JPH0665318B2 - ヒト成長ホルモンの製造方法 - Google Patents
ヒト成長ホルモンの製造方法Info
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- JPH0665318B2 JPH0665318B2 JP61501206A JP50120686A JPH0665318B2 JP H0665318 B2 JPH0665318 B2 JP H0665318B2 JP 61501206 A JP61501206 A JP 61501206A JP 50120686 A JP50120686 A JP 50120686A JP H0665318 B2 JPH0665318 B2 JP H0665318B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ジペプチジル アミノペプチダーゼＩ（ＤＡ
ＰＩ）（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）を使用してアミノ
末端が延長された（amino terminal extended）ヒト成
長ホルモンからヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を製造する
方法に関する。
ＰＩ）（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）を使用してアミノ
末端が延長された（amino terminal extended）ヒト成
長ホルモンからヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を製造する
方法に関する。
米国特許第４３４２８３２号明細書から、メチオニンと
関連したｈＧＨのコードである組換え体の宿主細胞、特
に大腸菌（Ｅscherichia coli）中での醗酵によって生
合成のｈＧＨを製造する方法が知られている。しかし、
この既知の方法では、Ｎ末端が、成熟（ripe）ｈＧＨに
は存在しないアミノ酸であるメチオニンに結合したｈＧ
Ｈが得られる。
関連したｈＧＨのコードである組換え体の宿主細胞、特
に大腸菌（Ｅscherichia coli）中での醗酵によって生
合成のｈＧＨを製造する方法が知られている。しかし、
この既知の方法では、Ｎ末端が、成熟（ripe）ｈＧＨに
は存在しないアミノ酸であるメチオニンに結合したｈＧ
Ｈが得られる。
ｈＧＨと完全には同一でない成長ホルモンの使用におい
ては抗原反応や他の副作用の危険があるので、正しいア
ミノ酸配列を有する生合成のｈＧＨを製造できる方法が
強く望まれている。この問題に対する解決手段がＵＳ
ＳＮ ４８８２３２（ＤＫ特許出願２０４６／８４）明
細書に提出されている。これは緑膿菌（Ｐseudomonas a
eruginosa）また大腸菌等の組換え体原核微生物中でプ
レｈＧＨからｈＧＨを製造する方法に関したものであ
る。
ては抗原反応や他の副作用の危険があるので、正しいア
ミノ酸配列を有する生合成のｈＧＨを製造できる方法が
強く望まれている。この問題に対する解決手段がＵＳ
ＳＮ ４８８２３２（ＤＫ特許出願２０４６／８４）明
細書に提出されている。これは緑膿菌（Ｐseudomonas a
eruginosa）また大腸菌等の組換え体原核微生物中でプ
レｈＧＨからｈＧＨを製造する方法に関したものであ
る。
しかし、治療に使用するためのメチオニンを伴わないｈ
ＧＨの製造に緑膿菌を使用することは、この細菌および
多くの他のシュードモナス属（Ｐseudomonas）の細菌
が、潜在的に病原性であり、ｈＧＨの精製では除去が困
難な毒性のトキシンを合成する危険があるために、製造
方法としての価値を損われている。
ＧＨの製造に緑膿菌を使用することは、この細菌および
多くの他のシュードモナス属（Ｐseudomonas）の細菌
が、潜在的に病原性であり、ｈＧＨの精製では除去が困
難な毒性のトキシンを合成する危険があるために、製造
方法としての価値を損われている。
プレｈＧＨの発現（expression）の後に、たんぱく質分
解性（proteolytic）の開裂によって大腸菌（これは病
原性ではない）中で成熟ｈＧＨを得ることが、ＤＫ特許
出願２０４６／８４明細書に示されているが、たんぱく
質分解性の開裂によって必ず成熟ｈＧＨ、つまり正しい
アミノ酸配列を有するｈＧＨが形成されることは、この
明細書には記述されていない。
解性（proteolytic）の開裂によって大腸菌（これは病
原性ではない）中で成熟ｈＧＨを得ることが、ＤＫ特許
出願２０４６／８４明細書に示されているが、たんぱく
質分解性の開裂によって必ず成熟ｈＧＨ、つまり正しい
アミノ酸配列を有するｈＧＨが形成されることは、この
明細書には記述されていない。
上述したように、Ｍet−ｈＧＨの使用には危険が伴う可
能性がある。アミノペプチダーゼによってメチオニン基
を酵素開裂する方法が提出されているが、この型の既知
の酵素法では１００％の変換は起きないので、これによ
ってこの問題が解決されたわけではない。通常の製造的
な（preparative）精製法では完全には分離できないｈ
ＧＨとＭet−ｈＧＨの混合物が生じる。
能性がある。アミノペプチダーゼによってメチオニン基
を酵素開裂する方法が提出されているが、この型の既知
の酵素法では１００％の変換は起きないので、これによ
ってこの問題が解決されたわけではない。通常の製造的
な（preparative）精製法では完全には分離できないｈ
ＧＨとＭet−ｈＧＨの混合物が生じる。
本発明は、高い収率で酵素開裂できるプレ配列に結合し
ており、クロマトグラフィー等の既知の精製法によって
満足に分離できる生成物を酵素開裂によって与える生合
成のｈＧＨを製造することは可能であるという考えに基
づいている。このように、治療に適している均質な真正
の（authentic）ｈＧＨを商業的規模の量で得ることが
可能である。
ており、クロマトグラフィー等の既知の精製法によって
満足に分離できる生成物を酵素開裂によって与える生合
成のｈＧＨを製造することは可能であるという考えに基
づいている。このように、治療に適している均質な真正
の（authentic）ｈＧＨを商業的規模の量で得ることが
可能である。
請求の範囲第１項の特徴部分に定められている特性を特
徴とする本発明の方法では、酵素ジペプチジル アミノ
ペプチダーゼ（ＤＡＰ Ｉ）（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．
１）が、ｈＧＨの特定のアミノ末端の延長を開裂するた
めに使用される。この酵素は特異的であり、次に示す条
件で特にペプチドおよびたんぱく質のＮ末端からジペプ
チジルを開裂する。
徴とする本発明の方法では、酵素ジペプチジル アミノ
ペプチダーゼ（ＤＡＰ Ｉ）（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．
１）が、ｈＧＨの特定のアミノ末端の延長を開裂するた
めに使用される。この酵素は特異的であり、次に示す条
件で特にペプチドおよびたんぱく質のＮ末端からジペプ
チジルを開裂する。
a)たんぱく質／ペプチドのＮ末端アミノ酸がＬysまたは
Ａrgではない。
Ａrgではない。
b)たんぱく質／ペプチドのＮ末端から２番目または３番
目のアミノ酸がＰroではない。
目のアミノ酸がＰroではない。
ｈＧＨのＮ末端配列は、 Ｐhe１−Ｐro２−Ｔhr−Ｉle であり、このことはＤＡＰ Ｉが１と２で示したｈＧＨ
の結合を開裂できないことを意味している。
の結合を開裂できないことを意味している。
ＤＡＰ Ｉはジペプチドを開裂するので、アミノ末端が
延長されたｈＧＨが余分のアミノ酸を伴わないｈＧＨに
変換されるためには、この延長が偶数のアミノ酸からな
るものでなければならないことは明らかである。
延長されたｈＧＨが余分のアミノ酸を伴わないｈＧＨに
変換されるためには、この延長が偶数のアミノ酸からな
るものでなければならないことは明らかである。
この酵素が上に述べた特異性を有しているので、ジペプ
チドの開裂が延長の全体が開裂される前に止まらないた
めには、この伸長が奇数部位にＬysまたはＡrgを含んで
はならないことと、Ｐroがある場合はそれはＮ末端アミ
ノ酸としてのみ位置できることが明らかである。
チドの開裂が延長の全体が開裂される前に止まらないた
めには、この伸長が奇数部位にＬysまたはＡrgを含んで
はならないことと、Ｐroがある場合はそれはＮ末端アミ
ノ酸としてのみ位置できることが明らかである。
いずれの酵素反応も１００％の変換を行うことは期待で
きないので、真正のｈＧＨをアミノ酸末端が延長された
ｈＧＨから分析的かつ製造的に分離できるアミノ酸を延
長に導入することが必要である。これは荷電した側鎖を
有するアミノ酸、即ち、ＧluまたはＡsp（負に荷電した
側鎖）またはＡrg、ＬysまたはＨis（正に荷電した側
鎖）を選ぶことで成される。そして、荷電に関して互い
に中和するような正と負に荷電したアミノ酸残基の組合
せが延長の中に選ばれていないことを条件として、アニ
オン交換とカチオン交換（分析的または製造的）によっ
てまたはアニオン電気泳動とカチオン電気泳動によっ
て、アミノ末端が延長されたｈＧＨを（真正の）ｈＧＨ
から分離することが可能である。
きないので、真正のｈＧＨをアミノ酸末端が延長された
ｈＧＨから分析的かつ製造的に分離できるアミノ酸を延
長に導入することが必要である。これは荷電した側鎖を
有するアミノ酸、即ち、ＧluまたはＡsp（負に荷電した
側鎖）またはＡrg、ＬysまたはＨis（正に荷電した側
鎖）を選ぶことで成される。そして、荷電に関して互い
に中和するような正と負に荷電したアミノ酸残基の組合
せが延長の中に選ばれていないことを条件として、アニ
オン交換とカチオン交換（分析的または製造的）によっ
てまたはアニオン電気泳動とカチオン電気泳動によっ
て、アミノ末端が延長されたｈＧＨを（真正の）ｈＧＨ
から分離することが可能である。
アミノ末端の延長の全体が開裂されたかどうかを観測で
きるので、ｈＧＨのＮ末端に直接結合しているジペプチ
ド成分中に少なくとも一つの荷電したアミノ酸が含まれ
ると有利である。しかし、延長の最後のアミノ酸残基が
荷電した側鎖を有するアミノ酸であることが最も望まし
い。これは、体中の微生物がＮ末端メチオニン残基を部
分的にのみ開裂する場合に特に重要である。
きるので、ｈＧＨのＮ末端に直接結合しているジペプチ
ド成分中に少なくとも一つの荷電したアミノ酸が含まれ
ると有利である。しかし、延長の最後のアミノ酸残基が
荷電した側鎖を有するアミノ酸であることが最も望まし
い。これは、体中の微生物がＮ末端メチオニン残基を部
分的にのみ開裂する場合に特に重要である。
ｈＧＨに対するアミノ末端の延長の中の荷電した側鎖を
有するアミノ酸が、全く正にのみ荷電しているか、また
は全く負にのみ荷電していることが最も望ましい。この
ことは、アミノ末端が延長されたｈＧＨと、部分的に酵
素変換されたアミノ末端が延長されたｈＧＨと、真正の
ｈＧＨとが、常に同じ正味の荷電を持つことを防ぐ。
有するアミノ酸が、全く正にのみ荷電しているか、また
は全く負にのみ荷電していることが最も望ましい。この
ことは、アミノ末端が延長されたｈＧＨと、部分的に酵
素変換されたアミノ末端が延長されたｈＧＨと、真正の
ｈＧＨとが、常に同じ正味の荷電を持つことを防ぐ。
ｈＧＨでは、一定のＧln残基とＡsn残基の脱アミノ化が
起きる。つまり、ＧlnとＡsnは、負に荷電した側鎖を有
するアミノ酸であるＧluとＡspにそれぞれ変換される。
この理由のために、アミノ末端の延長の荷電したアミノ
酸が負に荷電したＧluおよび／またはＡspであることが
最も望ましい。というのは、これによって、ｈＧＨの中
の一つまたはそれ以上の脱アミノ化が延長に存在する正
の荷電を中和する状況を避けることができるからであ
る。そのような荷電の中和は、多分に未反応の脱アミノ
化されたアミノ末端が延長されたｈＧＨを、イオン交換
によって、酵素的に形成されたｈＧＨから分離すること
を不可能にする。
起きる。つまり、ＧlnとＡsnは、負に荷電した側鎖を有
するアミノ酸であるＧluとＡspにそれぞれ変換される。
この理由のために、アミノ末端の延長の荷電したアミノ
酸が負に荷電したＧluおよび／またはＡspであることが
最も望ましい。というのは、これによって、ｈＧＨの中
の一つまたはそれ以上の脱アミノ化が延長に存在する正
の荷電を中和する状況を避けることができるからであ
る。そのような荷電の中和は、多分に未反応の脱アミノ
化されたアミノ末端が延長されたｈＧＨを、イオン交換
によって、酵素的に形成されたｈＧＨから分離すること
を不可能にする。
ＤＡＰ Ｉを用いて開裂される特に適したアミノ末端の
延長の例を次に示す。
延長の例を次に示す。
１． Ｍet−Ｇlu−Ａla−Ｇlu ２． （Ａla−Ｇlu）ｒ、式中ｒは１からまでの 整数 ３． Ｍet−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu ４． Ｔhr−Ｇlu−Ａla−Ｇlu ５． Ｍet−Ａsp−Ａla−Ａsp ６． Ｍet−Ｇlu−Ａla−Ａsp これらおよび他の適当なアミノ末端の延長は、これらの
結合したアミノ末端の延長を有するヒト成長ホルモンの
コードであるプラスミドで形質転換した微生物を、適当
な基質中で醗酵させることにより得ることができる。
結合したアミノ末端の延長を有するヒト成長ホルモンの
コードであるプラスミドで形質転換した微生物を、適当
な基質中で醗酵させることにより得ることができる。
いくつかの特定のプレ配列では、メチオニンは、これは
大腸菌中で形成される全てのたんぱく質のＮ末端アミノ
酸であるが、たんぱく質の発現後に微生物中で酵素開裂
される。このようにして、例えば、上に述べたアミノ末
端が延長されたｈＧＨたんぱく質が得られる。
大腸菌中で形成される全てのたんぱく質のＮ末端アミノ
酸であるが、たんぱく質の発現後に微生物中で酵素開裂
される。このようにして、例えば、上に述べたアミノ末
端が延長されたｈＧＨたんぱく質が得られる。
これらのたんぱく質は通常の精製法によって精製され
る。アミノ末端の延長は選択的に高収率で開裂され、そ
の後、形成されたｈＧＨはアニオン交換によって、残り
の部分的に変換されたアミノ末端が延長されたｈＧＨか
ら容易に分離される。
る。アミノ末端の延長は選択的に高収率で開裂され、そ
の後、形成されたｈＧＨはアニオン交換によって、残り
の部分的に変換されたアミノ末端が延長されたｈＧＨか
ら容易に分離される。
本発明の方法を次の幾つかの作業例によってより詳しく
説明する。
説明する。
例１ 活性酵素または酵素複合体の製造 シグマ（Ｓigma）からのロイシン アミノペプチダーゼ
試料が、活性酵素または酵素複合体の製造のための出発
物質として使用され、活性酵素はロイシン アミノペプ
チダーゼ（ＬＡＰ）と共に分別された。活性酵素は、フ
ァルマシア（Ｐharmacia）からの高度に可溶性のモノＱ
（monoＱ）上でのＩＥ−ＨＰＬＣ（イオン交換ＨＰＬ
Ｃ）によりＬＡＰから分別できた。
試料が、活性酵素または酵素複合体の製造のための出発
物質として使用され、活性酵素はロイシン アミノペプ
チダーゼ（ＬＡＰ）と共に分別された。活性酵素は、フ
ァルマシア（Ｐharmacia）からの高度に可溶性のモノＱ
（monoＱ）上でのＩＥ−ＨＰＬＣ（イオン交換ＨＰＬ
Ｃ）によりＬＡＰから分別できた。
分別 カラム：０．１９６cm2 ｘ５cm。モノＱ（ファル マシア）を詰めた。１０μｍ±０．２μｍ。
緩衝液Ａ：２０ｍＭトリス−Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ pH＝８．５。
緩衝液Ｂ：２０ｍＭトリス−Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５００ｍＭ ＮａＣｌ pH＝８．５。
流速：１ｍｌ／分。
注入容積：５００μｌ。
検出：２８０ｎｍ、０．５ＡＵＦＳ。
温度：２０℃ 勾配の表： 分画：１min-1。
１０mgのＬＡＰ／mlと１２Ｕ／mgを含む使用したロイシ
ン アミノペプチダーゼ試料（シグマ、Ｌ−１５０３、
ロット番号１４Ｆ−８１５５）を緩衝液Ａを用いて２．
６mg／mlに希釈した。５００μｌがカラムに適用され
た。図に表わした分別のＵＶプロフィールは、この試料
が不均質であることを示していた。１７の分画が集めら
れ、ロイシン アミノペプチダーゼ活性とＡla−Ｇlu−
ｈＧＨをｈＧＨへ変換する比活性とを調べられた。
ン アミノペプチダーゼ試料（シグマ、Ｌ−１５０３、
ロット番号１４Ｆ−８１５５）を緩衝液Ａを用いて２．
６mg／mlに希釈した。５００μｌがカラムに適用され
た。図に表わした分別のＵＶプロフィールは、この試料
が不均質であることを示していた。１７の分画が集めら
れ、ロイシン アミノペプチダーゼ活性とＡla−Ｇlu−
ｈＧＨをｈＧＨへ変換する比活性とを調べられた。
ロイシン アミノペプチダーゼ活性は、文献１（Ｅ．Ｍ
er ck：Ａnalytisches Ｚentrallab.Ｐruefungsvorsch
rift code NO.ＡＺＬ ０５２６６７５）に記述される
ように、Ｌ−ロイシンアミドをＬ−ロイシンとアンモニ
アに変換することにより、分光光度計で２３８nm、pH＝
８．５で測定された。それぞれの分画の３００μｌが、
活性測定の前に４０℃で２時間予備インキュベーション
された。活性測定の結果を図に示した。
er ck：Ａnalytisches Ｚentrallab.Ｐruefungsvorsch
rift code NO.ＡＺＬ ０５２６６７５）に記述される
ように、Ｌ−ロイシンアミドをＬ−ロイシンとアンモニ
アに変換することにより、分光光度計で２３８nm、pH＝
８．５で測定された。それぞれの分画の３００μｌが、
活性測定の前に４０℃で２時間予備インキュベーション
された。活性測定の結果を図に示した。
Ａla−Ｇlu−ｈＧＨのｈＧＨへの変換に対する比活性は
次の方法で測定された。個々の分画の１００μｌを、後
に記述するようにした生成されたＡla−Ｇlu−ｈＧＨ
（５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０ｍＭトリス pH＝８．５中
に１mg／ml）の１００μｌと混合し、pHを４．２に調節
した。反応混合物は２時間後に、１０％ゲル上でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。変換
の度合いははゲルのレーザースキャンによって測定し
た。結果を図に示した。
次の方法で測定された。個々の分画の１００μｌを、後
に記述するようにした生成されたＡla−Ｇlu−ｈＧＨ
（５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０ｍＭトリス pH＝８．５中
に１mg／ml）の１００μｌと混合し、pHを４．２に調節
した。反応混合物は２時間後に、１０％ゲル上でのポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。変換
の度合いははゲルのレーザースキャンによって測定し
た。結果を図に示した。
個々の分画のロイシン アミノペプチダーゼ活性を図に
示した。ＬＡＰ活性は分画13と分画14にのみ存在し。Ｌ
ＡＰ活性のバランス計算は、全ての適用したＬＡＰ活性
がこれらの二つの分画に溶出されたことを示した。
示した。ＬＡＰ活性は分画13と分画14にのみ存在し。Ｌ
ＡＰ活性のバランス計算は、全ての適用したＬＡＰ活性
がこれらの二つの分画に溶出されたことを示した。
Ａla−Ｇlu−ｈＧＨのｈＧＨへの変換に対する活性は、
分画12を最大として分画９から分画15までに存在し、そ
れから活性は急速に減少した。このように、二つの酵素
活性が存在することと、これを一定の分別法によって分
離することが可能であることは明らかとなった。Ａla−
Ｇlu−ｈＧＨの変換に対する比活性は酵素ＤＡＰ Ｉの
存在によるものであることが証明された。
分画12を最大として分画９から分画15までに存在し、そ
れから活性は急速に減少した。このように、二つの酵素
活性が存在することと、これを一定の分別法によって分
離することが可能であることは明らかとなった。Ａla−
Ｇlu−ｈＧＨの変換に対する比活性は酵素ＤＡＰ Ｉの
存在によるものであることが証明された。
生合成によるＡla−Ｇlu−ｈＧＨの製造 ヒト成長ホルモン ｈＧＨ（１９１アミノ酸残基、その
最初の４つのアミノ酸はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉleであ
る）のようなアミノ酸配列を有するたんぱく質のコード
であるクローニングされたＤＮＡ配列が、以下で合成的
に生成された二重らせんＤＮＡ配列と、＋ストランドの
３′末端が上に述べた遺伝子の＋５′末端と結合し、合
成ＤＮＡ配列ストランドの５′末端が上に述べた遺伝子
の３′末端と結合するように、次のブラントエンド結合
によって結合された。
最初の４つのアミノ酸はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉleであ
る）のようなアミノ酸配列を有するたんぱく質のコード
であるクローニングされたＤＮＡ配列が、以下で合成的
に生成された二重らせんＤＮＡ配列と、＋ストランドの
３′末端が上に述べた遺伝子の＋５′末端と結合し、合
成ＤＮＡ配列ストランドの５′末端が上に述べた遺伝子
の３′末端と結合するように、次のブラントエンド結合
によって結合された。
＋５′ ＣＧＡＴＧ ＧＣＴ ＧＡＡ −３′ ＴＡＣ ＣＧＡ ＣＴＴ ここで、＋ストランドの最初の二つのヌクレオチドはＣ
ｌａＩ制限部位のオーバーハング（overhang）であり、
その後に続くヌクレオチド配列がアミノ酸配列Ｍet−Ａ
la−Ｇlu−に対するコードである。
ｌａＩ制限部位のオーバーハング（overhang）であり、
その後に続くヌクレオチド配列がアミノ酸配列Ｍet−Ａ
la−Ｇlu−に対するコードである。
上に述べた遺伝子が通常の遺伝子クローニング技術によ
って、融合したＴrp−Ｌacプロモータ並びにＳＤ配列Ａ
ＧＧＡを含む発現プラスミドへ導入された。この構造は
Ｍet−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨを発現するはずのものであっ
た。
って、融合したＴrp−Ｌacプロモータ並びにＳＤ配列Ａ
ＧＧＡを含む発現プラスミドへ導入された。この構造は
Ｍet−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨを発現するはずのものであっ
た。
それから、このプラスミド構造が従来の技術によって大
腸菌細胞に導入された。上述の構造を含む適当なクロー
ンが単離され、５スケールで培養された。細胞は遠心
分離によって収穫され、小容積に懸濁され、いわゆる
「フレンチプレス（Ｅrench press）」を使用して溶菌
された。
腸菌細胞に導入された。上述の構造を含む適当なクロー
ンが単離され、５スケールで培養された。細胞は遠心
分離によって収穫され、小容積に懸濁され、いわゆる
「フレンチプレス（Ｅrench press）」を使用して溶菌
された。
予測した融合たんぱく質を、ｈＧＨ抗体を使用する免疫
学的方法によって上に述べた細菌抽出物中に証明するこ
とができた。これは培養基中２００mg／の濃度に対応
していた。融合たんぱく質は常法に従い、アニオン交
換、硫酸アンモニウム沈澱および疎水クロマトグラフィ
ーによって精製された。
学的方法によって上に述べた細菌抽出物中に証明するこ
とができた。これは培養基中２００mg／の濃度に対応
していた。融合たんぱく質は常法に従い、アニオン交
換、硫酸アンモニウム沈澱および疎水クロマトグラフィ
ーによって精製された。
精製した（予測の）Ｍet−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨはＳＤＳ
電気泳動から、純度が９９％以上であると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製したｈＧＨ物質はＡla
−Ｇlu−ｈＧＨの配列を持つことが示された。これは、
Ｍetが大腸菌の酵素によって開裂されたことを示してい
た。
電気泳動から、純度が９９％以上であると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製したｈＧＨ物質はＡla
−Ｇlu−ｈＧＨの配列を持つことが示された。これは、
Ｍetが大腸菌の酵素によって開裂されたことを示してい
た。
Ａla−Ｇlu−ｈＧＨからｈＧＨへの酵素開裂 ２０ｍＭトリス−Ｃｌ、pH４．２中の１００mgのＡla−
Ｇlu−ｈＧＨ（１．５mg／ml）を、ブタ腎臓から上述の
ようにして単離されたＤＡＰ Ｉ活性を有する酵素分画
の７mgと混合した。
Ｇlu−ｈＧＨ（１．５mg／ml）を、ブタ腎臓から上述の
ようにして単離されたＤＡＰ Ｉ活性を有する酵素分画
の７mgと混合した。
それから、反応混合物は４０℃でインキュベーションさ
れた。４．５時間後、混合物は４℃に冷却された。冷却
された反応混合物はアニオン交換によって分別され、そ
の後、主ピーク（ｈＧＨ生成物）が単離された。収率は
９０％であった。
れた。４．５時間後、混合物は４℃に冷却された。冷却
された反応混合物はアニオン交換によって分別され、そ
の後、主ピーク（ｈＧＨ生成物）が単離された。収率は
９０％であった。
ｈＧＨ生成物はＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上
であると計算された。アミノ末端決定（エドマン（Edma
n）分解）により、ｈＧＨ生成物のアミノ末端配列はＰh
e−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−であり、真正のｈＧＨに
対するものと同じであることが示された。
であると計算された。アミノ末端決定（エドマン（Edma
n）分解）により、ｈＧＨ生成物のアミノ末端配列はＰh
e−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−であり、真正のｈＧＨに
対するものと同じであることが示された。
ｈＧＨ生成物の生物学的活性が脛骨（tibia）試験によ
り測定され、２．５ＩＵ／mgであることが見出された。
これはまた真正のｈＧＨの場合と同じであった。
り測定され、２．５ＩＵ／mgであることが見出された。
これはまた真正のｈＧＨの場合と同じであった。
例２ ジペプチジル アミノペプチダーゼＩを用いるＭet−Ｇ
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ｇ
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。Ｍet−Ｇlu−Ａ
la−Ｇlu−ｈＧＨは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ｇ
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。Ｍet−Ｇlu−Ａ
la−Ｇlu−ｈＧＨは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
精製されたＭet−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨは、ＩＥ−
ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であ
ると計算された。
ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であ
ると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製されたｈＧＨはＭet−
Ｇlu−Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌ
euの持つことが示された。ここで、最後の６のアミノ酸
はｈＧＨのＮ末端に対応している。２０ｍＭトリス、１
０ｎＭクエン酸、２５ｍＭ ＮａＣｌ、pH４．２中のＭ
et−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨ（２．０mg／ml）の２０
０mlが、ベーリンガーマンハイム（Ｂoehringer Ｍann
heim）からのジペプチジル アミノペプチダーゼＩ
（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の１０，０００ｍＵ
（３．３mgに相当）と混合された。他の標品も同様に使
用できる。場合によっては、pHの値を再び４．２に調節
する。
Ｇlu−Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌ
euの持つことが示された。ここで、最後の６のアミノ酸
はｈＧＨのＮ末端に対応している。２０ｍＭトリス、１
０ｎＭクエン酸、２５ｍＭ ＮａＣｌ、pH４．２中のＭ
et−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨ（２．０mg／ml）の２０
０mlが、ベーリンガーマンハイム（Ｂoehringer Ｍann
heim）からのジペプチジル アミノペプチダーゼＩ
（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の１０，０００ｍＵ
（３．３mgに相当）と混合された。他の標品も同様に使
用できる。場合によっては、pHの値を再び４．２に調節
する。
それから、反応混合物は４０℃で６０分間インキュベー
ションされ、その結果、Ｍet−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧ
Ｈの９８％が以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了し
た後、反応混合物は４℃に冷却された。更にその後の精
製は、イソプレシピテーション（isoprecipitaion）、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
ションされ、その結果、Ｍet−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧ
Ｈの９８％が以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了し
た後、反応混合物は４℃に冷却された。更にその後の精
製は、イソプレシピテーション（isoprecipitaion）、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
ｈＧＨ生成物はＩＥ−ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列により、ｈＧＨ生成物のアミノ末端
配列はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真
正のｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列により、ｈＧＨ生成物のアミノ末端
配列はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真
正のｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
ｈＧＨ生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
例３ ジペプチジル アミノペプチダーゼＩを用いいるＡla−
Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ａ
la−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。醗酵によって形成され
たたんぱく質がＡla−Ｇlu−ｈＧＨとなるように、Ｍet
は体中で開裂された。これは、常法に従って、アニオン
交換と疎水相互クロマトグラフィーによって精製され
た。
Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ａ
la−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。醗酵によって形成され
たたんぱく質がＡla−Ｇlu−ｈＧＨとなるように、Ｍet
は体中で開裂された。これは、常法に従って、アニオン
交換と疎水相互クロマトグラフィーによって精製され
た。
精製されたＡla−Ｇlu−ｈＧＨは、ＩＥ−ＨＰＬＣとＳ
ＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であると計算され
た。
ＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であると計算され
た。
アミノ末端配列分析により、精製されたｈＧＨ生成物は
Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuの配
列を持つことが示された。ここで、最後の６のアミノ酸
はｈＧＨのＮ末端に対応している。
Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuの配
列を持つことが示された。ここで、最後の６のアミノ酸
はｈＧＨのＮ末端に対応している。
２０ｍＭトリス、１０ｍＭクエン酸、２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、pH４．２中のＡla−Ｇlu−ｈＧＨ（２．２mg／ml）
の１００mlが、ベーリンガーマンハイムからのジペプチ
ジル アミノベプチダーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の
８８００ｍＵ（２．９mgに相当）と混合された。他の標
品も同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び
４．２に調節する。
ｌ、pH４．２中のＡla−Ｇlu−ｈＧＨ（２．２mg／ml）
の１００mlが、ベーリンガーマンハイムからのジペプチ
ジル アミノベプチダーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の
８８００ｍＵ（２．９mgに相当）と混合された。他の標
品も同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び
４．２に調節する。
反応混合物は４０℃で６０分間インキュベーションさ
れ、その結果、Ａla−Ｇlu−ｈＧＨの９８％以上が変換
された。反応が完了した後、反応混合物は４℃に冷却さ
れた。更にその後の精製は、イソプレシピテーション、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
れ、その結果、Ａla−Ｇlu−ｈＧＨの９８％以上が変換
された。反応が完了した後、反応混合物は４℃に冷却さ
れた。更にその後の精製は、イソプレシピテーション、
ゲルろ過およびアニオン交換を含む。
ｈＧＨ生成物はＩＥ−ＨＰＬＣとＳＤＳと電気泳動か
ら、純度が９９％以上であると計算された。エドマン分
解によるアミノ酸配列決定で、ｈＧＨのアミノ末端配列
はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真正の
ｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
ら、純度が９９％以上であると計算された。エドマン分
解によるアミノ酸配列決定で、ｈＧＨのアミノ末端配列
はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真正の
ｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
ｈＧＨ生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
例４ ジペプチジル アミノペプチダーゼＩを用いるＭet−Ｐ
he−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ｐ
he−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。Ｍet−Ｐhe−Ｇ
lu−Ｇlu−ｈＧＨは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
he−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によって、Ｍet−Ｐ
he−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。Ｍet−Ｐhe−Ｇ
lu−Ｇlu−ｈＧＨは、アニオン交換と疎水相互作用クロ
マトグラフィーによって醗酵生成物から精製された。
精製されたＭet−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨは、ＩＥ−
ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であ
ると計算された。
ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以上であ
ると計算された。
アミノ末端配列決定により、精製されたｈＧＨはＭet−
Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌ
euの配列を持つことが示された。ここで、最後の６のア
ミノ酸はｈＧＨのＮ末端に対応している。
Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌ
euの配列を持つことが示された。ここで、最後の６のア
ミノ酸はｈＧＨのＮ末端に対応している。
２０ｍＭトリス、１０ｍＭクエン酸、２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ Ｌ−システイン pH４．２中のＭet−Ｐhe
−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨ（１．５mg／ml）の１００mlが、
ベーリンガーマンハイムからのジペプチジル アミノペ
プチダーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の１５，０
００ｍＵ（５．０mgに相当）と混合された。他の標品も
同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び４．
２に調節する。
ｌ、１ｍＭ Ｌ−システイン pH４．２中のＭet−Ｐhe
−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧＨ（１．５mg／ml）の１００mlが、
ベーリンガーマンハイムからのジペプチジル アミノペ
プチダーゼＩ（Ｅ．Ｃ．３．４．１４．１）の１５，０
００ｍＵ（５．０mgに相当）と混合された。他の標品も
同様に使用できる。場合によっては、pHの値を再び４．
２に調節する。
それから、反応混合物は４０℃で６０分間インキュベー
ションされ、その結果、Ｍet−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧ
Ｈの９８％以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了した
後、反応混合物は４℃に冷却された。更にその後の精製
は、イソプレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン
交換を含む。
ションされ、その結果、Ｍet−Ｐhe−Ｇlu−Ｇlu−ｈＧ
Ｈの９８％以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了した
後、反応混合物は４℃に冷却された。更にその後の精製
は、イソプレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン
交換を含む。
ｈＧＨ生成物はＩＥ−ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、ｈＧＨ生成物のアミノ末端
配列はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真
正のｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、ｈＧＨ生成物のアミノ末端
配列はＰhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真
正のｈＧＨに対するものと同じであることが示された。
ｈＧＨ生成物の生物学的活性が脛骨試験により測定さ
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
れ、脳下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示さ
れた。
例５ ジペプチジル アミノペプチダーゼＩを用いるＡla−Ｇ
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によってＭet−Ａla
−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。醗酵によっ
て形成されたたんぱく質がＡla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈ
ＧＨになるように、Ｍetは体中で開裂された。これは、
常法に従って、アニオン交換と疎水相互作用クロマトグ
ラフィーによって精製された。
lu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨからのｈＧＨの製造 原則的に例１に記述した遺伝子技術によってＭet−Ａla
−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨが製造された。醗酵によっ
て形成されたたんぱく質がＡla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈ
ＧＨになるように、Ｍetは体中で開裂された。これは、
常法に従って、アニオン交換と疎水相互作用クロマトグ
ラフィーによって精製された。
精製されたＡla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨは、 ＩＥ−ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、純度が９９％以
上であると計算された。
上であると計算された。
アミノ末端配列分析により、精製されたｈＧＨ生成物は
Ａla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐ
ro−Ｌeuの配列を持つことが示された。ここで、最後の
６のアミノ酸はｈＧＨのＮ末端に対応している。
Ａla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐ
ro−Ｌeuの配列を持つことが示された。ここで、最後の
６のアミノ酸はｈＧＨのＮ末端に対応している。
２０ｍＭトリス、１０ｍＭクエン酸、２５ｍＭ ＮａＣ
ｌ、pH４．２中のＡla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨ
（２．０mg／ml）の１００mlが、ベーリンガーマンハイ
ムからのジペプチジル アミノペプチダーゼＩ（Ｅ．
Ｃ．３．４．１４．１）の２０００ｍＵ（６．７mgに相
当）と混合された。他の標品も同様に使用できる。場合
によっては、pHの値を再び４．２に調節する。
ｌ、pH４．２中のＡla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨ
（２．０mg／ml）の１００mlが、ベーリンガーマンハイ
ムからのジペプチジル アミノペプチダーゼＩ（Ｅ．
Ｃ．３．４．１４．１）の２０００ｍＵ（６．７mgに相
当）と混合された。他の標品も同様に使用できる。場合
によっては、pHの値を再び４．２に調節する。
反応混合物は４０℃で６０分間インキュベーションさ
れ、その結果、Ａla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨの９８
％以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了した後、反応
混合物は４℃に冷却された。更にその後の精製は、イソ
プレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン交換を含
む。
れ、その結果、Ａla−Ｇlu−Ａla−Ｇlu−ｈＧＨの９８
％以上がｈＧＨへ変換された。反応が完了した後、反応
混合物は４℃に冷却された。更にその後の精製は、イソ
プレシピテーション、ゲルろ過およびアニオン交換を含
む。
ｈＧＨ生成物はＩＥ−ＨＰＬＣとＳＤＳ電気泳動から、
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、ｈＧＨのアミノ末端配列は
Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真正のｈ
ＧＨに対するものと同じであることが示された。
純度が９９％以上であると計算された。エドマン分解に
よるアミノ末端配列決定で、ｈＧＨのアミノ末端配列は
Ｐhe−Ｐro−Ｔhr−Ｉle−Ｐro−Ｌeuであり、真正のｈ
ＧＨに対するものと同じであることが示された。
ｈＧＨ生成物の生物学的活性が脛骨試験で測定され、脳
下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示された。
下垂体のｈＧＨと等しい効力を有することが示された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クリステンセン，ソールキルド デンマ−ク国 デイ・ケイ−3450 アラー ロド，ベリスヴエジ 55 (72)発明者 ハンセン，ジオルリ，ウイニー デンマ−ク国 デイ・ケイ−2600 グロス トラツプ，クロベルホジ 20 (72)発明者 ジエツセン，トルベン，エーレルン デンマ−ク国 デイ・ケイ−4300 ホルベ ク，カルンドボルグヴエジ 216
Claims (4)
- 【請求項１】生合成的に形成され且つアミノ末端の延長
されたｈＧＨがアミノペプチダーゼで消化される、真正
なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の製造方法であって、 使用される前記アミノ末端の延長されたｈＧＨは、式Ｘ
−ｈＧＨ（ここでＸは、ジペプチド成分にＡsp及びＧlu
から選択された少なくとも１のアミノ酸を有するアミノ
酸配列であって、ｈＧＨのＮ末端に直接に結合され且つ
偶数個のアミノ酸を有しており、Ｎ末端からみて第一番
目はＬys及びＡrgではなく、他の全ての奇数番目のアミ
ノ酸はＰro、Ｌys及びＡrgではなく、全ての偶数個のア
ミノ酸はＰroではない）で表され、該Ｘ−ｈＧＨが酵素
ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（E.C.3.4.14.1）と
反応されることを特徴とする方法。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列Ｘの最後のアミノ酸が、
Ａsp又はＧluであることを特徴とする特許請求の範囲第
１項に記載の方法。 - 【請求項３】前記アミノ酸配列Ｘの最後から２番目のア
ミノ酸が、Ａsp又はＧluであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】前記アミノ酸配列Ｘの最後及び最後から２
番目のアミノ酸が、Ａsp又はＧluであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK556/85 | 1985-02-07 | ||
| DK055685A DK55685A (da) | 1985-02-07 | 1985-02-07 | Enzym eller enzymkompleks med proteolytisk aktivitet |
| PCT/DK1986/000014 WO1986004609A1 (en) | 1985-02-07 | 1986-02-06 | A process for producing human growth hormone |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62501609A JPS62501609A (ja) | 1987-07-02 |
| JPH0665318B2 true JPH0665318B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=8094869
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61501206A Expired - Lifetime JPH0665318B2 (ja) | 1985-02-07 | 1986-02-06 | ヒト成長ホルモンの製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20010018199A1 (ja) |
| EP (1) | EP0217814B2 (ja) |
| JP (1) | JPH0665318B2 (ja) |
| AU (1) | AU590258B2 (ja) |
| DE (1) | DE3671245D1 (ja) |
| DK (1) | DK55685A (ja) |
| WO (1) | WO1986004609A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE251217T1 (de) * | 1984-08-16 | 2003-10-15 | Savient Pharmaceuticals Inc | Methode zur herstellung von menschlichen wachstumshormonen |
| IT1228925B (it) * | 1987-08-07 | 1991-07-10 | Eniricerche Spa | Procedimento per la preparazione dell'ormone della crescita umano |
| IT1223577B (it) * | 1987-12-22 | 1990-09-19 | Eniricerche Spa | Procedimento migliorato per la preparazione dell'ormone della crescita umano naturale in forma pura |
| US5126249A (en) * | 1989-05-09 | 1992-06-30 | Eli Lilly And Company | Enzymatic removal of a protein amino-terminal sequence |
| DE4105480A1 (de) * | 1991-02-21 | 1992-08-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte aktivierung von rekombinanten proteinen |
| TW257792B (ja) * | 1992-10-01 | 1995-09-21 | Lilly Co Eli | |
| KR970010135B1 (ko) * | 1993-06-17 | 1997-06-21 | 주식회사 엘지화학 | 신규 아미노펩티다제 |
| US5573923A (en) * | 1993-12-22 | 1996-11-12 | Eli Lilly And Company | Method for removing N-terminal dipeptides from precursor polypeptides with immobilized dipeptidylaminopeptidase from dictyostelium discoideum |
| AU2445495A (en) * | 1994-05-09 | 1995-11-29 | Unizyme Laboratories A/S | An enzymatic process for producing a desired protein from an amino terminal extended protein |
| US5840517A (en) * | 1995-04-26 | 1998-11-24 | Eli Lilly And Company | Process for preparing obesity protein analogs |
| US5614379A (en) * | 1995-04-26 | 1997-03-25 | Eli Lilly And Company | Process for preparing anti-obesity protein |
| US7714020B2 (en) | 2001-05-24 | 2010-05-11 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Treatment of non-convulsive seizures in brain injury using G-2-methyl-prolyl glutamate |
| US7605177B2 (en) * | 2001-05-24 | 2009-10-20 | Neuren Pharmaceuticals Limited | Effects of glycyl-2 methyl prolyl glutamate on neurodegeneration |
| AU2002303856A1 (en) | 2001-05-24 | 2002-12-03 | Neuronz Limited | Gpe analogs and peptidomimetics |
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|---|---|---|---|---|
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| US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
| US4769326A (en) * | 1980-02-29 | 1988-09-06 | The Regents Of The University Of California | Expression linkers |
| US4775622A (en) * | 1982-03-08 | 1988-10-04 | Genentech, Inc. | Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast |
| US4532207A (en) * | 1982-03-19 | 1985-07-30 | G. D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
| US4745069A (en) * | 1982-05-25 | 1988-05-17 | Eli Lilly And Company | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
| JPS60500043A (ja) * | 1982-12-10 | 1985-01-17 | ノルデイスク・インスリンラボラトリウム | 原核細胞又は真核細胞中で合成される融合蛋白質から成熟蛋白質を作る方法 |
| US4755465A (en) * | 1983-04-25 | 1988-07-05 | Genentech, Inc. | Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas |
| ATE251217T1 (de) * | 1984-08-16 | 2003-10-15 | Savient Pharmaceuticals Inc | Methode zur herstellung von menschlichen wachstumshormonen |
| US4865974A (en) * | 1985-09-20 | 1989-09-12 | Cetus Corporation | Bacterial methionine N-terminal peptidase |
-
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- 1985-02-07 DK DK055685A patent/DK55685A/da not_active Application Discontinuation
-
1986
- 1986-02-06 DE DE8686901361T patent/DE3671245D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 JP JP61501206A patent/JPH0665318B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 WO PCT/DK1986/000014 patent/WO1986004609A1/en active IP Right Grant
- 1986-02-06 EP EP86901361A patent/EP0217814B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-02-06 AU AU55145/86A patent/AU590258B2/en not_active Expired
-
1997
- 1997-10-17 US US08/953,217 patent/US20010018199A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-10-20 US US10/689,445 patent/US20040235090A1/en not_active Abandoned
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|---|---|
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| WO1986004609A1 (en) | 1986-08-14 |
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