JPH06510025A - Ｈｉｖ−１に対するｔ細胞活性化の誘導に用いられるペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ−１こ・　Ｔ　の°゛　こ　い゛　べ　゛本発明は、１９９０年８月２２ 日こ出願された現在も係属中の米国特許出願第０７．１５７１，０８０号の一部 継続出願である。

光咀の五旦 ＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ Ｖ）というレトロウィルスにより発生する。Ｂａｒｒ６−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ他「 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の虞れのある患者からのＴリンパ向性レトロ ウィルスの分離Ｊ　Ｓｃ　１ｅｎｃｅ２２０　：８６８　（１９８３年）　、Ｇ 　ａ　ｌ　ｌ　。

他ｒＡＩＤｓ患者およびＡＩＤＳの虞れのある患者からの細胞障害性レトロウィ ルス（ＨＴＬＶ−１［［）の頻繁な検出および分離ＪＳｃｉｅｎｃｅ２２４：５ ００（１９８４年）。

たいていのウィルスと同様、ＨＩＶはしばしば中和抗体の産生を誘発する。しか し、多くの他のウィルスや他の感染因子では感染により防御免疫が導かれるのに 対し、ＨＩＶ特異抗体は、疾病の進行を停止するには不充分である。したがって 、ＨＩＶの場合には、自然感染の免疫を誘発するワクチンでは効果がないことに なる。実際、ＨＩＶ蛋白ｇｐｌＦＤから調製されたワクチンは、中和抗体を誘発 するものの、ＨＩＶ感染に対する免疫性はごくわずかにすぎないようである。

有効な抗ＨＩＶワクチンを製造できないことは、１９９０年代の終りまでは有効 なワクチンを得ることはできないであろうという予測を導いた。

ＨＩＶゲノムは充分に性質が調べられてきた。その約１０Ｋｂは、ＨＩＶ複製の ための調節セグメント、ならびに、コア蛋白、逆転写酵素−蛋自分解酵素一エン ドヌクレアーゼ、内部および外部エンベロープグリコプロティンをそれぞれコー ドするｇａｇ、ｐｏｌ・ｅｎｖ遺伝子を含む配列をコード化する。

ＨＩＶｅｎｖ遺伝子は、細胞内グリコプロティンｇｐ１６０をコード化し、これ は通常蛋白分解によりプロセスされてウィルス外部グリコプロティンｇｐ１２０ と、ウィルス膜通過グリコプロティンｇｌ）４１を形成する。ｇｐ１２０プロテ ィンは、ｇｐ４１との非共有結合性相互作用によりＨＩＶピリオンと連結したま まである。これらの非共有結合性相互作用は弱く、その結果、ｇｐ１２０の大半 は細胞およびピリオンから可溶性の状態で解放される。

ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子の産物に対する抗体力用ＩＶに感染したＡＩＤＳおよ びＡＲＣ患者の血清に発見されることから、ＨＩＩ−１ゲノムのｇａｇおよび特 にｅｎｖ領域によりコード化される蛋白は免疫原性をもつことが、過去の研究に よりわかっている。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者、ならびに、当該ウィルスに感染した無症状者の血清 から得られるいくつかの抗体はｇｐ１２０およびｇｐ１６０に特異的であること が、すでにわかっている。これらの抗体はしばしば中和活性をもつ。エンベロー プグリコプロティンは、ＡＩＤＳおよびＡＲＣ患者の血清中の抗体によりもっと も適合して認識されるＨＩＶ−１抗原である。Ａ１１ａｎ他ｒＡＩＤｓ患者体内 に抗体を誘発する主要なグリコプロティンはＨＴＬＶ−Ｉ［［によりコード化さ れるＪ　Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ２２８　：１０９１〜１０９４　（１９８５年）、 Ｂａｒｉｎ他ｒＨＴＬＶ−Ｉ［［のウィルス性エンベロープ蛋白はＡＩＤＳ患者 体内の抗体の主要な標的抗原をあらオつすＪ　Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ２２８　：１ ０９４−１０９６　（１９８５年）。さらに、患者血清中の抗体は、ｇａｇ遺伝 子によりコード化されるウィルス性コア蛋白のエピトープをも認識する。

臨床検査用およびワクチン組成物候補としての免疫学的に重要なＨＩＶ−１抗原 は、バクテリア、酵母、種痘疹などのさまざまな発現システムにおいてＨＩＶ− １ゲノムの部分をクローン化することにより調製される。Ｃａｂｒａｄ　ｉ　ｌ 　ｌａ他［バクテリア合成されたｅｎｖポリペプチドを用いた、ヒトＡＩＤＳレ トロウィルスに対する抗体の血清診断ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１２８ 〜１３３　（１９８６年）、Ｃｂａｎｇ他［組換え大腸菌を使用した免疫学的検 定でのヒトＴ細胞リンパ向性ウィルス−ｍ　（ＨＴＬＶ−ｍ）に対する抗体の検 出−誘導されたウィルス抗原性ペプチドＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：９０ ５〜９０９　（１９８５年）。しかしながら、組換えＤＮＡ法により産生された ＨＩＶ−１抗原は、なお徹底的に精製しなければならない。これは、調製される ＨＩＶ−１抗原を汚染する可能性のある、発現システムの抗原に対するなんらか の抗体反応により、ワクチン接種時の副作用およびＥＬＩ　ＳＡ検定における誤 った陽性反応が起きるのを避けるためである。また、精製中のＨｉＶ−１抗原の 変性は、重要な抗原活性を破壊することがある。完全ウィルスからの蛋白の調製 は、やはり、ウィルスによる汚染をもたらす可能性がある。

いくつかの刊行物に、ＨＩＶ−１の抗原性蛋白の部分に対応する、選択された合 成ペプチドの免疫学的反応性を示すデータが呈示されている。１つの研究におい て、ＨＩ　Ｖ−１のアミノ酸残基７３５〜７５２に対応するアミノ酸配列Ｔｙｒ −Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ −Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｒｇ− ８ｅ　ｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓをもつペプチド力構成された。Ｋｅｎｎｅｄｙ他「合 成ペプチドに対する抗血清はＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ｍエンベロープグリコプロティン を認識する」５ｃｉｅｎｃｅ２３１　：１５５６−１５５９　（１９８６年）。

このペプチドはｇｐ４１の部分に由来し、ＨＩＶ−１に対する中和抗体反応を誘 起する目的でラビットを免疫化するために用いられた。さらに、抗ｇｐ４１抗体 を含むことが知られているＡＩＤＳ患者からの数種の血清は、このペプチドとは 反応性が弱い。これは、このペプチドが、天然のｇｐ１６０／ｇｐ４１に対する 抗体に、ある程度認識される少なくとも１つのエピトープを含むことを示すもの である。しかしながら、このペプチドが、ラビット以外の哺乳類において中和抗 体を誘起することは証明されておらず、ヒトワクチンとしての使用についての示 唆もない。

ＨＩＶ感染者の集団に対して実施された長尺の研究により、安定的な臨床状態は 、ＨＩＶのエンベロープグリコプロティンｇｐ１２０に対する、特に、８個のア ミノ酸の特異セグメントに対する中和抗体が高いタイター（抗体価）で存在する ことに関係していることがわかった。Ｒａｎｋｉ他ｒＨＩＶ　（ＨＴＬＶ−ＩＩ Ｉ）感染における中和抗体：臨床的成果と種々のウィルス蛋白に対する抗体反応 の相関Ｊ　Ｃｌ　ｉｎ、Ｅｘｐ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６９：２３１　（１９８７年 ）、ＭａｒＸ　（１９８９年）。

ＨＩＶに対する防御免疫を達成することは、ｇ　ｐ　１．２０特異中和抗体の誘 発にかかっているようである。ＭａｒｘｒＡＩＤＳワクチン最前線の新たな希望 」Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ２４４　：１２５４　（１９８９年）。ウィルス特異的細 胞障害性Ｔ細胞の生成と拡大を促進するためには、効果Ｔ細胞（ｐｏｔｅｎｔ　 Ｔ　ｃｅｌｌ）の助けも重要である。Ｒｅ１ｎｈｅｒｔｚおよびＳｃｈｌｏｓｓ ｍａｎｒヒト免疫調節Ｔリンパ球サブセットの特徴と機能Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｔｏｄａｙ２：６９　（１９８１年）、Ｂｕｒｎｓ他「ウィルス性抗原の胸腺依 存ＪＮａｔｕｒｅ２５６：６５４（１９７５年）　、Ａｓｋｏｎａｓ他「ウィル ス感染における細胞障害性記憶Ｔ細胞とヘルパーＴ細胞の特異性Ｊ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ４５ニア９　（１９８２年）。

防御免疫を持続的かつ広範なものにするためには、ヘルパーＴ細胞認識のための 限られたＭＨＣ拘束を示すエピトープからなる、構造的に保存された抗原性部分 に対して、免疫学的記憶を誘発することが必要である。Ａｓｋｏｎａｓ他（１９ ８２年）。

Ｂ細胞による、中和抗体を含む抗体の産生は、同系［ｃｏｇｎａｔｅ］Ｔ細胞の 助けに大きく依存し、Ｔ細胞により認識される抗原決定基はＢ細胞により認識さ れるものとはしばしば異なる。このため、Ｔ細胞により認識される抗原性部分（ いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」）の同定は、ＴおよびＢ細胞エピトープの適切な 組合わせに基づ（ワクチン戦略を考序するに際して重要である。

そこで、ＡＩＤＳおよびＡＲＣの治療および予防において、中和抗体を産生ずる とともにＴ細胞の助けを誘起することのできるＨＩＶワクチンを得ることが有用 となってくる。

■細胞により認識される大半の抗原決定基は、ペプチドの連続伸長体から構成さ れている。５ｔｒｅｉｔｃｈｅｒ他［抗原の立体配座はＴ細胞活性化の処理要件 を決定するＪ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ 、７９　：４７２３　（１９８２年）、ＤｅｌｉｓｉおよびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ ｒＴ細胞抗原部位は両親媒性構造になる傾向があるＪ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１． Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ　、８２　：　７０４８　（１９８５年）　、Ｍａｒｇａ　Ｉ　ｉ　 を他［−次配列からの免疫優勢ヘルパーＴ細胞抗原部位の予測Ｊ　Ｊ、Ｉｍｍｕ ｎｏｌ、１３８：２２１３　（１９８７年）。ＢおよびＴ細胞認識部位は、しば しば、複合抗原のさまざまな領域に配置される。Ｍｉｌｉｃｈ他「Ｂ型肝炎抗原 ｐｒｅ−３（２）領域合成ペプチド」二の非重複（オーバーラツプ）ＴおよびＢ 細胞決定基ＪＪ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６４　：　５３２　（１９８６年）。機能 性Ｔ細胞のレパートリ−の中で、ヘルパーＴ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、サプレッ サーＴ細胞は、構造的に異なる決定基を認識するようである。Ｋｒｚｙｃｈ他「 大型蛋白抗原、β−ガラクトシダーゼ上の非重複決定基によるヘルパーおよびサ プレッサーＴ細胞の誘導」ＦＡＳＥＢ　Ｊ、２・１４１　（１９８８年）。この 機能的分離は、ワクチンの開発に重要な関係をもつ。というのは、サプレッサー Ｔ細胞により認識される特定の決定基を除去し、その結果、免疫原性に対する重 要な恩恵をもたらすことができるからである。

ＡＩＤＳおよびＡＲＣは、ＣＤ４’Ｔ細胞の漸進的劣化および日和見感染に対す る罹患性の増加と関連している。この点に関し、ＨＩＶ感染者は、ポリクローナ ルＢ細胞分化に対するヘルパーＴ細胞活性の低下、および、ＣＤ２９’記憶Ｔ細 胞の早期喪失に関連した、抗原およびミトゲン（ｍｉ　ｔｏｇｅｎ月二対するＴ 細胞増殖反応の低下を見せる。Ｔｅｒｐｓｔｒａ他ｒＨＩ　Ｖについてのセロコ ンバージョンがなされた［５ｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔｅｄ］同性愛男性における白 血球機能の研究ＨＩＶ感染後のＢ細胞機能の急速かつ持続的な損失Ｊ　Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｆ、１９：６６７（１９８９年）、Ｆａｈｅｙ他［後天性免疫 不全症候群を他の免疫サブセット障害から区別する、Ｔヘルパーまたはサプレッ サー／細胞障害性リンパ球サブセットにおける量的な変化ＪＪＡＭＡ７６・９５ （１９８４年）、５ｈｅａｒｅｒ他［後天性免疫不全症候群の症状を呈しない同 性愛男性の群における機能的Ｔリンパ球免疫不全Ｊ　Ｊ−：　Ｃ１ｉｎ、Ｉｎｖ ｅｓ　ｔ、７４〜１９６〜５０６　（１９８４年）、Ｇｉｏｒｇｉ他［生体内に おけるＣＤ４リンパ球に対するＨＩＶの早期効果Ｊ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３ ８：３７２５　（１９８７年）、ｖａｎ　Ｎｏｅｓｅｌｓ他「ヒト免疫不全ウィ ルスに感染した無症状の男性における記憶Ｔ細胞の選択的損失についての機能的 かつ表現型上の証拠Ｊ　８６　：　２９３　（１９９０年）。

サブユニットワクチン候補の組成における人工的Ｔ細胞認識部位として合成ペプ チドを用いることにより、魅力的な展望がひらかれる。これに関して、重複およ び非重複Ｂ細胞（抗体）認識部位に対する次の抗体反応の展開のために合成ペプ チドでヘルパーＴ細胞を育成することの可能性が、いくつかの実験的システムに おいて実証されている。３ｔｒｅｉｔｃｈｅｒ他（１９８２年）、ｐｅｌｉｓｌ およびＢｅｒｚｏｖｓｋｙ　（１９８５年）、Ｍｉｌｉｃｈ他「１０残基Ｐｒｅ Ｓ（１）ペプチド単体は、ＨＢｓＡｇのｐｒｅ−８（１）　、ｐｒｅ−８（２） 、Ｓ領域内の多重エピトープに対する抗体製造のためのＴ細胞の助けを触発する ことができるＪ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：４４５７　（１９８７年）。Ｈ ＩＶゲノムの２つの領域から由来したペプチドがＴ細胞活性化を誘起することが ここに見出だされた。これらのペプチドは、さらに、ＨＩＶ−１に対する中和抗 体の産生を誘発できる。

発朋り概要 本発明によれば、ＨＩＶ−１蛋白ｇｐ１２０のエピトープおよびその類似体と相 同体に対応する新規なペプチドが得られる。これらのペプチドは単独であるいは 組み合わ七で、また、他の分子や物質と非結合あるいは結合して、利用すること ができる。これらのペプチドはＴ細胞活性化の誘起、ＨＩＶ感染に対する免疫、 ＨＩＶに対する高度な免疫反応の誘発、ポリクローナルおよびモノクローナル抗 体の産生において有用である。

ヒト免疫不全ウィルスｌ型（ＨＩＶ−１）のエンベロープｇｐ１２０の全−次配 列に対応する４０個の合成ペプチドについて、抗体形成を誘発する能力を試験し 、および／または、Ｔ細胞活性化抗体形成を、形成されたペプチド特異的抗体の 量を測定することにより判定した。Ｔ細胞活性化の測定には、免疫を施したサル から採取した、非分画の、Ｔ細胞および／またはＣＤ４’Ｔ細胞に富む末梢血単 核細胞（ＰＢＭＣ）の培養に添加したときの、ペプチドの試験管内（ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏ）増殖反応および／またはｌ−２産生を誘発する能力が用いられた。同定 されたＴ細胞認識の４つの主要な領域のうち、２つの新規なＴ細胞活性化領域が 同定された。これらの両方ともに、生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で、ＨＩＶ−１に 対する中和抗体の産生を誘発できることもわかった。これら２つの新規な領域の 一方は、ＨＩＶ−１ｇｐ−１２０の高度に保存された領域に対応し、他方の領域 は、ｇｐ−１２０の可変領域に配置される。後者の可変領域の認識は、ＭＨＣ多 型注型性リモルフイズム）により拘束されないようである。というのは、対応す るペプチドで免疫した６匹のサルのすべてが、これらのペプチドに対する試験管 内増殖反応を示すことが見出だされたからである。すなわち、ペプチドの効果は 、合成サブ、ユニットＡＩＤＳワクチンの開発のために大きな有用性をもつ。

口面Ω直里ｌ説朋 図１は、２回および／または３回のペプチド免疫化の後の、リコールペプチドに 対するサル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試験管内増殖反応を示すグラフである 。

図２は半重複ペプチドに対するサルＰＢＭＣの試験管内増殖反応を示すグラフで ある。

発皿Ω詳細五説皿 対ＡＩＤＳワクチンは、もし効率的なものが見つかるとしたら、ＨＩＶ中和抗体 の産生に関与する同系Ｂ細胞（ｃｏｇｎａｔｅ　Ｂ　ｃｅｌｌ）に対してヘルパ ーＴ細胞活性を誘発できる構成要素を含むものになるだろう。

本発明はペプチドを提供するものであり、これらのペプチドのいくつかについて は霊長類検体によるＨＩＶ中和抗体の産生を誘起することがすでに見出だされ、 また、これらのペプチドすべてがＴ細胞活性化を誘起する驚くべき特性をもつこ とがここに見出だされた。これらのペプチドは、Ｋｅｎｎｅｄｙ他「合成ペプチ ドに対する抗血清はＨＴＬＶ−ｍエンベロープグリコプロティンを認識するＪＳ ｃｉｅｎｃｅ２３１：１５５６〜１５５９（１９８６年）に示されるアミノ酸座 標をもつｇｐ１２０蛋白の領域に対応する。本発明のペプチドはｇｐ１２０−１ １（アミノ酸座標１４１〜１６４）、ｇｐ１２０−１２　（アミノ酸座標１５１ 〜１７６）　、ｇｐ１２０−１３　（アミノ酸座標１６４〜１９２）、ｇｐ１２ ０−１６（アミノ酸座標２０５〜２３０）、ｇｐ１２０−１９　（アミノ酸座標 ２４７〜２６９）、ｇｌ）１２０−２９　（アミノ酸座標３６６〜３８９）、ｇ ｐ１２０−３０（アミノ酸座標３７７〜４００）と称される。本発明のペプチド は、ここに参照として組み込まれる１９９０年９月２７田こ提出された米国特許 出願第０７１５８９．４２２号において、ワクチン組成における免疫原として用 いるものとして、および、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体産生を誘起 するものとして、説明されている。

ｇｐ１２０に由来する、領域的に関連した４つのグループのペプチドが、Ｔ細胞 活性化特性を示すものとして、同定された。Ｔ細胞活性化を誘起することが見出 だされたｇｐ１２０領域のうちの２つは、すでに同定されたＴ細胞エピトープに 類似している。Ｂｏ　Ｉ　ｏｇｎｅ　ｓ　ｉ　ｒＨＩＶ抗体およびＡＩＤＳ設計 ＪＡＩＤＳ３：５１１１−８１１８（１９８９年）。本発明の示すところによれ ば、ペプチドｇｐ１２０−２５を注射した２匹のサルの一方が試験管内で当該ペ プチドに反応しなかったので、免疫Ｔ細胞による、アミノ酸座標２９５〜３４３ により定義される領域の認識は、強いＭＭＣ拘束を受ける可能性がある。重複ペ プチドのいずれも試験管内増殖反応を生じなかったので、この領域内のＴ細胞抗 原決定基は、各免疫化ペプチド内に多かれ少なかれ独占的に配置されていると考 えられる。

しかしながら、ペプチ）’ｇｐ１２０−２４で免疫化されたサルから分離したＰ ＢＭＣを、ペプチドｇｐ１２０−２５の存在において培養したところ、ＩＬ−２ を分泌した。このことは、これら２つのペプチドにより共有されるマイナーなエ ピトープの存在を示す。

アミノ酸座標２９５から３４３（ペプチドｇｐ１２０−２３、ｇｐ１２０−２４ 、ｇｐ１２０−２５）に対応するｇｐ１２０の領域は、中和ループの配列を包含 する配列をもつメジャーＴ細胞認識部位（アミノ酸座標３０３〜３３７）を含む ことが他の研究者によりすでに示された領域（アミノ酸座標３０１から３３８） と類似している。Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ　（１９８９年）、Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ 他［ヒト免疫不全ウィルスＩ型エンベロープ蛋白の主要な中和ドメインＪＰｒｏ ｃ。

Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ８６　：　６７６８　（１９８９年 ）、Ｒｕ５ｃｈｅ池［ヒト免疫不全ウィルス感染細胞の融合を禁じる抗体は、ウ ィルスエンベロープ、ｇｐ１２０の２４−アミノ酸配列を結合するＪ　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａ　ｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５：３１９８　（１９８８年 ）。

アミノ酸座標４０９および４６６の間に位置するｇｐ−１２０（ペプチドｇｐ１ ２０−３３、ｇｐ１２０−３４、ｇｐ１２０−３５及びｇｐ１２０−３６）の領 域は、以下の例に説明されるように、効果Ｔ細胞活性化特性をもつことが判明し た。アミノ酸座標４０９および４６６の間の領域は、Ｔ細胞活性ドメインを含む ことがすでに示されている。Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ　（１９８９年）。この領域に おいて、２つのＴ細胞エピトープが同定され、１つはアミノ酸座標４１０および ４２９の間、もう１つはアミノ酸座標４２８および４４３の間である。後者の領 域は、許容Ｔ細胞上のウィルス接合の主要部位である、ｇｐ１２０のＣＤ４結合 部位（アミノ酸座標４２０〜４６３）と大きく重複している。

Ｔ細胞活性化特性をもつ他のいくつかのエピトープが、ｇｐ１２０分子の不連続 領域において、同定された。すなわち、ペプチドｇｐ１２０−４　（アミノ酸座 標５３〜７４）と、ｇｐ１２０−５　（アミノ酸座標６４〜８９）と、ｇｐ１２ ０−８（アミノ酸座標１００〜１２６）と、ｇｐ１２０−７　（アミノ酸座標２ １８〜２４７）と、ペプチドｇｐ１２０−２１　（アミノ酸座標２６９〜２９５ ）と、それらの重複ペプチドの少なくとも１つが、試験管内Ｔ細胞反応を誘発で きることが示された。しかしながら、ペプチドｇｐ１２０−２１で免疫化された サルの両方を、最後のブースター投与の５ケ月後に再試験したところ、試験管内 での、リコールペプチドに対するＴ細胞反応性を失っていた。すなわち、Ｔ細胞 活性化を誘起できるペプチドすべてが、ＡＩＤＳの治療および予防に用いるのに 適しているわけではない。

驚くべきことに、ペプチドｇｐ１２０−１９は、同系ペプチド（ｃｏｇｎａｔｅ 　ｐｅｐｔｉｄｅ）に対する類人猿ＰＢＭＣの試験管内増殖反応により明らかな ようにＴ細胞免疫原特性をもつことがわかった。さちに、ＯＶＡ接合ペプチドｇ ｐ１２Ｕ−１６で免疫化されたサルからのＰＢＭＣは、試験管内でペプチドｇｐ １２０−１６にさらした後にＩＬ−２を分泌することがわかった。したがって、 ペプチドｇｐｔ２０−１６は、さらなる新規なＴ細胞エピトープを代表する。

試験管内Ｔ細胞活性化特性を備えた２つの新規な領域が同定された。アミノ酸座 標１４１から１９２に対応する、ペプチドｇｐ１２０−１１、ｇｐ１２０−１２ 、ｇｐ１２０−１３は最もすぐれた試験管内増殖反応を誘発し、対応するＯｖＡ 接合ペプチドで免疫化されたサルからのＴ細胞培養において、Ｓｌ値は時とし　 □て２０を越えた。異系交配された母集団からの６匹のサルの６匹ともに、ペプ チドｇｐ１２０−１１、ｇｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１３に反応したという 事実は、類人猿Ｔ細胞によるこの真正のＴ細胞エピトープ領域の認識は厳しいＭ ＭＣ拘束にとられれないことを、強く示すものである。したがって、少なくとも ３つの異なるエピトープが、免疫したサルのＰＢＭＣにより認識された。その１ つはペプチドｇｐ１２０−１１およびｇｐ１２０−１２により共有され、１つは ペプチドｇｐ１２０−１２およびｇｐｌ、２０−１３により共有され、もう１つ のエピトープはペプチド１２０−１３内にある。さらに、ペプチドｇｐ１．２０ −１２およびｇｐ１２０−１３に対する試験管内増殖反応が、ＣＤ２”Ｔ細胞と 、ＣＤ４゛Ｔ細胞の培養において実現され、第２回の免疫化の５か列後になって 開始された。

このことは、その領域内に記憶Ｔヘルパー（ＣＤ４”）細胞活性エピトープが存 在することを示す。

この研究において同定された別の新規な領域は、ペプチドｇｐ１２０−２９およ びｇｐ１２０−３０　（アミノ酸座標３６６から４００）を含み、これは、４匹 のサルのうち３匹においてＴ細胞反応を誘導した。免疫Ｔ細胞によるこの領域の 認識は、やはり、限られたＭＨＣ拘束に支配されるように、すなわち、注型性Ｍ ＨＣ決定基に関連するエピトープを含むようにみうけられる。反応は必ずしも重 複しないので、少なくとも２つのエピトープがこの領域内にあることが予測され る。

重要なことに、ここに同定された新規なＴ細胞活性化領域のうち、３つのペプチ ドが、ＨＩＶ−１に対する中和抗体の産生を生体内で誘発できることがさらに見 出だされた。すなわち、ペプチドｇｐ１２０−１２、ペプチドｇｐ１２０−１６ 、ペプチド１２０−１９で免疫化されたすべてのサルから得られた血清は、試験 管内ＨＩＶ誘導ｐ−２４抗原の解放、および、対応する（ＢＲＵ）分離体［１ｓ ｏｌａｔｅ］のＨＩＶ−１ピリオンにさらされたヒト許容Ｔ細胞株による合胞体 形成を阻害した。さらに、ペプチドｇｐ１２０−１２は、ｇ＋）１２０の部分的 に保存された領域に由来し、中和抗体により認識される部位に関連している。ペ プチドｇｐ１２０−１６は、調べた１４個の異なる分離体すべての内部の、ｇｐ １２０の高度に保存された領域を代表する。ＨＩＶの保存領域から由来したペプ チドの、ＨＩＶ中和抗体の産生を誘発する効率ならびにＴ細胞反応を開始させる 効率は、顕著である。すなわち、ペプチドｇｐ１２０−１２およびｇｐ１２０− １６は、本発明の好ましい実施例である。

ＨＩＶ感染者（７）１０％未満が、ペプチドｇｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１ ５、ｇｐ１２０−１６、ｇｐ１２０−１９を認識することのできる抗体を産生ず る。

抗体はこれらのペプチドでの免疫化に応えて生成されるため、ＨＩＶ陽性者にお いて中和抗体を産生ずるＢ細胞のレパートリ−の増加を導ひくことができる。

蛋白は、多数の抗原決定基やエピトープを含み、これらは、特異的抗体のための 認識および結合部位からなる蛋白の領域である。エピトープは６がら８個のアミ ノ酸の配列を含む。エピトープは、６〜８個のアミノ酸の配列が直線的であると ころの連続型でも、アミノ酸が蛋白の立体的折り返しにより集まっているところ の非連続型でもよい。エピトープが比較的少ない数のアミノ酸しか構成しないと しても、抗体との反応は、エピトープを囲む蛋白内アミノ酸により影響を受ける 。

蛋白の抗原部位やエピトープをマツピングすることを目的とした研究は、問題の 蛋白のさまざまな領域に対応する合成ペプチドを用いることにより助けられてき た。Ｌｅｒｎｅｒ他［免疫学的疾病の生物学：病院実務読本Ｊ（Ｄｉｘｏｎおよ びＦｉｓｈｅｒ編）３３１〜３３８頁（１９８３年）　、Ｌｅｒｎｅｒ、Ａｄｖ 。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、３６・１　（１９８４年）。エピトープのマツピング研究にお ける有用性に加え、合成ペプチドは、蛋白の主要な抗原決定基を包含させれば、 ワクチンや診断用試薬としての可能性を秘めている。Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒ ｔｅｌ、Ａｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ　Ｖｉｒｏｌ、１３７Ｅ：４９７〜 ５２８　（１９８６年）、Ｖａｎ　Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ　ｒ抗原としての合 成ペプチドＪ　Ｂｕ　ｒｏｄｅｎおよびＶａｎ　Ｋｎｉｐｐｅｎｂｕｒｇ編「生 化学および分子生物学における研究技法」第１９巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ｌ５Ｂ ＮＯ−４４４−８０９７４−０（１９８８年）。

合成ペプチドは、特異抗原の産生および反応性に関していくつかの利点をもつ。

合成ペプチドの正確な配列は、蛋白のアミノ酸配列づけにより決定される蛋白の アミノ酸配列や蛋白をコード化するＤＮＡ配列から決定される予測アミノ酸配列 から選択できる。特異的合成ペプチドの使用により、ワクチン接種および抗体の 産生または検定において完全長蛋白の必要はなくなる。さらに、Ｍｅｒｒｉｆｉ ｅｌｄと共同研究者による固相ペプチド合成法により、本質的に無制限の量の合 成ペプチドを化学的に製造することが可能となる。Ｅｒ１ｃｋｓｏｎおよびＭｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄｒ蛋白質」第３版第２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、＝ ニーヨーク、第３章（１９７６年）。自動ペプチド合成器の実用化は、このよう な技術によりさらに前進した。

蛋白の抗原領域を予測するためにさまざまな基準が用いられるが、このような領 域に対応するペプチドは、必ずしもワクチンとして有用ではない。たとえば、ペ プチドが、蛋白と反応する抗体により認識されるべき適切な空間的配位になけれ ば、抗原性は失われる。また、Ｃ型レトロウィルスおよびＨＩＶから由来するペ プチドのい（つかは、ＨＩＶ自身よりももっと強く免疫抑制因子として作用する ことがわかっている。Ｃ１ａｎｃｉｏｌｏ他、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２４：２ ９００−２９０５　（１９８０年）、Ｃ１ａｎｃｉｏｌｏ他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ２３０：４５３−４５５　（１９８５年）。この ようなペプチドは、患者に対して有害な効果をもち、ワクチンとして用いるには 適当ではない。

さらに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２において特に明らかなように、ウィルスの 数多くの血清型すなわち分離体を導くこれら２つのウィルス群の各々には、かな りの遺伝学的変異性がある。このことにより、免疫原の形成に用いるペプチドを 引き出す蛋白の領域を選択する際に、かなりの拘束が課せられる。しかし、ＨＩ Ｖ−１およびＨＩＩ−２蛋白の免疫優勢部分には、比較的不変なものがあること がわかった。合成ペプチドは、天然の分子内の通常は免疫原性をもたない型共通 配列［ｔｙｐｅ　ｃｏｍｍｏｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ］に対して免疫反応を誘発 するという点において、ウィルス性ワクチンに対する重要な鍵でもある。これら の、さもなければ沈黙しているエピトープは、広範な防御特異性をもつ。５ｔｅ ｖａｒｄ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ８：５１−５８　（１９８７年）。い くつかの試験的ワクチンが、ウィルスに接触した恐れのある人々における感染を 防ぐ目的で作成された。Ｂｅｒｍａｎ他「組換えグリコプロティンｇｐ１６０で はなくｇｐ１２０を用いたワクチン接種後のＨＩＶｉによる感染からのチンパン ジーの防護ＪＮａｔｕｒｅ３４５：６２２−６２５　（１９９０年）。

ｇｐ１２０上の多数の中和エピトープが発見され、何人かの研究者により開示さ れた。その総覧については、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、ＡＩＤＳ（１９８９年）３（ ｓｕｐｐｌ　１）：５ｌｌｌ−３１１８を参照されたい。この総覧において、Ｂ ｏｌｏｇｎｅｓｉはアミノ酸座標２５４〜２７４．３０３〜３３７．４５８〜４ ８４．４９１〜５２３をもつ４つの異なるウィルス中和エピトープに言及してい る。アミノ酸領域２５４〜２７４をもつペプチドは、ラビットを免疫化するため に用いられ、生じた抗血清は上述したようにＨＩＶ−１を中和することが見出だ された。Ｈｏ他、Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、２３９：１０２１〜１０２３　（１９８ ８年）。

本発明に包含されるペプチドは、ＨＩＶ特異抗体の産生の誘起に加えて宿主にお ける活性化Ｔ細胞の産生を誘起する少なくとも１つの連続型（直線型）エピトー プを含む、アミノ酸配列からなる。

すなわち、本発明は、Ｍｕｅｓｉｎｇ他［核酸構造およびヒトＡＩＤＳ／リンパ 節病レトロウィルスの発現ＪＮａｔｕｒｅ３１３：４５０〜４５８　（１９８５ 年）に記載されたＨＩＶ−Ｉ　ＨＴＬＶＩ［［−Ｈのエンベロープ遺伝子により コード化されるＨＩＶｇｐ１２０蛋白の領域に対応する免疫原ペプチドを包含す る。

ヌクレオチド配列は、ＨＩＶＰＶ２２の名称でＧｅｎｂａｎｋリリース６３にお いて提供される。本発明はさらに、ペプチドの免疫原特性に重大な影響を及ぼさ ない、ペプチドの機能的等価変異体を包含する。たとえば、アミノ酸残基の保存 的置換、１つまたはいくつかのアミノ酸欠失や追加、アミノ酸残基のアミノ酸類 似体による置換は、いずれも、本発明の範囲内にある。

相同体は、アミノ酸残基を保存的に置換したペプチド、および、異なるＨＩＶ分 離体の対応する領域から由来したペプチドである。互いに保存的に置換できるア ミノ酸には以下のものがあるがこれらに限定されるものではない。グリシン／グ ルタミン、バリン／イソロイイン／ロイシン、アスパラギン／グルタミン、アス パラギン酸／クルラミン酸、セリン／スレオニン、リジン／アルギニン、フェニ ルアラニン／チロシン。相同ペプチドは、下記に示す配列をもつｇｐ１２０−１ ２、ｇｐ１２０−１６、ｇｐ１２０−１９で示されるペプチドを認識する抗体に より認識されるならば、本発明の範囲内にあるものとみなされる。さらに、本発 明のペプチドに対応する相同ペプチドで、異なるＨＩＶ分離体から由来するすべ てのものも、本発明の範囲内に含まれる。

さらに、本発明は、１つ以上のこれらのペプチドのポリマーを含み、ペプチド類 似体や相同体は本発明の範囲内にある。さらに、これらのペプチドよりもアミノ 酸残基は少ないが、これらのペプチドのどれかに存在する１つ以上の免疫原エピ トープを含みしたがって基本ペプチドの免疫原特性を保持するペプチドも、本発 明の範囲内である。

さらに、本発明は、ペプチドの抗原性またはＴ細胞活性化特性に重大な影響を及 ぼさないようなペプチドの機能的等価変異体を含む。たとえば、種々の類似体、 すなわちペプチド疑似体［ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ］が公知であり、ペ プチド内の１つ以」−のアミノ酸を置換するために用いることができる。類似体 は、本発明のペプチドに機能的に等価であり、ただし、天然には発生しない、す なわち１．改変されたアミノ酸残基を含むペプチドとして定義される。さらに、 １つ以上のこれらのペプチドのポリマーも本発明の範囲内である。

ペプチド類似体の使用により、活性が増加し、酵素分解に対する感度が低く、よ り選択性をもつペプチドがもたらされる。好適なプロリン類似体は、天然ペプチ ドの活性を２０倍以−Ｌ増加させることが証明された２−アミノシクロペンタン カルボン酸（βＡｃ’ｃ）である。Ｍ　ｉ　ｅ　ｒ　ｋ　ｅ他「プロリンのペプ チド疑似体として２−アミノシクロペンタンカルボン酸を含むモルフイセブチン 類似体Ｊｌｎｔ、Ｊ、ＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、３５：３５〜４５ （１９９０年）。さらに、Ｐｏｒｔｏｇｈｅｓｅ他［メツセージ−アドレス概念 を用いたペプチド疑似Ｓオピオイドレセプター拮抗物質の設計ｊ　Ｊ、Ｍｅｄ、 Ｃｈｅｍ。

３３　：１７１４−１７２０　（１９９０年）　、Ｇｏｏｄｍａｎ他「ペプチド 疑似体合成、分光法、コンピュータシミュレーションＪ　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ ｓ２６Ｓ２５−８３２　（１９８７年）。

ペプチドは公知の固相ペプチド合成技術を用いて合成された。Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄおよびＢａｒａｎｙｒペプチド・分析、合成、生物学」第１巻、ＧｒｏｓＳ 及びＭｅｉｎｅｎｈｏｆｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク 、第１章（１９８０年）。合成により、さらに、元来の蛋白配列に対応しない１ つ以上のアミノ酸を、ペプチドのアミノあるいはカルボキシル末端に付は加える ことが可能となる。このような付加アミノ酸は、ペプチドを別のペプチドや、大 型担体蛋白や、固相支持体に結合するために有用である。これらの目的に有用な アミノ酸には、チロシン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システィン 、これらの誘導体があるが、これらに限定されるものではない。たとえば、ＮＨ ２アセチル化やＣ０ＯＨ末端アミド化など、さらなる蛋白改変技術を用いて、ペ プチドを別の蛋白やペプチド分子や支持体に結合するためのさらなる手段を提供 することができる。ペプチドを互いに、あるいは担体蛋白や固相支持体に結合す るための処理法は、公知である。したがって、カルボキシまたはアミノ末端にお いて担体または固相支持体に離合される上述の付加アミノ酸残基を含むペプチド は、本発明の範囲内にある。本発明のペプチドに対する言及は、ここに論じられ るすべての実施例を包含する。

ワクチン製造の別の方法は、分子生物学技術を用いて、本発明の１つ以上のペプ チドと高度に免疫原性の蛋白を含む融合蛋白を生成することである。たとえば、 問題の抗原とコレラ毒素のＢサブユニットを含む融合蛋白が、問題の抗原に対す る免疫反応を誘発することが証明されている。３ａｎｃｈｅｚ他［ワクチン開発 の基礎としての、コレラ菌（ビブリオ・コレラ）におけるコレラ毒素Ｂサブユニ ットの過剰発現のための組換えシステムＪ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６　：　４８１〜４８５　（１９８９年）。したがって、本発 明において、コレラ毒素のような担体蛋白に融合されるＢおよびＴ細胞エピトー プの適切な構造にもとづくワクチン構造体は、ワクチン接種において重要な効果 を示すであろうことはいうまでもない。

新規なペプチドアミノ酸配列を、下記および表２に示す。アミノ酸残基は、Ｋ６ ｎｎｅｄｙ他（１９８６年）によりすでに開示されたヌクレオチド配列から取り 出される。ペプチドはそのカルボキシ末端にアミドまたはカルボキシ基のいずれ かを含む。

ｇｐ１２０−１１ Ｘ−８ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌ ｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−８ｅｒ−Ｐｈ ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｙ−Ｚｇｐ１２０−１２ Ｘ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｕ−１ｌ　ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｒ＋−Ｃｙｓ−Ｓｅ　ｒ−Ｐ ｈｅ　−Ａｓｎ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｙ　ｓ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｔｙ　ｒ　−Ａ　 ｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ　−Ｙ−Ｚｇｐ１２０−１３ Ｘ−１１ｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｖａ　１−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔ ｙｒ−Ａｌ　ａ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｉ　Ｉｅ −１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｔ　ｌ　ｅ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔ＋〕ｒ−Ｔｈｒ− ８ｅ　ｒ　−Ｔｈ　ｒ−Ｔｈ　ｒ　−Ｙ−Ｚ ｇｐ１２０−１６ Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ− Ｐｒｏ−１ｌ　ｅ−Ｈｉ　５−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌ ｙ−Ｐｈｅ−Ａｌ　ａ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｙ −Ｚｇｐ１２０−１９ Ｘ−Ｔｈｒ−Ｈｉ　５−Ｇｌ　ｙ−１ｌ　ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａ　ｌ　−Ｖ ａ　Ｉ　−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ −Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｙ−Ｚｇｐ１２ｃｌ−２ ９ Ｘ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−１ｌ　ｅ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ−Ｈｉ　 ｓ　−８ｅ　ｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｕ−Ｐ ｈｅ−Ｐｈｅ　−Ｔｙ　ｒ−Ｃｙ　５−Ａｓ　ｎ−３ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇ　 ｌ　ｎ　−Ｙ−Ｚｇｐ１２０−３０ Ｘ−Ｃｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａ ｓｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔ ｒｐ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−８ｅ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｙ−Ｚここで、Ｘは、ペプ チドのアミン末端Ｎ　Ｈ２基の水素分子あるいはペプチドの担体への結合を促進 するために選択される付加アミノ酸である。Ｙは無しあるいはＣｙｓである。Ｚ はカルボキシ末端アミノ酸のカルボキシル基もしくはアミド基である。用いられ ているアミノ酸略称を表２に示す。

Ｔ細胞活性化の誘起に加え、これらのペプチドのいくつかは、ＨＩＶによる将来 の感染を防御するため、あるいは、すてにＨＩＶに感染した検体におけるＨＩＶ に対する免疫反応を高めるためのワクチンとして有用である。いかなるヒト検体 にもペプチドを用いてワクチン接種できるが、もつとも適切な検体はＨＩＶ感染 の危険がある人々である。このような被験者には、同性愛者、売春婦、薬物静脈 注射常用者、血友病者、患者や生物学的標本に接触する医療従事者が含まれるが 、これらに限定されるものではない。本発明は、さらに、これらのペプチドを特 異的に認識するモノクローナルおよびポリクローナル抗体を提供する。本発明は 、さらに、ＨＩＶを中和するペプチドを用いたワクチン接種に応答して産生され る抗体を提供する。

本発明の好ましい実施例において、ペプチドは免疫原として用いられる組成に構 成される。これらの免疫原はヒトを含む哺乳類におけるワクチンとして、あるい は、動物におけるＴ細胞活性化および／またはポリクローナルおよびモノクロー ナル抗体の産生を誘起するために用いることができる。このような組成を構成す るため、Ｔ細胞活性化を誘起するのに充分な量（約１〜５００μｇ）の少なくと も１゛つのペプチドを、ヒトを含む哺乳類への投与に適した生理的受容可能な担 体に混合する。

ペプチドは、互いに、または、他のペプチドや蛋白担体やその他の担体に共有結 合で接合され、リポソームその他のベシクルに組み込まれ、および／またはワ　 □クチン技術において知られるようにアジュバントや吸着剤と混合される。たと えば、１つあるいは複数のペプチドは、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他「精製したＨＩＶ −１エンベロープ蛋白およびｌＳＣ０Ｍ５を用いた免疫化によるＣＤ８＋細胞障 害性Ｔ細胞の誘導ＪＮａｔｕｒｅ３４４：８７３〜８７５　（１９９０年）に開 示されるとおり、免疫刺激性複合体に混合することができる。あるいは、ペプチ ドは、結合されずに、単に、通常の食塩水などの生理的許容可能な担体やヒトを 含む哺乳類に投与するのに適した緩衝化合物と混合される。

抗体を誘起するすべての免疫原組成物についてと同様に、本発明のペプチドの免 疫原として有効な量は、経験的に決定されなければならない。考慮されるべき因 子には、天然ペプチドの免疫原性、ペプチドがアジュバントや担体蛋白やその他 の担体に複合すなわち共有結合で接合されるかどうか、静脈注射、筋肉注射、皮 下注射などの組成物の投与経路、免疫化投与回数が含まれる。このような因子は ワクチン技術において公知であり、余分な実験を行なうことなくこのような決定 をなすことは免疫学者の技術範晴である。

以下の具体例により本発明をさらに説明するが、これらは決して本発明の範囲を 狭めるものではない。Ｔ細胞活性化を判定するために、ＯＶＡ接合ｉ−ｉｒｖｌ −１ｒｖペプチドで免疫化したサルからのＰＢＭＣについて、試験管内でリコー ル（免疫化）、重複、非重複ペプチドにさらした場合にＩＬ−２を産生および／ または増殖する能力の試験を行なった。

塞施伝１ ｐ　の　におい　い゛ サイノモルガス［Ｃｙｎｏｍｏ　ｌ　ｇｕｓ］サル（Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉ ｃｕｌａｒｉｓ）に、３週問おきに、オボアルブミン（ＯＶＡ）接合ペプチド（ 下記参照）の皮下注射による投与を３回行なった。各投与は、フロイント完全（ 第１投与）あるいは不完全（ブースター投与）アジュバントに乳化した１００μ ｇのオボアルブミン結合ペプチドからなる。

尖施雌呈 ベズ天上合成 付加カルボキシ末端システィン残基を備えた、４０　ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプ チド（表１）が、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製４３０Ａペプチド合 成器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシ ティ）を使用して、ｐメチルベンズヒドリルアミンポリマー樹脂（Ｐｅｐｔｉｄ ｅｓ　Ｉｎｔ、、アメリカ合衆国ルイビル）を固相として用い、固相上で合成さ れた。

合成に用いた全てのアミノ酸は、α−ＮＨ２基を保護するｔ−ブチルカルボニル 基（ｔ−Ｂｏｃ）を含み、スイスのＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ　ＡＧから入手した 。

反応側鎖基をもつアミノ酸は、所望しない本章な側鎖の連鎖反応を防ぐための追 加保護基を含んでいた。これらのペプチドすべてを合成するのに用いた、保護さ れたアミノ酸の各々を表１に記載する。

表土 ペプチ゛ム　こ　いた　ミ Ｂｏｃ−Ａｌａ−Ｏｈ Ｂｏｃ−Ａｒｇ　（Ｔｏｓ）−ＯＨ Ｂｏ　ｃ−Ａｓ　ｎ　−０Ｈ Ｂｏｃ−Ａｓｐ　（Ｏｂｚ　ｌ）　−０ＨＢｏａ−Ｃｙｓ　（Ｐｍｅｏｂｚ　１ ）−ＯＨＢｏｃ−Ｇｌｕ　（Ｏｂｚｌ）−ＯＨ Ｂｏｃ−Ｇｉｎ−ＯＨ Ｂｏ　ｃ　−Ｇ　ｌ　ｙ　−０Ｈ Ｂｏｃ−Ｈｉ　ｓ−（Ｔｏｓ）−ＯＨ Ｂｏｃ　Ｉ　ｌｅ　０Ｈ−１／２　Ｈ２０Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ”Ｈ２Ｏ Ｂｏｃ−Ｌｙｓ　（２−ＣＩ−Ｚ）−ＯＨ（ｃｒｙｓｔ、）Ｂ　ｏ　ｃ　−Ｍｅ 　ｔ　−０Ｈ Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ Ｂｏ　ｃ−Ｐ　ｒ　ｏ−０Ｈ Ｂｏｃ−８ｅｒ　（Ｂｚｌ）−ＯＨ−ＤＣＨＡＢｏｃ−Ｔｈ　ｒ　（Ｂｚ　１） −ＯＨＢｏｃ−Ｔｒｐ　（Ｆｏｒｍｙり−０ＨＢｏｃ−Ｔｙｒ　（２−Ｂｒ−Ｚ ）−ＯＨＢｏｃ−Ｖａｔ　−０Ｈ Ｔｏｓ　トンル（Ｔｏｓｙｌ）またはｐ−トルエンスルホン酸０ｂｚｌ−ベンジ ルオキシ Ｐｍｅｏｂｚｌ＝ｐ−メチルベンジルオキシ２−ＣＩ　−Ｚ＝塩化カルボベンゾ キシ２−Ｂｒ−Ｚ＝臭化カルボベンゾキシ ペプチドは、製造者により示唆されるとおり、ｔ−Ｂｏａ合成プロトコルを用い て合成された。すべての溶剤はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから、使 用した側鎖保護アミノ酸はＮｏｖａ　Ｂｉｏｃｈｅｍ（スイス）およびＡｐｐｌ ｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。各アミノ酸の結合につづき、試料 をとり、ニンヒドリン定量検定を実施した。結合された各アミノ酸に対して結合 効率が９９％を越えた場合のみに、ペプチドをさらなる処理に進めることが許さ れた。完成したペプチドを固相から分離し、アニソールおよびエタンジチオール （Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）をスカベンジャーとして用いる酸性加水分解によりアミ ノ酸側鎖の脱保護化を行なった。

合成の完了後、合成されたペプチドから保護基を取り除き、Ｂｅｒｇｏｔ他「固 相ペプチド合成における分割試薬としてのトリフルオロメタンスルホン酸の有用 性ｊＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ。

Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、第１６号、１９８６年９月２日発行 に記載された方法にしたがって、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ） を用いた処理により、固相支持体樹脂からペプチドを切断した。以下に、用いら れたプロトコルの詳細を記す。

１　ペプチド−樹脂１グラムに対して、チオアニソールと１．　２−エタン−ジ チオール（２：　１）３ｍｌをスカベンジ剤として添加し、混合物を室温で１０ 分間、連続的に攪拌しながらインキュベートした。

２、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）ｌＯｍｌを添加し、室温で１０分間にわたり連 続的に攪拌した。

３　強く攪拌しながら、ＴＦＭＳＡｌｍｌを滴下して添加し、室温で２５分間に わたり反応させた。

４、分離につづいて、ペプチドを無水エーテルを用いて沈殿させ洗浄した。

５、沈殿洗浄されたペプチドを少量のＴＦＡに溶解した。

６、溶解されたペプチドを再び工程４に述べたように沈殿洗浄し、沈殿物をＮ２ 流のもとで乾燥させた。

検定に用いる前に、所望に応じ、逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ） により、ペプチドをさらに精製してもよい。このような精製に特に適したカラム としては、水（ＴＦＡ）−アセトニトリル（ＴＦＡ）勾配を用いてペプチドを溶 出する逆相Ｖｙｄａｋ　（登録商標）がある。表２に示すアミノ酸配列をもつ４ ０個のペプチドを合成した。

アミノ酸長さ１７〜１９で、半分は互いに重なり、全体としてｇｐ−１２０を包 含した、ペプチドのアミノ酸配列が、ＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵ分離体から得られた。

Ｍｕｅｓｉｎｇ他「核酸構造とヒトＡＩＤＳ／リンパ節病レトロウィルスの発現 ＪＮａｔｕｒｅ３１３：４５０　（１９８５年）。

（以下余白） ネ＊Ｋｅｎｎｃｄｙ他によりすでに説明されている（１９８（ｉ年）。

太施皿旦 のこ　のぺ　′の Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ） （Ｐｈａ　ｒｍａｃ　ｉ　ａ、スエーデン国つプサラ）を二機能性リンカ−とし て用い、下記に要約するところの製造者（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）の指 示にしたがって、本発明によるペプチドを、オボアルブミングレードＶ　（Ｓ　 ｉ　ｇｍａ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）に、はぼ１０：１（ペプ チド：オボアルブミン）のモル比で、共有結合で連結した。

オボアルブミンを結合緩衝液（０，２ＭのＮ　ａ　Ｈ２Ｐ　０４、Ｐｈ８．５） に溶解した。つぎに、溶解されたオボアルブミンを、同じ緩衝液を用いてＳｅｐ ｈａｄｅｘＧ−２５Ｍカラム（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ、　７．エーデン ）を通過させた。蛋白濃度を２８０ｎｍで測定し、回収を判定した。５ＰＤＰを 、最終濃度４０ｍＭになるまで、９９．５％エタノールに溶解した。つぎに、攪 拌しながら、オボアルブミン溶液に５ＰＤＰを滴下して添加した。つぎに、５Ｐ ＤＰ−オボアルブミン混合物を室温で約３０分間放置した。水を溶出剤として用 い、混合物をＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５Ｍカラムを通過させることにより、オボ アルブミンー５ＰＤＰ接合体を非接合５ＰＤＰから分離した。オボアルブミンー ５ＰＤＰ接合の置換度は、ペプチド溶液に添加すべき量を決定するために、接合 体５０μｍを水２ｍｌで希釈した後に、希釈された接合体を２８０ｎｍで、およ び、希釈された接合体にジチオトレイトール（ＤＴＴ）　（′ｓｉ　ｇｍａ）１ ００　μＩを添加して一８４３０ｍで測定することにより、決定された。

最後に、オボアルブミンー５ＰＤＰ接合体に結合すべき合成ペプチドを１０％酢 酸に溶解し、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとした。適当な量（上記の置換度により決定 される）のオボアルブミンー５ＰＤＰ接合体を添加し、室温で一晩静置した。

尖施偲土 免疫化ズ旦土ユ匹 Ｍ、ファクシキュラリス（Ｍ、ｆａｃｓｉｃｕｌａｒｉｓ）が抗体の産生に用い られた。最初のペプチド注射の前に、血液試料をサルから採取した。この最初の 血液試料を「免疫前」　（表５〜８）と呼び、内部対照として用い、各免疫血清 と同じく分析する。

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．５ｍｌに懸濁したペプチド−８ＰＤＰ−オ ボアルブミン１００μｇをサルに注射した。３週問おきに３回の筋肉注射により サルを免疫化した。アジュバントとしては、最初の免疫化全部についてはフロイ ント完全アジュバント０．５ｍｌを用い、ブースター注射についてはフロイント 不完全アジュバントを用いた。最終の免疫化から２週間後、窩［ｆｏｓｓａ］か ら血液試料１０ｍ１を取り出すことによりサルから採血し、免疫前および超免疫 ［ｈｙｐｅ　ｒ　ｉｍｍｕｎｅ］血清について実施例９に述べる中和検定を実施 した。

尖施偲旦 たＭ、フ　シ　−１スか゛の １ンパ　のＩ　′ 第２回および／または第３回の注射から少なくとも２週間後、ヘパリン処理した 静脈血を大腿静脈から採取した。末梢血単核細胞（、ＰＢＭＣ）は、以下の方法 にしたがって、ゼラチン沈降と濃度勾配遠心分離により得られた。ハンクス平衡 食塩溶液中にゼラチン（ゼラチンＬ９３６、ＰＢ　Ｇｅ１ａｔｉｎｓ　ＵＫ　Ｌ ＴＤ、イギリス）３％（重量／容積）を溶解した溶液を血液と１：３の割合で混 合し、３７℃で１時間にわたり赤血球を沈降させた。赤血球を除いた上澄み液を フィコール−ハイベーククッション層（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ１スエー デン）上に重層し、２０℃において１５分間２３０Ｘｇで遠心分離した。等張リ ン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ＮａＣＩ　Ｏ，１５Ｍ中にリン酸緩衝剤０．ＯＩＭ、 ｐＨ７，４）を用いて遠心分離（５００ｘ　ｇ、　２０℃、５分間）を行なうこ とによりインターフェースＰＢＭＣを２回洗浄した。

以下に示す実施例のいくつかにおいて、Ｋａｐ　Ｉ　ａｎおよびＣ１ａｒｃ　「 ヒトＴリンパ球の検出のためのロゼツト検定の改良Ｊ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１． 　Ｍｅ　ｔ。

６　：１３１　（１９７４年）に記載されているように、ＡＥＴ処理ヒツジ赤血 球細胞を用いたロゼツト化によりＴ細胞を富化し、つづいて、フイコールーハイ ペ−り層上で濃度遠心分離を行なった。ロゼツト化細胞（名目的［ｎｏｍｉｎａ ｌ］Ｔ細胞）をペレットから収集し、蒸留水で２０秒間再懸濁してヒツジ赤血球 細胞を溶解する。製造者の指示にしたがって、モノクローナル抗ＣＤ８抗体（Ｄ ｙｎａｌ　ＡＳ、ノルウェー）で被覆した微小球を用いたＣＤ８”Ｔ細胞の常磁 性消耗［ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ］により、ＣＤ４’Ｔ 細胞へのさらなる富化を達成した。

実施何旦 ユ２ビ球増殖検定 非分画ＰＢＭＣを、完全培地（下記参照）中に再懸濁し、丸底９６八マイクロウ エルプレート（’Ｎｕｎｃ、デンマーク）内に、ウシ胎児血清（ＦＣＳ、　Ｂ　 ｉ　。

ｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）１０％、Ｌ−グルタミン （Ｇｉｂｃｏ、イギリス）３．ｃｚｇ／ｍｌ、ゲンタマイシン硫酸塩（Ｅｓｓｅ ｘＬａｋｅｍｅｄｅｌ　ＡＢ、スエーデン）Ｏ，１ｍｇ／ｍｌを補なったＩｓｃ 。

ｖｅ培地中において３通りの異なる細胞濃度（ウェル当り細胞数２Ｘ１０’、１ ×１０６．５　Ｘ　１０’）で分散した。付属細胞［ａｃｃｅｓｓｏｒｙ　ｃｅ ｌｌｓ］の源として、４Ｘ１０’　ｔ−２Ｘ１０’　の　Ｔ　昭−２５００ｒａ ｄ　ＰＢＭＣこ、分画Ｔ細胞（名目的Ｔ細胞２Ｘ１０’または１．２×１０５個 、あるいはＣＤ４’Ｔ細胞４Ｘ１０’個）をウェルの別の組に分散させた。合成 ペプチドをジメチルスルホキシド（２０μｇ／ｍｌ）に溶解し、さらに培養培地 で希釈した。結合されていないペプチドを、異なる濃度（１０，１，０、ｌμｇ ／ｍ１）で培養ウェルに添加した。

コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）（１０μｇ／ｍｌ）を、陽性対照として別々の 培養に添加した。最終容積０．２ｍｌの細胞を、ＣＯ２７，５％の湿潤雰囲気内 で３７℃で５日間培養した。４日後、培養上澄液２５μｍを各ウェルから採取し 、実施例５で説明する方法によりＩＬ−２活性の検定を行なうまで、−７０℃で 凍結した。培養期間の終了の１６時間前に、［３Ｈ］チミジン（Ａｍｅ　ｒ　ｓ 　ｈ　ａｍ。

イギリス）１μＣｉを含む培養培地２０μｍを各ウェルに添加した。細胞を集め 、つづいて放射能の取込を、アルゴン活性化β−シンチレーションカウンタ（Ｉ ｎｏｔｅｃｈ、スイス）に連結された自動フィルター細胞採集器上で測定した。

データは、相加平均刺激指標（Ｓｌ）として表される。後者のＳｉは、ペプチド 刺激培養に取り込まれた［’Ｈ］−チミジンの平均比率として定義される（対照 培養（非刺激）の対応する３連で分けられた３つの培養の平均）。平均Ｓｌ値２ ．４以上が陽性とみなされる。少なくとも２．４に等しいＳｉ値（すなわち、無 関係なペプチドにさらされた複製培養のＳＤの３．３倍をプラスした平均値の合 計の２倍（信頼区間、ｐ＜０．００１、スチューデントを検定））は、かなり増 加したものとみとめられた。

図１に示されるように、ＯＶＡ置換形式でサルに注射されたペプチドのかなりの 数（１８／４０）が、対応する免疫動物からのＰＢＭＣの試験管内増殖を誘発し た。図１において、結果は、％ＳＤを試験されたすべての３連の平均ＳＩ＋ＳＤ として示されている（２匹のサルにおいて試験した場合）。黒い棒は陽性の結果 を示す。反応したサルの出現頻度が示されている。２〜３個の重複ペプチドの付 加配列に対応する４つの主要な領域が、この活性を含むものと判定された。ペプ チドｇｐ１２０−１１、ｇｐ１２０〜１２、ｇｐ１２０−１３　（アミノ酸座標 １４１〜１９２）はそのような領域の１つに対応する。これら３つのペプチドの １つで免疫化した６匹のサルのうち５匹が、リコールペプチドに反応した。別の 主要な領域は、ペプチドｇｐ１２０−２３、ｇｐ１２０−２４、ｇｐ１２０−２ ５（アミノ酸座標２９５〜３４３）からなり、これらは、対応するペプチドで免 疫化した２匹のサルの少なくとも１匹からＰＢＭＣの増殖反応を誘発した。第３ の領域は、ペプチドｇｐ１２０−２９およびｇｐ１２０−３０からなり、対応す るＯＶＡ接合ペプチドで免疫化したサルからのＰＢＭＣに対する増殖誘発活性の 部位（２）を含む。第４の領域は、ペプチドｇｐ１２０−３３、ｇｐ１２０−３ ４、ｇｐ１２０−３５、ｇｐ１２０−３６　（アミノ酸座標４０９〜４６６）か らなり、ここで、各ペプチドは免疫されたサルの少なくとも１匹からのＰＢＭＣ の増殖を誘発することができた。

これらの主要領域とは別に、５つのペプチドすなわちペプチドｇｐ１２０−４（ アミノ酸座標５３〜７４）、ｇｐ１２０−５　（アミノ酸座標６４〜８９）、ｇ ｐ１２０−１７　（アミノ酸座標２１８〜２４７）、ｇｐ１２０−２１　（アミ ノ酸座標２６９〜２９５）は、対応するＯＶＡ接合ペプチドで免疫化したサルか らのＰＢＭＣに添加したときに、試験管内増殖反応を誘発することが判明した。

対応するＯＶＡ接合ペプチドで免疫化したサルからのＰＢＭＣの増殖反応を誘発 できることが判明したペプチドは、非同系ＯＶＡ結合ペプチドで免疫化した少な くとも３匹の他のサルからのＰＢＭＣについての再検定にかけられた。ペプチド ｇｐ１２０−４、ｇｐ１２０−１３、ｇｐ１２０−３４は３匹のサルのうち１匹 から、ペプチドｇｐ１２０−３０は７匹のうち１匹のサルにおいて、Ｐ　ＢＭＣ の増殖を誘発した（Ｓｌは２．０と２５の間）。その他のペプチドでは顕著な増 殖反応を誘発することはなかった。

ｌまたは２匹の免疫サルにおいて増殖反応を誘発することのできたペプチドは、 第３回の免疫化の後、再試験された。この機会に、免疫ペプチドと半分重複する 配列を含む２つのペプチドの各々に対する、免疫サルからのＰＢＭＣの試験管内 増殖反応についても、評価を行なった。

図２に示されるように、ＯＶＡ接合ペプチドｇｐ１２０−１１で免疫化された両 方のサルからのＰＢＭＣは、やはり、試験管内でペプチドｇｐ１２０−１２に反 応した。しかし、ペプチドｇｐ１２０−１２で免疫化されたサルは一匹も、ペプ チドｇｐ１２０−１１に反応しなかった。第３回の免疫化の２週間後、細胞を採 取した。試験されたペプチドは、２回の免疫化の後の免疫ペプチドに対する試験 管内応答性に基づいて選択された。図２において、結果は％ＳＤを試験されたす べての３連の平均ＳＩとして表されている（２匹のサルについて試験ｔ７た場合 ）。

点棒は陽性結果を示している。

同様に、ペプチドｇｐ１２０−１２で免疫したサルは、ペプチドｇｐ１２０−１ ３に反応した。しかしペプチドｇｐ１２０−１３で免疫を与えたサルは一匹も、 ペプチドｇ＋）１２０−１２に反応しなかった。試験管内増殖活性の次の領域、 すなわちペプチドｇｐ１２０−２３、ｇｐ１２０−２４、ｇｐ１２０−２５にお いて、重複ペプチドはひとつとして、ＯＶＡ接合ペプチドで免疫を与えたサルか らのＰＢＭＣの試験管内増殖を誘発しなかった。ペプチドｇｐ１２０−２９およ びｇｐ１２０−３０　（ＯＶＡ接合）で免疫を与えたサルからのＰＢＭＣについ ても、重複ペプチドに対する反応がなかったので、同じことである。ペプチドｇ ｐ１２０−３３、ｇｐ１２０−３４、ｇｐ１２０−３５からなる領域において、 重複ペプチドのいずれも、ＯＶＡ接合ペプチドで免疫を与えたサルからのＰＢＭ Ｃの試験管内増殖を誘発しなかった。他のサルからのＰＢＭＣはこの点において やはり陰性であった。同定された他のエピトープのうち、ペプチドｇｐ　ｌ　２ ０−４で免疫したサルからのＰＢＭＣだけが、重複ペプチドすなわちペプチドｇ ｐ１２０−５に対して試験管内で反応した。

２匹のサル（ペプチドｇｐ１２０−１２またはペプチドｇｐ１２０−１３で免疫 した）からの異なる細胞分画の増殖反応について調べた。表３に示すように、免 疫された（しかし結合していない）ペプチドの存在において培養したときの、両 方のサルから得られたＰＢＭＣの増殖反応は、ＣＤ２’細胞の富化により増加し た。また、重複ペプチドに対する既存の反応は比較的一定に保たれた。ＣＤ８’ Ｔ細胞のさらなる消耗ののち、ＣＤ４’Ｔ細胞を富化した分画（元来のＣＤ２’ Ｔ細胞分画９〜１８％を含む）は、免疫化ペプチドを用いたインキュベーション に応えてなおも増殖した。しかしながら、ペプチドｇｐ１２０−１２で免疫した サルからのＣＤ４’Ｔ細胞を富化した分画は、重複ペプチドのいずれに対しても 増殖し表３において、各欄は次のようにして得られた。

免疫化ペプチド　ＯＶＡ接合ペプチド１００μｇが、フロイント完全（第１回投 与）または不完全（ブースター投与）アジュバントにおいて３回にわたり免疫化 された。

試験管内ペプチド・非接合ペプチド 総ＰＢＭＣ：異なる細胞密度およびペプチド濃度の４つの３連の平均５ＩＣＤ２ ”富化分画：２Ｘ１０’個の５ＲＢＣ−ロゼツト化ＰＢＭＣが、４×１０４個の 照射非ロゼツト細胞で、ペプチド１０μｇ／ｍｌとともに、インキュベートされ た。

ＣＤ４’富化分画：抗ＣＤ８’被覆ビーズでインキュベートすることにより、さ らにＣＤ４’Ｔ細胞内において富化された、１．２５ｘｌＯ’個（ペプチドｇｐ １２０−１２で免疫化されたサル）あるいは４　Ｘ　１０’個（ペプチドｇｐ１ ２０−１３で免疫化されたサル）の５ＲＢＣ−ロゼツト化ＰＢＭＣが、２Ｘ１０ ’個の照射非ロゼツト細胞で、ペプチド１０μｇ／ｍＩとともに、インキュベー トされた。

Ｇ１１ｌｉｓ他［Ｔ細胞成長因子：成長パラメータおよび活性の定量マイクロ検 定Ｊ　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２０：２０２７　（１９７８）に記載されている ように生物学的検定を実施することにより、個々の細胞微小培養のＩＬ−２含有 量を判定した。簡単にいえば、上澄み液を、１０４個のＣＴＬＬ−２細胞に１＝ ４の最終希釈度で添加した。平底９６穴マイクロウエルプレート（Ｎｕｎｃ、デ ンマーク）内で、ＦＣＳＩＯ％、Ｌ−グルタミン３μｇ／ｍＬゲンタマイシン硫 酸塩０．１ｍｇ／ｍｌ、β−メルカプトエタノール５ｘｌＯ−’Ｍを補なったｌ ５ｃｏｖｅ培地中で、３７℃で２４時間にわたり細胞をインキュベートした。培 養期間の終ｒの６時間前に、［３Ｈ］−チミジンｌμＣｉを添加した。細胞が採 集され、実施例４で説明したようにビＨ］−チミジン取り込みを判定した。上澄 み中の１Ｌ−２含有量は、既知量の組換えヒトＩＬ−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ、マサ チューセッツ州ホストン）の存在のもとでＣＴＬＬ−２細胞を培養することによ り作成された投与−反応（ドーズ・レスポンス）標準曲線からの推定により、決 定された。

表４に示されるように、いくつかの細胞培養上澄み液は、ＯＶＡ接合ペプチドｇ ｐ１２０−１１Ｓｇｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１３、ｇｐ１２０−１６、ｇ ｐ１２０−２１．ｇｐ１２０−２５、ｇｐ１２０−３０、ｇｐ１２０−３４で免 疫化されたサルからのＰＢＭＣの培養中に、検出可能な量のＩＬ−２を含んでい た。対応する非接合ペプチドを用いた試験管内チャレンジの後、分泌されたＩＬ −Ｓを検出することができた。試験管内培養の４日後にみとめられた分泌ＩＬ− ２の割合は、０２から１．００／ｍｌの範囲であった。ペプチドｇｐ１２０−１ １．ｇｐ１２０−１２、ｇｐ１２０−１３、ｇｐ１２０−３０、ｇｐ１２０−３ ４で免疫化されたサルから取り出されたＰＢＭＣの細胞培養上澄み液は、試験管 内で１つまたは２つの重複ペプチドにさらした後、やはり、ＩＬ−２を含んでい た。したがって、ペプチドｇｐ１２０−１１で免疫化したサルからのＰＢＭＣは 、ペプチドｇｐ１２０−１２での刺激の４日後に、検出可能なレベルのＩＬ−２ を細胞上澄み液内で分泌した。そして、ペプチドｇｐ１２０−１２で免疫化した サルからのＰＢＭＣは、ペプチドｇｐ１２０−１．３での刺激の後、検出可能な レベルのＩＬ−２を分泌した。ＩＬ−２を含む細胞培養上澄み液は、重複ペプチ ド（ペプチドｇｐ１２０−１２およびｇｐ１２０−１４）を、ペプチドｇｌ）１ ２０−１３で免疫化したサルからのＰＢＭＣとともに含む、両方のＰＢＭＣ培養 から、同定された。同じことが、ペプチドｇｐ１２０−３４で免疫化したサルか らのＰＭＢＣと共培養した場合のペプチドｇｐ１２０−３３およびｇｐ１２０− ３５についても成り立つ。最後に、ペプチドｇｐ１２０−３０で免疫化したサル から得られたＰＢＭＣは、ペプチドｇｐ１２０−３０の存在において培養したと きのみならず、ペプチドｇｐ１２０−２９を培養に添力１ルたときにも、検出可 能な鼠のＩＬ−２を分泌した。

（以下余白） 去施刈旦 ゛　ルスス　・・ すべての中和試験は、Ｈ−９細胞およびＨＴＬＶ−ＢＩＢウィルス（Ｒ，Ｃ，Ｇ ａ１ｌｏからのもので、ニューヨーク州マンハセットのノースショア病院のＷｉ ｌ　１　ｉａｍ　Ｈａｌ　ｌ博士により供給された）を用いて実施された。）（ −９細胞（Ｈ９ＮＹとして示される）を、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）２０％と、ペ ニシリン／ストレプトマイシン（ＰＥＮ／５ＴＲＥＰ各５０μｇ／ｍｌ各段０μ 剤は含まず）を補なったＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）内に保持した。細胞は、４ 日おきに１＝３希釈で、継代培養された。

細胞をプレートからかき取り、３２５Ｘｇの遠心分離によりペレット化した。

ペレット化された細胞を、前もって１／ｌＯに希釈した株ウィルス１ｍｌ中に再 懸濁し、頻繁に攪拌しながら３７℃で６０分間にわたり吸着を行なった。ウィル スの吸着ののち、細胞を再遠心分離し、ＦＣ３２０％およびポリブレン（２μｇ ／ｍ１）を含むＲＰＭ１１０ｍｌ中に再懸濁しく５　ｘ　１０’細胞／ｍｌの最 終濃度に）、５％Ｃ０２中において３７℃でインキュベートした。

感染された細胞は、合胞体形成、免疫蛍光検査における陽性細胞、ｐ−２４産生 （Ａｂｂｏ　ｔ　ｔ　ｐ−２４抗原試験により検定される）を検査することによ り、感染後（ｐ、ｉ、）４〜５日目に検出可能であることが判明した。ＨＩＶ産 生のピークは、ｐ、ｉ、］ｏ〜１５日目にみられ、このとき、ウィルスを採取し た。

破砕物を除くための低速遠心分離の後、感染細胞から採取したウィルスを含む上 澄み液を、−９０℃でストックとして凍結した。５０％培養細胞感染量（ＴＣＩ Ｄ　ｓ　ｏ　）として終点タイター４０，０００の値をもつ１つのウィルススト ックが研究を通じて用いられた（ＮＴ３〜ＮＴ１９と呼ぶ）。

尖施拠旦 旦１■二上土租挾定 ＨＴＬＶＩＩ［−Ｂ感染能を中和する抗体を含む血清は、ＨＩＶ−１合胞体形成 を防ぐ能力、ｐ−２４抗原形成、免疫蛍光マーカーにより判定される感染細胞数 の減少により検出され、ペプチド特異抗血清を欠（対照感染と比較された。実施 例８で述べたストックウィルスを、ＴＣＩ　Ｄｉ。の値が１００になるまで希釈 し、実施例４に述べたように免疫化されたサルから得られた、連続４倍希釈（１ １５，１／２０．１／８０）の補体不活性免疫血清と混合した。陽性対照として 、既知のＨＩＶ中和タイターｌ／４０〜ｌ／１８０をもつモルモット超免疫血清 （ＭＳＶと呼ぶ）がすべての実験に加えられた（Ｂ、Ｍｏｒｅｉｎ教授の提供に よる、ＢＭＣ獣医学ウィルス部門、スエーデン国つプサラ）。３７℃で６０分間 または４℃で１６時間にわたるインキュベーションの後、血清−ウィルス混合体 を、１×１０６個のＨ−９細胞に添加し、さらに３７℃で６０分間インキュベー トした。

インキュベーションに続き、細胞を一度洗浄し、２４穴多皿プレート内に、各ウ ェルごとに成長培地（ＲＰＭＩ、ＰＣ３ＩＯ％、ポリブレン２．ＣＺｇ／ｍｌ） ２ｍｌを入れた中に置いた。

ｐ、ｉ、５〜１２日について、顕微鏡（倍率ｘ２００）下で、合胞体の存在につ いて細胞を検査した。製造者の指示（Ａｂｂｏｔｔ　ａｇ　ｔｅｓｔ　ＨＩＶＡ Ｇ−１（登録商標）、ヒト血清または血漿におけるヒト免疫不全ウィルスｌ型（ ＨＩＶ−１）抗原の検出のための酵素免疫検定）にしたがって、感染細胞からの 上澄み液を、ｐ−２４抗原の存在について、ｐ、ｉ、１０Ｂｉ：：、１０倍連続 希釈（１／１０〜１／１０００）で検定した。結果は、４５４ｎｍでの吸光度と して示され、より高い吸収度はより高いｐ−２４抗原濃度ひいてはＨＩＶ感染を 示す。上澄み液の連続希釈は、もっとも正確な範囲（＜２．　０吸光度単位）に おいてｐ−２４濃度を検出することができるように行なわれた。

感染細胞の数は、実験の最後（通常、ｐ、ｉ、１５日）に、免疫蛍光検査（ＩＦ ）のために採用されたスライド上の細胞のアセトン固定により判定された。Ｊｅ ａｎｓｓｏｎ他［超免疫血清を利用した細胞培養からのマイコプラズマの除去ｊ Ｅｘ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１６１：１８１〜１８８（１９８５年）に記載された 標準的方法にしたがって、ＨＩＶ感染者からの１／４００希釈超免疫血清、およ び、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識した１／１００に希釈 された抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｉｏ−Ｍｅｒｉｅｕｘ　Ｆｒａｎｃｅ）を用い、間 接的ＩＦ試験が使用された。表５〜８に、ペプチド１〜４０で免疫化されたサル からの超免疫血清のスクリーニングから得られた結果を示す。

表５（Ａ−Ｄ）〜表８において、上澄み液のｐ２４抗原含有量は、上述したよう に、ＥＬＩＳＡ、間接ＩＦ、合胞体形成により分析された。抗原陽性細胞の相対 量は、ＡＧＰＯ５細胞として示され、ここで、パーセンテージは、−＝＝　０％ 、＋＝〉０〜２％、＋＋＝３〜１０％、＋＋＋＝１１〜２０％として示され、パ ーセンテージの間隔は抗原陽性細胞の数を示している。

表５Ａ　（ＨＩＶＮＴ３Ｐ１．ＸＬＳ）　は、ペプチドｇｐ１２０−１〜ｇｐ１ ２０−１０で免疫化されたサルから取り出した血清を用いて得られた結果を示し ている。用いられた細胞は、Ｈ９ＮＹであり、用いられたウィルスは、実施例８ で述べたＨＴＬＶ−１［ＩＢ、Ｂａｔｃｈ　１８であった。インキュベーション プロトコルは、３７℃で１時間の（ウィルスプラス血清）インキュベーションで あった。

表５Ｂ　（ＨＩＶＨＮＴ４Ｐ１．ＸＬＳ）　は、ペプチドｇｐ１２０−１１−ｇ ｐ１−２０−２０で免疫化されたサルから取り出した血清を用いて得られた結果 を示している。用いられた細胞は、８９　ＮＹであり、用いられたウィルスは、 実施例８で述べたＨＴＬＶ−ｍＢ、Ｂａｔｃｈ　１８であった。インキュベーシ ョンプロトコルは３７℃で１時間の（ウィルスプラス血清）インキュベーション であった。

表５Ｃ（ＨＩＶＨＮＴ５Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−２１〜ｇｐ１ ２０−３０で免疫化されたサルから取り出した血清を用いて得られた結果を示し ている。用いられた細胞は、Ｈ９ＮＹであり、用いられたウィルスは、実施例８ で述べたＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｂ、Ｂａｔｃｈ　１８であった。用いられたインキュ ベーションプロトコルは３７℃で１時間のウィルスプラス血清インキュベーショ ンであった。

表５Ｄ　（ＨＩＶＨＮＴ６Ｐ１．ＸＬＳ）は、ペプチドｇｐ１２０−３１〜ｇｐ １２０−４０で免疫化されたサルから取り出した血清を用いて得られた結果を示 している。用いられた細胞は、Ｈ９ＮＹであり、用いられたウィルスは、実施例 ８で述べたＨＴＬＶ−１［［ＢＳＢａｔｃｈ　１８であった。インキュベーショ ンプロトコルは３７℃で１時間の（ウィルスプラス血清）インキュベーションで あった。

表６　（ＨＩＶＴＡＢ４．ＸＬＳ）ｉ；！、第１の試験（表５Ａ−Ｄ）ｊ、：よ り決定される推定中和抗体の第１の再試験の結果を示す。各試験において、用い られたウィルスはＨＴＬＶ−ｎｌＢ、　Ｂ　ａ　ｔ　ｃ　ｈ　１８であり用いら れた細胞は８９　ＮＹであった。１−ｉ９列の第１の再試験結果は、中和試験番 号５の結果である。インキュベーションプロトコルは３７℃で１時間のインキュ ベーションであった。２０〜２２列の第１の再試験結果は中和試験番号７の結果 である。インキュベーションプロトコルは３７℃で１時間のインキュベーション であった。

表７　（Ｈ［ＶＴＡＢ５．ＸＬＳ）は、陽性ペプチドの第２、第３、第４の再試 験の結果を示す。各試験において、用いられたウィルスはＨＴＬＶ−ｍＢ　Ｂａ ｔｃｈ１８であり用いられた細胞はＨ９ＮＹであった。１〜４列の第２の再試験 結果は、中和試験番号７の結果である。インキュベーションプロトコルは３７℃ で１時間のインキュベーションであった。５〜１３列の第２の再試験結果は中和 試験番号１２の結果である。１４〜１６列の第３の再試験結果は中和試験番号１ ２の結果である。インキュベーションプロトコルは３７℃で１時間のインキュベ ーションであった。１７〜３９列の第４の再試験結果は中和試験番号１６の結果 である。インキュベーションプロトコルは４℃で１６時間であった。４０〜５３ 列の第２の再試験結果は中和試験番号１９の結果である。インキュベーション果 である。ここで、ウィルスおよび細胞のインキュベーションは４℃で１６時間す ることは、ＨＴＶによる感染を防ぐために、または、すてにＨＩＶに感染した検 体における高められた免疫反応を誘発するために適用できる。

国際調査報告 一□ｍ＋ｗ＋１ｌｅｓｉｌＡｓ−舊暑「−９暴。ｘｌｌａρＣＴ／５Ｅ９２１０ ０３７３−１−−一一嚢−＾ｅｍ−＋＋−５ｈｅＰＣＴ／５Ｅ９２１００３７３ １ｎｌｅｒｅｊｌ１６１１＠ｌ＾、、、、、、１．、、、−　ＰＣＴ／ＳＥ　９ ２１００３７３＋−，−ｎ−−＋ａｐ＋１−−ｖ＋−ＰＣＴ／ＳＥ　９２１００ ３７３１Ｍ、ｔＮｍｔｔＡｔｐ＋−＃＆　ＰＣＴ／ＳＥ　９２１００３７３国際 調査報告 国際調査報告 フロントベージの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ 、５Ｄ （７２）発明者　リーモ、ラーシュ スウェーデン、フーヴオース、Ｓ−４３０８０、ヘツレクーラヴエーゲン　１７ （７２）発明者　イエンジン、ステイーグスウェーデン、イエーテボリ、　Ｓ− ４１１２７、フエレーニングスガータン　３３（７２）発明者　ホーラル、ペー テル スウェーデン、イエーテボリ、Ｓ−４１２６６、オランジェリーガータン　２１ 　Ｂ（７２）発明者　チェルキンスキ、セフルスウェーデン、イエーテボリ、Ｓ −４１３１４、スヴエアーガータン　１６−１８゜（７２）発明者　ホルムグレ ーン、ヤーンスウェーデン、ヴエストラ　フレールンダ、Ｓ−４２１７４，コル ヴエットガータン　Ｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】 なるアミノ酸配列、上記 配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認識されるエピトープを含む上記配列 のサブフラグメントのいずれかから選択され、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端Ｎ Ｈ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために選択さ れた付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン残基、 アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を含むグ ループから選択されるところの上記ペプチドと、（ｂ）そのための生理的許容可 能な担体とを含む組成物。 ２，（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるア ミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認識されるエピトー プを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され、Ｘは上記ペプチ ドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進 するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、 システイン残基、アミノ基か後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステ イン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチドと、（ｂ）そのた めの生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ３．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるアミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認 識されるエピトープを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され 、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担 体への結合を促進するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはア ミノ基、水酸基、システイン残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基 が後に続くシステイン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチド と、 （ｂ）そのための生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ４．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるア ミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認識されるエピトー プを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され、Ｘは上記ペプチ ドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進 するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、 システイン残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステ イン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチドと、（ｂ）そのた めの生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ５．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるアミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認 識されるエピトープを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され 、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担 体への結合を促進するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはア ミノ基、水酸基、システイン残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基 が後に続くシステイン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチド と、 （ｂ）そのための生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ６．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるアミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認 識されるエピトープを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され 、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担 体への結合を促進するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはア ミノ基、水酸基、システイン残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基 が後に続くシステイン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチド と、（ｂ）そのための生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ７．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量のペプチドであって、Ｔ細胞によ り認識される少なくとも１つのエピトープを有し、上記エピトープは、【配列が あります】なるアミノ酸配列、上記配列の類似体および相同体、Ｔ細胞により認 識されるエピトープを含む上記配列のサブフラグメントのいずれかから選択され 、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担 体への結合を促進するために選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはア ミノ基、水酸基、システイン残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基 か後に続くシステイン残基を含むグループから選択されるところの上記ペプチド と、（ｂ）そのための生理的許容可能な担体とを含む組成物。 ８．（ａ）Ｔ細胞活性化を誘起するに充分な量の少なくとも２つのペプチドであ って、各ペプチドは、Ｔ細胞により認識される少なくとも１つのエピトープを有 し、上記エピトープは、 【配列があります】および【配列があります】なるアミノ酸配列、上記配列の類 似体および相同体、Ｔ細胞により認識されるエピトープを含む上記配列のサブフ ラグメントのいずれかから選択され、Ｘは上記ペプチドのアミノ末端ＮＨ２基の 水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために選択された付加 アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン残基、アミノ基 が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を含むグループか ら選択されるところの上記ペプチドと、（ｂ）そのための生理的許容可能な担体 とを含む組成物。 ９．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ末 端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために選 択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン残 基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を含 むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １０．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １１．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １２．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １３．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １４．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基が後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。 １５．【配列があります】なるアミノ酸配列を有し、Ｘは上記ペプチドのアミノ 末端ＮＨ２基の水素原子あるいは上記ペプチドの担体への結合を促進するために 選択された付加アミノ酸のいずれかであり、Ｙはアミノ基、水酸基、システイン 残基、アミノ基が後に続くシステイン残基、水酸基か後に続くシステイン残基を 含むグループから選択されることを特徴とするペプチド。