JPH06511145A

JPH06511145A - ミコバクテリア内での挿入突然変異

Info

Publication number: JPH06511145A
Application number: JP5500932A
Authority: JP
Inventors: ジェイコブズ，ウイリアム，アール．; ブルーム，バリー; カルパナ，ガンジャム，ヴィ．; シリルロ，ジェフリー，ディー．
Original assignee: アルバート　アインシュタイン　カレッジ　オブ　メディシン、ア　ディビジョン　オブ　イェシーバ　ユニバーシティ
Priority date: 1991-06-13
Filing date: 1992-06-02
Publication date: 1994-12-15
Also published as: CA2111217A1; FI935566A; EP0972839A1; NO934515D0; FI935566A0; AU1635797A; EP0590027A1; WO1992022326A1; EP0590027A4; NO934515L; AU2189392A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ミコバクテリア内での挿入突然変異この発明は、ミコバクテリアの突然変異誘発に関する。より詳細には、この発明は、ミコバクテリア内での挿入突然変異の発生に関する。

ある種のミコバクテリアは、人間および動物の主要な病原体を表わす。例えば結核は一般にヒト結核菌によりヒトに生じ、生型結核菌により牛に生じ、後者はヒトおよび他の動物に媒介される。らい菌はらい病の原因となる因子である。ヒト結核菌および鳥型・イントラセルラーレ・スクロフラセウムグループ（ＭＡＩＳグループ）のミコバクテリアは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳＩに係る患者の主要な日和見的な病原体を表わす。偽結核菌は牛の主要な病原体である。

一方、生型結核菌の非病原性菌株であるカルメツトゲラン生型結核菌、すなわちＢＣＧはヒトワクチンに広く用いられ、とりわけ生ワクチンとして使用され結核に対し防御する。ＢＣＧ　。

は子供用ワクチンのみで一般に生まれた時に投与され、副作用が発生する率がきわめて小さく、個体に繰返しく例えば多重形式で）使用することができる。加えてＢＣＧおよび他のミコバクテリア（例えば恥垢菌）がワクチンに使用されるとそれらは現在知られている最良の免疫助成剤の性質を有し、従って抗原に対し非常に有効に反応するように受容者の免疫系を刺戟する。

ジエイコブ他によりｒＮａｔｕｒｅＪ　Ｖｏ　］、、３２７゜Ｎｏ、６１２２．ｐｇｓ、５３２−５３５　（１９８７年６月１１日号）で提案されたのは、ＢＣＧが組換型ワクチンの構築のための宿主として使用出来ることであった。換言すれば、現存するワクチン（この場合は結核菌に対するワクチン）をとり出し、他の病原体から、一つもしくはそれ以上の遺伝子の導入を通じてその防御的レバーＩ・リーを拡張することが提案された。ＢＣＧワクチンが生細菌として投与されるので、この細菌で発現されるいずれの外部の抗原、ポリペプチドあるいは蛋白質もワクチン接種に続く細菌から失われないことが基本となる。

裸のＤＮＡが細菌細胞に導入される方法である形質転換が、ミコバクテリアにおいて首尾よ〈実施された。前記引用のジェイコブ他（１９８７年）は、化学的方法によりミコバクテリアの形質転換を述べており、また、スナツパ−他は、ｒＰＮＡＳＶｏｌ、８５．ｐｇｓ、６９８７−６９９１　（１９８８年９月号）で電気穿孔法によるミコバクテリアの形質転換を記述している。電気穿孔法はプラスミドＤＮＡのｕｇ当り１０５からｌＯ″個の形質転換細胞を得ることが出来、このようなプラスミドＤＮＡは形質転換細胞を非形質転換細胞から選択出来るように、カナマイシンなどのような抗生物質マーカー耐性が遺伝子を保持することがある（スナツパ−他、１９８８年）。

ジエイコブ他（１９８７年）およびスナツパ−他（１９８８年）は更に関心のある遺伝子をミコバクテリアに運ぶために、プラスミドおよびバクテリオファージなどのベクターの利用についても述べている。

前記手法を分子クローニングの標準用具（例えば制限酵素等の使用）とを組合わせることにより、関心のある遺伝子のベクターへのクローニングおよびその遺伝子のミコバクテリアへの導入が可能となる。これら遺伝子を発現させるため、遺伝子発現に利用出来るシグナル、とりわけ転写プロモーターエレメントを有することが重要となる。このようなプロモーターエレメントは、ミコバクテ「げ熱シヨツク遺伝子から分離され、ミコバクテリア内の外部抗原を発現するために使用されてきた。

しかし、ミコバクテリア分子遺伝学はつい最近発展し始めたばかりであり、それは部分的にはミコバクテリアが遺伝学研究に難しい障害を提起するためであり、つまり一般的には、ミコバクテリアは培養すると塊状になり、成長がきわめて緩やかであるということであった。トランスポゾンを利用することによる突然変異体の直接選択（ランダム挿入突然変異誘発としても知られる）は、微生物病原論の突然変異分析に対する有用ｐｇｓ、１−１１　（１９８５年）。ティラー他ｒＪ、Ｂａｃｔ（１９８９年）。フィールズ他ｒｓｃｆ　ｅｎｃｅＪ　Ｖｏｌ。

２４３、ｐｇｓ、１０５９−１０６１　（１９８９年）。ベルナＶｏ１．８６．ｐｇｓ、３８６７−３８７１　（１９８９年））。しかし突然変異体のそのような選択はミコバクテリアにつぃては記載されていなかった。

この発明の目的は、ミコバクテリア内での突然変異の生成。

およびもしくは異種遺伝子のミコバクテリアへの導入、とりわけＢＣＧのようなワクチンに使用されるミコバクテリアの突然変異の生成、また同じく、結核菌あるいはらい菌などの病原性ミコバクテリア内での突然変異の生成で、そこではその突然変異がミコバクテリアを非病原性に変換するような生成を含む。

ミコバクテリアに導入される異種遺伝子は、必ずしもそれに限定されないが、多種多様な病原体に対する防御性抗原およびもしくは、治療薬のための遺伝子である。

この発明の一局面に従って、突然変異生型結核菌ＢＣＧ、突然変異結核菌、および突然変異らい菌よりなるクラスから選択された突然変異ミコバクテリアが提供される。ここで使用される「突然変異生型結核菌ＢＣＧＪあるいは「突然変異ＢＣＧＪあるいは「突然変異ヒト結核菌」あるいは「突然変異らい菌」は、遺伝子の発現あるいは機能が親菌株にある非突然変異遺伝子に関して変化しているような少くとも一つの突然変異遺伝子を含む結核菌ＢＣＧ、ヒト結核菌あるいはらい菌であることを意味する。

望ましくは、ミコバクテリアはミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異により突然変異を起こす。ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異は、ＤＮＡのミコバクテリア染色体への非正統的組換えにより、あるいは、相同的組換えにより、もしくは、ミコバクテリア・トランスポゾンのミコバクテリア遺伝子への挿入により実行される。望ましくは、挿入突然変異はＤＮＡのミコバクテリア染色体への非正統的組換えにより行なわれる。

この発明のもう一つの実施例に従って、生型結核菌遺伝子の挿入突然変異を通じて突然変異した突然変異生型結核菌が提供される。生型結核菌の挿入突然変異は突然変異生型結核菌ＢＣＧ、突然変異ヒト結核菌、および突然変異らい菌としてここに記載されているように実行することが出来る。

非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込まれるＤＮＡは、線形ＤＮＡ、あるいは円形ＤＮＡであり得る。望ましくは、ＤＮＡは線形ＤＮＡ断片である。

出願者が発見したのは、原始核細胞ではまれな現象である非正統的組換えが、ＢＣＧあるいはヒト結核菌を線状化プラスミドで形質転換することで生型結核菌ＢＣＧおよびヒト結核菌内で実行出来るということであった。形質転換は従来の技術で当業者に知られているいずれの方法でも達成可能である。例えば、電気穿孔法、あるいは形質転換ＤＮＡが挿入される原形質体の発生、および細胞壁の再生が続く方法などによってであり、ジエイコブ（１９８７年）およびスナツパ−（１９８８年）が記述している。

一つの実施例において、非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込まれるＤＮＡは１選択的マーカーを含んでいる。採用される選択的マーカーは、カナマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、あるはヒグロマイシン耐性マーカー、あるいは必ずしもそれに限定されないが、ミコバクテリオファージＬ５．Ｌｌ、Ｂｘｂｌ、Ｂｘｂ２゜Ｂ　ｘ　ｔ＋３　、Ｄ　２９、あるいはＴＭ４耐性マーカーなどのバタテリオファージ耐性マーカーである。

他の実施例において、ＤＮＡは異種蛋白質をミコバクテリアにコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列を含む。

異種蛋白質をミコバクテリアにコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列は、関心のある蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子の全体あるいは一部であるＤＮＡである。

少くとも一つのＤＮＡ配列によりコード化される関心のある蛋白質あるいはポリペプチドは必ずしもそれに限定されないが、抗原、抗腫瘍剤、酵素、リンフ才力イン、薬理剤、免疫強化剤、詮所情況下で関心のあるリボ−クー分子である。

少くとも一つのＤＮＡがコード化される抗体は、必ずしもそれに限定されないが、らい菌抗原、ヒト結核菌抗原、リケッチア抗原、マラリア胞子小体および*** 小体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、クロストリジウム属抗原、リーシュマニア属抗原、サルモネラ属抗原、ボレリア抗原、マイコバクテリウムアフリカヌム抗原、マイコバクテリウムイントラセルラーレ抗原、角型結核菌抗原、トレボネマ抗原、百日咳抗原、住血吸虫属抗原、フィラリア属抗原、ヘルペスウィルス抗原。

インフルエンザおよびパラインフルエンザウィルス抗原、はしかウィルス抗原、流行性耳下腺炎ウィルス抗原、肝炎ウィルス抗原、赤痢菌抗原、ナイセリア属抗原、狂犬病ウィルス抗原、ポリオウィルス抗原、リフトバレーウィルス抗原、デング熱ウィルス抗原、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原、呼吸器系合胞体ウィルス（Ｒ３Ｖ）抗原、ヘビ毒抗原、ビブリオ属コレラ抗原である。コード化される酵素は、必ずしもそれに限定されないがステロイド酵素である。

少くとも一つのＤＮＡでコード化される抗腫瘍剤は必ずしもそれに限定されないが、インターフェロンａ、インターフェロンβ、あるいはインターフェロンγ、および腫瘍壊死因子、あるいはＴＮＦである。コード化されるリンフ才力インは必ずしもそれに限定されないが、インターロイキン１がらインターロイキン８である。

コード化されるリポータ−分子は必ずしもそれに限定されないが、ルシフェラーゼ、Ｂガラクトシダーゼ、Ｂグルクロニダーゼ、およびカテコール脱水素酵素である。

少くとも一つのＤＮＡ配列でコード化される他の蛋白質あるいはペプチドは必ずしもそれに限定されないが、ストレス蛋白質をコード化するもの、免疫応答を呼び起こすために、あるいは自己免疫病（例えば変形関節炎）に耐性を誘導するために投与出来るものを含む。

一つの実施例において、非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込まれるＤＮＡはプラスミドがら誘導される。

このプラスミドはシャトルプラスミドであり、大腸菌複製起点、バチルス複製起点、ブドウ球菌属複製起点、ストレプトマイセス属複製起点、あるいは肺炎球菌複製起点などのような細菌性複製起点を含む。他の実施例において、プラスミドはミコバクテリア複製起点を含むことが出来るし、あるいはここに記載したミコバクテリア複製起点プラス細菌性複製起点を含むシャトルプラスミドであることも出来る。望ましくは、プラスミドは非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込まれる前に線形化される。

望ましい実施例において、線形ＤＮＡ、例えば線形プラスミドは、非正統的組換えにより、例えばＢＣＧ染色体などのような、生型結核菌染色体、生型結核菌ＢＣＧ染色体、あるいはヒト結核菌染色体、あるいはらい菌染色体に組み込まれる。そのような組み込みによりＤＮＡはミコバクテリア染色体内に遺伝子の挿入突然変異を生じさせる。例えばＤＮＡは、栄養分あるいはアミノ酸の生合成経路に基本的である酵素をコード化する遺伝子の挿入突然変異を起こすことが出来る。

形質転換されたミコバクテリアは、次いで突然変異を生じる遺伝子を決定するためにスクリーニングされる。例えば突然変異ミコバクテリアは、（アミノ酸なしで）最少培地で、また、突然変異ミコバクテリアの栄養要求を決定するための各種アミノ酸を含有する培地で成長する。すなわち突然変異ミコバクテリアは栄養要求性突然変異のためにスクリーンされる。一度突然変異遺伝子が確認されると、補足（すなわち非突然変異）遺伝子は分離され発現ベクターにクローン化される。発現ベクターは次いで突然変異ミコバクテリアに形質転換され、そこで補足遺伝子は突然変異ミコバクテリアに発現され、突然変異ミコバクテリアは原栄養体になる。発現ベクターは更に突然変異ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子になる。そのような蛋白質あるいはポリペプチドは前記記載のものである。補足遺伝子および異種蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子を含むミコバクテリアの選択は、突然変異ミコバクテリアが適切な培地で成長する際に、補足および異種遺伝子が導入され生残する突然変異ミコバクテリアの能力に依存する。

一つの実施例において、発現ベクターは、突然変異ミコバクテリア染色体にバクテリオファージ組込みをコード化する。

ファージＤＮＡ部分である最初のＤＮＡ配列、および補足遺伝子をコード化する第２のＤＮＡ配列を含むＤＮＡであるが、更に、ＤＮＡが組み込まれる突然変異ミコバクテリアに異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第３のＤＮＡ配列を含むことが出来る。

ここで使用される［ファージＤＮＡ部分」はＤＮＡ配列がファージから誘導され、ファージ複製に必要なりＮＡを欠如していることを意味する。

ファージＤＮＡ部分が誘導されるバクテリオファージでは必ずしもそれに限定されないが、Ｌ５．Ｌｌ、Ｂｘｂｌ、Ｂｘｂ２、Ｂｘｂ３．Ｄ２９およびＴＭ４のバクテリオファージ、大腸菌のラムダファージ、コリネバクテリウム属の毒素ファージ、アクチノミセス属およびノルカシア属のファージ、ストレプトマイセス属のφＣ３１ファージ、およびサルモネラ属のＰ２２ファージである。望ましくは、ファージＤＮＡ部分は、ミコバクテリア染色体にミコバクテリオファージをコード化する。

望ましくは最初のＤＮＡ配列は、インテグラーゼをコード化するＤＮＡであり、それは、ＤＮＡを突然変異生型結核菌、あるいは突然変異生型結核菌ＢＣＧあるいは突然変異ヒト結核菌あるいは突然変異らい菌の染色体に組み込むことを用意する蛋白質である。最も望ましくは、最初のＤＮＡ配列もまたａｔｔＰ部位をコード化するＤＮＡを含む。

ａｔｔＰ部位およびインテグラーゼをコード化するＤＮＡ配列は部位特異的組込みとして参照される組み込み事象を提供する。ａｔｔＰ部位およびインテグラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡは、対応する生型結核菌ＢＣＧ、ヒト結核菌あるいはらい菌のａｔｔＢ部位に組み込むことが可能である。

ａｔｔＰ部位をコード化する正確なりＮＡ配列が異なったファージの間で変化し、ａｔｔＢ部位をコード化する正確なりＮＡ配列が生型結核菌、生型結核菌ＢＣＧ、ヒト結核菌、およびらい菌の間で変化することは理解されねばならない。

組込み事象はａｔｔＬおよびａｔｔＲと呼ばれる二つの新しい結合部位を形成し、そのそれぞれがａｔｔＰおよびａｔｔＢのそれぞれを含有している。最初のおよび第２の、望ましくは第３のＤＮＡ配列を含む挿入組込み非ファージＤＮＡは、ａｔ、ｔｌ、およびａｔｔＲ部位に隣接する。ファージＤＮＡ部分の挿入および組込みは、挿入突然変異ミコバクテリア遺伝子、補足遺伝子、および望ましくはミコバクテリアに異質の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮ、Ａ配列を含む形質転成突然変異ミコバクテリアを形成する。

ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第３のＤＮＡ配列は、ここで記載されたような関心となる蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子の全体あるは一部であるＤＮＡ、選択的マーカーをコード化するＤＮＡ、あるいはマーカーおよび関心のある少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドの双方をコード化するＤＮＡであり得る。

コード化される選択的マーカーは、必ずしもそれに限定されないが、ここで記載されているようなカナマイシン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、ヒグロマイシン耐性マーカー、あるいはバクテリオファージ耐性マーカーなどである。

ミクロバクテリオファージ組込みをコード化する第１　ＤＮＡ配列、および補足遺伝子をコード化する第２ＤＮＡ配列、およびもし存在するとしてミクロバクテリアに異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第３ＤＮＡ配列を含むファージＤＮＡ部分は、従来の技術の当業者に周知の遺伝子工学技術で構築することが出来る。一つの実施例において、ファージＤＮＡ部分は、組込みをコード化するＤＮＡに加えて、補足遺伝子をコード化するＤＮＡ、および存在するものとして、必ずしもそれに限定されないが、大腸菌、ストレプトミセス属、バチルス属、ブドウ球菌属、赤痢菌属、サルモネラ属および各種の肺炎球菌などを含む多種多様の生体の複製起点である異種蛋白質をコード化するＤＮＡを含むプラスミドであり得る。望ましくは、プラスミドは大腸菌の複製起点を有する。

ファージＤＮＡ部分は更に適切なプロモーターを含むことが出来る。適切なプロモーターは、必ずしもそれに限定されないがＢ　ＣＧ　ＨＳ　Ｐ　６０およびＨＳ　Ｐ　７０プロモーターなどのミコバクテリアプロモーター、ヒト結核菌およびＢＣＧのミコバクチンプロモーター、スーパーオキシドジスムターゼプロモーター、ヒト結核菌およびＢＣＧのα抗原プロモーター、ＭＢＰ−７０プロモーター、ヒト結核菌およびＢＣＧの４５キロダルトン抗原プロモーター、ミコバクテリアａｓｄプロモーター、ミコバクテリア１４キロダルトンおよび１２キロダルトン抗原プロモーター、Ｂｘｂｌ、Ｂｘｂ２．Ｂｘｂ３プロモーター、ＬｌおよびＬ５プロモーター、Ｄ２９プロモーターおよびＴＭ４プロモーターなどのミコバクテリオファージプロモーター、大腸菌プロモーター、あるいはその他適切なプロモーターである。適切なプロモーターの選択はここで含まれる教訓から、従来技術の当業者の範囲内にあるものと見做される。

一つの実施例においてプロモーター配列は、発現カセットの一部であり、それは更に通常プロモーターの制御下にある遺伝子の一部を含む。例えば、ミコバクテリアＨ３Ｐ６０あるいはＨ３Ｐ７０プロモーターが採用された場合、発現ベクターはプロモーターに加えてＨＳＰ６０あるいはＨ３Ｐ７０蛋白質の遺伝子を含む。発現カセットおよび異種蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡが発現された場合、カセットおよび異種蛋白質、あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡで発現した蛋白質は、ミコバクテリア蛋白質（例えばＨ３Ｐ６０あるいはＨＳＰ７０蛋白質）、および異種蛋白質の断片の融合蛋白質である。

望ましくは、転写開始部位、リボゾーム結合部位およびｍＲＮＡの翻訳の開始を用意する出発コドンは、それぞれミコバクテリア起点である。ｍＲＮＡの翻訳を停止し、補足蛋白質およびもしくは異種蛋白質の合成を終結する停止コドンおよび転写終結部位は、ミコバクテリア起点、あるいは他の細菌起点であり、あるいはそのような停止コドン、および転写終結部位は、そのようなりＮＡが存在する場合補足遺伝子をコード化するＤＮＡあるいは異種蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡのそれである。

ミコバクテリア染色体へバクテリオファージ組込みをコード化するファージＤＮＡ部分である第１ＤＮＡ配列、および補足遺伝子をコード化する第２ＤＮＡ配列、およびもしも存在するとしてＤＮＡが組み込まれる突然変異ミコバクテリアに異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第３ＤＮＡ配列を含むそのようなりＮＡは、１９９０年７月１６日出願の米国特許出願番号筒５５３，９０７号に詳述されており、その内容はここに参考文献として組み入れられている。

他の実施例において、発現ベクターは補足遺伝子をコード化するＤＮＡを含み、更に、ここに記載されたような蛋白質あるいはポリペプチドを発現する突然変異ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡ、および補足遺伝子をコード化するＤＮＡ、およびもし存在するならば異種蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡの発現を制御するミコバクテリアプロモーターとミコバクテリオファージブロモ−ターよりなるクラスから選択されたプロモーターを含むことが出来る。ミコバクテリアプロモーターは、ミコバクテリア染色体にファージを組み込むことをコード化するＤＮＡに関連してここに記載したものである。プロモーターは更に発現カセットの一部であり、カセットはここに記載しているように１通常プロモーターの制御下にある遺伝子の一部を含む。更にまた。転写開始コドン、リボゾーム結合部位および出発コドンは、それぞれミコバクテリア起点であり、また、停止コドン、および転写終結部位はミコバクテリア起点、あるいは他の細菌起点であり、あるいは停止コドン、および転写終結部位は、ここでも記載されであるように補足遺伝子をコード化するＤＮＡ、あるいは異種蛋白質もしくはポリペプチドをコード化するＤＮＡのそれであることが出来る。

一つの実施例において、異種蛋白質あるいはポリペプチドは選択的マーカーである。そのような選択的マーカーは必ずしもそれに限定されないが、Ｂガラクトシダーゼマーカー、カナマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、ヒグロマイシン耐性マーカー、あるいはここで記載されているようなバクテリオファージマーカーである。

一つの実施例において、発現ベクターは更にミコバクテリア複製起点を含む。

もう一つの実施例において、そのような発現ベクターはプラスミドである。プラスミドは非シャトルプラスミド、あるいはシャトルプラスミドであり、それは更に、大腸菌複製起点、バチルス菌複製起点、ブドウ球菌複製起点、ストレプトミセス複製起点、あるいは肺炎菌複製起点などのような細菌複製起点を含む。

ベクターは更に多重クローニング部位を含み、補足遺伝子をコード化するＤＮＡおよびもしくは異種蛋白質をコード化するＤＮＡは多重クローニング部位に挿入される。

ミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリオファージプロモーターを含むそのような発現ベクターは１９９１年１月１６日出願の米国特許出願番号第６４２，０１７号に詳述されており、これは現在放棄された同じ＜１９９０年７月１６日米国特許出願番号第５５２，８２８号の継続したものである。出願番号筒６４２，０１７号はここで参考文献として組み入れられている。

もう一つの実施例において、補足遺伝子およびもしくはミコバクテリアに異種である蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む発現ベクターはシャトルファスミドベクターであり、それは細菌内にプラスミドとして、またミコバクテリア内にファージとして複製する。一つの実施例において、シャトルファスミドベクターは、付着末端部位の二種のものを含む。一つはラムダファージでありそれは大腸菌内で機能する。もう一つはミコバクテリア（例えばミコバクテリオファージＴＭ）であり、これはミコバクテリア内で機能する。望ましくは、そのようなシャトルファスミドベクターはユニーク部位（例えばユニークＥｃｏＲＩ部位）を有し、その中へ補足遺伝子およびもしくはミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドコード化するＤＮＡが挿入される。そのようなシャトルファスミドベクターは１９８９年６月５日出願の米国特許出願番号第３６１，９４４号で詳細に記述されている。その内容はここで参考文献として組み入れられる。

更に理解されるべきことは、この発明の範囲内で補足遺伝子は一つの発現ベクターに含有されており、またミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子は他の発現ベクターに含まれるということである。

前記の通り、ミコバクテリアは、ミコバクテリアトランスポゾンのミコバクテリア遺伝子への挿入によって実現されるミコバクテリアの挿入突然変異を含む。かくして、この発明のもう一つの局面に従って、ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異を実現するためにミコバクテリア染色体へ無作為に挿入することが出来るミコバクテリアトランスポゾンが提供される。ミコバクテリアトランスボソンは、例えば生型結核菌染色体、生型結核菌ＢＣＧ染色体、ヒト結核菌染色体、鳥型結核菌染色体、らい菌染色体あるいは恥垢菌染色体に無作為に挿入出来る。一つの実施例において、トランスポゾンは恥垢菌ｌ５１０９６）ランスボゾンである。

以下に記載されるｌ５１０９６トランスポゾンは２，２７５塩基対の長さであり、転位に含まれる蛋白質をコード化する２個の読み取り枠を含有する。恥垢菌内でこのＩ　Ｓ　１９９６１−ランスボゾンは発見されたが、トランスポゾンはここで記述されるようにミコバクテリアの他の属でも挿入突然変異を発生するのに使用される。

ここで使用される「トランスポゾン」という用語は、非突然変異トランスポゾン、あるいは、トランスポゾンの一部が削除され、およびもしくは取り替えられ、およびもしくはトランスポゾンが追加のＤＮＡ配列を含む突然変異トランスポゾンを意味する。

一般に、トランスポゾンはそれぞれ（５′および３′）末端に逆方向反復塩基配列、および逆方向反復塩基配列の間にトランスボザーゼ酵素をコード化する遺伝子を含有する。トランスボザーゼは、トランスポゾンがＤＮＡ　（例えば染色体ＤＮＡ。

プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡなど）から立ち退き、別のＤＮＡあるいは同じＤＮＡの他の領域に挿入あるいは転位するように逆方向反復塩基配列に作用する。ある場合には、トランスポゾンは更に、転位を調節するりゾルベースおよびもしくは調節蛋白質をコード化する遺伝子を含む。

ミコバクテリアトランスポゾンで実施される挿入突然変異番ヨ、染色体の一つの領域がらのミコバクテリア染色体に含まれるトランスポゾンの、染色体の他の領域に含まれるミコバクテリア遺伝子へと「ホッピングＪする無作為転位により、実行されるし、あるいは各種の手段によりトランスポゾンはミコバクテリアに形質移入することが出来る。形質移入に続き、トランスポゾンは次いで挿入突然変異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に挿入することが出来る。

トランスポゾンは、ミコバクテリアベクターおよびミコバクテリオファージベクターを含むいずれのプラスミドあるいはファージＤＮＡベクターにも含まれる。

一実施例において、トランスポゾンはミコバクテリアベクターに含まれる。このペクターは前記記載のようにミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリオファージプロモーターを含む。もう一つの実施例において、トランスポゾンは前記記載のようにミコバクテリア染色体へのファージの組込みをコード化するミコバクテリア発現ベクターあるいはＤＮＡを含むし、あるいはトランスポゾンは、一つの生体内で複製出来るファージＤＮＡ内では得られるが、ファージが形質移入される生体内では含まれない。代替的に、トランスポゾンはミコバクテリア以外の細菌に複製出来るがミコバクテリアには複製出来ない接合性プラスミドに含有される。例えばトランスポゾンは大腸菌あるいはストレプトマイセス属などの細菌には複製出来るが、生型結核菌ＢＣＧには複製出来ない接合性プラスミドに含有される。

一実施例において、トランスポザーゼをコード化する遺伝子およびレゾルベースをコード化する遺伝子、およびもしくはもし存在するとしての調節蛋白質がそのトランスポゾン内部の正しい位置（逆方向反復塩基配列の間）から除去される構築物が作られ、その構築物内では逆方向反復塩基配列の外部に置かれる。前記記載のような選択的マーカー（例えば抗生物質耐性）は、次いで逆方向反復塩基配列の間で位置を占める。転位因子はかくして逆方向反復塩基配列および選択可能なマーカーを含む。この構築物は次いでミコバクテリア発現ベクターにクローニングされ、これはミコバクテリア複製起点を含み、また前記記載のもののようなミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリオファージプロモーターを含む。プラスミドのミコノ（クチリア複製起点は次いで、ミコバクテリア複製起点が温度に感受的になるように突然変異される（例えばプラスミドは３０℃で複製出来るが、３７℃では出来ない）。プラスミドは次いで３０℃でミコバクテリアに形質移入され、ミコバクテリアは抗生物質耐性で選択される。抗生物質耐性コロニーは次いで抗生物質を含む完全培地で３７℃で培養される。３７℃では、突然変異ミコバクテリア複製起点は複製出来ない。生残するミコバクテリアは、逆方向反復塩基配列を含む転位因子がプラスミドからミコバクテリア染色体に転位したものである。トランスボザーゼ遺伝子、およびレゾルベース遺伝子およびもし存在するとして調節蛋白質遺伝子がプラスミドに残っているために、トランスボザーゼ遺伝子およびレゾルベースおよびもしくはもし存在するとしての調節蛋白質遺伝子がミコバクテリアの更なる複製で失われ、従ってミコバクテリア染色体への挿入に際し転位構築物はその後何らの転位を受けることもな（なる。

代わりに、前記記載の構築物は、ミコバクテリアに複製出来ないベクターにクローニングする。すなわち、このベクターはミコバクテリアの複製起点を含まない。ベクターは次いでミコバクテリアに形質移入される。構築物を有するベクターがミコバクテリアに複製しないので、ベクターは消失する。形質移入の後でミコバクテリアは抗生物質耐性でスクリーニングされる。生残するミコバクテリアは逆方向反復塩基配列を含む転位因子および抗生物質耐性マーカーがプラスミドからミコバクテリア染色体へ転位したものである。トランスポザーゼ、プラスリシルベースおよびもしも存在するとしての調節蛋白質遺伝子はプラスミド内に残存しており、従ってミコバクテリアの複製を繰返す毎に失われ、そのため、転位構築物は、ミコバクテリア染色体への挿入に際して、更なる転位を受けることはなくなるであろう。

ミコバクテリアトランスポゾンが構築されるがそれはミコバクテリアに異種の蛋白質をコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列を含むことも考察される。ミコバクテリアに異種の蛋白質をコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列は、関心のある蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子のすべであるし）は一部であるＤＮＡであり得る。関心のある蛋白質あるいはポリペプチドは前記記載のものである。ミコバクテリアに異質の蛋白質をコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列は適切なプロモーターの制御の下にある。このようなトランスポゾンはまた当業者に周知の技術で構築すること力咄来る。トランスポゾンはまた前記記載のトランスボザーゼ遺伝子およびもしくは選択可能なマーカーを含むことが出来る。代替的に、トランスボザーゼ遺伝子、およびリシルベース遺伝子およびもしくはもしそれが存在するものとしての調節蛋白質遺伝子がミコノ＼クチ１ノアトランスポゾンから除去され、逆方向反復塩基配列の外側に位置するような構築物が形成され、またミコバクテリ月こ異種の蛋白質をコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列および望ましくは選択可能なマーカーが、逆方向反復塩基配列の間に位置を占める。構築物は、次いでミコバクテリアへの形質移入のため、前記記載のようにベクター内に置かれる。逆方向反復塩基配列を含有する転位因子、ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する少くとも一つのＤＮＡ配列および選択可能なマーカーは次いでミコバクテリア染色体に無作為に挿入される。

ミコバクテリアトランスポゾンにより一度ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異が実行されると、ミコバクテリアは前記記載の方法により突然変異される遺伝子を決定するためにスクリーニングされる。突然変異遺伝子が一度確認されると、補足遺伝子が分離されまた発現ベクターにクローニングされ、それは突然変異ミコバクテリアに形質転換される。

この発明の範囲内で考察されたことは、更に、挿入突然変異が遺伝子のヒト結核菌内に病原性をヒト結核菌に授け、これによりヒト結核菌を病原性から非病原性の生体に形質転換させる。このような突然変異非病原性ヒト結核菌生体は結核菌に対する防御のワクチンに使用される。もし望ましければ、突然変異非病原性ヒト結核菌生体は、前記記載の通り更に挿入突然変異を受け、これにより栄養要求性突然変異が突然変異ヒト結核菌生体に授けられる。その突然変異ヒト結核菌生体は次いで前記記載の当業者により遺伝的に操作され、補足遺伝子およびもしくは関心のある異種の蛋白質に対する遺伝子も発現される。

ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するＤＮＡで形質転換された前記記載の突然変異ミコバクテリアは、形質転換突然変異ミコバクテリアにより発現された蛋白質あるいはポリペプチドに依存してワクチンもしくは治療薬の生産に用いることが出来る。

そのワクチンあるいは治療薬を形成するために、形質転換突然変異ミコバクテリアは、適切な薬剤キャリアと併用して投与される。適切な薬剤キャリアの代表例としては、鉱油、ミョウバン、合成ポリマーなどがある。ワクチンおよび治療薬の溶剤は当業者にとって周知であり、適切な溶剤の選択はここでの教訓から当業者の範囲内にあるものと見做される。適切な溶剤の選択は更にワクチンあるいは治療薬が投与される方法にも依存する。ワクチンあるいは治療薬は注射の形をとることが出来、筋肉、静脈内、経口、皮肉あるいは皮下投与で投与される。

ワクチンあるいは治療薬を投与する他の手段はここでの教訓で当業者には明白である。従ってこの発明の範囲は特定の運送形態に限定されるものではない。

形質転換突然変異ミコバクテリアがワクチンとして利用される場合、そのワクチンは現在利用出来る他のワクチン以上に重要な利点を持つ。ここで指示されるようにミコバクテリアは現在知られている最良のアジュバント性能を有し、従って、受容者の免疫系統が大きな効果で応答するよう刺戟する。ワクチンのこの局面が細胞性免疫を誘導し、かくして細胞性免疫が耐性に非常に重要である場合に病原に対する免疫を提供するのに特に有用である。更にミコバクテリアは長期の記憶すなわち免疫を刺戟することが出来る。かくしてそれは長期持続Ｔ細胞記憶を活性化することが可能であり、感染因子あるいは毒素を中和する第２吹拭体応答を刺戟する。そのＴ細胞を活性化することは、例えば、破傷風やジフテリアの毒素、百日咳、マラリア、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、狂犬病、リフトバレー熱ウィルス、デング熱ウィルス、はしかウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、呼吸器系合胞体ウィルス、ヒト腫瘍、およびヘビ毒に対し有用である。

ワクチンあるいは治療薬としてこの発明に従って形質転換されたミコバクテリアを採用するもう一つの利点は、一般にミコバクテリアが大きなゲノム（すなわち約３Ｘ１０’塩素対の長さ）を有することである。ゲノムが大きいため、他の源から大量のＤＮＡを融通することができ、１個以上の抗原およびもしくは治療薬をコード化するＤＮＡを含むワクチンおよびもしくは治療薬を作り出すことが出来る。

この発明は下記の実施例に関連して記述される。しかし、この発明の範囲はそれによって限定されるものではない。

実施例１（比較）恥垢菌の無作為シャトル突然変異恥垢菌菌株ｍｃ”　６の染色体ＤＮＡ　（ジヱイコブ、ジュニア他ｒＮａｔｕｒｅＪＶｏ１．３２７．ｐｇｓ、５３２−５３６（１９８７））はＭ　ｓ　ｐ　Ｉで部分消化された。次のサイズ選択、４Ｋｂから７ＫｂまでのＤＮＡ挿入はＣ１ａＩ消化ｐＹＵＢ３６にて結合された（図１）。ｐＹＬＩＢ３６はアンピシリン耐性の遺伝子（ａｍｐ）、および大腸菌複製起点を含み、ｐＢＲ３２２の誘導体であり（ポリパー他、ｒＧｅｎｅＪＶｏ１．２．ｐｇｓ、９５−１１３　（１９７７））、そこで、非必須１．９Ｋｂ　ＥｃｏＲＶからＰｖｕｌＩ断片が除去された。ＤＮＡ挿入がＣ１ａＩ消化ｐＹＵＢ３６に連結された後、生成した構築物は大腸菌株Ｘ２３３８の誘導体である大腸菌株ｅｃ”　２７０に形質転換され（ジェイコブ他ｒＰ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｊ　Ｖｏｌ、８３．ｐｇｓ。

１９２６−１９３０　（１９８６））、その中でトランスポゾンＴｎ５．配列ｌ　（ナグ他ｒＧｅｎｅＪ　Ｖｏｌ、６４．ｐｇｓ。

１３５−１４５　（１９８８）（図２）が染色体の未知の位置で挿入された。Ｔｎ５配列ｌはカナマイシン耐性を大腸菌およびミコバクリチアの双方に授けるネオ遺伝子をコード化し、そのネオマシンハイパー耐性表現型を使用するプラスミドベクターにクローニングするＤＮＡ配列への挿入の選択を可能にしくバーブ他、ｒＧｅｎｅｔｉｃｓＪ　Ｖｏｌ、１０５．ｐｇｓ。

８１３−８２８　（１９８３））、またＴｎ５ｓｅｑｌはストレプトマイシン耐性をコード化するＴｎ５に存在していたクリプテイック遺伝子を欠いている。因にストレプトマイシン耐性は、下記に記述するように、ヒト結核菌株の遺伝子工学にとっては重要な生物災害問題なる。（ｒＵ、Ｓ、Ｆｅｄ、ＲｅｇｉｓｔｅｒＪ　Ｖｏｌ、５１．ｐｇ、１６９５７）形質転換大腸菌生体は、アンピシリンおよびカナマイシンをそれぞれ４０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌの濃度を有するし寒天培地を培養された。約３００００個体形質転換細胞がプールされ、２０個の独立した５ｍｌ培養で１０−３に稀釈され一夜３７℃で保温された。−後培養のそれぞれからの２００μｌサンプルは、２５０μｇ／ｍｌネオマイシンを含有するし寒天上に約１０００個のコロニーを作り出したが、ここでそのコロニーは、大腸菌染色体から形質移入プラスミド−のＴｎ５ｓｅｑ　１の転位を通じて授けられるネオマイシンハイパー耐性で選択された。ネオマイシンハイパー耐性コロニーから得られたプラスミドＤＮＡは、バーンボイムｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ　Ｖｏｌ、ｔｏｏ、ｐｇｓ、２４３−２５５（１９８３）で記載されている方法で分離され、大腸菌株Ｘ２３３８に再び形質転換され、プラスミドＤＮＡは引き続き形質転換細胞から分離、調製されて。Ｔｎ５ｓｅｑ　ｌ突然変異プラスミドライブラリーは次いで恥垢菌株ｍｃ”　６あるいはｍｃ２１５５に電気穿孔され（スナツパ−他、ｒＭｏＬ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ　Ｖｏｌ、４．ｐｇｓ、１９１５−１９１９　（１９９０））、またカナマイシン耐性形質転換細胞は、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するに寒天（ミドルプルツク７Ｈ１０寒天、５ｍｇ／ｍｌカザミノｆｉｌ（Ｄｉｆｃｏ）、ｌｏｏｕｇ／ｍｌジアミノピメリン酸、５０ｕｇ／ｍｌチミジン、４０ｕｇ／μｌウラシル、１３３ｇｇ／ｍｌアデノシン、０．２％グリセロール、卵白デクストローズ複合体、およびＩＯμｇ／ｍｌシクロへキサミドで補足）から選択された。カナマイシン耐性形質転換細胞はプラスミドＤＮＡのｐｇ当り２０から４０の頻度で得られた。相同ＤＮＡ配列を欠除している対照ｐＢＲ３２２：　Ｔｎ５ｓｅｑ１プラスミド（図１３で示されるｐＹＵＢ２４４で知られるもの）からはカナマイシン耐性コロニーは得られなかった。約８００個の恥垢菌形質転換細胞がアスパラギンなしで最小ツートン培地にストリーキングすることで栄養要求性突然変異のためスクリーニングされた。形質転換細胞はデーヴイス他［遺伝子工学マニュアル。

先行細菌遺伝学」コールド、スプリング、ハーバ−、ラボラトリ−（１９８０１Ａｐｐｅｎｄｉｘ２．ｐｇｓ、２０９−２１０で記載された栄養素要求性突然変異のためスクリーニングされた。このスクリーンの結果、３個の栄養素要求性突然変異体が得られ、その栄養素要求株は、同じくディヴイス他（１９８０）で記述されているように、大腸菌の栄養素要求株突然変異分析で用いられた１１個のプールの栄養分の１個もしくは他のもので補完されたツートン寒天平板により決定された。このスクリーンで得られた栄養素要求性突然変異体３個は、メチオニン要求性突然変異体（恥垢菌株ｍｃ”３１１）、ピリドキシン要求性突然変異体（恥垢菌株ｍｃ”３１３）および特徴の不完全な突然変異体であった。

実施例２Ａ、恥垢菌メチオニン要求性突然変異体のＢＣＧパスツール相補性クローンの分離。

ＢＣＧパスツールのゲノムライブラリー（ＷＨＯレフエレンスライブラリ−１国立血清研究所、コペンハーゲンより入手）は、４Ｋｂ−７Ｋｂ、Ｍｓｐ−１消化染色体ＤＮＡ断片をＣ１ａＩ消化ｐＹＵＢ５３に連続して構築された（図３）。

後者は大腸菌ミコバクテリアシャトルベクターであり、大腸菌複製起点およびミコバクテリア複製起点を含んでいる。連結されたＩ）　Ｎ　Ａは次いで大腸菌株ｅｃ”　２７０に導入され、スナツパ−他（１９８８）に記載された大腸菌プールから分離されたプラスミドは、恥垢菌メチオニン要求性突然変異体ｍｃ”３１１に電気穿孔された。このためプラスミドはミコバクテリア複製起点を持っているためミコバクテリア染色体には組み込まれず、ミコバクテリア内で自己複製する。スナツパ−他（１９８８）に記載されているように、（ｍｅｔ相補相補ワクローンて引用される）ｍｃ”３１１に原栄養体性を授けるプラスミドが分離された。

Ｂ、ｍｅｔ相補性クローンの不活性化前記実施例１で記載の通り、ｐＹＵＢ　１２１と名付けられたｍｅｔ相補性クローンはネオマイシンハイパー耐性選択により、大腸菌の挿入不活性化を受けた。

個体ｐＹＵＢ　ｌ　２１クローンは、デーヴイス他（１９８０）に記載の手法に従って、ｍｃ”　３１１メチオニン要求性突然変異を補完する能力の減少を確かめるためスクリーンされた。

Ｃ，ＢＣＧの組換えスナツパ−（１９８８）の手法に従い、プラスミドｐＹＵＢ１２］、、２４ａ（図４）、ｐＹＵＢ１２１．３　（図５）およびｐＹＵＢ１２１．２　（図６）がｍｃ”３１１メチオニン要求性突然変異体から分離されたｐＹＵＢ１２１．２４ａ。

ｐＹＵＢ１２１．３およびｐＹＬＩＢ１２１．２のそれぞれがＥｃｏＲＩで消化された。各プラスミドからのＴｎ５ｓｅｑｌを含むＥｃｏＲＩ断片が、対応するｐＹＵＢ１４９　（図８）、ｐＹＵＢ１４７　（図９）およびｐＹＵＢ１４６　（図１０）をそれぞれ得るため、ミコバクテリアに複製不可能な大腸菌ベクターであるＥｃｏＲＩ消化ｐ、ＹＵＢ１３７（図７〕にサブクローニングされた。

ＢＣＧパスツールは、バーナディー二重ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｊ　Ｖｏｌ、８６．ｐｇｓ、３８６７−３８７１　（１９８９）の記載により、但し下記の修正を伴ってｐＹＵＢ　１４６で電気穿孔された。ＢＣＧ培養はＭＡＤＣ−ＴＷ肉汁５０ｍ１内でｌ：５０で二次培養（スナツパ−他ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、５ｃｉＪ　Ｖｏｌ、８５゜ｐｇｓ、６９８７−６９９１　（１９８８）され、１０日間３７℃で成長した。得られた培養はコールドグリセロール５０ｍ１で、次いで２５ｍ１で洗滌された。遠心分離に続き、最終ベレットは各電気穿孔で用いられる１０のコールドグリセロール２．５ｍｌおよび０．４ｍｌで再懸濁された。ＢＣＧ形質転換細胞は、スナツパ−他（１９８８）に記載の通り、卵白デキストローズ複合体、（ＡＤＣ）、０．２％グリセロール、カナマイシン（２０ａｇ／ｍ　１　）およびメチオニン（５０ａｇ／ｍ　ｌ　）を含む１０ａｇ／ｍｌシクロへキサミドで補完されたミドルプルツク７Ｈ１０寒天で培養された。

Ｔｎ５　５ｅｑｌ不活性化メチオニンを含む線形ＤＮＡ断片の二重交差事象から得られる相同性組換えは、カナマイシン耐性メチオニン要求性ＢＣＧ突然変異体を作り出すものと考えられた。しかし期待に反して、ＢＣＧパスツールの２００個以上のカナマイシン耐性形質細胞の１個だけのメチオニン要求性突然変異体が、Ｔｎ５　５ｅｑｌ不活性メチオニン遺伝子を含む線形ｐＹＵＢ　ｌ　４６の形質転換から得られた。形質転換細胞はデーヴイス他（１９８０）の手法に従いスクリーンされた。この結果が示すことは、高度の非正統性あるいは無作為組換えが形質転換ＢＣＧパスツール生体に生じ、そこではＢ’ＣＧ染色体にある相同性ｍｅｔ部位にＴｎ５ｓｅｑ　１不活性ｍｅｔ遺伝子が組換えも組み込みもしなかったことであった。

実施例３ＢＣＧにおける非正統的組換えの論証以下でＢＣＧ菌株ｍｅ２５７６として引用される実施例２で得られたＢＣＧメチオニン要求性突然変異体よりの全染色体ＤＮＡは、ＡＴＣＣＮｏ、５５２０２として預けられ、他の２個のカナマイシン耐性形質転換細胞はプローブとしてＢＣＧｍｅｔ遺伝子よりの１．８ｋｂＸｈｏｌＤＮＡ断片を用いてサインプロツティング分析を受けた（図１１）。図１１のレーン１に示されるように、このプローブは野生型ＢＣＧ染色体に８．５ｋｂ断片を発見する。もし相同性組換えが起こっていたなら、染色体と形質転換プラスミドからの線形ＤＮＡの間の二重交差は、挿入不活性遺伝子により染色体ｍｅｔ遺伝子に代替していた筈であった。サインブロツティング分析で、染色体の８．５ｋｂＸｈＯＩ断片はＴｎ５ｓｅｑ　１にあるＸｈｏ　Ｉの存在のため２個の新しいＸｈｏ　Ｉ断片に代替する筈である。

２個の断片の全長は８．５Ｋｂプラス３．２ｋｂであり、３．２ｋｂはＴｎ５ｓｅｑｌの長さである。しかし図１１が示すように、ｍｃ２５７６　（レーン２）栄養性要求突然変異体は、他の２個のカナマイシン耐性形質転換細胞（レーン３および４）と同じように、３個のＸｈｏＩ断片を含み、１個は８．５Ｋｂ断片で、２個は断片ＡおよびＢで、それはＴｎ５ｓｅｑｌ不活性ＢＣＧｍｅｔクローンに存在するものと同じである。これらの結果が示すことは、メチオニン要求性突然変異体ｍｃ’５７６にも他の２個のカナマイシン耐性形質転換細胞にも二重交差は生じなかったということであった。従って、Ｔｎ５ｓｅｑｌ不活性ｍｅｔ遺伝子を含む線形ＤＮＡ断片はＢＣＧ染色体に非正統的に組み込まれた。

更にＨｉｄＩＩＩ消化染色体ＤＮＡおよび同じＸｈｏＩｍｅｔプローブを用いて、サイン分析が行なわれた。野生型ＢＣＧの分析は１個のみの断片（図１１．レーン５）を発見する。

図１１に示されるように、ドナー（プラスミド）ＤＮＡの内部Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片Ｃは、すべてのクローン（レーン６．７および８）に保持される。プローブを用いるＨｉｎｄＩＩＩ消化染色体ＤＮＡのサイン分析は、栄養素要求性突然変異体（レーン６）および原栄養体（レーン７および８）で＊印で示されるように隣接断片Ｃを発見し、またそのサイズは組み込みの部位に依存する。異なったＢＣＧ組換え体からの隣接断片Ｃのサイズの変化は、更にドナーすなわち形質転換ＤＮＡ断片がＢＣＧ染色体に無作為に組み込まれていることを示す。更にまた、Ｘｈｏ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化染色体ＤＮＡは、ドナーのｍｅｔ遺伝子でＴｎ５ｓｅｑｌの位置が変化せず、またＴｎ５ＳｅＱｌはＢＣＧ染色体に転位しなかったことを示した。

サイン分析は次いで、線形化されたｐＹＵＢ１４６の形質転換で得られた９個の追加カナマイシン耐性形質転換細胞よりのＨｉｎｄＩＩＩ消化およびＸｈｏＩ消化染色体ＢＣＧＤＮＡに対し、ＢＣＧｎｅｔ遺伝子から得られたＸｈｏ　Ｉプローブを使って行なわれた。３個のドナーバンドＡ、ＢおよびＣが９個のクローンすべてで発見され、相同的組換えが行なわれなかったことを示した。グアニンおよびシトシン、ヌクレオチドに富むミコバクテリアＤＮＡは、標準ゲル電気泳動では溶解しない非常に大きいＨｉｎｄｌＩＩ断片を作り出すので、前記記載のバンド０組込みの無作為を確立するために、サインブロッティング分析は、１２個のクローンのＡｖａＩ消化染色体ＤＮＡをベクダブローブでハイブリッド形成することで実行された。

図１２で示されたように、プローブはｐＹＵＢ　１４６に４個の断片を発見しくレーン１）、野生型ＢＣＧには断片はなく（レーン２）、各レーン（レーン３〜１４）に保護される２個の内部断片を発見しそれは各クローンでサイズが変り、異なったパターンを示し、これは組込みが無作為部位で起こり、また高度の非正統性組換えがＢＣＧに起きたことを論証した。

実施例４この実施例では、前記記載の非正統性、すなわち非相同性組換えがＢＣＧの特性であるのが、あるいはメチオニン（ｍｅｔ）遺伝子の特性であるのかを決定するために行なわれた。

Ｔｎ５ｓｅｑ　１がｐＹＵＢ２４４を形成するためにｐＢＲ３２２に挿入される。円形および線形ｐＹＵＢ２４４の等量が恥垢菌に電気穿孔された。この電気穿孔では円形あるいは線形ｐＹＵＢ２４４のいずれにも組込みは生じなかった。組込みはカナマイシン耐性の選択〔スナツパ−他（１９８８））、続くサインブロツティング分析で決定された。恥垢菌の補完ｍｅｔクローンに挿入されたＴｎ５ｓｅｑ　１を有する円形および線形のｐＹＵＢ　ｌ　５６の等量（図１４）が、次いで、恥垢菌に電気穿孔された。スナツパ−他（１９８８）の手法で決められたように、線形および円形ｐＹＵ８１５６を使用するカナマイシン耐性コロニーの頻度はほぼ同じであり、次いでサインブロツティング分析が行われた。恥垢菌のカナマイシン耐性コロニー６個のサインブロッティング分析で、ｐＹＵＢ１５６の組込みが６個のコロニーすべてにおいて染色体のＥｃｏＲＩ断片で生じたことが示された。この結果、ミコバクリチア相同性配列が恥垢菌染色体への組込みに必要であり、また恥垢菌への組込みは相同性組換えにより生じすることが判明した。

円形およびＥｃｏＲＩ消化ｐＹＵＢ２４４およびＴｎ５ｓｅｑ　ｌ不活性ＢＣＧｍｅｔクローン（ｐＹＵＢ１４６゜ｐＹＵＢ１４７およびｐＹＵＢ１４９）の等量がＢＣＧに電気穿孔された。前記の内円形ではなく線形の断片が、その断片がミコバクテリアを含んでいるか否かにかかわらず、約１Ｏ−６から１０−’／ｕｇＤＮＡの頻度で染色体に組み込まれた。組込みは（１）コロニーはカナマイシン耐性であること、および（２）前記記載のサインブロッティング分析で証明されるドナー分子でバイブリド形成される形質転換細胞からの染色体ＤＮＡ、という２個の評価基準で決定される。

円形および線形ｐＹＵＢ２４４およびｐ、ＹｔＪＢ８（図１５）でＢＣＧが電気穿孔される実験が更に行われた。ｐＹＵＢ８はｐＢＲ３２２の誘導体で、そこではｐＢＲ３２２のａｍｐ遺伝子はＴｎ８９３のａｐｈ　（カナマイシン耐性）遺伝子に置換されており（スナツパ−１９８８）、また、Ｔｎ５ｓｅｑ　１の配列を欠除している。この実験では、ｐＹＵＢ２４４およびｐＹｔＪＢ８双方の線形ＤＮＡはＤＮＡｕｇ当り１個だけ形質転換細胞を得たが、一方スナッパー他（１９８８）の手順に従って、線形化されたｐＹＵＢ８はそれぞれＤＮＡｕｇ当９１２個および１０個の形質転換細胞を得、その後サインブロッティング分析が行われた。この結果、ＢＣＧにおける非正統的組換えはＴｎ５ｓｅｑｌのトランスボザーゼ機能に依存しないことが示される。

実施例５この実施例では、円形および線形ｐＹＵＢ２４４およびｐＹＵＢ　１４７がヒト結核菌病原性Ｈ３７Ｒｖ菌株（疾病管理センター、ジョーシア州アトランタ、ウィルバー、ジョーンズ博士より入手）に電気穿孔された。この電気穿孔の結果、スナツパ−他（１９８８）で決定されたようにｐＹＵＢ　ｌ　４７およびｐＹＵＢ２４４双方の線形のものが、より高い頻度でヒト結核菌染色体に組み込まれることが示され、その後サインブロツティング分析を受けた。前記の結果、非正統的組換えはＢＣＧに限定されないことが示される。

実施例６非正統的組換を利用するＢＣＧイソロイシン−ロイシン−バリン栄養素要求性突然変異体の分離および特性付けＢＣＧパスツールは電気穿孔法により線形化ｐＹｔＪＢ２４４に形質転換された。電気穿孔法に続き、ＢＣＧ細飽は０．５ｍｇ／ｍｌカザミノ酸および２０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するミドルプルツク７ＨＩＯ寒天で培養された。カナマイシン耐性コロニーはツートン最小培地で成長する能力を調べるためスクリーンされ、またデーヴイス他（１９８０）で記述される栄養素要求性突然変異のためスクリーンされた。栄養素要求性突然変異分析は、ｍｃ’７１６と指定される１個のＢＣＧ突然変異細胞が、成長のためイソロイシン、ロイシンおよびバリンを必要とすることを示した。

ＢＣＧパスツールのゲノムライブラリーは、実施例２で前記記載の通り、４Ｋｂ −７Ｋｂ、Ｍｓｐ−１消化染色体断片なＣ１ａＩ消化ｐＹＵ８５３に連続して構築された（図３）。スナツパ−他（１９８８）による記述の通り、連続ＤＮＡは次いで大腸菌株ｅｃ”　２７０に導入され、プラスミドは大腸菌のプールから分離され、ＢＣＧ菌株ｍｃ”７１６に電気穿孔されＡＴＣＣＮｏ、５５２０３として預けられた。（イソロイシン−ロイシン−バリン補完クローンとして引用される）ｍｃ”７１６に原栄養性を授け、またＢＣＧｉｌｖ遺伝子を含有するプラスミドは、スナツパ−他（１９８８）に記述されるように分離された。このプラスミドはｐＹＵＢ２４５として参照される（図＋６］。

実施例７Ａ、恥垢菌の突然変異ａｓｄ選伝子を有するプラスミドの構築アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（ａ　ｓ　ｄ）遺伝子は、アスパラギン酸からジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を生合成する初期の段階の触媒作用をする酵素をコード化し、か（してそれはミコバクテリアの細胞壁生合成に重要な成分となる。

ａｓｄ遺伝子および組換えＤＮＡベクターに図するａｓｄ遺伝子によるその補完の中で突然変異を含む菌株は、ベクターを生体内で維持するための有用な栄養素要求性突然変異選択システムを代表するものとなる。ジェイコブ他ｒＰＮＡｓＪ　Ｖｏｌ。

８３、ｐｇｓ、１９２６−１９３０　（１９８６）の手順に従って、恥垢菌ａｓｄ遺伝子は大腸菌ａｓｄ突然変異体を補完し、核酸配列を決定することによりクローニングされた。ａｓｄ遺伝子は、２個のＰｓｔＩ部位を遺伝子の真中に持ち２個のｐｓｔＩ部位を遺伝子の側面に持つ５ＫｂＥｃｏＲＩ上に運ばれる。ａｓｄ遺伝子はｐブルースクリプトＫｓ＋のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされ、（ストラータジエン社、ラホーラ。

カリフォルニア）、生じたプラスミドはｐＹＵＢ１１４と指定された（図１７）、ｐＹＵＢｌ　１４はＥｃｏＲＩで消化され、大きなＥｃｏＲＩ断片は次いで分離され、ＥｃｏＲＩ部位でｐＧＥＭ−７２ｆ＋　（プロメガ）と連結され、ｐＹＵＢ　ｌ　６０を形成した（図１８）、ｐＹＵＢ１６０はＰｓｔＩで切断され、ａｓｄ遺伝子の中央１．６３７ｂｐの欠失を有する大きい断片は分離された。ｐＹＵＢ８　（図１５）はＰｓｔＩで切断され、ＰｓｔＩ　Ｋａｎ１１カセットはｐＹＵＢ８から分離され、ｐＹ（ＪＢ　１６０からの大きいＰｓｔＩ断片に連結された。

生成した連結は、電気穿孔法によりｐｙｕＢｌ　１４に運ばれるアンピシリン耐性を選択する大腸菌株ＤＨ５ｘに形質転換された（ダワー他、’ｒＮｕｃ１．Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、Ｊ　Ｖｏｌ。

＋６．ｐｇｓ、６１２７−６１４５）、形質転換細胞はａｓｄ遺伝子の中央１．６３７ｂｔを］、３ＫｂＫａｎ”　カセットと置換するためにスクリーンされた。生じたプラスミドｐＹＵＢ２０５　（図１９）は、ａｓｄ遺伝子の１．６３７ｂｐを欠除し、それはａｐｈ遺伝子に置換されている。そのような欠除および置換は以後△ａｓｄ　：　：　ａｐｈとして引用される。

ｐＹＵＢ２０５は次いでＥｃｏＲＩで切断され、大きい断片はアガロースゲルから分離された。断片は次いでｐＹＵＢ　ｌ　７４に連結され（図２０）、それはＥｃｏＲＩで切断され、子牛の腸のフォスファターゼでフォスファターゼ化された（ベーリンガー社、インディアナポリス、インディアナ）。βガラクトシダーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＹＢＢ　１７４は、ミコバクテリアにβガラクトシダーゼを発現させるために、切形βガラクトシダーゼ遺伝子の上流である前に分離されたミコバクチオファージＬ　ｌプロモーター（パーラツタ他ｒＪ、Ｇｅｎ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｊ　（１９９１））を置くことで構築された。生じたプラスミドｐＹＵＢ２１５（図２１）はΔａｓｄ：：　ａｐｈ遺伝子、およびミコバクテリオファージＬｌプロモーターで制御される切形βガラクトシダーゼ遺伝子を有している。

Ｂ、ｍｃ”　６８７の構築ジェイコブ他ｒＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏ１．Ｊ　Ｖｏｌ。

２０４、ｐｇｓ、５３７−５５５　（１９９１）の手法に従って、ｐＹＵＢ２　］　５は電気穿孔法により恥垢菌株ｍｃ２６に形質転換された。この形質転換は次いでＭ−ＡＤＣ平板で１５ｇ／ｌバクト寒天で培養（ジエイコブズ他、１９９１年）され、カナマイシンを含み、ＩＯμｇ　／　ｍ　１で加えられ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−ｇａｌ）を８０μｇ／ｍｌで加えられ、この培地はこれからＭ−ＡＤＣ−ＫＸとして何回か参照される。平板はコロニーが見えるようになるまで３７℃で保温された。ブルーコロニーは摘みとられ、ｐＹＵＢ２１５の組込みを確定するためにサインブロツティング分析でスクリーンされた。

プラスミドｐＹＵＢ２１５がはじめに恥垢菌に形質転換された時、ブルーのカナマイシン耐性コロニーは、形質転換効率対照ベクターｐＭＶ２６１と比較して（スト−パー他ｒＮａｔｕｒｅＪ　Ｖｏｌ、３５１．ｐｇｓ、４５６−４６０（１９９１））、ＤＡＰおよびカザミノ酸を含むＭ−ＡＤＣ−ＫＸ寒天上で、ＤＮＡのマイクログラム当り１０−’から１０−６コロニーの頻度で得られた。１個から５個のコロニーのバックグラウンド以上に、著しい数のホワイトコロニーは得られなかった。ブルーコロニーは、ｐＹ（ＪＢ２１５および恥垢菌染色体の間の単一交差組換え事象により発生したと推論された。単一交差事象は、恥垢菌染色体にあるａｓｄ遺伝子に隣接する恥垢菌ＤＮＡ配列と同一であるａｐｈ遺伝子に隣接する恥垢菌ＤＮＡ配列の間で生じたものであろうと考えられた。サイン分析を８個の形質転換細胞で行った結果、ｐＹＵＢ２１５はａｐｈ遺伝子のどちらか一方の側に組み込まれ、そのような形質転換細胞の一つが菌株ｍｃ２６８７と指定された。染色体ａｓｄ遺伝子を突然変異体△ａｓｄ　：　：　ａｐｈ対立遺伝子と置換することが出来ないことは、ａｓｄ遺伝子が基本的なものであり、あるいは二重交差事象がミコバクテリアにおいて非常に少ない頻度でしか起こらないことを示すものと解釈される。同時二重交差事象を持つ必要性は、染色体Δａｓｄ　：　：　ａｐｈ突然変異体が二段階方法で横築されることで観察される。ｍｃ”６８７が既にｐｙｕＢに組み込まれるという単一交差事象を受けているために、染色体での２個の対立遺伝子の相同的配列の間の第２組換えが望ましい突然変異体を生じることができる。

図２３で示されるように、第２組換え事象において、ａｓｄ遺伝子の３′末端は Δａｓｄ　：　：　ａｐｈ遺伝子の３′末端に自身で並ぶ。これら２個の「３′ 末端」配列は相同的である。染色体間の組換えを通じて、ａｓｄ遺伝子、１　ａｃＺ遺伝子、および大腸菌複製起点（ｏ　ｒ　ｉ　Ｅ）を有する円形プラスミドは、染色体から飛び出すはずである。かくして、プラスミド配列が飛び出す際にはその間プラスミドはミコバクテリア複製起点を含まないので、βガラクシトーゼの損耗によって染色体間の組換えをスクリーンすることが可能になる。

Ｃ，ｍｃ”　６８７のβガラクトシダーゼ突然変異体の分離菌株ｍｃ”　６８７はＭ−ＡＤＣ−ＴＷ培地およびカナマイシンで成長し、アリコートはカナマイシンおよびｘ−ｇａｌの追加でＭ−ＡＤＣ寒天で培養され、ホワイトコロニー生産のためにスクリーンされた。

失われたβガラクトシダーゼ活性を有するｍｃ”　６８７の突然変異体は、細胞当り８Ｘ１（Ｉ５の頻度で得られた。ｍｃ”６８７と比較して８個のクローンから得られる全染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ消化のサイン分析が図２・・４で示される。このＤＮＡはｐＹＵＢ２４５でプローブされた。図２４で示されるように、プロットのトップから、ｍＣ”　６８７において、第２および第５バンドはＢａｍＨＩ断片を組込みｐＹＵＢ２１５に隣接させており、第１．第３および第４バンドはｐＹＵＢ２１５からの内部断片（第１）あるいは染色体ａｓｄ遺伝子（第３および第４バンド）に対応する。矢印で示されるように、ｌ　ａｃＺ遺伝子（ βガラクトシダーゼ遺伝子）断片は約９．５Ｋｂの最大のバンドである。すべての白色突然変異体は１ａｃＺバンドおよび余分の小さいバンドのサイズに移行している。１　ａｃＺバンドに加えられたより小さなバンドのサイズは長さで約１１．５Ｋｂの断片を生じ、これは約２．５Ｋｂの挿入要素（ＩＳ要素）すなわちＢａｍＨＩ部位を有するトランスポゾンがｌ　ａｃＺ遺伝子に挿入されることにより、説明することができる。

βガラクトシダーゼ遺伝子に挿入される挿入要素は、完成のためＥｃｏＲＩで挿入要素を含むクローンから分離した全染色体ＮＤＡを切断することで回収することが出来る。

ＥｃｏＲＩ消化は完全に機能的大腸菌プラスミドを開放するが、これはΔａｓｄ　：　：　ａｐｈ遺伝子がＥｃｏＲＩ部位でｐＹＵＢ　ｌ　７４にクローンされたためであった。ＥｃｏＲＩでの消化は、今や挿入要素を含むもとのｐＹＵＢ　ｌ　７４を開放することになろう。挿入要素を分離するために、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡは、ＤＮＡ濃度５ｎｇ／μｌ以下で自己連結し、ｐＹｔＪＢ　１７４で運ばれるＢラクタマーゼによりコード化されるアンピシリン耐性を選択する大腸菌株ＤＨ５に形質転換した。ｌ５１０９６と措定された挿入要素を含む一つのクローンはｐＹｔＪＢ２０９として指定された（図２５）。

Ｄ、ｌ５１０９６の特性付け βガラクトシダーゼ遺伝子への８個のｌ３１０９６挿入の近似位置が図２６で示される。ｐＹＵＢ２１５βガラクトシダーゼ遺伝子への８個のｌ３１０９６転位の近似位置がサイン分析で決定された。ｌ５１０９６の制限地図は、挿入要素内でのＢａｍＨＩ部位のオリエンテーションに、１　ａｃＺ遺伝子への挿入位置の正しい近似値を可能にさせた。βガラクトシダーゼで遺伝子内での挿入分布から、ｌ５１０９６は無作為様式で転位する。

恥垢菌のｌ５１０９６転位の頻度をより正確に決定するために、ｍｃ”　６８７の１０個のコロニーがカナマイシンで飽和した５ｍ１Ｍ−ＡＣＤ−ＴＷで静止局面まで培養された。この１０個の培養の稀釈が、約１０００コロニー／平板が得られるようにＭ−ＡＤＣ−ＫＸ平板で取り出された。各培養の細胞は、次いでホワイトコロニーをスクリーンするために２０個のＭ−ＡＤＣ−ＫＸ平板に移された。存在するコロニーの全数で分割されたホワイトコロニーの数は、ｍｃ”　６８７のβガラクトシダーゼ遺伝子にある突然変異の分離度数を表す。

これらの培養におけるβガラクトシダーゼ活性の平均損耗度数は、細胞当り、７．２Ｘ１０−’であった。この数は、平板を含むＸ−ｇａｌで第２次スクリーンされた際、βガラクトシダーゼに対し全く陰性であることを証明するコロニーのみを含むものである。

Ｅ、ｌ５１０９６の制限分析ｐＹＵＢ２０９内のｌ３１０９６は、２個のＨｐａＩを部位の間のβガラクトシダーゼ遺伝子間に位置していた。挿入要素の配列化を容易にするために、このＨｐａ１断片は、オリエンテーションの双方をｐＧＥＭｆ”　（プロメガ）のＳｍａＩ部位にクローニングした。一度この断片がｐＧＥＭ７Ｚｆ“にクローニングすると、Ｉ　Ｓ　１０９６およびｌ５１０９６のポリリンカーにある好都合な部位を利用してい（っかの欠失が構築された。欠失は、ｐＧＥＭ７Ｚｆ”のポリリンカーへの両方向でＩ　Ｓ　ｌ　０９６内でＢｓｔＸＩおよびＢａｍＨＩ部位から行われた。これらの欠失を持つことで、これらの部位の両方向からｌ５１０９６への配列化が可能となった。ｌ５１０９６の両連鎖およびｌ５１０９６およびｐＹＵＢ２０９の間の結合の配列化は、同じように合成オリゴヌクレオチドを使用して行われた。配列化反応は、シークエナーゼ、ヴアーシロン２．０（ユナイテッドステーツ、バイオケミカル社）の二重連鎖ＤＮＡ鋳型を使いクラフト他ｒＢｉｏ　ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓＪ　Ｖｏｌ、６．ｐｇｓ、５４４−５４７　（１９８８）記載の方法で実施された。

ストレプトマイシス・コエリーコロール（Ｓ、ｃｏｅ　１　ｉ　ｃｏｌｏｒ）、大腸菌株に−１２、枯草菌および１２個のミコバクテリア属のサイン分析が、プローブとして、図２８のグラフによる提示で示されているようにＢａｍＨＩおよびＢ　ｓ、ｔ　Ｘ　Ｉ部位の間に固形バーで示される内部ＴＳ１０９６を断片を使用して達成された。図２７に示されるようにＩ　Ｓ　１０９６は恥垢菌のみに存在する。ミコバクテリアの病原菌株であるヒト結核菌、生型結核菌、角型結核菌、およびらい菌は、挿入要素を欠如している。

３個の形態型の恥垢菌ＡＴＣＣ６０７を含むいくつかの異なった恥垢菌分離体は、ｌ５１０９６でプローブされた時に制限パターンの変化の度合を決定するために、サイン分析でプローブされた。サイン分析は、恥垢菌ｍｅ”　２２．ｍｃ” 　２３、ｍｃ”　３１．ｍｃ’　３２およびＨｉｎｄｌｌＩで切断されたＤＮＡ　（サイズ標準が放射性同位元素で標識される）から分離された全染色体ＤＮＡのＰｓｔｌ消化に対し、ｌ５１０９６で実行された。このブロワ］−は図２８で示される。

レーン１はｍｃ”　６＋　レーン２はｍｃ″２２、レーン３はｍｃ”２３であり、レーン４はｍ　ｃ　２３１　＋　レーン５はｍｃ”３２であり、レーン６はサイズ標準が放射性同位元素で標識されたＨｉｎｄＩＩＩで切断されたＤＮＡである。図２９で示されるようＩ乙異なった分離体にはかなりの変異性がある。ただ一つのバンドがすべての分離体の中にあられれており、また数多くの挿入要素が８から１６の区域で見出された。ｍＣ”２２およびｍｃ”２３の双方がｍｃ”　６には存在しないｌ５１０９６の追加のコピーを有していた。

Ｆ、ｌ５１０９６のヌクレオチド配列ｌ５１０９６の配列が図２９で示される。前記記載の方法で実施された配列分析は、ｌ５１０９６の長さが２２７５ｂｐであり、グアニンおよびシストシン（Ｇ＋Ｃ）の割合が６７％であり、これは通常恥垢菌染色体で観察されるものに等しいことが明らかとなった。（ウニイン他、ｒＪ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、Ｊ　Ｖｏｗ、９６．ｐｇｓ、１９１５−１９１９　（１９６８））。ｌ３１０９６の内部領域は、平均Ｇ＋Ｃ容量に類似の領域と同じように、約７０％から約８０％までの範囲のより高いＧ＋Ｃの領域を有しているが、しかし挿入要素の末端のＧ＋Ｃ容量は６０％以下のＧ＋Ｃ容量を有している。

よく保持された逆方向反復塩基配列がＪＳ１０９６の両末端で観察され、長さは２５ｂｐであり、これは図２９で肉太型で示されている。逆方向反復塩基配列に２個のミス対合が存在する。βガラクトシダーゼ遺伝子への転位は、挿入点の両側にある標的ＤＮＡ配列の肉太線で示されるようにｓｂｐの重複という形で現れている。この重複は大抵の挿入要素の転位メカニズムと一致している。長さ約９ｂｐの逆方向反復塩基配列の３個のセットがｌ５１０９６の３′末端に見出され、この位置は図２９で反対方向にある矢印の対でｔ旨定され示されている。

ｌ５１０９６配列の読み取り枠（ＯＲＦ）分析は、１００個のアミノ酸より長い１３０ＲＦの存在を明らかにした。推定上のＯＲＦはいずれも他の挿入要素によりコード化された蛋白質への高水準の相同性を示さなかった。しかし、ＯＲＦのうち２個は、図２９で示され、またターナ−他ｒＮｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪＶｏ１．１７．ｐｇｓ。

１７５７　（１９８９）およびローランド他ｒＭｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．Ｊ　Ｖｏｌ、４．ｐｇｓ、９６１−９７５　（１９９０）で記載されているように、ｔｎｐＡトランスボザーゼおよびｔｎｐＲ遺伝子が前に配列されているように遠縁にあたるといえる。バリン開始コドンを持つ大きい４１４アミノ酸ＯＲＦが発見され、これはＴｎ３９２６からのトランスボザーゼを持つ１８５個のアミノ酸に関し、２１．１％が同一で６６％が相同性であった（ターナ−他（１９８９））、更にバリンで始まる２３７アミノ酸読み取り枠は１図２９で示されるように推定上のｔｎｐＡ遺伝子に対し反対の方向にあり、ｔｎｐＲと名付けられた。

ｔｎｐＲのアミノ末端９２アミノ酸は、ＴｎｌＯ００リシルベースのアミノ末端に対し１８．５％が同一で６９％は相同性である。（リード他、ｒＮａｔｕｒｅＪ　Ｖｏｌ。

３００、ｐｇｓ、３８１−３８３　（１８９２））。これらのＯＲＦでコード化された蛋白質は、ｌ５１０９６で発見された他のＯＲＦよりも標準のトランスボザーゼおよびリシルベース蛋白質と同じサイズか、それと非常に類似している。

これは、そのよりなＯＲＦコード化蛋白質がｌ５１０９６の転位に含まれるが、他のトランスポゾンの転位に含まれることで知られるよ（特性付けられた蛋白質の遠縁にあたることを示すものである。

実施例８ＩＳＬＯ９６が恥垢菌にクローニングされ、構築物はトランスポザーゼをコード化すると考えられる配列がｌ５１０９６から除去され（前記記載のとおり）ａｐｈ遺伝子で置換されるように作られる。トランスボザーゼをコード化すると考えられる配列は、生じる構築物に残るが、逆方向反復塩基配列の外側に位置する。

生じた構築物は対でｐＧＥＭ７２ｆ“にクローニングされる。生成したプラスミドは生型結核菌ＢＣＧに形質転換され、生型結核菌ＢＣＧ細胞はカナマイシンを含みカナマイシン耐性で選択された完全な栄養性培地で培養される。生存するコロニーは、転位因子がプラスミドからＢＣＧ染色体に転移したコロニーである。

トランスボザーゼ遺伝子はプラスミド内に残り、それは、ミコバクテリアには複製出来ない。従ってプラスミドは損耗する。プラスミド内に残るトランスボザーゼ遺伝子が損耗するので、転位因子はそれが挿入されるＢＣＧ染色体の領域で残り、染色体の他の領域あるいは細胞内に存在するいずれの発現ベクターにも転位することはない。

生成するコロニーの選択に際し、コロニーは各種の培地で培養することにより、特異な突然変異のためスクリーンされる。

しかしこの発明の範囲は、前記記載の特異な実施例に限定されるもものでないことは理解されるべきである。この発明は特に記載されたより以上に実施することができ、しかも以下の請求の範囲内に存在する。

ｆ／Ｇ・りｒ″ｙｃｒｓ情１°ＳｆｔＧ、ｔ７’／ｌ、ｌｊＮ利Ｆｌ　＆、／。

／ｂｄｔ／ｒＦ／Ｇ−、／’ｆＦ／Ｇ−、／ｊ”″ ｆ／Ｇ−、／６ −一一一で―イｉ〒−＋？＋フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：３２）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＦＩ、ＪＰ、Ｎ。

（７２）発明者　ブルーム、バリーアメリカ合衆国、ニューヨーク　１０７０６゜ヘイスティングスーオンーハドソン、サミット　ドライブ　８１ＦＩ（７２）発明者　カルバ九ガンジャム、ヴイ。

アメリカ合衆国、ニューヨーク　１０４６１゜ブロンクス、イーストチェスター　ロード（７２）発明者　シリルロ、ジエフリー、ディー。

アメリカ合衆国、ニューヨーク　１０４６１゜ブロンクス、アパートメント　２０ジー　イーストチェスター　ロード　１９２５

Claims

【特許請求の範囲】

１．突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ，突然変異ヒト結核菌および突然変異らい菌よりなるクラスから選択された突然変異ミコバクテリウム。
２．ミコバクテリウムがミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異により突然変異を起こす請求の範囲第１項記載の突然変異ミコバクテリウム。
３．前記ミコバクテリウム遺伝子の挿入突然変異が非正統的組換えによって実行される請求の範囲第２項記載の突然変異ミコバクテリウム。
４．突然変異ヒト結核菌ＢＣＧおよび突然変異ヒト結核菌よりなるクラスから選択される形質転換された突然変異ミコバクテリウムであって、前記突然変異ミコバクテリウムが異種の遺伝子を発現することができる突然変異ミコバクテリウム。
５．前記突然変異ミコバクテリウムが突然変異ヒト結核菌ＢＣＧである請求の範囲第１項記載の突然変異ミコバクテリウム。
６．突然変異ミコバクテリウムが突然変異ヒト結核菌ＢＣＧである請求の範囲第４項記載のミコバクテリウム。
７．一つのワクチンであって、請求の範囲第６項記載の生型結核菌ＢＣＧおよび受容可能な薬品キャリアよりなるワクチン。
８．前記生型結核菌ＢＣＧが栄養素要求性生型結核菌ＢＣＧである請求の範囲第５項記載の突然変生型結核菌ＢＣＧ。
９．栄養素要求性生型結核菌ＢＣＧがメチオニン栄養素要求株である請求の範囲第８項記載の突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ。
１０．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５５２０２として預けられた突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ。
１１．栄養素要求性生型結核菌ＢＣＧがイソロイシン−ロイシン−バリン栄養素要求株である請求の範囲第８項記載の突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ。
１２．ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５５２０３として預けられた突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ。
１３．前記突然変異が生型結核菌遺伝子の挿入突然変異により実行される突然変異ヒト結核菌。
１４．突然変異ヒト結核菌ＢＣＧ、突然変異ヒト結核菌、突然変異らい菌よりなるクラスから選択される形質転換突然変異ミコバクテリウムであって、ここで前記ミコバクテリウムがミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異による突然変異を起こし、また、前記ミコバクテリウムが前記挿入突然変異ミコバクテリア遺伝子を補完し、それによって前記ミコバクテリウムが前記補完遺伝子を発現することが出来る非突然変異遺伝子を含むＤＮＡで形質転換される形質転換突然変異ミコバクテリウム。
１５．ミコバクテリア遺伝子の前記挿入突然変異がミコバクテリアトランスポゾンにより実行される請求の範囲第２項記載の突然変異ミコバクテリウム。
１６．ミコバクテリアトランスポゾンであって、前記トランスポゾンがミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に挿入することが出来るミコバクテリアトランスポゾン。
１７．請求の範囲第１６項記載のミコバクテリアトランスポゾンであって、前記トランスポゾンは、生型結核菌染色体、生型結核菌ＢＣＧ染色体、鳥型結核菌染色体、ヒト結核菌染色体、らい菌染色体、あるいは恥垢菌染色体から選択される染色体に無作為に挿入するミコバクテリアトランスポゾン。
１８．前記トランスポジンが図２９に示されるＩＳ１０９６である請求の範囲第１７項記載のミコバクテリアトランスポゾン。
１９．突然変異ミコバクテリウムであって、前記ミコバクテリウムは、ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に挿入するミコバクテリアトランスポゾンによって突然変異を起こす突然変異ミコバクテリウム。
２０．前記トランスポゾンが、ミコバクテリアに異種の蛋白質をコード化する少なくとも一つのＤＮＡ配列を含む請求の範囲第１６項記載のミコバクテリアトランスポゾン。