィー法によって純度を確認した。21個のオリゴヌクレオ
チドの物理的性状として１次元ホモクロマトグラフィー
におけるRf値を示す。Other oligonucleotides were synthesized in the same manner. The purity of the synthesized fragment was confirmed by a one-dimensional homochromatography method. The R f value in one-dimensional homochromatography is shown as the physical property of 21 oligonucleotides.

また半数のフラグメントに対しては２次元ホモクロマト
グラフィー法（たとえば、R.Bambara等、NAR１331（197
4）参照）又はマクサム、ギルバート法（たとえば、A.M
axam等、Methods in Enzymology65499（1980）参照）に
よって純度と塩基配列を確認した。 For half of the fragments, a two-dimensional homochromatography method (for example, R. Bambara et al., NAR 1 331 (197
4)) or Maxam, Gilbert method (for example, AM
Axam et al., Methods in Enzymology 65 499 (1980)) confirmed the purity and nucleotide sequence.

フラグメントによるサブブロックの作製 第３図に酵素反応によって作製したサブブロックの一部
を示す。すなわちサブブロック3-5を作製するために
は、サブブロックを構成する10個のフラグメントそれぞ
れ100pmlを蒸溜水で希釈して９μｌとし、10μciのγ
〔32p〕ATP（3100ei/mmol）を加え、溶液を50mM Tris塩
酸、pH9.6、10mM MgCl2、2mMスペルミン、100mMKCl、10
mM DTTになる様に調整し、４単位のポリヌクレオチドキ
ナーゼを加え全容積を15μｌとした。37℃で30分間反応
する事により５′末端を32pでラベルした。次にすべて
の５′末端をリン酸化するために1nmolのATPと１単位の
ポリヌクレオチドキナーゼを加え37℃で60分間反応させ
た。Preparation of subblock by fragment Fig. 3 shows a part of the subblock prepared by enzymatic reaction. That is, in order to prepare sub-block 3-5, 100 pml of each of the 10 fragments constituting the sub-block was diluted to 9 μl with distilled water to obtain 10 μci of γ.
[32p] ATP (3100ei / mmol) was added, and the solution was added to 50 mM Tris hydrochloric acid, pH 9.6, 10 mM MgCl 2 , 2 mM spermine, 100 mM KCl, 10
It was adjusted to mM DTT and 4 units of polynucleotide kinase was added to make the total volume 15 μl. By reacting at 37 ° C for 30 minutes, the 5'end was labeled with 32p. Next, in order to phosphorylate all 5'ends, 1 nmol of ATP and 1 unit of polynucleotide kinase were added and reacted at 37 ° C for 60 minutes.

反応後10個のフラグメントを混合し、C-18ディスポーザ
ブルカラムSeppak（Waters）を用いて前述した方法で精
製した。溶離したDNA溶液を濃縮しエタノール沈殿処理
を行ってDNAを沈下させた。上清を除去した後減圧によ
ってエタノールを除き乾固物を40μｌのリガーゼ緩衝液
（25mMN-2−ヒドロキシエチルピペラジンＮ′‐２−エ
タンスルホン酸（HEPES）pH7.8、7.5mM MgCl2）に溶解
した。この溶液を1.5ml容エッペンドルフチューブに入
れ、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃にお
いて10個のフラグメントを接着させた。このDNA溶液を
0.2mMのATP、6mMのDTTを含むリガーゼ緩衝溶液とし、T4
リガーゼ８単位を加え、全容量を50μｌとし、12℃で16
時間反応させた。After the reaction, 10 fragments were mixed and purified by the method described above using a C-18 disposable column Seppak (Waters). The eluted DNA solution was concentrated and subjected to ethanol precipitation to precipitate the DNA. After removing the supernatant, the ethanol was removed by decompression and the dried solid was dissolved in 40 μl of ligase buffer (25 mM N-2-hydroxyethylpiperazine N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES) pH 7.8, 7.5 mM MgCl 2 ). did. This solution was placed in a 1.5 ml Eppendorf tube and heated at 65 ° C. for 10 minutes and 42 ° C. for 30 minutes, and then 10 fragments were attached at 0 ° C. This DNA solution
A ligase buffer solution containing 0.2 mM ATP and 6 mM DTT was added, and T4
Add 8 units of ligase to bring the total volume to 50 μl and add 16 at 12 ℃.
Reacted for hours.

反応溶液を一部取り出し12％のポリアクリルアミドゲル
電気泳動で検討した。ゲルは7M尿素を含んだものと含ま
ないものの２種類を用い、電気泳動を行った後ラジオオ
ートグラフィーを行い、デンシトメーター（Helena Lab
oratories）を用いて反応物の組成を検討した。その結
果78塩基と93塩基に相当するDNAが15％と27％の割合で
生成していた。同様にして他のサブブロックを合成し
た。A part of the reaction solution was taken out and examined by 12% polyacrylamide gel electrophoresis. Two types of gels were used, one containing 7M urea and the other containing no 7M urea. After electrophoresis, radioautography was performed and a densitometer (Helena Lab) was used.
oratories) was used to examine the composition of the reaction product. As a result, DNA corresponding to 78 bases and 93 bases was produced at a ratio of 15% and 27%. Similarly, other sub-blocks were synthesized.

第２図のヌクレオチド配列に基づくサブブロックは、3-
1、3-2であり、５つの反復するLeuのトリヌクレオチド
コドンはフラグメントU1,L2,U2,L3,U3,L4,U4,L5上に存
在する。The sub-block based on the nucleotide sequence in FIG.
1, 3-2, and 5 repeating Leu trinucleotide codons are present on the fragments U1, L2, U2, L3, U3, L4, U4, L5.

合成収率は次の通りであった。サブブロック 収率（％） 3-1 0.3 3-2 2 3-3 85 3-4 65 3-5 23 3-6 31 3-7 50 3-8 48 この表から明らかなごとく、本発明により修正する前の
塩基配列を有するサブブロック3-1、及び3-2の収率は非
常に低かったが、この発明に係るその他のサブブロック
の収率は十分に高かった。The synthetic yield was as follows. Sub-block yield (%) 3-1 0.3 3-2 2 3-3 85 3-4 65 3-5 23 3-6 31 3-7 50 3-8 48 As apparent from this table, modified by the present invention. The yields of the sub-blocks 3-1 and 3-2 having the base sequence before that were very low, but the yields of the other sub-blocks according to the present invention were sufficiently high.

サブブロックによる全遺伝子の製造 サブブロックを集合、連結してヌクレオチド配列の全体
を製造した。Production of all genes by subblocks Subblocks were assembled and linked to produce the entire nucleotide sequence.

すなわち、前（Ｉ）式の方法で全遺伝子を製造するため
には、サブブロック3-5と3-7のリガーゼ反応終了後の反
応液各45μｌを1.5ml容エッペンドルフチューブ内で混
合し、65℃で10分間、42℃で30分間加熱した後、０℃に
おいてサブブロックDNA相互を接着させた。このDNA溶液
に新たに30nmolのATPと500nmolのDTTを加えT4リガーゼ1
2単位を加えて全量を100μｌとし12℃で16時間反応させ
た。That is, in order to produce all genes by the method of the formula (I), 45 μl of each reaction solution after the ligase reaction of subblocks 3-5 and 3-7 was mixed in a 1.5 ml Eppendorf tube, After heating at 0 ° C for 10 minutes and at 42 ° C for 30 minutes, the subblock DNAs were adhered to each other at 0 ° C. To this DNA solution, add 30 nmol of ATP and 500 nmol of DTT newly and add T4 ligase 1
Two units were added to make the total volume 100 μl, and the mixture was reacted at 12 ° C. for 16 hours.

反応物の組成を検討すると113塩基と115塩基の対合に相
当するDNAが全体の23％の割合で生成していた。（第４
図参照） 次に上記の反応溶液全量を7M尿素を含む12％のポリアク
リルアミド電気泳動により分離した。ラジオオートグラ
フィーにより目的のDNAを確認したのち、その部分のゲ
ル片を切り出して透析チューブに入れ、89mMトリスホウ
酸、2mM EDTA緩衝液を満たしシールした後、同緩衝液中
で50Vの定電圧で12時間電気泳動する事によりゲル中のD
NAを溶出させた。次にDNAを透析チューブより取り出し
凍結乾燥し、乾固物を100μｌの蒸溜水に溶解して、イ
オン交換ディスポーザブルカラムElotip-d（Schleicher
＆Schuell）を用いて精製した。When the composition of the reaction product was examined, DNA corresponding to the pairing of 113 bases and 115 bases was produced in a ratio of 23% of the whole. (4th
(See the figure) Next, the total amount of the above reaction solution was separated by 12% polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea. After confirming the target DNA by radioautography, cut out the gel piece from that portion and put it in a dialysis tube, fill it with 89 mM Tris borate, 2 mM EDTA buffer and seal it, then at a constant voltage of 50 V in the same buffer 12 D in the gel
NA was eluted. Next, the DNA is taken out from the dialysis tube, lyophilized, and the dried solid is dissolved in 100 μl of distilled water. The ion exchange disposable column Elotip-d (Schleicher
& Schuell).

同様にして前（II）式の方法ではサブブロック3-6と3-8
とをオリゴヌクレオチドL5、U5とで集合連結して、113
塩基と115塩基の対合に相当するDNAを全体の11％の割合
で得た。Similarly, in the method of the formula (II), sub-blocks 3-6 and 3-8
Are assembled and linked with oligonucleotides L5 and U5,
DNA corresponding to the pairing of bases and 115 bases was obtained in a proportion of 11% of the whole.

また、オリゴヌクレオチドを段階的に集合連結していく
従来の手法においては、第５図に示したような精製した
小ブロックを順次連結していく方法も一般的に行なわれ
ている。Further, in the conventional method of stepwise assembling and connecting oligonucleotides, a method of sequentially connecting purified small blocks as shown in FIG. 5 is also generally performed.

（たとえば、Ａ・Gddstein等、Biochemistry196096（19
80）参照） 第1A及びＢ図のヌクレオチド配列を用い第５図の方法で
ヌクレオチド配列の全体を製造したところ、それぞれ50
pmolのフラグメントを使用して122塩基と116塩基が対合
したDNAが0.2pmol得られた。(For example, A. Gddstein et al., Biochemistry 19 6096 (19
80))) The whole nucleotide sequence was prepared by the method of FIG. 5 using the nucleotide sequences of FIGS. 1A and 1B.
Using pmol of the fragment, 0.2 pmol of DNA in which 122 bases and 116 bases were paired was obtained.

製造した全遺伝子はすべてT4ポリヌクレオチドキナーゼ
とATPを用いて５′末端をリン酸化した。All genes produced were phosphorylated at the 5'end using T4 polynucleotide kinase and ATP.

組み替えベクタープラスミドの造成 プラスミドpHT2は発現用ベクターpKC30（たとえばH.Shi
matake等Nature292128（1981）参照）に、pCQV2（たと
えば、C.Queen、J.Mol・Appl・Genetics２１（1983）参
照）由来のCIts遺伝子を組み込んで宿主域を広げたプラ
スミドであり、一ケ所の制限酵素HpaIの切断部位をＮ蛋
白構造遺伝子内に有する。この切断部位にアミノ酸のト
リヌクレオチドコドンの位相を合はせて外来遺伝子を挿
入する事により、PLプロモーターの発現調整支配下にＮ
蛋白との雑種蛋白を発現する事が可能である。Construction of recombinant vector plasmid Plasmid pHT2 is used for expression vector pKC30 (eg H.Shi).
etc. Nature 292 128 (1981) refer) matake, pCQV2 (e.g., C.Queen, J.Mol · Appl · Genetics 2 1 (1983) refer) a plasmid with wider host range incorporates CI ts gene from , Has a cleavage site for the restriction enzyme HpaI in the N protein structural gene. By inserting a foreign gene into the cleavage site by aligning the trinucleotide codons of amino acids with each other, N
It is possible to express a hybrid protein with a protein.

プラスミドpHT2のHpaI、ClaI断片にHpaI、ClaIの制限酵
素認識配列が再生するようにサケカルシトニン遺伝子を
組み込んだ組み替えプラスミドを造成した（第６図参
照）。A recombinant plasmid was constructed in which the salmon calcitonin gene was incorporated into the HpaI and ClaI fragment of the plasmid pHT2 so that the HpaI and ClaI restriction enzyme recognition sequences were regenerated (see FIG. 6).

すなわち、pHT2の20μｇを100μｌのClaI反応液（6mM T
ris塩酸、pH7.9、6mM MgCl2、50mM NaCl）中で制限酵素
ClaIを10単位加え37℃60分間反応を行いエタノール沈殿
処理によってDNAを沈下させた。That is, 20 μg of pHT2 was added to 100 μl of ClaI reaction solution (6 mM T
restriction enzyme in ris hydrochloric acid, pH 7.9, 6 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl)
10 units of ClaI was added, the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes, and the DNA was precipitated by ethanol precipitation.

このDNA沈殿を100μｌのHpaI反応液（10mM Tris塩酸、p
H7.5、7mM MgCl2、100mM KCl、7mMβメルカプトエタノ
ール）に溶解し制限酵素HpaIを15単位加えて37℃90分間
反応を行った。さらに反応液に、大腸菌アルカリフォス
ファターゼ0.08単位を加え65℃30分間反応させて５′末
端を脱リン酸化した。反応液を100μｌのフェノールで
洗浄したあと0.7％アガロースゲル電気泳動を行い、大
きなDNA断片を電気泳動法によって回収した。This DNA precipitate was added to 100 μl of HpaI reaction solution (10 mM Tris hydrochloric acid, p
H7.5, 7 mM MgCl 2 , 100 mM KCl, 7 mM β-mercaptoethanol), and 15 units of the restriction enzyme HpaI was added and reacted at 37 ° C. for 90 minutes. Further, 0.08 unit of Escherichia coli alkaline phosphatase was added to the reaction solution and reacted at 65 ° C for 30 minutes to dephosphorylate the 5'end. The reaction solution was washed with 100 μl of phenol and then subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and a large DNA fragment was recovered by electrophoresis.

このようにして得たpHT2のClaI、HpaI断片DNA0.5pmol
と、５′末端にリン酸基を含むサケカルシトニン遺伝子
0.5pmolを、T4DNAライゲーション反応液20μｌ（25mM H
EPES、pH7.8、7.5mM MgCl2、0.2mM ATP、6mM DTT）に
溶解して、T4DNAリガーゼ３単位と20℃16時間反応し、
そのうちの10μｌを用いて大腸菌株RRIに形質転換させ1
00μg/mlのアンピシリンに耐性の形質転換体を選んだ。
第３図のサブブロック3-6と3-8とオリゴヌクレオチドL5
とU5とを連結し、制限酵素HpaIによって５′末端を切断
した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT1、サブブロック3-5
と3-7を連結した遺伝子の形質転換株をRRI/pSCT2と命名
した。0.5 pmol of ClaI, HpaI fragment DNA of pHT2 thus obtained
And a salmon calcitonin gene containing a phosphate group at the 5'end
0.5 pmol was added to 20 μl of T4 DNA ligation reaction solution (25 mM H
EPES, pH 7.8, 7.5 mM MgCl 2 , 0.2 mM ATP, 6 mM DTT) and reacted with 3 units of T4 DNA ligase at 20 ° C for 16 hours,
10 μl of which was used to transform E. coli strain RRI 1
Transformants resistant to 00 μg / ml ampicillin were selected.
Subblocks 3-6 and 3-8 and oligonucleotide L5 in Figure 3
And U5 were ligated to each other, and the transformant of the gene in which the 5'end was cleaved with the restriction enzyme HpaI was used as RRI / pSCT1, subblock 3-5.
The transformant of the gene in which 3 and 7 were ligated was named RRI / pSCT2.

組み替えプラスミドpSCT1はサケカルシトニンの遺伝子
を有し、組み替えプラスミドpSCT2はサケカルシトニン
の前駆体の遺伝子を有する。Recombinant plasmid pSCT1 has the gene for salmon calcitonin, and recombinant plasmid pSCT2 has the gene for salmon calcitonin precursor.

組み替えプラスミドpSCT1、pSCT2は末端がアミド化され
ていないサケカルシトニンのペプチド、及びカルシトニ
ンの前駆体のペプチドをＮ蛋白との雑種蛋白として発現
する事が可能である。The recombinant plasmids pSCT1 and pSCT2 are capable of expressing a peptide of salmon calcitonin whose terminal is not amidated and a peptide of a precursor of calcitonin as a hybrid protein with N protein.

人工合成サケカルシトニン遺伝子の塩基配列の確認 上記形質転換株のプラスミド中のサケカルシトニン遺伝
子の塩基配列は次のようにして分析した。Confirmation of base sequence of artificially synthesized salmon calcitonin gene The base sequence of the salmon calcitonin gene in the plasmid of the above transformant was analyzed as follows.

すなわち、pSCT1、pSCT2の各プラスミドDNA15μｇを15
単位の制限酵素HpaIを用いて切断し、大腸菌アルカリフ
ォスファターゼにより５′末端を脱リン酸化した後γ
〔32p〕ATP及びポリヌクレオチドキナーゼを用いて５′
末端を32pラベルした。次に15単位の制限酵素BamH1を用
いて分解後目的とするDNA断片を精製し、マクサム、ギ
ルバート法により塩基配列を決定した（第７〜14図参
照）。That is, 15 μg of each pSCT1 and pSCT2 plasmid DNA was
Cleavage with the unit restriction enzyme HpaI and dephosphorylation of the 5'end with E. coli alkaline phosphatase
5'using [32p] ATP and polynucleotide kinase
The end was labeled with 32p. Next, the target DNA fragment was purified after digestion with 15 units of restriction enzyme BamH1 and the nucleotide sequence was determined by Maxam-Gilbert method (see FIGS. 7 to 14).

その結果、すべてのプラスミドは設計通りの塩基配列を
有していた。但しpSCT1とpSCT2は制限酵素Cla1の認識配
列を有しながらも、ClaIで切断されなかった。As a result, all the plasmids had the designed nucleotide sequences. However, although pSCT1 and pSCT2 had a recognition sequence for the restriction enzyme Cla1, they were not cleaved by ClaI.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第1A、及び1B図は、この発明に従って設計された、サケ
カルシトニン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及び
その周辺部分を含む）の全体図であり； 第２図は、従来技術に従って設計されたサケカルシトニ
ン及びその前駆体の遺伝子（構造遺伝子及びその周辺部
分を含む）の全体図であり； 第３図は、サケカルシトニン及びその前駆体遺伝子の合
成過程で使用したサブブロックの構成図であって、●印
は酵素によるリン酸基の付加を示し； 第４図は、方式（Ｉ）に従って、サブブロック3-5と3-7
とからサケカルシトニン前駆体遺伝子が生成することを
確認するラジオオートグラム図であり； 第５図は、従来技術の手法に従ってサブブロックを作製
し、これを集合、連結してカルシトニン前駆体遺伝子を
合成する工程を示し； 第６図は、出発プラスミドpHT2と、この発明の遺伝子CT
1、又はCT2から組換プラスミドpSCT1、又はpSCT2を造成
する場合の工程図であり；そして、 第７〜14図は、マキサム・ギルバート法による塩基配列
の決定を示す電気泳動図である。1A and 1B are general views of the genes of salmon calcitonin and its precursor (including the structural gene and its peripheral portion) designed according to the present invention; and FIG. 2 is designed according to the prior art. FIG. 1 is a general view of a gene of salmon calcitonin and its precursor (including a structural gene and its peripheral portion); FIG. 3 is a block diagram of sub-blocks used in the process of synthesizing salmon calcitonin and its precursor gene. , ● indicates addition of phosphate group by enzyme; FIG. 4 shows sub-blocks 3-5 and 3-7 according to scheme (I).
Fig. 5 is a radioautogram diagram for confirming that the salmon calcitonin precursor gene is produced; Fig. 5 shows that subblocks are prepared according to the method of the prior art, and these are assembled and linked to synthesize the calcitonin precursor gene. FIG. 6 shows the starting plasmid pHT2 and the gene CT of the present invention.
FIG. 1 is a process chart in the case of constructing a recombinant plasmid pSCT1 or pSCT2 from 1 or CT2; and FIGS. 7 to 14 are electrophoretograms showing the determination of the nucleotide sequence by the Maxam-Gilbert method.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 7/36 8318−4Ｈ (72)発明者 碇 貴臣 神奈川県相模原市西大沼４−４―１ (72)発明者 成島 裕之 神奈川県相模原市西大沼４−４―１ (72)発明者 斎藤 あけみ 神奈川県横浜市緑区すすき野３−６―１― 303 (72)発明者 松本 礼子 神奈川県相模原市麻溝台2621 (56)参考文献 特公 昭57−16977（ＪＰ，Ｂ２) 特公 昭53−1806（ＪＰ，Ｂ２) 特表 昭59−501096（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−501097（ＪＰ，Ａ)─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Reference number within the agency FI Technical indication location C07K 7/36 8318-4H (72) Inventor Takaomi Ikari 4-4-1 Nishionuma, Sagamihara City, Kanagawa Prefecture (72) Inventor Hiroyuki Narushima 4-4-1 Nishionuma, Sagamihara City, Kanagawa Prefecture (72) Inventor Akemi Saito 3-6-1-303, Susukino, Midori-ku, Yokohama City, Kanagawa Prefecture (72) Reiko Matsumoto Sagamihara City, Kanagawa Prefecture Asamizodai 2621 (56) References JP 57-16977 (JP, B2) JP 53-1806 (JP, B2) JP 59-501096 (JP, A) JP 59-501097 (JP, A) )

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子。1. The following nucleotide sequence: Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
A structural gene encoding salmon calcitonin or a precursor thereof consisting of TX (X is absent or represents -GGT). 【請求項２】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子の製造方法であって、（１）該構造遺伝子の塩基配列
の部分を構成する複数のオリゴヌクレオチドフラグメン
トを合成し、（２）該フラグメントを連結することによ
って複数のサブブロックを作製し、（３）該サブブロッ
クを連結する段階を含んで成る方法。2. The following nucleotide sequence: Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
A method for producing a structural gene encoding salmon calcitonin or a precursor thereof comprising TX (X is absent or represents -GGT), comprising: (1) a plurality of nucleotides constituting the base sequence of the structural gene; Synthesizing the oligonucleotide fragment of, and (2) making a plurality of subblocks by ligating the fragments, and (3) ligating the subblocks. 【請求項３】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子を含有するプラスミド。[Claim 3] The following nucleotide sequence: Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
A plasmid containing a structural gene encoding salmon calcitonin or a precursor thereof consisting of TX (X is absent or represents -GGT). 【請求項４】pSCT1又はpSCT2である特許請求の範囲第３
項記載のプラスミド。4. A third claim which is pSCT1 or pSCT2.
The plasmid according to the item. 【請求項５】次の塩基配列： 正鎖:TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
T-X （Ｘは、存在しないか、又は−GGTを表わす）から成る
サケカルシトニン又はその前駆体をコードする構造遺伝
子を含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌。5. The following nucleotide sequence: Positive chain: TGCTCCAATCTCTCTACTTGCGTTCTGGGGAAGTTGAGTCAGGAA
TTACATAAGCTGCAAACTTACCCGCGTACCAACACTGGTTCTGGTACACC
E. coli transformed with a plasmid containing a structural gene encoding salmon calcitonin or a precursor thereof consisting of TX (X is absent or represents -GGT). 【請求項６】RRI/pSCT1（FERM-P No7774）、又はRRI/pS
CT2（FERM-BP No866）である特許請求の範囲第５項記載
の大腸菌。6. RRI / pSCT1 (FERM-P No7774) or RRI / pS
The Escherichia coli according to claim 5, which is CT2 (FERM-BP No866).
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