JPH06509877A - Mediator for oxidoreductases - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 酸化還元酵素に対するメディエータ 本発明は酸化還元酵素に対するメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）に関するもの である。特に、本発明は電流測定用（ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ）酵素電極に使 用する上述のメディエータに関するものである。[Detailed description of the invention] Mediator for oxidoreductases The present invention relates to mediators for oxidoreductases. It is. In particular, the present invention is suitable for use in amperometric enzyme electrodes. The above-mentioned mediator is used.

背景技術 電流測定用酵素電極は、例えば、ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）、カルーベ（Ｋａｒ ｕｂｅ）およびウィルソン（Ｗｉ　１ｓｏｎ）編［バイオセンサース・ファンダ メンタルス・アンド・アプリケエイションス（ＢＩＯ３ＥＮＳＯＲ３，Ｆｕｎｄ ａｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｊオックスフォード大 学出版部（１９８７）に記載されている。本発明の背景技術についてはこの刊行 物を参照されたい。Background technology Enzyme electrodes for current measurement include, for example, Turner, Karoube. ube) and Wilson (Eds.) [Biocensus Funda] Mentalities and Applications (BIO3ENSOR3, Fund amentals and Applications J Oxford University It is described in Gakusha Publishing Department (1987). Regarding the background technology of the present invention, please refer to this publication. Please refer to the item.

電極と酸化還元酵素との間の電気的伝達が電流測定用酵素電極の重要な特性であ る。一般に、これは低分子量の迅速に拡散するメディエータと迅速な酸化還元カ ップルとを使用して達成されている。フェナジン、メトサルフェート、２．６− ジクロロインドフェノール、キノン類およびフェニレンジアミド類のような有機 化合物かグルコースオキシダーゼ（ＣＯＤ）と−緒に使用される第１のこの種の ものである。しかし、これらの化合物には安定性が小さく、酸化還元電位がｐＨ に依存する等のいくつかの問題かある。これらの問題はオクタシアノタングステ ート、ヘキサシアノフエレート、ヘキサシアノルテネート、ルテニウムアミン複 合体、オスミウム複合体、および金属ポルフィリンのような無機化合物を使用す ることによって取り組まれている。ビピリジンおよびフェナントロリンの金属錯 体も示唆されている。Electrical transfer between the electrode and the oxidoreductase is an important characteristic of enzyme electrodes for amperometric measurements. Ru. Generally, this involves low molecular weight, rapidly diffusing mediators and rapid redox molecules. This has been achieved using Apple. Phenazine, methosulfate, 2.6- Organics such as dichloroindophenol, quinones and phenylenediamides The first of its kind to be used in conjunction with the compound glucose oxidase (COD) It is something. However, these compounds have low stability, and their redox potential is low at pH. There are some problems depending on the These problems are caused by octacyanotungsten Hexacyanoferate, Hexacyanoruthenate, Ruthenium amine complex using inorganic compounds such as conjugates, osmium complexes, and metalloporphyrins. This is being tackled by Metal complexes of bipyridine and phenanthroline The body is also suggested.

これらの無機メディエータの多くには、その酸化還元電位および／または水溶性 を変えるのが容易でないという問題がある。Many of these inorganic mediators have their redox potential and/or water solubility. The problem is that it is not easy to change.

この点において無機メディエータの分野はフェロセンによって拡張されている。In this respect, the field of inorganic mediators is expanded by ferrocene.

フェロセンとは２個のπ結合しているシクロペンタジェニル環の間に１個の鉄原 子が挟まれているサンドイッチ型化合物である。多数の誘導体の使用が試みられ れていることは、１個または２個のシクロペンタジェン環における置換によって フェロセンの性質を容易に変えることかできることを意味する。Ferrocene is one iron atom between two π-bonded cyclopentadienyl rings. It is a sandwich-type compound in which the child is sandwiched. The use of numerous derivatives has been attempted. that by substitution on one or two cyclopentadiene rings This means that the properties of ferrocene can be easily changed.

フェロセン・メディエータは、酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ （アナリティカル・ケミストリイ（Ａｎａｌ。Ferrocene mediators are oxidoreductases, e.g. glucose oxidase. (Analytical Chemistry (Anal.

Ｃｈｅｍｌ　５６　（１９８７）６６７）；コレステロールオキシダーゼ（［エ レクトロケミカル・センサース・フォー・バイオメディカル・アプリケイション ス（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｅｎｓｏｒｓ　ｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉ ｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｎｓ）　Ｊ　、シー、ケー、エヌ、リーム（Ｃ。Cheml 56 (1987) 667); cholesterol oxidase ([E Lectrochemical Census for Biomedical Applications (Electrochemical 5 sensors for Biomedi) cal Applications) J, C, K, N, Ream (C.

Ｋ、　Ｎ、　Ｌｉｍ）編［ザ・エレクトロケミカル・ソサイエテイ（プロン−デ ィンゲス・ボリューム）　（Ｔｈｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　（ Ｐｒ。K, N, Lim) [The Electrochemical Society (Pronde) Inges Volume) (The Electrochem, Soc, ( Pr.

ｃｅｅｄｉｎｇｓＶｏｌｕｍｅ））Ｊ、８６１４　（１９８６）　１６）　；サ ルフシンオキシダーゼ（［ジャーナル・オブ・エレクトロアナリティカル・ケミ スリイ（Ｊ、　［ＥＩｅｃｔｒｏａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、）Ｊ　２４０　（１９ ８８）３３．乳酸オキシダーゼ（「ジャーナル・才ブ・エレクトロアナリティカ ル・ケミストリイＪ　２４０　（１９８８）３３、ピルビン酸オキシダーゼ（「 ジャーナル・才ブ・エレクトロアナリティカル・ケミストリイＪ　１９０　（１ ９８５）１１７）；キサンチンオキシダーゼ（［ジャーナル・オブ・エレクトロ アグルタチオンレダクターゼ（「ジャーナル・オブ・エレクトメアナリティカル ・ケミストリイ」±９０　（１９８５）１１７）；ジアホラーゼ（「エレクトロ ケミカル・センサース・フォー・バイオメディカル・アプリケイションス」、シ ー、ケー、エヌ。ceedingsVolume)) J, 8614 (1986) 16); Rufusin oxidase ([Journal of Electroanalytical Chemistry Surii (J, [EI electroanal, Chem,) J 240 (19 88) 33. Lactate oxidase (Journal of Electroanalytica) Le Chemistry J 240 (1988) 33, pyruvate oxidase (" Journal of Electroanalytical Chemistry J 190 (1 985) 117); xanthine oxidase ([Journal of Electrolysis Aglutathione reductase (Journal of Electomeretical ・Chemistry" ±90 (1985) 117); Diaphorase ("Electro "Chemical Census for Biomedical Applications", -, K, N.

リーム編［ザ・エレクトロケミカル・ソサイエティ（プロシーディンゲス−ボリ ューム）Ｊ　８６−１４　（１９ｓ６）　１６）；グルコースデヒドロゲナーゼ （「バイオセンサース（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）Ｊ２　（１９８６）７１）：お よびホースラディツシュペルオキシダーゼ（「ジャーナル・オブ・エレクトロア ナリティヵル・ケミストリイＪ２０±（１９８６）ｌ）の場合に、迅速な電子伝 達を行うことが示されている。Ream [The Electrochemical Society (Proceedinges-Bori)] Glucose dehydrogenase ("Biosensors J2 (1986) 71): and horseradish peroxidase (Journal of Electroa In the case of Scientific Chemistry J20± (1986) l), rapid electronic transfer It has been shown that this can be achieved.

しかし、候補となるメディエータのリストを拡張して特定の用途に適合した性質 を有する新しいメディエータの開発を可能にする必要がある。However, the list of candidate mediators can be expanded to include properties adapted to specific applications. It is necessary to enable the development of new mediators with

発明の目的 本発明の主目的は、酸化還元酵素または他の電子伝達酸化還元タンパク質に対す るメディエータとして使用される化合物を提供することにある。関連する目的と しては、このようなメディエータを使用するメゾイエ−ジョンプロセス、このメ ゾイエ−ジョンプロセスに基く生成物、このメゾイエ−ジョンされた生成物の製 造方法、およびメディエータを含有する組成物がある。Purpose of invention The main objective of the present invention is to reduce oxidoreductase or other electron transfer redox proteins. The object of the present invention is to provide a compound that can be used as a mediator. related objectives and Therefore, the meso-ageation process using such a mediator, this method Products based on the mezoyedion process, the production of this mesoyaged product There are methods for producing mediators, and compositions containing mediators.

発明の要約 本発明においては、１個のπ配位子（この配位子はなかんずくアリル、シクロプ ロペニル、シクロブタジェン、シクロペンタジェニル、ベンゼン、シクロへブタ トリエンル、またはトリメチレンメタンとすることができる）を有する遷移金属 、例えば、鉄、マンガンおよびクロムの錯体（半サンドイッチ型錯体）が、グル コースオキシダーゼのような酸化還元酵素への電子伝達をメゾイエ−ジョンする ことかでき、その有効性はフェロセンに匹敵し、しかも一層広い範囲の置換化学 現象に対する可能性を提供することを見い出した。メゾイエ−ジョン作用は酵素 に限定されず、他の電子伝達酸化還元タンパク質の場合にも適用することができ る。Summary of the invention In the present invention, one π-ligand (this ligand is inter alia allyl, cyclopropyl) Lopenyl, cyclobutadiene, cyclopentadienyl, benzene, cyclohebuta (can be triethylene, or trimethylenemethane) , for example, complexes of iron, manganese and chromium (semi-sandwich complexes) meso-ionizes electron transfer to redox enzymes such as course oxidase Its effectiveness is comparable to that of ferrocene, and it can be used over a wider range of substitution chemistries. discovered that it offers possibilities for the phenomenon. Mesoielation action is an enzyme is not limited to, but can also be applied to other electron transfer redox proteins. Ru.

遷移金属の半サンドイッチ型錯体についてはいくつかの報告がなされているが、 酸化還元タンパク質に対するメゾイエ−ジョンに関するものではない。例えば、 シクロペンタジェニルトリカルボニル−マンガンおよび−レニウムのア七ト二ト リル中における電気化学的酸化に及ぼす置換の影響については「ジャーナル・才 ブ・オルガノメタリック・ケミストリイ（Ｊ、　Ｏｒｇａｎ。There have been several reports on half-sandwich complexes of transition metals, but It is not concerned with mesolysis for redox proteins. for example, Cyclopentadienyl tricarbonyl-manganese and -rhenium 7-tonite The effect of substitution on electrochemical oxidation in Organometallic Chemistry (J, Organ.

ｍｅｔ、ｃｈｅｍ、）Ｊ　１０１　（１９７５）Ｃ４３に報告されている。met, chem, ) J 101 (1975) C43.

クロムのアレーン、シクロへブタトリエン、およびシクロへブタトリエニルトリ 力ルポニル錯体のジクロロメタン中におけるポルタン（ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｉ ｃ）酸化については［ジャーナル・才ブ・ケミカル・ソサイエティ・ダルトン・ トランスアクション（Ｊ。Arenes of chromium, cyclohebutatriene, and cyclohebutatrienyltri voltammetri complex in dichloromethane c) Regarding oxidation [Journal of the Chemical Society Dalton Transaction (J.

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　ＤａｌｊｏｎＴｒａｎｓ、）　Ｊ　（１９７３）　１７ ６８に報告されている。シクロペンタジェニルマンガン誘導体、シクロペンタト リエニルモリブデン誘導体およびシクロペンタジェニル鉄誘導体のア七ト二トリ ル中における環状ボルタンメトリイは「ジャーナル・才ブ・オルガノメタリック ・ケミストリイ」１７０　（＋９７９）２＋７に報告されている。マグネシウム 、モリブデン、タングステンおよびコバルトのいくつかのπ−シクロペンタジェ ニル硫黄錯体のジクロロメタン中におけるポルタンメトリー特性については［イ ンオルガニック・ケミストす４　（Ｉｎｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）　Ｊ　８　（１ ９６９）　１３４０に報告されている。Chem, Soc, Daljon Trans, ) J (1973) 17 It has been reported in 68. Cyclopentadienylmanganese derivative, cyclopentato Atenatonitrione of lienylmolybdenum derivatives and cyclopentadienyl iron derivatives The cyclic voltammetry in the ・Chemistry” 170 (+979) 2+7. magnesium , some π-cyclopentadienes of molybdenum, tungsten and cobalt. Regarding the portammetric properties of the dichloromethane complex, Organic Chemist 4 (Inorg, Chem,) J 8 (1 969) reported in 1340.

発明の好適例 一般的に、本発明は酵素と電極との間の電子伝達においてメディエータとして使 用される遷移金属半サンドイッチ型錯体を提供する。これに対応して、本発明は メディエータとして遷移金属半サンドイッチ型化合物を使用することを特徴とす る、酸化還元酵素と電極との間の電子伝達をメゾイエ−ジョンする方法を提供す る。本発明においては、このような遷移金属半サンドイッチ型化合物が水性系に おいてメディエータとて作用することかできることを見い出した。Preferred example of the invention Generally, the present invention describes the use of enzymes as mediators in electron transfer between enzymes and electrodes. Provided are transition metal semi-sandwich complexes for use in the present invention. Corresponding to this, the present invention Characterized by the use of a transition metal semi-sandwich type compound as a mediator We provide a method for meso-aging electron transfer between oxidoreductases and electrodes. Ru. In the present invention, such a transition metal semi-sandwich type compound is added to an aqueous system. We have discovered that it can act as a mediator.

他の面において、本発明はメゾイエ−ジョンされた酵素生成物および該酵素生成 物の製造方法を提供する。例えば、本発明の錯体は、欧州特許出願（ＥＰ）第７ ８６３６号Ａ、同第１２５１３６号Ａ、同第１２５１３７号Ａ、同第１２５１３ ９号Ａ。In other aspects, the invention provides meso-aged enzyme products and Provide a method for manufacturing products. For example, the complexes of the invention may be used in European Patent Application (EP) No. 7 8636A, 125136A, 125137A, 12513 No. 9A.

同第１２５８６７号Ａ、同第１２７９５８号Ａまたは同２３０７８６号Ａ明細書 に記載されているものと同様であるが、メディエータとて遷移金属半サンドイッ チ型化合物を使用する電流測定用酵素センサを製造するのに使用することができ る。上述の公表されている特許明細書を参考としてここに加入する。従って、本 発明は、試料、特に水性試料中における検体の存在を試験するために使用される 電流測定用酵素センサを提供する。Specification No. 125867A, No. 127958A or No. 230786A similar to that described in , but with a transition metal semi-sandwich as the mediator. It can be used to produce amperometric enzyme sensors using di-type compounds. Ru. The published patent specifications mentioned above are hereby incorporated by reference. Therefore, the book The invention is used to test the presence of an analyte in a sample, especially an aqueous sample. An enzyme sensor for measuring current is provided.

例えば、試料は複雑な生体試料、例えば、全血、血漿または血清のような体液と することができ、検体はグルコースまたはコレステロールのような天然に存在す る代謝物、または医薬のような導入した物質とすることができる。For example, the sample may be a complex biological sample, e.g., a body fluid such as whole blood, plasma or serum. The analyte can be a naturally occurring substance such as glucose or cholesterol. It can be a metabolite, or an introduced substance, such as a drug.

さらに、本発明は、電流測定用酵素電極を製造するのに特に有用な、遷移金属半 サンドイッチ型メディエータ化合物を含有する導電性印刷インキを提供する。Furthermore, the present invention provides transition metal semiconductors that are particularly useful for producing enzyme electrodes for amperometric measurements. Conductive printing inks containing sandwich-type mediator compounds are provided.

本発明の中心的特徴は、１個のπ配位子か他の配位子によって錯化されている遷 移金属に結合しているキサン１〜イッチ型錯体を使用することにある。１個のπ 配位子は３個以上、例えば３〜７個の原子を有し、これらの原子は普通炭素原子 であるが、π結合することができる窒素、酸素、硫黄およびリンを包含するペテ ロ原子を含むことができる。当然なことであるが、π結合を有するためには、π 配位子の少なくとも３個の相互結合した原子はπ結合か局在していない１個の平 面を規定し、これらの少なくとも３個の原子は遷移金属原子と直接に相互作用す る。A central feature of the invention is that the transition complexed by one π-ligand or another It consists in using xane 1-1 type complexes which are bonded to transfer metals. 1 pi The ligand has 3 or more atoms, for example 3 to 7 atoms, and these atoms are usually carbon atoms. However, petene containing nitrogen, oxygen, sulfur and phosphorus that can be π-bonded is It can contain atoms. Naturally, in order to have a π bond, π At least three interconnected atoms of the ligand are either π-bonded or a single delocalized plane. at least three of these atoms interact directly with the transition metal atoms. Ru.

遷移金属イオンの性質は、迅速な電子伝達を行うことができる点を除けば重要で ない。他の配位子の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）はπ結合性である点を除けば重 要でない。例えば、他の配位子はカルボニル、ホスフィン、イソソアニＦ、ニト ロシル、ビピリジン、フェナン）・ロリンまたはジチオレートから選択すること ができる。The properties of transition metal ions are important apart from their ability to perform rapid electron transfer. do not have. The identity of other ligands is important, except that they are π-bonded. Not necessary. For example, other ligands include carbonyl, phosphine, isosoaniF, nitrate. Choose from rosyl, bipyridine, phenane), lolin or dithiolate Can be done.

メディエータとして使用される半サンドイッチ型化合物としては、次の一般式二 （π配位子）Ｍ（非π配位子）、 で表わされ、式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍは遷移金属原 子を示し、ｎはπ配位子てはない配位子の数を示し、非π配位子は同一または異 なる一価または多価の配位子てあって、遷移金属Ｍの原子価を満たす作用を有す るものを示し、電荷を有するかあるいは中性である錯体であるのが好ましい。Semi-sandwich compounds used as mediators include the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand), The π-ligand in the formula represents one π-bonded ligand, and M is a transition metal atom. n indicates the number of non-π ligands, and non-π ligands may be the same or different. A monovalent or polyvalent ligand having the effect of satisfying the valence of the transition metal M. The complex is preferably a charged or neutral complex.

π配位子は３〜７個の炭素原子を有するπ配位子から選択するのが一層好ましく 、アリル、シクロプロペニル、シクロフタジエン、シクロペンタジェニル、ベン ゼン、シクロへブタトリエニルまたはトリメチレンメタン基であるのが最も好ま しい。More preferably the π-ligand is selected from π-ligands having 3 to 7 carbon atoms. , allyl, cyclopropenyl, cyclophtadiene, cyclopentadienyl, ben most preferably zene, cyclohebutatrienyl or trimethylenemethane groups. Yes.

π配位子は未置換であってもよいが、置換基を有する配位子であるのか好ましい 。置換基の性質は重要でない。その理由は、置換置の同一性を変えることによっ てメディエータ候補として評価するために種々の性質を有する化合物を製造する ことができることか本発明の特徴であるからである。純粋に例として、１個以上 、普通１〜４個の置換置を存在させることができる。The π ligand may be unsubstituted, but it is preferable to have a substituent. . The nature of the substituents is not important. The reason is that by changing the identity of the substitution to produce compounds with various properties for evaluation as mediator candidates. This is because it is a feature of the present invention that it can be performed. Purely as an example, one or more , usually 1 to 4 substitutions can be present.

この置換基はアルキル基、特にメチルまたはエチル基；アルコキシ基、特にメト キシまたはエトキシ基；アミノおよび置換アミノ基、特にアミ／、ジメチルアミ ／、ジエチルアミノまたはジ（β−ヒドロキシエチル）アミノ基二アミノアルキ ルおよび置換アミノアルキル基、特にアミノメチルまたはジメチルアミ　・ツメ チル基、カルボン酸残基：またはスルホン酸残基がら選択することかできる。This substituent can be an alkyl group, especially a methyl or ethyl group; an alkoxy group, especially a meth oxy or ethoxy groups; amino and substituted amino groups, especially ami/, dimethylamino /, diethylamino or di(β-hydroxyethyl)amino diaminoalkyl and substituted aminoalkyl groups, especially aminomethyl or dimethylaminoyl, It can be selected from a thyl group, a carboxylic acid residue, or a sulfonic acid residue.

遷移金属Ｍとしては鉄、マンガンまたはクロムが好ましい。The transition metal M is preferably iron, manganese or chromium.

非π配位子はいずれもカルボニル、ボスフィン、イソシアニド、ニトロシル、ビ ピリジン、フェナントロリンまたはジチオレート基から選択するのが好ましい。All non-π ligands are carbonyl, bosphine, isocyanide, nitrosyl, and bicarbonyl. Preference is given to choosing from pyridine, phenanthroline or dithiolate groups.

これらの基のうち最初の４個の基は１価であり、これらの基のうち最後の３個は 二価である。The first four of these groups are monovalent, and the last three of these groups are It is bivalent.

本発明の一つの好ましい例においては、遷移金属半サンドイッチ型化合物をβ− シクロデキＩ・スリン中の包接錯体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ）とし て使用する。この錯体は代表的な例では１：ｌ付加物の形になっている。In one preferred embodiment of the invention, the transition metal semi-sandwich compound is As an inclusion complex in cyclodextrin and use it. This complex is typically in the form of a 1:1 adduct.

遷移金属半サンドイッチ型化合物は広く知られているが、あるいは文献に記載さ れている方法を改良することにより製造することかできる。Transition metal semi-sandwich compounds are widely known or have not been described in the literature. It can be manufactured by improving the existing method.

遷移金属半サンドイッチ型錯体がフェロセンより優れている特別な利点は、構造 上の可能性が一層大きくなるので、錯体の層緊密に適合させることかできること にある。遷移金属半サンドイッチ型錯体を、酸化還元酵素、例えば、大部分のフ ラビンタンパク質、金属タンパク質およびキノンタンパク質酸化還元酵素に対す るメディエータとして使用する可能性：またはヘモグロビンのような酸化還元タ ンパク質に対して、あるいは呼吸タンパク質または他の電子伝達酸化還元タンパ ク質に対してメディエータとして作用させる可能性；欧州特許（ＥＰ）第１２５ １３９号Ａ明細書に記載されているような方法を包含する免疫化学方法において 抗原または抗体のためのラベルとして前記半サンドイッチ型錯体を使用する可能 性：酵素との反応によって変性された酸化還元電位を有する酵素反応をモニター するための人工基質として前記半サンドイッチ型錯体を使用する可能性：特定の 酸化還元酵素タンパク質とは相互作用するか他の酸化還元酵素タンパク質とは相 互作用しないように配位子を注意して選択することによりメディエータの酸化還 元電位を適合させる可能性、酵素−メディエータ複合体または変性された電極を 製造するために半サンドイッチ型錯体について一層広範囲の置換化学現象を使用 すること：および当業者にとって明らかである電気化学および生物電気化学の分 野における他の適用のような、本発明の他の適用および利点は明らかである。A special advantage of transition metal semi-sandwich complexes over ferrocene is that the structure As the above possibilities become even greater, the layers of the complex can be closely matched. It is in. Transition metal semi-sandwich complexes can be used for oxidoreductases, e.g. for rabin proteins, metalloproteins and quinone protein oxidoreductases. Possibility of use as a mediator: or redox proteins such as hemoglobin proteins, or respiratory proteins or other electron transport redox proteins. Possibility of acting as a mediator on macrobiotics; European Patent (EP) No. 125 In immunochemical methods including those described in No. 139A Possibility to use the semi-sandwich complex as a label for antigen or antibody Characteristics: monitors enzyme reactions with redox potential modified by reaction with enzymes Possibility of using the semi-sandwich complex as an artificial substrate for: It interacts with oxidoreductase proteins or is incompatible with other oxidoreductase proteins. Redox of the mediator by careful selection of ligands to avoid interactions. Possibility to adapt the original potential, enzyme-mediator complex or modified electrode Using a wider range of substitution chemistries for semi-sandwich complexes to produce and electrochemical and bioelectrochemical components that are obvious to those skilled in the art. Other applications and advantages of the invention will be apparent, such as other applications in the field.

メディエータとして遷移金属半サンドイッチ型化合物を採用した好適な電流測定 用酵素センサは、テスト用帯状部材、特に乾燥した使い捨てテスト用帯状部材を 利用する。好ましくは、使い捨てテスト用帯状部材は、作用電極、検体レベルを 示す電流を発生させるために少なくとも酸化還元酵素および遷移金属半サンドイ ッチ型メディエータ化合物を含有するテスト用試薬、および基準電極を具える。Suitable current measurements employing transition metal semi-sandwich compounds as mediators Enzyme sensors require test strips, especially dry disposable test strips. Make use of it. Preferably, the disposable test strip includes a working electrode, an analyte level at least an oxidoreductase and a transition metal semi-sandido to generate the current shown. a test reagent containing an etch-type mediator compound, and a reference electrode.

代表的な例においては、テスト用部材において、テスト用試薬は作用電極と組み 合わされている１個以上のカーボンベースの層中に存在する。従って、センサ電 極は、例えば、スクリーン印刷、吹付け、または他の適当な堆積技術によって形 成された電極区域を有するのが好ましい。In a typical example, the test reagent is assembled with the working electrode in the test member. present in one or more carbon-based layers that are combined. Therefore, the sensor voltage The poles may be shaped, for example, by screen printing, spraying, or other suitable deposition techniques. Preferably, the electrode area has a defined area.

好ましくは、各カーボン混合物をキャリア上の導電性トラック上に、例えば第２ トラツクに接続されている基準電極の極めて近くに被着させる。このようにして 、小試料の全血または他の液体て有効電極区域をおおうことによって機能させる ことができるセンサか生成する。これらのカーボン混合物はスクリーン印刷によ ってキャリアに被着させるのが最適である。Preferably, each carbon mixture is applied onto a conductive track on the carrier, e.g. Deposit very close to the reference electrode connected to the track. In this way It works by covering the active electrode area with a small sample of whole blood or other liquid. Can you generate a sensor? These carbon mixtures are produced by screen printing. It is best to attach it to a carrier.

特に好ましい例では、本発明は、細長い電気絶縁性キャリアを具え、該キャリア はその上に１対の縦方向の実質的に平行な導電性トラックを有し、各導電性トラ ックには同一端に、読出し手段に電気的に接続する手段と１個の電極とかテスト 用試薬と一緒に設けられており、電極のうちの一方は基準電極であり、他方は作 用電極である。In particularly preferred embodiments, the invention comprises an elongated electrically insulating carrier, the carrier has a pair of longitudinal, substantially parallel conductive tracks thereon, each conductive track The rack has at the same end a means for electrically connecting it to the readout means and one electrode for testing. one of the electrodes is the reference electrode and the other is the working reagent. This is an electrode for use.

特に、このようなセンサは、合成樹脂（例えば、ＰＶＣ）のような電気絶縁性ギ ヤリア材料からなり、印刷された導電性トラック上に支持されている２個の電極 を両端間に有する帯状支持部材の形態に形成される。例えば、電極は２個の長方 形区域が帯状ギヤリア部材上で平行している形態にすることができる。In particular, such sensors are suitable for electrically insulating materials such as synthetic resins (e.g. PVC). Two electrodes made of Yaria material and supported on printed conductive tracks between both ends thereof. For example, the electrodes are two rectangular It can be provided that the shaped sections are parallel on the band-shaped gear element.

このような長方形区域は、検体を試験するための１滴の試料、例えば、全血によ っておおわれる標的区域として形成することができる。所望に応じて、非長方形 の電極区域、例えば、ダイアモンド形、半円形、または三角形の区域を使用して 、液体試料との接触を最適にするための標的区域を提供することかできる。Such a rectangular area can accommodate a single drop of sample for testing a specimen, e.g. whole blood. The target area can be formed as a covered area. Non-rectangular as desired using electrode areas, e.g. diamond-shaped, semicircular, or triangular areas. , can provide targeted areas for optimal contact with the liquid sample.

キャリアは、少なくとも２個の電極、すなわち基準電極および作用電極を有して いるか、作用電極に類似した配合を有する反対電極および／またはダミー電極を 、１種以上の活性成分か欠けている関連するテスト用試薬と共に有することがで きる。The carrier has at least two electrodes, a reference electrode and a working electrode. or a counter electrode and/or a dummy electrode with a similar formulation to the working electrode. , may have one or more active ingredients or associated test reagents lacking. Wear.

このようなダミー電極である第３電極は、第３電極を流れる電荷を作用電極を流 れる電荷から引き算した場合に、得られる電荷は関係する反応のみに起因すると いう点において、信頼性の一層大きい結果をもたらす。The third electrode, which is such a dummy electrode, allows the charge flowing through the third electrode to flow through the working electrode. When subtracted from the charge obtained, the resulting charge is due only to the reaction involved. In this respect, it provides even more reliable results.

標的区域またはその上方に膜を設けて濾過作用を行わせることがてき、例えば、 試料かテスト用帯状部材に入る前に試料から血球を濾過することかできる。ある いはまた、濾過膜または細胞分離膜を系内て流し込み形成（ｃａｓｔ　ｉｎ　５ ｉｔｕ）することがてきる。A membrane may be provided at or above the target area to provide filtration, e.g. Blood cells can be filtered from the sample before it enters the test strip. be Alternatively, the filtration membrane or cell separation membrane can be cast in the system. I can do it.

特に一層好ましい例においては、液体混合物中のある化合物を示す電流を検知す るために、センサ系の信号読出しサーキッ１ヘリイ（ｃｉｒｃ旧けｙ）に取り付 けるための１個の使い捨て帯状電極部材を提供する。この帯状部材は ａ）読取りサーキッｌ〜リイに着脱自在に取り付けるのに適した細長い支持体。In a particularly more preferred embodiment, detecting an electric current indicative of a compound in a liquid mixture. In order to provides one disposable strip-shaped electrode member for This band-shaped member a) An elongated support suitable for removably attaching to the reading circuit.

ｂ）該支持体に沿って延在し、前記読取りサーキットリイに接続するための導電 性部材を具える第１導体。b) an electrical conductor extending along said support and for connecting to said readout circuitry; a first conductor comprising a sexual member;

Ｃ）前記帯状部材上に設けられ、第１導体と接触し、かつ前記液体混合物と接触 するように設置されている活性電極であって、酵素で触媒された反応と前記第１ 導体との間で伝達された電子を伝達して前記酵素の活性を示しかつ前記化合物を 示す電流を生しさせることができる遷移金属半サンドイッチ型メディエータと酵 素基質とを包含する反応を触媒することができる酵素を含有する面積２５ｍｍ” 未満の印刷された層を前記支持体上に具える活性電極： ｄ）前記支持体に沿って延在し、前記読取りサーキットリイに接続するための導 電性部材を具える第２導体；およびｅ）第２導電性部材と接触し、かつ前記液体 混合物および前記第２導体と接触するように設置されている基準電極を具え、前 記第１導電性部材および前記活性電極は前記第２導電性部材および前記基準電極 から離間して設けられ、これらの電極は１滴の血液によって完全におおうことの できる充分に小さい合計有効面積を有するような大きさおよび配置になっていて 、前記血液が前記活性電極と前記基準電極との間の電気回路を完結して、電流測 定によって前記酵素の活性を検知できるように構成されている。C) provided on the strip member, in contact with the first conductor, and in contact with the liquid mixture; an active electrode arranged to conduct an enzyme-catalyzed reaction and said first Transfers the electrons transferred to and from the conductor to exhibit the activity of the enzyme and release the compound. A transition metal semi-sandwich mediator and an enzyme that can produce a current of 25 mm area containing an enzyme capable of catalyzing a reaction involving an elementary substrate An active electrode comprising on said support a printed layer of: d) a conductor extending along said support and for connecting to said readout circuitry; a second conductor comprising an electrically conductive member; and e) a second conductor in contact with the second electrically conductive member and comprising: a reference electrode placed in contact with the mixture and the second conductor; The first conductive member and the active electrode are connected to the second conductive member and the reference electrode. These electrodes cannot be completely covered by a single drop of blood. sized and arranged to have a sufficiently small total effective area that , the blood completes an electrical circuit between the active electrode and the reference electrode so that the current measurement The enzyme is configured so that the activity of the enzyme can be detected by measurement.

本発明のテスト用帯状部材は、例えば、既知のメゾイエ−ジョンされた酵素の電 気化学的反応によってではあるが、メディエータとして遷移金属半サンドイッチ 型化合物を使用することにより、検体を検知することができる。この点に関し、 欧州特許第７８６３６号Ａ明細書、特にグルコースオキシダーゼについての記載 、ならびに欧州特許第１２７９５８号Ａおよび同第１２５１３７号Ａ明細書を参 照されたい。本発明のメディエータと一緒に使用することができる他の酵素とし ては、欧州特許第２３０７８６号Ａ明細書に記載されているように、遊離コレス テロールまたは総コレステロールを検出するために用いられるコレステロールオ キシダーゼとペルオキシダーゼと所望に応じてコレステロールエステラーゼとの 組合せかあり、一層一般的には、例えば、欧州特許第１２５１３７号Ａ明細書に 記載されているように、フラビンタンパク質、キノンタンパク質および金属タン パク質を包含する酸化還元酵素または他の酵素、およびＩｆ１以上のメディエー タ化合物を包含する系がある。本発明のデバイスに使用するのに適当な他の酵素 系としては、例えば、欧州特許第１２５８６７号Ａ明細書に記載されているよう に、補因子としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミド アデニンジヌクレオチド燐酸を使用する酸化還元酵素がある。The test strip member of the present invention can be used, for example, with known meso-aged enzymes. transition metal semi-sandwiches as mediators, albeit by gas-chemical reactions. By using type compounds, analytes can be detected. In this regard, European Patent No. 78636A, especially the description of glucose oxidase , and EP 127958A and EP 125137A. I want to be illuminated. Other enzymes that can be used with the mediators of the invention include: As described in European Patent No. 230786A, free cholaceous Cholesterol ointment used to detect terol or total cholesterol oxidase, peroxidase and optionally cholesterol esterase. There are only combinations, more generally, for example in EP 125 137 A. Flavoproteins, quinone proteins and metal proteins as described oxidoreductases or other enzymes, including proteins, and mediators of If1 and higher There are systems that include ta compounds. Other enzymes suitable for use in devices of the invention As a system, for example, as described in European Patent No. 125867A specification, with nicotinamide adenine dinucleotide and nicotinamide as cofactors. There are oxidoreductase enzymes that use adenine dinucleotide phosphate.

本発明のテスト用帯状部材は電子装置および計器系と一緒に使用するためのもの である。これらの系は、例えば、電極に特定の電位を維持し、反応をモニターし 、計算し、結果を与える。The test strip of the present invention is intended for use with electronic devices and instrumentation systems. It is. These systems, for example, maintain specific potentials at electrodes and monitor reactions. , calculate and give the result.

計器系においてこのタイプのテスト用帯状部材と一緒に使用するのに望ましい特 定の特性は、試料流体による反応圏の濡れを検出てきる能力であり；これにより 測定を適当な時期に開始することかでき、使用者の誤りによって生じる不正確さ の範囲が狭くなる。テスト用帯状部材を計器に挿入してから直ちに前記帯状部材 の電極に電位を印加することによりこの目的を達成することかでき、試料流体に よる反応圏の濡れを反映するある限界電流か測定されるまで、この電位を維持す る。次いで、この電位を短時間除去して濡れを完全にしてから、通常のように測 定を開始することかできる。Desirable characteristics for use with this type of test strip in instrumentation systems: A defining property is the ability to detect wetting of the reaction sphere by the sample fluid; Measurements can be started at a suitable time and inaccuracies caused by user error can be avoided. range becomes narrower. Immediately after inserting the test strip into the instrument, This can be achieved by applying a potential to the electrodes of the sample fluid. This potential is maintained until a certain limiting current is measured, which reflects the wetting of the reaction sphere by Ru. This potential is then removed briefly to ensure complete wetting and then measured as usual. You can start the configuration.

仔刊な他の特徴は、異なる検体を測定する場合に、テスト用帯状部材の同一性を 自動的に容易に確認てきることである。これは、例えば、テスト用帯状部材上に 追加の接点を、この帯状部材のタイプを特徴付けるパターンに従って設けること により達成され、計器は接点バット（ｃｏｎｔａｃｔ　ｐａｄ）を具えていて各 接点が存在しているか存在していないかを決める。あるいはまた、米国特許第５ １２６０３４号明細書、第４ｓ第３〜７行に記載されているように、テスト用帯 状部材に印刷され、帯状部材のタイプの特性を示す所定の抵抗を有する１個以上 の追加の回路ループを使用する系も可能である。さらに他の例としては、ノツチ （ｎｏｔｃｈ）または他の形状を、計器に挿入されるテスト用帯状部材の近位端 に形成することができ；計器中のスイッチまたは光検出器によって各ノツチが存 在するが存在しないかを検出することかできる。帯状部材のタイプを識別する他 の可能性としては、帯状部材の色を変えかっ色の範囲を区別できる光検出器を設 けること、また帯状部材にバーコード、帯状磁気部片または他のマーキングを設 けること、および計器に適当な読取り装置を設けることがある。Another interesting feature is the ability to ensure the identity of the test strip when measuring different analytes. This can be easily verified automatically. This can be done, for example, on a test strip. Additional contacts are provided according to the pattern characterizing this type of strip. The instrument is equipped with a contact pad and each Determine whether a contact exists or not. Alternatively, U.S. Pat. As described in No. 126034, No. 4s, lines 3 to 7, the test strip one or more strips printed on the strip and having a predetermined resistance characteristic of the type of strip Systems using additional circuit loops are also possible. Yet another example is Notsuchi. (notch) or other shape at the proximal end of the test strip that is inserted into the instrument. each notch can be formed by a switch or photodetector in the instrument. It is possible to detect whether it exists or not. Identifying the type of band member, etc. One possibility is to change the color of the strip and install a photodetector that can distinguish the brown range. and bar codes, magnetic strips or other markings on the strips. The meter may be equipped with a suitable reading device.

本発明のテスト用帯状部材を大量生産するのに好ましい技術について説明する。A preferred technique for mass-producing test strip members of the present invention will be described.

この例では、帯状電極を、基準電極と作用電極とダミー電極とを具える三電極構 造にする。In this example, the strip electrode is arranged in a three-electrode structure comprising a reference electrode, a working electrode, and a dummy electrode. Make it a structure.

キャリアは、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエステル、紙、ポール紙 、セラミック、セラミック被覆した金属または他の絶縁材料を包含する電気絶縁 性表面を有する材料から製造することができる。ポリ塩化ビニル、またはポリカ ーボネートとポリエステルとの混和物が特に適当である。Carriers include polyvinyl chloride, polycarbonate, polyester, paper, and pole paper. electrical insulation, including ceramics, ceramic-coated metals or other insulating materials It can be manufactured from a material with a flexible surface. Polyvinyl chloride or polycarbonate Blends of carbonates and polyesters are particularly suitable.

いくつかの位置合せ用孔を押し抜くと同時に外側端縁を切り取る押抜き具を使用 して、キャリア材料のシートを所定の寸法に切断する。以後の操作ではこれらの 孔を使用するのが有利てあるが、処理中に端縁の位置合せも容易に行うことがで きる。Use a puncher to punch out several alignment holes and cut off the outer edge at the same time The sheet of carrier material is then cut to size. In subsequent operations, these Although it is advantageous to use holes, it is also easier to align edges during processing. Wear.

スクリーン印刷のような堆積方法によって導電性インキをキャリアに被着させる 。押抜かれた孔を使用してキャリアの位置合せを行う。この層は計器をテスト用 帯状部材と接触可能にする接点区域を生成し、接点と帯状部材上で生起する化学 現象との間に電気回路を提供する。インキとしては、自然乾燥する有機溶媒ヘー スのカーボン混合物か好ましい。他の配合物としては、水ヘースのインキおよび 銀インキを使用することができる。Applying conductive ink to the carrier by a deposition method such as screen printing . The punched holes are used to align the carrier. This layer is for testing instruments The chemistry that occurs on the contact and the strip, creating a contact area that allows contact with the strip. Provide an electrical circuit between phenomena. The ink is an organic solvent that dries naturally. Carbon mixtures of carbon are preferred. Other formulations include water haze inks and Silver ink can be used.

インキを乾燥または硬化させる他の方法としては、赤外、紫外および高周波の放 射かある。Other methods of drying or curing ink include infrared, ultraviolet and radio frequency radiation. There's a shot.

次いて、銀と塩化銀との混合物を含有する有機溶媒ヘースのインキを使用して、 基準電極を形成する層を印刷する。このプリントを反応圏に延在するカーボンプ リントの中間トラックを部分的におおうように延在させる。このプリントの別個 の部分を反応圏の外側で他のカーボントラックの部分をおおうように延在させて 、各トラックの総電気抵抗か減少するようにするのか、有用である。Then, using an organic solvent Hess ink containing a mixture of silver and silver chloride, Print the layer forming the reference electrode. Carbon fibers extending this print into the reaction sphere Extend to partially cover the intermediate track of lint. Separate of this print The part of the carbon track is extended outside the reaction zone to cover the other part of the carbon track. , so that the total electrical resistance of each track is reduced, which is useful.

所要に応じて、誘電性インク層を、カーボンおよび銀／塩化銀の印刷層の大部分 かおおわれるように印刷することができる。If desired, the dielectric ink layer is applied to the majority of the carbon and silver/silver chloride printed layers. Can be printed to cover.

この場合には、２個の区域、すなわち電気的接点区域および反応圏の下に位置す る感知区域か被覆されずに残る。このプリントは反応圏の区域を規定し、露出し たトラックを短絡から保護する作用をする。In this case, two areas, namely the electrical contact area and the reaction zone located below the Sensitive areas left uncovered. This print defines and exposes the area of the reaction sphere. This protects the track from short circuits.

作用電極に関しては、１種以上のインキを、反応圏内の導電性ｌ・ランクの１本 の頂部における規定区域内に、正確な厚さに堆積させ、酵素および半サンドイッ チ型メディエータ化合物を堆積させる。これをスクリーン印刷によって行うのか 好都合である。このインキを被着させる他の方法としては、イ゛ンキジェノト、 容積供給（ｖｏｌｕｍｍｅｔｒｉｃ　ｄｏｓｉｎｇ）　、グラビア印刷、フレキ ソ印刷および凸版印刷かある。Regarding the working electrode, one or more types of ink are applied to one of the conductive l rank in the reaction zone. Deposit the enzyme and semi-sandwich to a precise thickness within a defined area on top of the Deposit a Ti-type mediator compound. Can this be done by screen printing? It's convenient. Other methods of applying this ink include inkjet, Volumetric dosing, gravure printing, flexible There are Soviet printing and letterpress printing.

所要に応じて、残りの導電性トラック上に、ダミー電極を形成する第２の部分活 性インキを、各活性インキが銀／塩化銀インキで被覆された中央トラックから等 距離の導電性トラック上に被着するように、堆積することかできる。Optionally, on the remaining conductive tracks, a second partial active layer is applied to form a dummy electrode. active ink from the center track where each active ink is coated with silver/silver chloride ink, etc. It can be deposited over a distance of conductive tracks.

実施例 本発明を実施例についてさらに説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によ って限定されるものではない。Example The present invention will be further explained with reference to examples. However, the present invention does not rely on these examples. It is not limited to that.

有機金属試薬か関係するすべての反応およびその後の操作は、窒素雰囲気を使用 して無酸素・無水条件下に行った。ストレム・ケミカルス・インク（Ｓｔｒｅｍ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、）から、ヘキサカルボニルクロムおよびメチル シクロペンタジェニルマンガントリカルボニルを入手した。アルドリッチ・ケミ カルス（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ）から、１．１０−フェナントロリ ン、２，２′−ビピリジン、β−ソシクデキストリン水和物、ジメチルジチオカ ルバミン酸、ジエチルジチオカルバミン酸および４−モルホリンカルボジチオ酸 を購入した。シス１，２−ジシアノエチレン−１，２ジチオ酸ジナトリウムは公 知の方法（［インオルガニック・ケミストリイＪ　５　（１９６６）１１５７） によって製造した。All reactions and subsequent operations involving organometallic reagents use a nitrogen atmosphere. The test was carried out under anoxic and anhydrous conditions. Strem Chemicals, Inc. Chemicals, Inc.), hexacarbonylchromium and methyl Cyclopentadienylmanganese tricarbonyl was obtained. aldrich kemi From Callus (Aldrich Chemicals), 1.10-phenanthroli 2,2'-bipyridine, β-socyclodextrin hydrate, dimethyl dithioca Rubamic acid, diethyldithiocarbamic acid and 4-morpholinecarbodithioic acid I bought it. Disodium cis-1,2-dicyanoethylene-1,2-dithioate is a publicly available Methods of knowledge ([Inorganic Chemistry J 5 (1966) 1157) Manufactured by.

生成物である化合物は「化合物６」というように化合物番号で示した。The product compound is indicated by a compound number such as "Compound 6."

０．１Ｍグルコースを含有する０、　１５Ｍ　ＩＪン酸塩（支持電解質として０ ．２Ｍ塩化ナトリウムを含有する）のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を、メルク社（Ｍ ｅｒｃｋ　ＢＤＨ）からのアナラー（Ａｎａｌａｒ）試薬を使用して製造した。0,15M IJ phosphate containing 0.1M glucose (0 as supporting electrolyte) ．． Phosphate buffered saline (PBS) containing 2M sodium chloride was prepared from Merck & Co. (M was prepared using the Analar reagent from Erck BDH.

この緩衝液を４°Ｃにおいて一夜貯蔵し、その後にα−アノマーとβ−アノマー とを平衡させるのに使用した。グルコースオキシダーゼ（アスペルギルス・ニゲ ル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）からのＥＣ１，１，３，４）はスタ ーク・エンチームス社（Ｓｔｕｒｇｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）から入手した。ホーラ デイッシュペルオキソダーゼはバイオチーム社（Ｂｉｏｚｙｍｅ）から入手した 。This buffer was stored overnight at 4°C and then the α- and β-anomers were was used to equilibrate the Glucose oxidase (Aspergillus niger) (EC1, 1, 3, 4) from Aspergillus niger) Obtained from Sturge Enzymes. Hora Dish peroxodase was obtained from Biozyme. .

以下の実施例では、次の添付図面を参照されたい。In the following examples, reference is made to the following accompanying drawings.

図面の簡単な説明 図１は、クロム錯体化合物６の環状ポルタモグラムである。Brief description of the drawing FIG. 1 is a cyclic portammogram of chromium complex compound 6.

図２（ａ）は、クロム錯体化合物６を含有する電極の環状ポルタモグラムてあり 、図２（ｂ）は、グルコースオキシダーゼを添加した場合の触媒波である。Figure 2(a) shows the annular portammogram of the electrode containing chromium complex compound 6. , FIG. 2(b) shows the catalytic wave when glucose oxidase is added.

図３は、グルコースオキシダーゼをマンガン錯体化合物８て滴定した際に得られ た触媒波である。Figure 3 shows the results obtained when glucose oxidase was titrated with manganese complex compound 8. This is a catalytic wave.

図４は、図３の触媒波から得たデータをプロットしたグラフである。FIG. 4 is a graph plotting data obtained from the catalytic wave of FIG.

図５は、マンガン錯体化合物１６の環状ポルタモグラムである。FIG. 5 is a cyclic portammogram of manganese complex compound 16.

図６は、（ａ）マンガン錯体化合物ｌＯのβ−シクロデキストリン付加物の環状 ポルタモグラムおよび（ｂ）グルコースオキシダーゼを添加した場合の触媒波を 示すグラフである。Figure 6 shows (a) the cyclic form of β-cyclodextrin adduct of manganese complex compound IO. Portamogram and (b) Catalytic wave when glucose oxidase is added. This is a graph showing.

図７は、異なる量のβ−シクロデキストリンの存在下におけるマンガン錯体化合 物１６の環状ポルタモグラムである。Figure 7 shows the manganese complex compounds in the presence of different amounts of β-cyclodextrin. It is a circular portammogram of object 16.

図８（ａ）は、マンガン錯体化合物ＩＯを含有する電極の環状ポルタモグラムで あり、図８（ｂ）は、マンガン錯体化合物１１を含有する電極の環状ポルタモグ ラムてあり、図８（Ｃ）は、マンガン錯体化合物１２を庁有する電極の環状ポル タモグラムである。Figure 8(a) is a cyclic portammogram of an electrode containing manganese complex compound IO. 8(b) shows the annular portamoglycan of the electrode containing the manganese complex compound 11. Figure 8(C) shows the cyclic polymer of the electrode containing the manganese complex compound 12. It is a tamogram.

図９（ａ）は、マンガン錯体化合物ｌＯを含有する電極の環状ポルタモグラムで あり、図９（ｂ）は、グルコースオキシダーゼを添加した場合の触媒波である。Figure 9(a) is a circular portammogram of an electrode containing the manganese complex compound IO. 9(b) shows the catalytic wave when glucose oxidase is added.

図ＩＯは、平衡したグルコースオキシダーゼ／化合物ＩＯ電極のグルコースに対 する応答を示すグラフである。Figure IO shows the balanced glucose oxidase/compound IO electrode relative to glucose. FIG.

実施例１ アレーンクロムトリカルボニル錯体を、文献（［インオルガニック・シンセシス 」第１９巻（１９７９）第１５４頁）記載の一般的方法に従って、ジ−ｎ−ブチ ルエーテル／テトラヒドロフラン（１０・ｌ）を還流させ、このなかで適当なア レーンをＣｒ（ＣＯ）ｓ　と共に還流させることにより製造した。（ＭｅＣｐＭ ｎ（ＮＯ）（Ｃｏ）２　）　ＰＦ、化合物９を、キング（Ｋｉｎｇ）およびビス ネット（Ｂｉｓｎｅｔｔｅ）の方法（［インオルガニック・ケミストリイ」第６ 巻（１９６７）第４６９頁）により製造した。文献に記載されている方法を使用 して（ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯＸＣＮ）２）　Ｎａ化合物１３（〔ジャーナル・オブ ・カルガノメタリック・ケミストリイ」第　１７０巻（１９７９）第２１７頁、 （ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯ）（ｂｉｐｙ））ＰＦ、化合物１４（［インオルガニック ・ケミストリイ」第８巻（１９６９）第１３４０頁）、（ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯＸ ｐｈｅｎ））　ＰＦｓ化合物Ｉ５（「インオルガニック・ケミストリイ」第８巻 （＋９６９）第１３４０頁）　（ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯＯ３，ＣＮＭｅｚ）　）化 合物ｌＯ（［インオルガニック・ケミストリイ」第８巻（１９６９）第１３４０ 頁）、（ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯ）（Ｓ２ＣＮＥｔｚ）　）化合物１１（ｒインオル ガニック・ケミストリイ］第８巻（１９６９）第１３４０頁）、および（ＭｅＣ ｐＭｎ（ＮＯ）　＋（ＳＣＣＮ）２　＋　）　（ＮＥｔ４）化合物１６（［イン オルガニック・ケミストリイ」第８巻（１９６９）第１３４０頁）を合成した。Example 1 Arene chromium tricarbonyl complexes were prepared in the literature ([inorganic synthesis ” Vol. 19 (1979) p. 154). ether/tetrahydrofuran (10 L) is refluxed. The lanes were prepared by refluxing with Cr(CO)s. (MeCpM n(NO)(Co)2) PF, compound 9 was prepared from King and Bis Bisnette's method ([Inorganic Chemistry] No. 6) (1967), p. 469). Using methods described in the literature (MeCpMn(NOXCN)2) Na compound 13 ([Journal of ・Carganometallic Chemistry” Volume 170 (1979) Page 217, (MeCpMn(NO)(bipy))PF, compound 14 ([inorganic ・Chemistry” Vol. 8 (1969), p. 1340), (MeCpMn(NOX phen)) PFs Compound I5 ("Inorganic Chemistry" Volume 8 (+969) page 1340) (MeCpMn(NOO3, CNMez)) Compound lO ([Inorganic Chemistry] Vol. 8 (1969) No. 1340 Page), (MeCpMn(NO)(S2CNEtz)) Compound 11 (r-inol [MeC Chemistry] Volume 8 (1969) Page 1340), pMn(NO) + (SCCN)2 + ) (NEt4) Compound 16 ([in Organic Chemistry, Vol. 8 (1969, p. 1340).

［ＭｅＣｐＭｎ（Ｎｏ）　（ｓ２ｃ罷訂扉πｃｏ、ｃｕｔ：＋　）化合物１２の 製造：塩（ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯ）（ＣＯ）ｔ　）　ＰＦ＠化合物９　（１，５ｇ 、４．１　ミリモル）を温脱気アセ１−ン（４５ｍｌ）中に溶解した。この溶液 をかきまぜ、５０ｍ１のエタノール／アセトン（１：　１）中の４−モルホリン カルボジチオ酸（１，０３ｇ、４．１１ミリモル）と１５ｍ１の水との混合物で 処理した。赤褐色への色変化と共に一酸化炭素ガスの放出か観察された。かきま ぜを４５°Ｃにおいて２時間続けた。濾過して溶液を得、この溶液中の溶媒の容 積を真空下に減少させ、次いで冷却することにより、この溶液から黒褐色の粗生 成物を得た。生成した沈殿を濾別し、沸騰する石油エーテル（４０〜６０°Ｃ） ／アセトンから再結晶し、２０°Ｃにおいて３日間貯蔵した後に化合物Ｉ２の褐 色針状結晶（０，２ｇ、Ｉ　５９６）を得た。[MeCpMn (No) (s2c cancellation door πco, cut: +) of compound 12 Production: Salt (MeCpMn(NO)(CO)t) PF @ Compound 9 (1.5g , 4.1 mmol) was dissolved in hot degassed acetone (45 ml). This solution Stir 4-morpholine in 50 ml of ethanol/acetone (1:1). In a mixture of carbodithioic acid (1,03 g, 4.11 mmol) and 15 ml of water Processed. A color change to reddish brown was observed along with the release of carbon monoxide gas. Scratch The heating was continued for 2 hours at 45°C. Filter to obtain a solution and determine the volume of solvent in this solution. A black-brown crude product is obtained from this solution by reducing the volume under vacuum and then cooling. A product was obtained. The formed precipitate was filtered and boiled in petroleum ether (40-60°C). The brown color of compound I2 after recrystallization from /acetone and storage for 3 days at 20 °C. Colored needle-like crystals (0.2 g, I596) were obtained.

融点：１１２〜１１３℃ 分析結果・ 実測値：　Ｃ，４０，７８；Ｈ，４，７０；Ｎ、８．５３Ｃ＋　＋ｔＬ　ｓＮｚ Ｏｚｓ２Ｍｎに対する計算値：Ｃ，４０，４９、Ｈ，４，６３，Ｎ、８．５８（ ＭｅＣｐＭｎ（ＮＯＸＳ２ＣＮＭｅｚ）　：ｌβ−シクロデキストリンの製造： 使用した方法は、既に報告されているフェロセン−β−シクロデキストリン（＝ ｆ加物の製造方法（「ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・ダルト ン・トランスアクションＪ（１９９］）第２２７４頁）から採用した。Melting point: 112-113℃ result of analysis· Actual value: C, 40,78; H, 4,70; N, 8.53C+ +tL sNz Calculated values for Ozs2Mn: C, 40, 49, H, 4, 63, N, 8.58 ( MeCpMn (NOXS2CNMez): Production of lβ-cyclodextrin: The method used was the previously reported ferrocene-β-cyclodextrin (= Process for producing additives (Journal of the Chemical Society Dalto Transaction J (199), p. 2274).

β−シクロデキストリン水和物（２，５０ｇ、２．２ミリモル）を窒素雰囲気下 に７０’Ｃにおいて水（２５ｙｄ）に溶解した。次いで、固体の（ＩＪｅＣｐＭ ｎ（Ｎｏ）（Ｓ２ＣＮＭｅｚ）　）化合物１０　（０，２８４ｇ、１．０ミリモ ル）を添加し、生成した混合物をかきまぜ、７０°Ｃにおいて７時間加熱した。β-cyclodextrin hydrate (2.50 g, 2.2 mmol) was added under nitrogen atmosphere. Dissolved in water (25 yd) at 70'C. Then the solid (IJeCpM n(No) (S2CNMez)) Compound 10 (0,284g, 1.0mmol The resulting mixture was stirred and heated at 70°C for 7 hours.

冷却後、沈殿を濾別し、充分水洗し、次いでエタノールおよびジエチルエーテル で洗浄した。所要の付加物（０，４０５ｇ）を褐色粉末として得た。融点は３０ ０”Ｃで分解を伴った。粗生成物についての最初の微量分析結果は、生成物が数 分子の結晶水を有するＩｌｌ付加物であることを示した。After cooling, the precipitate was filtered, washed thoroughly with water, and then treated with ethanol and diethyl ether. Washed with. The required adduct (0,405 g) was obtained as a brown powder. Melting point is 30 Decomposition occurred at 0"C. Initial microanalysis results on the crude product showed that the product was It was shown to be an Ill adduct with molecular water of crystallization.

実施例２ ベンゼンクロムトリカルボニルの半波電位はジクロロメタン中で標準カロメル電 極（ＳＣＥ）に対して＋７１０＋ｙ＋Ｖであると記録されている（ジャーナル・ オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・ダルトン・トランスアクションＪ　（１９ ７３）第１７６８頁）。この錯体は緩衝液中で無視できる溶解性を示した。しか し、テトロヒドロフラン／ジ−ｎ−ブチルエーテル中でヘキサカルボニルクロム を置換ベンゼン化合物と共に熱分解する方法（「インオルガニック・シンセシス 」第１９巻（１９７９）第１５４頁）を使用して、誘導体を簡単に製造すること ができた。生成する錯体の水に対する溶解度が大きくなると共に中点電位値が小 さくなることを期待して、環にアミンが直接結合しているアレーンを選定した。Example 2 The half-wave potential of benzene chromium tricarbonyl is the standard calomel potential in dichloromethane. It is recorded as +710+y+V with respect to the pole (SCE) (Journal Of the Chemical Society Dalton Transaction J (19 73) p. 1768). This complex showed negligible solubility in buffer. deer and hexacarbonylchromium in tetrahydrofuran/di-n-butyl ether. A method of thermally decomposing a compound with a substituted benzene compound (inorganic synthesis) ” Vol. 19 (1979, p. 154) to easily produce derivatives. was completed. As the solubility of the resulting complex in water increases, the midpoint potential value decreases. We selected an arene with an amine directly bonded to the ring in the hope that it would reduce the particle size.

一連の７種の錯体について検討を行い、これらの錯体が次表に示すように水溶液 では＋２８０ｍＶ〜＋４０ｍＶの範囲で電気化学現象を示すことを観察した。A series of seven types of complexes were investigated, and these complexes were dissolved in aqueous solution as shown in the following table. It was observed that an electrochemical phenomenon was exhibited in the range of +280 mV to +40 mV.

図１はＰＢＳ中５０ｍＶ／ｓにおけるクロム錯体化合物６の環状ポルタモグラム である。化合物６は緩衝水溶液中における溶解性に乏しいが、図１に示すように 、可逆波を示す唯一の化合物であった。以後の検討は化合物６に限定して行った 。Figure 1 shows the cyclic portammogram of chromium complex compound 6 at 50 mV/s in PBS. It is. Compound 6 has poor solubility in aqueous buffer solution, but as shown in Figure 1, , was the only compound that showed reversible waves. Subsequent studies were limited to compound 6. .

実施例３ クロム錯体を３．５　ｍｇ／　ｇインキのレベルで含有する有機カーボンインキ から、スクリーン印刷された化合物６混入電極を製造した。図２（ａ）はＰＢＳ 中５０ｍＶ／Ｓおよび０．２　ｕＡ　／ｃ＋ｎにおけるクロム錯体を含有する電 極の環状ポルタモグラムであり、図２（ｂ）は１００μｌのグルコースオキシダ ーゼ添加後に２０ｍＶ／ｓおよび０．５μＡ／ｃｍにおいて記録された触媒波で ある。Example 3 Organic carbon ink containing chromium complex at a level of 3.5 mg/g ink A screen-printed compound 6-loaded electrode was prepared from the following. Figure 2(a) is PBS Voltage containing chromium complex at 50 mV/S and 0.2 uA/c+n Figure 2(b) is a polar annular portamogram. With catalytic waves recorded at 20 mV/s and 0.5 μA/cm after addition of be.

図２（ａ）から、ＰＢＳが電極に被着していても一１５ｍＶという低い中点電位 値では、可逆波が記録されたことが判る。From Figure 2(a), even if PBS is attached to the electrode, the midpoint potential is as low as -15 mV. The values show that reversible waves were recorded.

Ｒ２（ｂ）から、酵素とグルコースとの混合物を電極が被着していると、ＣＯＤ メゾイエ−ジョンか生起し、触媒電流は約ＩμＡであることが判る。From R2(b), if the electrode is coated with a mixture of enzyme and glucose, the COD It can be seen that meso-ionization occurs and the catalytic current is about IμA.

この結果は重要である。その理由は、錯体かカーボン電極に混入されている場合 には、疎水性の極めて大きい錯体を使用してＣＯＤに対してメゾイエ−ジョンす ることができることを、上述の結果が示すからである。また、この結果はメディ エータとしての遷移金属半サンドイッチ型錯体の電位を示す。This result is important. The reason is that if it is mixed into the complex or the carbon electrode. For this purpose, an extremely hydrophobic complex is used to perform meso-ionization against COD. This is because the above results show that it is possible. Also, this result is The potential of a transition metal semi-sandwich complex as eta is shown.

実施例４ マンガン半サンドイッチ型錯体を（メチルシクロペンタンジェニル）マンガント リカルボニル化合物８がら得ることができた。この化合物８は無鉛ガソリンにお けるアンチノック剤として大規模に使用されているので、高価でなく容易に入手 できる出発材料である。例えば、次の反応図式に示されているように、トリカル ボニル化合物８を亜硝酸（「インオルガニック・ケミストリイ」第６巻（１９６ ７）第４６９頁）またはニトロソニウムイオン（「ジャーナル・才ブ・カルガノ メタリック・ケミストリイ」第５６巻（１９７３）第３４５頁）で処理すること により生成したニトロシル陽イオン化合物９を経由して広範囲の種々のカルボニ ル置換化学を実施した。Example 4 Manganese semi-sandwich type complex (methylcyclopentanenyl) manganese Licarbonyl compound 8 could be obtained. This compound 8 is added to unleaded gasoline. It is used on a large scale as an anti-knock agent, so it is not expensive and easily available. It is a starting material that can be used. For example, as shown in the following reaction scheme, trical Bonyl compound 8 was replaced with nitrous acid ("Inorganic Chemistry" Vol. 6 (196 7) p. 469) or nitrosonium ion (Journal Saibu Calgano) Metallic Chemistry, Vol. 56 (1973), p. 345) A wide variety of carbonyl compounds can be synthesized via the nitrosyl cation compound 9 produced by Replacement chemistry was carried out.

反応図式 シクロペンタジェニルマンガントリカルボニル１１本はフェロセンより酸化困難 であり、その酸化電位はアセトニトリル中ではフェロセンより約１．２Ｖ大きい （［ジャーナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリイ」第１０１巻（１９ ７５）第Ｃ４３頁）。ニトロンル陽イオン化合物９は緩衝水溶液中て容易に分解 して＋２３０ｍＶにおいて可逆的に酸化される物質を生成する。しかし、化合物 ８をシアン化物イオンで処理する（［ジャーナル・オブ・オルガノメタリック・ ケミストリイ」第１７０巻（１９７９）第２１７頁）と、陰イオンジシアノ錯体 化合物１３が得られ、この化合物は水溶性が大きく、＋４４０ｍＶにおいて可逆 波を示す。図３は、マンガン錯体化合物８を０．１Ｍグルコース／ＰＢＳ中に溶 解した溶液中に０〜２５μｌのＣＯＤを滴定したものを使用して、グルコースオ キシダーゼをマンガン錯体化合物８て滴定した際に、５　ｍＶ／　ｓおよび５μ Ａ／ｃｍにおいて得られた触媒波を示す。振幅の次第に増加する一連の触媒波が 得られた。文献（「プログレス・イン・リアクション・カイネティクス（Ｐｒｏ ｇ、　Ｒｅａｃｔ、　Ｋｉｎｅｔ、　Ｊ第１６巻（１９９１）第５５頁、および 「ジャーナル・才ブ・エレクトロアナリティカル・ケミストリイ」第２９３頁（ １９９０）第５５頁）記載の方法に従ってプロットした図４に示す触媒電流１ｅ ａｆ対〔ＧＯＤ）”’のグラフから、還元されたＣＯＤを酸化する場合の二次速 度係数２．Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　Ｍ”ｓ−’を得た。この速度定数は好都合にもフ ェロセンの場合に得られた値、例えばフェロセンモノカルボン酸の場合の２．Ｏ Ｘ　Ｉ　Ｏ’　Ｍ−’ｓ−’　（ｒアナリティカル・ケミストリイ」第５６巻（ １９８４）第６６７頁）に匹敵いくつかの他のマンガン半サンドイッチ型化合物 を化合物９から製造した。文献（「ジャーナル・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエ ティ（Ａ）Ｊ　（１９７０）第８５０頁）記載の方法に従って、化合物９を二座 配位子である２、２−ビピリジンおよび］、　１０−フェナントロリンで処理す ることにより、それぞれ陽イオン化合物１４および１５を得た。両錯体とも約６ ００ｍＶの電位において不可逆的電気化学現象を示した。reaction scheme Cyclopentadienyl manganese tricarbonyl 11 is more difficult to oxidize than ferrocene and its oxidation potential is approximately 1.2 V higher than ferrocene in acetonitrile. ([Journal of Organometallic Chemistry] Volume 101 (19 75) No. C43). Nitrone cationic compound 9 is easily decomposed in buffered aqueous solution. to produce a substance that is reversibly oxidized at +230 mV. However, the compound 8 with cyanide ions ([Journal of Organometallics Chemistry, Vol. 170 (1979, p. 217) and anionic dicyano complexes. Compound 13 was obtained, which is highly water soluble and reversible at +440 mV. Showing waves. Figure 3 shows manganese complex compound 8 dissolved in 0.1 M glucose/PBS. Using a titration of 0 to 25 μl of COD in the dissolved solution, glucose When oxidase was titrated with manganese complex compound 8, 5 mV/s and 5μ The catalytic waves obtained in A/cm are shown. A series of catalytic waves of increasing amplitude Obtained. Literature (Progress in Reaction Kinetics (Pro g, React, Kinet, J Volume 16 (1991) Page 55, and “Journal of Electro-Analytical Chemistry” p. 293 ( The catalytic current 1e shown in FIG. 4 was plotted according to the method described in 1990), p. From the graph of af vs. [GOD)'', the second order rate when oxidizing reduced COD Degree coefficient 2. We obtained I The values obtained in the case of ferrocene, for example 2. in the case of ferrocene monocarboxylic acid. O X I O’ M-’s-’ (r Analytical Chemistry” Volume 56 ( (1984) p. 667) and some other manganese semi-sandwich compounds. was prepared from compound 9. Literature (Journal of the Chemical Society Compound 9 was bidentately prepared according to the method described by T. (A) J. (1970) p. 850). Treated with the ligands 2,2-bipyridine and ], 10-phenanthroline. By doing so, cationic compounds 14 and 15 were obtained, respectively. Both complexes are about 6 It showed an irreversible electrochemical phenomenon at a potential of 00 mV.

化合物１６をシス−１，２−ジシアノエチレン−１，２−ジチオレートから製造 した（［インオルガニック・ケミストリイ」第８巻（１９６９）第１３４０頁） 。図５は５０ｍＶ／ｓおよび２μＡ／ｃｍにおけるＰＢＳ中０．６ｍＭのマンガ ン錯体化合物１６の環状ポルタモグラムである。陰イオンジチオレン錯体の場合 に著しく低い一２５ｍＶというＥ、、、が実測されたが、酸化された形のもの（ 中性物質）は緩衝液に不溶性であることが判った。生成した電極被覆は酵素滴定 か不可能になったことを意味する。Compound 16 is prepared from cis-1,2-dicyanoethylene-1,2-dithiolate ([Inorganic Chemistry] Vol. 8 (1969) p. 1340) . Figure 5 shows 0.6mM manga in PBS at 50mV/s and 2μA/cm. 1 is a cyclic portammogram of complex compound 16. For anionic dithiolene complexes A significantly low E of -25 mV was actually measured for the oxidized form ( Neutral substances) were found to be insoluble in the buffer. The generated electrode coating is enzymatically titrated. It means that it has become impossible.

文献（「インオルガニック・ケミストリイ」第８巻（１９６９）第１３４０頁） 記載の方法に従って、ジチオカルバメート錯体化合物ｌＯおよび＋１を製造した 。また、この方法を使用して新規化合物であるモルホリノジチオカルバメート錯 体化合物１２を製造した。化合物ｌＯ〜１２は緩衝液に対して無視てきる溶解性 を示すので、これらの化合物の電気化学現象の実測か妨げられることか判った。Literature (Inorganic Chemistry, Vol. 8 (1969), p. 1340) Dithiocarbamate complex compounds IO and +1 were prepared according to the method described. . We also used this method to develop a new compound, a morpholinodithiocarbamate complex. Compound 12 was prepared. Compound lO~12 has negligible solubility in buffer It was found that the actual measurement of electrochemical phenomena of these compounds was hindered.

実施例６ 文献には、フェロセンがβ−シクロデキストリン（β−ｃｄ）の疎水活性に包接 （ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）されると、フェロセンの物理的性質か変化するか、その 水溶性は全く増加しないことを記載している報文か多い。β−シクロデキストリ ン中に混入されたフェロセンの中点電位値は、僅かなプラスの移動を示すことが 報告されており（［ジャーナル・才ブ・ザ・オルガニック・ケミストリイ」第５ ６巻（１９９１）第３５頁、［バイオエレクトロケミストリイ・アンド・バイオ エネルジティクス（Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｅｎｅｒｇ、）Ｊ 第２４巻（＋９９０）第２５７頁）、ＧＯＤの場合にフェロセンのメゾイエ−ジ ョンがβ−シクロデキストリンによって抑制されることか報告されている。β− シクロデキストリンかマンガン錯体を受容（ｈｏｓｔ）するという報告があると は思われない。Example 6 In the literature, ferrocene is included in the hydrophobic activity of β-cyclodextrin (β-CD). (inclusion), the physical properties of ferrocene change or their Many reports state that water solubility does not increase at all. β-cyclodextrin The midpoint potential value of ferrocene mixed in the liquid may show a slight positive shift. It has been reported ([Journal of Organic Chemistry] No. 5) Volume 6 (1991) Page 35, [Bioelectrochemistry and Bio Energetics (Bioelectrochem, Bioenerg,) J Vol. 24 (+990) p. 257), meso-age of ferrocene in the case of GOD It has been reported that this reaction is inhibited by β-cyclodextrin. β− There are reports that it hosts cyclodextrin or manganese complexes. I don't think so.

７０°Ｃにおいてβ−シクロデキストリン水溶液中で固体の錯体化合物ＩＯを単 にかきまぜることによりｌ：１包接錯体か生成し、この混合物を冷却すると前記 包接錯体が沈殿することを認めた。図６は、（ａ）　０．１　Ｍグルコース／Ｐ ＢＳ中におけるマンガン錯体化合物ＩＯとβ−シクロデキストリンとの付加物の 環状ポルタモグラムおよび（ｂ）５０μｌのグルコースオキシダーゼの添加後の 触媒波を示すグラフである。この包接錯体は＋２２５ｍＶにおいて可逆波を示し 、八Ｅ、＝７０ｍＶであり、ＧＯＤおよびグルコースを添加した後に触媒電流（ ｉ−＋）　＝　９．７μＡを有する触媒波が実測された。The solid complex compound IO was dissolved in an aqueous β-cyclodextrin solution at 70°C. By stirring, a l:1 inclusion complex is formed, and when this mixture is cooled, the above-mentioned It was observed that the inclusion complex precipitated. Figure 6 shows (a) 0.1 M glucose/P Adduct of manganese complex compound IO and β-cyclodextrin in BS Cyclic portamogram and (b) after addition of 50 μl glucose oxidase. It is a graph showing catalytic waves. This inclusion complex shows reversible waves at +225 mV. , 8E, = 70 mV, and the catalytic current ( A catalytic wave having i−+)=9.7 μA was actually measured.

実施例７ β−シクロデキストリンが中性のマンガン半サンドイッチ型錯体を受容てきるこ とが明らかになり、またβ−シクロデキストリンが先に記載した陰イオン錯体化 合物１６の酸化された不溶性の形のものに対する安定剤として作用することが観 察された。緩衝液中の０．５ｍＭ化合物１６溶液の環状ポルタモグラムは、この 物質が電極上に沈殿しつつあることを示す特性を有している。しかし、β−シク ロデキストリン（０，５〜５．０ｍＭ）を添加すると可逆波が生成する。図７（ ａ）は種々の量のＰＢＳ単独の存在下、図７（ｂ）は０．５ｍＭのβ−シクロデ キストリンを含有する種々の量のＰＢＳの存在下、図７（ｃ）はｌ　ＯｍＭのβ −シクロデキストリンを含有する種々の量のＰＢＳの存在下、図７（ｄ）は５． ０ｍＭのβ−シクロデキストリンを含有する種々の量のＰＢＳの存在下における マンガン錯体化合物１６の環状ポルタモグラムである。波はＥ””＝＋５ｍＶ、 ΔＥ、＝６ｍＶを示す。Example 7 The ability of β-cyclodextrin to accept neutral manganese half-sandwich complexes It has been revealed that β-cyclodextrin undergoes the previously described anion complexation. It has been observed that it acts as a stabilizer for the oxidized insoluble form of compound 16. It was noticed. The circular portamogram of a 0.5mM compound 16 solution in buffer is It has properties that indicate that the substance is precipitating on the electrode. However, β-sik Addition of lodextrin (0.5-5.0 mM) generates reversible waves. Figure 7 ( a) in the presence of various amounts of PBS alone, Figure 7(b) in the presence of 0.5mM β-cyclode In the presence of various amounts of PBS containing kistrin, Figure 7(c) showed that lOmM β - In the presence of various amounts of PBS containing cyclodextrin, Figure 7(d) shows 5. in the presence of various amounts of PBS containing 0 mM β-cyclodextrin. It is a cyclic portammogram of manganese complex compound 16. The wave is E””=+5mV, ΔE,=6mV is shown.

ジチオカルバメート錯体化合物ｌＯ〜１２について、各錯体を混入したカーボン インキから製造したスクリーン印刷されたカーボン電極を使用してさらに検討を 行った。図８に示すように、（ａ）化合物１Ｏ１（ｂ）化合物１１、および（ｃ ）化合物１２のそれぞれについて、０．５μＡ／ｃｍにおいて５０ｍＶ／ｓおよ び１００ｍＶ／ｓの走査速度を使用して＋２４０ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋２ ９０ｍＶにおいて酸化波を観察した。４μＡ領域における触媒波をＣＯＤおよび グルコースの存在下に記録した。メディエータと共に酵素をカーボン電極中に混 入した場合には、０．１Ｍグルコースの場合に、変動するが２９μ八まで増大す る電流か得られた、図９参照。Regarding dithiocarbamate complex compounds lO~12, carbon mixed with each complex Further studies using screen-printed carbon electrodes made from ink went. As shown in FIG. 8, (a) compound 1O1, (b) compound 11, and (c ) for each of compound 12 at 50 mV/s and 0.5 μA/cm. +240 mV, +300 mV and +2 using a scan rate of 100 mV/s Oxidation waves were observed at 90 mV. COD and catalytic waves in the 4μA region Recorded in the presence of glucose. Mixing the enzyme with the mediator into the carbon electrode In the case of 0.1M glucose, it increases to 29μ8 although it fluctuates. The current was obtained, see Figure 9.

これらのメディエータ／酵素電極は、＋４５０ｍＶで平衡させた場合に、図１Ｏ に示すように、０〜１３ｍＭの範囲のグルコースに対して線形に応答した。酵素 を含有するカーボンインキの配合物中にエチレングリコールを混入すると、Ｏ， １Ｍグルコースの場合に１９０μＡまでの電流が生じた。These mediator/enzyme electrodes were shown in Figure 1O when equilibrated at +450 mV. As shown, it responded linearly to glucose in the range of 0-13mM. enzyme When ethylene glycol is mixed into a carbon ink formulation containing O, Currents of up to 190 μA were generated for 1M glucose.

実施例９ ホースラディツシュペルオキシド（ＨＲＰ）を使用した場合に、マンガン錯体化 合物ＩＯとβ−シクロデキストリンとの付加物かメゾイエ−ジョン作用する性質 を、文献（「アナリティカル・ケミストリイ」第６２巻（１９９０）第２４２９ 頁）記載の方法に従って、回転リング・ディスク・ポルタンメトリーを使用して 、１．１’　−ジメチルフェロセンエタノールアミンと比較することにより評価 した。実験は白金反対電極とカロメル基準電極とを収容しているガラス容器（容 積１４−）を使用して行った。金・金リング・ディスク電極を４Ｈｚにおいて回 転させて、２８０単位（２８０Ｕ）のＨＲＰを含有するメディエータ（０，５ｍ Ｍ）のリン酸緩衝食塩水中に浸漬した。次いで、リング電極を一１００ｍＶにお いて平衡させ、ディスク電極を一１００ｍＶから一６００ｍＶにわたって走査し て過酸化水素を発生させなから、触媒リング電流を測定した。続いてフェロセン および化合物１０とβ−シクロデキストリンとの付加物を使用して実験した結果 、同一の触媒電流が記録された。Example 9 Manganese complexation when using horseradish peroxide (HRP) Properties of adduct of compound IO and β-cyclodextrin that act as mesoylation , in the literature ("Analytical Chemistry" Vol. 62 (1990) No. 2429) page) using rotating ring-disk portammetry according to the method described. , 1. Evaluated by comparing with 1'-dimethylferroceneethanolamine did. The experiment was carried out using a glass container containing a platinum counter electrode and a calomel reference electrode. Product 14-) was used. The gold, gold ring, and disk electrodes were rotated at 4Hz. mediator (0.5 m M) in phosphate buffered saline. Then, the ring electrode was set to -100 mV. The disk electrode was scanned from -100 mV to -600 mV. The catalyst ring current was measured without generating hydrogen peroxide. followed by ferrocene and results of experiments using the adduct of compound 10 and β-cyclodextrin , the same catalytic current was recorded.

ＦＩＧ、１゜ ＦＩＧ、３゜ ＦＩＧ、４゜ ＦＩＧ、７゜ ＋＋Ｉ　ＩＡ−＋＋ＡＩ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９３１０１１７９ＤｒＴ／Ｉ’！０ １）ｔ／Ｉ’ｌｌ＋７１１１フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　２７／３２７ ＨＯ５Ｋ　１１０９　Ａ　６９２１−４Ｅ／／ＨＯＩＢ　１１０６　Ｚ　７２４ ４−５ＧＩFIG, 1° FIG, 3゜ FIG, 4° FIG, 7° ++I IA-++AI+ PCT/GB 93101179DrT/I'! 0 1) Continuation of t/I’ll+7111 front page (51) Int, C1,5 identification symbol Internal reference number GOIN 27/327 HO5K 1109 A 6921-4E // HOIB 1106 Z 724 4-5GI

Claims (10)

【特許請求の範囲】[Claims] １．メディエータ化合物を使用して、電極と酸化還元酵素または他の電子伝達酸 化還元タンパク質との間の電子伝達をメディエーションするに当たり、 前記メディエータ化合物は遷移金属の半サンドイッチ型錯体であり、前記錯体は 非局在化π結合を有する１個のπ配位子を有することを特徴とする電子伝達をメ ディエーションする方法。1. Using a mediator compound to connect the electrode to a redox enzyme or other electron-transfer acid In mediating electron transfer between redox proteins, The mediator compound is a semi-sandwich complex of a transition metal, and the complex is A method for electron transfer characterized by having one π ligand with a delocalized π bond. How to dedicate. ２．前記半サンドイッチ型メディエータ化合物は、次の一般式：（π配位子）Ｍ （非π配位子）ｎ （式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍは遷移金属原子を示し、 ｎはπ配位子ではない配位子の数を示し、非π配位子は同一または異なる一価ま たは多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を満たす作用を有するものを示 す）で表わされ、電荷を有するかあるいは中性である錯体であることを特徴とす る請求項１記載の方法。2. The semi-sandwich type mediator compound has the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n (The π ligand in the formula represents one π-bonded ligand, M represents a transition metal atom, n indicates the number of ligands that are not π-ligands, and non-π-ligands may be the same or different monovalent or or a polyvalent ligand that has the effect of satisfying the valence of the transition metal M. ) and is characterized by being a charged or neutral complex. 2. The method according to claim 1. ３．前記π配位子はアリル基、シクロプロペニル基、シクロブタジエン基、シク ロペンタジエニル基、ベンゼン基、シクロヘプタトリエニル基またはトリメチレ ンメタン基からなる群から選択した基であることを特徴とする請求項２記載の方 法。3. The π ligand is an allyl group, a cyclopropenyl group, a cyclobutadiene group, or a cyclobutadiene group. Lopentadienyl group, benzene group, cycloheptatrienyl group or trimethylene The method according to claim 2, characterized in that it is a group selected from the group consisting of methane groups. Law. ４．前記π配位子はアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、アミ ノアルキル基、置換アミノアルキル基、カルボン酸残基およびスルホン酸残基か らなる群から選択した基であることを特徴とする請求項２記載の方法。4. The π-ligand may be an alkyl group, an alkoxy group, an amino group, a substituted amino group, or an amino group. Noalkyl group, substituted aminoalkyl group, carboxylic acid residue and sulfonic acid residue 3. The method according to claim 2, wherein the group is selected from the group consisting of: ５．遷移金属Ｍは鉄、マンガンまたはクロムであることを特徴とする請求項２記 載の方法。5. Claim 2, wherein the transition metal M is iron, manganese or chromium. How to put it on. ６．非π配位子はいずれもカルボニル基、ホスフィン基、イソシアニド基、ニト ロシル基、ビピリジン基、フェナントロリン基およびジチエオレート基からなる 群から選択した基であることを特徴とする請求項２記載の方法。6. All non-π ligands are carbonyl groups, phosphine groups, isocyanide groups, and nitride groups. Consists of rosyl group, bipyridine group, phenanthroline group and dithiolate group 3. A method according to claim 2, characterized in that it is a group selected from the group. ７．前記遷移金属半サンドイッチ型化合物をβ−シクロデキストリン中の包接錯 体として使用することを特徴とする請求項１記載の方法。7. The transition metal semi-sandwich type compound is added to an inclusion complex in β-cyclodextrin. The method according to claim 1, characterized in that the method is used as a body. ８．検体に対する電流測定用酵素センサにおいて、メディエータとして遷移金属 半サンドイッチ型化合物が使用されていることを特徴とする電流測定用センサ。8. Transition metals are used as mediators in enzyme sensors for measuring current to analytes. A current measurement sensor characterized by using a semi-sandwich type compound. ９．電流測定用酵素センサに使用される乾燥した使い捨てテスト用帯状部材にお いて、 前記使い捨てテスト用帯状部材は作用電極、少なくとも１種の酸化還元酵素と遷 移金属半サンドイッチ型メディエータ化合物とを含有する検体レベルを示す電流 を発生させるためテスト用試薬、および基準電極を具えることを特徴とする使い 捨てテスト用帯状部材。9. For dry, disposable test strips used in enzyme sensors for amperometric measurements. There, The disposable test strip includes a working electrode, at least one oxidoreductase, and a transition electrode. a current indicating the level of an analyte containing a transfer metal semi-sandwich mediator compound; a test reagent and a reference electrode for generating Strip-shaped member for disposable testing. １０．導電性印刷インキにおいて、 遷移金属半サンドイッチ型メディエータ化合物を含有することを特徴とする導電 性印刷インキ。10. In conductive printing ink, Conductive material characterized by containing a transition metal semi-sandwich type mediator compound Gender printing ink.