JPH06511145A - ミコバクテリア内での挿入突然変異 - Google Patents
ミコバクテリア内での挿入突然変異Info
- Publication number
- JPH06511145A JPH06511145A JP5500932A JP50093293A JPH06511145A JP H06511145 A JPH06511145 A JP H06511145A JP 5500932 A JP5500932 A JP 5500932A JP 50093293 A JP50093293 A JP 50093293A JP H06511145 A JPH06511145 A JP H06511145A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mycobacterium
- mutant
- mycobacterial
- gene
- mycobacterium tuberculosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 157
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 87
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims description 70
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 63
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 26
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 22
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 20
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 20
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 claims description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 15
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 10
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 10
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000003689 pubic bone Anatomy 0.000 claims description 4
- OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N (2s)-2-amino-3-methylbutanoic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s,3s)-2-amino-3-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O.CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O OCUSNPIJIZCRSZ-ZTZWCFDHSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 claims 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 claims 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 55
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 53
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 41
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 38
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 38
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 38
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 34
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 30
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 28
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 28
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 28
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 28
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 23
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 17
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 17
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 16
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 16
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 10
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 9
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 101150057950 aph gene Proteins 0.000 description 6
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 6
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 4
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 4
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 4
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 4
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical class C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 3
- 101150105382 MET gene Proteins 0.000 description 3
- 240000000697 Pinguicula vulgaris Species 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 3
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 3
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 3
- 101150117381 tnpR gene Proteins 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 3
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 2
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100293261 Mus musculus Naa15 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150082943 NAT1 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 2
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 2
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000001417 Vigna umbellata Species 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 2
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000003426 interchromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 101150097091 tnpA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 2
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 102000006303 Chaperonin 60 Human genes 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 241000257465 Echinoidea Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000239183 Filaria Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000165883 Heracleum pubescens Species 0.000 description 1
- 241000175212 Herpesvirales Species 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 240000000366 Melilotus officinalis Species 0.000 description 1
- 241001467578 Microbacterium Species 0.000 description 1
- 240000005551 Micromelum minutum Species 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 1
- 241001417627 Mycobacterium tuberculosis BC Species 0.000 description 1
- 229930183781 Mycobactin Natural products 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000517304 Pthirus pubis Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282806 Rhinoceros Species 0.000 description 1
- 241000606651 Rickettsiales Species 0.000 description 1
- 241000713124 Rift Valley fever virus Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 208000025087 Yersinia pseudotuberculosis infectious disease Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 208000033354 avian tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 108010083912 bleomycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000005639 glycero group Chemical group 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- XZGYBQIQSLSHDH-COEJQBHMSA-N mycobactin Chemical compound C1CCCN(O)C(=O)C1NC(=O)C(C)C(CC)OC(=O)C(CCCCN(O)C(=O)\C=C/CCCCCCCCCCCCCCC)NC(=O)C(N=1)COC=1C1=C(C)C=CC=C1O XZGYBQIQSLSHDH-COEJQBHMSA-N 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ミコバクテリア内での挿入突然変異
この発明は、ミコバクテリアの突然変異誘発に関する。より詳細には、この発明
は、ミコバクテリア内での挿入突然変異の発生に関する。
ある種のミコバクテリアは、人間および動物の主要な病原体を表わす。例えば結
核は一般にヒト結核菌によりヒトに生じ、生型結核菌により牛に生じ、後者はヒ
トおよび他の動物に媒介される。らい菌はらい病の原因となる因子である。ヒト
結核菌および鳥型・イントラセルラーレ・スクロフラセウムグループ(MAIS
グループ)のミコバクテリアは後天性免疫不全症候群(AIDSIに係る患者の
主要な日和見的な病原体を表わす。偽結核菌は牛の主要な病原体である。
一方、生型結核菌の非病原性菌株であるカルメツトゲラン生型結核菌、すなわち
BCGはヒトワクチンに広く用いられ、とりわけ生ワクチンとして使用され結核
に対し防御する。BCG 。
は子供用ワクチンのみで一般に生まれた時に投与され、副作用が発生する率がき
わめて小さく、個体に繰返しく例えば多重形式で)使用することができる。加え
てBCGおよび他のミコバクテリア(例えば恥垢菌)がワクチンに使用されると
それらは現在知られている最良の免疫助成剤の性質を有し、従って抗原に対し非
常に有効に反応するように受容者の免疫系を刺戟する。
ジエイコブ他によりrNatureJ Vo ]、、327゜No、6122.
pgs、532−535 (1987年6月11日号)で提案されたのは、BC
Gが組換型ワクチンの構築のための宿主として使用出来ることであった。換言す
れば、現存するワクチン(この場合は結核菌に対するワクチン)をとり出し、他
の病原体から、一つもしくはそれ以上の遺伝子の導入を通じてその防御的レバー
I・リーを拡張することが提案された。BCGワクチンが生細菌として投与され
るので、この細菌で発現されるいずれの外部の抗原、ポリペプチドあるいは蛋白
質もワクチン接種に続く細菌から失われないことが基本となる。
裸のDNAが細菌細胞に導入される方法である形質転換が、ミコバクテリアにお
いて首尾よ〈実施された。前記引用のジェイコブ他(1987年)は、化学的方
法によりミコバクテリアの形質転換を述べており、また、スナツパ−他は、rP
NASVol、85.pgs、6987−6991 (1988年9月号)で電
気穿孔法によるミコバクテリアの形質転換を記述している。電気穿孔法はプラス
ミドDNAのug当り105からlO″個の形質転換細胞を得ることが出来、こ
のようなプラスミドDNAは形質転換細胞を非形質転換細胞から選択出来るよう
に、カナマイシンなどのような抗生物質マーカー耐性が遺伝子を保持することが
ある(スナツパ−他、1988年)。
ジエイコブ他(1987年)およびスナツパ−他(1988年)は更に関心のあ
る遺伝子をミコバクテリアに運ぶために、プラスミドおよびバクテリオファージ
などのベクターの利用についても述べている。
前記手法を分子クローニングの標準用具(例えば制限酵素等の使用)とを組合わ
せることにより、関心のある遺伝子のベクターへのクローニングおよびその遺伝
子のミコバクテリアへの導入が可能となる。これら遺伝子を発現させるため、遺
伝子発現に利用出来るシグナル、とりわけ転写プロモーターエレメントを有する
ことが重要となる。このようなプロモーターエレメントは、ミコバクテ「げ熱シ
ヨツク遺伝子から分離され、ミコバクテリア内の外部抗原を発現するために使用
されてきた。
しかし、ミコバクテリア分子遺伝学はつい最近発展し始めたばかりであり、それ
は部分的にはミコバクテリアが遺伝学研究に難しい障害を提起するためであり、
つまり一般的には、ミコバクテリアは培養すると塊状になり、成長がきわめて緩
やかであるということであった。トランスポゾンを利用することによる突然変異
体の直接選択(ランダム挿入突然変異誘発としても知られる)は、微生物病原論
の突然変異分析に対する有用pgs、1−11 (1985年)。ティラー他r
J、Bact(1989年)。フィールズ他rscf enceJ Vol。
243、pgs、1059−1061 (1989年)。ベルナVo1.86.
pgs、3867−3871 (1989年))。しかし突然変異体のそのよう
な選択はミコバクテリアにつぃては記載されていなかった。
この発明の目的は、ミコバクテリア内での突然変異の生成。
およびもしくは異種遺伝子のミコバクテリアへの導入、とりわけBCGのような
ワクチンに使用されるミコバクテリアの突然変異の生成、また同じく、結核菌あ
るいはらい菌などの病原性ミコバクテリア内での突然変異の生成で、そこではそ
の突然変異がミコバクテリアを非病原性に変換するような生成を含む。
ミコバクテリアに導入される異種遺伝子は、必ずしもそれに限定されないが、多
種多様な病原体に対する防御性抗原およびもしくは、治療薬のための遺伝子であ
る。
この発明の一局面に従って、突然変異生型結核菌BCG、突然変異結核菌、およ
び突然変異らい菌よりなるクラスから選択された突然変異ミコバクテリアが提供
される。ここで使用される「突然変異生型結核菌BCGJあるいは「突然変異B
CGJあるいは「突然変異ヒト結核菌」あるいは「突然変異らい菌」は、遺伝子
の発現あるいは機能が親菌株にある非突然変異遺伝子に関して変化しているよう
な少くとも一つの突然変異遺伝子を含む結核菌BCG、ヒト結核菌あるいはらい
菌であることを意味する。
望ましくは、ミコバクテリアはミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異により突然
変異を起こす。ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異は、DNAのミコバクテリ
ア染色体への非正統的組換えにより、あるいは、相同的組換えにより、もしくは
、ミコバクテリア・トランスポゾンのミコバクテリア遺伝子への挿入により実行
される。望ましくは、挿入突然変異はDNAのミコバクテリア染色体への非正統
的組換えにより行なわれる。
この発明のもう一つの実施例に従って、生型結核菌遺伝子の挿入突然変異を通じ
て突然変異した突然変異生型結核菌が提供される。生型結核菌の挿入突然変異は
突然変異生型結核菌BCG、突然変異ヒト結核菌、および突然変異らい菌として
ここに記載されているように実行することが出来る。
非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込まれるDNAは、線形DN
A、あるいは円形DNAであり得る。望ましくは、DNAは線形DNA断片であ
る。
出願者が発見したのは、原始核細胞ではまれな現象である非正統的組換えが、B
CGあるいはヒト結核菌を線状化プラスミドで形質転換することで生型結核菌B
CGおよびヒト結核菌内で実行出来るということであった。形質転換は従来の技
術で当業者に知られているいずれの方法でも達成可能である。例えば、電気穿孔
法、あるいは形質転換DNAが挿入される原形質体の発生、および細胞壁の再生
が続く方法などによってであり、ジエイコブ(1987年)およびスナツパ−(
1988年)が記述している。
一つの実施例において、非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込ま
れるDNAは1選択的マーカーを含んでいる。採用される選択的マーカーは、カ
ナマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、あるはヒグロマイシン
耐性マーカー、あるいは必ずしもそれに限定されないが、ミコバクテリオファー
ジL5.Ll、Bxbl、Bxb2゜B x t+3 、D 29、あるいはT
M4耐性マーカーなどのバタテリオファージ耐性マーカーである。
他の実施例において、DNAは異種蛋白質をミコバクテリアにコード化する少く
とも一つのDNA配列を含む。
異種蛋白質をミコバクテリアにコード化する少くとも一つのDNA配列は、関心
のある蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子の全体あるいは一部で
あるDNAである。
少くとも一つのDNA配列によりコード化される関心のある蛋白質あるいはポリ
ペプチドは必ずしもそれに限定されないが、抗原、抗腫瘍剤、酵素、リンフ才力
イン、薬理剤、免疫強化剤、詮所情況下で関心のあるリボ−クー分子である。
少くとも一つのDNAがコード化される抗体は、必ずしもそれに限定されないが
、らい菌抗原、ヒト結核菌抗原、リケッチア抗原、マラリア胞子小体および***
小体、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、クロストリジウム属抗原、リ
ーシュマニア属抗原、サルモネラ属抗原、ボレリア抗原、マイコバクテリウムア
フリカヌム抗原、マイコバクテリウムイントラセルラーレ抗原、角型結核菌抗原
、トレボネマ抗原、百日咳抗原、住血吸虫属抗原、フィラリア属抗原、ヘルペス
ウィルス抗原。
インフルエンザおよびパラインフルエンザウィルス抗原、はしかウィルス抗原、
流行性耳下腺炎ウィルス抗原、肝炎ウィルス抗原、赤痢菌抗原、ナイセリア属抗
原、狂犬病ウィルス抗原、ポリオウィルス抗原、リフトバレーウィルス抗原、デ
ング熱ウィルス抗原、ヒト免疫不全ウィルス(HIV)抗原、呼吸器系合胞体ウ
ィルス(R3V)抗原、ヘビ毒抗原、ビブリオ属コレラ抗原である。コード化さ
れる酵素は、必ずしもそれに限定されないがステロイド酵素である。
少くとも一つのDNAでコード化される抗腫瘍剤は必ずしもそれに限定されない
が、インターフェロンa、インターフェロンβ、あるいはインターフェロンγ、
および腫瘍壊死因子、あるいはTNFである。コード化されるリンフ才力インは
必ずしもそれに限定されないが、インターロイキン1がらインターロイキン8で
ある。
コード化されるリポータ−分子は必ずしもそれに限定されないが、ルシフェラー
ゼ、Bガラクトシダーゼ、Bグルクロニダーゼ、およびカテコール脱水素酵素で
ある。
少くとも一つのDNA配列でコード化される他の蛋白質あるいはペプチドは必ず
しもそれに限定されないが、ストレス蛋白質をコード化するもの、免疫応答を呼
び起こすために、あるいは自己免疫病(例えば変形関節炎)に耐性を誘導するた
めに投与出来るものを含む。
一つの実施例において、非正統的組換えによりミコバクテリア染色体に組み込ま
れるDNAはプラスミドがら誘導される。
このプラスミドはシャトルプラスミドであり、大腸菌複製起点、バチルス複製起
点、ブドウ球菌属複製起点、ストレプトマイセス属複製起点、あるいは肺炎球菌
複製起点などのような細菌性複製起点を含む。他の実施例において、プラスミド
はミコバクテリア複製起点を含むことが出来るし、あるいはここに記載したミコ
バクテリア複製起点プラス細菌性複製起点を含むシャトルプラスミドであること
も出来る。望ましくは、プラスミドは非正統的組換えによりミコバクテリア染色
体に組み込まれる前に線形化される。
望ましい実施例において、線形DNA、例えば線形プラスミドは、非正統的組換
えにより、例えばBCG染色体などのような、生型結核菌染色体、生型結核菌B
CG染色体、あるいはヒト結核菌染色体、あるいはらい菌染色体に組み込まれる
。そのような組み込みによりDNAはミコバクテリア染色体内に遺伝子の挿入突
然変異を生じさせる。例えばDNAは、栄養分あるいはアミノ酸の生合成経路に
基本的である酵素をコード化する遺伝子の挿入突然変異を起こすことが出来る。
形質転換されたミコバクテリアは、次いで突然変異を生じる遺伝子を決定するた
めにスクリーニングされる。例えば突然変異ミコバクテリアは、(アミノ酸なし
で)最少培地で、また、突然変異ミコバクテリアの栄養要求を決定するための各
種アミノ酸を含有する培地で成長する。すなわち突然変異ミコバクテリアは栄養
要求性突然変異のためにスクリーンされる。一度突然変異遺伝子が確認されると
、補足(すなわち非突然変異)遺伝子は分離され発現ベクターにクローン化され
る。発現ベクターは次いで突然変異ミコバクテリアに形質転換され、そこで補足
遺伝子は突然変異ミコバクテリアに発現され、突然変異ミコバクテリアは原栄養
体になる。発現ベクターは更に突然変異ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいは
ポリペプチドをコード化する遺伝子になる。そのような蛋白質あるいはポリペプ
チドは前記記載のものである。補足遺伝子および異種蛋白質あるいはポリペプチ
ドをコード化する遺伝子を含むミコバクテリアの選択は、突然変異ミコバクテリ
アが適切な培地で成長する際に、補足および異種遺伝子が導入され生残する突然
変異ミコバクテリアの能力に依存する。
一つの実施例において、発現ベクターは、突然変異ミコバクテリア染色体にバク
テリオファージ組込みをコード化する。
ファージDNA部分である最初のDNA配列、および補足遺伝子をコード化する
第2のDNA配列を含むDNAであるが、更に、DNAが組み込まれる突然変異
ミコバクテリアに異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化
する第3のDNA配列を含むことが出来る。
ここで使用される[ファージDNA部分」はDNA配列がファージから誘導され
、ファージ複製に必要なりNAを欠如していることを意味する。
ファージDNA部分が誘導されるバクテリオファージでは必ずしもそれに限定さ
れないが、L5.Ll、Bxbl、Bxb2、Bxb3.D29およびTM4の
バクテリオファージ、大腸菌のラムダファージ、コリネバクテリウム属の毒素フ
ァージ、アクチノミセス属およびノルカシア属のファージ、ストレプトマイセス
属のφC31ファージ、およびサルモネラ属のP22ファージである。望ましく
は、ファージDNA部分は、ミコバクテリア染色体にミコバクテリオファージを
コード化する。
望ましくは最初のDNA配列は、インテグラーゼをコード化するDNAであり、
それは、DNAを突然変異生型結核菌、あるいは突然変異生型結核菌BCGある
いは突然変異ヒト結核菌あるいは突然変異らい菌の染色体に組み込むことを用意
する蛋白質である。最も望ましくは、最初のDNA配列もまたattP部位をコ
ード化するDNAを含む。
attP部位およびインテグラーゼをコード化するDNA配列は部位特異的組込
みとして参照される組み込み事象を提供する。attP部位およびインテグラー
ゼ遺伝子を含有するDNAは、対応する生型結核菌BCG、ヒト結核菌あるいは
らい菌のattB部位に組み込むことが可能である。
attP部位をコード化する正確なりNA配列が異なったファージの間で変化し
、attB部位をコード化する正確なりNA配列が生型結核菌、生型結核菌BC
G、ヒト結核菌、およびらい菌の間で変化することは理解されねばならない。
組込み事象はattLおよびattRと呼ばれる二つの新しい結合部位を形成し
、そのそれぞれがattPおよびattBのそれぞれを含有している。最初のお
よび第2の、望ましくは第3のDNA配列を含む挿入組込み非ファージDNAは
、at、tl、およびattR部位に隣接する。ファージDNA部分の挿入およ
び組込みは、挿入突然変異ミコバクテリア遺伝子、補足遺伝子、および望ましく
はミコバクテリアに異質の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するDN、A
配列を含む形質転成突然変異ミコバクテリアを形成する。
ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第3のDN
A配列は、ここで記載されたような関心となる蛋白質あるいはポリペプチドをコ
ード化する遺伝子の全体あるは一部であるDNA、選択的マーカーをコード化す
るDNA、あるいはマーカーおよび関心のある少くとも一つの蛋白質あるいはポ
リペプチドの双方をコード化するDNAであり得る。
コード化される選択的マーカーは、必ずしもそれに限定されないが、ここで記載
されているようなカナマイシン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、クロ
ラムフェニコール耐性マーカー、ヒグロマイシン耐性マーカー、あるいはバクテ
リオファージ耐性マーカーなどである。
ミクロバクテリオファージ組込みをコード化する第1 DNA配列、および補足
遺伝子をコード化する第2DNA配列、およびもし存在するとしてミクロバクテ
リアに異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第3D
NA配列を含むファージDNA部分は、従来の技術の当業者に周知の遺伝子工学
技術で構築することが出来る。一つの実施例において、ファージDNA部分は、
組込みをコード化するDNAに加えて、補足遺伝子をコード化するDNA、およ
び存在するものとして、必ずしもそれに限定されないが、大腸菌、ストレプトミ
セス属、バチルス属、ブドウ球菌属、赤痢菌属、サルモネラ属および各種の肺炎
球菌などを含む多種多様の生体の複製起点である異種蛋白質をコード化するDN
Aを含むプラスミドであり得る。望ましくは、プラスミドは大腸菌の複製起点を
有する。
ファージDNA部分は更に適切なプロモーターを含むことが出来る。適切なプロ
モーターは、必ずしもそれに限定されないがB CG HS P 60およびH
S P 70プロモーターなどのミコバクテリアプロモーター、ヒト結核菌およ
びBCGのミコバクチンプロモーター、スーパーオキシドジスムターゼプロモー
ター、ヒト結核菌およびBCGのα抗原プロモーター、MBP−70プロモータ
ー、ヒト結核菌およびBCGの45キロダルトン抗原プロモーター、ミコバクテ
リアasdプロモーター、ミコバクテリア14キロダルトンおよび12キロダル
トン抗原プロモーター、Bxbl、Bxb2.Bxb3プロモーター、Llおよ
びL5プロモーター、D29プロモーターおよびTM4プロモーターなどのミコ
バクテリオファージプロモーター、大腸菌プロモーター、あるいはその他適切な
プロモーターである。適切なプロモーターの選択はここで含まれる教訓から、従
来技術の当業者の範囲内にあるものと見做される。
一つの実施例においてプロモーター配列は、発現カセットの一部であり、それは
更に通常プロモーターの制御下にある遺伝子の一部を含む。例えば、ミコバクテ
リアH3P60あるいはH3P70プロモーターが採用された場合、発現ベクタ
ーはプロモーターに加えてHSP60あるいはH3P70蛋白質の遺伝子を含む
。発現カセットおよび異種蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するDNAが
発現された場合、カセットおよび異種蛋白質、あるいはポリペプチドをコード化
するDNAで発現した蛋白質は、ミコバクテリア蛋白質(例えばH3P60ある
いはHSP70蛋白質)、および異種蛋白質の断片の融合蛋白質である。
望ましくは、転写開始部位、リボゾーム結合部位およびmRNAの翻訳の開始を
用意する出発コドンは、それぞれミコバクテリア起点である。mRNAの翻訳を
停止し、補足蛋白質およびもしくは異種蛋白質の合成を終結する停止コドンおよ
び転写終結部位は、ミコバクテリア起点、あるいは他の細菌起点であり、あるい
はそのような停止コドン、および転写終結部位は、そのようなりNAが存在する
場合補足遺伝子をコード化するDNAあるいは異種蛋白質あるいはポリペプチド
をコード化するDNAのそれである。
ミコバクテリア染色体へバクテリオファージ組込みをコード化するファージDN
A部分である第1DNA配列、および補足遺伝子をコード化する第2DNA配列
、およびもしも存在するとしてDNAが組み込まれる突然変異ミコバクテリアに
異種の少くとも一つの蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する第3DNA配
列を含むそのようなりNAは、1990年7月16日出願の米国特許出願番号筒
553,907号に詳述されており、その内容はここに参考文献として組み入れ
られている。
他の実施例において、発現ベクターは補足遺伝子をコード化するDNAを含み、
更に、ここに記載されたような蛋白質あるいはポリペプチドを発現する突然変異
ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するDNA、お
よび補足遺伝子をコード化するDNA、およびもし存在するならば異種蛋白質あ
るいはポリペプチドをコード化するDNAの発現を制御するミコバクテリアプロ
モーターとミコバクテリオファージブロモ−ターよりなるクラスから選択された
プロモーターを含むことが出来る。ミコバクテリアプロモーターは、ミコバクテ
リア染色体にファージを組み込むことをコード化するDNAに関連してここに記
載したものである。プロモーターは更に発現カセットの一部であり、カセットは
ここに記載しているように1通常プロモーターの制御下にある遺伝子の一部を含
む。更にまた。転写開始コドン、リボゾーム結合部位および出発コドンは、それ
ぞれミコバクテリア起点であり、また、停止コドン、および転写終結部位はミコ
バクテリア起点、あるいは他の細菌起点であり、あるいは停止コドン、および転
写終結部位は、ここでも記載されであるように補足遺伝子をコード化するDNA
、あるいは異種蛋白質もしくはポリペプチドをコード化するDNAのそれである
ことが出来る。
一つの実施例において、異種蛋白質あるいはポリペプチドは選択的マーカーであ
る。そのような選択的マーカーは必ずしもそれに限定されないが、Bガラクトシ
ダーゼマーカー、カナマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカ
ー、ネオマイシン耐性マーカー、ヒグロマイシン耐性マーカー、あるいはここで
記載されているようなバクテリオファージマーカーである。
一つの実施例において、発現ベクターは更にミコバクテリア複製起点を含む。
もう一つの実施例において、そのような発現ベクターはプラスミドである。プラ
スミドは非シャトルプラスミド、あるいはシャトルプラスミドであり、それは更
に、大腸菌複製起点、バチルス菌複製起点、ブドウ球菌複製起点、ストレプトミ
セス複製起点、あるいは肺炎菌複製起点などのような細菌複製起点を含む。
ベクターは更に多重クローニング部位を含み、補足遺伝子をコード化するDNA
およびもしくは異種蛋白質をコード化するDNAは多重クローニング部位に挿入
される。
ミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリオファージプロモーターを含
むそのような発現ベクターは1991年1月16日出願の米国特許出願番号第6
42,017号に詳述されており、これは現在放棄された同じ<1990年7月
16日米国特許出願番号第552,828号の継続したものである。出願番号筒
642,017号はここで参考文献として組み入れられている。
もう一つの実施例において、補足遺伝子およびもしくはミコバクテリアに異種で
ある蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するDNAを含む発現ベクターはシ
ャトルファスミドベクターであり、それは細菌内にプラスミドとして、またミコ
バクテリア内にファージとして複製する。一つの実施例において、シャトルファ
スミドベクターは、付着末端部位の二種のものを含む。一つはラムダファージで
ありそれは大腸菌内で機能する。もう一つはミコバクテリア(例えばミコバクテ
リオファージTM)であり、これはミコバクテリア内で機能する。望ましくは、
そのようなシャトルファスミドベクターはユニーク部位(例えばユニークEco
RI部位)を有し、その中へ補足遺伝子およびもしくはミコバクテリアに異種の
蛋白質あるいはポリペプチドコード化するDNAが挿入される。そのようなシャ
トルファスミドベクターは1989年6月5日出願の米国特許出願番号第361
,944号で詳細に記述されている。その内容はここで参考文献として組み入れ
られる。
更に理解されるべきことは、この発明の範囲内で補足遺伝子は一つの発現ベクタ
ーに含有されており、またミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチド
をコード化する遺伝子は他の発現ベクターに含まれるということである。
前記の通り、ミコバクテリアは、ミコバクテリアトランスポゾンのミコバクテリ
ア遺伝子への挿入によって実現されるミコバクテリアの挿入突然変異を含む。か
くして、この発明のもう一つの局面に従って、ミコバクテリア遺伝子の挿入突然
変異を実現するためにミコバクテリア染色体へ無作為に挿入することが出来るミ
コバクテリアトランスポゾンが提供される。ミコバクテリアトランスボソンは、
例えば生型結核菌染色体、生型結核菌BCG染色体、ヒト結核菌染色体、鳥型結
核菌染色体、らい菌染色体あるいは恥垢菌染色体に無作為に挿入出来る。一つの
実施例において、トランスポゾンは恥垢菌l51096)ランスボゾンである。
以下に記載されるl51096トランスポゾンは2,275塩基対の長さであり
、転位に含まれる蛋白質をコード化する2個の読み取り枠を含有する。恥垢菌内
でこのI S 19961−ランスボゾンは発見されたが、トランスポゾンはこ
こで記述されるようにミコバクテリアの他の属でも挿入突然変異を発生するのに
使用される。
ここで使用される「トランスポゾン」という用語は、非突然変異トランスポゾン
、あるいは、トランスポゾンの一部が削除され、およびもしくは取り替えられ、
およびもしくはトランスポゾンが追加のDNA配列を含む突然変異トランスポゾ
ンを意味する。
一般に、トランスポゾンはそれぞれ(5′および3′)末端に逆方向反復塩基配
列、および逆方向反復塩基配列の間にトランスボザーゼ酵素をコード化する遺伝
子を含有する。トランスボザーゼは、トランスポゾンがDNA (例えば染色体
DNA。
プラスミドDNA、ファージDNAなど)から立ち退き、別のDNAあるいは同
じDNAの他の領域に挿入あるいは転位するように逆方向反復塩基配列に作用す
る。ある場合には、トランスポゾンは更に、転位を調節するりゾルベースおよび
もしくは調節蛋白質をコード化する遺伝子を含む。
ミコバクテリアトランスポゾンで実施される挿入突然変異番ヨ、染色体の一つの
領域がらのミコバクテリア染色体に含まれるトランスポゾンの、染色体の他の領
域に含まれるミコバクテリア遺伝子へと「ホッピングJする無作為転位により、
実行されるし、あるいは各種の手段によりトランスポゾンはミコバクテリアに形
質移入することが出来る。形質移入に続き、トランスポゾンは次いで挿入突然変
異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に挿入することが出来る。
トランスポゾンは、ミコバクテリアベクターおよびミコバクテリオファージベク
ターを含むいずれのプラスミドあるいはファージDNAベクターにも含まれる。
一実施例において、トランスポゾンはミコバクテリアベクターに含まれる。この
ペクターは前記記載のようにミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリ
オファージプロモーターを含む。もう一つの実施例において、トランスポゾンは
前記記載のようにミコバクテリア染色体へのファージの組込みをコード化するミ
コバクテリア発現ベクターあるいはDNAを含むし、あるいはトランスポゾンは
、一つの生体内で複製出来るファージDNA内では得られるが、ファージが形質
移入される生体内では含まれない。代替的に、トランスポゾンはミコバクテリア
以外の細菌に複製出来るがミコバクテリアには複製出来ない接合性プラスミドに
含有される。例えばトランスポゾンは大腸菌あるいはストレプトマイセス属など
の細菌には複製出来るが、生型結核菌BCGには複製出来ない接合性プラスミド
に含有される。
一実施例において、トランスポザーゼをコード化する遺伝子およびレゾルベース
をコード化する遺伝子、およびもしくはもし存在するとしての調節蛋白質がその
トランスポゾン内部の正しい位置(逆方向反復塩基配列の間)から除去される構
築物が作られ、その構築物内では逆方向反復塩基配列の外部に置かれる。前記記
載のような選択的マーカー(例えば抗生物質耐性)は、次いで逆方向反復塩基配
列の間で位置を占める。転位因子はかくして逆方向反復塩基配列および選択可能
なマーカーを含む。この構築物は次いでミコバクテリア発現ベクターにクローニ
ングされ、これはミコバクテリア複製起点を含み、また前記記載のもののような
ミコバクテリアプロモーターあるいはミコバクテリオファージプロモーターを含
む。プラスミドのミコノ(クチリア複製起点は次いで、ミコバクテリア複製起点
が温度に感受的になるように突然変異される(例えばプラスミドは30℃で複製
出来るが、37℃では出来ない)。プラスミドは次いで30℃でミコバクテリア
に形質移入され、ミコバクテリアは抗生物質耐性で選択される。抗生物質耐性コ
ロニーは次いで抗生物質を含む完全培地で37℃で培養される。37℃では、突
然変異ミコバクテリア複製起点は複製出来ない。生残するミコバクテリアは、逆
方向反復塩基配列を含む転位因子がプラスミドからミコバクテリア染色体に転位
したものである。トランスボザーゼ遺伝子、およびレゾルベース遺伝子およびも
し存在するとして調節蛋白質遺伝子がプラスミドに残っているために、トランス
ボザーゼ遺伝子およびレゾルベースおよびもしくはもし存在するとしての調節蛋
白質遺伝子がミコバクテリアの更なる複製で失われ、従ってミコバクテリア染色
体への挿入に際し転位構築物はその後何らの転位を受けることもな(なる。
代わりに、前記記載の構築物は、ミコバクテリアに複製出来ないベクターにクロ
ーニングする。すなわち、このベクターはミコバクテリアの複製起点を含まない
。ベクターは次いでミコバクテリアに形質移入される。構築物を有するベクター
がミコバクテリアに複製しないので、ベクターは消失する。形質移入の後でミコ
バクテリアは抗生物質耐性でスクリーニングされる。生残するミコバクテリアは
逆方向反復塩基配列を含む転位因子および抗生物質耐性マーカーがプラスミドか
らミコバクテリア染色体へ転位したものである。トランスポザーゼ、プラスリシ
ルベースおよびもしも存在するとしての調節蛋白質遺伝子はプラスミド内に残存
しており、従ってミコバクテリアの複製を繰返す毎に失われ、そのため、転位構
築物は、ミコバクテリア染色体への挿入に際して、更なる転位を受けることはな
くなるであろう。
ミコバクテリアトランスポゾンが構築されるがそれはミコバクテリアに異種の蛋
白質をコード化する少くとも一つのDNA配列を含むことも考察される。ミコバ
クテリアに異種の蛋白質をコード化する少くとも一つのDNA配列は、関心のあ
る蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子のすべであるし)は一部で
あるDNAであり得る。関心のある蛋白質あるいはポリペプチドは前記記載のも
のである。ミコバクテリアに異質の蛋白質をコード化する少くとも一つのDNA
配列は適切なプロモーターの制御の下にある。このようなトランスポゾンはまた
当業者に周知の技術で構築すること力咄来る。トランスポゾンはまた前記記載の
トランスボザーゼ遺伝子およびもしくは選択可能なマーカーを含むことが出来る
。代替的に、トランスボザーゼ遺伝子、およびリシルベース遺伝子およびもしく
はもしそれが存在するものとしての調節蛋白質遺伝子がミコノ\クチ1ノアトラ
ンスポゾンから除去され、逆方向反復塩基配列の外側に位置するような構築物が
形成され、またミコバクテリ月こ異種の蛋白質をコード化する少くとも一つのD
NA配列および望ましくは選択可能なマーカーが、逆方向反復塩基配列の間に位
置を占める。構築物は、次いでミコバクテリアへの形質移入のため、前記記載の
ようにベクター内に置かれる。逆方向反復塩基配列を含有する転位因子、ミコバ
クテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化する少くとも一つのD
NA配列および選択可能なマーカーは次いでミコバクテリア染色体に無作為に挿
入される。
ミコバクテリアトランスポゾンにより一度ミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異
が実行されると、ミコバクテリアは前記記載の方法により突然変異される遺伝子
を決定するためにスクリーニングされる。突然変異遺伝子が一度確認されると、
補足遺伝子が分離されまた発現ベクターにクローニングされ、それは突然変異ミ
コバクテリアに形質転換される。
この発明の範囲内で考察されたことは、更に、挿入突然変異が遺伝子のヒト結核
菌内に病原性をヒト結核菌に授け、これによりヒト結核菌を病原性から非病原性
の生体に形質転換させる。このような突然変異非病原性ヒト結核菌生体は結核菌
に対する防御のワクチンに使用される。もし望ましければ、突然変異非病原性ヒ
ト結核菌生体は、前記記載の通り更に挿入突然変異を受け、これにより栄養要求
性突然変異が突然変異ヒト結核菌生体に授けられる。その突然変異ヒト結核菌生
体は次いで前記記載の当業者により遺伝的に操作され、補足遺伝子およびもしく
は関心のある異種の蛋白質に対する遺伝子も発現される。
ミコバクテリアに異種の蛋白質あるいはポリペプチドをコード化するDNAで形
質転換された前記記載の突然変異ミコバクテリアは、形質転換突然変異ミコバク
テリアにより発現された蛋白質あるいはポリペプチドに依存してワクチンもしく
は治療薬の生産に用いることが出来る。
そのワクチンあるいは治療薬を形成するために、形質転換突然変異ミコバクテリ
アは、適切な薬剤キャリアと併用して投与される。適切な薬剤キャリアの代表例
としては、鉱油、ミョウバン、合成ポリマーなどがある。ワクチンおよび治療薬
の溶剤は当業者にとって周知であり、適切な溶剤の選択はここでの教訓から当業
者の範囲内にあるものと見做される。適切な溶剤の選択は更にワクチンあるいは
治療薬が投与される方法にも依存する。ワクチンあるいは治療薬は注射の形をと
ることが出来、筋肉、静脈内、経口、皮肉あるいは皮下投与で投与される。
ワクチンあるいは治療薬を投与する他の手段はここでの教訓で当業者には明白で
ある。従ってこの発明の範囲は特定の運送形態に限定されるものではない。
形質転換突然変異ミコバクテリアがワクチンとして利用される場合、そのワクチ
ンは現在利用出来る他のワクチン以上に重要な利点を持つ。ここで指示されるよ
うにミコバクテリアは現在知られている最良のアジュバント性能を有し、従って
、受容者の免疫系統が大きな効果で応答するよう刺戟する。ワクチンのこの局面
が細胞性免疫を誘導し、かくして細胞性免疫が耐性に非常に重要である場合に病
原に対する免疫を提供するのに特に有用である。更にミコバクテリアは長期の記
憶すなわち免疫を刺戟することが出来る。かくしてそれは長期持続T細胞記憶を
活性化することが可能であり、感染因子あるいは毒素を中和する第2吹拭体応答
を刺戟する。そのT細胞を活性化することは、例えば、破傷風やジフテリアの毒
素、百日咳、マラリア、インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、狂犬病、
リフトバレー熱ウィルス、デング熱ウィルス、はしかウィルス、ヒト免疫不全ウ
ィルス(HIV)、呼吸器系合胞体ウィルス、ヒト腫瘍、およびヘビ毒に対し有
用である。
ワクチンあるいは治療薬としてこの発明に従って形質転換されたミコバクテリア
を採用するもう一つの利点は、一般にミコバクテリアが大きなゲノム(すなわち
約3X10’塩素対の長さ)を有することである。ゲノムが大きいため、他の源
から大量のDNAを融通することができ、1個以上の抗原およびもしくは治療薬
をコード化するDNAを含むワクチンおよびもしくは治療薬を作り出すことが出
来る。
この発明は下記の実施例に関連して記述される。しかし、この発明の範囲はそれ
によって限定されるものではない。
実施例1(比較)
恥垢菌の無作為シャトル突然変異
恥垢菌菌株mc” 6の染色体DNA (ジヱイコブ、ジュニア他rNatur
eJVo1.327.pgs、532−536(1987))はM s p I
で部分消化された。次のサイズ選択、4Kbから7KbまでのDNA挿入はC1
aI消化pYUB36にて結合された(図1)。pYLIB36はアンピシリン
耐性の遺伝子(amp)、および大腸菌複製起点を含み、pBR322の誘導体
であり(ポリパー他、rGeneJVo1.2.pgs、95−113 (19
77))、そこで、非必須1.9Kb EcoRVからPvulI断片が除去さ
れた。DNA挿入がC1aI消化pYUB36に連結された後、生成した構築物
は大腸菌株X2338の誘導体である大腸菌株ec” 270に形質転換され(
ジェイコブ他rP r o c。
Natl、Acad、Sci、J Vol、83.pgs。
1926−1930 (1986))、その中でトランスポゾンTn5.配列l
(ナグ他rGeneJ Vol、64.pgs。
135−145 (1988)(図2)が染色体の未知の位置で挿入された。T
n5配列lはカナマイシン耐性を大腸菌およびミコバクリチアの双方に授けるネ
オ遺伝子をコード化し、そのネオマシンハイパー耐性表現型を使用するプラスミ
ドベクターにクローニングするDNA配列への挿入の選択を可能にしくバーブ他
、rGeneticsJ Vol、105.pgs。
813−828 (1983))、またTn5seqlはストレプトマイシン耐
性をコード化するTn5に存在していたクリプテイック遺伝子を欠いている。因
にストレプトマイシン耐性は、下記に記述するように、ヒト結核菌株の遺伝子工
学にとっては重要な生物災害問題なる。(rU、S、Fed、Register
J Vol、51.pg、16957)形質転換大腸菌生体は、アンピシリンお
よびカナマイシンをそれぞれ40μg/mlおよび50μg/mlの濃度を有す
るし寒天培地を培養された。約30000個体形質転換細胞がプールされ、20
個の独立した5ml培養で10−3に稀釈され一夜37℃で保温された。−後培
養のそれぞれからの200μlサンプルは、250μg/mlネオマイシンを含
有するし寒天上に約1000個のコロニーを作り出したが、ここでそのコロニー
は、大腸菌染色体から形質移入プラスミド−のTn5seq 1の転位を通じて
授けられるネオマイシンハイパー耐性で選択された。ネオマイシンハイパー耐性
コロニーから得られたプラスミドDNAは、バーンボイムrMethods i
n EnzymologyJ Vol、too、pgs、243−255(19
83)で記載されている方法で分離され、大腸菌株X2338に再び形質転換さ
れ、プラスミドDNAは引き続き形質転換細胞から分離、調製されて。Tn5s
eq l突然変異プラスミドライブラリーは次いで恥垢菌株mc” 6あるいは
mc2155に電気穿孔され(スナツパ−他、rMoL。
Microbiol、J Vol、4.pgs、1915−1919 (199
0))、またカナマイシン耐性形質転換細胞は、20μg/mlのカナマイシン
を含有するに寒天(ミドルプルツク7H10寒天、5mg/mlカザミノfil
(Difco)、looug/mlジアミノピメリン酸、50ug/mlチミジ
ン、40ug/μlウラシル、133gg/mlアデノシン、0.2%グリセロ
ール、卵白デクストローズ複合体、およびIOμg/mlシクロへキサミドで補
足)から選択された。カナマイシン耐性形質転換細胞はプラスミドDNAのpg
当り20から40の頻度で得られた。相同DNA配列を欠除している対照pBR
322: Tn5seq1プラスミド(図13で示されるpYUB244で知ら
れるもの)からはカナマイシン耐性コロニーは得られなかった。約800個の恥
垢菌形質転換細胞がアスパラギンなしで最小ツートン培地にストリーキングする
ことで栄養要求性突然変異のためスクリーニングされた。形質転換細胞はデーヴ
イス他[遺伝子工学マニュアル。
先行細菌遺伝学」コールド、スプリング、ハーバ−、ラボラトリ−(19801
Appendix2.pgs、209−210で記載された栄養素要求性突然変
異のためスクリーニングされた。このスクリーンの結果、3個の栄養素要求性突
然変異体が得られ、その栄養素要求株は、同じくディヴイス他(1980)で記
述されているように、大腸菌の栄養素要求株突然変異分析で用いられた11個の
プールの栄養分の1個もしくは他のもので補完されたツートン寒天平板により決
定された。このスクリーンで得られた栄養素要求性突然変異体3個は、メチオニ
ン要求性突然変異体(恥垢菌株mc”311)、ピリドキシン要求性突然変異体
(恥垢菌株mc”313)および特徴の不完全な突然変異体であった。
実施例2
A、恥垢菌メチオニン要求性突然変異体のBCGパスツール相補性クローンの分
離。
BCGパスツールのゲノムライブラリー(WHOレフエレンスライブラリ−1国
立血清研究所、コペンハーゲンより入手)は、4Kb−7Kb、Msp−1消化
染色体DNA断片をC1aI消化pYUB53に連続して構築された(図3)。
後者は大腸菌ミコバクテリアシャトルベクターであり、大腸菌複製起点およびミ
コバクテリア複製起点を含んでいる。連結されたI) N Aは次いで大腸菌株
ec” 270に導入され、スナツパ−他(1988)に記載された大腸菌プー
ルから分離されたプラスミドは、恥垢菌メチオニン要求性突然変異体mc”31
1に電気穿孔された。このためプラスミドはミコバクテリア複製起点を持ってい
るためミコバクテリア染色体には組み込まれず、ミコバクテリア内で自己複製す
る。スナツパ−他(1988)に記載されているように、(met相補相補ワク
ローンて引用される)mc”311に原栄養体性を授けるプラスミドが分離され
た。
B、met相補性クローンの不活性化
前記実施例1で記載の通り、pYUB 121と名付けられたmet相補性クロ
ーンはネオマイシンハイパー耐性選択により、大腸菌の挿入不活性化を受けた。
個体pYUB l 21クローンは、デーヴイス他(1980)に記載の手法に
従って、mc” 311メチオニン要求性突然変異を補完する能力の減少を確か
めるためスクリーンされた。
C,BCGの組換え
スナツパ−(1988)の手法に従い、プラスミドpYUB12]、、24a(
図4)、pYUB121.3 (図5)およびpYUB121.2 (図6)が
mc”311メチオニン要求性突然変異体から分離されたpYUB121.24
a。
pYUB121.3およびpYLIB121.2のそれぞれがEcoRIで消化
された。各プラスミドからのTn5seqlを含むEcoRI断片が、対応する
pYUB149 (図8)、pYUB147 (図9)およびpYUB146
(図10)をそれぞれ得るため、ミコバクテリアに複製不可能な大腸菌ベクター
であるEcoRI消化p、YUB137(図7〕にサブクローニングされた。
BCGパスツールは、バーナディー二重rProc、Nat1、Acad、Sc
i、J Vol、86.pgs、3867−3871 (1989)の記載によ
り、但し下記の修正を伴ってpYUB 146で電気穿孔された。BCG培養は
MADC−TW肉汁50m1内でl:50で二次培養(スナツパ−他rProc
、Nat1.Acad、5ciJ Vol、85゜pgs、6987−6991
(1988)され、10日間37℃で成長した。得られた培養はコールドグリ
セロール50m1で、次いで25m1で洗滌された。遠心分離に続き、最終ベレ
ットは各電気穿孔で用いられる10のコールドグリセロール2.5mlおよび0
.4mlで再懸濁された。BCG形質転換細胞は、スナツパ−他(1988)に
記載の通り、卵白デキストローズ複合体、(ADC)、0.2%グリセロール、
カナマイシン(20ag/m 1 )およびメチオニン(50ag/m l )
を含む10ag/mlシクロへキサミドで補完されたミドルプルツク7H10寒
天で培養された。
Tn5 5eql不活性化メチオニンを含む線形DNA断片の二重交差事象から
得られる相同性組換えは、カナマイシン耐性メチオニン要求性BCG突然変異体
を作り出すものと考えられた。しかし期待に反して、BCGパスツールの200
個以上のカナマイシン耐性形質細胞の1個だけのメチオニン要求性突然変異体が
、Tn5 5eql不活性メチオニン遺伝子を含む線形pYUB l 46の形
質転換から得られた。形質転換細胞はデーヴイス他(1980)の手法に従いス
クリーンされた。この結果が示すことは、高度の非正統性あるいは無作為組換え
が形質転換BCGパスツール生体に生じ、そこではB’CG染色体にある相同性
met部位にTn5seq 1不活性met遺伝子が組換えも組み込みもしなか
ったことであった。
実施例3
BCGにおける非正統的組換えの論証
以下でBCG菌株me2576として引用される実施例2で得られたBCGメチ
オニン要求性突然変異体よりの全染色体DNAは、ATCCNo、55202と
して預けられ、他の2個のカナマイシン耐性形質転換細胞はプローブとしてBC
Gmet遺伝子よりの1.8kbXholDNA断片を用いてサインプロツティ
ング分析を受けた(図11)。図11のレーン1に示されるように、このプロー
ブは野生型BCG染色体に8.5kb断片を発見する。もし相同性組換えが起こ
っていたなら、染色体と形質転換プラスミドからの線形DNAの間の二重交差は
、挿入不活性遺伝子により染色体met遺伝子に代替していた筈であった。サイ
ンブロツティング分析で、染色体の8.5kbXhOI断片はTn5seq 1
にあるXho Iの存在のため2個の新しいXho I断片に代替する筈である
。
2個の断片の全長は8.5Kbプラス3.2kbであり、3.2kbはTn5s
eqlの長さである。しかし図11が示すように、mc2576 (レーン2)
栄養性要求突然変異体は、他の2個のカナマイシン耐性形質転換細胞(レーン3
および4)と同じように、3個のXhoI断片を含み、1個は8.5Kb断片で
、2個は断片AおよびBで、それはTn5seql不活性BCGmetクローン
に存在するものと同じである。これらの結果が示すことは、メチオニン要求性突
然変異体mc’576にも他の2個のカナマイシン耐性形質転換細胞にも二重交
差は生じなかったということであった。従って、Tn5seql不活性met遺
伝子を含む線形DNA断片はBCG染色体に非正統的に組み込まれた。
更にHidIII消化染色体DNAおよび同じXhoImetプローブを用いて
、サイン分析が行なわれた。野生型BCGの分析は1個のみの断片(図11.レ
ーン5)を発見する。
図11に示されるように、ドナー(プラスミド)DNAの内部Hindl I
I断片Cは、すべてのクローン(レーン6.7および8)に保持される。プロー
ブを用いるHindIII消化染色体DNAのサイン分析は、栄養素要求性突然
変異体(レーン6)および原栄養体(レーン7および8)で*印で示されるよう
に隣接断片Cを発見し、またそのサイズは組み込みの部位に依存する。異なった
BCG組換え体からの隣接断片Cのサイズの変化は、更にドナーすなわち形質転
換DNA断片がBCG染色体に無作為に組み込まれていることを示す。更にまた
、Xho IおよびHindIII消化染色体DNAは、ドナーのmet遺伝子
でTn5seqlの位置が変化せず、またTn5SeQlはBCG染色体に転位
しなかったことを示した。
サイン分析は次いで、線形化されたpYUB146の形質転換で得られた9個の
追加カナマイシン耐性形質転換細胞よりのHindIII消化およびXhoI消
化染色体BCGDNAに対し、BCGnet遺伝子から得られたXho Iプロ
ーブを使って行なわれた。3個のドナーバンドA、BおよびCが9個のクローン
すべてで発見され、相同的組換えが行なわれなかったことを示した。グアニンお
よびシトシン、ヌクレオチドに富むミコバクテリアDNAは、標準ゲル電気泳動
では溶解しない非常に大きいHindlII断片を作り出すので、前記記載のバ
ンド0組込みの無作為を確立するために、サインブロッティング分析は、12個
のクローンのAvaI消化染色体DNAをベクダブローブでハイブリッド形成す
ることで実行された。
図12で示されたように、プローブはpYUB 146に4個の断片を発見しく
レーン1)、野生型BCGには断片はなく(レーン2)、各レーン(レーン3〜
14)に保護される2個の内部断片を発見しそれは各クローンでサイズが変り、
異なったパターンを示し、これは組込みが無作為部位で起こり、また高度の非正
統性組換えがBCGに起きたことを論証した。
実施例4
この実施例では、前記記載の非正統性、すなわち非相同性組換えがBCGの特性
であるのが、あるいはメチオニン(met)遺伝子の特性であるのかを決定する
ために行なわれた。
Tn5seq 1がpYUB244を形成するためにpBR322に挿入される
。円形および線形pYUB244の等量が恥垢菌に電気穿孔された。この電気穿
孔では円形あるいは線形pYUB244のいずれにも組込みは生じなかった。組
込みはカナマイシン耐性の選択〔スナツパ−他(1988))、続くサインブロ
ツティング分析で決定された。恥垢菌の補完metクローンに挿入されたTn5
seq 1を有する円形および線形のpYUB l 56の等量(図14)が、
次いで、恥垢菌に電気穿孔された。スナツパ−他(1988)の手法で決められ
たように、線形および円形pYU8156を使用するカナマイシン耐性コロニー
の頻度はほぼ同じであり、次いでサインブロツティング分析が行われた。恥垢菌
のカナマイシン耐性コロニー6個のサインブロッティング分析で、pYUB15
6の組込みが6個のコロニーすべてにおいて染色体のEcoRI断片で生じたこ
とが示された。この結果、ミコバクリチア相同性配列が恥垢菌染色体への組込み
に必要であり、また恥垢菌への組込みは相同性組換えにより生じすることが判明
した。
円形およびEcoRI消化pYUB244およびTn5seq l不活性BCG
metクローン(pYUB146゜pYUB147およびpYUB149)の等
量がBCGに電気穿孔された。前記の内円形ではなく線形の断片が、その断片が
ミコバクテリアを含んでいるか否かにかかわらず、約1O−6から10−’/u
gDNAの頻度で染色体に組み込まれた。組込みは(1)コロニーはカナマイシ
ン耐性であること、および(2)前記記載のサインブロッティング分析で証明さ
れるドナー分子でバイブリド形成される形質転換細胞からの染色体DNA、とい
う2個の評価基準で決定される。
円形および線形pYUB244およびp、YtJB8(図15)でBCGが電気
穿孔される実験が更に行われた。pYUB8はpBR322の誘導体で、そこで
はpBR322のamp遺伝子はTn893のaph (カナマイシン耐性)遺
伝子に置換されており(スナツパ−1988)、また、Tn5seq 1の配列
を欠除している。この実験では、pYUB244およびpYtJB8双方の線形
DNAはDNAug当り1個だけ形質転換細胞を得たが、一方スナッパー他(1
988)の手順に従って、線形化されたpYUB8はそれぞれDNAug当91
2個および10個の形質転換細胞を得、その後サインブロッティング分析が行わ
れた。この結果、BCGにおける非正統的組換えはTn5seqlのトランスボ
ザーゼ機能に依存しないことが示される。
実施例5
この実施例では、円形および線形pYUB244およびpYUB 147がヒト
結核菌病原性H37Rv菌株(疾病管理センター、ジョーシア州アトランタ、ウ
ィルバー、ジョーンズ博士より入手)に電気穿孔された。この電気穿孔の結果、
スナツパ−他(1988)で決定されたようにpYUB l 47およびpYU
B244双方の線形のものが、より高い頻度でヒト結核菌染色体に組み込まれる
ことが示され、その後サインブロツティング分析を受けた。前記の結果、非正統
的組換えはBCGに限定されないことが示される。
実施例6
非正統的組換を利用するBCGイソロイシン−ロイシン−バリン栄養素要求性突
然変異体の分離および特性付けBCGパスツールは電気穿孔法により線形化pY
tJB244に形質転換された。電気穿孔法に続き、BCG細飽は0.5mg/
mlカザミノ酸および20μg/mlカナマイシンを含有するミドルプルツク7
HIO寒天で培養された。カナマイシン耐性コロニーはツートン最小培地で成長
する能力を調べるためスクリーンされ、またデーヴイス他(1980)で記述さ
れる栄養素要求性突然変異のためスクリーンされた。栄養素要求性突然変異分析
は、mc’716と指定される1個のBCG突然変異細胞が、成長のためイソロ
イシン、ロイシンおよびバリンを必要とすることを示した。
BCGパスツールのゲノムライブラリーは、実施例2で前記記載の通り、4Kb
−7Kb、Msp−1消化染色体断片なC1aI消化pYU853に連続して構
築された(図3)。スナツパ−他(1988)による記述の通り、連続DNAは
次いで大腸菌株ec” 270に導入され、プラスミドは大腸菌のプールから分
離され、BCG菌株mc”716に電気穿孔されATCCNo、55203とし
て預けられた。(イソロイシン−ロイシン−バリン補完クローンとして引用され
る)mc”716に原栄養性を授け、またBCGilv遺伝子を含有するプラス
ミドは、スナツパ−他(1988)に記述されるように分離された。このプラス
ミドはpYUB245として参照される(図+6]。
実施例7
A、恥垢菌の突然変異asd選伝子を有するプラスミドの構築
アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素(a s d)遺伝子は、アスパラギ
ン酸からジアミノピメリン酸(DAP)を生合成する初期の段階の触媒作用をす
る酵素をコード化し、か(してそれはミコバクテリアの細胞壁生合成に重要な成
分となる。
asd遺伝子および組換えDNAベクターに図するasd遺伝子によるその補完
の中で突然変異を含む菌株は、ベクターを生体内で維持するための有用な栄養素
要求性突然変異選択システムを代表するものとなる。ジェイコブ他rPNAsJ
Vol。
83、pgs、1926−1930 (1986)の手順に従って、恥垢菌as
d遺伝子は大腸菌asd突然変異体を補完し、核酸配列を決定することによりク
ローニングされた。asd遺伝子は、2個のPstI部位を遺伝子の真中に持ち
2個のpstI部位を遺伝子の側面に持つ5KbEcoRI上に運ばれる。as
d遺伝子はpブルースクリプトKs+のEcoRI部位にクローニングされ、(
ストラータジエン社、ラホーラ。
カリフォルニア)、生じたプラスミドはpYUB114と指定された(図17)
、pYUBl 14はEcoRIで消化され、大きなEcoRI断片は次いで分
離され、EcoRI部位でpGEM−72f+ (プロメガ)と連結され、pY
UB l 60を形成した(図18)、pYUB160はPstIで切断され、
asd遺伝子の中央1.637bpの欠失を有する大きい断片は分離された。p
YUB8 (図15)はPstIで切断され、PstI Kan11カセットは
pYUB8から分離され、pY(JB 160からの大きいPstI断片に連結
された。
生成した連結は、電気穿孔法によりpyuBl 14に運ばれるアンピシリン耐
性を選択する大腸菌株DH5xに形質転換された(ダワー他、’rNuc1.A
c1d、Res、J Vol。
+6.pgs、6127−6145)、形質転換細胞はasd遺伝子の中央1.
637btを]、3KbKan” カセットと置換するためにスクリーンされた
。生じたプラスミドpYUB205 (図19)は、asd遺伝子の1.637
bpを欠除し、それはaph遺伝子に置換されている。そのような欠除および置
換は以後△asd : : aphとして引用される。
pYUB205は次いでEcoRIで切断され、大きい断片はアガロースゲルか
ら分離された。断片は次いでpYUB l 74に連結され(図20)、それは
EcoRIで切断され、子牛の腸のフォスファターゼでフォスファターゼ化され
た(ベーリンガー社、インディアナポリス、インディアナ)。βガラクトシダー
ゼ遺伝子を有するプラスミドpYBB 174は、ミコバクテリアにβガラクト
シダーゼを発現させるために、切形βガラクトシダーゼ遺伝子の上流である前に
分離されたミコバクチオファージL lプロモーター(パーラツタ他rJ、Ge
n。
Microbiol、J (1991))を置くことで構築された。生じたプラ
スミドpYUB215(図21)はΔasd:: aph遺伝子、およびミコバ
クテリオファージLlプロモーターで制御される切形βガラクトシダーゼ遺伝子
を有している。
B、mc” 687の構築
ジェイコブ他rMeth、Enzymo1.J Vol。
204、pgs、537−555 (1991)の手法に従って、pYUB2
] 5は電気穿孔法により恥垢菌株mc26に形質転換された。この形質転換は
次いでM−ADC平板で15g/lバクト寒天で培養(ジエイコブズ他、199
1年)され、カナマイシンを含み、IOμg / m 1で加えられ、5−ブロ
モ−4−クロロ−3−インドイルβ−D−ガラクトシダーゼ(X−gal)を8
0μg/mlで加えられ、この培地はこれからM−ADC−KXとして何回か参
照される。平板はコロニーが見えるようになるまで37℃で保温された。ブルー
コロニーは摘みとられ、pYUB215の組込みを確定するためにサインブロツ
ティング分析でスクリーンされた。
プラスミドpYUB215がはじめに恥垢菌に形質転換された時、ブルーのカナ
マイシン耐性コロニーは、形質転換効率対照ベクターpMV261と比較して(
スト−パー他rNatureJ Vol、351.pgs、456−460(1
991))、DAPおよびカザミノ酸を含むM−ADC−KX寒天上で、DNA
のマイクログラム当り10−’から10−6コロニーの頻度で得られた。1個か
ら5個のコロニーのバックグラウンド以上に、著しい数のホワイトコロニーは得
られなかった。ブルーコロニーは、pY(JB215および恥垢菌染色体の間の
単一交差組換え事象により発生したと推論された。単一交差事象は、恥垢菌染色
体にあるasd遺伝子に隣接する恥垢菌DNA配列と同一であるaph遺伝子に
隣接する恥垢菌DNA配列の間で生じたものであろうと考えられた。サイン分析
を8個の形質転換細胞で行った結果、pYUB215はaph遺伝子のどちらか
一方の側に組み込まれ、そのような形質転換細胞の一つが菌株mc2687と指
定された。染色体asd遺伝子を突然変異体△asd : : aph対立遺伝
子と置換することが出来ないことは、asd遺伝子が基本的なものであり、ある
いは二重交差事象がミコバクテリアにおいて非常に少ない頻度でしか起こらない
ことを示すものと解釈される。同時二重交差事象を持つ必要性は、染色体Δas
d : : aph突然変異体が二段階方法で横築されることで観察される。m
c”687が既にpyuBに組み込まれるという単一交差事象を受けているため
に、染色体での2個の対立遺伝子の相同的配列の間の第2組換えが望ましい突然
変異体を生じることができる。
図23で示されるように、第2組換え事象において、asd遺伝子の3′末端は
Δasd : : aph遺伝子の3′末端に自身で並ぶ。これら2個の「3′
末端」配列は相同的である。染色体間の組換えを通じて、asd遺伝子、1 a
cZ遺伝子、および大腸菌複製起点(o r i E)を有する円形プラスミド
は、染色体から飛び出すはずである。かくして、プラスミド配列が飛び出す際に
はその間プラスミドはミコバクテリア複製起点を含まないので、βガラクシトー
ゼの損耗によって染色体間の組換えをスクリーンすることが可能になる。
C,mc” 687のβガラクトシダーゼ突然変異体の分離
菌株mc” 687はM−ADC−TW培地およびカナマイシンで成長し、アリ
コートはカナマイシンおよびx−galの追加でM−ADC寒天で培養され、ホ
ワイトコロニー生産のためにスクリーンされた。
失われたβガラクトシダーゼ活性を有するmc” 687の突然変異体は、細胞
当り8X1(I5の頻度で得られた。mc”687と比較して8個のクローンか
ら得られる全染色体DNAのBamHI消化のサイン分析が図2・・4で示され
る。このDNAはpYUB245でプローブされた。図24で示されるように、
プロットのトップから、mC” 687において、第2および第5バンドはBa
mHI断片を組込みpYUB215に隣接させており、第1.第3および第4バ
ンドはpYUB215からの内部断片(第1)あるいは染色体asd遺伝子(第
3および第4バンド)に対応する。矢印で示されるように、l acZ遺伝子(
βガラクトシダーゼ遺伝子)断片は約9.5Kbの最大のバンドである。すべて
の白色突然変異体は1acZバンドおよび余分の小さいバンドのサイズに移行し
ている。1 acZバンドに加えられたより小さなバンドのサイズは長さで約1
1.5Kbの断片を生じ、これは約2.5Kbの挿入要素(IS要素)すなわち
BamHI部位を有するトランスポゾンがl acZ遺伝子に挿入されることに
より、説明することができる。
βガラクトシダーゼ遺伝子に挿入される挿入要素は、完成のためEcoRIで挿
入要素を含むクローンから分離した全染色体NDAを切断することで回収するこ
とが出来る。
EcoRI消化は完全に機能的大腸菌プラスミドを開放するが、これはΔasd
: : aph遺伝子がEcoRI部位でpYUB l 74にクローンされ
たためであった。EcoRIでの消化は、今や挿入要素を含むもとのpYUB
l 74を開放することになろう。挿入要素を分離するために、EcoRI消化
DNAは、DNA濃度5ng/μl以下で自己連結し、pYtJB 174で運
ばれるBラクタマーゼによりコード化されるアンピシリン耐性を選択する大腸菌
株DH5に形質転換した。l51096と措定された挿入要素を含む一つのクロ
ーンはpYtJB209として指定された(図25)。
D、l51096の特性付け
βガラクトシダーゼ遺伝子への8個のl31096挿入の近似位置が図26で示
される。pYUB215βガラクトシダーゼ遺伝子への8個のl31096転位
の近似位置がサイン分析で決定された。l51096の制限地図は、挿入要素内
でのBamHI部位のオリエンテーションに、1 acZ遺伝子への挿入位置の
正しい近似値を可能にさせた。βガラクトシダーゼで遺伝子内での挿入分布から
、l51096は無作為様式で転位する。
恥垢菌のl51096転位の頻度をより正確に決定するために、mc” 687
の10個のコロニーがカナマイシンで飽和した5m1M−ACD−TWで静止局
面まで培養された。この10個の培養の稀釈が、約1000コロニー/平板が得
られるようにM−ADC−KX平板で取り出された。各培養の細胞は、次いでホ
ワイトコロニーをスクリーンするために20個のM−ADC−KX平板に移され
た。存在するコロニーの全数で分割されたホワイトコロニーの数は、mc” 6
87のβガラクトシダーゼ遺伝子にある突然変異の分離度数を表す。
これらの培養におけるβガラクトシダーゼ活性の平均損耗度数は、細胞当り、7
.2X10−’であった。この数は、平板を含むX−galで第2次スクリーン
された際、βガラクトシダーゼに対し全く陰性であることを証明するコロニーの
みを含むものである。
E、l51096の制限分析
pYUB209内のl31096は、2個のHpaIを部位の間のβガラクトシ
ダーゼ遺伝子間に位置していた。挿入要素の配列化を容易にするために、このH
pa1断片は、オリエンテーションの双方をpGEMf” (プロメガ)のSm
aI部位にクローニングした。一度この断片がpGEM7Zf“にクローニング
すると、I S 1096およびl51096のポリリンカーにある好都合な部
位を利用してい(っかの欠失が構築された。欠失は、pGEM7Zf”のポリリ
ンカーへの両方向でI S l 096内でBstXIおよびBamHI部位か
ら行われた。これらの欠失を持つことで、これらの部位の両方向からl5109
6への配列化が可能となった。l51096の両連鎖およびl51096および
pYUB209の間の結合の配列化は、同じように合成オリゴヌクレオチドを使
用して行われた。配列化反応は、シークエナーゼ、ヴアーシロン2.0(ユナイ
テッドステーツ、バイオケミカル社)の二重連鎖DNA鋳型を使いクラフト他r
Bio TechniquesJ Vol、6.pgs、544−547 (1
988)記載の方法で実施された。
ストレプトマイシス・コエリーコロール(S、coe 1 i color)、
大腸菌株に−12、枯草菌および12個のミコバクテリア属のサイン分析が、プ
ローブとして、図28のグラフによる提示で示されているようにBamHIおよ
びB s、t X I部位の間に固形バーで示される内部TS1096を断片を
使用して達成された。図27に示されるようにI S 1096は恥垢菌のみに
存在する。ミコバクテリアの病原菌株であるヒト結核菌、生型結核菌、角型結核
菌、およびらい菌は、挿入要素を欠如している。
3個の形態型の恥垢菌ATCC607を含むいくつかの異なった恥垢菌分離体は
、l51096でプローブされた時に制限パターンの変化の度合を決定するため
に、サイン分析でプローブされた。サイン分析は、恥垢菌me” 22.mc”
23、mc” 31.mc’ 32およびHindllIで切断されたDNA
(サイズ標準が放射性同位元素で標識される)から分離された全染色体DNA
のPstl消化に対し、l51096で実行された。このブロワ]−は図28で
示される。
レーン1はmc” 6+ レーン2はmc″22、レーン3はmc”23であり
、レーン4はm c 231 + レーン5はmc”32であり、レーン6はサ
イズ標準が放射性同位元素で標識されたHindIIIで切断されたDNAであ
る。図29で示されるようI乙異なった分離体にはかなりの変異性がある。ただ
一つのバンドがすべての分離体の中にあられれており、また数多くの挿入要素が
8から16の区域で見出された。mC”22およびmc”23の双方がmc”
6には存在しないl51096の追加のコピーを有していた。
F、l51096のヌクレオチド配列
l51096の配列が図29で示される。前記記載の方法で実施された配列分析
は、l51096の長さが2275bpであり、グアニンおよびシストシン(G
+C)の割合が67%であり、これは通常恥垢菌染色体で観察されるものに等し
いことが明らかとなった。(ウニイン他、rJ、Bacteriol、J Vo
w、96.pgs、1915−1919 (1968))。l31096の内部
領域は、平均G+C容量に類似の領域と同じように、約70%から約80%まで
の範囲のより高いG+Cの領域を有しているが、しかし挿入要素の末端のG+C
容量は60%以下のG+C容量を有している。
よく保持された逆方向反復塩基配列がJS1096の両末端で観察され、長さは
25bpであり、これは図29で肉太型で示されている。逆方向反復塩基配列に
2個のミス対合が存在する。βガラクトシダーゼ遺伝子への転位は、挿入点の両
側にある標的DNA配列の肉太線で示されるようにsbpの重複という形で現れ
ている。この重複は大抵の挿入要素の転位メカニズムと一致している。長さ約9
bpの逆方向反復塩基配列の3個のセットがl51096の3′末端に見出され
、この位置は図29で反対方向にある矢印の対でt旨定され示されている。
l51096配列の読み取り枠(ORF)分析は、100個のアミノ酸より長い
130RFの存在を明らかにした。推定上のORFはいずれも他の挿入要素によ
りコード化された蛋白質への高水準の相同性を示さなかった。しかし、ORFの
うち2個は、図29で示され、またターナ−他rNucl。
Ac1ds Re5earchJVo1.17.pgs。
1757 (1989)およびローランド他rMo1.Microbio1.J
Vol、4.pgs、961−975 (1990)で記載されているように
、tnpAトランスボザーゼおよびtnpR遺伝子が前に配列されているように
遠縁にあたるといえる。バリン開始コドンを持つ大きい414アミノ酸ORFが
発見され、これはTn3926からのトランスボザーゼを持つ185個のアミノ
酸に関し、21.1%が同一で66%が相同性であった(ターナ−他(1989
))、更にバリンで始まる237アミノ酸読み取り枠は1図29で示されるよう
に推定上のtnpA遺伝子に対し反対の方向にあり、tnpRと名付けられた。
tnpRのアミノ末端92アミノ酸は、TnlO00リシルベースのアミノ末端
に対し18.5%が同一で69%は相同性である。(リード他、rNature
J Vol。
300、pgs、381−383 (1892))。これらのORFでコード化
された蛋白質は、l51096で発見された他のORFよりも標準のトランスボ
ザーゼおよびリシルベース蛋白質と同じサイズか、それと非常に類似している。
これは、そのよりなORFコード化蛋白質がl51096の転位に含まれるが、
他のトランスポゾンの転位に含まれることで知られるよ(特性付けられた蛋白質
の遠縁にあたることを示すものである。
実施例8
ISLO96が恥垢菌にクローニングされ、構築物はトランスポザーゼをコード
化すると考えられる配列がl51096から除去され(前記記載のとおり)ap
h遺伝子で置換されるように作られる。トランスボザーゼをコード化すると考え
られる配列は、生じる構築物に残るが、逆方向反復塩基配列の外側に位置する。
生じた構築物は対でpGEM72f“にクローニングされる。生成したプラスミ
ドは生型結核菌BCGに形質転換され、生型結核菌BCG細胞はカナマイシンを
含みカナマイシン耐性で選択された完全な栄養性培地で培養される。生存するコ
ロニーは、転位因子がプラスミドからBCG染色体に転移したコロニーである。
トランスボザーゼ遺伝子はプラスミド内に残り、それは、ミコバクテリアには複
製出来ない。従ってプラスミドは損耗する。プラスミド内に残るトランスボザー
ゼ遺伝子が損耗するので、転位因子はそれが挿入されるBCG染色体の領域で残
り、染色体の他の領域あるいは細胞内に存在するいずれの発現ベクターにも転位
することはない。
生成するコロニーの選択に際し、コロニーは各種の培地で培養することにより、
特異な突然変異のためスクリーンされる。
しかしこの発明の範囲は、前記記載の特異な実施例に限定されるもものでないこ
とは理解されるべきである。この発明は特に記載されたより以上に実施すること
ができ、しかも以下の請求の範囲内に存在する。
f/G・り
r″ycrs情1°S
ftG、t
7’/l、ljN利
Fl &、/。
/bdt/r
F/G−、/’f
F/G−、/j”″
f/G−、/6
−一一一で―イi〒−+?+
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号Cl2R1:32)
(81)指定国 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IT、LU、MC,NL、SE)、AU、CA
、FI、JP、N。
(72)発明者 ブルーム、バリー
アメリカ合衆国、ニューヨーク 10706゜ヘイスティングスーオンーハドソ
ン、サミット ドライブ 81
FI
(72)発明者 カルバ九ガンジャム、ヴイ。
アメリカ合衆国、ニューヨーク 10461゜ブロンクス、イーストチェスター
ロード(72)発明者 シリルロ、ジエフリー、ディー。
アメリカ合衆国、ニューヨーク 10461゜ブロンクス、アパートメント 2
0ジー イーストチェスター ロード 1925
Claims (20)
- 1.突然変異ヒト結核菌BCG,突然変異ヒト結核菌および突然変異らい菌より なるクラスから選択された突然変異ミコバクテリウム。
- 2.ミコバクテリウムがミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異により突然変異を 起こす請求の範囲第1項記載の突然変異ミコバクテリウム。
- 3.前記ミコバクテリウム遺伝子の挿入突然変異が非正統的組換えによって実行 される請求の範囲第2項記載の突然変異ミコバクテリウム。
- 4.突然変異ヒト結核菌BCGおよび突然変異ヒト結核菌よりなるクラスから選 択される形質転換された突然変異ミコバクテリウムであって、前記突然変異ミコ バクテリウムが異種の遺伝子を発現することができる突然変異ミコバクテリウム 。
- 5.前記突然変異ミコバクテリウムが突然変異ヒト結核菌BCGである請求の範 囲第1項記載の突然変異ミコバクテリウム。
- 6.突然変異ミコバクテリウムが突然変異ヒト結核菌BCGである請求の範囲第 4項記載のミコバクテリウム。
- 7.一つのワクチンであって、請求の範囲第6項記載の生型結核菌BCGおよび 受容可能な薬品キャリアよりなるワクチン。
- 8.前記生型結核菌BCGが栄養素要求性生型結核菌BCGである請求の範囲第 5項記載の突然変生型結核菌BCG。
- 9.栄養素要求性生型結核菌BCGがメチオニン栄養素要求株である請求の範囲 第8項記載の突然変異ヒト結核菌BCG。
- 10.ATCC No.55202として預けられた突然変異ヒト結核菌BCG 。
- 11.栄養素要求性生型結核菌BCGがイソロイシン−ロイシン−バリン栄養素 要求株である請求の範囲第8項記載の突然変異ヒト結核菌BCG。
- 12.ATCC No.55203として預けられた突然変異ヒト結核菌BCG 。
- 13.前記突然変異が生型結核菌遺伝子の挿入突然変異により実行される突然変 異ヒト結核菌。
- 14.突然変異ヒト結核菌BCG、突然変異ヒト結核菌、突然変異らい菌よりな るクラスから選択される形質転換突然変異ミコバクテリウムであって、ここで前 記ミコバクテリウムがミコバクテリア遺伝子の挿入突然変異による突然変異を起 こし、また、前記ミコバクテリウムが前記挿入突然変異ミコバクテリア遺伝子を 補完し、それによって前記ミコバクテリウムが前記補完遺伝子を発現することが 出来る非突然変異遺伝子を含むDNAで形質転換される形質転換突然変異ミコバ クテリウム。
- 15.ミコバクテリア遺伝子の前記挿入突然変異がミコバクテリアトランスポゾ ンにより実行される請求の範囲第2項記載の突然変異ミコバクテリウム。
- 16.ミコバクテリアトランスポゾンであって、前記トランスポゾンがミコバク テリア遺伝子の挿入突然変異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に 挿入することが出来るミコバクテリアトランスポゾン。
- 17.請求の範囲第16項記載のミコバクテリアトランスポゾンであって、前記 トランスポゾンは、生型結核菌染色体、生型結核菌BCG染色体、鳥型結核菌染 色体、ヒト結核菌染色体、らい菌染色体、あるいは恥垢菌染色体から選択される 染色体に無作為に挿入するミコバクテリアトランスポゾン。
- 18.前記トランスポジンが図29に示されるIS1096である請求の範囲第 17項記載のミコバクテリアトランスポゾン。
- 19.突然変異ミコバクテリウムであって、前記ミコバクテリウムは、ミコバク テリア遺伝子の挿入突然変異を実行するためにミコバクテリア染色体に無作為に 挿入するミコバクテリアトランスポゾンによって突然変異を起こす突然変異ミコ バクテリウム。
- 20.前記トランスポゾンが、ミコバクテリアに異種の蛋白質をコード化する少 なくとも一つのDNA配列を含む請求の範囲第16項記載のミコバクテリアトラ ンスポゾン。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71465691A | 1991-06-13 | 1991-06-13 | |
US714,656 | 1991-06-13 | ||
US80670691A | 1991-12-12 | 1991-12-12 | |
US806,706 | 1991-12-12 | ||
PCT/US1992/004706 WO1992022326A1 (en) | 1991-06-13 | 1992-06-02 | Insertional mutations in mycobacteria |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06511145A true JPH06511145A (ja) | 1994-12-15 |
Family
ID=27109189
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP5500932A Pending JPH06511145A (ja) | 1991-06-13 | 1992-06-02 | ミコバクテリア内での挿入突然変異 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP0590027A4 (ja) |
JP (1) | JPH06511145A (ja) |
AU (2) | AU2189392A (ja) |
CA (1) | CA2111217A1 (ja) |
FI (1) | FI935566A0 (ja) |
NO (2) | NO934515L (ja) |
WO (1) | WO1992022326A1 (ja) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6566121B1 (en) | 1991-06-13 | 2003-05-20 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
ATE407945T1 (de) | 1993-11-23 | 2008-09-15 | Univ California | Reichlich vorhandene extrazelluläre produkte und methoden zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung |
US7300660B2 (en) | 1993-11-23 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
US6752993B1 (en) | 1993-11-23 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular product vaccines and methods for their production and use |
WO1995032277A1 (en) * | 1994-05-23 | 1995-11-30 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Insertional mutations in mycobacteria |
US5843664A (en) * | 1996-06-11 | 1998-12-01 | Institut Pasteur | Method of selection of allelic exchange mutants |
US6013660A (en) * | 1996-10-02 | 2000-01-11 | The Regents Of The University Of California | Externally targeted prophylactic and chemotherapeutic method and agents |
US6221364B1 (en) * | 1996-11-12 | 2001-04-24 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacteria auxotrophic for diaminopimelate |
US6818222B1 (en) | 1997-03-21 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
WO1999002670A1 (en) * | 1997-07-10 | 1999-01-21 | The Government Of The United States As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Method of attenuating pathogenic mycobacteria and strains of mycobacteria so attenuated |
US6387694B1 (en) * | 1998-04-03 | 2002-05-14 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Mycobacterial isocitrate lyase gene and uses thereof |
US7115730B1 (en) | 1999-04-27 | 2006-10-03 | Chiron Srl | Immunogenic detoxified mutant E. coli LT-A-toxin |
AU2001230912A1 (en) | 2000-01-11 | 2001-07-24 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Identification of virulence determinants |
CL2007002710A1 (es) * | 2007-09-20 | 2008-01-04 | Univ Pontificia Catolica Chile | Formulacion inmunogenica que confiere proteccion contra la infeccion o patologia causada por el virus respiratorio sincicial (vrs) que comprende una cepa recombinante atenuada de mycobacterium; y uso de la formulacion inmunogenica para preparar una vacuna para prevenir, tratar o atenuar infecciones del vrs. |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3011939B2 (ja) * | 1987-03-02 | 2000-02-21 | ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ | 組換えミコバクテリア・ワクチン |
US5504005A (en) * | 1987-03-02 | 1996-04-02 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Recombinant mycobacterial vaccine |
DE69034100T2 (de) * | 1989-06-19 | 2004-06-09 | Whitehead Institute For Biomedical Research, Cambridge | Verktorvermittelte genominsertion und expression von dna in bcg |
CA2045842A1 (en) * | 1990-07-16 | 1992-01-17 | William R. Jacobs | Dna capable of site-specific integration into mycobacteria |
-
1992
- 1992-06-02 EP EP9292913432A patent/EP0590027A4/en not_active Withdrawn
- 1992-06-02 JP JP5500932A patent/JPH06511145A/ja active Pending
- 1992-06-02 AU AU21893/92A patent/AU2189392A/en not_active Abandoned
- 1992-06-02 WO PCT/US1992/004706 patent/WO1992022326A1/en not_active Application Discontinuation
- 1992-06-02 EP EP99110251A patent/EP0972839A1/en not_active Withdrawn
- 1992-06-02 CA CA002111217A patent/CA2111217A1/en not_active Abandoned
-
1993
- 1993-12-09 NO NO934515A patent/NO934515L/no unknown
- 1993-12-09 NO NO934515D patent/NO934515D0/no unknown
- 1993-12-10 FI FI935566A patent/FI935566A0/fi unknown
-
1997
- 1997-03-17 AU AU16357/97A patent/AU1635797A/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2111217A1 (en) | 1992-12-23 |
FI935566A (fi) | 1993-12-10 |
EP0972839A1 (en) | 2000-01-19 |
NO934515D0 (no) | 1993-12-09 |
FI935566A0 (fi) | 1993-12-10 |
AU1635797A (en) | 1997-06-12 |
EP0590027A1 (en) | 1994-04-06 |
WO1992022326A1 (en) | 1992-12-23 |
EP0590027A4 (en) | 1994-10-19 |
NO934515L (no) | 1994-02-02 |
AU2189392A (en) | 1993-01-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6372478B1 (en) | Recombinant mycobacteria | |
EP0347425B1 (en) | Recombinant mycobacterial vaccine | |
US5773267A (en) | D29 shuttle phasmids and uses thereof | |
Glover | Gene cloning: the mechanics of DNA manipulation | |
US6752994B2 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
Jacobs et al. | In vivo repackaging of recombinant cosmid molecules for analyses of Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, and mycobacterial genomic libraries | |
Braunstein et al. | Genetic methods for deciphering virulence determinants of Mycobacterium tuberculosis | |
JPH06511145A (ja) | ミコバクテリア内での挿入突然変異 | |
JPH04506297A (ja) | ベクター媒介ゲノム挿入及びbcgにおけるdnaの発現 | |
US5866403A (en) | Homologously recombinant slow growing mycobacteria and uses therefor | |
JP2867374B2 (ja) | 百日咳毒素遺伝子 | |
AU728576B2 (en) | Method of selection of allelic exchange mutants | |
US5972700A (en) | TM4 conditional shuttle phasmids and uses thereof | |
US5736367A (en) | Vectors and prokaryotes which autocatalytically delete antibiotic resistance | |
JPH0576376A (ja) | 修飾されたトランスポゾンによるdnaの挿入 | |
US5571688A (en) | Method of detecting gene expression | |
WO1995032277A9 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
WO1995032277A1 (en) | Insertional mutations in mycobacteria | |
WO1993019603A1 (en) | Prokaryotes including dna encoding bacteriophage immunity | |
ELLING | Chapter Five Recombinant DNA |