JPH06510187A

JPH06510187A - 同翅類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法

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Publication number: JPH06510187A
Application number: JP5504218A
Authority: JP
Inventors: ヒルダー，バーン　アラン; ゲイトハウス，アナラッド　マーガレット　ロスコー; パウエル，ケビン; ブルター，ドナルド
Original assignee: ノバルティス　アクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1991-08-27
Filing date: 1992-08-26
Publication date: 1994-11-17
Also published as: EP0600993A1; CA2116449C; EP0600993B1; GR3032297T3; DK0600993T3; AU668096B2; HU219057B; CA2116449A1; AU2464592A; ES2140416T3; DE69230290T2; HUT70273A; US5604121A; WO1993004177A1; DE69230290D1; HU9400571D0; ATE186571T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】同列類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法本発明は植物に有害である同翅亜目に属する樹液吸引昆虫をコントロールするためのタンパク質の用法と同列類ベストへの高い耐性を植物中に導入する上でそれらを用いるための方法に関する。

発明の背景半翅目の別の亜目としてよくみなされる同翅亜目には植物昆虫として知られる昆虫を含む。これらの昆虫は穿刺及び吸引する口器を有しており、樹液から栄養摂取している。それらにはアブラムシ〔アブヒジダ（ＡｐｈｌｄＩｄａｅ）科〕、コナジラミ　〔アレイロジダ（Ａｌｅｙｒｏｄｉｄａｅ））　、プラントホッパー（ｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒ）　Ｃデルファシダ（Ｄｅｌｐｈａｃｉｄａｅ））　、ヨコバイ〔シカデリダ（Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ））　、キジラミ　〔サイリダ（Ｐｓｙｌｌｉｄａｅ））　、ワタアブラムシ〔ペンフィギダ（Ｐｅ■ｐｈ１ｇｉｄａｅ））　、コナカイガラムシ〔シェードコシダ（Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｉｄａｅ））及びカイガラムシ〔コシダ（Ｃｏｃｃｌｄａｅ）、ジアスピジダ（Ｄｉａｓｐｉｄｉｄａｅ）、アステロレカニイダ（ＡｓｔｅｒｏｌｅｃａｎＩ　１ｄａｅ）及びマーガロシダ（Ｍａｒｇａｒｏｄｌｄａｅ））がある。例えば、エントウアブラムシ、黒豆アブラムシ、ワタアブラムシ、緑リンゴアブラムシ、温室ポテトアブラムシ、葉カーリングプラムアブラムシ、バナナアブラムシ、キャベツアブラムシ、カブアブラムシ、モモポテトアブラムシ、トウモロコシ葉アブラムシ、小麦アブラムシ、アブラマコナジラミ、タバココナジラミ、温室コナジラミ、シトラスブラックフライ（ｂｌａｃｋｆｌｙ）、小褐色プラントホッパー、イネ褐色プラントホッパー、サトウキビプラントホッパー、背面白色プラントホッパー、緑イネヨコバイ、ビートヨコバイ、ワタヨコバイ、ジグザグ翼イネヨコバイ、リンゴ吸い虫、ナシ吸い虫、ワタリンゴアブラムシ、レタス根ワタアブラムン、ブドウネアブラムシ、オナガコナ力イガラムシ、パイナップルコナカイガラムシ、シマコナカイガラムシ、ピンクサトウキビコナカイガラムシ、ワタフキ力イガラムン、オリーブカイガラムシ、イガイカイガラムシ、サンホゼカイガラムン、カリフォルニアレッドカイガラムシ、フロリダレッド力イガラムシ及びココナツカイガラムシを含めた多くの種類は農業及び園芸作物と観賞植物にとり重大なベスト（害虫）である。

これらの昆虫による栄養摂取の結果としての作物被害はいくつかの方式で起きる。樹液の抽出は植物から栄養素及び水を奪い、活力の喪失を招いて立枯れさせる。一部の種類の唾液中に存在する植物毒性物質と栄養摂取による篩部の機械的遮断は〔゛ホッパーバーン゛（ｈｏｐｐｅｒｂｕｒｎ）の場合として〕葉群のゆがみ及び壊死と穀物においてブラインド化（ｂ　ｌ　１ｎｄｎｅｓｓ）又は核の縮みを起こすことがある。口器の挿入により生じた傷は損傷を残して、そこから植物病原体が侵入する。豊富な゛糖液′の産生はすす病を発生させるか又はその粘着性は穀類及びワタの収穫を妨げるかもしれない。これらのベストにより生しる最も重大なダメージのうちいくっがは植物ウィルスのベクターとしてのそれらの役割のために間接的である。

膜翅類により拡散される重大なウィルス病の例としてはトウモロコシストリーク（ｍａｉｚｅ　５ｔｒｅａｋ）病、ビートカーリ−トップ（ｃｕｒｌｙ−ｔｏｐ＞病、北穀類モザイク病、エンバクロゼット病、ナシデクライン（ｄｅｃｌｉｎｅ）病、タバコモザイク病、カリフラワーモザイク病、ターニップ（ｔｕｒｎｌｌ））モザイク病、イネオレンジ葉病、イネ萎病、イネ黄萎病、イネー過性黄化病、イネ草発育阻害（ｇｒａｓｓｙｓｔｕｎｔ）病、サトウキビフィシ−病、カッサバモザイク病、ワタ葉縮病、タバコ葉縮病、サツマイモウィルスＢ病、グラウンドナツツロゼツト病、バナナふさ状トップ病、ントラストリステザ（ｔｒｌｓｔｅｚａ）病、パイナップルコナヵイガラムシ立枯病及びカカオスオルンシュート（ｓｗｏｌｌｅｎｓｈｏｏｔ）病がある。膜翅類昆虫群の減少は作物においてこれらと他のウィルス病の拡散を制限する上で有用である。本発明はこれらの吸引昆虫ベストのコントロールの問題について取扱う。

１９４０年代後半以来、これらのベストをコントロールする方法は合成Ｈ環化合物の外部適用に集中していた。

それらの給餌習慣のせいで、有効な殺虫剤は接触で作用するか又は植物内で全体的でなければならない。塩素化炭化水素、置換フェノール、有機ホスフェート、カルバメート及びピレトリン種の殺虫剤か用いられてきたが、但しこの植物保護方法は当業者に知られる問題の増加と８会う。殺虫剤に対するベスト昆虫耐性の獲得の問題は膜翅類の中でも特に急性であり、その場合に典型的に短い世代時間は耐性バイオタイプを非常に急激に出現させる。例えば、イネの褐色プラントホッパーは見たところわずか約１８月間で新しいバイオタイプを生しることができる。

ベスト昆虫の生物学的コントロールは代替戦略として好まれてきた。このようなアプローチではその群を制限するために標的ベストの天然ウィルス、細菌又は真菌病原体あるいは天然魚を推又はを椎捕食動物を活用する。

例としては特定のイモムシ及びハバチ幼虫〔例えば、へりオディス（Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ）　Ｐ　ＨＶ　）に対して有効な顆粒症及び多角体病ウィルスとあるイモムシに対して有効なバチルス・ツリンギエンシス・カースタキ（Ｂａｃｆｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｋｕｒｓｔａｋｉ）かある。病原性／寄生真菌は膜翅類を含めて様々な昆虫種で確認された；パーティシリウム・レカニイ（ＶｅｒｔｉｃＮｉｕＩＩＩｅｃａｎｉｉ）は野外ではなく温室においてアブラムシ及びコナジラミのコントロールに有用であることがわかった。ベストの独立生活及び寄生捕食動物は特に温室及び果樹園のような安定な生態系である程度うまく用いられ、例えば様々な膜翅類、鞘翅類及びコナダニ昆虫は温室においてアブラムシ及びコナジラミのコントロールに用いられてきた。しかしながら、生物学的コントロール尺度の広範な導入は野外における大規模生産、広範な適用及びコントロール剤の持続性の欠如という問題により制限されてきた。

好ましい解決法は一体的なベスト管理プログラムの一部として生来的に昆虫耐性の品種、変種又は系統を用いることである。ベスト忌避、非優先性、抗生作用又はベスト耐性を示すこのような耐性系統の生産が作物改良に関する多くの従来の植物育成プログラムの主要ゴールである。膜翅類に対する耐性の生化学メカニズムが決定されたケースにおいて、それは特定の非タンパク質二次植物代謝産物のレベルを変えることである。このアプローチは交雑生殖質内で利用しうる耐性に関する遺伝的変異性の程度により制限される。特定のベストに対する耐性源は利用できないことが多い。それは農業経済学上許容される遺伝的背景の中に特徴を遺伝子移入する上で必要な多数の戻し交配により得られる耐性品種を生産するために要求される長い時間的スケールによって更に制限される。植物の新たな昆虫耐性系統の導入に応答して、植物が耐性でない新たな昆虫バイオタイプが現れる。合成殺虫剤に関しては、耐性破壊バイオタイプの出現が膜翅類について具体的な問題である。例えば、しばらく野外でこの虫の優れたコントロールを示した褐色プラントホッパー（ＢＰＨ）に耐性の多くのイネ変種がフィリピン、マニラのインターナショナル・ライス・リサーチ・インステイチュート（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｌｃｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）　（Ｉ　ＲＲＩ　）で開発された。しかしながら、耐性破壊バイオタイプは一部の地域において地域的イネ生産があやうくなるまで出現した。新たなりＰＨ耐性変種がＩＲＲＩプログラムから現れても、すぐに新たな耐性破壊バイオタイプの昆虫が出てくる。このため、新規のＢＰＨ耐性耐性遺伝子育成プログラムに組込む必要性が継続している。

遺伝子工学は、それがタンパク質の天然源又は宿主と雑種形成しうるその能力に関係なく単一ステ・ノブで殺虫タンパク質についてコードする遺伝子を作物植物のエリート系統中に挿入させつることから、ここでかなり役立つ。外来遺伝子が、葉、根、茎又は果実を噛むことで植物から栄養摂取する昆虫にとり毒性又は代謝拮抗性であるタンパク質の産生レベルを特定するトランスジェニック植物中に導入されたいくつかのケースが当業界で知られている。

欧州特許出願第０１４２９２４号〔アグリゲネテイクスφリサーチ・アソシエーツ社（ＡｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ　Ｌｔｄ、）　）明細書ではある鱗翅類にとり幼虫殺性であるＢ、ツリンギエンシス・デルタ内毒素のトランスジェニック植物内産生について記載している。同様に、ＥＰＡ第０１９３２５９号〔プラント・ジエネティック・システムズＮ　Ｖ　（Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＳｙｓｔｅｍｓＮＶ））明細書では端部切取りＢｔ毒素遺伝子を発現するトランスジェニック植物における鱗翅類毒性タンパク質の産生について記載している。トランスジェニック植物中への導入により鞘翅類昆虫をコントロールする上で有用なりｔ毒素遺伝子はＥＰＡ第０２８９４７９号〔モンサント社（Ｍｏｎｓａｎｔｏ　Ｃｏ、））及びＥＰＡ第０３０５２７５号（プラント・ジエネティック・システムズＮＶ）明細書で記載されている。ＥＰＡ第０３３９００９号（モンサンド社）明細書ではトランスジェニック植物でトリプシンインヒビターを同時発現させることによる鞘翅類特異性Ｂｔ毒素の有効性の増強について記載している。

ＥＰＡ第０２７２１４４号〔アグリ力ルチャラル・ジェネティックス社（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏ、））明細書ではトランスジェニック植物でカラビーからのトリプシンインヒビターについてコードする遺伝子の発現が鱗翅類及び鞘翅類双方のペストに対する耐性を高めることを示している。

ＥＰＡ第０３３７７５０号〔プラント・セル・リサーチ・インスティチュート社（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ、）　）明細書ではトランスジエニ・ツク植物における野生フ７セオラス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）豆種子の貯蔵タンパク質アルセリンについてコードする遺伝子の導入及び発現について記載し、それが鞘翅類ペストからの保護上有用であろうと示唆している。

ＥＰＡ第０３５１９２４号〔シェル・インターナショナル・リサーチ・マーチャビーＢＶ（Ｓｈｅｌｌ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｍａａｔｓｃｈａｐｐｉｊ　ＢＶ）］明細書では鱗翅類幼虫に対する耐性を高めるトランスジェニック植物における庭エントウからのレクチンにつ（１てコードする遺伝子の導入及び発現について記載してｔする。

ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１２９０　（アグリ力ルチャラル・ジエネテイックス社）明細書は、関連する哺乳動物の毒性なしに、鱗翅類及び鞘翅類のコントロール用に単子葉植物ヒガンバナ及びアリウム科からのレクチン（こつ（１てコードする遺伝子の使用に関する。ＥＰＡ第０４２７５２９号〔パイオニア・１１イブリ・ソド・インターナショナル社（Ｐｉｏｎｅｅｒ　ＨｉＢｒｅｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｃ、））明細書では鱗翅類及び鞘翅類ペストをコントロールするため番二様々なレクチンの使用について記載している。

これら各々のタンパク質はそれらの殺虫効果を発揮するために摂取されねばならず、それらの−次作用部位ｉｔ中中編あるらしい（Ｈｏｆｆｓａｎｎ、Ｃ，ら（１９８８）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５．７８４４−　；　Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ　Ａ、Ｍ、Ｒ，及びＢｏｕｌｔｅｒ、Ｄ、（１９８３）、Ｊ、Ｓｃｉ、Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、３４．３４５−３５０；Ｇａｔｅｈｏｕｓｅら（１９８４）、Ｊ、Ｓｃｉ、Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、３５，３７３−３８０）。

しかしながら、樹液吸引昆虫間における消化系はいくつかの重要な点で昆虫の中では珍しく、例えばそれらは作物を欠き、中編は周囲栄養（ｐｅｒｌｔｒｏｐｈｉｃ）膜で覆われておらず、加水分解消化酵素がない〔例えば、Ｔｅｒｒａ４．Ｒ。

（１９９０）　、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｅｎｔｏｉｏｌ、３５．１８１−２００参照〕。植物組織噛昆虫及び樹液吸引昆虫間において根本的に異なる栄養摂取様式、食物の性質及び腸の必要組織からみて、１種の昆虫に対して殺虫活性を有するタンパク質が他に対しても有効であるならば非常に驚くべきことであろう。

図面の簡単な説明図１は膜翅類昆虫ペストをコントロールする上で有効（例えば、小麦麦芽アグルチニン）及び無効（例えば、カラピートリブシンインヒビター）を慮別するために褐色プラントホッパーでの人工餌バイオアッセイデータについて表す。

図２はモモポテトアブラムシのミズス・パーシカ（Ｍｙｚｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａｅ）での人工餌バイオアッセイデータにつける昆虫生存数の減少について示す。

図３はトランスジェニック植物における外来遺伝子の篩部特異性発現にとり有用なプロモーターを含むプラスミドｐＳＣとその産生に用いられる中間プラスミドｐＤＢ２及びｐＤＡの遺伝子地図について表す。

図４はＲ３５ｌ遺伝子プロモ一ター／イントロン１配列を含む有用な中間プラスミドであるプラスミドｐＳＳ２４ＮＮ３０Ｂの遺伝子地図について表す。

図５はプラスミドｐｓｓ２４ＮＮ３０ＢにおけるインサートのＲ３５ｌプロモーター＋イントロン１領域の＋鎖のヌクレオチド配列：単子葉植物プロモーターからの植物における遺伝子の篩部特異性発現にとり有用な配列について表す。

図６は篩部特異性発現カセットとして有用であるプラスミドｐＳＣＢ及びスノードロップレクチン構造遺伝子用の特異性発現ベクターであるプラスミドｐＳＣＩＧＮＡの遺伝子地図について表す。

図７はトランスジェニック植物の篩部におけるＲ３５１遺伝子プロモーターからのＧＮＡの発現のための二元ベクターとして有用であるプラスミドｐＢＲ３ＳＬＴ２の遺伝子地図について表す。

図８は直接ＤＮＡ取込みによる植物内導入のためのスノードロップレクチン遺伝子の篩部特異性発現組立体であるプラスミドＩ）ＳＣＧＮＡＲＩの遺伝子地図について表す。同様のプラスミドだがヒグロマイシン耐性に関する選択を可能にしたｐＳＣＧＮＡＲ２及びｐＳＣＧＮＡＲ２の組立てにおける中間体ｐＪＩＴＡｐｈの遺伝子地図も表されている。

図９はトランスジェニックイネ植物の篩部におけるＲ５５ｌプロモーターからのＧＮＡの発現にとり有用であるプラスミドｐＲ３ＳＬＴＲの遺伝子地図について表す。

図１０はモモポテトアブラムシのミズス・バーシカに対するＧＮＡ発現トランスジェニック及びコントロールタバコ植物の全植物バイオアッセイからのデータについて表す。

図１１はＭ、バーシカに対するＧＮＡ発現トランスジェニック及びコントロールタバコ植物の葉片バイオアッセイからのデータについて表す。

発明の説明あるタンパク質はイネ褐色プラントホッパー（ＢＰＨ）に腸内投与された場合に強い殺虫活性を有することがここで実証された。このため、本発明はガランタス・ニバリス（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ　ｎ１ｖａｌｉｓ）レクチン（スノードロップレクチン；ＧＮＡ）及びトリチカム・プルガレ（Ｔｒｉｔｉｃｕｓｖｕｌｇａｒｅ）レクチン（小麦麦芽アグルチニン、ＷＧＡ）のようなタンパク質の殺虫量を昆虫に腸内投与することによりＢＰＨを含めた同月類昆虫を殺す方法を提供する。

標的昆虫は篩部樹液からもっばら栄養摂取するため、そのタンパク質は樹液でそれらに与えられねばならない。

外部適用されたタンパク質は処理された植物の篩部樹液中に移動しない。しかしながら、これらのタンパク質についてコードする遺伝子は単離、クローニングされて、適切な発現カセット中に挿入声れ、篩部での発現が起きるように感受性植物のゲノム中に導入される。このためその方法の好ましい態様では植物で活性な篩部特異性プロモーター配列に対して正しい向きでスノードロップレクチン又は小麦麦芽アグルチニンのような膜翅類殺性タンパク質についてコードするＤＮＡ配列を宿主植物のゲノム中に導入する。

植物で遺伝子発現用として最も普通に用いられるプロモーター配列が本発明の目的に特に適するわけてはない。

カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子Ｃ０ｄｅ１１，１．Ｔ、ら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１３，８１０−８１２１　、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｆｆｉ）ツバリンシンターゼ（ｎｏｓ）及びオクトビンシンターゼ（ＯＣ５）％大豆からの小サブユニットリブロース−１，５〜ビスホスフエートカルボキシラーゼ遺伝子ＣＢｅｒｒｙ−Ｌｏｖｅら（１，９８２）Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、１，４８３−４９８）　、りｏａミツイルミｂ結合タンパク質遺伝子ＣＳｉｍｐｓｏｎら（１９８Ｂ）Ｎａｔｕｒｅ、３２３゜５５１−５５４　〕に由来するようなプロモーター配列は鱗翅類及び鞘廷類目の噛昆虫に対して殺虫活性を有するタンパク質の発現にとり好ましいものであった。しかしながら、これらは本発明の好ましい態様において要求される特異性を有していない。４ＸＢ２＋Ａプロモ一ター組立体ＣＢｅｎｆｅｙら（１９９０）ＥＭＢＯＪ、９．１８７７−１８８４）　、脂肪種子ナタネエクステンシン遺伝子プロモーター［：５ｈｉｒｓａｔ　Ａ、ら（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ、Ｂｉｏｌ、１７．７０１−７０９］及びイネスクロースシンテターゼ遺伝子プロモーターＣＹａｎｇ　、　Ｎ−３、及びＲｕ５ｓｅ１１．Ｄ、（１９９０）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ＾、１１７．４１４４−４１４８）はトランスジェニック植物の篩部組織で高レベルの発現を指示することがここで実証された。このため、本発明の好ましい態様では膜翅類殺性タンパク質についてコードする配列が４ＸＢ２＋Ａプロモーター、エクステンシン遺伝子プロモーター又はイネスクロースシンテターゼ遺伝子プロモーターから選択される配列のコントロール下におかれたキメラＤＮＡ組立体を要する。

これらの組立体は正しい向きでポリアデニル化シグナル及び転写終結シグナルも含む。これらの配列はツバリンシンターゼ遺伝子（ＮＯ３）ターミネータ−領域により得られる。

これらの遺伝子発現組立体は形質転換植物細胞の選択を容易にするために選択マーカー遺伝子の発現を指示する付加構造遺伝子に連結される。好ましい選択剤は抗生物質カナマイシン及びヒグロマイシンであるが、多くの代替剤が当業者に知られている。

これらの発現組立体は当業界に公知の多くのプラスミドベクター／細菌宿主で維持及び増殖させることができる。

植物は好ましくは同月類昆虫による侵襲及び障害をうけやすい作物植物である。

本発明の方法に従い形質転換される好ましい植物としてはイネ、トウモロコン、小麦、大麦、モロコシ、オート麦、キビ、リンゴ、ナシ、シトラス、テンサイ、ポテト、トマト、タバコ、ワタ等がある。

以下の記載では本発明の組成物とそれらの製造及び使用方法について更に例示している。しかしながら、当業者に知られる代替法も使用できることが理解される。分子生物学の多くの標準法は当業界で周知であり、ここでは詳細に説明されないが、例えば５ａｓｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら（１９１１９：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）でよく詳述され同動類殺性タンパク質の同定あらゆるタンパク質において同列類に対する殺虫活性を予想する先験的基礎はないが、但し人工餌で投与された様々なタンパク質に対する同列類の感受性が評価されたときにＧＮＡがこのような活性を示すという意外な観察をした。イネ褐色プラントホッパー（ＢＰＨ）ニラバルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ　ｌｕｇｅｎｓ）を殺虫活性に関していくつかのタンパク質をスクリーニングするために最初に用いた。

１．１．昆虫の維持昆虫は日照１６時間、温度２５±２℃及び相対湿度７５〜８５％の生育室条件下で飼育した。昆虫を感受性変種″台中ネイティブ１−（ＴＮＩ）の４０〜６０日齢オリザ・サチバ（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ）植物で維持し、新しい植物をストック培養物を維持するために飼育カゴ中に毎週ＭＭＤ　１と称される用いられた人工餌はアブラムシ用のＭｉｔｔｌｅｒ及びＤａｄｄ（１９６２：Ｎａｔｕｒｅ、Ｉ９５，４（１４）餌の修正である旧ｔｓｕｈａｓｈｆ（１９７４：Ｒｅｖ、ＰＩａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃ、Ｒｅｓ、７．５７−６７）の場合に基づいていた。成分は表１でリスト化されている。餌は栄養素に富み、微生物汚染を避けるために０．２μｍ孔サイズのミリポア（旧１１１ｐｏｒｅ（ＴＭ））フィルターで１０ｍＩずつに分けた。餌は不安定成分アスコルビン酸ナトリウムの劣化を避けるために一２０℃で貯蔵し、プラスチック容器で保った。餌は最長４週間にわたり一２０℃で貯蔵した。

表１．ＭＭＤＩ餌の組成成　分　、　ｓｇ／ｌｕｓｔＭｇＳ０　・７Ｈ２０に２ＨＰＯ４７５０スクロース　５０００Ｌ−アラニン　１００Ｌ−フルギニンＨＣＩ　２７０Ｌ−アスパラギン　５５０Ｌ−アスパラギン酸　１４０Ｌ−システィン　４゜Ｌ−グルタミン酸　１４０Ｌ−グルタミン　１５０グリシン　８゜Ｌ−ヒスチジン　８゜Ｌ−イソロイシン　８゜Ｌ−ロイシン　８゜Ｌ−！Ｊジ：ｚＨｃｌ　１２ＯＬ−メチオニン　８゜Ｌ−フェニルアラニン　４゜Ｌ−プロリン　８゜ＤＬ−セリン　８゜Ｌ−トレオニン　１４０Ｌ−）−リブトファン　８゜Ｌ−チロシン　４゜Ｌ−バリン　８゜チアミンＭＣＩ　２．５リボフラビン　□、５ニコチン酸　１゜ピリドキシンＨＣ１２，５葉酸　０．５パントテン酸カルシウム　５イノシトール　５゜塩化コリン　５゜ビオチン　０．１アスコルビン酸ナトリウム　ｌｏ。

Ｆ　ｅ　Ｃｌ　・６　Ｈ２０３２，２３Ｃｕ　Ｃ１・２　Ｈ２０２０，２７Ｍ　ｎ　Ｃ１０４Ｈ２０２０，７９チロシンはそれが蒸留水に易溶性でないため最初にＩＮ　ＨＣｌに溶解させた。

リボフラビンを少量の水の中で加熱してその溶解を助ける。必要なところで餌をＫＯＨ及１．ＦＨＣｌでｐＨ６，５ｉ：ｍ整ＬＩ：。

固溶液をプラントホッパー及びヨコバイの飼育用にＭＩｔｓｕｈａｓｈｉ（１９７４）により記載された修正法に基づく給餌容器にいれた。これは直径３５＋ｇｍ、深さ１０■で一端が開いた円形プラスチック容器からなっていた。その容器の底部は既に蒸留水に浸漬されたワットマン（Ｗｈａｌａｎ（ＴＭ））Ｎｏ、　１フイルターベーパーの３５ｍ５径片で裏打ちした。容器の開口端はその原面積の４倍に伸ばされた１枚のバラフィルム（Ｐａｒａｆ’ｉ１ｍ”））膜で覆った。

２００μｇ液層の餌溶液をこの基礎膜上におき、もう１層の伸ばしたバラフィルム膜で覆って、給餌袋を設けた。

１．３．給餌試験Ｎ、ルゲンスの若虫を茎を軽くたたくことにより宿主植物から取出し、若虫５匹を細いハケを用いて各パイアッセイ容器に移した。新たに出現した第−齢又は第三齢双方の幼虫を用いた；生存率は後者の丈夫な方の幼虫のコントロール餌の方が良い。試験タンパク質は０．１％（Ｖ／Ｖ）で人工餌中に配合した。タンパク質無添加餌のコントロール及び完全無餌のコントロールも各一連の試験に含めた。各処理で１０回の反復を実施した。容器は冷却インキュベーター中において日照１６時間、２５±２℃で維持した。餌は新鮮な栄養素供給を保証するために毎日変えた。生存若虫の数を毎日記録した。

結果この餌は若虫の成長を成虫期まで支えないが、但し１８日以内の生存がＭ〜ＩＤＩてみられ、そのときまでに苦虫は第四齢に達していた。成虫期までの生存は（袋に水の約５ｃｒＡヘツドを設けて給餌室を修正することで）給餌袋を圧力下におくことにより達成できるが、但しタンパク質の殺虫効果を実証する上で不要である。一部の昆虫は餌の不在下で２日間生存する（図１）。すべての′無餌゛昆虫が死んだ日においてＡｂｂｏｔｔ（１９２５：Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＥｃｏｎｏｍｉｃ　Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ、１８，２６５−２６７）に従い補正された死亡増加率を試験タンパク質の有効性の尺度として用いた。

昆虫生存率がコントロールと比較して試験タンパク質の存在下で高められるならば、この処方は補正死亡率に関して否定的価値を生じることが注記される。このような有益な（昆虫に対するン効果を示すいくつかのタンパク質が発見された。

生存頻度を独立のＧ検定による統計分析に付した〔例えば、５ｏｋａ１．Ｒ，Ｒ，＆　Ｒｏｈｌｆ、Ｆ、Ｊ、。

Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　ｂｆｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｏ、。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｊｓｃｏ（１９７３）ｐｐ、２８Ｂ−３０３）　、イエイテス（Ｙａｔｅｓ“）補正を適宜（即ち、ｎ＜２００）にそのデータに適用した。

図１から判断されるように、この時点で〉５０％の死亡率増加は実質的な毒性又は代謝拮抗効果を示す。第−齢若虫に関する結果は表２で、第三齢に関しては表３で示される。

表２．第−齢Ｎ、ルゲンスに対する抗昆虫活性について様々なタンパク質のバイオアッセイＢ　Ｓ　Ａ　−ｔｏ　１２．５５４　（０，００１＊＊＊○ＶＡ　４　０　＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

レクチンＧＮＡ　Ｔ６　４２．２２４　（０，００１＊木本ＰＨＡ　２７　４．５２８　（０，０５本ＰＬＡ　−２０＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

ＷＧＡ、　７５　４．２．８４０　＜０．００１　＊＊＊ＬＣＡ　〜、Ｄ。

ＨＧＡ　Ｎ、Ｄ。

ＪＣＡ　Ｎ、Ｄ。

Ｃｏ　ｎ　Ａ　Ｎ、Ｄ、Ｃｐ　Ｔ　Ｉ　−１３０，１６０＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

ＷＡＸ　Ｎ、Ｄ酵素Ｃｈａｓｅ　Ｎ、Ｄ。

ＬＰＯＮ、Ｄ。

ＰＰＯ〜、Ｄ。

０ＶＡ−オボアルブミン、ＢＳＡ−牛血清アルブミン。

Ｇ　Ｎ　Ａ−スノードロップレクチン、ＰＨＡ−フィトヘマグルチニン、ＰＬＡ −エントウレクチンＡ、ＷＧＡ−小麦麦芽アグルチニン、ＬＣＡ−ヒラマメレクチン：ＨＧＡ−ホースグラム（ｈｏｒｓｅ　ｇｒａｍ）レクチン、ＪＣＡ−ジャカリン（ｊａｃａｌｌｎ）レクチン；ＣｏｎＡ−コンカナバリンＡ　；　ＰＰＬ −ポテトレクチン；ＣｐＴＩ−カラビートリブシンインヒビター、ＷＡＸ−小麦昆虫特異性α−アミラーゼインヒビター；Ｃｈａｓｅ−マメエンドキチナーゼ、ＬＰＯ−大豆リポキシダーゼ、ｐｐｏ−ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ポリフェノールオキシダーゼ；Ｎ、Ｄ、−決定せず表３．第三齢Ｎ、ルゲンスに対する抗昆虫活性について様々なタンパク質のバイオアッセイＢＳＡ　Ｎ、Ｄ。

ＯＶＡ　Ｎ、Ｄ。

レクチンＧ　Ｎ　Ａ　７９　１０４．８４２　＜ｏ、ｏｏｉ　＊ｉＥ＊ＰＨＡ　−１４５９，７５２（０，００５＊本ＰＬＡ　Ｎ、Ｄ。

ＷＧ　Ａ　７８　６１．７２４　（０，００１＊本＊ＬＣＡ　２２　４．３３８　（０，０５＊ＨＧＡ　２８　２．７２８　）０．０５　Ｎ、Ｓ。

ＪＣＡ　−３０）０．０５　Ｎ、Ｓ。

Ｃｏ　ｎ　Ａ　３０　Ｌ、９８０　＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

Ｐ　Ｐ　Ｌ　−１００，１８４＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

酵素インヒビターＣｐＴＩ　Ｎ、Ｄ。

ＷＡＸ　−４０＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

酵素Ｃｈ　ａ　ｓ　ｅ　−５５９，７６２（０，００５＊＊Ｌ　Ｐ　０　８５　８３．７２４　（０，００１＊＊＊Ｐ　Ｐ　０　１２　Ｇ、３３０　＞０．０５　Ｎ、Ｓ。

略号は表２と同じスノードロップ（ガランタス・ニバリス、ＧＮＡ）及び小麦麦芽（トリチカム・プルガレ、ＷＧＡ）からのレクチンは褐色プラントホッパーに対して実質的な殺虫活性を有し、同月類昆虫に対して植物を保護する上で有用である。酵素リポキシダーゼ（リポキシゲナーゼ；リノール酸：酸素オキシドレダクターゼ；　ＥＣ１，１３，１１，１２）も実質的な殺虫活性を有する。

１．４．緑ヨコバイに対する給餌試験褐色プラントホッパーに対する人工餌バイオアッセイにおいて有効な殺虫性であるあるタンパク質は同月類目内で全く異なる分類セミ科（−ヨコパイ科）に属する樹液吸引昆虫に対しても有効であることがここでわかった。

緑ヨコバイのネフォテチックス・ニグロビクタス（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ　ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）はイネの時折深刻なペストであって、イネ黄萎病及び一時的貧化を含めたいくつかの病気を発生するウィルスのベクターである。緑ヨコバイを前記（１，１〜１．３）のように維持してバイオアッセイに付した。表４で示された結果はスノードロップレクチンがヨコバイ及び褐色プラントホッパーに対して有効な殺虫性であることを示す。

表４．第三齢ネフオテチックス・ニグロビクタス（緑ヨコバイ）に対する抗昆虫活性について様々なタンパク質のバイオアッセイＧＮＡ　８７　１１．１１０　く０．００１　＊＊＊ＷＧＡ　１５　０．６７４　＞０．０５　Ｎ、！３゜懸Ｌ　Ｐ　Ｏ５０，０５２）０．０５　Ｎ、Ｓ。

略号は表２と同じ１．５．モモポテトアブラムシに対する給餌試験スノードロップレクチンは褐色プラントホッパー及び緑ヨコバイに対してだけではなく同月類目内でもう１つの全く異なる分類アブラムシ科に属する樹液吸引昆虫に対しても人工餌バイオアッセイにおいて有効な殺虫性であることが更にわかった。アブラムシ科は植物虫の中で最も重要なグループであり、熱帯地方よりも温帯地方で生活によく順応している。モモポテト又は緑モモアブラムシのミズス・バーシカは世界中にひろがる重大な雑食性ペストであり、１００種を超える異なる発病性ウィルスのベクターとして作用する。多くのバイオタイプが従来の化学農薬にマルチ耐性を示す。

アブラムシを研究所においてタバコ植物〔ニコチアナφタバカム変種サムサンＮ　Ｎ　（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｖａｒ。

Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ））で維持した。ＧＮＡによる人工餌ノくイオアッセイは旧ｔｔｌｅｒ及びＤａｄｄ（１９Ｂ２：Ｎａｔｕｒｅ、１９５．４０４）により記載された餌の未修正版で新生宵月若虫に対し１．３で記載された静水圧アッセイ系を用いて前記のように実施した。結果（図２）はＧＮＡが人工餌で緑モモアブラムシの生存率を実質上減少させることを実証している。

セクション１．３で記載された操作に従う補正死亡率は試験された他の同月類の場合よりも少ないが（２５±４％）、そのタンパク質は昆虫生存に関して明らかに有意の有害効果を有する。それは生存昆虫の発育にとり有害効果も有する一生育昆虫のサイズは給餌４日後にイメージ分析により測定した：結果（表５）はＧＮＡ含有餌で若虫の平均サイズに関して有意の減少を示す。若虫のサイズに関するこのような減少は昆虫の発育時間及び繁殖能にかなりの効果を有し、このためアブラムシ群の成長速度を有意に減少させると予想される。

表５．コントロール及びＧＮＡ含有人工餌から回収されたアブラムシのサイズこうして、広範囲の同店類昆虫タイプに対して有効である限定されないがＧＮＡを含めたあるタンパク質が同定される。

例２組織特異性プロモーターの産生２．１．４ｘＢ２＋ＡＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ遺伝子プロモーターはトランスジェニック植物のほとんどの器官で活性である強い構成プロモーターとして当業者に知られている。その全体活性はいくつかの別個のドメイン及びサブドメインの相互作用により支配されるが、その様々な組合せが研究されて、トランスジェニック植物で異なるパターンの発現をすることが示された［　Ｐａｎｇら（１９８９）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．１．１４１−１５０　；Ｂｅｎｆｅｙら（１９８９）ＥＭＢＯＪ、８．２１９５−２２０２　；　Ｂｅｎｆｅｙら（１９９０ａ）ＥＭＢＯＪ、９．１６７７−１６８４ＨＢｅｎｒｅｙら（１９９０ｂ）ＥＭＢＯＪ、９．１［１８５−１８９８）。４ＸＢ２＋Ａと称される組合せは篩部を含めた導管組織で強い発現をすることが示された（　Ｂｅｎｒｅｙら。

１９９０ａ　）。この組合せは本発明の目的にとり特に有用である３５Ｓ遺伝子（１３ｅｎｆ’ｅｙら、　１９９０ｂ）の−９０〜＋８領域に融合された３５Ｓ遺伝子の領域−１５５〜−１０２の４重タンデム反復を含む。

プラスミドｐ　Ｅ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　１２　ｘの５ａｉｌ及びＸｈｏ１部位間に挿入された４×８２断片を含むｐＤＢ２と表示されるプラスミドＤＮＡ　（ｐＥ〜ＩＢＬ１２ＸはＢａｍＨ１部位の５゛側にＸｈｏＩが導入されたｐＥＭＢＬ１２の誘導体である：ファージミドのｐ　ＥＭＢＬ群はＤｅｎｔｅら（１９８３）　Ｎｕｃｌ、＾Ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ＬＬ、１６４５−１６５５で記載されている〕とｐＥＭＢＬ１８のＸｈｏＩ及び５ａｉｌ部位間に挿入されたＡ断片を含むｐＤＡと表示されるＤＮＡはＰ。

Ｎ、Ｂｅｎｆ’ｅｙｌｉ±にューヨーク、ロックフェラー大学の植物分子生物学研究所）から入手したプラスミドＤＮＡは大腸菌ＤＨ５α〔ノーサンプリア・バイオロジカルズ社（ＮｏｒｔｈｕＩＩｂｒｉａ　Ｂｉｏｌｏｇｌｃａｌｓ　Ｌｔｄ）。

クラムリントン、ＵＫＩのコンピテント細胞をアンピシリン耐性に形質転換するために用いた。この及び後の例におけるプラスミドＤＮＡは標準−ミニブレツブ法により作製した。ｐＤＢ２からのＤＮＡを制限酵素５ａｌＩ及びＸｈｏｌで切断し、制限断片をアガロースゲルで電気泳動により分離した。１９４ｂｐ４ｘＢ２断片をゲルから単離し、精製した。この断片をＸｈｏ　Ｉ切断で直鎖化されたｐＤＡからのＤＮＡと結合させた。これを用いてコンピテント大腸菌ＤＨ５αをアンビンリン耐性に形質転換し、有用な４ＸＢ２＋Ａプロモ一ター組立体を含むｐＳＣと表示されるプラスミドを含有したクローンを得た（図３）。

２．２．イネスクロースシンターゼ相同性プロモーターからトランスジェニック植物で同月類殺性タンパク質を発現させることは特に有用であると考えられる。したがって、この例では最も好ましい植物のうち１つ、単子葉植物オリザ・サチバ−イネで有効な発現を行うだけでなく、異種系での発現にとり有用な篩部特異性プロモーターでもある相同性プロモーターを提供する。

ＵＤＰ−グルコース、Ｄ−フルクトース　２−α−Ｄ−グルコシルトランスフエラーゼ（ＥＣ２，４，１，，１３）についてコードするトウモロコシスクロースシンターゼ１遺伝子（Ｓ　ｈ　−１）はプロモーター配列がクローニングされたいくつかの単子葉植物遺伝子のうちの１っである（Ｂｕｒｒ、Ｂ、及びＢｕｒｒ、Ｆ、　（１９８２）ｅｅｌ　ｌ　、　２９．９７７−９８６　；　Ｇｅｊｓｅｒら（１９８２）ＥＭＢＯＪ、１．１４５５−１４６０１　。Ｓ　ｈ　−１−次転写物の５′−非翻訳領域に翻訳開始部位及び第一イントロンを含む５ｈ−１プロモーターはトランスジェニック植物の篩部細胞で外来遺伝子の非常に高度な特異的発現を指示することが実証された（　Ｙａｎｇ　、　Ｎ−３、及びＲｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ。

（１９９０）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、８７．４１４４−４１４８）　、トウモロコシ５ｈ−１遺伝子配列は下記のようなイネスクロースシンターゼプロモーター配列を得るために用いた。

合成オリゴヌクレオチドを標準技術により作製した。

これらの配列は以下である：５“−ＴＴＣＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＡＧＡ５°−ＣＴＧＣＡＣＧＡＡＴＧＣＧＣＣＣＴＴこれは公表された５ｈ−１遺伝子配列のコード鎖のヌクレオチド＋４２６４〜＋４２８２及びアンチコード鎖の＋４５６４〜＋４５８１に相当する［ｅｒｒ、Ｗ、　ら（１９８５）ＥＭＢＯＪ、４．１３７３−１３８０３　、　ソレラハ標準ポリメラーゼ鎖反応（Ｐ　ＣＲ）法〔例えば、１ｎｎｉｓ、Ｍ、＾、らｅｄｓ、　（１９９０）ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＰＣＲプロトコール：方法及び適用のガイド）。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｌｅｇｏｌを用いてトウモロコシ種苗ゲノムＤＮＡからの５ｈ−１遺伝予断片＋４２６４〜＋４５８１の増幅でプライマーとして用いた。増幅させた生成物を標準技術に従いｐＵｃ１８のＳｍａ　Ｉ部位に組み込んでクローニングした。このプラスミドはｐＵＥＸと表示した。

プラスミドｐＵＥＸはイネゲノムＤＮＡライブラリーでイネスクロースシンターゼ遺伝子クローンを同定するためにプローブとして有用である。このようなライブラリーは当業者に公知の様々な方法により作製して又は得てよい。この例において、バクテリオファージＥＭＢ　Ｌ　−３における市販イネゲノムＤＮＡライブラリーはクロンチック・ラボラトリーズ社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　（バロアルト、ＵＳＡ）から購入した。ｐＵＥＸからの３２Ｐ標識インサートで常法による６、８Ｘ１０５プラークのスクリーニングでは１０の陽性クローンを得た。クローンλＲ５５２，４は完全鎖長イネスクロースシンターゼ１遺伝子を含むとして特徴付けられた。このクローンは常法により制限地図作製、すブクローニング及び配列決定で詳細に研究したＣＷａｎｇ、Ｍ。

ら（１９９２）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１９，８８１−８８５）。

λＲ５５２，４内におけるイネスクロースシンターゼプロモーター／イントロン１配列は５ｈ−１配列との比較により同定した：それは約３．１ｋｂＮｈｅｌ制限酵素切断断片に存在する。この断片を標準技術により単離してプラスミドｐＵｃ１９のＸｂａＩ部位に組込みクローニングし、Ｒ５５ｌプロモ一ター／イントロン１配列を含む有用な中間プラスミド−プラスミドｐＳＳ２４ＮＮ３０Ｂを得た（図４）。本発明の目的にとり有用であるこの３．１ｋｂ断片の配列の一部は図５で示されている：本発明の目的にとり不要であって、当業界で周知である制限酵素切断、エキソヌクレアーゼ切断又はＰＣＲ増幅のような技術により全部又は一部除去しつる２　００　ｂｐが図示された配列の上流に更に存、在する。

本発明の目的にとり好ましいタンパク質の１つはスノードロップレクチンであり、下記例はトランスジェニック単子葉及び双子葉植物の篩部におけるこのタンパク質の発現のために中間ベクターを提供する。当業者であればその方法が他のタンパク質にも容易に適合しうることを知っている。同様に、これら例のほとんどは好ましいプロモーターの一部を用いているが、それらは他の篩部特異性プロモーターにも容易に適合しつる。

３．１．双子葉植物篩部におけるＧＮＡの発現３．１．１．４ＸＢ２＋Ａプロモーターからアグロバクテリウム二元ベクターｐ　ＲＯＫ　２　［）ＩＮｄｅｒら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ、３３０．１８０−１６３）を制限酵素Ｉ（ｉｎｄｌｌ＋及びＢａｍＨＩで切断し、Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ遺伝子プロモーターを切り出した。プラスミドｐ　Ｓ　Ｃ（前ｆＦ１２．　１）をＨｉｎｄｌｌｌ及びＢａｍＨＩで切断し、４ＸＢ２＋Ａ配列を含む２９２ｂｐ断片を制限断片のアガロースゲル電気泳動分離から精製した。この断片をＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐＲＯＫ断片に結合させて、４ＸＢ２＋Ａプロモーターからの植物発現用カセット、ｐｓｃａ（図６）を得た。

国際特許出願節ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１２９Ｑ号（アグリ力ルチャラル・ジエネティクス社）明細書で十分に記載されたプラスミドｐｌＧＮＡ２はＷ、Ｄ、０．Ｈａｍｉ　１ｔｏｎ博士（Ａ、Ｇ、Ｃ，−Ａ、Ｐ、Ｔ、Ｌ、　、バブラハム、ＵＫ）から提供された。これはｐＵｃ１９のＢ　ａ　ｔｎ　ＨＩ及びＫｐｎＩ部位間にＧＮＡ前駆タンパク質に関する全コード配列を含む。

ＧＮＡ配列をＢａｍＨＩ及びＫｐｎ　１でのｐｌＧＮＡ２ＤＮＡの切断と制限断片のアガロースゲル電気泳動分離から４９０ｂｐ断片の抽出により単離した。この断片をＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌで切断されたｐＳＣＢ中に結合させて、トランスジェニック植物篩部における４ＸＢ２＋ＡプロモーターからのＧＮＡの発現用に適しタヘクター、ｐｓｃＩＧＮＡと表示されるプラスミド（図６）を得た。

３．１．２．Ｒ５５ｌプロモーターからプラスミドｐＢ１１０１．２は無プロモーターＧＵＳ遺伝子カセットを含むｐＢＩＮ１９に由来する市販（クロンチック・ラボラトリーズ社１バロアルト、ＣＡ）Ａ。

ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｒａｃｌｅｎｓ）二元ベクターである。

プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ５ａｌｌ及びＢａｍＨＩで切断し、プラスミドｐｓ８２４ＮＮ３０Ｂ（例２．２）の切断物から単離されたＳａｌｌ −ＢａｍＨＩ制限断片と結合させて、トランスジェニック植物におけるＲ５５ｌプロモーターからのＧＵＳの発現用に適した二元ベクター、プラスミドｐＢＲｓｓ７を得た。

この組立体を標準アグロバクテリウム媒介遺伝子移入によりトランスジェニックタバコ中に導入し、双子葉植物トランスジェニック体におけるこのプロモーターからの発現の篩部特異性を標準細胞ＧＵＳアッセイにより実証した。

ＧＵＳ遺伝子を制限エンドヌクレアーゼＳｍａ　Ｉ及び５ｓｔｌでの切断によりプラスミドｐＢＲＳＳ７から除去し、３′−突出部分を７４ＤＮＡポリメラーゼでの処理ニヨリ５ｓｔ１部位から除去した。ＧＮＡコード配列をＳｍａｌ−Ｐｓｔｌ制限断片としてプラスミドｐｌＧＮＡ２から作製し、Ｐｓｔ１部位の３′− 突出部分をＴ４ポリメラーゼでの処理により除去した。これらの断片を一緒に平滑末端結合させ、大腸菌ＤＨ５αに組込んでクローニングした。Ｒ５５ｌプロモーターに対して機能的に正しい向きでＧＮＡコード配列を含むクローンはＨｉ　ｎ　ｄ　ｌ１ｌ（正しい向きでＧＮＡ配列を含む約２．１ｋｂ断片を生じる；　ｃｆ、逆向きの約１．５ｋｂ）及びＥｃｏＲＩ　（正しい向きでＧＮＡ配列を含む約１．７ｋｂ断片を生じる；　ｃｆ、　＜　０　、６　ｋｂ）を用いて診断制限分析により同定し、トランスジェニック植物篩部におけるＲ５５ｌ遺伝子プロモーターからのＧＮＡの発現用に適した二元ベクター、ｐＢＲ５ＳＬＴ２と表示されるプラスミド（図７）を得た。

この組立体はＧＮＡブレタンパク質開始コドンの３６ヌクレオチド上流にＲ５５ｌのエキソン２に由来する枠内翻訳開始コドンを含むことが注記される。これは下記のようにＧＮＡブレタンパク質のアミノ末端で更に１２残基を生じる（３つはＲ５５ｌ、９つはポリリンカーに由来する）：Ｒ３ｓ　ｌ　ポリリンカー　ＧＮＡｌ　Ｉ＾ＴＧＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＣＧＧＴＴＣＣＡＴＧＬＧＳＰＧＤＰＬＥＳＧＳｉ二〇Ｎ末端伸長は本発明の目的にとり重要でないと考えられる。

３．２．イネ篩部におけるＧＮＡの発現３．２．１．４ＸＢ２＋ＡプロモーターからプラスミドｐｓｃＩＧＮＡ　（前例３．１．１．）をＢｇｌｌ＋及びＲｃｏＲＩで切断し、ｎ　ｐ　ｔ　ＩＩ遺伝子及びＧＮＡ発現組立体を含む断片をアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ及びＲｃｏＲＩ切断ｐＵｃ１８と結合させた。ｐｓｃＧＮＡＲｌと表示される得られたプラスミドはイネ形質転換に有用である（図８）。

トランスポゾンＴｎ５からのｎ　ｐ　ｔ　ＩＩ遺伝子をすべての前記例で用いて、カナマイシンで形質転換植物組織を選択した。しかしながら、カナマイシンはトランスジェニックイネで不稔性を生じると言われているＣＬｌ、Ｚ、ら（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、８．２７６−２９１）　、したがって、大腸菌からのａｐｈｌＶ遺伝子を用いてイネ形質転換用にもう１つの組立体を作製し、ヒグロマイシンで形質転換植物組織を選択した。プラスミドｐＪＩＴ７２をＢａｍＨＩ及びＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌで切断し、ａ　ｐ　ｈ　ＩＶ遺伝子配列を含む１１１０ｂｐ断片をアガロースゲルから精製した。プラスミドｐＪ　ＩＴ３ＯＮｅｏをＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びＥｃｏＨＩで切断し、大きな断片をアガロースゲルから精製した。断片を混ぜ、Ｓ１ヌクレアーゼでの処理により平滑末端化させた。ヌクレアーゼを不活性化させ、断片を結合させ、大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞を形質転換するために用いた。組換えプラスミドはＫｐｎ　１＋Ｅ　ｃ　ｏＲＩ及びＸｈｏｌ＋ＥｃｏＲＩを用いた制限分析によりスクリーニングし、プロモーター及びターミネータ−配列と比較して正しい向きでａ　ｐ　ｈ　ＩＶ遺伝子を有する組立体を同定した。この組立体はｐＪＩＴ３０Ａｐｈと表示した（図８）。プラスミドｐＳＣＧＮＡＲ１をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びＥｃｏＨＩで切断し、ＧＮＡ発現断片をアガロースゲルから精製した。この断片をＸｈ。

！切断により直鎖化されたｐＪ　ＩＴ３０Ａｐｈと混ぜ、断片を８１ヌクレアーゼでの処理により平滑末端化させた。ヌクレアーゼを不活性化させ、断片を結合させ、大腸菌ＤＨ５αを形質転換するために用いた。ｐＳＣＧＮＡＲ２（図８）と表示される得られた組立体はヒグロマイシンに耐性であるトランスジェニックイネ植物の篩部におけるＧＮＡの発現にとり有用である。完全なｐＳＣＧＮＡＲ２又はＰｓｔｌ直鎖化プラスミドもイネ形質転換に用いてよい。

３．２．２．Ｒ５５ｌプロモーターからプラスミドｐＢＲ３ｓＬＴ２　（前例３．１．２）からのＤＮＡ断片くくイネスクロースシンターゼプロモーター−ＧＮＡコード配列−ノバリンシンターゼターミネータ−−Ｔｉプラスミド左境界〉〉を制限エンドヌクレアーゼＳａ　Ｉ　Ｉ／Ｂｇ１冊切断物から単離した。この断片を市販ベクタープラスミドｐＳＫ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンジエゴ、ＣＡ）の５ａｌＩ及びＢａｍＨＩ部位間で部位−ニングし、プラスミドｐＫＲ５ＳＬＴを得た。次いでこれらの配列をＫｐｎｌ／　Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼ切断断片においてｐＫＲ５ＳＬＴから単離し、ｐＪＩＴ３０のＫｐｎｌ及びＸｈｏＩ部位間でクローニングし、プラスミドｐＲ５ＳＬＴＲ（図９）を得たか、これはトランスジェニックイネ植物の篩部におけるＲ５５ｌプロモーターからのＧＮＡの発現にとり有用である。

ＧＮＡ発現組立体ｐｓｃＩＧＮＡ　（例３．１．１）及びｐＢＲ５ＳＬＴ２　（例３．１．２）を標準操作ＣＢｅｖａｎ、Ｍ、（１９８４）　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１２，１０３−ＬＩＯＩでｐＲＫ２０１３保有大腸菌ＨＢＩＯＩと二親交配することによりアグロバクテリウム・ツメファシェンスＬＢＡ４４０４中に移動させた。次いでＧＮＡ遺伝子組立体を葉片を用いてアグロバクテリウム媒介遺伝子移入によりタバコ植物にコチアナ・ツバカム変種サムサンＮＮ）中に導入し、成熟トランスジェニックタバコ植物を確立されたプロトコール（Ｆｒａｌｅｙら（１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８０．４８０３−４８０７；　Ｈｏｒｓｃｈ　ら　（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７゜１２２９−１２３１１　に従い再生した。ＧＮＡの発現レベルは確立された方法〔Ｊａｈｎら（ｌＨ４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８１．１８８４（６８７］　に従いタンパク質抽出ドツトプロットにおいてウサギ抗ＧＮＡ抗血清及び３５Ｓ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ（アマ−ジャム・インターナショナル社（ＡｉｅｒｓｈａＩＩＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ）、アマ−ジャム、ＵＫ）二次抗体を用いて免疫学的に調べてもよい。ニトロセルロース膜上における切茎及び葉切片の痕跡を抗ＧＮＡ−次抗体でプローブ処理し、ＨＲＰ複合化ヤギ抗ウサギ二次抗体［バイオ−ラッド会うボラトリーズ社（Ｂｆｏ −ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、）＝　ウォトフォード、ＵＫ］及び市販ＥＣＬイムノアッセイシグナル検出試薬（アマ−ジャム・インターナショナル社、アマ−ジャム、ＵＫ）を用いて高化学発光（Ｅ　ＣＬ）系により視覚化させた。これはこれらのプロモーターからＧＮＡの篩部特異性発現について実証した。選択された植物は自家式で播種させたが、挿入遺伝子にとりホモ接合である８１世代の個体はＳ２世代でカナマイシン耐性の分離分析により同定してもよい。ホモ接合ＧＮＡ発現Ｓ２植物は全植物にモモポテトアブラムシ（ミズス・バーシカ）を寄生させることによりベスト同月類への耐性に関するバイオアッセイに付した。

Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ遺伝子プロモーターは導管組織を含めたトランスジェニック植物のほとんどの組織で活性である強い構成プロモーターとして当業界では知られている。

本発明とは異なる目的によりＣａ〜ＩＶ３５Ｓ遺伝子ブロモーターからＧＮＡを発現させる遺伝子組立体のトランスジェニックタバコ植物中への導入は国際特許出願箱ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１２９０号（アグリ力ルチャラル・ジェネティクス社）明細書で詳述されている。１５ＧＮＡＩ＄７９と表示されるこれらＧＮＡ発現系の１つに由来する（標準技術により茎切断物から産生された）トランスジェニックＮ、ツバカム変種サムサンＮＮ植物及び非発現コントロール植物のクローン複製はケンブリッジ、バブラハムのアグリ力ルチャラル・ジエネティクス社ＡＰＴＬから得た。この系統におけるＧＮＡの発現の箇所及び相対レベルはポリクローナルウサギ抗ＧＮＡ−次抗体及びＨＲＰ複合化二次抗体を用いて葉及び茎物質からの薄切片の免疫細胞試験により調べた。

葉肉と比較した１５ＧＮＡ１＃７９タバフ植物の篩部におけるＧＮＡの見掛は発現レベルはトランスジェニックタバコ植物でＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ遺伝子プロモーターにより指示されるＧＵＳ遺伝子発現の相対レベルに関して我々自身の及び公表された観察から予想されるよりも高いことがここで示された。その２遺伝子の発現の相対レベルに関する差異は遺伝子の細胞内標的化に関する差異の結果かもしれない。

非最良プロモーターから１５ＧＮＡ１＃７９植物の篩部におけるＧＮＡの発現の相対的に高いレベルのために、モモポテトアブラムシに対するバイオアッセイでこれらの植物を試験することは有用であると考えられた。

４．２．）ランスジェニックイネＧＮＡ遺伝子発現組立体は当業者に知られるいくつかの確立されたプロトコールのうちいずれでイネ植物（０゜サチバ）中に導入してもよいＣＳｈｉｍａｍｏｔｏら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、８３８，２７４−２７８　ＨＹａｎｇら＜１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、７゜４２１−４２５　；　Ｚｈａｎｇら（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐ、７．３７９−３ｇ４；Ｌｉら（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐ、８．２７８−２９１）　、この例では篩部でＧＮＡを発現するトランスジェニックイネ植物を提供するためにＹａｎｇら（１９Ｂ）の操作を用いる一０ＩＲＲＩから得たイネの一台北３０９ ″変種″を細胞懸濁培養物の供給源として用いるが、その原形質体はセルラーゼ及びペクチナーゼで細胞壁の酵素消化により調製してよい。原形質体をｐｓｃＧＮＡＲｌもしくはｐｓｃＧＮＡＲ２（例３．２．１）又ハｐ　ＲＳ　Ｓ　Ｌ　Ｔ　Ｒ（例３．２．２）と共にインキュベートし、電気パルスで処理して、プラスミドＤＮＡの取込みを誘導させる。

原形質体を抗生物質カナマイシン（ｐｓｃＧＮＡＲｌ及びｐＲＳＳＬＴＲ）又はヒゲｏｖイシン（ｐＳＣＧＮＡＲ２）を含有した培地で培養して、形質転換細胞について選択する。抗生物質耐性カルスを再生培地に移してトランスジェニックイネ苗木を産生じ、しかる後これを土壌で成熟させる。再生体は例４．１のような免疫学的方法でＧＮＡの発現について分析してよい。ホモ接合トランスジェニック植物を例４．１でタバコについて記載されたように自家受粉により得て、コントロールとして非脂質転換′台北３０９′植物を用いて樹液吸引ベスト昆虫、このケースでは褐色プラントホッパーへの耐性に関するバイオアッセイに用いる。種子を望ましい耐性特徴を示す植物から集めて、これらの系統に由来する植物を繁殖させ、従来のイネ改良プログラムに組み込んでもよい。

例５トランスジェニック植物の樹液吸引昆虫バイオアッセイそれらの篩部でＧＮＡを発現するトランスジェニックタバコ植物（例４．１）を例１．５で記載されたように維持されたミズス・バージカーモモポテトアブラムシに対するバイオアッセイで試験した。

５．１．全植物バイオアッセイトランスジェニックタバコ系１５ＧＮＡ１＃７９　（例４．１）のクローン複製を標準技術により茎切断物から産生じた。これらの植物とクローン繁殖非形質転換Ｎ。

ツバカム変種サムサンＮＮコントａ−ル植物を５インチ（約１３ｃｍ）ポットに植えて、制御環境生育室内にある個別の２４　Ｘ　２’４　Ｘ４　Ｄｃ＋１パースペクスボックスで成長させた・高さ約２０ｃｍのとき、植物に８匹の後期齢宵月アブラムシを寄生させた。アブラムシ群の繁殖は各植物ですべてのアブラムシをカウントすることによりモニターした。図１０で示された結果はトランスジェニック植物でアブラムシ群のサイズについて有意の減少を実証している。アブラムシ群の繁殖速度は倍加時間ＴＤ：Ｔ　Ｄ−０，３０１０３７ｍから評価してよい。−ｍ−は経時的な１　ｏ　ｇ　１０アブラムシ数の退行の勾配である。ＴＤはコントロールにおける４、４±０．２日と比較してトランスジェニック植物では４．８±０．２日に増加する。

５．２２葉片バイオアッセイコントロール及びＧＮ八へ現トランスジェニック植物を高さ３０〜４０ｃｍまで成長させた。直径２５１■の片を完全成熟葉から切出したが、大きな葉脈がある葉の領域を避けた。葉片を直径５ｃｍ使捨てベトリ皿中にある水道水１０１上にさかさまに浮かべた。２匹の後期齢宵月アブラムシ若虫を各葉片に適用し、皿にフタをして制御環境生育室内で維持した。アブラムシを毎日カウントした。

図１１で示された結果はトランスジェニック植物でアブラムシ群のサイズについて有意の減少を実証している。

このため、葉片バイオアッセイから得られた結果は全植物バイオアッセイで得られたものを反映している；前者はより多数の複製を実施できるという利点を有する。

上記のように計算されたアブラムシ群倍加時間はコントロール（ＴＤ−１，６２日）の場合よりもトランスジェニック植物から産生された葉片（ＴＤ−２，４７８）の方が長い。

葉片バイオアッセイはいくつかの個別的複製コントロール及びトランスジェニック植物からの葉と個別的コントロール及びトランスジェニック植物内におけるいくつかの異なる葉からの複製を用いて繰り返した。７日間パイオアンセイ後におけるアブラムシ数／葉片の統計分析ではトランスジェニック植物葉から採取された片におけるアブラムシの数に関して有意の減少を明らかに示している（表６）。同植物内の葉に関する偏差係数は約２０％であった；異なる複製コントロール植物に関する偏差係数は５４％、異なる複製トランスジェニック植物の場合は７５％であった。

表６１Ｍ、バーシカに対する異なる複製ＧＮＡ発現トランスジェニック及びコントロールタバコ植物の葉片バイ平均アブラムシ／片　Ｎ　ＳＥＭコントロール　３８．８　６　±８．６１５０腎Ａ１１１７９　−　８．３　８　±２．５ＧＮＡ発現トランスジェニック植物で生存するアブラムシが生来の耐性サブグループを表すかどうかについて確定するために葉片バイオアッセイを行い、６週間にわたりコントロールタバコ植物で維持されたアブラムシの動作をＧＮＡ発現トランスジェニックタバコ植物で維持されたものと比較したが、その間にアブラムシは数世代を経過した。結果（表７）はＧＮＡ順化アブラムシがトランスジェニックタバコ植物でＧＮＡ発現の効果を同等にうけやすいことを示す。

表７．コントロール又はＧＮＡ発現トランスジェニックタバコ植物で順化されたＭ、バーシカに対するコントロール及びＧＮＡ発現トランスジェニックタバコ植物の葉平均アブラムシ／片（±ＳＥ間）葉片源　アブラムシ源コントロール　ＧＮＡコントロール　１１．８±３．０　１２．０±２．８１５ＧＮＡ１ｔＩ７９　３．３±Ｌ、１１　２．５±１，８これらのバイオアッセイでは人工餌で同月類に対し有効であるとして同定されたタンパク質がトランスジェニック植物の篩部で発現された場合にもこれらの昆虫に対して有効であることを実証している。

Ｆｉｇｕｒｅ　１生存数日Ｆｉｇｕｒｅ　２食餌バイオアッセイ日一コントロール　、−ＧＮＡ　十無餌１１ｍ　ｐＥＭＢＬ１８ＥｃｏえＦｉｇｕｒｅ　４ＴＡＧＴＴＧＴＡＡＡ　ＧＧＧＴＡＧＡＡＡＴ　ＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧ　ＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧ　ＡＡＡＣＭＴＴＴＣＦｉｇｕｒｅ　５．　（Ｈさ）ＧＣＴＧＡＴＴＣＡＧ　ＣＧＧＣＧＣＴＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡ　ＴＣＧＴＧＧＴＣＴＴ　ＧＧＣＴＣＧＣＣＣＡＦｉｇｕｒｅ　５．　（Ｒき）ＣＡＧＣＴＧＴＴＴＴ　ＴＡＧＴＴＡＴＧＴＴ　ＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＣＴＴＴＴＧ　ＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＦｉｇｕｒｅ　５．　（ＩＩき）Ｆｉｇｕｒｅ７Ｅｃｏ良Ｆｉｇｕｒｅ　１０　’Ｔｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ　ｂｉｏａｓｓａｙアブラムシ／植物臼一コントＯ−ル　＋ＧＮＡ　−１９Ｆｉｇｕｒｅ　１１　Ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ　ｂｉｏａｓｓａｙ葉片バイオアッセイＭ、バーシカに対するＧＮＡタバコ日一コントロール　＋ＧＮＡ　−１９、　、　−ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１５６５フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＡＯＩＭ　１／２０　Ａ　８６０２−２ＢＡＯＩＮ　３７／４４　９１５９−４Ｈ６５１００Ｚ　９１５９− ４ＨＣ１２Ｎ　９１０２　９３５９−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／Ｃｌ２Ｎ　５／１０（８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳＩ（７２）発明者　パウエル、ケビンイギリス国ダーラム、ピティー、ミー、ハートサイド、ビュー、１３（７２）発明者　プルター、ドナルドイギリス国ダーラム、シティ−、クロスゲート、５

Claims

【特許請求の範囲】

１．同翅類害虫に毒性又は代謝拮抗効果を有するタンパク質についてコードする遺伝子を含み、その遺伝子が植物の篩部でその遺伝子にそのタンパク質を発現させるプロモーターと連結されているトランスジェニック植物。
２．タンパク質がレクチン又はリポキシダーゼから選択される、請求項１に記載の植物。
３．レクチンがスノードロップレクチン又は小麦麦芽アグルチニンであり、又はリポキシダーゼがエンドウリポキシダーゼ１である、請求項２に記載の植物。
４．プロモーターが４×Ｂ２＋Ａプロモーター、イネスクロースシンテターゼ遺伝子プロモーター又は脂肪種子ナクネエクステンシン遺伝子プロモーターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
５．植物がイネ、トウモロコシ又はいずれか他の形質転換しうる植物から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
６．アブラムシ、プラントホッパー、ヨコバイ、コナジラミ、アワフキ又はカイガラムシから選択される同翅類害虫に対して保護される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
７．請求項１〜６のいずれか一項で記載された植物に由来する子孫又は零余子。
８．同翅類害虫に毒性又は代謝拮抗効果を有するタンパク質についてコードする遺伝子を植物のゲノム中に組込むことからなり、その遺伝子が植物の篩部でその遺伝子にそのタンパク質を発現させることができるプロモーターと連結されている、トランスジェニック植物の作製方法。
９．遺伝子が、プロモーターと連結してその遺伝子を組込んだＡ．ツメファシエンスの無力化株で植物に由来する物質を感染させ、その感染植物物質から植物を再生させることにより、植物のゲノム中に組込まれる、請求項８に記載の方法。
１０．同翅類害虫に毒性又は代謝拮抗効果を有するタンパク質についてコードする遺伝子とその遺伝子と作動的に連結した篩部特異性植物プロモーターを含むＤＮＡ配列。
１１．害虫に毒性又は代謝拮抗効果を有するタンパク質を害虫に腸内投与することからなり、そのタンパク質がトランスジェニック植物の篩部で発現される、同翅類害虫のコントロール方法。
１２．害虫に毒性又は代謝拮抗効果を有するタンパク質の、同翅類害虫のコントロールに関する用法。
１３．タンパク質が、害虫用の給餌に加えられた場合に、そのタンパク質を含まない餌と比較して少くとも５０％の致死率増加を示すものである、請求項１２に記載の用法。