JP2527681B2 - HPCT gene - Google Patents
HPCT geneInfo
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Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はC末端がアミド化されて
−CONH2 基となっているペプチドの前駆体を製造す
るのに用いることのできる遺伝子、それが挿入されたプ
ラスミドおよびそのプラスミドで形質転換された単細胞
生物または動物細胞に関する。The present invention relates to a gene which can be used for producing a precursor of a peptide having a C-terminal amidated group to give a -CONH 2 group, a plasmid having the gene inserted therein and a plasmid thereof. It relates to a transformed unicellular organism or animal cell.
【0002】[0002]
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】C末端が
アミド化されたペプチドには薬理的に活性なものがあ
り、たとえばカルシトニンはC末端がアミド型になった
32個のアミノ酸残基からなるペプチドであるが、高カ
ルシウム症,骨粗鬆症,骨ベーゼット病の治療や骨形成
促進のために用いられている。そしてアミド型のC末端
構造は活性発現に必須であるとされている。2. Description of the Prior Art Some C-terminal amidated peptides are pharmacologically active. For example, calcitonin consists of 32 amino acid residues whose C-terminal is amide type. It is used as a peptide for the treatment of hypercalcemia, osteoporosis, bone-Bezette's disease and promotion of bone formation. The amide type C-terminal structure is said to be essential for activity expression.
【0003】現在までにカルシトニンはブタ,ウシ,ヒ
ツジ,ヒト,ラット,サケ,ウナギから分離され、それ
ぞれ構造が明かにされ、そのうちヒト,ウナギ,ブタ,
サケのカルシトニンが治療用として市販されている。こ
れらは生体から抽出されたか、または化学合成されたも
のであるが、生体内のカルシトニン含有量は低く、また
合成は困難である。To date, calcitonin has been isolated from pigs, cows, sheep, humans, rats, salmon, and eels, and the structure of each has been clarified. Among them, humans, eels, pigs,
Salmon calcitonin is commercially available for therapeutic use. These are extracted from the living body or chemically synthesized, but the calcitonin content in the living body is low, and the synthesis is difficult.
【0004】本発明者らは遺伝子操作技術を利用して大
量かつ安価にカルシトニンを製造することを意図した
が、現在の遺伝子操作技術によってはC末端アミド型の
ペプチドを造ることはできない。The present inventors intended to produce calcitonin in large quantities and at low cost by utilizing gene manipulation techniques, but C-terminal amide type peptides cannot be produced by the current gene manipulation techniques.
【0005】[0005]
【課題を解決するための手段】ところが、アミド化され
るべきアミノ酸の後にグリシン(Gly)、続いてリジ
ン(Lys)やアルギニン(Arg)のような塩基性ア
ミノ酸を2個以上付加した前駆体は薬理的に活性である
ことを知った。その理由はおそらく生体内で酵素作用に
より前駆体が切断,修飾されてC末端アミド化ペプチド
が生成するためではないかと考えられる。[Means for Solving the Problems] However, a precursor obtained by adding two or more basic amino acids such as glycine (Gly) and then lysine (Lys) or arginine (Arg) after the amino acid to be amidated is I knew it was pharmacologically active. It is considered that the reason is probably that the precursor is cleaved and modified by an enzymatic action in vivo to generate a C-terminal amidated peptide.
【0006】本発明はこの新しい知見に基くもので、そ
の一部は、次の式The present invention is based on this new finding, part of which is expressed by the following formula:
【化2】 Embedded image
【0007】上記の前駆体は後述する方法によって製造
できる。The above precursor can be produced by the method described below.
【0008】この遺伝子のヌクレオチド配列の最初にメ
チオニンのコドンを、末端に翻訳終止コドンを付すのが
好ましく、さらに好ましくはさらにその両端に制限酵素
で切断される配列、たとえば上流(5′側)にEcoR
I、下流(3′側)にBamHI切断部位、を付加す
る。[0008] It is preferable to add a methionine codon at the beginning of the nucleotide sequence of this gene and a translation stop codon at the end, and more preferably, a sequence to be cleaved with a restriction enzyme at both ends thereof, for example, upstream (5 'side). EcoR
I, BamHI cleavage site is added downstream (3 'side).
【0009】また、ヌクレオチド配列の中に一つ以上の
制限酵素切断部位、たとえばRsaI,KpnI,Sm
aI,XmaI切断点を設けてもよい。遺伝子の二重鎖
DNAのデザインの好ましい例は図2に示される。該遺
伝子の化学合成は、先ず図3に示されるF1〜F20の
20個のDNAフラグメントを固相法(Miyosh
i,K.Nucl Acid.Res.,8,550
7,1980)を用いて合成し、リガーゼ反応によって
これらのフラグメントから二重鎖DNAを得ることによ
り行われる。In addition, one or more restriction enzyme cleavage sites such as RsaI, KpnI, Sm in the nucleotide sequence.
You may provide an aI and XmaI cutting point. A preferred example of double-stranded DNA design for a gene is shown in FIG. For the chemical synthesis of the gene, first, the 20 DNA fragments F1 to F20 shown in FIG. 3 were subjected to the solid phase method (Miyosh).
i, K. Nucl Acid. Res. , 8 , 550
7, 1980) and obtain double-stranded DNA from these fragments by a ligase reaction.
【0010】本発明の一部は、前記の遺伝子を含むDN
Aが挿入された単細胞生物または動物細胞由来のプラス
ミドまたは雑種プラスミドである。Part of the present invention is a DN containing the above gene.
A is a plasmid or hybrid plasmid derived from a unicellular organism or animal cell in which A is inserted.
【0011】その態様としては、単細胞生物、たとえば
細菌,酵母,糸状菌などの微生物,動物細胞,たとえば
サル腎細胞などに由来するプロモーター領域を含むオペ
ロンの構造遺伝子(例.APaseやβ−ガラクトシダ
ーゼ)に上記の遺伝子を読みとりフレームが合うように
連結させたプラスミドが挙げられる。好ましい例は図6
に示されたpAHPCT38である。もしくは図6に示
されたpHPCT4でもよい。pHPCT4はPKO1
3(特願昭56−163303号明細書参照)のEco
RI,BamHI切断点に前記の化学合成遺伝子を挿入
することによって得られ、pAHPCT38はエシエリ
シア・コリのアルカリ性フオスフアターゼ(APas
e)遺伝子をもつPBR322由来のプラスミドpAα
NE1(特開昭58−71894号公報参照)のEco
RI,BamHI切断点に前記の化学合成遺伝子を挿入
することによって得られる。As an embodiment, a structural gene of an operon (eg, APase or β-galactosidase) containing a promoter region derived from a unicellular organism, for example, a microorganism such as bacteria, yeast, filamentous fungi, or an animal cell, for example, monkey kidney cells. And a plasmid in which the above genes are read and ligated so that the frames match each other. A preferred example is FIG.
PAHPCT38 shown in FIG. Alternatively, the pHPCT4 shown in FIG. 6 may be used. pHPCT4 is PKO1
3 (see Japanese Patent Application No. 56-163303)
RI, BamHI was obtained by inserting the above-mentioned chemically synthesized gene at the breakpoint, and pAHPCT38 was an alkaline phosphatase (APas) of Escherichia coli.
e) PBR322-derived plasmid pAα carrying the gene
Eco of NE1 (see Japanese Patent Laid-Open No. 58-71894)
It can be obtained by inserting the above-mentioned chemically synthesized gene at RI and BamHI breakpoints.
【0012】本発明の一部は、上記のプラスミドで形質
転換された単細胞生物または動物細胞である。Part of the present invention is a unicellular or animal cell transformed with the above plasmid.
【0013】その一態様として、プラスミドpHPCT
4をエシエリシア・コリK12WA802株に形質転換
して形質転換株WA802/pHPCTを得、またpA
HPCT38をエシエリシア・コリK12・E15株に
形質転換して形質転換株E15/pAHPCTを得るこ
とができた。In one embodiment, the plasmid pHPCT
4 into Escherichia coli K12WA802 strain to obtain a transformed strain WA802 / pHPCT.
HPCT38 was transformed into the Escherichia coli K12 / E15 strain to obtain the transformed strain E15 / pAHPCT.
【0014】E15/pAHPCT38株はSBMC1
38の識別表示を付して工業技術院微生物工業研究所に
寄託され、受託番号微工研菌寄第6523号を付され、
その後国際寄託に移管されて受託番号微工研条寄第28
3号を付されている。E15 / pAHPCT38 strain is SBMC1
It was deposited at the Institute of Microbiology, Institute of Industrial Science and Technology with the identification number of 38, and was given the deposit number, Micro Engineering Research Institute No. 6523,
After that, it was transferred to an international deposit and the deposit number is Micromachine Research Institute Article 28.
No. 3 is attached.
【0015】5′末側にMetに対するコードを付加し
た前記式(I)のペプチドのアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列とそれに続いて翻訳終止をコードする
ヌクレオチド配列を有する遺伝子を組み込んだプラスミ
ドにより形質転換した宿主細胞を培養し、培養物中に蛋
白成分として上記のペプチドを生成させることができ
る。Transformation with a plasmid incorporating a gene having a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the peptide of the above formula (I) having a code for Met added to the 5'-terminal side, and subsequently, a nucleotide sequence encoding a translation termination. The above-described peptide can be produced as a protein component in the culture by culturing the host cell.
【0016】形質転換した宿主細胞の一例は前記のE1
5/pAHPCTである。この例について培養を説明す
ると、たとえば、先ず高リン酸含有培地で培養し次いで
低リン酸培地に移すことによりAPaseの誘導を行う
と菌体中に所望のペプチド前駆体が蛋白成分として生成
する。An example of transformed host cells is E1 described above.
5 / pAHPCT. To explain the culture in this example, for example, when the APase is induced by first culturing in a high-phosphate-containing medium and then transferring to a low-phosphate medium, a desired peptide precursor is produced in the cells as a protein component.
【0017】培養の好ましい操作,条件はプラスミドお
よび宿主細胞の種類に応じて選択される。ついで培養物
から菌体を分離し、ギ酸一臭化シアン処理を経て、たと
えば、SP−セファデックス・カラムでピリジン−酢酸
緩衝液を用いる濃度勾配溶出分画を行い、所望のペプチ
ドを含む分画を集めてHPLCを行って精製することが
できる。The preferable operation and conditions for culture are selected depending on the type of plasmid and host cell. Then, the cells were separated from the culture, treated with formate cyanogen monobromide, and then subjected to concentration gradient elution fractionation using a pyridine-acetic acid buffer on an SP-Sephadex column to obtain a fraction containing the desired peptide. Can be collected and purified by HPLC.
【0018】かくして得られるC末端アミド化ペプチド
前駆体はC末端アミド化ペプチドと同様の活性を示し
た。たとえば図1上方に示される前駆体(以下HPCT
と略称する)はラット血中のカルシウム濃度を強く降下
させ、カルシトニン活性を示した。The C-terminal amidated peptide precursor thus obtained exhibited the same activity as the C-terminal amidated peptide. For example, the precursor shown below in FIG.
Abbreviated as), strongly reduced calcium concentration in rat blood and exhibited calcitonin activity.
【0019】以下、ヒトカルシトニンのMet8 をVa
lで置き換えたカルシトニンの前駆体をHPCTと略称
する。In the following, human calcitonin Met 8 is Va
The calcitonin precursor replaced by 1 is abbreviated as HPCT.
【0020】[0020]
実施例 HPCT遺伝子フラグメントの化学合成 図3に示した、それぞれF1〜F20と名付けた20個
のオリゴデオキシリボヌクレオチドの化学合成は、以下
に述べる改良を除いては、基本的にはKen−ichi
Miyoshi等により報告されている固相法〔Ke
n−ichiMiyoshi et al(1980)
NuCl・Acids,Res.85507〕を用い
た。Example Chemical Synthesis of HPCT Gene Fragment The chemical synthesis of 20 oligodeoxyribonucleotides, designated F1 to F20, respectively, shown in FIG. 3, is basically Ken-ichi except for the improvements described below.
Solid-phase method [Ke reported by Miyashi et al.
n-ichi Miyashi et al (1980)
NuCl Acids, Res. 8 5507] was used.
【0021】この改良技術によるオリゴデオキシリボヌ
クレオチドの化学合成の概略は以下のごとくである。 a) まず図4に示す様にアミノメチル化ポリスチレン
樹脂に3′末端モノヌクレオシド.ユニットを固定化す
ることからはじめた。すなわち図4に示したアミノメチ
ル化ポリスチレン樹脂は1%ジビニルベンゼンで架橋
した樹脂を用い、この樹脂にβ−アラニンを2個連結し
た樹脂を合成した。The outline of the chemical synthesis of oligodeoxyribonucleotides by this improved technique is as follows. a) First, as shown in FIG. 4, a 3'-terminal mononucleoside was added to an aminomethylated polystyrene resin. We started by fixing the unit. That is, as the aminomethylated polystyrene resin shown in FIG. 4, a resin crosslinked with 1% divinylbenzene was used, and a resin in which two β-alanines were linked to each other was synthesized.
【0022】この樹脂に3種類(Bはチミン、N−ベン
ゾイルシトシン又はN−イソブチリルグアニン)の化合
物を作用させることにより、3種類の3′末端ヌクレ
オシドを樹脂に固定化したポリスチレン樹脂を得た。By reacting three kinds of compounds (B is thymine, N-benzoylcytosine or N-isobutyrylguanine) with this resin, a polystyrene resin having three kinds of 3'-terminal nucleosides immobilized on the resin is obtained. It was
【0023】この樹脂の合成法の例を図4中Bはチミ
ンの場合について示せば次の通りである。An example of the method of synthesizing this resin is as follows when B in FIG. 4 is shown for thymine.
【0024】アミノメチル化ポリスチレン.HCl(ジ
ビニルベンゼン1%、100〜200メッシュ,N
H2 :0.63mmole/g)樹脂15gをCH2 C
l2 75mlでよく膨潤させた後、N−t−BOC−β
−アラニン(1.01g,11.34mmole)を加
え、DCC(2.34g,11.34mmole)を用
いて室温3時間縮合した。樹脂をガラスフィルターでろ
別した後、CH2 Cl2 150mlで4回、DMF15
0mlで4回、次いでピリジン150mlで4回洗浄し
た。次に樹脂を25%の無水酢酸−ピリジン75mlで
30分処理することにより未反応アミノ基をアセチル化
した。次に樹脂を20%CF3 COOH−CH2 Cl2
90mlで室温25分処理することによりt−BOC基
を除去、次いで5%トリエチルアミン−CH2 Cl2 1
50mlで樹脂を洗浄し、さらにCH 2 Cl2 150m
lで4回樹脂を洗った。同様の操作をもう一度くり返す
ことにより、図4の樹脂すなわち、アミノメチル化ポ
リスチレン樹脂にβ−アラニンが2個連結した樹脂を得
た。ここで得た樹脂(図4)5gをDMF30mlに
けんだくし、図4化合物(BはN−チミン)5mmo
leとトリエチルアミン500mgを加え室温12時間
振盪した。反応後、樹脂をガラスフィルターを用いてろ
別し、DMF、続いてピリジンで洗浄した。次に樹脂を
10%フェニルイソシアナートピリジン75mlで3時
間処理することにより、未反応アミノ基を保護し、続い
て樹脂をピリジン,メタノールで洗った後、P2 O5 存
在下、減圧乾燥することにより、図4樹脂(Bはチミ
ン)を得た。Aminomethylated polystyrene. HCl (di
Vinylbenzene 1%, 100-200 mesh, N
H2: 0.63 mmole / g) CH resin 15 g2C
l2After swelling well with 75 ml, Nt-BOC-β
-Add alanine (1.01 g, 11.34 mmole)
Well, use DCC (2.34 g, 11.34 mmole)
And allowed to condense at room temperature for 3 hours. Filter the resin through a glass filter
After separating, CH2Cl2Four times with 150 ml, DMF15
Wash 4 times with 0 ml, then 4 times with 150 ml pyridine
Was. The resin is then treated with 75 ml of 25% acetic anhydride-pyridine.
Acetylation of unreacted amino groups by treatment for 30 minutes
did. Next, add 20% CF resin3COOH-CH2Cl2
By treating with 90 ml at room temperature for 25 minutes, t-BOC group
Removed, then 5% triethylamine-CH2Cl21
Wash the resin with 50 ml and then CH 2Cl2150m
The resin was washed 4 times with 1. Repeat the same operation again
Therefore, the resin of FIG.
A resin in which two β-alanines are linked to a styrene resin is obtained.
Was. 5 g of the resin (Fig. 4) obtained here was added to 30 ml of DMF.
Kendakushi, Figure 4 compound (B is N-thymine) 5mmo
le and 500 mg of triethylamine are added, and room temperature is 12 hours.
Shaken. After the reaction, filter the resin using a glass filter.
Separated and washed with DMF followed by pyridine. Then resin
3 hours with 75 ml of 10% phenyl isocyanate pyridine
The unreacted amino group is protected by
After washing the resin with pyridine and methanol,2OFiveExistence
Figure 4 resin (B is the
Got).
【0025】ここで得られた樹脂(図4、Bはチミ
ン)の一部を〔M.J.Gait et al.(19
80)NuCl.A cids Res.8 108
1〕を用いて樹脂1gに固定化されている3′末端ヌク
レオサイドの量を定量したところ、0.153mmol
eであった。樹脂(BはN−ベンゾイルシトミン又は
N−イソブチルグアニン)も上記合成法と同様な方法で
製造した。樹脂の1gに固定化されている3′末端ヌ
クレオシドの量は樹脂4(BはN−ベンゾイルシトミ
ン)で0.150mmole、樹脂4(BはN−イソブ
チルグアニン)で0.147mmoleであった。A part of the resin obtained here (FIG. 4, B is thymine) is a part of [M. J. Gait et al. (19
80) NuCl. A cids Res. 8 108
1] was used to quantify the amount of the 3'-terminal nucleoside immobilized on 1 g of the resin.
It was e. A resin (B is N-benzoylcytomine or N-isobutylguanine) was also produced by the same method as the above-mentioned synthetic method. The amount of 3'-terminal nucleoside immobilized on 1 g of the resin was 0.150 mmole for resin 4 (B is N-benzoylcytomine) and 0.147 mmole for resin 4 (B is N-isobutylguanine).
【0026】b) ここで得られた3種類の樹脂と図
5に示した3′燐酸ジエステルダイマーブロック(図5
nは0)及び3′燐酸ジエステルトリマーブロック(図
5nは1)を用い、一定の塩基配列を持ったF1〜F2
0からなる20個のオリゴデオキシリボヌクレオチドを
合成した。即ち、樹脂のジメトキシトリチル基(以上
DMTrと略)を2%ベンゼンスルホン酸CHCl3 −
MeOH7=3v/vで処理することによりDMTr基
を除去した後、樹脂に固定化されている3′ヌクレオ
シドユニット1当量に対し、3′燐酸ジエステルダイマ
ー(図5nは0)4当量、又は3′燐酸ジエステルトリ
マー(図5、nは1)3当量を逐次、縮合剤メシチレン
スルホニルテトラゾリド(MsTe)20〜50当量を
用いて縮合した。過剰の3′燐酸ジエステルブロック及
び縮合剤は、ガラスフィルターで反応混合物をろ化する
ことにより容易に除去することができる。B) The three kinds of resins obtained here and the 3'phosphoric acid diester dimer block shown in FIG. 5 (FIG. 5)
n is 0) and 3 ′ phosphodiester trimer block (1 in FIG. 5n) is used, and F1 to F2 having a constant base sequence are used.
20 oligodeoxyribonucleotides consisting of 0 were synthesized. That is, the dimethoxytrityl group of the resin (abbreviated as DMTr above) was replaced with 2% benzenesulfonic acid CHCl 3 −.
After removing the DMTr group by treatment with MeOH7 = 3 v / v, 4 equivalents of 3'phosphodiester dimer (0 in FIG. 5n) or 3'to 1 equivalent of 3'nucleoside unit immobilized on the resin. 3 equivalents of phosphoric acid diester trimer (FIG. 5, n is 1) were sequentially condensed using 20 to 50 equivalents of the condensing agent mesitylenesulfonyl tetrazolide (MsTe). Excess 3'phosphate diester block and condensing agent can be easily removed by filtering the reaction mixture through a glass filter.
【0027】次に未反応5′水酸基を保護する為に、樹
脂を10%無水酢酸−ピリジンで室温1時間処理するこ
とにより、未反応5′水酸基をアセチル化した。次に樹
脂を2%ベンゼンスルホン酸(CHCl3 −MeOH,
7:3v/v)で処理することにより5′末端DMTr
基を除去し、次の縮合反応を行なった。このような操作
を所望の長さが得られるまでくり返した。Next, in order to protect the unreacted 5'hydroxyl group, the resin was treated with 10% acetic anhydride-pyridine at room temperature for 1 hour to acetylate the unreacted 5'hydroxyl group. The resin was then treated with 2% benzene sulfonic acid (CHCl 3 -MeOH,
7: 3 v / v) to treat the 5'end DMTr
The group was removed and the following condensation reaction was performed. This operation was repeated until the desired length was obtained.
【0028】この一連の操作の例をF3フラグメントの
合成について示せば次の通りである。図4樹脂(B−
N−ベンゾイルシトシン)200mgを2%ベンゼンス
ルホン酸(CHCl3 −MeOH7:3v/v)(以下
2%BSAと略)20mlで室温1分、2回処理するこ
とにより樹脂のDMTr基を除去した樹脂を得た。
この樹脂に3′燐酸トリマーブロック、GAG,(図
5、n=1、B1 はN−イソブチリルグアニン、B2 は
N−ベンゾイルアデニン、B3 はN−イソブチリルグア
ニン)90μmoleを加えピリジン3mlと3回共沸
をくり返した後、ピリジン2mlを加え、縮合剤MsT
e 1mmoleを用いて室温2時間縮合反応を行っ
た。反応後、過剰の3′燐酸トリマー及び縮合剤は反応
混合物をガラスフィルターを用いてろ過した後、得られ
る樹脂をピリジンでよく洗うことにより容易に除去でき
る。次に、未反応5′水酸基を保護する為に樹脂を10
%無水酢酸−ピリジン20mlにけんだくさせ室温で1
時間振盪した。反応後、樹脂をグラスフィルターを用い
てろ別し、ピリジン、続いてCHCl3 でよく洗う。次
に樹脂を2%BSA(CHCl3 :MeOH,7:3v
/v)20mlで1分、2回処理することにより樹脂よ
りDMTr基を除去した。次に樹脂をCHCl3次いで
ピリジンでよく洗った後、同様にして所望の長さが得ら
れるまでブロック縮合を繰り返した。すなわちF3 のオ
リゴデオキシリボヌクレオチドを合成する為には、ひき
つづき次の3′燐酸ブロック、CCT,AA,GGT,
を順次用い、縮合反応をくり返すことによりF3の塩基
配列をもつ完全保護したオリゴデオキシリボヌクレオチ
ド樹脂を得た。同様にして他のフラグメントF1,F2
及びF4〜F20の各フラグメントもヌクレオチドの組
合せを変えるほかは上記と同様な方法を用いて製造し
た。An example of this series of operations is as follows for the synthesis of the F3 fragment. Fig. 4 Resin (B-
Resin in which DMTr group of resin was removed by treating 200 mg of N-benzoylcytosine) with 20 ml of 2% benzenesulfonic acid (CHCl 3 -MeOH 7: 3 v / v) (hereinafter abbreviated as 2% BSA) at room temperature for 1 minute twice. Got
To this resin was added 90 μmole of 3'phosphate trimer block, GAG, (FIG. 5, n = 1, B 1 is N-isobutyrylguanine, B 2 is N-benzoyladenine, B 3 is N-isobutyrylguanine). After repeating azeotropic distillation with 3 ml of pyridine 3 times, 2 ml of pyridine was added, and the condensing agent MsT was added.
A condensation reaction was performed at room temperature for 2 hours using e 1 mmole. After the reaction, the excess 3'phosphate trimer and the condensing agent can be easily removed by filtering the reaction mixture with a glass filter and washing the resulting resin well with pyridine. Next, to protect the unreacted 5'hydroxyl group, 10
% Acetic anhydride-Pyridine 20 ml at room temperature
Shake for hours. After the reaction, the resin is filtered off using a glass filter, and washed thoroughly with pyridine and then with CHCl 3 . The resin was then loaded with 2% BSA (CHCl 3 : MeOH, 7: 3 v
/ V) The DMTr group was removed from the resin by treatment with 20 ml for 1 minute and twice. The resin was then washed well with CHCl 3 and then pyridine, and block condensation was repeated in the same manner until the desired length was obtained. That is, in order to synthesize the oligodeoxyribonucleotide of F 3, the following 3'phosphate block, CCT, AA, GGT,
Was successively used to repeat the condensation reaction to obtain a completely protected oligodeoxyribonucleotide resin having the base sequence of F3. Similarly, other fragments F1 and F2
And F4 to F20 fragments were also prepared by the same method as above except that the nucleotide combination was changed.
【0029】c) この様にして得た一定の塩基配列を
もって完全保護したオリゴデオキシリボヌクレオチドの
樹脂からの切り出し及び完全脱保護反応は、樹脂を濃ア
ンモニア水−ピリジン(2:1v/v)で55℃10時
間、つづいて80%酢酸で室温10分処理することによ
り得た。C) Cleavage of the oligodeoxyribonucleotide completely protected with a certain base sequence thus obtained from the resin and the complete deprotection reaction, the resin was treated with concentrated aqueous ammonia-pyridine (2: 1 v / v) to 55%. It was obtained by treating at 10 ° C. for 10 hours and then at room temperature for 10 minutes with 80% acetic acid.
【0030】この脱保護反応条件をフラグメントF3 に
ついて記せば次のごとくである。フラグメントF3の樹
脂50mgをピリジン1mlと濃アンモニア水2mlで
封管中55℃、10時間振盪した後、樹脂をろ別、ろ液
を減圧下濃縮する。得られた残渣にトルエンを加え共沸
をくり返すことにより、ピリジンを除く。次に、残渣に
80%酢酸2mlを加え、室温10分処理することによ
り、完全脱保護した、オリゴデオキシリボヌクレオチド
を得た。The deprotection reaction conditions for the fragment F 3 are as follows. 50 mg of the resin of fragment F3 was shaken in 1 ml of pyridine and 2 ml of concentrated aqueous ammonia in a sealed tube at 55 ° C. for 10 hours, the resin was filtered off, and the filtrate was concentrated under reduced pressure. Toluene is added to the obtained residue and azeotropic distillation is repeated to remove pyridine. Next, 2% of 80% acetic acid was added to the residue, and the mixture was treated at room temperature for 10 minutes to obtain a completely deprotected oligodeoxyribonucleotide.
【0031】d) 最終産物の分離,精製は高性能液体
クロマトグラフィー(HPLC)を用いて行なった。こ
のHPLCはALTEXmodel110A液体クロマ
トグラフィを使用し、溶媒A(0.005M,KH2 P
O4 ,pH4.0)と溶媒B(0.05M,KH2 PO
4 −1.0M KCl,pH4.0)による直線濃度勾
配法を用い、パーマフェイズAAX(デュポン)カラム
(0.21×50cm)で化合物を分離,精製した。溶
媒Aから開始し、1分毎に3%の溶媒Bを加えることに
より、勾配をつけた。溶出は58℃で1分当たり2ml
の流速で行なった。目的とするピークのものを集め、透
析により脱塩し、凍結乾燥した。この様にして得られた
各フラグメントはさらに、溶媒A(0.01Mエチレン
ジアミン酢酸/2.5%アセトニトリルpH7.0)と
溶媒B(0.01Mエチレンジミン酢酸/25%アセト
ニトリルpH7.0)による直線濃度勾配法を用い、μ
−BondapakC18カラム(0.4×25cm)
で化合物をさらに精製した。溶媒Aから開始し、1分毎
に3%の溶媒Bを加えることにより、勾配をつけた。溶
出は室温で1分当たり2mlの流速で行なった。目的と
するピークのものを集め、凍結乾燥することにより、F
1 〜F20の20個のDNAフラグメントを得た。D) Separation and purification of the final product was carried out using high performance liquid chromatography (HPLC). This HPLC uses ALTEX model 110A liquid chromatography and uses solvent A (0.005M, KH 2 P
O 4 , pH 4.0 and solvent B (0.05M, KH 2 PO)
The compound was separated and purified on a Permaphase AAX (DuPont) column (0.21 × 50 cm) using a linear concentration gradient method with 4-1.0 M KCl, pH 4.0). A gradient was applied starting with solvent A and adding 3% solvent B every minute. Elution is 2 ml per minute at 58 ° C
At a flow rate of The target peak was collected, desalted by dialysis, and freeze-dried. Each fragment thus obtained was further linearized with solvent A (0.01 M ethylenediamine acetic acid / 2.5% acetonitrile pH 7.0) and solvent B (0.01 M ethylenedimine acetic acid / 25% acetonitrile pH 7.0). Using the concentration gradient method, μ
-Bondapak C18 column (0.4 x 25 cm)
The compound was further purified by. A gradient was applied starting with solvent A and adding 3% solvent B every minute. Elution was performed at room temperature with a flow rate of 2 ml per minute. By collecting the peaks of interest and freeze-drying,
20 DNA fragments of 1 to F 20 were obtained.
【0032】e) この様にして得たF1〜F20の2
0個の完全脱保護したオリゴデオキシリボヌクレオチド
の均一性(homogeneity)はT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを用い〔γ−32P〕ATPで5′末端を
標識した後、20%ポリアクリルアミドゲルによる電気
泳動によりチェックした。又、各々のオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの塩基配列は、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用い、〔γ−32P〕ATPで5′末端を標識し
た後、ヌクレアーゼを用いて部分水解したものを、セル
ローズアセテートを用いるpH3.5の電気泳動と、D
EAE−セルローズによるホモクロマトグラフィーを行
なって得られる二次元マッピング法で確認した。〔Ba
mbara,J,E,et al.(1974)NuC
l.Acids.Res.1 331〕.E) 2 of F1 to F20 thus obtained
The homogeneity of 0 fully deprotected oligodeoxyribonucleotides was checked by electrophoresis on a 20% polyacrylamide gel after labeling the 5'end with [γ- 32 P] ATP using T4 polynucleotide kinase. . The base sequence of each oligodeoxyribonucleotide was T4 polynucleotide kinase, 5 ′ end was labeled with [γ- 32 P] ATP, and then partially hydrolyzed with nuclease to obtain pH3 using cellulose acetate. .5 electrophoresis and D
It was confirmed by a two-dimensional mapping method obtained by performing homochromatography with EAE-cellulose. [Ba
mbara, J, E, et al. (1974) NuC
l. Acids. Res. 1 331].
【0033】HPCT遺伝子フラグメントのリゲーショ
ン 化学合成した18のオリゴヌクレオチドフラグメント
(F2〜F19,図3参照)の5′末端をリン酸化した
後、これにF1,F20のフラグメントを加えアニーリ
ングさせ、T4DNAリガーゼを用い結合させ、122
塩基対からなるHPCTに相当する遺伝子を合成した。
以下詳細に示す。Ligation of HPCT gene fragment After chemically phosphorylating the 5'end of 18 chemically synthesized oligonucleotide fragments (F2 to F19, see FIG. 3), the fragments of F1 and F20 were added and annealed to obtain T4 DNA ligase. 122 and
A gene corresponding to HPCT consisting of base pairs was synthesized.
Details are shown below.
【0034】F1とF20を除く18フラグメントそれ
ぞれ4.2μgを22μlの蒸留水に溶解し、90℃で
2分間加熱し、直ちに0℃に冷却した。この水溶液に1
0μCiのr〔32P〕ATP(5100Ci/mmo
l)を加え、溶液を50mMトリス塩酸,pH9.6,
10mM MgCl2 ,2mMスパーミン,100mM
KCl,10mMDTT(オリゴヌクレオチドキナーゼ
緩衝液)となる様に調整し、3単位のポリヌクレオチド
キナーゼを加え全容量を30μlとした。37℃で15
分間反応することにより5末端を32Pでラベルした。次
にすべての5末端をリン酸化する為に4nmolのAT
Pと3単位のポリヌクレオチドキナーゼを加え、37℃
で45分間反応させ、90℃で5分間加熱することによ
り反応を止めた。上記のリン酸化したF2からF19の
18フラグメント及びリン酸化していないF1及びF2
0をそれぞれ2.1μgを混合し、透析チーユブに入
れ、蒸留水に対して4℃で16時間透析し、未反応AT
P及びキナーゼ緩衝液成分を除いた。この透析したDN
A溶液を濃縮乾固し、14.5μlのリガーゼ緩衝液
(20mMトリス塩酸,pH7.6,10mM MgC
l2 )に溶解した。この溶液を0.5ml容エツペンド
ルフチユーブに入れ95℃で2分間加熱し、その後ゆっ
くりと温度を下降させ(30分間で室温まで下げる)2
0フラグメントをアニールした後、0℃に置いた。この
DNA溶液を0.4mMのATP,10mMのDTTを
含むリガーゼ緩衝溶液としT4DNAリガーゼ30単位
を加え、全容量を80μlとし、11℃で16時間反応
させた。反応溶液を一部取り出し8%ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で検討した。ゲルは7M尿素の含んだも
のと含まないものの2種類を用い、電気泳動を行った後
ラジオオートグラフで反応物の検討をした。その結果1
22塩基対に相当するDNAが約20%の割合で結合し
ていた(図11,12参照)。次に上記の反応溶液全量
を8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
た。ラジオオートグラフにより、122塩基対DNAを
確認したのち、その部分のゲル片を切り出し、透析チュ
ーブに入れ、9mMトリスホウ酸(pH8.3),0.
25mM EDTA緩衝液を満たし、シールした後同緩
衝液中で200Vの定電圧で3時間電気泳動することに
よりゲル中のDNAを溶出させた。次にDNA溶液を透
析チューブより取り出し、凍結乾燥した。乾固物を10
0μlの0.3M酢酸ナトリウム(pH7.0)に溶解
後2.5倍量のエタノールを加え、−80℃に30分間
放置し、遠心分離によりDNA沈澱を回収した。得られ
たDNAをキナーゼ緩衝液30μlに溶解し、6単位の
ポリヌクレオチドキナーゼ,0.8nmolATPを加
え、37℃で1時間反応を行った。反応終了後、3μl
の3M酢酸ナトリウムを加えた後、2.5倍量のエタノ
ールを加えてDNAを沈澱させ約2μgの122塩基対
に相当するHPCT遺伝子を得た。4.2 μg of each of the 18 fragments except F1 and F20 was dissolved in 22 μl of distilled water, heated at 90 ° C. for 2 minutes, and immediately cooled to 0 ° C. 1 in this aqueous solution
0 μCi of r [ 32 P] ATP (5100 Ci / mmo
l) was added and the solution was added to 50 mM Tris-HCl, pH 9.6.
10 mM MgCl 2 , 2 mM spermine, 100 mM
After adjusting to KCl, 10 mM DTT (oligonucleotide kinase buffer), 3 units of polynucleotide kinase was added to make the total volume 30 μl. 15 at 37 ° C
By reacting for 5 minutes, the 5 terminal was labeled with 32 P. Then 4 nmol of AT to phosphorylate all 5 ends
Add P and 3 units of polynucleotide kinase at 37 ℃
At 45 ° C. for 45 minutes, and the reaction was stopped by heating at 90 ° C. for 5 minutes. 18 fragments of the above phosphorylated F2 to F19 and unphosphorylated F1 and F2
2.1 μg of each of 0 was mixed and placed in a dialysis tube and dialyzed against distilled water at 4 ° C. for 16 hours to obtain unreacted AT.
P and kinase buffer components were removed. This dialyzed DN
The A solution was concentrated to dryness and 14.5 μl of ligase buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgC
I 2 ). This solution was placed in a 0.5 ml volume Eppendorf tube and heated at 95 ° C. for 2 minutes, and then the temperature was slowly lowered (reduced to room temperature in 30 minutes). 2
The 0 fragment was annealed and then placed at 0 ° C. This DNA solution was used as a ligase buffer solution containing 0.4 mM ATP and 10 mM DTT, 30 units of T4 DNA ligase was added to make the total volume 80 μl, and the reaction was carried out at 11 ° C. for 16 hours. A part of the reaction solution was taken out and examined by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. Two types of gel were used, one containing 7 M urea and the other not containing 7 M urea. After electrophoresis, the reaction products were examined by radio autograph. As a result 1
DNA corresponding to 22 base pairs was bound at a rate of about 20% (see FIGS. 11 and 12). Next, the total amount of the above reaction solution was separated by 8% polyacrylamide gel electrophoresis. After confirming 122 base pair DNA by radio autograph, a gel piece of the portion was cut out and placed in a dialysis tube, and 9 mM tris borate (pH 8.3), 0.
DNA in the gel was eluted by filling with 25 mM EDTA buffer and sealing, followed by electrophoresis in the same buffer at a constant voltage of 200 V for 3 hours. Next, the DNA solution was taken out from the dialysis tube and freeze-dried. 10 dry matter
After dissolving in 0 μl of 0.3 M sodium acetate (pH 7.0), 2.5 times amount of ethanol was added, the mixture was left at −80 ° C. for 30 minutes, and the DNA precipitate was collected by centrifugation. The obtained DNA was dissolved in 30 μl of kinase buffer, 6 units of polynucleotide kinase and 0.8 nmol ATP were added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 1 hour. 3 μl after reaction
After the addition of 3 M sodium acetate, the DNA was precipitated by adding 2.5 times the amount of ethanol to obtain about 2 μg of HPCT gene corresponding to 122 base pairs.
【0035】組み換えプラスミドの造成 図6はHPCT遺伝子を含む組み換えプラスミドを造成
する方法を示したものであり、これについて以下に詳述
する。Construction of Recombinant Plasmid FIG. 6 shows a method for constructing a recombinant plasmid containing the HPCT gene, which will be described in detail below.
【0036】(A)プラスミドpHPCTの造成 プラスミドpKO13の造成法は、特願昭56−163
303号明細書に明記されている通りである。プラスミ
ドpKO13は大腸菌ラクトースオペロンのプロモータ
ー領域からほとんどのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持
ったプラスミドであり、EcoRI,BamHI制限酵
素切断部位をそれぞれ一ケ所有しており、化学的又は天
然より得たEcoRI,BamHIの粘着部位(coh
esive end)を持つ遺伝子をプラスミドpKO
13に容易に導入することができる。さらにラクトース
プロモーターの支配下にEcoRI制限酵素切断部位下
流に組み込まれた遺伝子をβ−ガラクトシダーゼとの雑
種蛋白として発現させ、臭化シアン分解後、目的とする
ペプチドを分離精製することが可能である。(A) Construction of plasmid pHPCT The construction method of plasmid pKO13 is described in Japanese Patent Application No. 56-163.
As specified in No. 303 specification. The plasmid pKO13 is a plasmid having most of the β-galactosidase gene from the promoter region of the Escherichia coli lactose operon, possesses one EcoRI and BamHI restriction enzyme cleavage site, respectively, and has the EcoRI and BamHI of chemically or naturally obtained. Adhesive site (coh
The gene carrying the active end) is transformed into the plasmid pKO
13 can be easily introduced. Furthermore, under the control of the lactose promoter, a gene incorporated downstream of the EcoRI restriction enzyme cleavage site can be expressed as a hybrid protein with β-galactosidase, and after decomposition with cyanogen bromide, the desired peptide can be separated and purified.
【0037】そこでpKO13の5μgを40μlの1
XTA反応液(33mMトリス酢酸緩衝液pH7.6,
66mM酢酸カリウム,10mM酢酸マグネシウムおよ
び0.5mM ジチオスレイトール)中で制限酵素Ec
oRI,BamHI各々1単位ずつ加え37℃,60分
間反応を行った。反応液を65℃30分間加熱して酵素
を不活性化した後、0.7%アガロースゲル電気泳動を
行い、大きいDNA断片を電気泳動法により回収した。
このようにして得たpKO13のEcoRI,BamH
I断片DNA/μgと先に得た5′−OH末端をリン酸
化したHPCT遺伝子0.6μgをT4DNAライゲー
ション反応液40μl(20mMトリス塩酸緩衝液,p
H7.6,10mM MgCl2 ,10mMDTT,
0.4mMATP)に溶解し、T4DNAリガーゼ2単
位と5℃16時間、反応させた。反応液に2.5倍量の
冷エタノールを加え、DNAを沈澱として得た。このD
NA沈澱を15μlの蒸留水に溶解し、その10μlを
E.Coli菌株WA802への形質転換をした。形質
転換株はアンピシリン40μg/mlを含む栄養寒天培
地に37℃で一夜培養後生じたコロニーを10μg/m
lのテトラサイクリンを含む栄養寒天培地にレプリカし
て、テトラサイクリン感受性コロニーを選択した。アン
ピミリン耐性,テトラサイクリン感受性の形質転換株に
ついてWA802/pHPCT/〜WA802/pHP
CT5と命名した。このうち菌株WA802/pHPC
T4より得られた小さなEcoRI,BamHIフラグ
メントのDNA塩基配列を後記するように分析した結
果、pHPCT4プラスミドは目的のHPCT遺伝子の
DNA塩基配列を持っていることを確認した。このWA
802/pHPCT4菌内でHPCTはラクトースプロ
モーターの支配下にβ−ガラクトシダーゼ−HPCTの
雑種蛋白として発現され、生じた雑種蛋白より臭化シア
ンのメチオニン分解反応により、HPCTは完全な目的
とするペプチドとして分離できる。しかしながらβ−ガ
ラクトシダーゼ蛋白中にはメチオニンが23残基存在す
る為臭化シアン分解の際、不要の夾雑ペプチドが多数生
成され、目的のペプチドの分離精製が困難となる欠点を
有している。そこで我々は上記の欠点を改良したベクタ
ーとして、大腸菌アルカリ性フオスフアターゼ遺伝子を
用いたプラスミドを開発し、その有用性を証明した(特
願昭56−170543号)。従ってHPCTペプチド
を大腸菌より分離精製を行うには、アルカリ性フオスフ
アターゼ遺伝子を用いたプラスミドにHPCT遺伝子を
再度組み換えたプラスミドを造成する方が好ましいと考
え、以下のプラスミドの造成を行った。Then, 5 μg of pKO13 was added to 40 μl of 1
XTA reaction solution (33 mM Tris acetate buffer pH 7.6,
Restriction enzyme Ec in 66 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate and 0.5 mM dithiothreitol)
1 unit each of oRI and BamHI was added, and the reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes. After the reaction solution was heated at 65 ° C. for 30 minutes to inactivate the enzyme, 0.7% agarose gel electrophoresis was performed, and a large DNA fragment was recovered by the electrophoresis method.
EcoRI and BamH of pKO13 thus obtained
I fragment DNA / μg and 0.6 μg of the previously obtained 5′-OH-phosphorylated HPCT gene were added to 40 μl of T4 DNA ligation reaction solution (20 mM Tris-HCl buffer, p
H7.6, 10 mM MgCl 2 , 10 mM DTT,
It was dissolved in 0.4 mM ATP) and reacted with 2 units of T4 DNA ligase at 5 ° C. for 16 hours. 2.5 volumes of cold ethanol was added to the reaction solution to obtain DNA as a precipitate. This D
The NA precipitate was dissolved in 15 μl of distilled water, and 10 μl of which was dissolved in E. E. coli strain WA802 was transformed. The transformant was 10 μg / m 2 of a colony formed after overnight culture at 37 ° C. on a nutrient agar medium containing 40 μg / ml of ampicillin.
A tetracycline-sensitive colony was selected by replicating on a nutrient agar medium containing 1 tetracycline. Transformants resistant to ampimiline and sensitive to tetracycline WA802 / pHPCT / ~ WA802 / pHP
It was named CT5. Of these, strain WA802 / pHPC
As a result of analyzing the DNA base sequence of the small EcoRI, BamHI fragment obtained from T4 as described below, it was confirmed that the pHPCT4 plasmid had the DNA base sequence of the desired HPCT gene. This WA
In 802 / pHPCT4 bacteria, HPCT is expressed as a β-galactosidase-HPCT hybrid protein under the control of the lactose promoter, and HPCT is separated from the resulting hybrid protein by the methionine decomposition reaction of cyanogen bromide as a complete target peptide. it can. However, since there are 23 residues of methionine in the β-galactosidase protein, a large number of unwanted contaminating peptides are produced during the decomposition of cyanogen bromide, which makes it difficult to separate and purify the desired peptide. Therefore, we have developed a plasmid using the Escherichia coli alkaline phosphatase gene as a vector to improve the above-mentioned drawbacks and proved its usefulness (Japanese Patent Application No. 56-170543). Therefore, in order to isolate and purify the HPCT peptide from Escherichia coli, it was considered preferable to construct a plasmid in which the HPCT gene was recombined with a plasmid using the alkaline phosphatase gene, and the following plasmid was constructed.
【0038】なお、上記形質転換株のプラスミド中のH
PCT塩基配列は次のようにして分析した。 HPCT塩基配列 pHPCT1,pHPCT2,pHPCT3,pHPC
T4の各プラスミドDNA150μgを200単位の制
限酵素EcoRI及び200単位の制限酵素SalIを
用いて分解し、PHCT遺伝子を含む約400塩基対の
DNA断片を分離精製した。次にバクテリアアルカリホ
スフアターゼにより5′末端を脱リン酸した後、γ−〔
32P〕ATP及びポリヌクレオキーゼを用いて5′末端
を32Pラベルした。次に100単位の制限酵素BamH
Iを用いて分解後122塩基対DNA断片を分離精製
し、Maxam−Gilbert法により塩基配列を決
定(Proc.Nat.Acad.Sci.USA.7
4,560−564,1977)した。その結果pHC
T1を除きすべて最初のデザイン通りの塩基配列を有し
ていた。pHCT1はHPCTの17番のアミノ酸であ
るアスパラギンに相当するコドン(AAC)の3番目が
CからTに変換していた。しかしコドンAATもアスパ
ラギンに対応するものである。H in the plasmid of the above transformant strain
The PCT base sequence was analyzed as follows. HPCT base sequence pHPCT1, pHPCT2, pHPCT3, pHPC
150 μg of each T4 plasmid DNA was digested with 200 units of restriction enzyme EcoRI and 200 units of restriction enzyme SalI to separate and purify a DNA fragment of about 400 base pairs containing the PHCT gene. Next, after dephosphorylating the 5'end with bacterial alkaline phosphatase, γ- [
The 5'end was 32 P-labeled with 32 P] ATP and polynucleokease. Next, 100 units of restriction enzyme BamH
The 122 base pair DNA fragment was separated and purified after degradation using I, and the base sequence was determined by the Maxam-Gilbert method (Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 7
4 , 560-564, 1977). As a result pHC
All had the same nucleotide sequence as originally designed except T1. In pHCT1, the third codon (AAC) corresponding to asparagine, which is the 17th amino acid of HPCT, was converted from C to T. However, the codon AAT also corresponds to asparagine.
【0039】(B)プラスミドpAHPCT38の造成 プラスミドpAαNE1の造成法は特願昭56−170
543号明細書に明記されている。pAαNE1は大腸
菌アルカリ性フオスフアターゼ構造遺伝子のEcoRI
制限酵素切断部位の下流にアルファ・ネオ・エンドルフ
ィン遺伝子を組み込んだプラスミドであり、アルカリ性
フオスフアターゼの発現調節支配下にアルカリ性フオス
フアターゼ−アルファ・ネオ・エンドルフィン雑種蛋白
を発現するベクターである。アルファ・ネオ・エンドル
フィン遺伝子の代わりにHPCT遺伝子を組み込んだプ
ラスミドpAHPCT38の造成法を以下に詳述する。(B) Construction of plasmid pAHPCT38 The construction method of plasmid pAαNE1 is described in Japanese Patent Application No. 56-170.
543. pAαNE1 is EcoRI of Escherichia coli alkaline phosphatase structural gene
It is a plasmid that incorporates the alpha neo-endorphin gene downstream of the restriction enzyme cleavage site, and is a vector that expresses the alkaline phosphatase-alpha neo neoendorphin hybrid protein under the control of expression control of alkaline phosphatase. The method for constructing the plasmid pAHPCT38 in which the HPCT gene is inserted in place of the alpha neo endorphin gene is described in detail below.
【0040】プラスミドpAαNE1 10μgを10
0μlの1XTA反応液中で制限酵素EcoRI 10
単位を用いて37℃30分間、部分的に切断した後、
0.7%アガロースゲル電気泳動を行い、1ケ所のみ、
EcoRIにより切断されたDNA断片をアガロースか
ら電気泳動法により回収した。回収したDNA断片を3
0μlの1XTA反応液中で制限酵素BamHI 5単
位用いて、37℃60分完全に切断した後、2.5倍量
の冷エタノールを加えて、DNAを沈澱させた。このD
NA沈澱物を30μlの蒸留水に溶解した。この制限酵
素EcoRI−BamHI切断DNA断片0.5μgと
制限酵素EcoRI−BamHIを用いてpHPCT4
より調整されたHPCT遺伝子DNA0.5μgを30
μlのT4DNAライゲーション反応液に溶解し、T4
DNAリガーゼ2単位を用いて、5℃,16時間、ライ
ゲーション反応を行った。反応液に2.5倍量の冷エタ
ノールを加え、DNAをエタノール沈澱として得た。D
NA沈澱に10μlの蒸留水を加え、溶解した後、大腸
菌E15(Hayashi et al.1964年
J.Biol.chem.239 3091)へ形質転
換した。形質転換株はアンピシリン40μg/mlを含
む栄養寒天培地に37℃一夜培養した。得られたアンピ
シリン耐性株72株について、プラスミドの制限酵素S
maI切断部位の有無について調べた。その結果3株
が、HPCT遺伝子内のSmaI切断部位を持っている
プラスミドであることが判り、その中の1株をE15/
pAHPCT38と命名し、次のHPCTペプチドの分
離精製に使用した。10 μg of plasmid pAαNE1 was added to 10
Restriction enzyme EcoRI 10 in 0 μl of 1 × TA reaction solution
After partially cutting with the unit at 37 ° C for 30 minutes,
Perform 0.7% agarose gel electrophoresis and
The DNA fragment cleaved with EcoRI was recovered from agarose by electrophoresis. 3 DNA fragments collected
After complete digestion with 5 units of the restriction enzyme BamHI in 0 μl of 1 × TA reaction solution at 37 ° C. for 60 minutes, 2.5 volumes of cold ethanol was added to precipitate the DNA. This D
The NA precipitate was dissolved in 30 μl of distilled water. PHPCT4 was prepared by using 0.5 μg of this restriction enzyme EcoRI-BamHI-cut DNA fragment and the restriction enzyme EcoRI-BamHI.
30 μg of 0.5 μg of HPCT gene DNA
Dissolve in T1 DNA ligation reaction solution
A ligation reaction was carried out using 2 units of DNA ligase at 5 ° C. for 16 hours. 2.5 volumes of cold ethanol was added to the reaction solution to obtain DNA as an ethanol precipitate. D
After adding 10 μl of distilled water to the NA precipitate to dissolve it, E. coli E15 (Hayashi et al. 1964 J. Biol. Chem. 239 3091) was transformed. The transformant was cultured overnight at 37 ° C. on a nutrient agar medium containing 40 μg / ml of ampicillin. Regarding the obtained 72 ampicillin-resistant strains, the restriction enzyme S of the plasmid
The presence or absence of the maI cleavage site was examined. As a result, it was found that 3 strains were plasmids having a SmaI cleavage site in the HPCT gene, and one strain among them was E15 /
It was named pAHPCT38 and used for the subsequent separation and purification of the HPCT peptide.
【0041】なお、上記のエシエリシア・コリE15/
pAHPCT38はSBMC138の表示を付して、工
業技術院微生物工業研究所に寄託され、受託番号微工研
菌寄第6523号を付され、その後国際寄託に移管され
て受託番号微工研条寄第283号を付された。The above Escherichia coli E15 /
pAHPCT38 was attached to the Institute of Microbiology, Institute of Industrial Science, with the label SBMC138, and was given the deposit number: Microindustrial Research Institute of Microbiology No. 6523, then transferred to the international deposit, and the deposit number: No. 283 was attached.
【0042】ヒトカルシトニン前駆体のE.ColiE
15/pAHPCT38からの精製E.Coli E1
5/pAHPCT38中でHPCT遺伝子はアルカリ性
フオスフアターゼ構造遺伝子中に挿入されている。この
ためHPCTは、アルカリ性フオスフアターゼとの雑種
蛋白として発現されるはずである。しかし最初のHPC
T遺伝子のデザインに示した如く、HPCTのアミノ酸
末端部位にメチオニンを挿入することにより、このアル
カリ性フオスフアターゼとHPCTの雑種蛋白を臭化シ
アンで開裂することにより容易にHPCTを得ることが
できる。そこで以下に詳述する方法でE.coli K
12E15/pAHPCT38よりHPCTの分離精製
を行った。猶、E.coli K12E15/pAHP
CT38菌株の培養法、並びにアルカリ性フオスフアタ
ーゼ−HPCT雑種蛋白の誘導法は、特願昭56−17
0543号明細書に記載された方法に従って行った。菌
株E.coli E15/pAHPCT38をアンピシ
リン40μg/μlを含むTG+20(高リン酸培地)
100mlで37℃16時間培養後、10lのTG+1
(低リン酸培地)に接種し、37℃でさらに24時間培
養を行った。連続遠心により菌体を 菌し、2.36g
の湿菌体が得られた。この湿菌体に500mgの臭化シ
アンを含む70%ギ酸溶液20mlを加え、懸濁し、室
温で24時間暗所に放置した。The human calcitonin precursor E. ColiE
Purification from E. 15 / pAHPCT38 Eli E1
In 5 / pAHPCT38, the HPCT gene is inserted into the alkaline phosphatase structural gene. Therefore, HPCT should be expressed as a hybrid protein with alkaline phosphatase. But the first HPC
As shown in the T gene design, by inserting methionine at the amino acid terminal site of HPCT, HPCT can be easily obtained by cleaving the hybrid protein of alkaline phosphatase and HPCT with cyanogen bromide. Therefore, the E. coli K
HPCT was separated and purified from 12E15 / pAHPCT38. Grace, E. coli K12E15 / pAHP
The method for culturing the CT38 strain and the method for inducing the alkaline phosphatase-HPCT hybrid protein are described in Japanese Patent Application No. 56-17.
It was carried out according to the method described in the specification of 0543. Strain E. E. coli E15 / pAHPCT38 TG + 20 containing 40 μg / μl of ampicillin (high phosphate medium)
After culturing in 100 ml at 37 ° C for 16 hours, 10 l of TG + 1
(Low-phosphate medium) and inoculated at 37 ° C. for 24 hours. Incubate the cells by continuous centrifugation to 2.36g
Wet cells were obtained. 20 ml of a 70% formic acid solution containing 500 mg of cyanogen bromide was added to the wet cells, and the suspension was suspended and left at room temperature for 24 hours in the dark.
【0043】HPCTの、菌株E.coli E15/
pAHPCT1からの精製 菌体のブロムシアン反応液を凍結乾燥し、60mlの蒸
留水を加たのち、約1時間室温で超音波処理を行なっ
た。こうして得た懸濁液を遠心分離し(10,000r
pm.15分)上澄液を残し、沈澱物に蒸留水30ml
を加え再度超音波処理後遠心分離して、上澄液を先のも
のと合わせて90ml得た。この溶液に蒸留水10ml
を加えて100mlとし、SP−セファデックスC−2
5のカラム(1.4×20cm)にかけた。カラムはあ
らかじめ0.025M酢酸で平衡化しておき、サンプル
をカラムに供した後230mlの同じ酢酸溶液で洗い、
つづいて1.5%ピリジン−酢酸緩衝液−以下PA緩衝
液と略称−(pH4.47)200ml、2.5%pA
緩衝液(pH4.65)160mlで洗浄した。次に
2.5%pA緩衝液(pH4.65)60mlと3.7
5%pA緩衝液(pH4.76)60mlを用いた直線
濃度勾配による溶出、つづいて後者緩衝液60mlでの
溶出を行ない、さらに3.75%pA緩衝液(pH4.
76)160mlと、5.0%pA緩衝液(pH4.8
7)160mlを用いた直線濃度勾配による溶出を行な
って、溶出液を6mlづつ分取した。分画は数本おき
に、その一部100μlをHPLCを用いて分析した
(HPLCの条件は後述)。HPLCから得られた主な
各ピークに相当する分画を、乾固後0.1%フェノール
を含む6N塩酸150mlに溶かし110℃24時間加
水分解した。分解物は蒸発乾固させたのちアミノ酸分析
を行なって(日立#835−50型アミノ酸分析機使
用)、HPCTのカラムからの溶出状況をモニターし
た。HPCT strain E. coli E15 /
Purification from pAHPCT1 The Bromcian reaction solution of the cells was freeze-dried, 60 ml of distilled water was added, and then ultrasonication was performed at room temperature for about 1 hour. The suspension thus obtained is centrifuged (10,000 r
pm. 15 minutes) 30 ml of distilled water was added to the precipitate, leaving the supernatant.
Was sonicated again and centrifuged to obtain 90 ml of the supernatant together with the previous one. 10 ml of distilled water in this solution
To 100 ml and add SP-Sephadex C-2
5 columns (1.4 x 20 cm) were applied. The column was equilibrated with 0.025M acetic acid in advance, the sample was applied to the column, and then washed with 230 ml of the same acetic acid solution.
Subsequently, 1.5% pyridine-acetic acid buffer-abbreviated as PA buffer below- (pH 4.47) 200 ml, 2.5% pA
It was washed with 160 ml of a buffer solution (pH 4.65). Next, 60 ml of 2.5% pA buffer (pH 4.65) and 3.7
Elution was performed with a linear concentration gradient using 60 ml of 5% pA buffer (pH 4.76), followed by elution with 60 ml of the latter buffer, and then 3.75% pA buffer (pH 4.76).
76) 160 ml and 5.0% pA buffer (pH 4.8)
7) Elution was performed with a linear concentration gradient using 160 ml, and the eluate was collected in 6 ml portions. Every several fractions, 100 μl of each fraction was analyzed using HPLC (HPLC conditions are described later). Fractions corresponding to each main peak obtained from HPLC were dried and dissolved in 150 ml of 6N hydrochloric acid containing 0.1% phenol and hydrolyzed at 110 ° C. for 24 hours. The decomposed products were evaporated to dryness and then analyzed for amino acids (using Hitachi # 835-50 type amino acid analyzer) to monitor the elution status from the HPCT column.
【0044】この結果、2.5%から3.75%の濃度
勾配溶出分画(合計120ml)、3.75%の溶出分
画(60ml)のすべて、および3.75%から5.0
%の濃度勾配溶出分画の内の最初の10分画(60m
l)に、HPCTの存在が確認された。As a result, 2.5% to 3.75% gradient elution fractions (total 120 ml), all 3.75% elution fractions (60 ml), and 3.75% to 5.0%.
The first 10 of the gradient elution fractions (60 m
The presence of HPCT was confirmed in l).
【0045】これらのHPCTを含む分画を集めて凍結
乾燥し、HPLCによる精製を次に行った。上記乾固物
を、8.0mlの0.1N酢酸に溶解し、その内の10
0−300μlづつをμ−Bondapak C18
(ウオーターズ)0.39×30cmカラムを用いて精
製した。溶出は、10%アセトニトリルを含む0.1%
トリフルオロ酢酸と、50%アセトニトリルを含む0.
1%トリフルオロ酢酸による直線濃度勾配を用いて行な
い210nmのUV波長でモニターした。図7の典型的
なクロマトグラムに示すように、HPCTに相当するピ
ークを明瞭に検出することができる。このピークを含む
分画を分取し、更にもう一度同じ条件でのHPLCを行
ない(図8)、純粋なHPTCを2.15mg(0.5
6μmol)得ることができた。Fractions containing these HPCT were collected, lyophilized and then purified by HPLC. The dried solid was dissolved in 8.0 ml of 0.1N acetic acid, and 10 of
0-300 μl each of μ-Bondapak C18
(Waters) 0.39 × 30 cm column was used for purification. Elution is 0.1% with 10% acetonitrile
Trifluoroacetic acid and 50% acetonitrile in 0.
A linear gradient with 1% trifluoroacetic acid was used and monitored at a UV wavelength of 210 nm. As shown in the typical chromatogram of FIG. 7, the peak corresponding to HPCT can be clearly detected. Fractions containing this peak were collected and further subjected to HPLC under the same conditions (FIG. 8) to obtain 2.15 mg (0.5) of pure HPTC.
6 μmol) could be obtained.
【0046】HPCTの構造確認 HPCTのアミノ酸組成は、HPCTを減圧封管中0.
1%フェノール含有6N塩酸を用いて、110℃で2
4,48,72時間加水分解したもののアミノ酸分析の
結果、およびHPCTを常法に従い(1)過ギ酸酸化し
たものを6N塩酸110℃、24時間加水分解後のアミ
ノ酸分析の結果から決定した(表1)。HPCT過ギ酸
酸化物のアミノ酸配列分析は、エドマン分解法(2)を
用いて行なったところ、アミノ末端から15番目までの
配列を決定することができた(図9)。つづいてHPC
T全体のアミノ酸配列を決定するために、HPCTをト
リプシン分解しペプチド断片を得ることを試みた。Confirmation of structure of HPCT The amino acid composition of HPCT was found to be 0.
2% at 110 ° C with 6N hydrochloric acid containing 1% phenol
It was determined from the result of amino acid analysis of the product hydrolyzed for 4,48,72 hours, and the result of amino acid analysis after hydrolyzing HPCT according to a conventional method (1) formic acid oxidation of 6N hydrochloric acid at 110 ° C. for 24 hours. 1). When the amino acid sequence analysis of HPCT performance oxide was carried out using the Edman degradation method (2), the sequence from the amino terminus to the 15th position could be determined (FIG. 9). HPC
In order to determine the amino acid sequence of the entire T, we tried tryptic digestion of HPCT to obtain a peptide fragment.
【0047】HPCT160μgを0.1N PA緩衝
液(pH7.80)300μlに懸濁し30分間超音波
処理したのち、TPCK処理した(3)トリプシン溶液
(1mg/ml)を10μl加え、37℃で2時間放置
した。反応溶液を凍結乾燥後400μlの0.1N酢酸
に溶解してHPLCに供した。HPLCの条件は、HP
CT精製の際に用いた条件と全く同一で、210nmの
UV波長でモニターしたクロマトグラムは図10に示し
たようなパターンを示し、各ピークT1 ,T2,T3 の
アミノ酸組成からT1 はHPCTの19番目のアミノ酸
から34番目のアミノ酸までのペプチド、T2 はアミノ
末端から18番目までのペプチド、更にT3 は、アミノ
末端から34番目までのペプチドであることが推定され
た(表1)。After 160 μg of HPCT was suspended in 300 μl of 0.1 N PA buffer (pH 7.80) and sonicated for 30 minutes, 10 μl of TPCK-treated (3) trypsin solution (1 mg / ml) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 2 hours. I left it. The reaction solution was freeze-dried, dissolved in 400 μl of 0.1N acetic acid and subjected to HPLC. HPLC conditions are HP
The chromatogram monitored at a UV wavelength of 210 nm was exactly the same as the conditions used for CT purification, and showed a pattern as shown in FIG. 10. From the amino acid composition of each peak T 1 , T 2 , T 3 , T 1 Was estimated to be a peptide from the 19th amino acid to the 34th amino acid of HPCT, T 2 was a peptide from the amino terminus to the 18th, and T 3 was a peptide from the amino terminus to the 34th. 1).
【0048】なお、上記(1),(2),(3)におい
て参照する文献を次に示す。 (1)C.H.W.Hirs,“Method in
Enzymology”,Academic Pres
s,New York,Vol.11,P.197(1
967) (2)J.P.Van Eerd et.al.,Bi
ochemistry,15,1171(1976) (3)S.−S.Wang et.al.,J.Bio
l.Chem.,240,1619(1965)The documents referred to in the above (1), (2) and (3) are shown below. (1) C.I. H. W. Hirs, "Method in
Enzymology ”, Academic Pres
s, New York, Vol. 11, P.I. 197 (1
967) (2) J. P. Van Eerd et. al. , Bi
Chemistry, 15 , 1171 (1976) (3) S. -S. Wang et. al. , J. et al. Bio
l. Chem. , 240 , 1619 (1965)
【0049】つづいてT1 および過ギ酸酸化したT2 を
使ってアミノ酸配列分析を行なった(図9)。さらにH
PCTあるいはT1 ,T2 のカルボキシル末端部分のア
ミノ酸配列分析を、カルボキシペプチダーゼ法(T.I
sobeら,J.Mol.Biol.,102,349
(1976))を用いて行ない、カルボキシル末端分析
を、ヒドラジン分解法(A.Tsug:taら,Pro
c.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.46.
1462(1960))を用いて行なった(図9)。以
上の結果より、HPCTのアミノ酸配列を、図9のとお
り決定した。Subsequently, amino acid sequence analysis was performed using T 1 and T 2 which had been subjected to peroxidic acid oxidation (FIG. 9). Further H
Amino acid sequence analysis of the carboxyl terminal portion of PCT or T 1 and T 2 was carried out by the carboxypeptidase method (T.I.
sobe et al. Mol. Biol. , 102 , 349
(1976)) to carry out a carboxyl terminal analysis by a hydrazine decomposition method (A. Tsug: ta et al., Pro.
c. Nat. Acad. Sci. , U.S. S. A. 46 .
1462 (1960)) (FIG. 9). From the above results, the amino acid sequence of HPCT was determined as shown in FIG.
【0050】HPCTのカルボキシペプチダーゼを用い
た分解物HPCT−Cp(1−33)の精製 HPCT 500μgを0.1N PA緩衝液(pH
7.80)300μlに懸濁し、1時間超音波処理した
のちカルボキシペプチダーゼB溶液(0.67mg/m
l)を7.5μl加えて37℃で6時間放置した。遊離
するアミノ酸(リジン2モルとアルギニン1モル)をア
ミノ酸分析でチェックしたのち、反応溶液は凍結乾燥し
0.1酢酸500μlに溶解して、HPLCを用いて精
製した。HPLCの条件は、HPTC精製に用いた条件
と同一で、クロマトグラムは210nmのUV波長でモ
ニターした。このようにして精製したペプチドは、アミ
ノ酸分析により、HPCTのアミノ末端から33番目の
アミノ酸までのペプチド、HPCT・Cp(1−33)
であることを確認した(表1)。更にこのアミノ酸分析
の結果から求めた収量は302μgで、収率は68%で
あった。Purification of degradation product HPCT-Cp (1-33) using carboxypeptidase of HPCT 500 μg of HPCT was added to 0.1 N PA buffer (pH).
7.80) Suspended in 300 μl, sonicated for 1 hour and then carboxypeptidase B solution (0.67 mg / m 2
l) was added in an amount of 7.5 μl and left at 37 ° C. for 6 hours. After checking the released amino acids (2 mol of lysine and 1 mol of arginine) by amino acid analysis, the reaction solution was freeze-dried, dissolved in 500 μl of 0.1 acetic acid, and purified using HPLC. The HPLC conditions were the same as those used for HPTC purification, and the chromatogram was monitored at a UV wavelength of 210 nm. By the amino acid analysis, the peptide purified in this way was identified as HPPT-Cp (1-33), a peptide from the amino terminus of HPCT to the 33rd amino acid.
Was confirmed (Table 1). Furthermore, the yield determined from the results of this amino acid analysis was 302 μg, and the yield was 68%.
【0051】[0051]
【表1】 HPCT,T1 ,T2 ,HPCT−Cp(1−33)のアミノ酸組成 HPCT T1 T2 HPCT−Cp(1−33) ────────────────────────────────── CySO3 H 1.6 1.8 1.8 Asp 3.1 3.0 3.0 Thr 4.7 1.8 2.8 4.7 Ser 1.1 1.1 1.0 Glu 2.0 1.0 1.1 2.1 Pro 2.0 1.9 1.9 Gly 4.8 2.8 2.0 5 Ala 2.2 1.9 2.1 Val 1.9 1.0 1.0 2.0 Ile 1.1 1.0 1.1 Leu 2 1.9 2.0 Tyr 1.0 1.0 1.0 Phe 2.7 1.9 1.1 3.0 Lys 2.9 1 1 1.1 His 0.9 0.9 1.0 Arg 1.0 ──────────────────────────────── 36 16 18 33 表中、アンダラインした数値を基礎として他のアミノ酸
の組成値を算出した。Table 1 Amino acid composition of HPCT, T 1 , T 2 and HPCT-Cp (1-33) HPCT T 1 T 2 HPCT-Cp (1-33) ─────────────── ──────────────────── CySO 3 H 1.6 1.8 1.8 Asp 3.1 3.0 3.0 3.0 Thr 4.7 1.8 2 .8 4.7 Ser 1.1 1.1 1.1 Glu 2.0 1.0 1.1 2.1 Pro 2.0 1.9 1.9 Gly 4.8 2.8 2.0 5 Ala 2.2 1.9 2.1 Val 1.9 1.0 1.0 2.0 2.0 Ile 1.1 1.0 1.1 Leu 2 1.9 2.0 Tyr 1.0 1.0 1.0 1.0 Phe 2.7 1.9 1.1 3.0 Lys 2.9 1 1 1.1 His 0.9 0.9 0.9 1.0 Arg 1.0 ─────────────── ────── ──────────── 36 16 18 33 In the table, the composition values of other amino acids were calculated based on the underlined values.
【0052】HPCTの生物学的活性 前記の方法で精製したHPCTおよびHPCT・Cp
(1−33)の生物学的活性を、ラットにおける血清カ
ルシウム低下作用を指標として測定した。Biological activity of HPCT HPCT and HPCT · Cp purified by the above method
The biological activity of (1-33) was measured using the serum calcium lowering effect in rats as an index.
【0053】実験方法 体重300〜350グラムのウイスター系雄性ラットを
一夜絶食後エーテル麻酔下に背位に固定し、右側下肢の
下腿動脈にあらかじめ日本薬局方ヘパリンナトリウム注
射液(日本アップジョン)を満したポリエチレンチュー
ブ(INTRAMEDICR PE−50,Clay A
dams社)を挿入した。ついでポールマンケージにラ
ットを固定し、麻酔覚醒後30分に上述の下腿動脈に挿
入したポリエチレンチューブより血液0.5mlを50
単位のヘパリンナトリウムを含むポリエチレン製遠沈管
に採取した。ただちに、後述する生理食塩液、HPCT
液、HPCT・Cp(1−33)液あるいはブタカルシ
トニン液をラット1匹あたり0.2ml背部皮下に投与
し、投与後1,2,4および6時間目に前述のポリエチ
レンチューブを通して血液0.5mlを採取した。採取
した血液は、採取後すみやかにエッペンドルフ微量遠心
機(Eppendorf 5414)を用い毎分13,
000回転で1分間遠心し、上清を血清画分とした。Experimental method Male Wistar rats weighing 300 to 350 g were fasted overnight, fixed in the dorsal position under ether anesthesia, and the lower leg of the right leg was filled with sodium heparin sodium injection (Japan Upjohn) in advance. polyethylene tubing (INTRAMEDIC R PE-50, Clay A
dams). Then, the rat was fixed in a Pallman cage, and 30 minutes after the anesthesia was awakened, 0.5 ml of blood was added to 50 ml from a polyethylene tube inserted into the above-mentioned lower leg artery.
It was collected in a polyethylene centrifuge tube containing a unit of sodium heparin. Immediately afterwards, physiological saline solution, HPCT
Solution, HPCT-Cp (1-33) solution or porcine calcitonin solution was subcutaneously administered to the back of 0.2 ml per rat, and 0.5 ml of blood was passed through the polyethylene tube at 1, 2, 4 and 6 hours after the administration. Was collected. The collected blood was immediately collected with an Eppendorf microcentrifuge (Eppendorf 5414) at a rate of 13,
It was centrifuged at 000 rpm for 1 minute, and the supernatant was used as a serum fraction.
【0054】血清カルシウム濃度は、市販のカルシウム
測定用試液RM117−K(CaSET)(ヤトロン)
を使用し、o−クレゾールフタレインコンプレクソン
(OCPC)法により測定した。すなわち血清50μl
を試験管にとり、o−クレゾールフタレインコンプレク
ソンと8−ハイドロオキシキノリンを含む呈色試薬(R
M117−2)0.5mlを加えて攪拌する。ついでモ
ノエタノールアミンホウ酸緩衝液(RM117−1)
5.0mlを加えて攪拌し、90分以内に自記分光光度
計(日立製作所・320型)を使用して575mμの波
長で吸光度を測定した。カルシウム濃度は吸光度より計
算して求めた。実験に供した生理食塩液,HPCT液,
HPCT・Cp(1−33)液ならびにブタカルシトニ
ン液の調製法を以下に述べる。 a)生理食塩液:ウシ血清アルブミン(SIGMAR )
を日本薬局方生理食塩液(大塚製薬)に室温で溶解し、
アルブミン濃度が0.1%になるように調製した。 b)HPCT液:HPCTを上述のアルブミンを0.1
%含有する生理食塩液で稀釈し、溶液0.2ml中にH
PCT4.5μgを含むように調製した。 c)HPCT・Cp(1−33)液:HPCT・Cp
(1−33)を上述のアルブミンを0.1%含有する生
理食塩液で稀釈し、溶液0.2ml中にHPCT・Cp
(1−33)20μgを含むように調製した。 e)ブタカルシトニン液:1バイアル中にブタ起源のカ
ルシトニン160国際単位を含有するカルシタールR 注
射用(山之内製薬)を日本薬局方精製ゼラチン16%,
日本薬局方フェノール0.5%を含有する溶解液4.0
mlで溶解し、これを上述のアルブミンを0.1%含有
する生理食塩液で稀釈し、溶液0.2ml中にブタカル
シトニン0.2国際単位あるいは1国際単位を含むよう
に調製した。Serum calcium concentration is determined by a commercially available calcium measuring reagent RM117-K (CaSET) (Yatron).
Was measured by the o-cresolphthalein complexone (OCPC) method. Ie 50 μl of serum
In a test tube, and a coloring reagent containing R-compound of o-cresolphthalein and 8-hydroxyquinoline (R
Add 0.5 ml of M117-2) and stir. Then monoethanolamine borate buffer (RM117-1)
5.0 ml was added and stirred, and within 90 minutes, the absorbance was measured at a wavelength of 575 mμ using a self-recording spectrophotometer (Hitachi Model 320). The calcium concentration was calculated from the absorbance. Physiological saline solution, HPCT solution,
The method for preparing the HPCT-Cp (1-33) solution and the porcine calcitonin solution will be described below. a) Physiological saline: bovine serum albumin (SIGMA R )
Is dissolved in the Japanese Pharmacopoeia physiological saline solution (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) at room temperature,
The albumin concentration was adjusted to 0.1%. b) HPCT solution: HPCT was added to the above albumin at 0.1
% Saline solution and add 0.2 ml of H
It was prepared to contain 4.5 μg of PCT. c) HPCT / Cp (1-33) solution: HPCT / Cp
(1-33) was diluted with the physiological saline solution containing 0.1% of albumin described above, and HPCT / Cp was added to 0.2 ml of the solution.
It was prepared so as to contain 20 μg of (1-33). e) Porcine Calcitonin Solution: Calcitar R containing 160 international units of porcine-origin calcitonin in 1 vial (Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.), purified gelatin 16%,
Dissolution solution containing 0.5% of the Japanese Pharmacopoeia phenol 4.0
It was dissolved in ml, diluted with a physiological saline solution containing 0.1% of the above-mentioned albumin, and 0.2 ml or 1 international unit of porcine calcitonin was prepared in 0.2 ml of the solution.
【0055】実験成績 表2に実験成績を示す。4.5μgのHPCTを皮下投
与されたラットの血清カルシウム濃度は、投与後1およ
び2時間後に統計的に有意に減少した。HPCT投与後
の血清カルシウム濃度の時間的推移は、ブタカルシトニ
ン0.2国際単位を皮下投与されたラットの血清カルシ
ウム濃度の時間的推移にきわめて近く、本実験条件下に
おいてHPCT4.5μgは概ねブタカルシトニン0.
2国際単位に相当する活性を有するものと推察された。
一方、20μgのHPCT・Cp(1−33)を皮下投
与されたラットの血清カルシウム濃度は、投与1時間後
に統計的に有意に減少したが、投与後2時間以降は血清
カルシウム濃度降下作用はみられなかった。一般に天然
から見出されるC末端がアミド化されたペプチドに比べ
ると、C末端が遊離の状態になったペプチド(デスアミ
ドペプチド)はその生物学的活性において非常に低いこ
とが知られている。一方、本発明の実施例で示したHP
CT(Val3 ヒトカルシトニン前駆体)およびHPC
T・Cp(1−33)は表2に示したように、絶対的比
較はできないが、強い生理学的活性を有していることを
示唆している。さらにつけ加えるならば、カルシトニン
のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換やアミノ酸または
ペプチドの部分的除去に関する研究は多くなされている
が、本発明のようなペプチドを附加したものが活性を示
したという事実は全く知られていない。Experimental Results Table 2 shows the experimental results. The serum calcium concentration of the rat subcutaneously administered with 4.5 μg of HPCT was statistically significantly decreased 1 and 2 hours after the administration. The time course of serum calcium concentration after HPCT administration is very close to the time course of serum calcium concentration in rats subcutaneously administered with 0.2 international units of porcine calcitonin, and under the present experimental conditions, 4.5 μg of HPCT is generally porcine calcitonin. 0.
It was presumed to have activity equivalent to 2 international units.
On the other hand, the serum calcium concentration of rats subcutaneously administered with 20 μg of HPCT-Cp (1-33) decreased statistically significantly 1 hour after the administration, but the serum calcium concentration lowering effect was observed 2 hours after the administration. I couldn't do it. It is known that a peptide having a free C-terminal (desamido peptide) has a very low biological activity as compared with a peptide generally found in nature and having an amidated C-terminal. On the other hand, the HP shown in the embodiment of the present invention
CT (Val 3 human calcitonin precursor) and HPC
As shown in Table 2, T.Cp (1-33) does not allow absolute comparison, but suggests that it has a strong physiological activity. In addition, although much research has been done on amino acid substitutions in the amino acid sequence of calcitonin and partial removal of amino acids or peptides, the fact that the peptides such as those of the present invention show activity was completely unknown. Not not.
【0056】[0056]
【表2】 [Table 2]
【0057】[0057]
【発明の効果】本発明のHPCT遺伝子、それを挿入し
たプラスミドおよびそのプラスミドで形質転換した細胞
を用いることにより、C末端アミド化ペプチドの前駆体
を得ることができ、同前駆体はカルボキシル末端がアミ
ド化されていないにも拘らずそれ自体強い生理活性を示
す。EFFECTS OF THE INVENTION By using the HPCT gene of the present invention, a plasmid into which it is inserted, and cells transformed with the plasmid, a precursor of a C-terminal amidated peptide can be obtained. Although not amidated, it shows strong physiological activity itself.
【0058】[0058]
図面は実施例に示された本発明の態様に関するもので、
図1は上段に合成遺伝子のデザインの基礎としたアミノ
酸配列、下段に成熟カルシトニンの構造を示し、下段に
おいては上段と共通する部分を線で表わしている。図2
はHPCT遺伝子のデザイン、図3は化学的に合成した
HPCT(1〜36)遺伝子のフラグメント(F1〜F
20)、図4はアミノメチル化ポリスチレン樹脂に3′
末端モノヌクレオチドユニットを固定化する工程、図5
は3′−燐酸ジエステルダイマー(またはトリマー)ブ
ロックの構造、図6はHPCT遺伝子を含む組み換えプ
ラスミドの造成工程、図7は上記のプラスミドにより形
質転換した菌によって生産されたHPCTのHPLCに
よる溶出パターン、図8は図7でピークを示す分画のH
PLCによる溶出パターンを示す。図9は上記のHPL
Cにより単離したHPCTのアミノ酸配列である。図1
0はHPCTのトリプトファン分解物のHPLCによる
溶出パターン、図11,12はオリゴヌクレオチドフラ
グメントF1〜20から合成した遺伝子の8%ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によるマッピングを示す。The drawings relate to the embodiments of the invention shown in the examples,
In FIG. 1, the upper row shows the amino acid sequence that was the basis of the design of the synthetic gene, the lower row shows the structure of mature calcitonin, and the lower row shows the parts common to the upper row by lines. Figure 2
Is the design of the HPCT gene, and FIG. 3 is a fragment of the chemically synthesized HPCT (1-36) gene (F1-F
20), FIG. 4 shows 3'on the aminomethylated polystyrene resin.
Step of immobilizing terminal mononucleotide unit, FIG.
Is the structure of the 3'-phosphate diester dimer (or trimer) block, Fig. 6 is a step of constructing a recombinant plasmid containing the HPCT gene, Fig. 7 is an elution pattern by HPLC of HPCT produced by a bacterium transformed with the above plasmid, FIG. 8 shows the H of the fraction showing the peak in FIG.
The elution pattern by PLC is shown. Figure 9 shows the above HPL
It is the amino acid sequence of HPCT isolated by C. FIG.
0 shows the elution pattern of tryptophan degradation product of HPCT by HPLC, and FIGS. 11 and 12 show the mapping of the gene synthesized from oligonucleotide fragments F1-20 by 8% polyacrylamide gel electrophoresis.
Claims (13)
に対するコドンを、末端に翻訳終止コドンを付加した請
求項1記載のポリヌクレオチド。2. The polynucleotide according to claim 1, wherein a codon for methionine is added at the beginning of the polynucleotide sequence and a translation stop codon is added at the end.
限酵素で切断される配列を付加した請求項2記載のポリ
ヌクレオチド3. The polynucleotide according to claim 2, wherein a sequence that is cleaved with a restriction enzyme is further added to both ends of the polynucleotide sequence.
側)にBamHI切断部位を付加した請求項1記載のポ
リヌクレオチド4. EcoRI on the upstream side (5 'side) and downstream (3' side)
The polynucleotide according to claim 1, wherein a BamHI cleavage site is added to the side).
pnI,SmaI,XmaIの少なくとも一つで切断さ
れる部位を設けた請求項1,2,3または4記載のポリ
ヌクレオチド5. A polynucleotide sequence comprising RsaI, K
The polynucleotide according to claim 1, 2, 3 or 4, which has a site cleaved by at least one of pnI, SmaI and XmaI.
ター領域を含むオペロンの構造遺伝子に、以下の遺伝子
群から何れか一つの遺伝子を選択して読みとりフレーム
が合ううように連結させた請求項6記載のプラスミド。 (1)次の式 【化3】 で示されるポリヌクレオチド配列の最初にメチオニンに
対するコドンを末端に翻訳終止コドンを付加したポリヌ
クレオチド配列を有する遺伝子、 (2)次の式 【化4】 で示されるポリヌクレオチド配列の最初にメチオニンに
対するコドンを末端に翻訳終止コドンを付加したポリヌ
クレオチド配列の両末端に更に制限酵素で切断される配
列を付加したポリヌクレオチド配列を有する遺伝子、 (3)次の式 【化5】 で示されるポリヌクレオチド配列の上流(5’側)にE
coRI、下流(3’側)にBamHIの切断部位を付
加したポリヌクレオチド配列を有する遺伝子、(4)上
記(1)〜(3)の遺伝子に係るポリヌクレオチド配列
の中にRsaI、KpnI、SmaI、XmaIのうち
少なくとも一つで切断される部位を有する遺伝子。7. The operon structural gene containing a promoter region derived from a microbial cell or an animal cell is ligated in such a manner that one of the following genes is selected and the reading frames are matched. Plasmid. (1) The following formula A gene having a polynucleotide sequence in which a translation termination codon is added to the end of the codon for methionine at the beginning of the polynucleotide sequence represented by (2) the following formula: A gene having a polynucleotide sequence in which a translation stop codon is added to the end of the codon for methionine at the beginning of the polynucleotide sequence represented by Equation of E on the upstream side (5 'side) of the polynucleotide sequence shown by
coRI, a gene having a polynucleotide sequence having a BamHI cleavage site added downstream (3 ′ side), (4) RsaI, KpnI, SmaI in the polynucleotide sequences of the genes of (1) to (3) above, A gene having a site cleaved by at least one of XmaI.
リ)APaseもしくはβ−ガラクトシターゼの構造遺
伝子である請求項7記載のプラスミド8. The plasmid according to claim 7, wherein the structural gene is a structural gene of Escherichia coli APase or β-galactosidase.
る請求項7記載のプラスミド。9. The plasmid according to claim 7, which comprises pAHPCT38 shown in FIG.
請求項7記載のプラスミド。10. The plasmid according to claim 7, which comprises pHPCT4 shown in FIG.
転換された微生物細胞又は動物細胞11. The following formula: A microbial cell or an animal cell transformed with the plasmid having the polynucleotide shown in
ーター領域を含むオペロンの構造遺伝子に、以下の遺伝
子群から何れか一つの遺伝子を選択して読み取りフレー
ムが合うように連結させた遺伝子を有するプラスミドで
形質転換された請求項11記載の微生物細胞または動物
細胞。 (1)次の式 【化7】 で示されるポリヌクレオチド配列の最初にメチオニンに
対するコドンを末端に翻訳終止コドンを付加したポリヌ
クレオチド配列を有する遺伝子、 (2)次の式 【化8】 で示されるポリヌクレオチド配列の最初にメチオニンに
対するコドンを末端に翻訳終止コドンを付加したポリヌ
クレオチド配列の両末端に更に制限酵素で切断される配
列を付加したポリヌクレオチド配列を有する遺伝子、 (3)次の式 【化9】 で示されたポリヌクレオチド配列の上流(5’側)にE
coRI、下流(3’側)にBamHIの切断部位を付
加したホリヌクレオチド配列を有する遺伝子、(4)上
記(1)〜(3)の遺伝子に係るポリヌクレオチド配列
の中にRsaI、KpnI、SmaI、XmaIのうち
少なくとも一つで切断される部位を有する遺伝子。12. A plasmid having a gene in which a structural gene of an operon containing a promoter region derived from a microbial cell or an animal cell is selected from any one of the following gene groups and ligated so that the reading frames match each other. The transformed microbial cell or animal cell according to claim 11. (1) The following formula A gene having a polynucleotide sequence in which a translation termination codon is added to the end of the codon for methionine at the beginning of the polynucleotide sequence represented by (2) the following formula: A gene having a polynucleotide sequence in which a translation stop codon is added to the end of the codon for methionine at the beginning of the polynucleotide sequence represented by Equation of E on the upstream side (5 'side) of the polynucleotide sequence shown by
coRI, a gene having a holinucleotide sequence having a BamHI cleavage site added downstream (3 ′ side), (4) RsaI, KpnI, SmaI in the polynucleotide sequence of the gene of (1) to (3) above, A gene having a site cleaved by at least one of XmaI.
T38である請求項12記載の微生物細胞または動物細
胞。13. A pAHPC plasmid whose plasmid is shown in FIG.
The microbial cell or animal cell according to claim 12, which is T38.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP5136822A JP2527681B2 (en) | 1993-05-14 | 1993-05-14 | HPCT gene |
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP5136822A JP2527681B2 (en) | 1993-05-14 | 1993-05-14 | HPCT gene |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2527681B2 true JP2527681B2 (en) | 1996-08-28 |
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Family Applications (1)
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---|---|---|---|
JP5136822A Expired - Lifetime JP2527681B2 (en) | 1993-05-14 | 1993-05-14 | HPCT gene |
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Country | Link |
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JP (1) | JP2527681B2 (en) |
-
1993
- 1993-05-14 JP JP5136822A patent/JP2527681B2/en not_active Expired - Lifetime
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