JP3288044B2 - Mediator for oxidoreductase - Google Patents
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- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は酸化還元酵素に対するメディエータ（mediat
or）に関するものである。特に、本発明は電流測定用
（amperometric）酵素電極に使用する上述のメディエー
タに関するものである。The present invention relates to a mediator for oxidoreductase (mediat).
or). In particular, the present invention relates to a mediator as described above for use in an amperometric enzyme electrode.
背景技術 電流測定用酵素電極は、例えば、ターナー（Turne
r）、カルーベ（Karube）およびウィルソン（Wilson）
編「バイオセンサース・ファンダメンタルス・アンド・
アプリケェィションス（BIOSENSORS,Fundamentals and
Applications」オックスフォード大学出版部（1987）に
記載されている。本発明の背景技術についてはこの刊行
物を参照されたい。BACKGROUND ART Enzyme electrodes for current measurement are, for example, Turner (Turne).
r), Karube and Wilson
"Biosensors Fundamentals and
Applications (BIOSENSORS, Fundamentals and
Applications "Oxford University Press (1987). See this publication for background art of the present invention.
電極と酸化還元酵素との間の電気的伝達が電流測定用
酵素電極の重要な特性である。一般に、これは低分子量
の迅速に拡散するメディエータと迅速な酸化還元カップ
ルとを使用して達成されている。フェナジン、メトサル
フェート、2.6−ジクロロインドフェノール、キノン類
およびフェニレンジアミド類のような有機化合物がグル
コースオキシダーゼ（GOD）と一緒に使用される第１の
この種のものである。しかし、これらの化合物には安定
性が小さく、酸化還元電位がpHに依存する等のいくつか
の問題がある。これらの問題はオクタシアノタングステ
ート、ヘキサシアノフェレート、ヘキサシアノルテネー
ト、ルテニウムアミン複合体、オスミウム複合体、およ
び金属ポルフィリンのような無機化合物を使用すること
によって取り組まれている。ビピリジンおよびフェナン
トロリンの金属錯体も示唆されている。Electrical transfer between the electrode and the oxidoreductase is an important property of an enzyme electrode for amperometry. Generally, this has been achieved using low molecular weight, rapidly diffusing mediators and rapid redox couples. Organic compounds such as phenazine, methosulfate, 2.6-dichloroindophenol, quinones and phenylenediamides are the first of this type to be used with glucose oxidase (GOD). However, these compounds have some problems such as low stability and a redox potential dependent on pH. These problems have been addressed by using inorganic compounds such as octacyanotungstate, hexacyanoferrate, hexacyanoruthenate, ruthenium amine complexes, osmium complexes, and metalloporphyrins. Metal complexes of bipyridine and phenanthroline have also been suggested.
これらの無機メディエータの多くには、その酸化還元
電位および／または水溶性を変えるのが容易でないとい
う問題がある。この点において無機メディエータの分野
はフェロセンによって拡張されている。フェロセンとは
２個のπ結合しているシクロペンタジエニル環の間に１
個の鉄原子が挟まれているサンドイッチ型化合物であ
る。多数の誘導体の使用が試みられれていることは、１
個または２個のシクロペンタジエン環における置換によ
ってフェロセンの性質を容易に変えることができること
を意味する。Many of these inorganic mediators have the problem that it is not easy to change their redox potential and / or water solubility. In this regard, the field of inorganic mediators has been extended by ferrocene. Ferrocene is a group formed by two π-bonded cyclopentadienyl rings.
It is a sandwich compound in which two iron atoms are sandwiched. Attempts to use a large number of derivatives include:
It means that the properties of ferrocene can be easily changed by substitution on one or two cyclopentadiene rings.
フェロセン・メディエータは、酸化還元酵素、例え
ば、グルコースオキシダーゼ（アナリティカル・ケミス
トリィ（Anal.Chem.」56（1987）667）；コレステロー
ルオキシダーゼ［「エレクトロケミカル・センサース・
フォー・バイオメディカル・アプリケイションス（Elec
trochemical Sensors for Biomedical Application
s）」、シー．ケー．エヌ．リーム（C.K.N.Lim）編「ザ
・エレクトロケミカル・ソサイエティ（プロシーディン
グス・ボリューム）（The Electrochem.Soc.（Proceedi
ngs Volume））」、86・14（1986）16）；サルコシンオ
キシダーゼ（「ジャーナル・オブ・エレクトロアナリテ
ィカル・ケミスリィ（J.Electroanal.Chem.）」240（19
88）33;乳酸オキシダーゼ（「ジャーナル・オブ・エレ
クトロアナリティカル・ケミストリィ」240（1988）33;
ピルビン酸オキシダーゼ（「ジャーナル・オブ・エレク
トロアナリティカル・ケミストリィ」190（1985）11
7）；キサンチンオキシダーゼ（「ジャーナル・オブ・
エレクトロアナリティカル・ケミストリィ」190（198
5）117）；グルタチオンレダクターゼ（「ジャーナル・
オブ・エレクトメアナリティカル・ケミストリィ」190
（1985）117）；ジアホラーゼ（「エレクトロケミカル
・センサース・フォー・バイオメディカル・アプリケイ
ションス」、シー．ケー．エヌ．リーム編「ザ・エレク
トロケミカル・ソサイエティ（プロシーディングス・ボ
リューム）」86−14（1986）16）；グルコースデヒドロ
ゲナーゼ（「バイオセンサース（Bicsensors）」２（19
86）71）；およびホースラディシュペルオキシダーゼ
（「ジャーナル・オブ・エレクトロアナリティカル・ケ
ミストリィ」201（1986）１）の場合に、迅速な電子伝
達を行うことが示されている。Ferrocene mediators are oxidoreductases such as glucose oxidase (Analytical Chemistry (Anal. Chem.) 56 (1987) 667); cholesterol oxidase [Electrochemical Sensors.
Four Biomedical Applications (Elec
trochemical Sensors for Biomedical Application
s) ", C. K. N. Reem (CKNLim), The Electrochemical Society (Proceedings Volume) (The Electrochem. Soc. (Proceedi
ngs Volume)), 86・ 14 (1986) 16); Sarcosine oxidase (“J. Electroanal. Chem.” 240 ) (19)
88) 33; Lactate oxidase ("Journal of Electronic Analytical Chemistry" 240 (1988) 33;
Pyruvate oxidase ("Journal of Electronic Analytical Chemistry" 190 (1985) 11
7); Xanthine oxidase ("Journal of
Electroanalytical Chemistry " 190 (198
5) 117); Glutathione reductase ("Journal
Of electrical chemistry 190
(1985) 117); diaphorase (... "Electro Chemical sensors vinegar Four Biomedical app Kei Deployment scan", Sea cable NTT stream ed., "The Electro Chemical Society (Proceedings Volume)" 86 -14 (1986) 16); glucose dehydrogenase ("Bicsensors") 2 (19
86) 71); and in the case of horseradish peroxidase ("Journal of Electroanalytical Chemistry" 201 (1986) 1), rapid electron transfer has been shown.
しかし、候補となるメディエータのリストを拡張して
特定の用途に適合した性質を有する新しいメディエータ
の開発を可能にする必要がある。However, there is a need to extend the list of candidate mediators to enable the development of new mediators with properties tailored to particular applications.
発明の目的 本発明の主目的は、酸化還元酵素または他の電子伝達
酸化還元タンパク質に対するメディエータとして使用さ
れる化合物を提供することにある。関連する目的として
は、このようなメディエータを使用するメディエーショ
ンプロセス、このメディエーションプロセスに基く生成
物、このメディエーションされた生成物の製造方法、お
よびメディエータを含有する組成物がある。OBJECTS OF THE INVENTION It is a primary object of the present invention to provide compounds used as mediators for oxidoreductases or other electron transfer redox proteins. Related objects include mediation processes using such mediators, products based on the mediation process, methods of making the mediated product, and compositions containing the mediator.
発明の要約 本発明においては、１個のπ配位子（この配位子はな
かんずくアリル、シクロプロペニル、シクロブタジエ
ン、シクロペンタジエニル、ベンゼン、シクロヘプタト
リエチル、またはトリメチレンメタンとすることができ
る）を有する遷移金属、例えば、鉄、マンガンおよびク
ロムの錯体（半サンドイッチ型錯体）が、グルコースオ
キシダーゼのような酸化還元酵素への電子伝達をメディ
エーションすることができ、その有効性はフェロセンに
匹敵し、しかも一層広い範囲の置換化学現象に対する可
能性を提供することを見い出した。メディエーション作
用は酵素に限定されず、他の電子伝達酸化還元タンパク
質の場合にも適用することができる。SUMMARY OF THE INVENTION In the present invention, one π ligand (which can be, inter alia, allyl, cyclopropenyl, cyclobutadiene, cyclopentadienyl, benzene, cycloheptatriethyl or trimethylenemethane) ), A complex of iron, manganese and chromium (semi-sandwich type complex) can mediate electron transfer to oxidoreductases such as glucose oxidase, the effectiveness of which is comparable to ferrocene It has also been found that it offers the potential for a wider range of substitution chemistry. The mediation effect is not limited to enzymes, but can be applied to other electron transfer redox proteins.
遷移金属の半サンドイッチ型錯体についてはいくつか
の報告がなされているが、酸化還元タンパク質に対する
メディエーションに関するものではない。例えば、シル
ロペンタジエニルトリカルボニル−マンガンおよび−レ
ニウムのアセトニトリル中における電気化学的酸化に及
ぼす置換の影響については「ジャーナル・オブ・オルガ
ノメタリック・ケミストリィ（J.Organomet.Chem.）」1
01（1975）C43に報告されている。クロムのアレーン、
シクロヘプタトリエン、およびシクロヘプタトリエニル
トリカルボニル錯体のジクロロメタン中におけるボルタ
ン（voltammetric）酸化については「ジャーナル・オブ
・ケミカル・ソサイエティ・ダルトン・トランスアクシ
ョン（J.Chem.Soc.Dalton Trans.）」（1973）1768に報
告されている。シクロペンタジエニルマンガン誘導体、
シルロペンタトリエニルモリブデン誘導体およびシクロ
ペンタジエニル鉄誘導体のアセトニトリル中における環
状ボルタンメトリィは「ジャーナル・オブ・オルガノメ
タリック・ケミストリィ」170（1979）217に報告されて
いる。マグネシウム、モリブデン、タングステンおよび
コバルトのいくつかのπ−シクロペンタジエニル硫黄錯
体のジクロロメタン中におけるボルタンメトリー特性に
ついては「インオルガニック・ケミストリィ（Inorg.Ch
em.）」８（1969）1340に報告されている。Some reports have been made on semi-sandwich complexes of transition metals, but not on mediation of redox proteins. For example, for the effect of substitution on the electrochemical oxidation of sillopentadienyltricarbonyl-manganese and -rhenium in acetonitrile, see "Journal of Organometallic Chemistry" ( 1 ).
01 (1975) Reported at C43. Chrome arene,
The voltammetric oxidation of cycloheptatriene and cycloheptatrienyl tricarbonyl complex in dichloromethane is described in "Journal of Chemical Society Dalton Trans." (1973). ) Reported in 1768. Cyclopentadienyl manganese derivative,
Cyclic voltammetry of sillopentatrienyl molybdenum derivatives and cyclopentadienyl iron derivatives in acetonitrile is reported in Journal of Organometallic Chemistry 170 (1979) 217. For the voltammetric properties of some π-cyclopentadienyl sulfur complexes of magnesium, molybdenum, tungsten and cobalt in dichloromethane, see Inorganic Chemistry (Inorg.
em.) " 8 (1969) 1340.
発明の好適例 一般的に、本発明は酵素と電極との間の電子伝達にお
いてメディエータとして使用される遷移金属半サンドイ
ッチ型錯体を提供する。これに対応して、本発明はメデ
ィエータとして遷移金属半サンドイッチ型化合物を使用
することを特徴とする、酸化還元酵素と電極との間の電
子伝達をメディエーションする方法を提供する。本発明
においては、このような遷移金属半サンドイッチ型化合
物が水性系においてメディエータとて作用することがで
きることを見い出した。Preferred Embodiments of the Invention In general, the present invention provides transition metal half-sandwich complexes for use as mediators in electron transfer between enzymes and electrodes. Correspondingly, the present invention provides a method for mediating electron transfer between an oxidoreductase and an electrode, comprising using a transition metal semi-sandwich compound as a mediator. In the present invention, it has been found that such transition metal semi-sandwich compounds can act as mediators in aqueous systems.
他の面において、本発明はメディエーションされた酵
素生成物および該酵素生成物の製造方法を提供する。例
えば、本発明の錯体は、欧州特許出願（EP）第78636号
Ａ、同第125136号Ａ、同第125137号Ａ、同第125139号
Ａ、同第125867号Ａ、同第127958号Ａまたは同230786号
Ａ明細書に記載されているものと同様であるが、メディ
エータとて遷移金属半サンドイッチ型化合物を使用する
電流測定用酵素センサを製造するのに使用することがで
きる。上述の公表されている特許明細書を参考としてこ
こに加入する。従って、本発明は、試料、特に水性試料
中における検体の存在を試験するために使用される電流
測定用酵素センサを提供する。例えば、試料は複雑な生
体試料、例えば、全血、血漿または血清のような体液と
することができ、検体はグルコースまたはコレステロー
ルのような天然に存在する代謝物、または医薬のような
導入した物質とすることができる。In another aspect, the invention provides a mediated enzyme product and a method of making the enzyme product. For example, the complex of the present invention can be prepared by the method described in European Patent Application (EP) No. 78636A, No. 125136A, No. 125137A, No. 125139A, No. 125867A, No. 127958A or No. 127958A. Similar to that described in 230786A, but can be used to produce an enzymatic sensor for amperometry using a transition metal semi-sandwich compound as a mediator. The above-mentioned published patent specification is incorporated herein by reference. Accordingly, the present invention provides an amperometric enzyme sensor used to test the presence of an analyte in a sample, especially an aqueous sample. For example, the sample can be a complex biological sample, for example, a bodily fluid such as whole blood, plasma or serum, and the analyte can be a naturally occurring metabolite such as glucose or cholesterol, or an introduced substance such as a drug. It can be.
さらに、本発明は、電流測定用酵素電極を製造するの
に特に有用な、遷移金属半サンドイッチ型メディエータ
化合物を含有する導電性印刷インキを提供する。Further, the present invention provides a conductive printing ink containing a transition metal semi-sandwich type mediator compound, which is particularly useful for producing an enzyme electrode for current measurement.
本発明の中心的特徴は、１個のπ配位子が他の配位子
によって錯化されている遷移金属に結合している半サン
ドイッチ型錯体を使用することにある。１個のπ配位子
は３個以上、例えば３〜７個の原子を有し、これらの原
子は普通炭素原子であるが、π結合することができる酵
素、酸素、硫黄およびリンを包含するヘテロ原子を含む
ことができる。当然なことであるが、π結合を有するた
めには、π配位子の少なくとも３個の相互結合した原子
はπ結合が局在していない１個の平面を規定し、これら
の少なくとも３個の原子は遷移金属原子と直接に相互作
用する。遷移金属イオンの性質は、迅速な電子伝達を行
うことができる点を除けば重要でない。他の配位子の同
一性（identity）はπ結合性である点を除けば重要でな
い。例えば、他の配位子はカルボニル、ホスフィン、イ
ソシアニド、ニトロシル、ビピリジン、フェナントロリ
ンまたはジチオレートから選択することができる。A central feature of the present invention is the use of a half-sandwich complex in which one π ligand is bound to a transition metal complexed by another ligand. One pi ligand has 3 or more, for example 3 to 7, atoms, which are usually carbon atoms, but include enzymes capable of pi-bonding, oxygen, sulfur and phosphorus. Heteroatoms can be included. Of course, to have a π bond, at least three interconnected atoms of the π ligand define one plane where the π bond is not localized, and at least three of these Atom directly interacts with the transition metal atom. The nature of the transition metal ion is not important, except that it allows rapid electron transfer. The identity of the other ligands is not important except that they are π-bonded. For example, the other ligand can be selected from carbonyl, phosphine, isocyanide, nitrosyl, bipyridine, phenanthroline or dithiolate.
メディエータとして使用される半サンドイッチ型化合
物としては、次の一般式： （π配位子）Ｍ（非π配位子）ｎ で表わされ、式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子
を示し、Ｍは遷移金属原子を示し、ｎはπ配位子ではな
い配位子の数を示し、非π配位子は同一または異なる一
価または多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を
満たす作用を有するものを示し、電荷を有するかあるい
は中性である錯体であるのが好ましい。A semi-sandwich compound used as a mediator is represented by the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n , wherein the π ligand is one π bond M represents a transition metal atom, n represents the number of ligands that are not π ligands, and non-π ligands are the same or different monovalent or polyvalent ligands. In addition, the complex having the action of satisfying the valence of the transition metal M is shown, and it is preferable that the complex be charged or neutral.
π配位子は３〜７個の炭素原子を有するπ配位子から
選択するのが一層好ましく、アリル、シクロプロペニ
ル、シクロブタジエン、シクロペンタジエニル、ベンゼ
ン、シクロヘプタトリエニルまたはトリメチレンメタン
基であるのが最も好ましい。π配位子は未置換であって
もよいが、置換基を有する配位子であるのが好ましい。
置換基の性質は重要でない。その理由は、置換基の同一
性を変えることによってメディエータ候補として評価す
るために種々の性質を有する化合物を製造することがで
きることが本発明の特徴であるからである。純粋に例と
して、１個以上、普通１〜４個の置換置を存在させるこ
とができる。この置換基はアルキル基、特にメチルまた
はエチル基；アルコキシ基、特にメトキシまたはエトキ
シ基；アミノおよび置換アミノ基、特にアミノ、ジメチ
ルアミノ、ジエチルアミノまたはジ（β−ヒドロキシエ
チル）アミノ基；アミノアルキルおよび置換アミノアル
キル基、特にアミノメチルまたはジメチルアミノメチル
基；カルボン酸残基；またはスルホン酸残基から選択す
ることができる。More preferably, the π ligand is selected from π ligands having 3 to 7 carbon atoms, such as an allyl, cyclopropenyl, cyclobutadiene, cyclopentadienyl, benzene, cycloheptatrienyl or trimethylenemethane group. Is most preferred. The π ligand may be unsubstituted, but is preferably a ligand having a substituent.
The nature of the substituent is not important. The reason is that it is a feature of the present invention that a compound having various properties can be produced for evaluation as a mediator candidate by changing the identity of the substituent. Purely by way of example, one or more, usually from 1 to 4, substitutions can be present. This substituent may be an alkyl group, especially a methyl or ethyl group; an alkoxy group, especially a methoxy or ethoxy group; an amino and a substituted amino group, especially an amino, dimethylamino, diethylamino or di (β-hydroxyethyl) amino group; It can be selected from aminoalkyl groups, in particular aminomethyl or dimethylaminomethyl groups; carboxylic acid residues; or sulfonic acid residues.
遷移金属Ｍとしては鉄、マンガンまたはクロムが好ま
しい。The transition metal M is preferably iron, manganese or chromium.
非π配位子はいずれもカルボニル、ホスフィン、イソ
シアニド、ニトロシル、ビピリジン、フェナントロリン
またはジチオレート基から選択するのが好ましい。これ
らの基のうち最初の４個の基は１価であり、これらの基
のうち最後の３個は二価である。Preferably, all non-π ligands are selected from carbonyl, phosphine, isocyanide, nitrosyl, bipyridine, phenanthroline or dithiolate groups. The first four of these groups are monovalent, and the last three of these groups are divalent.
本発明の一つの好ましい例においては、遷移金属半サ
ンドイッチ型化合物をβ−シクロデキストリン中の包接
錯体（inclusion complex）として使用する。この錯体
は代表的な例では1:1付加物の形になっている。In one preferred embodiment of the present invention, a transition metal half-sandwich compound is used as an inclusion complex in β-cyclodextrin. The complex is typically in the form of a 1: 1 adduct.
遷移金属半サンドイッチ型化合物は広く知られている
か、あるいは文献に記載されている方法を改良すること
により製造することができる。Transition metal semi-sandwich compounds are widely known or can be prepared by modifications of the methods described in the literature.
遷移金属半サンドイッチ型錯体がフェロセンより優れ
ている特別な利点は、構造上の可能性が一層大きくなる
ので、錯体の性質を特定の酵素の適用および／またはバ
イオセンサ形状に一層緊密に適合させることができるこ
とにある。遷移金属半サンドイッチ型錯体を、酸化還元
酵素、例えば、大部分のフラビンタンパク質、金属タン
パク質およびキノンタンパク質酸化還元酵素に対するメ
ディエータとして使用する可能性；またはヘモグロビン
のような酸化還元タンパク質に対して、あるいは呼吸タ
ンパク質または他の電子伝達酸化還元タンパク質に対し
てメディエータとして作用させる可能性；欧州特許（E
P）第125139号Ａ明細書に記載されているような方法を
包含する免疫化学方法において抗原または抗体のための
ラベルとして前記半サンドイッチ型錯体を使用する可能
性；酵素との反応によって変性された酸化還元電位を有
する酵素反応をモニターするための人工基質として前記
半サンドイッチ型錯体を使用する可能性；特定の酸化還
元酵素タンパク質とは相互作用するが他の酸化還元酵素
タンパク質とは相互作用しないように配位子を注意して
選択することによりメディエータの酸化還元電位を適合
させる可能性；酵素−メディエータ複合体または変性さ
れた電極を製造するために半サンドイッチ型錯体につい
て一層広範囲の置換化学現象を使用すること；および当
業者にとって明らかである電気化学および生物電気化学
の分野における他の適用のような、本発明の他の適用お
よび利点は明らかである。A particular advantage of transition metal half-sandwich complexes over ferrocene is that they have a greater structural potential, making the properties of the complexes more closely tailored to specific enzyme applications and / or biosensor geometries. Is what you can do. Possibility of using the transition metal half-sandwich complex as a mediator for oxidoreductases, eg most flavin proteins, metalloproteins and quinone protein oxidoreductases; or for redox proteins such as hemoglobin, or for respiration Possibility to act as mediator for proteins or other electron transfer redox proteins; European Patent (E
P) Possibility of using said half-sandwich complexes as labels for antigens or antibodies in immunochemical methods, including those described in No. 125139A; modified by reaction with enzymes Possibility of using said half-sandwich complex as an artificial substrate to monitor enzymatic reactions with redox potential; interact with certain oxidoreductase proteins but not with other oxidoreductase proteins Possibility to adapt the redox potential of the mediator by careful choice of ligands; more extensive substitution chemistry for half-sandwich complexes to produce enzyme-mediator complexes or denatured electrodes. And other applications in the fields of electrochemistry and bioelectrochemistry that will be apparent to those of skill in the art. Other applications and advantages of the invention, such as applications, are apparent.
メディエータとして遷移金属半サンドイッチ型化合物
を採用した好適な電流測定用酵素センサは、テスト用帯
状部材、特に乾燥した使い捨てテスト用帯状部材を利用
する。好ましくは、使い捨てテスト用帯状部材は、作用
電極、検体レベルを示す電流を発生させるために少なく
とも酸化還元酵素および遷移金属半サンドイッチ型メデ
ィエータ化合物を含有するテスト用試薬、および基準電
極を具える。代表的な例においては、テスト用部材にお
いて、テスト用試薬は作用電極と組み合わされている１
個以上のカーボンベースの層中に存在する。従って、セ
ンサ電極は、例えば、スクリーン印刷、吹付け、または
他の適当な堆積技術によって形成された電極区域を有す
るのが好ましい。A preferred amperometric enzyme sensor employing a transition metal semi-sandwich compound as a mediator utilizes a test strip, especially a dry disposable test strip. Preferably, the disposable test strip comprises a working electrode, a test reagent containing at least an oxidoreductase and a transition metal half-sandwich mediator compound to generate a current indicative of the analyte level, and a reference electrode. In a representative example, in a test member, a test reagent is associated with a working electrode.
Present in one or more carbon-based layers. Thus, the sensor electrodes preferably have electrode areas formed, for example, by screen printing, spraying, or other suitable deposition techniques.
好ましくは、各カーボン混合物をキャリア上の導電性
トラック上に、例えば第２トラックに接続されている基
準電極の極めて近くに被着させる。このようにして、小
試料の全血または他の液体で有効電極区域をおおうこと
によって機能させることができるセンサが生成する。こ
れらのカーボン混合物はスクリーン印刷によってキャリ
アに被着させるのが最適である。Preferably, each carbon mixture is deposited on a conductive track on the carrier, for example very close to a reference electrode connected to the second track. In this way, a sensor is created that can function by covering the active electrode area with a small sample of whole blood or other liquid. Optimally, these carbon mixtures are applied to the carrier by screen printing.
特に好ましい例では、本発明は、細長い電気絶縁性キ
ャリアを具え、該キャリアはその上に１対の縦方向の実
質的に平行な導電性トラックを有し、各導電性トラック
には同一端に、読出し手段に電気的に接続する手段と１
個の電極とがテスト用試薬と一緒に設けられており、電
極のうちの一方は基準電極であり、他方は作用電極であ
る。In a particularly preferred embodiment, the present invention comprises an elongated electrically insulating carrier having a pair of longitudinally substantially parallel conductive tracks thereon, each conductive track having the same end. Means for electrically connecting to the reading means and 1
A number of electrodes are provided with a test reagent, one of the electrodes being a reference electrode and the other being a working electrode.
特に、このようなセンサは、合成樹脂（例えば、PV
C）のような電気絶縁性キャリア材料からなり、印刷さ
れた導電性トラック上に支持されている２個の電極を両
端間に有する帯状支持部材の形態に形成される。例え
ば、電極は２個の長方形区域が帯状キャリア部材状で平
行している形態にすることができる。このような長方形
区域は、検体を試験するための１滴の試料、例えば、全
血によっておおわれる標的区域として形成することがで
きる。所望に応じて、非長方形の電極区域、例えば、ダ
イアモンド形、半円形、または三角形の区域を使用し
て、液体試料との接触を最適にするための標的区域を提
供することができる。In particular, such sensors are made of synthetic resin (eg, PV
It is made of an electrically insulating carrier material as in C) and is formed in the form of a strip-shaped support member having two electrodes between both ends supported on a printed conductive track. For example, the electrode may be in the form of two rectangular sections parallel to each other in the form of a strip-shaped carrier member. Such a rectangular area can be formed as a target area covered by a drop of a sample for testing an analyte, eg, whole blood. If desired, non-rectangular electrode areas, such as diamond-shaped, semi-circular, or triangular areas, can be used to provide a target area for optimizing contact with the liquid sample.
キャリアは、少なくとも２個の電極、すなわち基準電
極および作用電極を有しているが、作用電極に類似した
配合を有する反対電極および／またはダミー電極を、１
種以上の活性成分が欠けている関連するテスト用試薬と
共に有することができる。このようなダミー電極である
第３電極は、第３電極を流れる電荷を作用電極を流れる
電荷から引き算した場合に、得られる電荷は関係する反
応のみに起因するという点において、信頼性の一層大き
い結果をもたらす。The carrier has at least two electrodes, a reference electrode and a working electrode, but has a counter electrode and / or a dummy electrode having a similar composition to the working electrode.
One or more active ingredients can be included with the associated test reagent that is missing. The third electrode, which is such a dummy electrode, is more reliable in that when the charge flowing through the third electrode is subtracted from the charge flowing through the working electrode, the resulting charge is only due to the relevant reactions. Bring results.
標的区域またはその上方に膜を設けて濾過作用を行わ
せることができ、例えば、試料がテスト用帯状部材に入
る前に試料から血球を濾過することができる。あるいは
また、濾過膜または細胞分離膜を系内で流し込み形成
（cast in situ）することができる。A membrane can be provided at or above the target area to provide a filtering effect, for example, to filter blood cells from the sample before the sample enters the test strip. Alternatively, a filtration or cell separation membrane can be cast in situ in the system.
特に一層好ましい例においては、液体混合物中のある
化合物を示す電流を検知するために、センサ系の信号読
出しサーキットリィ（circuitry）に取り付けるための
１個の使い捨て帯状電極部材を提供する。この帯状部材
は ａ） 読取りサーキットリィに着脱自在に取り付けるの
に適した細長い支持対； ｂ） 該支持体に沿って延在し、前記読取りサーキット
リィに接続するための導電性部材を具える第１導体； ｃ） 前記帯状部材上に設けられ、第１導体と接触し、
かつ前記液体混合物と接触するように設置されている活
性電極であって、酵素で触媒された反応と前記第１導体
との間で伝達された電子を伝達して前記酵素の活性を示
しかつ前記化合物を示す電流を生じさせることができる
遷移金属半サンドイッチ型メディエータと酵素基質とを
包含する反応を触媒することができる酵素を含有する面
積25mm2未満の印刷された層を前記支持体上に具える活
性電極； ｄ） 前記支持体に沿って延在し、前記読取りサーキッ
トリィに接続するための導電性部材を具える第２導体；
および ｅ） 第２導電性部材と接触し、かつ前記液体混合物お
よび前記第２導体と接触するように設置されている基準
電極 を具え、前記第１導電性部材および前記活性電極は前記
第２導電性部材および前記基準電極から離間して設けら
れ、これらの電極は１滴の血液によって完全におおうこ
とのできる充分に小さい合計有効面積を有するような大
きさおよび配置になっていて、前記血液が前記活性電極
と前記基準電極との間の電気回路を完結して、電流測定
によって前記酵素の活性を検知できるように構成されて
いる。In a particularly preferred embodiment, a single disposable strip electrode member is provided for mounting on a signal readout circuitry of a sensor system for sensing a current indicative of a compound in a liquid mixture. The strip comprises: a) an elongated support pair adapted to be removably mounted to the reading circuitry; b) a conductive member extending along the support and comprising a conductive member for connection to the reading circuitry. 1) a conductor; c) provided on the strip, in contact with the first conductor;
And an active electrode arranged to be in contact with the liquid mixture, wherein the active electrode transmits electrons transferred between the reaction catalyzed by the enzyme and the first conductor to show the activity of the enzyme, and ingredients the printed layer is less than an area 25 mm 2 containing an enzyme capable of catalyzing the reaction involving a transition metal half sandwich mediator and an enzyme substrate capable of generating a current indicating compound on said support D) a second conductor extending along the support and comprising a conductive member for connecting to the readout circuitry.
And e) a reference electrode in contact with the second conductive member and arranged to contact the liquid mixture and the second conductor, wherein the first conductive member and the active electrode are the second conductive member. A distance from the active member and the reference electrode, the electrodes being sized and arranged to have a sufficiently small total effective area that can be completely covered by a drop of blood; An electric circuit between the active electrode and the reference electrode is completed so that the activity of the enzyme can be detected by current measurement.
本発明のテスト用帯状部材は、例えば、既知のメディ
エーションされた酵素の電気化学的反応によってではあ
るが、メディエータとして遷移金属半サンドイッチ型化
合物を使用することにより、検体を検知することができ
る。この点に関し、欧州特許第78636号Ａ明細書、特に
グルコースオキシダーゼについての記載、ならびに欧州
特許第127958号Ａおよび同第125137号Ａ明細書を参照さ
れたい。本発明のメディエータと一緒に使用することが
できる他の酵素としては、欧州特許第230786号Ａ明細書
に記載されているように、遊離コレステロールまたは総
コレステロールを検出するために用いられるコレステロ
ールオキシダーゼとペルオキシダーゼと所望に応じてコ
レステロールエステラーゼとの組合せがあり、一層一般
的には、例えば、欧州特許第125137号Ａ明細書に記載さ
れているように、フラビンタンパク質、キノンタンパク
質および金属タンパク質を包含する酸化還元酵素または
他の酵素、および１種以上のメディエータ化合物を包含
する系がある。本発明のデバイスに使用するのに適当な
他の酵素系としては、例えば、欧州特許第125867号Ａ明
細書に記載されているように、補因子としてニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド燐酸を使用する酸化還元酵素があ
る。The test strip of the present invention can detect analytes, for example, by using a transition metal semi-sandwich compound as a mediator, but by an electrochemical reaction of a known mediated enzyme. In this regard, reference is made to EP 78636A, in particular the description of glucose oxidase, and EP 127958A and EP 125137A. Other enzymes that can be used with the mediators of the invention include cholesterol oxidase and peroxidase used to detect free or total cholesterol, as described in EP 230786A. And optionally cholesterol esterases, and more generally redox including flavin proteins, quinone proteins and metalloproteins, as described, for example, in EP 125137A. There are systems that include enzymes or other enzymes, and one or more mediator compounds. Other enzyme systems suitable for use in the devices of the invention include, for example, nicotinamide adenine dinucleotide and nicotinamide adenine dinucleotide as cofactors, as described in EP 125867A. There are oxidoreductases that use phosphate.
本発明のテスト用帯状部材は電子装置および計器系と
一緒に使用するためのものである。これらの系は、例え
ば、電極に特定の電位を維持し、反応をモニターし、計
算し、結果を与える。計器系においてこのタイプのテス
ト用帯状部材と一緒に使用するのに望ましい特定の特性
は、試料流体による反応圏の濡れを検出できる能力であ
り；これにより測定を適当な時期に開始することがで
き、使用者の誤りによって生じる不正確さの範囲が狭く
なる。テスト用帯状部材を計器に挿入してから直ちに前
記帯状部材の電極に電位を印加することによりこの目的
を達成することができ、試料流体による反応圏の濡れを
反映するある限界電流が測定されるまで、この電位を維
持する。次いで、この電位を短時間除去して濡れを完全
にしてから、通常のように測定を開始することができ
る。The test strip of the present invention is for use with electronic equipment and instrument systems. These systems, for example, maintain a specific potential at the electrodes, monitor the reaction, calculate and provide results. A particular property desirable for use with this type of test strip in an instrument system is the ability to detect the wetting of the reaction zone by the sample fluid; this allows the measurement to be started at the appropriate time. The range of inaccuracy caused by user error is reduced. This objective can be achieved by applying a potential to the electrodes of the strip immediately after the test strip is inserted into the instrument, and a certain limiting current, which reflects the wetting of the reaction zone by the sample fluid, is measured. Until this potential is maintained. The potential can then be removed for a short time to complete wetting before the measurement can be started as usual.
有利な他の特徴は、異なる検体を測定する場合に、テ
スト用帯状部材の同一性を自動的に容易に確認できるこ
とである。これは、例えば、テスト用帯状部材状に追加
の接点を、この帯状部材のタイプを特徴付けるパターン
に従って設けることにより達成され、計器は接点パッド
（contact pad）を具えていて各接点が存在しているか
存在していないかを決める。あるいはまた、米国特許第
5126034号明細書、第４欄第３〜７号に記載されている
ように、テスト用帯状部材に印刷され、帯状部材のタイ
プの特性を示す所定の抵抗を有する１個以上の追加の回
路ループを使用する系も可能である。さらに他の例とし
ては、ノッチ（notch）または他の形状を、計器に挿入
されるテスト用帯状部材の近位端に形成することがで
き；計器中のスイッチまたは光検出器によって各ノッチ
が存在するか存在しないかを検出することができる。帯
状部材のタイプを識別する他の可能性としては、帯状部
材の色を変えかつ色の範囲を区別できる光検出器を設け
ること、また帯状部材にバーコード、帯状磁気部片また
は他のマーキングを設けること、および計器に適当な読
取り装置を設けることがある。Another advantageous feature is that the identity of the test strip can be easily and easily ascertained when measuring different analytes. This is achieved, for example, by providing additional contacts on the test strip according to a pattern characterizing the type of strip, the meter having a contact pad and each contact being present. Determine if it does not exist. Alternatively, U.S. Pat.
One or more additional circuit loops having a predetermined resistance printed on the test strip and characterized by the type of strip, as described in 5126034, Column 4, Nos. 3-7. A system using is also possible. As yet another example, a notch or other shape can be formed at the proximal end of the test strip inserted into the instrument; each notch is present by a switch or photodetector in the instrument. Can be detected. Other possibilities for identifying the type of strip are to provide a photodetector that can change the color of the strip and distinguish the range of colors, and to provide the strip with a bar code, strip magnetic piece or other marking. And the instrument may be provided with a suitable reader.
本発明のテスト用帯状部材を大量生産するのに好まし
い技術について説明する。この例では、帯状電極を、基
準電極と作用電極とダミー電極とを具える三電極構造に
する。A preferred technique for mass-producing the test strip according to the present invention will be described. In this example, the strip electrode has a three-electrode structure including a reference electrode, a working electrode, and a dummy electrode.
キャリアは、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポ
リエステル、紙、ボール紙、セラミック、セラミック被
覆した金属または他の絶縁材料を包含する電気絶縁性表
面を有する材料から製造することができる。ポリ塩化ビ
ニル、またはポリカーボネートとポリエステルとの混和
物が特に適当である。The carrier can be made from a material having an electrically insulating surface, including polyvinyl chloride, polycarbonate, polyester, paper, cardboard, ceramic, ceramic coated metal or other insulating materials. Polyvinyl chloride or mixtures of polycarbonate and polyester are particularly suitable.
いくつかの位置合せ用孔を押し抜くと同時に外側端縁
を切り取る押抜き具を使用して、キャリア材料のシート
を所定の寸法に切断する。以後の操作ではこれらの孔を
使用するが有利であるが、処理中に端縁の位置合せも容
易に行うことができる。A sheet of carrier material is cut to size using a punch that punches out several alignment holes and simultaneously cuts the outer edge. It is advantageous to use these holes in subsequent operations, but the alignment of the edges can also be easily performed during processing.
スクリーン印刷のような堆積方法によって導電性イン
キをキャリアに被着させる。押抜かれた孔を使用してキ
ャリアの位置合せを行う。この層は計器をテスト用帯状
部材と接触可能にする接点区域を生成し、接点と帯状部
材上で生起する化学現象との間に電気回路を提供する。
インキとしては、自然乾燥する有機溶媒ベースのカーボ
ン混合物が好ましい。他の配合物としては、水ベースの
インキおよび銀インキを使用することができる。インキ
を乾燥または硬化させる他の方法としては、赤外、紫外
および高周波の放射がある。The conductive ink is applied to the carrier by a deposition method such as screen printing. The carrier is aligned using the punched holes. This layer creates a contact area that allows the meter to make contact with the test strip and provides an electrical circuit between the contacts and the chemistry that occurs on the strip.
As the ink, an organic solvent-based carbon mixture that dries naturally is preferable. As other formulations, water-based inks and silver inks can be used. Other methods of drying or curing the ink include infrared, ultraviolet and high frequency radiation.
次いで、銀と塩化銀との混合物を含有する有機溶媒ベ
ースのインキを使用して、基準電極を形成する層を印刷
する。このプリントを反応圏に延在するカーボンプリン
トの中間トラックを部分的におおうように延在させる。
このプリントの別個の部分を反応圏の外側で他のカーボ
ントラックの部分をおおうように延在させて、各トラッ
クの総電気抵抗が減少するようにするのが、有用であ
る。The layer forming the reference electrode is then printed using an organic solvent-based ink containing a mixture of silver and silver chloride. The print is extended to partially cover the intermediate track of the carbon print extending into the reaction zone.
It is useful to extend a separate portion of the print outside the reaction zone to cover the portion of the other carbon track so that the total electrical resistance of each track is reduced.
所要に応じて、誘電性インク層を、カーボンおよび銀
／塩化銀の印刷層の大部分がおおわれるように印刷する
ことができる。この場合には、２個の区域、すなわち電
気的接点区域および反応圏の下に位置する感知区域が被
覆されずに残る。このプリントは反応圏の区域を規定
し、露出したトラックを短絡から保護する作用をする。If desired, the dielectric ink layer can be printed such that the majority of the carbon and silver / silver chloride print layers are covered. In this case, two areas, the electrical contact area and the sensing area located below the reaction zone, remain uncoated. This print defines the area of the reaction zone and serves to protect the exposed tracks from short circuits.
作用電極に関しては、１種以上のインキを、反応圏内
の導電性トラックの１本の頂部における規定区域内に、
正確な厚さに堆積させ、酵素および半サンドイッチ型メ
ディエータ化合物を堆積させる。これをスクリーン印刷
によって行うのが好都合である。このインキを被着させ
る他の方法としては、インキジェット、容積供給（volu
mmetric dosing）、グラビア印刷、フレキソ印刷および
凸版印刷がある。For the working electrode, one or more inks are applied in a defined area at the top of one of the conductive tracks in the reaction zone,
Deposit to exact thickness, deposit enzyme and semi-sandwich mediator compound. This is conveniently done by screen printing. Other methods of applying this ink include ink jet, volume supply (volu
mmetric dosing), gravure printing, flexographic printing and letterpress printing.
所要に応じて、残りの導電性トラック上に、ダミー電
極を形成する第２の部分活性インキを、各活性インキが
銀／塩化銀インキで被覆された中央トラックから等距離
の導電性トラック上に被着するように、堆積することが
できる。Optionally, on the remaining conductive tracks, apply a second partially active ink forming a dummy electrode onto a conductive track equidistant from a central track where each active ink is coated with silver / silver chloride ink. It can be deposited as deposited.
実施例 本発明を実施例についてさらに説明する。しかし、本
発明はこれらの実施例によって限定されるものではな
い。Examples The present invention will be further described with reference to examples. However, the present invention is not limited by these examples.
有機金属試薬が関係するすべての反応およびその後の
操作は、窒素雰囲気を使用して無酸素・無水条件下に行
った。ストレム・ケミカルス・インク（Strem Chemical
s,Inc.）から、ヘキサカルボニルクロムおよびメチルシ
クロペンダジエニルマンガントリカルボニルを入手し
た。アルドリッチ・ケミカルス（Aldrich Chemicals）
から、1,10−フェナントロリン、2,2′−ビピリジン、
β−シクロデキストリン水和物、ジメチルジチオカルバ
ミン酸、ジエチルジチオカルバミン酸および４−モルホ
リンカルボジチオ酸を購入した。シス1,2−ジシアノエ
チレン−1,2ジチオ酸ジナトリウムは公知の方法（「イ
ンオルガニック・ケミストリィ」５（1966）1157）によ
って製造した。All reactions involving organometallic reagents and subsequent operations were performed under anoxic, anhydrous conditions using a nitrogen atmosphere. Strem Chemicals, Inc.
s, Inc.) obtained hexacarbonylchromium and methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl. Aldrich Chemicals
From 1,10-phenanthroline, 2,2'-bipyridine,
β-cyclodextrin hydrate, dimethyldithiocarbamic acid, diethyldithiocarbamic acid and 4-morpholinecarbodithioic acid were purchased. Disodium cis 1,2-dicyanoethylene-1,2 dithioate was produced by a known method ("Inorganic Chemistry" 5 (1966) 1157).
生成物である化合物は「化合物６」というように化合
物番号で示した。The product compound was indicated by a compound number such as “Compound 6”.
0.1Mグルコースを含有する0.15Mリン酸塩（支持電解
質として0.2M塩化ナトリウムを含有する）のリン酸緩衝
液（PBS）を、メルク社（Merck BDH）からのアナラー
（Analar）試薬を使用して製造した。この緩衝液を４℃
において一夜貯蔵し、その後にα−アノマーとβ−アノ
マーとを平衡させるのに使用した。グルコースオキシダ
ーゼ（アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）
からのEC1.1.3.4）はスタージ・エンチームス社（Sturg
e Enzymes）から入手した。ホーラディッシュペルオキ
シダーゼはバイオチーム社（Biozyme）から入手した。Phosphate buffer (PBS) of 0.15M phosphate containing 0.1M glucose (containing 0.2M sodium chloride as supporting electrolyte) was prepared using Analar reagent from Merck BDH. Manufactured. 4 ° C
For overnight and then used to equilibrate the α- and β-anomers. Glucose oxidase (Aspergillus niger)
EC 1.1.3.4 from Sturg Enteams (Sturg)
e Enzymes). Horadish peroxidase was obtained from Biozyme.
以下の実施例では、次の添付図面を参照されたい。 In the following examples, reference is made to the accompanying drawings, in which:
図面の簡単な説明 図１は、クロム錯体化合物６の環状ボルタモグラムで
ある。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a cyclic voltammogram of chromium complex compound 6.
図２（ａ）は、クロム錯体化合物６を含有する電極の
環状ボルタモグラムであり、図２（ｂ）は、グルコース
オキシダーゼを添加した場合の触媒波である。FIG. 2A is a cyclic voltammogram of an electrode containing the chromium complex compound 6, and FIG. 2B is a catalytic wave when glucose oxidase is added.
図３は、グルコースオキシダーゼをマンガン錯体化合
物８で滴定した際に得られた触媒波である。FIG. 3 is a catalytic wave obtained when glucose oxidase was titrated with manganese complex compound 8.
図４は、図３の触媒波から得たデータをプロットした
グラフである。FIG. 4 is a graph plotting data obtained from the catalytic waves of FIG.
図５は、マンガン錯体化合物16の環状ボルタモグラム
である。FIG. 5 is a cyclic voltammogram of the manganese complex compound 16.
図６は、（ａ）マンガン錯体化合物10のβ−シクロデ
キストリン付加物の環状ボルタモグラムおよび（ｂ）グ
ルコースオキシダーゼを添加した場合の触媒波を示すグ
ラフである。FIG. 6 is a graph showing (a) a cyclic voltammogram of a β-cyclodextrin adduct of the manganese complex compound 10 and (b) a catalytic wave when glucose oxidase is added.
図７は、異なる量のβ−シクロデキストリンの存在下
におけるマンガン錯体化合物16の環状ボルタモグラムで
ある。FIG. 7 is a cyclic voltammogram of manganese complex compound 16 in the presence of different amounts of β-cyclodextrin.
図８（ａ）は、マンガン錯体化合物10を含有する電極
の環状ボルタモグラムであり、図８（ｂ）は、マンガン
錯体化合物11を含有する電極の環状ボルタモグラムであ
り、図８（ｃ）は、マンガン錯体化合物12を含有する電
極の環状ボルタモグラムである。FIG. 8A is a cyclic voltammogram of an electrode containing a manganese complex compound 10, FIG. 8B is a cyclic voltammogram of an electrode containing a manganese complex compound 11, and FIG. 4 is a cyclic voltammogram of an electrode containing a complex compound 12.
図９（ａ）は、マンガン錯体化合物10を含有する電極
の環状ボルタモグラムであり、図９（ｂ）は、グルコー
スオキシダーゼを添加した場合の触媒波である。FIG. 9A is a cyclic voltammogram of an electrode containing the manganese complex compound 10, and FIG. 9B is a catalytic wave when glucose oxidase is added.
図10は、平衡したグルコースオキシダーゼ／化合物10
電極のグルコースに対する応答を示すグラフである。FIG. 10 shows the equilibrated glucose oxidase / compound 10
4 is a graph showing a response of an electrode to glucose.
実施例１ アレーンクロムトリカルボニル錯体を、文献（「イン
オルガニック・シンセシス」第19巻（1979）第154頁）
記載の一般的方法に従って、ジ−ｎ−ブチルエーテル／
テトラヒドロフラン（10:1）を還流させ、このなかで適
当なアレーンをCr（CO）６と共に還流させることにより
製造した。〔MeCpMn（NO）（CO）２〕PF6化合物９を、
キング（King）およびビスネット（Bisnette）の方法
（「インオルガニック・ケミストリィ」第６巻（1967）
第469頁）により製造した。文献に記載されている方法
を使用して〔MeCpMn（NO）（CN）２〕Na化合物13（「ジ
ャーナル・オブ・カルガノメタリック・ケミストリィ」
第170巻（1979）、第217頁、〔MeCpMn（NO）（bipy）〕
PF6化合物14（「インオルガニック・ケミストリィ」第
８巻（1969）第1340頁）、〔MeCpMn（NO）（phen）〕PF
6化合物15（「インオルガニック・ケミストリィ」第８
巻（1969）第1340頁）〔MeCpMn（NO）（S2CNMe2）〕化
合物10（「インオルガニック・ケミストリィ」第８巻
（1969）第1340頁）、〔MeCpMn（NO）（S2CNEt2）〕化
合物11（「インオルガニック・ケミストリィ」第８巻
（1969）第1340頁）、および〔MeCpMn（NO）｛（SCCN）
２｝〕〔NEt4〕化合物16（「インオルガニック・ケミス
トリィ」第８巻（1969）第1340頁）を合成した。Example 1 The arene chromium tricarbonyl complex was prepared according to the literature ("Inorganic Synthesis", Vol. 19 (1979), p. 154).
According to the general procedure described, di-n-butyl ether /
Prepared by refluxing tetrahydrofuran (10: 1), in which the appropriate arene is refluxed with Cr (CO) 6 . The [MeCpMn (NO) (CO) 2] PF 6 Compound 9,
King and Bisnette's Method (Inorganic Chemistry, Vol. 6, 1967)
469). [MeCpMn (NO) (CN) 2 ] Na compound 13 (“Journal of Carganometallic Chemistry”) using the method described in the literature.
Volume 170 (1979), page 217, [MeCpMn (NO) (bipy)]
PF 6 Compound 14 (“Inorganic Chemistry”, Vol. 8 (1969) p. 1340), [MeCpMn (NO) (phen)] PF
6 Compound 15 (“Inorganic Chemistry” No. 8
Volume (1969) p. 1340) [MeCpMn (NO) (S 2 CNMe 2 )] Compound 10 (“Inorganic Chemistry”, Vol. 8 (1969) p. 1340), [MeCpMn (NO) (S 2 CNEt) 2 )] Compound 11 (“Inorganic Chemistry”, Vol. 8, 1969, p. 1340), and [MeCpMn (NO) ｛(SCCN)
2 ｝] [NEt 4 ] Compound 16 (“Inorganic Chemistry”, Vol. 8, 1969, p. 1340) was synthesized.
化合物12の製造： 塩〔MeCpMn（NO）（CO）２〕PF6化合物９（1.5g、4.1
ミリモル）を温脱気アセトン（45m）中に溶解した。
この溶液をかきまぜ、50mのエタノール／アセトン
（1:1）中の４−モルホリンカルボジチオ酸（1.03g、4.
11ミリモル）と15mの水との混合物で処理した。赤褐
色への色変化と共に一酸化炭素ガスの放出が観察され
た。かきまぜを45℃において２時間続けた。濾過して溶
液を得、この溶液中の溶媒の容積を真空下に減少させ、
次いで冷却することにより、この溶液から黒褐色の粗生
成物を得た。生成した沈殿を濾別し、沸騰する石油エー
テル（40〜60℃）／アセトンから再結晶し、20℃におい
て３日間貯蔵した後に化合物12の褐色針状結晶（0.2g、
15％）を得た。 Preparation of Compound 12: salt [MeCpMn (NO) (CO) 2] PF 6 Compound 9 (1.5 g, 4.1
Mmol) was dissolved in warm degassed acetone (45 m).
This solution was stirred and 4-morpholine carbodithioic acid (1.03 g, 4.10 g) in 50 m ethanol / acetone (1: 1).
(11 mmol) and 15 m of water. Emission of carbon monoxide gas was observed with a color change to reddish brown. Stirring was continued at 45 ° C. for 2 hours. Filtering to obtain a solution, reducing the volume of solvent in this solution under vacuum,
Then, by cooling, a crude product having a dark brown color was obtained from this solution. The precipitate formed was filtered off, recrystallized from boiling petroleum ether (40-60 ° C.) / Acetone, and stored at 20 ° C. for 3 days before brown needles of compound 12 (0.2 g,
15%).
融点:113〜113℃ 分析結果： 実測値:C,40.78;H,4.70;N,8.53 C11H15N2O2S2Mnに対する計算値:C,40.49;H,4.63;N,8.
58 〔MeCpMn（NO）（S2CNMe2）〕β−シクロデキストリン
の製造： 使用した方法は、既に報告されているフェロセン−β
−シクロデキストリン付加物の製造方法（「ジャーナル
・オブ・ザ・ケミカル・ソサイエティ・ダルトン・トラ
ンスアクション」（1991）第2749頁）から採用した。Melting point: 113-113 ° C Analysis result: Found: C, 40.78; H, 4.70; N, 8.53 C 11 H 15 N 2 O 2 S 2 Mn Calculated: C, 40.49; H, 4.63; N, 8.
58 [MeCpMn (NO) (S 2 CNMe 2 )] Production of β-cyclodextrin: The method used was the previously reported ferrocene-β
-Cyclodextrin adduct was prepared ("Journal of the Chemical Society Dalton Transaction" (1991) p. 2749).
β−シクロデキストリン水和物（2.50g、2.2ミリモ
ル）を窒素雰囲気下に70℃において水（25m）に溶解
した。次いで、固体の〔MeCpMn（NO）（S2CNMe2）〕化
合物10（0.284g、1.0ミリモル）を添加し、生成した混
合物をかきまぜ、70℃において７時間加熱した。冷却
後、沈殿を濾別し、充分水洗し、次いでエタノールおよ
びジエチルエーテルで洗浄した。所要の付加物（0.405
g）を褐色粉末として得た。融点は300℃で分解を伴っ
た。粗生成物についての最初の微量分析結果は、生成物
が数分子の結晶水を有する1:1付加物であることを示し
た。β-cyclodextrin hydrate (2.50 g, 2.2 mmol) was dissolved in water (25 m) at 70 ° C. under a nitrogen atmosphere. Then, solid [MeCpMn (NO) (S 2 CNMe 2 )] compound 10 (0.284 g, 1.0 mmol) was added and the resulting mixture was stirred and heated at 70 ° C. for 7 hours. After cooling, the precipitate was filtered off, washed thoroughly with water and then with ethanol and diethyl ether. Required Additives (0.405
g) was obtained as a brown powder. The melting point was 300 ° C. with decomposition. Initial microanalysis of the crude product showed that the product was a 1: 1 adduct with several molecules of water of crystallization.
実施例２ ベンゼンクロムトリカルボニルの半波電位はジクロロ
メタン中で標準カロメル電極（SCE）に対して＋710mVで
あると記録されている（ジャーナル・オブ・ザ・ケミカ
ル・ソサイエティ・ダルトン・トランスアクション」
（1973）第1768頁）。この錯体は緩衝液中で無視できる
溶解性を示した。しかし、テトラヒドロフラン／ジ−ｎ
−ブチルエーテル中でヘキサカルボニルクロムを置換ベ
ンゼン化合物と共に熱分解する方法（「インオルガニッ
ク・シンセシス」第19巻（1979）第154頁）を使用し
て、誘導体を簡単に製造することができた。生成する錯
体の水に対する溶解度が大きくなると共に中点電位値が
小さくなることを期待して、環にアミンが直接結合して
いるアレーンを選定した。一連の７種の錯体について検
討を行い、これらの錯体が次表に示すように水溶液では
280mV〜＋40mVの範囲で電気化学現象を示すことを観察
した。Example 2 The half-wave potential of benzenechromium tricarbonyl is recorded to be +710 mV in dichloromethane against a standard calomel electrode (SCE) (Journal of the Chemical Society Dalton Transaction).
(1973) p. 1768). This complex showed negligible solubility in the buffer. However, tetrahydrofuran / di-n
The derivative could be easily prepared using a method of pyrolyzing hexacarbonylchromium with a substituted benzene compound in -butyl ether ("Inorganic Synthesis", Vol. 19 (1979) p. 154). In the hope that the solubility of the resulting complex in water would increase and the midpoint potential would decrease, an arene having an amine directly bonded to the ring was selected. A series of seven types of complexes were studied, and these complexes were used in an aqueous solution as shown in the following table.
Electrochemical phenomena were observed in the range of 280 mV to +40 mV.
図１はPBS中50mV/sにおけるクロム錯体化合物６の環
状ボルタモグラムである。化合物６は緩衝水溶液中にお
ける溶解性に乏しいが、図１に示すように、可逆波を示
す唯一の化合物であった。以後の検討は化合物６に限定
して行った。 FIG. 1 is a cyclic voltammogram of chromium complex compound 6 at 50 mV / s in PBS. Compound 6 was poorly soluble in an aqueous buffer solution, but was the only compound showing a reversible wave as shown in FIG. Subsequent investigations were limited to compound 6.
実施例３ クロム錯体を3.5mg/gインキのレベルで含有する有機
カーボンインキから、スクリーン印刷された化合物６混
入電極を製造した。図２（ａ）はPBS中50mV/sおよび0.2
μA/cmにおけるクロム錯体を含有する電極の環状ボルタ
モグラムであり、図２（ｂ）は100μのグルコースオ
キシダーゼ添加後に20mV/sおよび0.5μA/cmにおいて記
録された触媒波である。図２（ａ）から、PBSが電極に
被着していても−15mVという低い中点電位値では、可逆
波が記録されたことが判る。Example 3 A screen printed compound 6 loaded electrode was prepared from an organic carbon ink containing a chromium complex at a level of 3.5 mg / g ink. Figure 2 (a) shows 50mV / s in PBS and 0.2
FIG. 2B is a cyclic voltammogram of an electrode containing a chromium complex at μA / cm, and FIG. 2 (b) is a catalytic wave recorded at 20 mV / s and 0.5 μA / cm after addition of 100 μg glucose oxidase. From FIG. 2A, it can be seen that a reversible wave was recorded at a low midpoint potential value of −15 mV even when PBS was adhered to the electrode.
図２（ｂ）から、酵素とグルコースとの混合物を電極
が被着していると、GODメディエーションが生起し、触
媒電流は約１μＡであることが判る。From FIG. 2 (b), it can be seen that when the electrode is coated with a mixture of the enzyme and glucose, GOD mediation occurs and the catalytic current is about 1 μA.
この結果は重要である。その理由は、錯体がカーボン
電極に混入されている場合には、疎水性の極めて大きい
錯体を使用してGODに対してメディエーションすること
ができることを、上述の結果が示すからである。また、
この結果はメディエータとしての遷移金属半サンドイッ
チ型錯体の電位を示す。This result is significant. The reason is that the above results show that when the complex is mixed in the carbon electrode, it is possible to mediate to GOD using a very hydrophobic complex. Also,
This result indicates the potential of the transition metal half-sandwich complex as a mediator.
実施例４ マンガン半サンドイッチ型錯体を（メチルシクロペン
タンジエニル）マンガントリカルボニル化合物８から得
ることができた。この化合物８は無鉛ガソリンにおける
アンチノック剤として大規模に使用されているので、高
価でなく容易に入手できる出発材料である。例えば、次
の反応図式に示されているように、トリカルボニル化合
物８を亜硝酸（「インオルガニック・ケミストリィ」第
６巻（1967）第469頁）またはニトロソニウムイオン
（「ジャーナル・オブ・カルガノメタリック・ケミスト
リィ」第56巻（1973）第345頁）で処理することにより
生成したニトロシル陽イオン化合物９を経由して広範囲
の種々のカルボニル置換化学を実施した。Example 4 A manganese half-sandwich complex could be obtained from (methylcyclopentanedienyl) manganese tricarbonyl compound 8. Since compound 8 is used on a large scale as an anti-knock agent in unleaded gasoline, it is an inexpensive and readily available starting material. For example, as shown in the following reaction scheme, tricarbonyl compound 8 can be converted to nitrous acid ("Inorganic Chemistry", Vol. 6 (1967), p. 469) or nitrosonium ion ("Journal of Calga"). A wide variety of carbonyl substitution chemistry was performed via the nitrosyl cation compound 9 generated by treatment with Nometallic Chemistry, Vol. 56 (1973, p. 345).
シクロペンタジエニルマンガントリカルボニル自体は
フェロセンより酸化困難であり、その酸化電位はアセト
ニトリル中ではフェロセンより約1.2V大きい（「ジャー
ナル・オブ・オルガノメタリック・ケミストリィ」第10
1巻（1975）第C43頁）。ニトロシル陽イオン化合物９は
緩衝水溶液中で容易に分解して＋230mVにおいて可逆的
に酸化される物質を生成する。しかし、化合物８をシア
ン化物イオンで処理する（「ジャーナル・オブ・オルガ
ノメタリック・ケミストリィ」第170巻（1979）第217
頁）と、陰イオンジシアノ錯体化合物13が得られ、この
化合物は水溶性が大きく、＋440mVにおいて可逆波を示
す。図３は、マンガン錯体化合物８を0.1Mグルコース/P
BS中に溶解した溶液中に０〜25μのGODを滴定したも
のを使用して、グルコースオキシダーゼをマンガン錯体
化合物８で滴定した際に、5mV/sおよび５μA/cmにおい
て得られた触媒波を示す。振幅の次第に増加する一連の
触媒波が得られた。文献（「プログレス・イン・リアク
ション・カイネティクス（Prog.React.Kinet.」第16巻
（1991）第55頁、および「ジャーナル・オブ・エレクト
ロアナリティカル・ケミストリィ」第293頁（1990）第5
5頁）記載の方法に従ってプロットした図４に示す触媒
電流icat対〔GOD〕1/2のグラフから、還元されたGODを
酸化する場合の二次速度係数2.1×105M-1s-1を得た。こ
の速度定数は好都合にもフェロセンの場合に得られた
値、例えばフェロセンモノカルボン酸の場合の2.0×105
M-1s-1（「アナリティカル・ケミストリィ」第56巻（19
84）第667頁）に匹敵していた。 Cyclopentadienyl manganese tricarbonyl itself is more difficult to oxidize than ferrocene, and its oxidation potential is about 1.2 V higher than that of ferrocene in acetonitrile (see Journal of Organometallic Chemistry No. 10).
1 (1975) p. C43). The nitrosyl cation compound 9 readily decomposes in aqueous buffer to produce a substance that is reversibly oxidized at +230 mV. However, compound 8 is treated with cyanide ions (Journal of Organometallic Chemistry, Vol. 170 (1979) 217).
P.) And an anionic dicyano complex compound 13, which is highly water-soluble and exhibits a reversible wave at +440 mV. FIG. 3 shows that manganese complex compound 8 was converted to 0.1 M glucose / P
FIG. 3 shows the catalytic waves obtained at 5 mV / s and 5 μA / cm when glucose oxidase was titrated with manganese complex compound 8 using a solution of GOD titrated in a solution dissolved in BS with 0-25 μg. . A series of catalytic waves of increasing amplitude were obtained. Literature (Prog. React. Kinet., Vol. 16 (1991), p. 55, and "Journal of Electronic Analytical Chemistry", p. 293 (1990), p. 5
From the graph of catalyst current i cat versus [GOD] 1/2 shown in FIG. 4 plotted according to the method described on page 5), the second order rate coefficient for oxidizing reduced GOD is 2.1 × 10 5 M −1 s − 1 was obtained. This rate constant is conveniently the value obtained for ferrocene, for example 2.0 × 10 5 for ferrocene monocarboxylic acid.
M -1 s -1 (Analytical Chemistry, Vol. 56 (19
84) p. 667).
実施例５ いくつかの他のマンガン半サンドイッチ型化合物を化
合物９から製造した。文献（「ジャーナル・オブ・ザ・
ケミカル・ソサイエティ（Ａ）」（1970）第850頁）記
載の方法に従って、化合物９を二座配位子である2,2−
ビピリジンおよび1,10−フェナントロリンで処理するこ
とにより、それぞれ陽イオン化合物14および15を得た。
両錯体とも約600mVの電位において不可逆的電気化学現
象を示した。Example 5 Several other manganese half-sandwich compounds were prepared from compound 9. Literature ("Journal of the
According to the method described in “Chemical Society (A)” (1970, p. 850), compound 9 was converted to the bidentate ligand 2,2-
Treatment with bipyridine and 1,10-phenanthroline yielded cationic compounds 14 and 15, respectively.
Both complexes exhibited irreversible electrochemical phenomena at a potential of about 600 mV.
化合物16をシス−1,2−ジシアノエチレン−1,2−ジチ
オレートから製造した（「インオルガニック・ケミスト
リィ」第８巻（1969）第1340頁）。図５は50mV/sおよび
２μA/cmにおけるPBS中0.6mMのマンガン錯体化合物16の
環状ボルタモグラムである。陰イオンジチオレン錯体の
場合に著しく低い−25mVというEoxが実測されたが、酸
化された形のもの（中性物質）は衝撃液に不溶性である
ことが判った。生成した電極被覆は酵素滴定が不可能に
なったことを意味する。Compound 16 was prepared from cis-1,2-dicyanoethylene-1,2-dithiolate (Inorganic Chemistry, Vol. 8, 1969, p. 1340). FIG. 5 is a cyclic voltammogram of 0.6 mM manganese complex compound 16 in PBS at 50 mV / s and 2 μA / cm. A remarkably low E ox of −25 mV was measured for the anionic dithiolene complex, but the oxidized form (neutral) was found to be insoluble in the shock fluid. The resulting electrode coating means that enzyme titration is no longer possible.
文献（「インオルガニック・ケミストリィ」第８巻
（1969）第1340頁）記載の方法に従って、ジチオカルバ
メート錯体化合物10および11を製造した。また、この方
法を使用して新規化合物であるモルホリノジチオカルバ
メート錯体化合物12を製造した。化合物10〜12は緩衝液
に対して無視できる溶解性を示すので、これらの化合物
の電気化学現象の実測が妨げられることが判った。Dithiocarbamate complex compounds 10 and 11 were produced according to the method described in a literature ("Inorganic Chemistry", Vol. 8, 1969, p. 1340). Using this method, a novel compound, morpholinodithiocarbamate complex compound 12, was produced. Compounds 10-12 show negligible solubility in buffer, indicating that the electrochemical phenomena of these compounds were hampered.
実施例６ 文献には、フェロセンがβ−シクロデキストリン（β
−cd）の疎水活性に包接（inclusion）されると、フェ
ロセンの物理的性質が変化するが、その水溶性は全く増
加しないことを記載している報文が多い。β−シクロデ
キストリン中に混入されたフェロセンの中点電位値は、
僅かなプラスの移動を示すことが報告されており（「ジ
ャーナル・オブ・ザ・オルガニック・ケミストリィ」第
56巻（1991）第35頁、「バイオエレクトロケミストリィ
・アンド・バイオエネルジティクス（Bioelectrochem.B
ioenerg.）」第24巻（1990）第257頁）、GODの場合にフ
ェロセンのメディエーションがβ−シクロデキストリン
によって抑制されることが報告されている。β−シクロ
デキストリンがマンガン錯体を受容（host）するという
報告があると思われない。Example 6 In the literature, ferrocene contains β-cyclodextrin (β
Many reports state that inclusion of the hydrophobic activity of -cd) alters the physical properties of ferrocene but does not increase its water solubility at all. The midpoint potential value of ferrocene mixed in β-cyclodextrin is
It has been reported to show a slight positive movement ("Journal of the Organic Chemistry"
Vol. 56 (1991) p. 35, “Bioelectrochemistry and Bioenergytics (Bioelectrochem. B
ioenerg.), Vol. 24 (1990), p. 257), and it has been reported that the mediation of ferrocene in the case of GOD is suppressed by β-cyclodextrin. It does not appear that there is a report that β-cyclodextrin hosts the manganese complex.
70℃においてβ−シクロデキストリン水溶液中で固体
の錯体化合物10を単にかきまぜることにより1:1包接錯
体が生成し、この混合物を冷却すると前記包接錯体が沈
殿することを認めた。図６は、（ａ）0.1Mグルコース/P
BS中におけるマンガン錯体化合物10とβ−シクロデキス
トリンとの付加物の環状ボルタモグラムおよび（ｂ）50
μのグルコースオキシダーゼの添加後の触媒波を示す
グラフである。この包接錯体は＋225mVにおいて可逆波
を示し、ΔEp＝70mVであり、GODおよびグルコースを添
加した後に触媒電流（icat）＝9.7μＡを有する触媒波
が実測された。It was found that by simply stirring the solid complex compound 10 in an aqueous solution of β-cyclodextrin at 70 ° C., a 1: 1 clathrate complex was formed, and upon cooling the mixture, the clathrate complex precipitated. FIG. 6 shows (a) 0.1 M glucose / P
Cyclic voltammogram of adduct of manganese complex compound 10 with β-cyclodextrin in BS and (b) 50
It is a graph which shows the catalyst wave after addition of glucose oxidase (micro | micron | mu). The inclusion complex represents a reversible waves in + 225 mV, a Delta] E p = 70 mV, the catalyst wave having a catalytic current (i cat) = 9.7μA after addition of GOD and glucose were measured.
実施例７ β−シクロデキストリンが中性のマンガン半サンドイ
ッチ型錯体を受容できることが明らかになり、またβ−
シクロデキストリンが先に記載した陰イオン錯体化合物
16の酸化された不溶性の形のものに対する安定剤として
作用することが観察された。緩衝液中の0.5mM化合物16
溶液の環状ボルタモグラムは、この物質が電極上に沈殿
しつつあることを示す特性を有している。しかし、β−
シクロデキストリン（0.5〜5.0mM）を添加すると可逆波
が生成する。図７（ａ）は種々の量のPBS単独の存在
下、図７（ｂ）は0.5mMのβ−シクロデキストリンを含
有する種々の量のPBSの存在下、図７（ｃ）は1.0mMのβ
−シクロデキストリンを含有する種々の量のPBSの存在
下、図７（ｄ）は5.0mMのβ−シクロデキストリンを含
有する種々の量のPBSの存在下におけるマンガン錯体化
合物16の環状ボルタモグラムである。波はＥ1/2＝＋5m
V、ΔEp＝6mVを示す。Example 7 It was shown that β-cyclodextrin can accept a neutral manganese half-sandwich complex, and
Anion complex compounds described above with cyclodextrin
It was observed to act as a stabilizer for the 16 oxidized insoluble forms. 0.5 mM compound 16 in buffer
The cyclic voltammogram of the solution has properties indicating that the substance is precipitating on the electrode. However, β-
Addition of cyclodextrin (0.5-5.0 mM) produces a reversible wave. 7 (a) in the presence of various amounts of PBS alone, FIG. 7 (b) in the presence of various amounts of PBS containing 0.5 mM β-cyclodextrin, and FIG. 7 (c) in the presence of 1.0 mM β
FIG. 7 (d) is a cyclic voltammogram of manganese complex compound 16 in the presence of various amounts of PBS containing 5.0 mM β-cyclodextrin in the presence of various amounts of PBS containing cyclodextrin. The wave is E1 / 2 = + 5m
V, ΔE p = 6 mV.
実施例８ ジチオカルバメート錯体化合物10〜12について、各錯
体を混入したカーボンインキから製造したスクリーン印
刷されたカーボン電極を使用してさらに検討を行った。
図８に示すように、（ａ）化合物10、（ｂ）化合物11、
および（ｃ）化合物12のそれぞれについて、0.5μA/cm
において50mV/sおよび100mV/sの走査速度を使用して＋2
40mV、＋300mVおよび＋290mVにおいて酸化波を観察し
た。４μＡ領域における触媒波をGODおよびグルコース
の存在下に記録した。メディエータと共に酵素をカーボ
ン電極中に混入した場合には、0.1Mグルコースの場合
に、変動するが29μＡまで増大する電流が得られた、図
９参照。Example 8 The dithiocarbamate complex compounds 10 to 12 were further investigated using screen-printed carbon electrodes manufactured from carbon ink mixed with each complex.
As shown in FIG. 8, (a) compound 10, (b) compound 11,
And (c) 0.5 μA / cm for each of compound 12
+2 using scan speeds of 50 mV / s and 100 mV / s at
Oxidation waves were observed at 40 mV, +300 mV and +290 mV. Catalytic waves in the 4 μA region were recorded in the presence of GOD and glucose. When the enzyme was mixed into the carbon electrode together with the mediator, a current that fluctuated but increased to 29 μA was obtained with 0.1 M glucose, see FIG. 9.
これらのメディエータ／酵素電極は、＋450mVで平衡
させた場合に、図10に示すように、０〜13mMの範囲のグ
ルコースに対して線形に応答した。酵素を含有するカー
ボンインキの配合物中にエチレングリコールを混入する
と、0.1Mグルコースの場合に190μＡまでの電流が生じ
た。These mediator / enzyme electrodes responded linearly to glucose in the range of 0-13 mM when equilibrated at +450 mV, as shown in FIG. The incorporation of ethylene glycol into the enzyme-containing carbon ink formulation resulted in a current of up to 190 μA for 0.1 M glucose.
実施例９ ホースラディッシュペルオキシド（HRP）を使用した
場合に、マンガン錯体化合物10とβ−シクロデキストリ
ンとの付加物がメディエーション作用する性質を、文献
（「アナリティカル・ケミストリィ」第62巻（1990）第
2429頁）記載の方法に従って、回転リング・ディスク・
ボルタンメトリーを使用して、1,1′−ジメチルフェロ
センエタノールアミンと比較することにより評価した。
実験は白金反対電極とカロメル基準電極とを収容してい
るガラス容器（容積14m）を使用して行った。金・金
リング・ディスク電極を4Hzにおいて回転させて、280単
位（280∪）のHRPを含有するメディエータ（0.5mM）の
リン酸緩衝食塩水中に浸漬した。次いで、リング電極を
−100mVにおいて平衡させ、ディスク電極を−100mVから
−600mVにわたって走査して過酸化水素を発生させなが
ら、触媒リング電流を測定した。続いてフェロセンおよ
び化合物10とβ−シクロデキストリンとの付加物を使用
して実験した結果、同一の触媒電流が記録された。Example 9 When horseradish peroxide (HRP) was used, the property of an adduct of manganese complex compound 10 and β-cyclodextrin to mediate was described in the literature (“Analytical Chemistry”, Vol. 62 (1990), vol.
2429) Follow the procedure described in
Evaluation was made by comparison with 1,1'-dimethylferroceneethanolamine using voltammetry.
The experiment was performed using a glass container (capacity 14 m) containing a platinum counter electrode and a calomel reference electrode. The gold-gold ring-disk electrode was rotated at 4 Hz and immersed in phosphate buffered saline of a mediator (0.5 mM) containing 280 units (280 °) of HRP. The ring electrode was then equilibrated at -100 mV, and the catalyst electrode current was measured while scanning the disk electrode from -100 mV to -600 mV to generate hydrogen peroxide. Subsequent experiments using ferrocene and an adduct of compound 10 with β-cyclodextrin resulted in the same catalytic current being recorded.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウォルターズ スティーブン イギリス国 オックスフォード オーエ ックス５ ３エイチディー キルトリン トン オックスフォード ロード ９ (56)参考文献 特開 平２−88960（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−500732（ＪＰ，Ａ) Ｄｉｄｉｅｒ Ａｓｔｒｕｃ，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，16（１／２）350− 328（1992 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/327 C12M 1/40 H05K 1/09 H01B 1/06 ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (72) Inventor Walters Stephen Oxford Ox5 3rd UK 3rd Kiltlinton Oxford Road 9 (56) References JP-A-2-88960 (JP, A) Special Table 61-61 500732 (JP, A) Didier Astruc, New J. Biol. Chem. , 16 (1/2) 350-328 (1992 (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 27/327 C12M 1/40 H05K 1/09 H01B 1/06 CA (STN) JICST file (JOIS)
Claims (36)
化還元酵素または他の電子伝達酸化還元タンパク質との
間の電子伝達をメデイエーションするにあたり、 前記メデイエータ化合物は遷移金属の半サンドイッチ型
錯体であり、前記錯体は非局在化π結合を有するπ配位
子を１個だけ有することを特徴とし、且つ前記錯体は次
の一般式、 （π配位子）Ｍ（非π配位子）ｎ （式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍ
は遷移金属原子を示し、ｎはπ配位子ではない配位子の
数を示し、ｎ個の非π配位子は同一または異なる一価ま
たは多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を満た
す作用を有するものを示す）で表わされ、前記錯体は電
荷を有するかあるいは中性であることを特徴とする電子
伝達をメデイエーションする方法。1. In mediating electron transfer between an electrode and a redox enzyme or other electron transfer redox protein using a mediator compound, the mediator compound is a half-sandwich complex of a transition metal. The complex has only one π ligand having a delocalized π bond, and the complex has the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n (The π ligand in the formula represents one π-bonded ligand;
Represents a transition metal atom, n represents the number of ligands that are not π ligands, and n non-π ligands are the same or different monovalent or polyvalent ligands, and Wherein the complex has a function of satisfying the valence of M), and the complex is charged or neutral.
ル基、シクロブタジエン基、シクロペンタジエニル基、
ベンゼン基、シクロヘプタトリエニル基またはトリメチ
レンメタン基からなる群から選択した基であることを特
徴とする請求項１記載の方法。2. The π ligand is an allyl group, a cyclopropenyl group, a cyclobutadiene group, a cyclopentadienyl group,
The method according to claim 1, wherein the group is selected from the group consisting of a benzene group, a cycloheptatrienyl group and a trimethylenemethane group.
基、アミノ基、置換アミノ基、アミノアルキル基、置換
アミノアルキル基、カルボン酸基およびスルホン酸基か
らなる群から選択した１乃至４個の置換基を有すること
を特徴とする請求項１記載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the π ligand is one to four selected from the group consisting of an alkyl group, an alkoxy group, an amino group, a substituted amino group, an aminoalkyl group, a substituted aminoalkyl group, a carboxylic acid group and a sulfonic acid group. The method according to claim 1, further comprising a substituent.
あることを特徴とする請求項１記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the transition metal M is iron, manganese or chromium.
フィン基、イソシアニド基、ニトロシル基、ビピリジン
基、フェナントロリン基およびジチオレート基からなる
群から選択されることを特徴とする請求項１記載の方
法。5. The method according to claim 1, wherein the non-π ligand is selected from the group consisting of a carbonyl group, a phosphine group, an isocyanide group, a nitrosyl group, a bipyridine group, a phenanthroline group and a dithiolate group. the method of.
−シクロデキストリン中の包接錯体として使用すること
を特徴とする請求項１記載の方法。6. The transition metal half-sandwich compound is β
2. The method according to claim 1, wherein the method is used as an inclusion complex in cyclodextrin.
て、該センサはメデイエータとして遷移金属半サンドイ
ッチ型化合物を使用し、該遷移金属半サンドイッチ型化
合物は非局在化π結合を有する１つのπ配位子とのみ錯
体形成する遷移金属を含み、且つ次の一般式、 （π配位子）Ｍ（非π配位子）ｎ （式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍ
は遷移金属原子を示し、ｎはπ配位子ではない配位子の
数を示し、ｎ個の非π配位子は同一または異なる一価ま
たは多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を満た
す作用を有するものを示す）で表わされ、該錯体は電荷
を有するかあるいは中性であることを特徴とする電流測
定酵素センサ。7. An enzyme sensor for amperometric measurement of an analyte, wherein the sensor uses a transition metal half-sandwich compound as a mediator, wherein the transition metal half-sandwich compound has one π configuration having a delocalized π bond. And a transition metal which forms a complex with only a ligand, and has the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n (wherein the π ligand is one π-bonded coordination) Indicates a child, M
Represents a transition metal atom, n represents the number of ligands that are not π ligands, and n non-π ligands are the same or different monovalent or polyvalent ligands, and An enzyme having an action to satisfy the valence of M), wherein the complex is charged or neutral.
使い捨てテスト用帯状部材であって、前記使い捨てテス
ト用部材は作用電極、少なくとも１種の酸化還元酵素と
メディエータとしての遷移金属の半サンドイッチ型錯体
を含有する検体レベルを示す電流を発生させるためのテ
スト試薬、および基準電極を具え、前記錯体は非局在化
π結合を有する１個のπ配位子を有することを特徴と
し、且つ前記錯体は次の一般式、 （π配位子）Ｍ（非π配位子）ｎ （式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍ
は遷移金属原子を示し、ｎはπ配位子ではない配位子の
数を示し、ｎ個の非π配位子は同一または異なる一価ま
たは多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を満た
す作用を有するものを示す）で表わされ、前記錯体は電
荷を有するかあるいは中性である ことを特徴とする使い捨てテスト用帯状部材。8. A dry disposable test strip for use in an amperometric enzyme sensor, said disposable test strip comprising a working electrode, at least one oxidoreductase and a semi-sandwich of transition metal as a mediator. A test reagent for generating a current indicative of an analyte level containing the complex, and a reference electrode, wherein the complex has one π ligand having a delocalized π bond, and The complex is represented by the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n (wherein the π ligand represents one π-bonded ligand;
Represents a transition metal atom, n represents the number of ligands that are not π ligands, and n non-π ligands are the same or different monovalent or polyvalent ligands, and A complex having a function of satisfying the valence of M), wherein the complex is charged or neutral.
としての遷移金属の半サンドイッチ型錯体を含有し、前
記半サンドウィッチ型錯体は非局在化π結合を有する１
個のπ配位子を有することを特徴とし、且つ前記錯体は
次の一般式、 （π配位子）Ｍ（非π配位子）ｎ （式中のπ配位子は１個のπ結合した配位子を示し、Ｍ
は遷移金属原子を示し、ｎはπ配位子ではない配位子の
数を示し、ｎ個の非π配位子は同一または異なる一価ま
たは多価の配位子であって、遷移金属Ｍの原子価を満た
す作用を有するものを示す）で表わされ、前記錯体は電
荷を有するかあるいは中性である ことを特徴とする導電性印刷インキ。9. A conductive printing ink comprising a half-sandwich complex of a transition metal as a mediator, wherein the half-sandwich complex has a delocalized π bond.
Π ligands, and the complex is represented by the following general formula: (π ligand) M (non-π ligand) n (wherein the π ligand is one π ligand) Indicates a bound ligand, M
Represents a transition metal atom, n represents the number of ligands that are not π ligands, and n non-π ligands are the same or different monovalent or polyvalent ligands, and Wherein the complex has a function of satisfying the valence of M), and the complex is charged or neutral.
ニル基、シクロブタジエン基、シクロペンタジエニル
基、ベンゼン基、シクロヘプタトリエニル基またはトリ
メチレンメタン基からなる群から選択した基であること
を特徴とする請求項７に記載の電流測定酵素センサ。10. The π ligand is a group selected from the group consisting of an allyl group, a cyclopropenyl group, a cyclobutadiene group, a cyclopentadienyl group, a benzene group, a cycloheptatrienyl group and a trimethylenemethane group. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, wherein:
基、アミノ基、置換アミノ基、アミノアルキル基、置換
アミノアルキル基、カルボン酸基およびスルホン酸基か
らなる群から選択した１乃至４個の置換基を有すること
を特徴とする請求項７に記載の電流測定酵素センサ。11. The π ligand is one to four selected from the group consisting of an alkyl group, an alkoxy group, an amino group, a substituted amino group, an aminoalkyl group, a substituted aminoalkyl group, a carboxylic acid group and a sulfonic acid group. 8. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, having the following substituent:
であることを特徴とする請求項７に記載の電流測定酵素
センサ。12. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, wherein the transition metal M is iron, manganese or chromium.
スフィン基、イソシアニド基、ニトロシル基、ビピリジ
ン基、フェナントロリン基およびジチオレート基からな
る群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の
電流測定酵素センサ。13. The method according to claim 7, wherein each of the non-π ligands is selected from the group consisting of a carbonyl group, a phosphine group, an isocyanide group, a nitrosyl group, a bipyridine group, a phenanthroline group and a dithiolate group. An amperometric enzyme sensor according to claim 1.
−シクロデキストリン中の包接錯体として使用すること
を特徴とする請求項７に記載の電流測定酵素センサ。14. A transition metal half-sandwich type complex comprising β
8. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, which is used as an inclusion complex in cyclodextrin.
ニル基、シクロブタジエン基、シクロペンタジエニル
基、ベンゼン基、シクロヘプタトリエニル基またはトリ
メチレンメタン基からなる群から選択した基であること
を特徴とする請求項８に記載の乾燥したテスト用帯状部
材。15. The π ligand is a group selected from the group consisting of an allyl group, cyclopropenyl group, cyclobutadiene group, cyclopentadienyl group, benzene group, cycloheptatrienyl group and trimethylenemethane group. 9. The dry test strip of claim 8, wherein:
基、アミノ基、置換アミノ基、アミノアルキル基、置換
アミノアルキル基、カルボン酸基およびスルホン酸基か
らなる群から選択した１乃至４個の置換基を有すること
を特徴とする請求項８に記載の乾燥したテスト用帯状部
材。16. The π-ligand is one to four selected from the group consisting of an alkyl group, an alkoxy group, an amino group, a substituted amino group, an aminoalkyl group, a substituted aminoalkyl group, a carboxylic acid group and a sulfonic acid group. 9. The dried test strip according to claim 8, wherein the test strip has the following substituents.
であることを特徴とする請求項８に記載の乾燥したテス
ト用帯状部材。17. The dry test strip according to claim 8, wherein the transition metal M is iron, manganese or chromium.
スフィン基、イソシアニド基、ニトロシル基、ビピリジ
ン基、フェナントロリン基およびジチオレート基からな
る群から選択されることを特徴とする請求項８に記載の
乾燥したテスト用帯状部材。18. The method according to claim 8, wherein each of the non-π ligands is selected from the group consisting of a carbonyl group, a phosphine group, an isocyanide group, a nitrosyl group, a bipyridine group, a phenanthroline group and a dithiolate group. A dry test strip as described.
−シクロデキストリン中の包接錯体として使用すること
を特徴とする請求項８に記載の乾燥したテスト用帯状部
材。19. The transition metal half-sandwich type complex is represented by β
9. Dry test strip according to claim 8, characterized in that it is used as an inclusion complex in cyclodextrin.
ニル基、シクロブタジエン基、シクロペンタジエニル
基、ベンゼン基、シクロヘプタトリエニル基またはトリ
メチレンメタン基からなる群から選択した基であること
を特徴とする請求項９に記載の導電性印刷インキ。20. The π ligand is a group selected from the group consisting of allyl, cyclopropenyl, cyclobutadiene, cyclopentadienyl, benzene, cycloheptatrienyl and trimethylenemethane. The conductive printing ink according to claim 9, wherein:
基、アミノ基、置換アミノ基、アミノアルキル基、置換
アミノアルキル基、カルボン酸基およびスルホン酸基か
らなる群から選択した１乃至４個の置換基を有すること
を特徴とする請求項９に記載の導電性印刷インキ。21. The π ligand is one to four selected from the group consisting of an alkyl group, an alkoxy group, an amino group, a substituted amino group, an aminoalkyl group, a substituted aminoalkyl group, a carboxylic acid group and a sulfonic acid group. The conductive printing ink according to claim 9, which has a substituent of the following.
であることを特徴とする請求項９に記載の導電性印刷イ
ンキ。22. The conductive printing ink according to claim 9, wherein the transition metal M is iron, manganese or chromium.
スフィン基、イソシアニド基、ニトロシル基、ビピリジ
ン基、フェナントロリン基およびジチオレート基からな
る群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の
導電性印刷インキ。23. The method according to claim 9, wherein each of the non-π ligands is selected from the group consisting of a carbonyl group, a phosphine group, an isocyanide group, a nitrosyl group, a bipyridine group, a phenanthroline group and a dithiolate group. The conductive printing ink according to the above.
−シクロデキストリン中の包接錯体として使用すること
を特徴とする請求項９に記載の導電性印刷インキ。24. The transition metal half-sandwich type complex
The conductive printing ink according to claim 9, which is used as an inclusion complex in cyclodextrin.
導電性印刷インキ。25. The conductive printing ink according to claim 9, wherein the transition metal M is iron.
記載の導電性印刷インキ。26. The conductive printing ink according to claim 9, wherein the transition metal M is manganese.
載の導電性印刷インキ。27. The conductive printing ink according to claim 9, wherein the transition metal M is chromium.
方法。28. The method according to claim 1, wherein the transition metal M is iron.
記載の方法。29. The method according to claim 1, wherein the transition metal M is manganese.
載の方法。30. The method according to claim 1, wherein the transition metal M is chromium.
電流測定酵素センサ。31. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, wherein the transition metal M is iron.
記載の電流測定酵素センサ。32. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, wherein the transition metal M is manganese.
載の電流測定酵素センサ。33. The amperometric enzyme sensor according to claim 7, wherein the transition metal M is chromium.
乾燥したテスト用帯状部材。34. The dry test strip of claim 8, wherein the transition metal M is iron.
記載の乾燥したテスト用帯状部材。35. The dry test strip of claim 8, wherein the transition metal M is manganese.
載の乾燥したテスト用帯状部材。36. The dry test strip of claim 8, wherein the transition metal M is chromium.
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