JPH06509059A - Ｐｍｎから誘導されたｃｒ３モジュレータ及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ＰＭＮから誘導されたＣＲ３モジュレータ及びその使用発明の技術分野 本発明は全体的に炎症に関し、更に詳しくは、感染性物質及びそれに関連する侵 入的刺激に対応する白血球の移動、にかかわる活動及び関係する機構に関する。 発明の背景 炎症性疾患は、疾患組織への白血球の移動により特徴ずけられる。組織損傷は、 直接的には溶解性酵素や、過酸化陰イオンなどの反応性小細胞などの解放により 、間接的には炎症メディエータの解放により、多形核白血球（ＰＭＮ）が原因と なる、と考えられている。ＰＭＮを動物の循環路から除去することは、ある種の 炎症において組織損傷を減少させることになる。 ＣＤ１８抗原は、共通のβ鎖、ＣＤ１８を有する三つの異種二量体レセプタのフ ァミリーであり、相同体であるが、α鎖、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ ｃが相互に異なる。これらレセプタはすべての白血球にみられ、インテグリンの 上位ファミリーのメンバーである（Ｒ，Ｏ，Ｈｙｎｅｓ、１９８７年）。インテ グリンは、リガンド結合のため二価陽イオンとあたたかい温度を必要とするα、 β、異種二量体であって（前記Ｈｙｎｅｓ）、細胞−細胞及び細胞−細胞外マト リックス付着相互作用を媒介する。リガンドの多くはトリペプチド配列、Ａｒ　 ｇ−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ａ　ｓ　ｐ、あるいはＲＧＢを介して結合される。白血球イ ンテグリン（Ｂ＋インテグリンあるいはＣＤ１８抗原）は、ＩＣＡＭ−１，ＩＣ ＡＭ−２、Ｃ３ｂｆ、フィブリノーゲン及び内皮上の特定されない構造、を含む 多数の表面結合リガンドを認識することにより、細胞の付着に関与する（Ｓ、　 Ｄ、　Ｗｒ　ｉｇｈｔはか、１９９０年）。 補体レセプタ型３　（ＣＲ３，ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８としても知られる）である ＣＤ１．８抗体の一つは、ヒト多形核白血球（ＰＭＮ）　、単核細胞、巨大細胞 に見られる。このレセプタのりガントにはＣ３ｂ　ｉ、補体の第三成分の開裂産 物、フィブリノーゲン、及び内皮細胞のまだ特徴ずけられない分子、が含まれる （前記Ｓ、　Ｄ、　Ｗｒ　ｉ　ｇｈ　ｔほか）。リガントの第二の型は、グラム 陰性菌からのすボ多糖類のリピド■ａ部分であり（Ｓ、Ｄ、　Ｗｒ　ｉ　ｇｈ　 ｔほか、１９８６年；Ｓ、Ｄ、Ｗｒｉｇｈｔほか、１９８９年）、これは、異な るモノクローナル抗体との遮断による蛋白質性リガンドから区別することができ るレセプタの部位で結合することができる。 ＰＭＮの組織への移動はＣＤ１８抗原とモノクローナル抗体とを遮断することに より、劇的に減少させることができる。このような遮断は、ＰＭＮが、腹膜腔、 脳、心臓、腸、皮膚への移動を妨害することが発見さね、髄膜炎、心臓及び腸虚 血症、再がん流損傷及び出血ショック患者における組織損傷を減少させることが わかった（Ｅ、１．Ｔｕｏｍａｎｏｎほか、１．９８９年；Ｐ、Ｊ、Ｓｉｍｐｓ ｏｎほか、１９８８年；Ｎ、Ｂ、Ｖｅｄｄｅｒほか、１９８８年、Ｌ、Ａ、Ｈｅ ｒｎａｎｄｅｚほか、１９８７年）。このような治療法は、Ａｒｆｏｒｓに与え たれた再がん流に関する米国特許第４，７９７，３７７号、ＰＭＮ移動に関する 種々の炎症についてのヨーロッパ特許公開第０．３４６．０７８号（１９８９， １２，１３）、に示唆されている。 両公報において、ある種の抗体が指摘さね、ＣＤ１８レセプタを遮断し、従って ＰＭＮが内皮へ移動し付着することを遮断する仮説が提示されている。しかしこ れら抗体の構造及び発生は、炎症部位へのＣＤ１８付着の制■を説明する内因性 細胞内機構を示唆するものではない。 ＣＤ１８分子が内皮（あるはそのリガンドのいずれか）と結合する能力は迅速に 変えられる。このため、化学的親和性による刺激により白血球は迅速に内皮に付 着することができ、また細胞は、その先端が付着し尿で付着からはなれるように 、連動することが可能になる。このような調整された挙動により、ＣＤ１８は、 白血球の組織内への移動を促進する。 ヒトＰＭＮのＣＲ３は、調整された形でそのリガンドを結合する。この特性は、 ロゼツトアッセイ法を用いてＷｒｉｇｈｔ及びＭｅ　ｙ　ｅ　ｒ　（Ｓ、Ｄ、　 Ｗｒ　ｉｇｈｔほか、１９８６）によりはじめて記載された。ＰＭＮを生ず培養 壁に付着し、表面（ＥＣ３ｂｉ）にＣ３ｂ　ｉを共有結合的に有するヒツジの白 血球を添加する。短時間の培養の後、未結合Ｅを流し落し、１００　ＰＭＮあた りのＥ結合の数を相対即顕微鏡検査により数える（付着指数）。見たとるこては 、小径Ｅが、ＰＭＮに付着した時にはロゼツト状構造を形成する。 ＣＲ３はＰＭＮ上ではそのリガンドであるＣ３ｂ１の結合が貧弱である。しかし 、ＰＭＮをホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ）のような作用物質で処 理した時には、ＣＲ３の結合活性は一時的に増加する。ＰＭＡ中で２０分後、ロ ーゼットは５−１０倍に上昇するが、ＰＭＡ中で６０分後では、ローゼットは出 発レベル以下に低下する。Ｃ３ｂ　ｉとの結合のこの変化は、特定の顆粒から解 放される表面レセプタ数が２−３倍増加することから、部分的に説明することが できるだけである。結合が基準線以下に低下したとしても、脱顆粒後レセプタ表 現はなお高くとどまっている。 また研究の結果（Ｓ、　Ｋ、Ｌｏほか、１９８９年）によれば、ＣＤ１８活性は 、ＰＭＮ由来細胞質体のホルボールエステル刺激の後、上昇した。前記細胞質体 は特定が顆粒欠け、従ってプラズマ膜でレセプタ数を増大させるものではない。 かくして、何か他の手段が結合の一時的変化にかかわっているはずである。 Ｄｅ　ｔｍｅｒｓほか（１９８７）は、高いレセプタ結合が、細胞表面の小群中 にレセプタが局地化していることと、かかわりがあることを示した。しかしこの ような小群化の機構は知られておらず、小群中の個別レセプタのに４は知られて いない。そこで本発明はこのような現象を解明することがその課題である。 本発明の要約 本発明によれば、ＣＤＩ、８活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により 生成される物質もしくは因子が発見さね、単離さね、清製される。この因子は、 以下の説明において、ＣＲ３モジュレータ、ＣＲ３モジュレータ因子あるいはＣ ＭＦ−１と呼ばれる。ＣＲ３モジュレータはこれまでその物理的、機能的特性の いくつかが知られている。現在、ＣＲ３モジュレータは以下の物理的特性を有す ることが、わかっている： Ａ、　刺激を受けた多形核白血球により合成される酸性の、両親媒性化合物であ る； Ｂ、　約３４０ダルトンの分子量を有する；Ｃ１水酸化ナトリウムあるいは水酸 化アンモニウム等のよく知られた塩基り、メバロン酸合成の生合成産物であり、 その構造中におそらくイソプレノイドを有する。 上記の物理的特性のほか、本発明のＣＲ３モジュレータは以下の活性を有する： Ａ、ＣＤ１８に直接に結合する； Ｂ、　ＣＤ１８の付着促進活性を賦活する：Ｃ，Ｃ３ｂ１の結合位置でＣＲ３の 結合を増大させる；Ｄ、　内皮細胞、フィブリノーゲン被覆基体及びリピドｒＶ ａ被覆基体に対するＰＭＮ結合を増大させる； Ｅ、　ＬＦＡ−１により媒介される白血球付着を増大させる；Ｆ、　ＰＭＡなと の賦活体により既に活性化されているＰＭＮを更に刺激することができる； Ｇ、その活性は投与量に依存する。 このＣＲ３モジュレータは、その保有しない活性によっても特徴ずけられる。特 に、このＣＲ３モジュレータは全血液による腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の産生を導 くものでなく、同様にＰＭＮの脱顆粒化の原因となるものではない。この後者の 特性のため、ＣＲ３モジュレータはＰＭＮの一般的作用物質としての働きをなす ようにはみえず、むしろＣＲ３に特異性を有する活性をもつようにみえる。 本発明のＣＲ３モジュレータは、多形核白血球から単離し清製することにより得 られる。このＰＭＮ、あるいはこれと関係するＣＲ３モジュレータを有する活性 フラグメントは、例えばＣＤ１８の免疫沈降などの、一連のよく知られた単離法 を適用し、それによりＣＲ３モジュレータが回収される。本発明は、もちろん、 ＣＲ３モジュレータ調製の別の手段も提案しており、これは、ＰＭＮをＣＲ３モ ジュレータ合成のプロモータで刺激し、単離し、上述のようにＣＲ３モジュー　 レークに回収すること、及び化学的合成を含む。従って本発明は、その範囲にこ のような別の調製方法も含む。 本発明は、更に、特発性あるいは浸潤的刺激の発見方法であって、ＣＲ３モジュ レータの産出及びこれに影響される活動に基ずいて上記刺激を発見する方法を含 む。特に浸潤的な刺激は、多形核細胞によるＣＲ３モジュレータの産出を刺激す るその能力により、特定され発見することができる。例えばこの方法によれば、 多形核細胞の標本を多数の既知刺激物質、例えば比較物質としてのエンドトキシ ス　トリパノゾーマ等で処理するかこれらにさらし、一方、これと平行して細胞 標本を感染したと考えられる刺激部位からの抽出物で処理するがこれにさらす。 次いですべての標本を培養し、その後、ある態様によれば、ＣＲ３モジュレータ が存在するかどうか標本を検定する。あるいは培養標本の一部を、Ｃ３ｂ１（Ｅ Ｃ３ｂｊ）で被覆した赤血球標本に添加して、赤血球のＰＭＮ結合が生じている かどうかを確かめるようにすればよい。 同様に、ＣＲ３モジュレータに対抗する効果をもつか、あるいはその合成を阻止 する薬剤をスクリーニングするアッセイ系が提供される。例えば、試験薬をＣＲ ３モジュレータを有するＰＭＮ標本細胞、及びＥＣ３ｂｉのような活性ＰＭＮが 結合することがわかっている細胞標本に加え、ＰＭＮの結合活性に及ぼす影響を 決定する。あるいは、試験薬をＣＲ３モジュレータ産出を通常含む作用物質と共 に、ＰＭＮ標本コロニーに加える。標本中のＣＲ３モジュレータを測定すること により、その試験薬がＣＲ３モジュレータの産出を遮断するがどうがかわかる。 本発明はまた、哺乳動物における刺激された、自然的なあるいは特発性の病的状 態を本発明のＣＲ３モジュレータ存在の作用として、ＰＭＮ活性を測定すること により検出する方法に関する。より詳しくいうと、ＣＲ３モジュレータの活性は ＣＲ３モジュレータの適当なラベル量を使用することにより、後述するアッセイ 法により直接的に追跡できる。あるいは、ＣＲ３モジュレータはＣＲ３モジュレ ータの存在及び量を試験するための、ラベルされ媒体中に導入される結合相手あ るいは拮抗物質を培養するために使用し、それにより、前記媒体を抽出した宿主 の状態を評価することができる。 かくして、ＣＲ３モジュレータ、及びこれに対応して調製される拮抗物質は、水 酸化ホウ素ナトリウムなどの放射性物質あるいは放射性ヨウ素でラベルしたＣＲ ３モジュレータの拮抗物質などを使用する放射免疫測定などの免疫アッセイ法を 含む種々の診断法に関連した使用ができる。 免疫アッセイ法においては、ＣＲ３モジュレータ、その拮抗物質等のある量を調 製し、酵素、特定の結合相手及び／あるいは放射線元素をラベルし、次いで浸潤 が生じていると考えられる哺乳動物の血液標本に導入する。ラベルされた物質あ るいはその結合相手が標本中の部位と反応する機会をもった後、生じた物質を種 々の方法（ラベル物質の性質により異なる）で検査する。 同位元素、ＩＩＣ，Ｉ′Ｉ　ｌ、　３１．　Ｂ’５１．３５Ｓなどの放射性ラベ ルが使用される場合、今日採用されているカウント法を利用する。ラベルが酵素 である場合、検出は、現在用いられている比色定量法、分光光度法、蛍光比色法 あるいは気体定量法により行なう。 本発明は、ＣＲ３モジュレータの存在を定量的に分析するテストキットの形で提 供されるアッセイ系を含む。テストキットは、上述の放射線及び／あるいは酵素 定量法に用いるラベル成分を有し、このラベルをＣＲ３モジュレータに結合させ 、更にキットは一種あるいは数種の免疫化学的反応剤であって、そのうちの少く とも一種は遊離したあるいは不働態のリガンドであり、ラベルされた素子、その 結合相手、検定される素子あるいはその結合相手、と結合しうる反応剤を含む。 別の実施態様では、本発明はある種の治療法であって、ＣＲ３モジュレータ、Ｃ Ｒ３モジュレータの作用薬の活性、あるいはこれらもしくは作用薬活性を有する 他の薬剤の活性に基ずく治療法にかかわる。第一の治療プロトコル（治療計画） はＣＲ３モジュレータの結合活性に続く症状、例えば炎症の防止に関係するもの であり、ＣＲ３モジュレータの拮抗物質、あるいはＣＲ３モジュレータの産出及 び／あるいは活性を調節（モジュレータ）する薬剤を、単独であるいは複合させ て、宿主の症状の進展を防ぐことのできる量を投与することからなる。 ＣＲ３モジュレータの合成を抑制する方法には、ＰＭＮあるいはその活性フラグ メントと、ＣＲ３モジュレータ合成のプロモータとの反応を遮断することが含ま れる。従ってその実施態様では、ＣＲ３モジュレータ合成プロモータの役割をす る物質の抑制、例えば多形核白血球のレセプタと反応する作用物質、ＣＲ３モジ ュレータ合成を開始させる細胞内信号物質、ＣＲ３モジュレータを合成させる酵 素、ＣＲ３モジュレータの代謝プレカーサの役割をする分子の合成あるいは産生 を促進する物質の抑制にかかわる。かくしてこの方法では１、媒体その他の標本 あるいは基体に、拮抗物質あるいは先述物質の抗体を、ＣＲ３モジュレータの合 成を遮断、抑制するために有効な量を導入することを含む。ＣＲ３モジュレータ 合成を促進する代表的な物質には、ホルボールミリスチン酸アセテート（ＰＭＡ ）；血小板活性因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；ホルミル−ＮＯｒＬ ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｆＮＬＬＰ）；インターロイキン−３（ＩＬ−８）及 びＣ５ａ、が挙げられる。代表的な細胞内信号物質は、フロティンキナーゼＣ、 ＣＧＭＰ、Ｇ−プロティン及びこれらの混合物から選ばれる。ＣＲ３モジュレー タ合成プロモータに対する適当な拮抗物質／抗体は、採用するアッセイ法により 決定されよう。 上に概括した治療法の第一の局面では、感染、負傷、免疫学的に不明である原因 による炎症の治療法が含まオーこの方法によれば、ＣＲ３モジュレータに対する 拮抗物質、ＣＲ３モジュレータ合成プロモータの拮抗物質、あるいは本発明の別 の局面で準備され使用される薬剤スクリーニングアッセイ法により開発された他 の同様に有効な薬剤を投与する。 この治療法の別の実施態様では、先ずＣＲ３モジュレータの存在及び活性を検出 し、次いで適切な治療組成物を投与することが提案される。 本発明によれば、敗血症その他の感染性あるいは非感染性傷害時に肺その他の器 官に白血球の流入をを抑制する方法、及びそれに関連する組成物が提供される。 この方法は、ＣＲ３モジュレータの拮抗物質及び／もしくはＣＲ３モジュレータ 合成プロモータの拮抗物質を投与することからなる。更に本発明は、内毒素ショ ックあるいは何かの原因による成人呼吸困難症を有する患者の肺その他の器官に 白血球その他の進入を抑制するため、ＣＲ３モジュレータの拮抗物質及び／もし くはＣＲ３モジュレータ合成プロモータの拮抗薬を治療量投与することからなる このような患者の治療法及びそれに関する物質を提供する。 本発明はまた、患者の炎症を除去するあるいは減少させる方法及びその治療組成 物に関わり、本発明によれば、ＣＲ３モジュレータの拮抗薬及び／もしくはＣＲ ３モジュレータ合成プロモータの拮抗物質の治療量が感染性疾患に対する抗感染 剤の投与前に、投与と同時にあるいは投与後に、患者に投与される。対感染剤と 、ＣＲ３モジュレータ作用薬及び／もしくはＣＲ３モジュレータ合成拮抗物質の 治療量とを組みあわせた投与形態も記載されている。 本発明による第二の治療プロトコルは、宿主が免疫不能あるいはＰＭＮ不作用に 関係する機能不全である場合に、その治療のため多形核白血球の活性化及び動員 化かかる。このような場合、ＣＲ３モジュレータ、あるいはその活性を模倣する 薬剤を含む適当な組成物をその治療が必要な患者あるいは宿主に投与する。 投与法は医学スタッフには従来採用されているような、非経口投与を含む各種の 形態であってよい。 かくして本発明の主たる目的は、ＣＤ１８活性を高める作用物質に応じて多形核 白血球により合成される、多形核白血球活性のモジュレータを単離し、精製した 形で提供することである。 本発明の別の目的は、多形核白血球の刺激による前述ＣＲ３モジュレータの合成 法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、上述のＣＲ３モジュレータの拮抗物質及びその調製法 を提供することである。 本発明の更に別の目的は、適当な場合組換え手段を用いてＣＲ３モジュレータの 調製をする方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、哺乳動物において感染症などの浸潤的、自然的、ある いは特発的状態が疑われる場合に、ＣＲ３モジュレータの存在を検出する方法を 提供することである。 本発明の更に別の目的は、哺乳動物におけるＣＲ３モジュレータの悪影響を除く ために有効な、薬剤等の物質をスクリーニングするための方法及びア・ソセイ系 を提供することである。 本発明の更に別の目的は、ＣＲ３モジュレータの存在あるいは活性による悪影響 を変えるためその量を調節して、哺乳動物を治療する方法を提供することである 。 本発明の更に別の目的は、浸潤的、自然的あるいは特発的病的状態の悪影響を治 療あるいは逸らせるため、ＣＲ３モジュレータの量、あるいは活性を促進するこ とにより、哺乳動物を治療する方法を提供することである。 本発明の更に別の目的は、治療方法に使用する製薬組成物を提供することであっ て、これは、ＣＲ３モジュレータあるいはその結合相手、ＣＲ３モジュレータの 産生を制御する薬剤、あるいはＣＲ３モジュレータの活性を模倣もしくは拮抗す る薬剤をベースとする。 本発明の他の目的及び利点は、添付の図面を参照しつつ本文の説明を検討するこ とにより、当業者には明らかになろう。 発明の詳細な説明 本発明によれば、当業者には周知の分子生物学的、微生物学的、遺伝子組換え技 法が採用されてよい。このような技法は文献に記載されており、例えば、以下を 参照：Ｍａｎｉａｔｊｓ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ＆ＳａｍｂｒｏｏｋのＭｏｆｅｃｕｌ ａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：Ａ　ｈａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、１９８２ ；　”ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、 ”Ｉ、ＩＩ巻、（Ｄ、Ｎ、Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ、１９８５）；　’０１　ｉｇｏ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ”　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ　ｅｄ、　 １９８４）；　”Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ″　 （Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ＆Ｓ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ　ｅｄｓ、１９８５）；　”Ｔ ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”　（Ｂ、Ｄ、Ｈ ａｍｅｓ　＆Ｓ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｊｎｓ、ｅｄｓ、１９８４）；　“Ａｎｉｍａ ｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅ”　（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｌｌｎｅｙ、ｅｄ、１９８ ６）；　”Ｉｍｍ。 ｂｊｌｉｇｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｙｙｍｅｓ″　（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓ ｓ、１９８６）；Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、“Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　 Ｔｏ　Ｍｅｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　１９８６゜　従って本明細書に 出てくる以下の用語は、以下の内容を有する。 “作用物質”とは、細胞コロニー、抗原、抗体その他の要素のある活性を模倣し あるいは促進する化学物質、化合物、抗原等の物質であり、一方“拮抗物質”と は、このような活性を抑制し、遮断する物質、化合物、抗体等の物質である“抗 体”は、特定のエピトープと結合する抗体及びそのフラグメントを含むイムノグ ロブリンである。この用語は特にポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗 体を含み、キメラ抗体については詳細には米国特許第４．　８１６．　３９７号 及び４，８１６．８６７号に記載されている。 “抗体結合位置”は、特に抗原と結合する、変動的なあるいは超変動的な域の重 いあるいは軽い鎖を含む抗体分子の構造部分である。 “抗体分子“なる用語は、静止イムノグロブリン分子及びイムノグロブリン分子 の免疫学的に活性部分の双方を指す。 例示的な抗体分子は静止イムノグロブリン分子、実質的に静止したイムノグロブ リン分子、及び当業者にはＦａｂ’　、Ｆａｂ’　、Ｆ　（ａｂ’　）　２及び Ｆ　（Ｖ）として知られている部分であって治療法に使用することが好ましい部 分を含むパラトープを有するイムノグロブリン分子の前記部分である。 抗体分子のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２部分は、よく知られた方法で、実質的に静 止抗体分子上で、ペパインとペプシンそれぞれの蛋白分解反応により調製される 。例えばチオフィロポラスほかの米国特許第４．３４２．５６６号参匙Ｆａｂ’ 抗体分子部分もまたよく知られており、Ｆ　（ａｂ’　）　２部分からつくられ 、次いでメルカプトエタノールとの結合のような二つの重い鎖部分を架橋するジ スルフィド結合を減少させ、生ずるプロティンメルカプタンをヨー化アセトアミ ドのような反応剤を用いてアルキル化する。静止抗体分子を有する抗体が本発明 では好ましい。 “モノクローナル抗体”なる用語は、特定の抗原と免疫反応しうる一種のみの抗 体結合位置を有する抗体を指す。モノクローナル抗体は、従って、これと免疫反 応する抗原に対する単一の結合親和力を発揮する。モノクローナル抗体はかくし て、それぞれ相異なる抗原に免疫特異性がある複数の抗体結合位置を有する抗体 分子を含んでもよい。 本明細書において“実質的と同時に”なる句は、同時的な結果を生じさせるため に十分な時間範囲内を意味する。 “薬学的に受け入れられる”なる句は、分子あるいは組成物について、人間に投 与された時、胃のむカリき、目まい等のアレルギー的等の意図しない反応を生じ させることなく身体的に受けいれられる、ことを意味する。 “治療学的有効量”とは、炎症部位に移動する白血球を少なくとも約３０パーセ ントより好ましくは少くとも５０パーセント、もっとも好ましくは少くとも９０ パーセント阻止もしくは減少させるために十分な量、を意味する。 本発明はその第一の局面では、ＣＤ１８レセプタの活性を高め、補体レセプタ３ 型（ＣＲ３）あるいは（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）として知られる多形核且毛（Ｐ ＭＮ）のレセプタを刺激する作用物質に応じて、ＰＭＮにより合成される物質あ るいは因子の単離、精製及び同定に関する。既に述べたようにＰＭＮの活性、特 に内皮細胞その他の物質へのＰＭＮの移動及び結合は、このＣＲ３モジュレータ との直接的な相互作用により活性化されるように見える。従ってこの因子の存在 が活性の理解と制御は、炎症の治療及びＰＭＮの体止態と関係する免疫反応不全 の治療に重要な示唆を与える。同様に多くの診断上の有用性が予見される。 本発明のＣＲ３モジュレータは、現在、以下の特性を有することがわかっている ： Ａ、　刺激多形核白血球（ＰＭＮ）により合成される酸性の両親和性リピドある いはリピド状化合物である； Ｂ、　約３４０ダルトンの分子量を有する；Ｃ１水酸化ナトリウム、水酸化アン モニウムのような、よく知られた塩基で処理した後でもその活性を保持する；Ｄ 、メバロン酸合成の生合成産物から誘導されるようであり、おそらく構造中にイ ソプレノイドを有する。 本発明のＣＲ３モジュレータもまたその活性構造が明瞭である。このＣＲ３モジ ュレータは以下の活性を示す： Ａ、　ＣＤ１８に直接に結合する； Ｂ、　ＣＤ１８の付着促進活性を活性化する；Ｃ，Ｃ３ｂ１に対する結合部位で ＣＲ３の結合を増大化させる；Ｄ、　内皮細胞、フィブリノーゲン被覆基体及び リピドＩＶａ被覆基体に対するＰＭＮ結合を増大させる； Ｅ、　ＬＦＡ−１に媒介される白血球付着を増大させる；Ｆ、　ＰＭＡなどのア クチベータにより既に活性化されていたＰＭＮを再活性化させることができる； Ｇ、　その活性は投与量に依存する。 このＣＲ３モジュレータは有しているこれらの活性のほか、有していないように 見える活性によっても特徴ずけられる。特に、このＣＲ３モジュレータは、全血 液による腫瘍憤死因子（ＴＮＦ）の産生を誘うものでなく、同様に活性時にＰＭ Ｎの脱顆粒化の原因とならない。かくして後者の特性により、ＣＲ３モジュレー タはＰＭＮの一般的な作用物質としての作用をするようにはみえず、むしろＣＲ ３に対する特異活性を有するようにみえるのである。 既に述べたように、ＣＲ３モジュレータはＰＭＮからの回収及び精製により調製 される。ＰＭＮあるいはその活性フラグメンには、回収を行なうためよく知られ ている単離法を適用してもよい。あるいはＣＲ３モジュレータは化学反応剤及び 出発物質から工業的に合成することができ、本発明はこの合成法も含む。 既に述べたように、ＣＲ３モジュレータ、その同類、結合相手その他のＣＲ３モ ジュレータの模倣あるいは拮抗作用を示す物質は適当な担体と共に薬剤組成物と して調製することができる。このような薬剤組成物は、白血球がかわる免疫不全 などの組織感染その他の病理障害を有する患者に、種々の方法で、有効量を投与 することができる。種々の投与形態を利用することができ、これには軟こうある いは局部的投与法、例えば外科スポンジ、包装、ガーゼパッド等が含まれる。ま たこの組成物は非経口的投与、例えば皮下注射、静脈注射、腹腔内注射をするこ とができ、この際には、創傷域の洗浄のための洗浄液の供給、カテーテル挿入等 を伴ってもよい。ＣＲ３モジュレータの平均量は変動してよく、資格のある医者 あるいは獣医の処方に基ずくべきである。 本発明治療方法を実施するために有用な、代表的な治療組成物は、混合した形で 、治療学的に受け入れられる賦形剤（担体）、及び活性成分として一種又は数種 のＣＲ３モジュレータ／モジュレータ合成プロモータ拮抗物質、あるいはその同 類を含む。 好ましい治療組成物は更に有効量のＣＲ３モジュレータ／モジュレータ合成プロ モータ拮抗物質あるいはその同類と共に、拮抗物質、ステロイドの一種あるいは 複数種を含む。例示的な組成は以下の通りである。：セフォタキシリ　２５０． ０ ＣＲ３モジユレータ拮抗物質　１０．０デキストローズ（アメリカ薬局方）　４ ５．０ジスルフイドナトリウム（アメリカ薬局方）３．２エデト酸ジナトリウム （アメリカ薬局方）０．１注射用水　１．　０ｍｌ アンピシリン　２５０．０ ＣＲ３モジユレータ拮抗物質　１０．０ナトリウムジスルフイド（アメリカ薬局 方）３．２エデト酸ジナトリウム（アメリカ薬局方）０．１注射用水　１．０ｍ ｌ 静脈組成■ ゲンタマイシン（硫酸塩として装入）　４０．０ＣＲ３モジユレータ拮抗物質　 １０．０ナトリウムジスルフイド（アメリカ薬局方）３．２エデト酸ジナトリウ ム（アメリカ薬局方）　０゜１注射用水　１、Ｑｍｌ ＣＲ３モジュレータ拮抗物質　１０．０デキストローズ（アメリカ薬局方）　４ ５．０ナトリウムジスルフイド（アメリカ薬局方）３．２エデト酸ジナトリウム （アメリカ薬局方）０．１注射用水　１．　０ｍ１ ＣＲ３モジユレータ拮抗物質　１０．０ナトリウムジスルフイド（アメリカ薬局 方）３．２エデト酸ジナトリウム（アメリカ薬局方）０．１注射用水　１．　０ ｍｌ 対応する治療法も考えられており、従って本発明は、敗血症その他の非感染性外 傷時に白血球が肺その他の器官へ流入することを抑制する方法にも及び、この方 法は、治療量のＣＲ３モジュレータの拮抗物質、特にその薬剤組成物をそのよう な治療が必要な患者に投与することからなる。 本発明の治療法により治療される炎症は、グラム陽性及びグラム陰性菌、ビール ス、寄生虫及び菌類を含む感染性物質、あるいは外傷などの非感染性疾患）ら生 ずるものを含む。特に標的とする感染は、ベータラクタム抗性物質の治療を受け やすい感染源であって、例えばベモフィリス　インフルエンザＢＩＮ、メニンギ ティディスｂ：肺炎球菌、ストレプトコッカス　ニューモニア；大腸菌；表皮ブ ドウ球菌；黄色ブドウ球菌；Ｂ群連鎖球菌；サルモネラ菌；バチルスサブチリス ；緑膿菌；などが挙げられる。 本発明治療方法の標的である炎症器官もまた、上記物質により炎症を起しやすい 、どの身体器官であってもよい。しかし本発明は、肺、中央神経系、腎臓、関節 、心内膜、眼及び耳の治療に特に適しており、なかでも肺の治療は特に有効であ る。 本発明の治療方法は、敗血症に侵された哺乳動物の肺に白血球が進入することを 防止するために有効である。このような活性のためには投与法を静脈下とするこ とが好ましく、このような投与の場合、肺炎球菌、ヘモフィリス　インフルエン ザＢ、Ｎ、　メニンギティデスｂ、大腸菌、Ｂ群連鎖球菌、黄色ブドウ球菌及び 緑膿菌から生じる感染症に特に有効である。 同様に、本発明は感染以外の原因、例えば発作、心臓発作その他の虚血障害、や けど、外科手術、毒物、骨の破砕、その他の外傷による炎症にも適用できるＣＲ ３モジュレータ合成プロモータは、これに限定されるものではないが、ＰＭＮの レセプタと作用物質との相互反応を遮断あるいは拮抗作用をする物質、ＣＲ３モ ジュレータ合成を開始させる細胞内信号の産生を遮断あるいは拮抗作用をする物 質、ＣＲ３モジュレータを合成する酵素を遮断あるいは拮抗作用をする物質、Ｃ Ｒ３モジュレータの代謝プリカーサの役をする分子の産生を遮断あるいは拮抗作 用する物質、を含む。 本発明の別の方法は、抗感染物質の投与に関係する内毒素ショックあるいは成人 呼吸困難症の場合に、肺に白血球が流入することを減少あるいは除去するもので ある。この方法は、ＣＲ３モジュレータ及び／あるいはＰＭＮによりその合成を 促進する物質、あるいはその同等物の拮抗物質である抗感染物質の治療量の投与 前、投与中、あるいはその後に、そのような治療が必要な患者に投与することか らなる。その治療活性の機構のため抗感染性物質、特にベータラクタム抗体は、 その治療効果の結果として新たな炎症の原因となる。このような抗感染性物質は 、所定の感染を消すけれども、毒性産物、例えば感染物質の細胞壁及び／あるい は内毒素を解放する。このような細胞成分は、しばしば肺に急激にあられれる炎 症レスポンスを開始する。この炎症が多くの感染の長期的な肺損傷の主要な理由 である。 炎症性疾患、特に内毒素ショック及び成人呼吸困難症における炎症を減少あるい は除去することは、通常このような病的状態を伴う器官損傷を縮少する。ＣＲ３ モジュレータの拮抗物質は、ＣＤ１８の活性を抑制することにより白血球の肺そ の他の器官への移動を遮断する特異な能力をもっているため、非感染性疾患及び 感染性疾患を治療するために、特に適している。 原因となる感染性物質はへモフイリス　インフルエンザＢ、Ｎ、　メニンギティ デスｂ、大腸菌、ブドウ球菌、ストレプトコッカス　ニューモニアなどの肺炎球 菌、などである。このような感染源は、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド 、あるいはペニシリン、セファロスポリンなどのベータラクタム抗生物質である 。このような感染治療に使用されるアミノグリコシド、ペニシリン、セファロス ポリンの典型的な例としては、セファロチン、セファロリジン、カルベニシリン 、アミピシリン、カフシリンナトリウム。クロキサシリン、ジクロキサシリン、 オキサシリン、メチシリンナトリウム、フユノキシメチル　ペニシリン、プロ力 イン　ペニシリンＧ、ベンザチン　ペニシリンＧ、ペニシリンＧ、セフアセドリ ルナトリウム、ペニシリンＶ、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロルアンフェ ニコール、セフォタキシム、セフトリアキシオン、バンコマイシン、及びイミペ ネムがある。 ＣＲ３モジュレータ／ＣＲ３モジュレータ合成のプロモーターに対する拮抗物質 は感染症において抗感染薬の投与によって引き起こされる白血球の肺および他の 臓器への流入を減少させまたは除去する能力を有するため、ＣＲ３モジュレータ ／ＣＲ３モジュレータ合成のプロモーターに対する拮抗物質は投与の便宜上抗感 染薬と個別の単位投与形態に組合せることができる。はとんどの抗感染薬、特に β−ラクタム抗生物質は静脈内経路で投与するのに好適な化学的形態で入手する ことができるので、このような投与形態は、最も好ましくは静脈内投与形態であ る。これも、本発明の拮抗物質の好ましい投与形態である。典型的には、抗感染 薬と拮抗物質とを組合せて、個別のアンプル溶液にすることができる。これがで きないときには、抗感染薬と拮抗物質と個別に包装し、注射の直前に混合するこ とができる。同様に、任意の標準的静脈内溶液、すなわち規定溶液との混合物に より投与することもできる。 投与形態での抗感染薬の量は、利用される特定の抗感染薬および治療を行う特定 の感染症によって変化する。投与形態で利用される拮抗物質の量は、約１〜約１ ，０００ｍｇの範囲とすることができるが、投与単位当たり１０〜１００ｍｇが 特に好ましい。投与は一日１〜４回行ない、感染症が残っているかぎり治療を継 続することができる。 投与単位を投与法は、患者の症状および治療を行う感染性疾患の重篤度によって 治療を行う医師が変えることができるのは当然である。 前記のように、本発明は、能動感染が任意の身体の部位にある感染症疾患を含む 各種の炎症性疾患状態、例えば髄膜炎の場合における治療に適用できる。離れて いる身体の部位における一次感染に対して二次的である抗原の付着部位に起こる ことがある二次感染のような症状も含まね、具体的症状の例には、急性または慢 性の髄膜炎、脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、大腸炎、例えば炎症性腸疾患／クロー ン病、および皮膚炎、例えば乾癖も挙げられる。敗血症に伴う成人性呼吸困難症 候群のような感染の際の白血球の運動の変化によって生じる炎症も挙げられる。 他の炎症性疾患状態は、Ｔ細胞および／またはマクロファージの付着／認識を伴 なう免疫疾患、例えば急性および遅延性過感作、対宿主性移植片病；悪性貧血の ような一次自動免疫症状、および■型糖尿病のような感染症関連自動免疫症□状 、および多発性硬化症のような白血球漏出のような疾患に対するリウマチ性関節 炎の際のフレア；前記のようなある種の二次感染状態を含む抗原−抗体複合体に よって媒介される疾患；および移植拒絶反応から生じる。成人性呼吸困難症候群 および再潅流の外傷のような毒性ショックまたは損傷による炎症、および白血球 悪液質および転移のような腫瘍性症状による炎症も同様に本発明の範囲内に含ま れる。 ＣＲ３モジュレータへの拮抗物質の投与に基づく治療法の外に、本発明はＣＲ３ モジュレータの合成を遮断することにより治療目的を達成することにも拡張され る。したがって、本明細書で前記したように、本発明の方法は、拮抗物質、抗体 、またはＣＲ３モジュレータ合成プロモーターの作用を遮断することができる他 の薬剤を投与することを特徴とするものである。ＣＲ３モジュレータ合成プロモ ーターとは、作用物質とＰＭＮ上のレセプタとの相互作用を遮断または拮抗する 薬剤、ＣＲ３モジュレータ合成を開始する細胞内シグナルの産生を遮断または拮 抗する薬剤、ＣＭＦモジュレータを合成する酵素を遮断または拮抗する薬剤、お よびＣＲ３モジュレータの代謝前駆体として働く分子の産生を遮断または拮抗す る薬剤を包含することを意味するが、これらに限定されるものではない。ＣＲ３ モジュレータの合成を促進する代表的薬剤には、フォルボールミリステートアセ テート（ＰＭＡ）　、血小板活性化因子（ＰＡＦ）　、腫瘍情死因子（ＴＮＦ） 、ホルミル−ＮｏｒＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｆＮＬＬＰ）、インターロイキ ン−８（ＩＬ−８）およびＣ５ａが挙げられる。代表的な細胞内シグナル発生剤 は、タンパク質キナージＣ，ｃＧＭＰ、Ｇ−タンパク質および混合物から選択さ れる。ＣＲ３モジュレータ合成のプロモーターに好適な拮抗物質／抗体は、適当 なアッセイによって決定することができ、この方法の実施には、許容可能な治療 プロトコールによって配合し、投与することができる適当な拮抗物質または抗体 を決定および／または開発することがある。 本発明は、本発明のＣＲ３モジュレータによって影響される活性を引き出す能力 を参照することによって侵襲性刺激の存在を検出する方法のような各種の診断用 途にも関する。前記のように、ＣＲ３モジュレータは、様々な既知の手法により パートナ−をそれ自体に結合するのに用いることができ、このような結合パート ナ−を疑わしい哺乳類宿主におけるＣＲ３モジュレータの存在についての試験に 用いることもできる。 哺乳類におけるＣＲ３モジュレータ活性の存在は、このような測定法に応用可能 な通常の免疫学的処理法によって確かめることができる。多数の有用な処理法が 知られている。特に有用な３種類の処理法では、ＣＲ３モジュレータまたはその 拮抗物質または検出可能な標識（ラベル）を付けた他の結合性パートナ−が用い られる。これらの処理法を下記の式に纏めることができるが、星印は粒子が標識 されていることを表わし、「Ｍｏｄ」はＣＲ３モジュレータを表わし、ｒＡｎｔ ＪはＣＲ３モジュレータに対する結合性パートナ−を表わす。 Ａ、Ｍｏｄ”　＋Ａｎｔ＝Ｍｏｄ”　ＡｎｔＢ、Ｍｏｄ＋Ａｎｔ”＝ＭｏｄＡｎ ｔ”処理法およびその応用は、総て当業者には周知のことであるので、本発明の 範囲内で用いることができる。「競争的」処理法である処理法Ａは、米国特許第 ３．６５４．０９０号明細書及び第３，８５０．７５２号明細書に記載されてい る。処理法Ｃの「サンドイッチ」処理法は、米国特許第ＲＥ３１，００６号明細 書および第４．０１６．０４３号明細書に記載されている。「二重抗体」または ｒＤＡＳＰＪ処理法のような更に他の処理法も知られている。 それぞれの場合に、ＣＲ３モジュレータは結合性パートナ−と複合体を形成し、 この複合体の一員を検出可能な標識で標識するのである。複合体が形成されたと いう事実および所望ならばその量は、標識を検出に応用することができる既知の 方法によって決定することができる。 これらの検討に最も普通に用いられる標識は、紫外光線に暴露されると螢光を発 する放射性元素、酵素、化合物などである。 多数の螢光材料が知られており、標識として用いることができる。これらには、 例えばフルオレセイン、ローダミンおよびオーラミンが挙げられる。特別な検出 材料はヤギで調製し、イソチオシアネートを介してフルオレセインと抱合した抗 ウサギ抗体である。 ＣＲ３モジュレータまたは（複数の）その結合性パートナ−は、放射性元素また は酵素で標識することもできる。放射性標識は、任意の市販の計数装置で検出す ることができる。好ましい同位体は、＋４（１３１（１１２９１および３５Ｓか ら選択することができる。 酵素標識も同様に用いることができ、現在用いられている比色法、分光光度法、 螢光分光光度法またはガス定量法のいずれでも検出することができる。酵素を、 カルボシールイミド、シールイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのような 橋梁形成分子と反応させることによって選択された粒子に抱合させる。この処理 法に用いることができる多くの酵素は既知のものであり、用いることができる。 好ましいものは、ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシ ダーゼ、β−り、ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペ ルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。 米国特許第３，６５４．０９０号明細書、第３８５０．７５２号明細書および第 ４．０１６．０４３号明細書が、別の標識材料および方法の開示の方法として参 照される。 本発明にしたがって開発さね、利用されている特定のアッセイ系は、レセプタア ッセイとして知られている。レセプタアッセイでは、分析を行う材料を適当に標 識して、次に所定の細胞試験コロニーに標識したおよび未標識の材料の一定量を 接種した後、結合性の検討を行い標識した材料が細胞レセプタに結合する程度を 決定する。この方法では、材料間の親和性の差を確定することができる。 したがって、ＣＲ３モジュレータの精製量を放射能標識して、例えばＰＭＮと結 合させた後、例えばＣ３ｊをコーティングした赤血球を用いて結合性を検討する ことができる。次に、様々な量の標識したおよび未標識のＣＲ３モジュレータを 含む溶液を調製して、細胞試料を接種した後インキュベーションを行なうのであ る。次いて、生成する細胞単層を洗浄し、可溶化した後、標準誤差を〈５％とす るのに十分な時間ガンマ−カウンターで計数する。次に、これらのデーターをス キャッチャード分析に付した後、材料の活性に関する観察および結論を引き出す ことができる。前記の記載内容は例示のためのものであるが、分析を行う材料の 細胞結合力が顕著な特徴として働く場合には、レセプタアッセイを行ない、利用 することができる方法を示している。 本発明の別の態様では、医師が用いるのに好適な商業的な試験キットを調製して 、感染が疑われる哺乳類宿主におけるＣＲ３の有無を決定することができる。前 記の試験法によれば、このようなキットの一種類は、少なくとも標識したＣＲ３ モジュレータまたはその結合性パートナ−１例えばそれに特異的な拮抗物質、お よび、勿論のことであるが、例えば「競争的」、「サンドイッチ」　「ＤＡＳＰ 」などの選択される方法によって変わる指示書を含む。このキットは、緩衝液、 安定剤などの周辺の試薬も含むことができる。 したがって、哺乳類宿主の侵襲性刺激に対する反応を説明する試験キットであっ て、 （ａ）　本発明のＣＲ３モジュレータまたはそれに対する特異的結合性パートナ −の検出可能な標識への直接または間接的結合によって得られる少なくとも１種 類の標識した免疫化学的な反応性成分の所定量と、（ｂ）　他の試薬と、 （ｃ）　前記のキットの使用に関する指示書とを含んで成るキットを調製するこ とができる。 更に具体的には、この診断試験キットは、（ａ）　通常は固相に結合してイムノ ソーベントを形成するあるいは好適なタッグに結合した前記のようなＣＲ３モジ ュレータ（または結合性パートナ−）の所定量、または複数の最終生成物など（ またはそれらの結合性パートナ−）をそれぞれ１個、 （ｂ）　必要であれば、他の試薬、および（ｃ）　前記の試薬キットの使用指示 書とを含むことができる。 別の態様では、所定のプロトコール（例えば、「競争的」、「サンドイッチ」、 「二重抗体」など）にしたがって操作する試薬キットであって、（ａ）　ＣＲ３ モジュレータを検出可能な標識にカップリングすることによって得られた標識さ れた成分； （ｂ）　少なくとも１種類の試薬がリガンドまたは固定化リガンドであって、こ のリガンドが （ｉ）　標識された成分（ａ）と結合することができるリガンド、（１１）　標 識された成分（ａ）の結合性パートナ−と結合することができるリガンド、 （ｉｉｉ　）　測定を行う（複数の）成分の少なくとも１個と結合することがで きるリガンド、および （１ｖ）　測定を行う（複数の）成分の少なくとも１個の結合性パートナ−の少 なくとも１個と結合することができるリガンド、から成る群から選択されるもの 、および（ｃ）ＣＲ３モジュレータとその特異結合性パートナ−との間の免疫化 学的反応の１種類以上の成分を検出および／または測定するためのプロトコール の手順についての指示書 とを含んで成る試験キットを調製することができる。 前記の説明によれば、ＣＲ３モジュレータの活性を調整するのに有効な見込みの ある薬剤をスクリーニングするためのアッセイ系を調整することができる。 ＣＲ３モジュレータを見込みのある薬剤の存在下にて好中球とインキュベーショ ンした後、Ｃ３ｂ１でコーティングした赤血球のような細胞試験系に導入して、 次に培養物を検討して好中球の結合活性における変化を観察した。 別の薬剤スクリーニングアッセイでは、見込みのある薬剤の不在下での好中球と ＣＲ３モジュレータとのインキュベーションについて考察した後、インキュベー ションした好中球と試験薬剤を細胞試験系に導入して、生成する結合活性を観察 する。 別法による薬剤アッセイは、レセプタＣＤ１８を有するＰＭＮのような試験細胞 の試料または生成した表面の試料をＣ３ｂ１をコーティングした赤血球を含む培 地で培養することによって行うことができた。試験薬剤を生成する培養物に加え ることができ、次にＣＲ３モジュレータと試験細胞上のレセプタとの反応をＥＣ ３ｂｉのＣＤ１８に対する結合性の関数として測定して、見込みのある薬剤がＣ Ｒ３モジュレータの活性の阻害に何んらかの活性を有するかどうかを測定した。 ＣＲ３モジュレータ活性の拮抗物質を検出する他の方法では、見込みのある薬剤 の存在下にて、ＣＤ１８または精製し表面に結合したＣＤ１８を有する細胞を、 標識したＣＲ３モジュレータと共にインキュベーションする方法を用いることが できる。ＣＲ３モジュレータとＣＤ１８との相互作用を遮断する薬剤の有効性を 、標識したＣＲ３モジュレータの細胞または表面に結合したＣＤ１８への結合の 遮断によって測定する。 ＣＲ３モジュレータ合成プロモーターを遮断または拮抗する薬剤をスクリーニン グするアッセイ系を調製することもできる。このアッセイでは、ＰＭＮを見込み のある薬剤およびＰＭＮの作用物質、例えばＰＭＮ、ＰＡＦ、ＴＮＰ、ｆＮＬＬ Ｐ、ＩＬ−８などと共にインキュベーションする。薬剤の有効性を測定するため に、調製物のＣＲ３モジュレータ含量を前記の方法によって測定することができ る。あるいは、薬剤の有効性は、ＥＣ３ｂｉのＰＭＮへの結合を測定することに よって確定することができる。 ＣＲ３モジュレータ合成プロモーターを遮断または拮抗する薬剤のアッセイは、 試験薬剤がこの薬剤で処理し作用物質で刺激した細胞中にＣＲ３モジュレータの 前躯体の蓄積を防止する能力を測定することによって行うこともできた。 ＣＲ３モジュレータ合成プロモーターを遮断または拮抗する薬剤のアッセイは、 ＣＲ３モジュレータの前駆体のＣＲ３モジュレータへの転換を測定することによ って行うこともできる。適当に標識したＣＲ３モジュレータの前駆体を、見込み のある薬剤の存在下にて活性化したＰＭＮまたは活性化した細胞の抽出物に加え る。次に、ＣＲ３モジュレータ中の標識の存在を前記のアッセイによりまたは適 当なりロマトグラフィ系での標識の移動を測定することによって測定する。 このアッセイ系は、ＣＲ３モジュレータを合成する酵素の作用を遮断する薬剤を 見出す上で特に有用であり、本発明の特に有用な態様である。 下記の実施例に、本発明のＣＲ３モジュレータの単離および同定の詳細、および 本発明のＣＲ３モジュレータと本出願人および他の当業者とによって以前に同定 された因子との間の活性の差異および類似点を確定する本発明のＣＲ３の活性に ついて得られた情報を記載する。これ以後に記載する具体的な材料および手法は 単なる例示のためのものであり、変更することができるので、下記の実施例は本 発明の説明のために示すのであり、制限のためのものではないことは当然である 。 実施例Ｉ ＣＭＦ−１の単離 静止しているまたは刺激されたＰＭＮのペレットを、クロロホルム；メタノール ：水＝１０：１０：１中で、少なくとも溶媒を３回取替え、少なくとも３６時間 撹拌した（第１図参照）。上澄液を真空下にて乾燥し、クロロホルム：メタノー ル・水＝３０：６０：８に再懸濁した。抽出した脂質の溶液をＤＥＡＥ−セファ デックスカラムに適用し、カラムを６ベツド容量の溶媒で洗浄し、アニオン性脂 質を０．０６５Ｍ酢酸ナトリウムを含む同じ溶媒で溶出した。溶出液を真空下に て乾燥し、蒸溜水に再懸濁した。塩をＣ，、Ｓ　ｅ　ｐ−Ｐ　ａ　ｋ逆相カート リッジ上を通過させて除去した後、水で十分に洗浄した。脂質を、クロロホルム ：メタノール＝１：１でカートリッジ空溶出させ、乾燥して、クロロホルム：メ タノール＝２・１中に保存した。特に断らないかぎり、この材料を用いて次の官 能性の検討を行った。この部分的に精製したＣＭＦ−１溶液は、薄層クロマトグ ラフィ（データーは示していない）によって測定したところ、多くの他の酸性脂 質、主にガングリオシドを含んでいた。フォルチ分配法によって更に精製を行う ことができる。簡単には、脂質抽出物を乾燥し、クロロホルム／メタノール＝２ ／１および食塩水の２相系に再懸濁した。水性相にはＣＭＦ−１活性が含まね、 残りの非酸性混入物は有機相に局在し、除去した。精製度の定量において、ＣＭ Ｆ−１活性の０．１％未満がＤＥＡＥおよび５ｅｐ−Ｐａｋカラムからの流出物 中に見出だされている。しかしながら、ＣＭＦ−１活性の５０％までは、フオル チ分配法で失われる。活性は有機相て再生しないので、この処理法によりＣＭＦ −１活性か破壊され、したがって通常はＣＭＦ−１の単離からは除外されるもの と思われる。 精製の次の段階では、半調製用Ｖｅｒｓａ−ＰａｋＣ，，逆相カラムを用いて、 水からアセトニトリルへの１％／分でのグラディエンドで溶出する。ＣＭＦ−１ は、このカラム上で５０〜５５％アセトニトリルで溶出する（第２図参照）。 紫外部分光光度法（下記の第１４図参照）およびサイズ排除クロマトグラフィ（ 下記の第１４図参照）によって測定される材料の純度と組合せた逆相クロマトグ ラフィによって得られる微妙な区別から、この精製法によりＣＭＦ−１が単一体 として単離されることを示唆している。 実施例２ ＣＭＦ−１の生物学的特性 ＣＭＦ−１は、ＰＭＡによって刺激されたＰＭＮから抽出され静止しているＰＭ Ｎ上でＣＲ３の結合活性を増加することができる物質として最初に認識された。 ＣＭＦ−１活性は、新たに単離されたＰＭＮをＣＭＦ−１を含む抽出物と共に１ ５分間インキュベーションした後、Ｃ３ｂ１をコーティングした赤血球（ＥＣ３ ｂｉ）に結合するＰＭＮの能力を測定することによって検出する。 活性の単位は、ロゼツト形成分析において１、・２Ｘ１０’のＰＭＮを最大値の 半分活性化するのに要するＣＭＦ−１の量として定義される。１０７のＰＭＮは 、典型的なＣＭＦ−１抽出における活性の３〜１０単位を生じる。これは、８〜 ２５のＰＭＮが１ナノリツトルの容量の単一細胞を最大値の半分活性化すること ができることを意味している。ＣＭＦ−１は、付着指数を背景濃度の２〜１０倍 に増加することができる（第３図参照）。これとは対照的に、静止しているＰＭ Ｎから抽出された脂質はＣＭＦ−１活性がない。０Ｍ２、ＧＤｌａおよびＧＴｌ ｂのようなＣＭＦ−１と同時に精製されるガングリオシドは、結合には全く効果 がない。 ＣＭＦ−１を添加した後に見られる結合の増加は、Ｃ３ｂ１　（ＭＡｂＣ３９） 、ＣＲ３α鎖（ｍＡｂＯＫＭｌｏ）またはＣＲ３β鎖（ｍＡｂｌＢ４）に対する 抗体によって遮断することができるので、ＣＭＦ−１はＣＲ３のＣ３ｂ１への結 合についての特異的な効果によってロゼツト形成を増加する（第１表）。ＣＲ３ のα鎖に対する非遮断性抗体であるＯＫＭＩのような関連性のない抗体は、ＥＣ ３ｂｉロゼツト形成に全く効果がない。 Ｃ，ＣＭＦ−１はＣＲ３の結合活性を一時的に増加する。 ロゼツト形成分析において静止しているＰＭＮに加えたＣＭＦ−１は、ＰＭＡの ような作用物質と同様な時間経過でＥＣ３ｂ　ｉへのＣＲ３の結合を誘導する（ 第２表）。ＣＭＦ−１は、２０分までにロゼツト形成を最大濃度まで増加する。 次いで、ロゼツト形成は６０〜８０分までにベースライン濃度まで戻る。静止し ているＰＭＮからの脂質抽出物は、時間については全く効果がない（付着指数く ５５）。ＩｇＧ粒子でコーティングしたＥ（Ｅ１ｇＧ１第４図参照、白抜き三角 形）のロゼツト形成によって測定したところ、静止している細胞からのＣＭＦ− １も脂質もＰＭＮ上の離れたレセプタ、ＦｃγＲ１１ｌの結合活性につ１．）て は全く影響しない。 Ｄ、ＣＭＦ−１の効果は、投与量依存性である。 ＣＭＦ−１のＣＲ３結合についての効果（第４図、黒四角形）は、投与量によっ て変化する。未処理ＰＭＮからの脂質（黒三角形）は、あからさまに希釈したと きでも（１／１２）　、ＣＲ３結合活性に全く影響しない。ＥＩｇＧロゼ・ソト 形成（白抜き三角形）は、ＣＭＦ−１によって影響されなかった。このＣＭＦ　 −１調製物に対して、１単位は抽出物の１／３６０の希釈物に対応する。 これは１０７個の細胞が３単位を生じることを意味している。 Ｅ、　ＣＭＦ−１産生はＣＲ３結合活性と相関している。 ＣＭＦ−１はＣＲ３の結合活性を活性化することができるので、ＣＭＦ−１濃度 の変化が通常はＣＲ３活性を制御するものと考えた。この仮定を、静止している または刺激された細胞から得ることができるＣＭＦ−１の量を測定することによ って試験した。静止している細胞のＣＲ３活性は極めて低く、ＣＭＦ−１は抽出 されなかった（第３表）。ＰＭＡで２０分間刺激した後、ＣＲ３活性は最大とな り、多量のＣＭＦ−１を細胞から得ることができた。全部で９０分間ＰＭＡで更 にインキュベーションすると、ＣＲ３活性はベースラインにまで減少し、ＣＭＦ は細胞から抽出することができなかった。 これまでに試験した総てのＰＭＮ作用物質は、ピークＣＲ３結合活性と一致する 時点でＰＭＮによるＣＭＦ−１の産生を誘発する。ＰＭＮにおけるＣＲ３活性を 増加する作用物質で、ＣＭＦ−１の産生を誘導できないものは、見出だされてい ない。したがって、ＣＭＦ−１含量はＣＲ３の活性と緊密に相関している。 Ｆ、　ＣＭＦ−１はＰＭＡまたはＰＡＦとは同等ではない。 これまでのデーターは、脂質である抽出されたＰＭＮを活性化するのに用いられ るＰＭＡが部分的に精製された脂質抽出物中の混入物であることができ、ＣＭＦ −１活性に関与しているという可能性と矛盾しない。幾つかの証拠は、これが当 て嵌まらないことを示している。３Ｈ−ＰＭＡで処理した細胞からの抽出物は、 ＣＭＦ−１活性と共に溶出するカウント数が少なすぎ、活性をＰＭＡによるもの とすることができなかった。ＰＭＡは水中での加水分解を受け易く、抽出物は精 製の際には最低１２時間は水性溶液である。最後に、最も有力なものは、ＣＲ３ を活性化する様々な異なる作用物質でＰＭＮを処理すると、脂質もタンパク質も 総てＣＭＦ−１を産生ずることである。ＣＭＦ−１は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、 ５Ｘ１０８ｕ／ｍｌ、１５′）、血小板活性化因子（ＰＡＦ、１１００ｎ。 １５′）およびホルミル−ｎｏｒＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｆＮＬＬＰ、５Ｘ １０−８．５〜１５’　）で刺激されたＰＭＮにより並びにＰＭＡ　（３０ｎｇ ／ｍ＋、２０′）で刺激されたＰＭＨによって産生される。タンパク質の元の配 座は、有機溶媒に暴露することによって完全に破壊することができる。例えば、 腫瘍壊死因子はクロロホルム／メタノールで抽出した後にその活性な配座を保持 することができず、したがって抽出物中でＣＲ３の調整活性に関与する混入物で はないと思われる。 血小板活性化因子（ＰＡＦ）またはＬ−α−ホスファチジルコリン、β−アセチ ル−γ−−〇−アルキルは、作用物質に応答してＰＭＮによって産生される脂質 であり（Ｍ、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９８８年に概説）、これはＣＲ３結合 活性を増加することができる。したがって、ＰＡＦは、ＣＭＦ−１活性を説明す ることができる脂質抽出物中のもう一方の可能性のある混入物である。 ＣＭＦ−１がＰＡＦと同等であるということを除外するため、拮抗物質ＷＥＢ２ ０８６をＥＣ３ｂｉの１１００ｎのＰＡＦによって誘導されるロゼツト形成を完 全に遮断する濃度で加えた。この拮抗物質はＣＭＦ−１によって誘導されるロゼ ツト形成に全く影響しない（第４表）。 Ｇ、　ＣＭＦ−１は、全血によるＴＮＦ産生を誘導しない。 ＬＰＳとは異なり、ＣＭＦ−１（４２単位／ｍｌ）は全血中でＴＮＦ産生を起こ さず、ＣＭＦ−１活性はＬ　Ｐ　Ｓの混入によるものではないことを示唆してい る（第５図）。全血をＬＰＳ、ＣＭＦ−１または両方と共に３７℃で５時間イン キュベーションした。菌体を遠心分離により除去し、上澄液を分泌されたＴＮＦ についてラジオイムノアッセイによって試験した。それぞれのデータ一点は、６ 個のウェルの平均に対応している。これらのデーターは、ＣＭＦはＴＮＦ分泌を 開始しないことを示しており、ＣＭＦ−１にはＬＰＳが混入しないことが明らか ＣＲ３はＣ３ｂ１の外に各種のリガンドに結合するので、ＣＭＦ−１がこれらの リガンドの結合にも同様に影響することができるかどうかを試験した。脂質ＩＶ ａを血漿膜の表面葉状部（ＥＩＶａ）に取り込んだ赤血球の付着を測定すること によって、リポ多糖（Ｌ　Ｐ　Ｓ）の結合を観察した。脂質ＩＶａはＬＰＳの代 謝前躯体てあり、ＣＲ３によって認識される（８）。ＣＭＦ−１がＣ３ｂ１およ びＩＶａの結合における配位の増加を起こすことを見出した。（第５表）。 ＣＲ３のフィブリノーゲンへの結合は、フィブリノーゲンをコーティングした表 面へのＰＭＮの付着を検討することによって測定することができる。ＣＭＦ−１ は、フィブリノーゲンをコーティングしたプラスチック表面へのＰＭＮの結合を 増加させる（第６表）。ＣＤ１８はＣＲ３のβ鎖に対する抗体によって遮断され るがＭＨＣクラス■に対する関連のない抗体によって遮断されないので、結合は ＣＤ１８によって変化する。示された値は２個のウェルの平均値である。 ＣＭＦ−１に応答するＦＭＮによるフィブリノーゲンの結合の時間経過（４２単 位／ｍｌ）は、ＰＭＡに応答するものと同様である（第６図）。結合は１５分ま で増加した後、減少する。未処理のＰＭＮは、フィブリノーゲンにほとんど結合 しない。静ｌルているＰＭＮから抽出した脂質（１０７個の細胞からの抽出物の １　／　３６希釈物）は、フィブリノーゲンへの結合を増加しなかった（１ｍｍ ２当たりの４６±２０個の結合した細胞）。示した値は、２回の実験でそれぞれ ２個のウェルでの平均値である。 ＰＭＮは、ＣＲ３およびＬＦＡ−１を介して刺激されていない内皮細胞（ＥＣ） に結合する（Ｓ、に、Ｌｏら、１９８８年）。内皮細胞上でのＣＲ３に対するリ ガンドは未だ特性決定されていないが、ＰＭＮ状で発現したもう一方のインテグ リンで有りＣＲ３と同しβ鎖を共有するＬＦＡ−１はＥＣ状でＩＣＡＭ−１に結 合する。刺激されたＰＭＮと未刺激ＥＣとの間の結合相互作用も制御されたやり 方で起こり、ＰＭＮをホルボールエステルで処理した後一時的に増加して２０分 てピークに達し、６０分までにベースラインに戻る（Ｓ、Ｘ、Ｌｏら、１９８９ 年）。本出願人らは、ＰＭＮをＣＭＮ−１で処理した後、それらを未刺激のＥＣ 単層に加えた。ＣＭＦ−１は、投与量によって変化するやり方で、ＥＣに対する ＰＭＮの結合を増加した（第７図）。結合濃度は１５分でピークに達し、４５分 までにベースラインまで減少した（第８図）。最終的に、この結合を遮断する抗 体の能力は、細胞をホルボールエステルで処理したときに見られる能力と同一で あった（第９図）。ＣＲ３とＬＦＡ−１（ＩＢ４）との共通のβ鎖に対する抗体 は完全に遮断するが、ＬＦＡ−１α鎖（ＴＳＩ／２２）またはＣＲ３α鎖（ＯＫ Ｍｌｏ）またはＩＣＡＭ−１，（ＬＢ２）に対する抗体は、約５０％だけ結合を 遮断する。これらの２種類の抗−α鎖抗体を一緒に添加すると、結合を完全に遮 断することができるが、ＰＭＮ状でのＭＨＣクラスＩ（Ｗ６３２）またはＦｃγ ＲＩ　Ｉ　Ｉ　（３Ｇ８）に対する抗体はＥＣに対する結合に全く影響しない。 これらの結果は、ＣＲ３に緊密に関連したもう一方のインテグリンであるＬＦＡ −１はＣＭＦ−１によって制御することができることを示唆している。それらは 、ＣＭＦ−１がＰＭＮと内皮との相互作用を制御することも示している。 ＣＭＦ−１は、細胞中で一連の自消を誘発することによってそれ自身作用物質と して作用することができる。あるいは、これはもっばらＣＲ３の濃度で作用して 、恐らくはレセプタ自身への結合およびそのリガンドに対する結合親和性の変更 を行なうことができる。これらの可能性を説明するため、本出願人らは、ＣＭＦ −１がＣＲ３に関連のない細胞応答の誘発において作用物質のように作用するか どうかを検討した。ＰＭＮの作用物質に対する一つの共通の応答は特異的顆粒の 放出である。ロゼツト形成分析によるＣＭＦ−１活性を含むＰＭＡまたはＴＮＦ で処理したＰＭＮからの脂質抽出物を加えても、脱顆粒反応の際の細胞内プール からのＣＲ３の放出の尺度であるＣＲ３発現の濃度は変化しなかった（第１０図 ）。対照的に、ＰＭＡ自身は１５分後には約３倍までＣＲ３発現を増加した。コ ントロールとしてはＣＭＦ−１活性を持たない細胞（すなわち、静止しているＰ ＭＮまたはＰＭＡで６０分間処理したＰＭＮ）から抽出した脂質もＣＲ３の発現 を変化させなかった。 Ｋ、　ＰＭＡて活性化したＣＲ３はＣＭＦ−１で再刺激することができる。 ＰＭＡはＰＭＮ中のタンパク質キナーゼＣを活性化し、細胞内シグナル発生系を 枯渇させ、６０分後にはＰＭＡによる再刺激に対して細胞が免疫になる（ＡＨＶ およびＳＤＷ、未発表実験結果）。本出願人らは、ＣＭＦ−１がＰＭＡで処理し た細胞を再刺激することができるかどうかを検討した。ＣＭＦ−１がレセプタの 濃度で作用する場合には、外因性ＣＭＦ−１は上流シグナルに最早応答すること ができない細胞中でも同様に働くべきである。実際、ＰＭＮ　（３０ｎｇ／ｍｌ ）で６０分間処理した後ＣＭＦ−１（４２ｕ／ｍｌ）で処理し、次にＥＣ３ｂｉ に対するロゼツト形成について試験した細胞は、ＣＭＦ−１単独に暴露した細胞 よりも良好でない場合にも同様に良好に応答する（第１１図）。ＣＭＦ−１で処 理した細胞も、ＣＭＦ−１で同様に再刺激することができる。 Ｌ、　ＣＭＦ−１活性はＣＤ１８で免疫沈澱させることができる。 ＣＭＦ−１の作用の様式は、それとＣＲ３レセプタとの間で直接開口しているこ とを示唆している。この仮定を試験するため、ＰＭＡで刺激したＰＭＮを洗剤オ クチルグルコシドの臨界ミセル濃度でリーシスして、細胞表面上でＣＲ３を取り 巻（元の脂質の崩壊を最小限にし、溶解物ＣＲ３のβ鎖（ＣＤ１８）に対するセ ファロース担持抗体を用いて免疫沈澱した。ペレットを十分に洗浄し、クロロホ ルム・メタノール＝２・１て抽出してレセプタと会合したままの脂質を除去した 。次に、この脂質抽出物をＣＭＦ−１活性についてロゼツト形成分析で試験した ところ、実際にＣＭＦ−１を含むことを見出した（第７表）。セファロースビー ズ単独ではＣＭＦ−１活性を協同沈降させることはできなかった。 Ｍ、　活性化したＰＭＮはＣＭＦ−１の有意な量を分泌しない。 ＣＭＦ−１は刺激されたＰＭＮのペレットから抽出することができる。ＣＭＦ− １がこれらの細胞によって分泌されるかどうかを決定するために、刺激された細 胞の媒質を乾燥し、脂質を抽出した後、ＣＭＦ−１活性について試験した。 第１２図に示されるように、細胞上澄液から抽出される単位の数（四角形）は細 胞自身から誘導される数（三角形）より常にずっと少なかった。それ故ＰＭＮは 有意な量のＣＭＦ−１を分泌しない。 Ｎ、ＣＭＦ−１はＬＦＡ−１によって媒介される付着を増加する。 ＣＭＦ−１はＰＭＮと内皮細胞との間の結合を増加し、この結合相互作用はＬＦ Ａ−１並びにＣＲ３に対する抗体によって遮断されるので、本出願人らは、完全 にＬＦＡ−１に依存することが知られている別の制御された付着形に対するＣＭ Ｆ−１の影響を試験した。ヒト末梢血のリンパ球はＰＭＡに応答して集合し、Ｌ ＦＡ−１に対する抗体によって集合を防止することができる（Ｍ、Ｐａｔａｒ　 ｒｏｙｏら、１９８３年；Ｒ，Ｒｏｔｈｌｅｉｎら、１９８６年）　。ＣＭＦ− １を全血から新たに単離したリンパ球に加えると、ＰＭＡによって刺激された集 合に匹敵する程度まで同型集合を生じ、作用物質の効果は抗−ＬＦＡ−１β鎖お よびそのα鎖によって遮断されたが、ＣＲ３α鎖またはＭＨＣクラスＩに対する 抗体によっては遮断されなかった。また、ＣＭＦ−１活性を欠いている未刺激Ｐ ＭＮからの脂質もリンパ球には影響しない。 実施例３ ＣＭＦ−１の物理特性決定 Ａ、　紫外部および可視部分光光変法 純粋なＣＭＦ−１の紫外部および可視部スペクトルを第１４図の左に示す。 溶媒ブランクを右側に示す。 ＣＭＦ−１はλｍａｘが１９６ｎｍであり３００ｎｍまで若干の形を有している 。スペクトルは３００から８００ｎｍの間は平坦であった（データーは示してい ない）。この結果から、ＣＭＦ−１が２１４ｎｍに吸収を有するペプチド結合、 ２６０ｎｍに吸収を有する核酸および３００ｎｍを越える波長に吸収を有する共 役二重結合系を有するという可能性は除外される。 Ｂ、　既知の脂質なＣＭＦ−１は活性を持たない。 ＣＭＦ−１を同定するため、多くの十分に特性決定された脂質をロゼツト形成分 析においてＣＭＦ−１活性について試験した。第８表に試験したものを挙げてい るが、いずれもＥＣ３ｂｉに対するＰＭＮのロゼツト形成を増加することはでき なかった。 Ｃ９ＣＭＦ−１は各種の化学的修飾に耐性を有する。 ＣＭＦ−１と同様な物性を有する化合物のクラスには、グリセロールまたはスフ ィンゴシンを基剤とする脂質、エイコサノイド、他の脂肪酸、イソプレノイド脂 質、および疎水性の尾を有するタンパク質またはペプチドが挙げられる。イソプ レノイド以外は総て、ＣＭＦ−１を特定のクラスを破壊する処理を施すことによ って除外した。この処理の詳細は第９表に概説し、下記および第１５図に纏めて いる。 ＣＭＦ−１は、塩基（３０％水酸化アンモニウムまたはＩＮ　Ｎａ０Ｈ）または 無水酢酸で処理したところ、エステル結合した脂肪酸またはリン酸塩基を含まな いことを示唆していた。ＣＭＦ−１は酢酸を用いるデシアリル化またはニューラ ミニダーゼによって影響されないことから、ＣＭＦ−１活性はガングリオシドに 存在しないことを示唆していた。酸加水分解（２Ｎまたは０．５Ｎメタノール性 ＨＣ１）では活性は破壊されなかったので、ＣＭＦ−１はスフィンゴシンまたは グリセロール主鎖、または活性に必要なグリコシド結合を持たない。ＣＭＦ−１ 活性はホスファターゼまたはプロテアーゼによって影響されないことから、ホス フェート基は活性には本質的ではなく、ＣＭＦ−１はタンパク質構造を持たない ことを示唆している。 また、水素化ホウ素ナトリウムによる還元、過酸加水素による酸似および隣接ヒ ドロキシルの過ヨウ素酸による還元では、総てＣＭＦ−１活性に影響しなかった 。ＣＭＦ−１に対する候補構造の基の範鴫のうち、これらの処理により影響され ないままでいるごく僅かのものはイソプレノイドおよびプロスタグランジンまた は脂肪酸である。脂質の尾を有するプロテアーゼ耐性のペプチドは、ＣＭＦ−１ はペプチド結合の吸収の波長である２１４ｎｍに吸収を持たないので、可能性は 十分ではない。プロスタグランジンおよび脂肪酸は、フオルチ分配で有機相より も水性相にＣＭＦ−１活性が分配することを考慮すると見込みがなく、全社は共 役二重結合系を含むので、分光装置により除外される。この結果、イソプレノイ ド構造がＣＭＦ−１に対する最も見込みのある候補として残る。 ＣＭＦ−１活性を破壊することが見出されている一つの化学的処理は、オソノリ ーシスである（第１０表）。紫外部光源に酸素流を通過させるとオソン（２ｐｐ ｍ）が発生し、ＣＭＦ−１を酢酸エチルに溶解したものに１５分間通気する。こ の処理により、炭素−炭素二重結合を横切って酸素が添加さね、二重結合が開裂 され、２個のアルデヒド分子が形成される。イソプレノイドは二重結合を有する のでＣＭＦ−１のオソンによる開裂はイソプレノイド構造と矛盾しない。 Ｄ、　ＣＭＦ−１の分子量は、約３４０ダルトンである。 サイズ排除クロマトグラフィを用いて、ＣＭＦ−１の分子量を決定した。０〜２ ０００ダルトンの分離範囲を有するＴＳＫＧ２００ＯＨＸＬサイズ排除カラムを 用いた。テトラヒト泊フラン中で等量ずつ操作を行ったところ、分子量標準試料 を分離して、黒三角形で第１６図に示される校正曲線を得た。それぞれの両分に おいてロゼツト誘導活性によって測定したＣＭＦ−１は、６．４および９゜４ｍ １（棒グラフ）で流出した。ＣＭＦ−１活性のピークは、ＵＶスペクトルデータ ーから予測される２５４ｎｍにおける吸収のピークには対応しない。９，４ｍ１ 画分は３４０ダルトン＋／−１６の分子量に対応する。６．４ｍ１画分はカラム の排除容積にあることから、そこに流出するＣＭＦ−１の分子量は〉〉２０００ であることを示唆している。排除容積で溶出する物質を再度処理したところ、Ｃ ＭＦ−１活性を有する２個の分子量種を得た。３４０の分子量画分をホスファチ ジルコリンと混合した後再度処理した場合も、２つの形態のＣＭＦ−１を得た。 前記の結果として、２種類のＣＭＦ−１活性は互いに平衡になっており、それら は相互転換することができ、モノマー性（３４０）またはミセル性（〉〉２００ ０）の形態で流出する同じ分子に対応するからである。 ３４０ダルトンの分子量は明らかにガングリオシド構造（分子量＞ｉｏｏ。 ）並びにグリセロホスファチド（分子量＞５００）を除外するが、これはエイコ サノイドであることを示唆している。ロゼツト促進可能性を有する２種類の候補 のエイコサノイドを除外するため（ＡＨＶおよびＳＤＷ、未発表データー）ＣＭ Ｆ−１をＷａｔｅｒｓ　μＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ，８逆相カラム上で、’ＨＯイ コトリエンＢ４　（ＬＴＢ４）およびリボキシンＡ４　（ＬＸＡ４）と共に溶出 した（第１７□□□。グラディエンドは、毎分１％の水からアセトニトリルで０ から６０％までのアセトニトリルで溶出した（グラディエンド曲線についてはグ ラフ上の実線を参照されたい）。これらの条件は、このカラムでの前実験から４ ５〜５０％アセトニトリルでＣＭＦ−１を溶出することが知られていた。ＬＴＢ ４溶出位置は、それぞれの画分に含まれるＣｐｍによって監視しく破線）　、Ｌ ＸＡ４は２５４ｎｍにおける吸光度によって監視しく点線）　、ＣＭＦ−１の位 置はロゼツト形成分析における活性の画分をアッセイすることによって確かめた （棒グラフは付着指数に対応する）。エイコサノイドはＣＭＦ−１と同時溶出し なかった。 更に、ＣＲ３を活性化することができるＬＴＢ４またはＬＸＡ４の濃度は、２５ ４ｎｍにおける吸光度の大きなピークを与えた。 Ｆ、　ＣＭＦ−１はメバロネート前駆体から誘導することができる。 ＣＭＦ−１がイソプレノイドである可能性を説明するため、イソプレノイド合成 における速度制限酵素ＨＭＧＣｏＡレダクターゼを遮断することによって作用物 質に応答してＣＭＦ−１の産生の遮断を試みた。酵素ロバスタチン（４０％ｇ／ ’ｍｌ）の競争的阻害剤を細胞に加えて、酵素の活性を遮断した。次いで、合成 経路におけるこの初期段階を通過した任意のＣＭＦ−１前駆体の細胞を使用して しまうため、Ｃ５ａ　（１０８Ｍ）を加えた。Ｃ５ａは、ＰＭＡによる次の刺激 に耐性になることなく一時的に細胞を活性化した（１１）。次に、Ｃ５ａで簡単 にパルスを加えたロバスタチンで処理した細胞をＰＭＡで活性化して、イソプレ ノイド産生が遮断されているにも拘らずＰＭＡがＣＭＦ−１を産生ずることがで きるかどうかを見た。 ＰＭＡは遮断された細胞中ではロゼツト形成を増加することはできなかったが、 ＨＭＧＣｏＡレダクターゼの生成物であるメバロネートを培地に加えることによ って遮断を克服することができるときにはロゼツト形成を増加することができた （第１１表）。この実験は、ＣＭＦ−１がメバロネート合成経路の顆粒生成物で ある可能性を支持している。 表 第１表　活性化されたＰＭＮから抽出された脂質は未刺激ＰＭＮのＣＲ３活性を 調整する。 刺激したＰＭＮからの脂質　４３９ 静止しているＰＭＮからの脂質　１２２ＧＭ２　１３９ ＧＤ１ａ　１４１ ＧＴ１ｂ　１．５６ ＰＭＡ、２０’　５８９ 各種の物質を粘着性ヒトＰＭＮに、３７℃で４５分間適用した。次に、細胞を洗 浄してＣ３ｂ　ｉでコーティングした赤血球（ＥＣ３ｂｔ）に３７℃で１５分間 結合させた。付着指数は１００個の食細胞当たりの結合した赤血球の数である。 未処理の静止しているＰＭＮは、このロゼツト形成分析法では低い背景結合水準 を与える。ガングリオシドを１００μｇ／ｍｌで適用した。ホルボールミリステ ートアセテート（ＰＭＡ）は３０％ｇ／ｍｌであった。ＰＭＡで活性化したＰＭ Ｎから部分的に精製した脂質を３２ｕ／ｍｌで適用した。静止しているＰＭＮか らの抽出物は、活性化したＰＭＮからの抽出物の１０倍の細胞から誘導した。 第２表　ＣＭＦ−１によって誘導されるロゼツト形成はＣＲ３およびＣ３ｂ１に 対する抗体によって阻害することができる。 刺激　抗体　ＥＣ３ｂｉ’（Ａ・■）の結合なし　なし　なし ＣＭＦ−１なし　２０６ ＣＭＦ−１１８４８３ ＣＭＦ−Ｉ　Ｃ３９３１ ＣＭＦ−１０ＫＭ１０　２７ ＣＭＦ−１０ＫＭＩ　１７５ ４２単位／ｍｌの部分的に精製したＣＭＦ−１を、各種の単クローン性抗体の存 在下または非存在下にてＣＭＦ−１アツセイにおけるＰＭＮに加えた。ＩＢ４は ＣＤ１８を、ＯＫＭＩＯおよびＯＫＭＩはＣＤ１１ｂを認識する。Ｃ３ＱはＣ３ 分子に対するものである。抗体を、１０μｇ／ｍｌの最終濃度で用いた。この実 験は、これら３種類の代表例である。 第３表　ＣＭＦ−１産生はＣＲ３結合活性と相関する。１０７個の細胞当たりの 抽出可能な単位 未処理細胞からの脂質　＜０．３３ ＰＭＡ中の細胞からの脂質、２０’　２ＰＭＡ中の細胞からの脂質、６０’　０ ．　５ＰＭＡて０．２０または６０分間処理した細胞からの部分的に精製した脂 質をロゼツト形成分析におてＣＭＦ−１活性について試験した。 第４表　ＣＭＦ−１活性は抽出された血小板活性化因子によるものではな０゜刺 激　阻害剤　Ｅｃ：３ｂｔ　（ＡＩ）当たりの結合 なし　なし　１１２ ＰＡＦ、１００ｎＦ　なし　３７０ ＰＡＦ、１００ｎＦ　ＷＥＢ　２０８６　１０６ＰＡＦ、ｌｎＦ　なし　３１２ ＰＡＦ、１．ｎＦ　ＷＥＢ　２０８６　１６９ＣＭＦ−１なし　６５２ ＣＭＦ−Ｉ　ＷＥＢ　２０８６　５７５ＣＭＦ−１（４２単位／ｍｌ、ｆＮＬＬ Ｐ処理した細胞からの部分的１こ精製したもの）または血小板活性化因子（ＰＡ Ｆ）を、ＰＡＦレセプタ拮抗物質であるＷＥ８２０８６　（１０μＮ）の存在下 または非存在下にてロゼ・ソト形成分析法で試験した。ここで用いたＣＭＦ−１ はｆＮＬＬＰで３７℃で５分間処理した細胞から部分的に精製したものであった 。この実験は３回の反復値の代表的なものである。 第５表　ＣＭＦ−１葉ＣＲ３に対するＣ３ｂ１および脂質ＩＶａをコーティング した粒子の結合を増加する。 刺激の結合（ＡＩ）　ＥＣ３ｂｉ　ＥＩＶａＦＭＮを、（ｆＮＬＬＰて処理した 細胞からのもの、４２ｕ／ｍｌ）ＣＭＦ−１の存在したまたは非存在下にて３７ ℃で１５分間インキュベーションした。 細胞を洗浄し、Ｃ３ｂ１をコーティングしたまたは脂質ＩＶａをコーティングし たヒツジ赤血球と共に３７℃で１５分間インキュベーションした。この実験は３ 回繰り返し行ったものの代表的なものである。 第６表　ＣＭＦ−１によって誘導されるＰＭＮのフィブリノーゲンに対する結合 はＣＤ１８依存性である。 刺激　抗体　１ｍｍ２当たりの細胞数 なし　なし　２００±１２０ ＣＭＦ−１なＬ　６８０＋１７０ ＣＭＦ−Ｉ　ＩＢ４　２２０±１４０ ＣＭＦ−Ｉ　Ｗ６３２　５６０±２２０ＰＭＡ　なＬ　１１３０＋２３０ ＰＭＡ　ＩＢ４　１３０±５０ ＰＭＡ　Ｗ６３２　８８０±１２０ ＰＭＮを、作用物質およびｍＡｂｓの存在下または非存在下にてフィブリノーゲ ンをコーティングしたプラスチック表面に付着させた。ＣＭＦ−１は４２ｕ／ｍ ＋で適用し、ＰＭＡは３０　ｎ　ｇ／ｍ　ＪおよびＡｂｓは１０μｇ／ｍｌで適 用した。ＩＢ４はＣＤ１８を認識し、Ｗ６３２はクラスＩＭＨＣ分子を認識する 。 これらの作用物質は、はぼ等しい数でＰＭＮ表面上に含まれている。細胞をＡｂ の存在下で表面に０℃で３０分間適用した後、作用物質を加え、結合を３７℃で ３０分間起こさせた。洗浄段階の後に結合したままになっている細胞を位相差顕 微鏡法によって得点を付ける。データーは、それぞれ２個のウェルでの２回の実 験の平均値である。 第７表　ＣＤ１８と会合した脂質はＣＭＦ−１活性を有する。 刺激　ＥＣ３ｂｉ　（Ａｆ）の結合 なし　２５ ＣＤ１８と会合した脂質、 ＰＭＮ＋ＰＭＡ　１９０ セフアロ一ス七会合した脂質、 ＰＭＮ＋ＰＭＡ　４３ 抗−ＣＤ１８ｍＡｂ、ＩＢ４に共役したセファロースビーズを用いてＣＲ３を免 疫沈澱したビーズをＰＭＡて処理した３Ｘ１０ｓＰＭＮオクチルグルコシドリゼ ート（２５ｍＭ）と２０分間混合した。洗剤をビーズから洗い落とし、ＣＤ１８ と会合した脂質をクロロホルム：メタノール＝２：１で抽出した。この抽出物を 、ロゼツト形成分析法でＣＭＦ−１活性について評価した。抗体を欠いているセ ファロースビーズもコントロールとして抽出した。 第８表　下記のものはいずれもロゼツト形成分析法においてＣＭＦ−１活性を持 たない。 １００μｇ／ｍｌ： ＧＭＩ、アシアロＧＭＩ ＧＭ２、アシアロＧＭ２ Ｍ３ ＧＤｌａ、ＧＤＩｂ ＣＤ２、ＧＤ３ Ｔ１ｂ ラクトシルセラミド ウシ脳ガングリオシド ５０．５および０．５μｇ／ｍｌ　： Ｑ１ｂ ＰＣＳＰＣｄ　ｉｍｉ　ｒ 無水ミリスチン酸 ホスファチジン酸ニ ジラウロイル、シミリストイル、ジオレオイルリソホスファチジン酸 ミオイノシトールビスホスフェート リソホスファチジルイノシトール 第９表　ＣＭＦ−１活性は、各種の化学的および酵素的処理によって影響を受け ない。 ３０９６ＮＨ３０Ｈ：　ＣＨ３０Ｈ＝１　：　１、室温、−晩ＩＮ　ＮａＯＨ， ７５℃、３時間 無水酢酸：氷酢酸＝＝２・３．１５０℃、４８時間ＩＮ酢酸、１００℃、４５分 Ｖ、ｃｈｏ　ｌ　ｅ　ｒａニューラミニダーゼ、０．ＩＵ／ｍｌ、３７℃、−晩 ２Ｎメタノール性ＨＣＩ、７５℃、５時間０．５Ｎメタノール性ＨＣＩ、１００ ℃、２時間５０９６ＨＦ、４８時間、０℃ 細菌性アルカリ性ホスファターゼ、０．０４Ｕ／ｍｌ、３７℃、−晩プロテイナ ーゼに、Ｌ　６ｍＵ／ｍｌ、３７℃、−晩３　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＨ中０．５Ｍ　Ｎ ａＢ）（４、室温、−晩７０％エタノール中２ｍＭ　Ｎａ１０４、室温、−晩１ ０、ｃｚＭ　Ｆｅ５０．中３０％Ｈ２Ｏ２、室温、−晩０．１Ｍ酢酸緩衝液中０ ．２５Ｍ亜硝酸、ｐＨ３，８，３時間、室温部分的に精製したＣＭＦ−１にこれ らの修飾を施し、活性な分子の性状を見出す試みを行った。総ての場合に、感受 性のある脂質の基質であるシリルシルホスファチジルコリンまたはガングリオシ ドＧＭＩを平行に処理した。コントロール分子の分解を薄層クロマトグラフィに よって監視した処理の前後にロゼツト形成分析法によりＣＭＦ−１活性を試験し た。必要ならば、ＣＭＦ−１を反応の後にブタノール：水＝１：１抽出により酵 素または塩から精製した。ＣＭＦ−１はブタノール相に分配する。 第１０表　オソノリシスはＣＭＦ−１活性を破壊する。 ＰＭＡ　１０００ 部分的に精製した ＣＭＦ−１，７ｕ／ｍｌ　４４５ 精製したＣＭＦ−１，７ｕ／ｍｌ　５００精製したＣＭＦ−１゜ ＋ｏ、、２１ｕ／ｍｌ　９５ ＣＭＦ−１５０単位をサイズ除去クロマトグラフィにより精製しく第１６図参照 ）、酢酸エチルに再懸濁した。溶液にオゾン（２ｐ　ｐｍ）を１５分間、室温で 通じた。ＣＭＦ−１活性を、ロゼツト形成分析法により出発物質に対して分析し た。 第１１表　ＣＭＦ−１はメバロネート経路の生成物である。 静止ＰＭＮ　３２　１９ ０バスタチン　４８　検出不能 ロバスタチン十Ｃ５ａ　８６　３７ ＰＭＡ　３６２　２８２ Ｃ５ａ＋ＰＭＡ　検出不能　３０９ ０バスタチン＋ｃ５ａ＋ＰＭＡ　７４　５０ロバスタチン、メバロネート、 Ｃ５ａ＋ＰＭＡ　４６５　２８１ ＣＭＦ−１５１１２７７ ０バスクチン十ＣＭＦ−１３７２２６１ＰＭＮ　（２Ｘ１０６／ｍｌ）をウェル に加えてロゼツト形成分析法を行い、次いでメバロネー）（０，２μｇ／ｍｌ） と共にまたはなしでロバスフチン（４０μｇ／ｍｌ）で３７℃で６０分間処理し た。幾つかのウェルではＣ３ａ（１０−’Ｍ）を最初の１５分後に加えた。ＣＭ Ｆ−１（４２ｕ／ｍ＋）またはＰＭＡ　（３０ｎｇ／ｍＩ）１５分間加えた後、 ＥＣ３ｂｉを更に１５分間加えた。ＥＩｇＧを一組のウェルにコントロールとし て加え、その結合がウェルへの如何なる添加剤の組合せによっても影響されない ことを見出した（データーは示していない）。これらのデーターは４回繰り返し た２つの代表的な実験である。 文献 １、Ｈｙｎｅｓ　ＲＯ，インテグリン：細胞表面レセプタの一群、Ｃｅ１１．４ ８：５４９−５５４．１９８７２、Ｗｒｉｇｈｔ　ＳＤ、ＳＫ　ＬｏおよびＰＡ 　Ｄｏｔｍｅｒｓ。 ＣＤＩ！＋依存性の付着の特異性および制御、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓ ｉ。 ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ、ＴＡ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ＤＣＡｎｄｅｒｓｏｎ。 ＡＳ　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ及びＲＲｏｔｈｌｏｉｎ監修、ニューヨーク、Ｓｐｒ ｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、１９９０年、１９０〜２０７頁。 ３、Ｔｕｏｍａｎｅｎ　ＥＴ、Ｋ　５ａｕｋｋｏｎｅｎ、Ｓ　５ａｎｄｅ。 ＣＣ４ｏｆｆｅおよびＳＤ　Ｗｒｉｇｈｔ、リンパ球の付着促進レセプタに対す る単クローン性抗体で処理したウサギにおける髄膜炎における炎症、組織損傷お よび死亡率の減少、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１７０：９５９−９６８．１９８９４ 、５ｌｍｐｓｏｎ　ＰＪ、ＲＦ　Ｔｏｄｄ、ＪＣＦａｎｔｏｎｓ、ＪＫＭｉｃｋ ｅｌｓｏｎ、ＪＤ　Ｇｒｉｆｆｉｎ、ＢＲＬｕｃｃａｓｉ、ＭＤＡｄａｍｓ、Ｐ 　Ｈｏｆｆ、Ｋ　Ｌｅｅ　およびＣＥ　Ｒｏｇｅｒｓ、リンパ球の付着を阻害す る単クローン性抗体（抗−Ｍｏｌ、抗−ＣＤ１１ｂ）による実験的なイヌの心筋 と再潅流による外傷の軽減、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　６１：６２４−６２ ９．１９８８ ５、Ｖｅｄｄｅｒ　ＮＢ、ＲＫ　Ｗｉｎｎ、ＣＬ　Ｒｉｃｅ、ＥＹ　Ｃｈｉ、Ｘ −Ｅ　ＡｒｆｏｒｓおよびＪＭ　Ｈａｒｌａｎ、付着促進リンパ球糖タンパク質 ＣＤ１８に対する単クローン性抗体はウサギにおける器官の損傷を軽減し、出血 のショックからの回復および蘇生を改善する、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　８ １：９３９−９４４．１９８８ ６、　Ｈｅｒｎａｎｄｅｓ　ＬＡ、ＭＢ　Ｇｒｉｓｈａｍ、Ｂ　Ｔｗｃｈｉｇ、 に−Ｅ　Ａｒｆｏｒｓ、ＪＭ　ＨａｒｌａｎおよびＤＮ　Ｇｒａｎｇｅｒ、貧血 −再潅流によって誘発される微小血管の損傷における好中球の役割、Ａｍ　Ｊ　 ｌ’ｈｙｓｉｏｌ　２６３：Ｈ６９９−Ｈ７０３，１９８７７、Ｗｒｉｇｈｔ　 ＳＤおよびＭＴＣＪｏｎｇｓヒトミクロファージ上の付着促進レセプタはリポ多 糖類を結合することによりＥ、ｃｏｌｉを認識する、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６ ４：１８６７−１８８８．１９８６８、Ｗｒｉｇｈｔ　ＳＤ、ＳＭ　Ｌｅｖｉｎ 、ＭＴＣＪｏｎｇ。 Ｚ　ＣｈａｄおよびＬＧ　Ｋａｂｂａｓｈ、ＣＲ３（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）は Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するペプチドの一つの結合部位および細菌性リポ 多糖類の第二の部位を発現する。Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６９：１７５−１８３ ．１９８９ ９、Ｗｒｉｇｈｔ　ＳＤおよびＢＣＭｅｙｅｒ、ホルボールエステルは多形核リ ンパ球上の補体レセプタの逐次的活性化および不活性化を引き起こす。 Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３６：１７５９−１７６４．１９８６１０、Ｌｏ　ＳＫ 、ＧＡ　Ｖａｎ　５ａｖｅｎｔｅｒ、ＳＭ　ＬｅｖｉｎおよびＳＤ　Ｗｒ　ｉ　 ｇｈｔ、２個のリンパ球レセプタ（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８およびＣＤ１１ｂ／Ｃ Ｄ１８）は異なるリガンドへ結合することにより内皮への一時的付着を媒介する 。Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４３：３３２５−３３２９．１９８１１、Ｌｏ　ＳＫ 、ＰＡ　Ｄｅｔｍｅｒｓ、ＳＭ　ＬｅｖｉｎおよびＳＤ　Ｗｒｉｇｈｔ、好中球 の内皮への一時的付着、Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６８：１７７９−１７９３．１ ９８９ １２、　Ｄｅｔｍｅｒｓ　ＰＡ、ＳＤ　Ｗｒｉｇｎｔ、Ｅ　０１ｓｅｎ。 Ｂ　Ｋｉｍｂａｌｌ　およびＺ　Ｃｏｈｎ、リガンドの不在下におけるヒト好中 球上の補体レセプタの集合、Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　１０５：１１３７−１１ ４５．１９８７ １３、　Ｂａｇｇｉｏｔｉｎｊ　Ｍ、Ｂ　ＤｅｗａｌｄおよびＭＴｈｅｌｅｎ１ 好中球および単核食細胞に対するＰＡＦの影響、Ｐｒｏｇ　ＢｉｏｃｈａｍＰｈ ａｒｍａｃｏｌ　１２：０−１０５．１９８８１４、　Ｐａｔａｒｒｏｙｏ　Ｍ 、Ｍ　Ｊｏｎｄａｌ、Ｊ　ＧｏｒｄｏｎおよびＥ　Ｋｌｅｉｎ、ヒトリンパ球間 のホルボール１２．１３−ジブチレートにより誘導される結合の特性決定、Ｃｅ １ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　８１：３７３−３８３．１９８３ １５、Ｒｏｔｈｌｅｉｎ　ＲおよびＴ　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ホルボールによって 刺激された同型のリンパ球の付着におけるリンパ球の機能に関連した抗原１の要 件。Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１６３：１１３２−１１４５．１９８６１６、Ｗｒｉ ｇｈｔ　ＳＤ　およびＳＣ５ｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、腫瘍促進ホルボールエステ ルは培養したヒトの単球中でＣ３ｂおよびＣ３ｂ’　レセプタによって媒介され る食作用を刺激する。Ｊ　Ｅｘｐ　Ｍｅｄ　１５６：１１４９−１１６４．１９ ８２ 本発明は、本発明の精神または本質的特徴から離反することなく他の形態で具体 化することができ、または他の方法で行うことができる。これ故、本開示はあら ゆる点で例示のためのものであり、制限のためのものではないと考えるべきてあ り、本発明の範囲は請求の範囲に記載されており、同等な意味および範囲に当た る総ての変更は本発明に包含されることを意図するものである。 図面の簡単な説明 図１は、刺激を受けた好中球から部分的に精製されたＣＭＦ−１を抽出する方法 を示す。刺激されたＰＭＮのペットが有機溶媒で処理さね、上澄み液を、回転蒸 発器中で真空下に乾燥させた。容量が２−２−２ＯであるＤＥＡＥカラムを、１ ０９−１０”細胞からの出発物質のために使用した。乾燥した抽出物をクロロホ ルム：メタノール：水＝３０：６０：８である３床容量中で再び懸濁化し、前記 カラムに通した。カラムを溶媒の６床容量で洗い、クロロホルム：メタノール　 ０．８Ｍ酢酸ナトリウム＝３０：６０：８、で溶離させた。溶離物を真空下で乾 燥し、蒸留水で再び懸濁化した。１０９−１０”細胞それぞれからの物質の脱塩 化のために、セプーパク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）Ｃ１８カートリッジ、あるいはセブ ーパク溶媒のハンドパックカラムを使用した。標本に少くとも３床容量の水を適 用する前に、０１８カラムをメタノール、クロロホルム：メタノール＝２：１、 及びメタノール・１．６Ｍ酢酸ナトリウム＝１：１．のそれぞれであらかじめ洗 った。次にカラムを水（７６床容量）でゆすぐことにより塩分を洗い出し、次い でリピド抽出物を、１：１メタノール−クロロホルムで溶離させた。溶離物質に 次いでフ十ルチ（Ｆｏｌｃｈ）区分法を適用し、乾燥前に、クロロホルム：メタ ノール＝２・１の下側層と平衡する上側塩類担に分離させ、次いでこの物質を再 懸濁して、部分的に精製されたＣＭＦ−１の保存用ストックとした。 第２図は、半調製用Ｃ，，ＨＰＬＣカラム上での部分的に精製した脂質抽出物の 典型的な実験である。部分的に精製したＣＭＦ（を、蒸溜水中でＶｅｒｓａ−Ｐ ａｋｃ＋＋＋逆柑カラム（１，０μｍ充填、２５０ｍｍＸ］、Ｏｍｍ）に載せた 。ＣＭＦ−１は水からアセトニトリル間ての１％／分のグラディエンドによって 溶出した。ｃＭｐ−１（ロゼツト形成分析法における活性によって測定、棒グラ フ））は約５５９６アセトニトリルて溶出した。ＣＭＦ−１はＣＭＦ−１を含有 するミセルが含まれているため、親水性でありカラムマトリマックスによって保 持されない通過液中にも含まれていた。低能度の材料を載荷することによって突 破がなくなった。能動画分中に２４４ｎｍの吸収が見られないことが認められた 。 第３図は、ＣＭＦ−１で処理した後のＰＭＮによるＥＣ３ｂｉ結合の経過を示す グラフである。部分的に精製したＣＭＦ−１（４２単位／ｍｌ）をロゼツト形成 分析法において様々な時間にＰＭＮに添加した。この実験は３回繰り返したもの の代表的なものである。 第４図は、ＣＭＦ−１で処理したＰＭＮによるＥＣ３ｂｉ結合の投与量応答を示 すグラフである。ＰＭＡて刺激した細胞から抽出した部分的に精製した脂質を希 釈し、ロゼツト形成分析法においてＰＭＮに１５分間適用した（黒四角形）。半 最大結合は１／３６０倍の希釈で起こったが、これはＣＭＦ−１の６単位がこの 調製における１０７個の細胞から抽出されたことを意味している。静止ＰＭＮ（ 黒三角形）から抽出した脂質は、いずれの希釈倍率でもＣＭＦ−１活性を示さな かった。ＣＭＦ−１はＩｇＧをコーティングした赤血球（Ｅ　Ｉ　ｇＧ）へのＰ ＭＮの結合に何んら影響しなかった（ｎ＝角形）。 第５図は、ＣＭＦ−１が全血中の細胞によるＴＮＦ産生を誘発しないことを示す グラフである。全血をリポ多糖類（ＬＰＳ）　、ＣＭＦ−１（４２単位／ｍｌ） または両方と共に３７°Ｃて５時間インキュベーションした。細胞を遠心分離し た後、上澄液をラジオイノムアッセイにより腫瘍憤死因子（ＴＮＦ）の存在に就 いて試験した。この実験は２回繰り返した実験の代表的なものである。 第６図は、フィブリノーゲンをコーティングした表面へのＣＭＦ−１によって誘 導されたＰＭＮの結合の経過を示すグラフである。ＰＭＮを、ｆＮＬＬＰ処理し た細胞から部分的に精製したＣＭＦ−１の４２単位／ｍｌの存在下（四角形）ま たは非存在下（三角形）での様々な時間に３７℃で、フィブリノーゲンをコーテ ィングした表面に付着させた。データ一点は、それぞれ２個のウェルでの２回の 実験の平均である。 第７図は未刺激の内皮へのＣＭＦ−１で処理したＰＭＨの結合の投与量応答を示 すグラフである。ＰＭＮを様々な量のＣＭＦ−１で３７℃で１５分間刺激し、洗 浄により作用物質を除き、未刺激のヒト請帯静脈内皮細胞の単層（ＥＣ）に適用 した。ＥＣへの結合は洗浄前、３７℃で１５分間行い、位相差顕微鏡法により結 合細胞を計数した。数は、それぞれ２個のウェルでの２回の実験の平均である。 第８図は、ＣＭＦ−１処理を行ったＰＭＮの未刺激内皮への結合の経過を示すグ ラフである。ＰＭＮを様々な時間ＣＭＦ−１（４２単位／ｍｌ、ｆＮＬＬＰ処理 した細胞から部分的に精製したのもの）で刺激し、第７図に記載したのと同様に ＥＣ結合に就いて試験した。データーは、それぞれ２個のウェルで２回の実験の 平均である。 第９図は、ＣＭＦ−１で処理したＰＭＮの未刺激内皮への結合がＣＲ３およびＬ ＦＡ−１によるものであることを示すグラフである。ＰＭＮをｍＡｂｓ（１０ａ ｇ／ｍｌ）の存在または非存在下にて前記のＥＣ結合に就いて試験した。数値は ２個のウェルの平均値である。この実験は３回反復したものの代表的なものであ った。 第１０図は、ＣＭＦ−１がＰＭＮ脱顆粒反応をおこなさないことを示すグラフで ある。ＰＭＮを脂質抽出物またはＰＭＡと共に様々な時間インキュベーションし 、洗浄し、ＣＤ１１ｂｇ　（ＯＫＭＩＯ１５μｇ／ｍｌ）に対するｍＡＢおよび フルオレセイン抱合二次抗体で染色した。次に、細胞を流動細胞計数法により分 析した。ＰＭＮを３０ａｇ／ｍｌ使用した。この実験で用いた脂質抽出物は、異 なる作用物質で様々な時間処理したＰＭＮから誘導した。ＰＭＡで２０分間処理 した細胞からの脂質はＣＭＦ−１活性が１７単位／ｍｌであったが、ＴＮＦで４ ５分間処理した細胞からの脂質の活性は４２単位／ｍｌであった。ＰＭＡでＯま たは６０分間処理した細胞からの脂質のＣＭＦ−１活性はそれぞれ〈２単位／ｍ ｌおよび４単位／ｍｌであった（第３表参照）。この実験は３回繰り返したもの の代表的なものであった。 第１１図は、ＰＭＡで刺激した細胞を再度ＣＭＦ−１に刺激することができるこ とを示すグラフである。細胞をＰＭ　（３０ａｇ／ｍｌ）またはＣＭＦ−１（４ ２単位／ｍｌＳ　ｆＮＬＬＰ処理した細胞から部分的に精製したもの）で所定時 間刺激し、洗浄した後、指示がある場合には他の作用物質で刺激した。ＥＣ３ｂ ｉを適用する前に作用物質を洗浄により除去し、通常の方法でロゼツト形成を測 定した。これらのデーターは、それぞれ３個のウェルての２回の実験の平均値で ある。 第１２図は、活性化したＰＭＨによって産生されるＣＭＦ−１の大半は細胞会合 していることを示すグラフである。ＰＭＮをＴＮＦ　（５Ｘ１０’単位／ｍｌ） に様々な時間暴露して、遠心分離を行った。ペレットを前記と同様にクロロホル ム、メタノール：水＝１０・１０：１で抽出し、上澄液をロータリーエバポレー ターで乾燥し、クロロホルム：メタノール＝２：１に再懸濁した。次いで、抽出 物をロゼツト形成分析法によりＣＭＦ−１活性について試験した。 第１３図は、ＣＭＦ−１がＬＦＡ−１によりリンパ球集合を刺激することを示す グラフである。リンパ球を、（１６）に記載の方法でパーコールグラディエンド 上で精製した。混入する単球はプラスチックの粘着性によって除去した。次いて 、細胞をテラサキプレートウエルに加え、ＰＭＡ　（１００ｎｇ／ｍｌ）　、Ｃ ＭＦ−１（４２単位／ｍｌ）または静止ＰＭＡから抽出された脂質（ｒＰＭＮ脂 質」、ＣＭＦ−１の３倍程度の細胞から抽出）を抗体（１０ａｇ／ｍｌ）の存在 下または非存在下にて加えた。ＴＳＩ／２２帯ＯＫＭＩＯは、それぞれＣＤ１１ ａおよびＣＤ１１ｂに対するものである。μＢ４はＣＤ１８に対するものである 。Ｗ２Ｂ５はクラスＩ　ＭＨＣを認識する。静止ＰＭＮからの脂質を１／３０に 希釈した。細胞を３７℃で３０分間インキュベーションし、集合を下記の式にし たがって位相差顕微鏡法によって測定した。％集合＝［ｉ−（試験ウェル中の１ ｍｍ２当たりの遊離細胞数）／コントロールの未処理ウェル中の１ｍｍ２当たり の遊離細胞数）Ｘ１００゜この実験は、３回反復したものの代表的なものである 第１４図は、ＣＭＦ−１の紫外部スペクトログラフである。ダブルビームおよび 組合せ石英セルを備えたｒ’ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｄａ　５紫外部／ 可視分光光度計を両方のセルでアセトニトリルでゼロ合わせをした後（右側）、 逆相クロマトグラフィにより精製したＣＭＦ−１（５２，０００単位／ｍｌアセ トニトリル）を一方のセルに加え、スペクトルを得た（左側）。 第１５図は、ＣＦｖＩ　Ｆ活性を臨床的に破壊するための実験を纏めた流れ図で ある。 第１６図は、ＣＭＦ−１の分子量は３４０±１６ダルトンであることをしめずグ ラフである。ＣＭＦ−１をＴＳＫ　Ｇ２００ＯＨＸＬサイズ排除クロマトグラフ イカラムに載荷し、テトラヒドロフランの均一グラディエンドで溶出した。 溶出した物質の２５４　ｎｍの吸収は、カラムは、カラムでの分布によって示さ れる。１０００〜１８０ダルトンの範囲の分子量標準試料の溶出容積を示す（三 角形）。直線回帰により、標準曲線 ｙ＝１．２７８ｘ＋３．３０２、ｒ２＝０．９８８４が得られた。それぞれの画 分のＣＭＦ−１活性（棒グラフ）をロゼツト形成分析法によって測定した。 第１７図は、ＣＭＦ−１がロイコトリエンＢ４またはリボキシンＡ４に同等では ないことを示すグラフである。Ｗａｔｏｒｓ　μＢ　ｏ　ｎ　ｄ　ａ　Ｐ　ａ　 ｋ　Ｃ＋ａ逆相カラム（１０，ｃｚｍ粒度、３．９ｍｍｘ１５０ｍｍ）にＣＭＦ −１（５０単位、ｆＮＬＬＰて処理した細胞から部分的に精製）ＬＴＢ４　（５ ｎｇおよび０．　５μＣ１）またはＬＸＡ４　（５μｇ）を載荷し、水からアセ トニトリルへの１％／分のグラディエンドで溶出した（実線）。ＣＭＦ−１の溶 出はロゼツト形成分析法によって監視しく棒グラフ）　、ＬＴＢ４は画分当たり のｃｐｍ（破線）で、ＬＸＡ４は２５４ｎｍでの吸光度（点線）によって監視し た。 （図１　】 付着指数（０）

【図３　】 １０７個の細胞からの抽出物の希釈 １図５】 ０　０．０５　０．２５　７　５ リボ寥糖濃度（ｎｇ／ｍＷ （図７１ 加えたＣＭＦ（単位／ｍ０ Ｉ図′ｉ３］ （図ｃ１１

【図（０］ 平均チャンネル蛍光 【図１１ 付精攪数 【図１″Ｌ】 ７ＮＦ中の時間（分） 集　合　％ １Ｎ 呼　吸　（２５４ｎｍ） ｌｏｇ　ＭＷ　（ｖ） 手続補正書

Claims (89)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、前 記ＣＤ１８レセプタに直接結合する、精製された形のＣＲ３モジュレータ。
2. ２．前記ＣＲ３モジュレータが酸性の両親和性リピドあるいはリピド状化合物で あり、強塩基で処理された後でもその活性を保持し、約３４０ダルトンの分子量 を有する請求項１記載のＣＲ３モジュレータ。
3. ３．メバロン酸合成の生合成産物から由来し、イソプレノイド構造を有する請求 項２記載のＣＲ３モジュレータ。
4. ４．ＣＤ１８の付着促進能力を活性化し、Ｃ３ｂｉの結合位置でレセプタＣＲ３ の結合を増大させ、内皮細胞、フィブリノーゲン被覆基質及びリピドＩＶａに対 する多形核白血球結合力を増大し、ＬＦＡ−１媒介白血球付着力を増大する請求 項１，２もしくは３項記載のＣＲ３モジュレータ。
5. ５．全血液によるＴＮＦの産生を誘導するものでなく、多形核白血球の脱顆粒化 を生じさせるものでない請求項４記載のＣＲ３モジュレータ。
6. ６．検出可能なラベルをラベルした請求項１，２もしくは３項記載のＣＲ３モジ ュレータ。
7. ７．ラベルは酵素、あるいは螢光もしくは放射線を発する化学物質から選ばれる 請求項６記載のＣＲ３モジュレータ。
8. ８．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、Ｃ Ｄ１８レセプタに直接結合するＣＲ３モジュレータの調製方法であって、Ａ．哺 乳動物から多形核白血球標本を収集し；Ｂ．前記多形核白血球からＣＲ３モジュ レークを単離する、ことからなる方法。
9. ９．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、Ｃ Ｄ１８レセプタに直接結合するＣＲ３モジュレータの合成を抑制する方法であっ て、前記多形核白血球もしくはその活性フラグメントと、前記作用物質あるいは ＣＲ３モジュレータ合成の他のプロモータとの間の反応を遮断／拮抗することか らなる方法。
10. １０．請求項９記載の方法であって、前記多形核白血球を含む宿主中の生物学的 媒体に、前記ＣＤ１８活性を高める作用物質に対する拮抗物質、前記ＣＲ３モジ ュレータ合成プロモーター、前記多形核白血球、もしくは前記多形核白血球活性 フラグメント、前記ＣＤ１８活性を高める作用物質の抗体／又はこれらの混合物 のうちから選ばれた少くとも一種を投与することにより、前記作用物質あるいは ＣＲ３モジュレータ合成の他のプロモーターを遮断する、ことからなる方法。
11. １１．請求項１０記載の方法であって、ＣＲ３モジュレータ合成の前記プロモー ターが、ホルポールミリステン酸アセテート（ＰＭＡ）、血小板活性因子（ＰＡ Ｆ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ホルミル−ＮｏｒＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆ ＮＬＬＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ５ａ、及びこれらの混合物 からなる群より選ばれる方法。
12. １２．ＣＲ３モジュレーク合成の前記プロモーターがプロティンキナーゼＣｃＧ ＭＰ，Ｇ−プロティン，及びこれらの混合物のうちから選ばれる細胞内信号物質 である請求項１０記載の方法。
13. １３．ＣＲ３モジュレータ合成の前記プロモーターが、プリカーサを活性ＣＲ３ モジュレータに転化させる生合成酵素である請求項１０記載の方法。
14. １４．ＣＲ３モジュレータ合成の前記プロモーターが、ＣＲ３モジュレータの基 体を合成する酵素である請求項１０記載の方法。
15. １５．ＣＲ３モジュレータに対する拮抗物質であって、前記拮抗物質に対応する ＣＲ３モジュレータが、ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球 により合成され、ＣＤ１８レセプタに直接結合する純粋な形の化合物に含んでい るものであることを特徴とする拮抗物質。
16. １６．前記拮抗物質がＣＲ３モジュレータのＣＤ１８への結合を妨げるものであ る請求項１５記載の拮抗物質。
17. １７．前記拮抗物質がＣＲ３モジュレータの破壊を早めるものである請求項１５ 記載の拮抗物質。
18. １８．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、 前記ＣＤ１８レセプタに直接結合するＣＲ３モジュレータ、の存在を定量する方 法であって、下記段階： Ａ．多形核白血球から前記ＣＲ３モジュレータを含む標本を調製し；Ｂ．前記Ｃ Ｒ３モジュレータ標本に対応する結合相手を調製し；Ｃ．前記ＣＲ３モジュレー タ標本とこれに対する結合相手からなる群から選ばれた物質に検出可能なラベル を配置し；Ｄ．ラベルされていない段階Ｃの物質からなる群から選ばれた物質、 及び前記ＣＲ３モジュレータの結合が疑われている哺乳動物からの生物学的標本 を適当な基体の上で不働化し； Ｅ．段階Ｃからのラベルされた物質を前記生物学的標本、及び不勧化物質と接触 して配置し； Ｆ．前記不勧化物質に結合しない段階Ｃの物質から、前記不働化物質に結合した 段階Ｃの物質を分離し； Ｇ．前記結合した物質について、前記ラベルした物質の存在を検定する段階から なる方法。
19. １９．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、 前記ＣＤ１８レセプタに直接に結合するＣＲ３モジュレータ、の存在をアッセイ する方法であって、下記段階： Ａ．多形核白血球から前記ＣＲ３モジュレータを含む標本を調製し；Ｂ．静止相 の多形核白血球の試験標本に、段階ＡのＣＲ３モジュレータ標本の所定量を接種 し； Ｃ．段階Ｂの接種された試験標本を、検出可能なラベルを有し、Ｃ３ｂｉで被覆 された赤血球標本に添加し；そして、Ｄ．前記多形核白血球と前記赤血球との結 合度を測定する段階からなる方法。
20. ２０．ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、 前記ＣＤ１８に直接に結合するＣＲ３モジュレークの存在及び活性をアッセイす る試験キットであって、 Ａ．前記ＣＲ３モジュレータの所定量を含む溶液；Ｂ．静止相の多形核白血球標 本； Ｃ．Ｃ３ｂｉを被覆した赤血球標本； Ｄ．前記キットの使用説明書、を含むキット。
21. ２１．ＣＲ３モジュレータ産生を調整する能力について薬剤その他の物質をスク リーニングするアッセイ系であって、薬剤又は物質が接種されており、抽出物を 生じうる観察可能な細胞試験標本を含み、前記抽出物がＣＲ３モジュレータの存 在を検定されるようにしたアッセイ系において、前記ＣＲ３モジュレータがＣＤ １８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、前記ＣＤ１ ８レセプタに直接に結合するものでるアッセイ系。
22. ２２．前記細胞試験標本が多形核白血球からなる請求項２１記載のアッセイ系。
23. ２３．前記多形核白血球が作用物質により刺激される請求項２２記載のアッセイ 系。
24. ２４．前記作用物質が、ホルボールミリステン酸アセテート（ＰＭＡ）、血小板 活性因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ホルミル−ＮｏｒＬｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｐｈｅ（ｆＮＬＬＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ５ａ、及び これらの混合物からなる群より選ばれる請求項２３記載のアッセイ系。
25. ２５．ＣＲ３モジュレークの産生を調整する薬剤その他の能力をスクリーニング するアッセイ系であって、薬剤その他の物質を接種した観察可能な細胞試験標本 を含んでなり、この標本を、標本上でＣＤ１８分子が付着を媒介する能力を検定 するようにしたアッセイ系。
26. ２６．前記付着は、フィブリノーゲン、Ｃ３ｂｉ、リピド／Ｖａを被覆した表面 、及び内皮細胞に対して行われるものである請求項２５記載のアッセイ系。
27. ２７．細胞標本が多形核白血球からなる請求項２５記載のアッセイ系。
28. ２８．多形核白血球が作用物質である請求項２７記載のアッセイ系。
29. ２９．作用物質が、ホルポールミリステン酸アセテート（ＰＭＡ）、血小板活性 因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ホルミル−ＮｏｒＬｅｕ−Ｌｅｕ− Ｐｈｅ（ｆＮＬＬＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ５ａ、及びこれ らの混合物からなる群より選ばれる請求項２８記載のアッセイ系。
30. ３０．ＣＲ３モジュレータ活性に対して拮抗する能力を薬剤その他の物質に対し てスクリーニングするアッセイ系であって、薬剤その他の物質及び既知量のＣＲ ３モジュレータを接種した観察可能な細胞の試験標本からなり、前記薬剤あるい は物質の作用が、前記細胞の試験標本上で、結合相手との付着を媒介するＣＤ１ ８分子の減退した活性により測定するようにしたアッセイ系。
31. ３１．前記付着が、フィブリノーゲン、Ｃ３ｂｉ、リピド／Ｖａを被覆した表面 、及び内皮細胞に対して行われる請求項３０記載のアッセイ系。
32. ３２．細胞標本が多形核白血球である請求項３０記載のアッセイ系。
33. ３３．多形核白血球が作用物質である請求項３２記載のアッセイ系。
34. ３４．前記作用物質が、ホルポールミリステン酸アセテート（ＰＭＡ）、血小板 活性因子（ＰＡＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ホルミル−ＮｏｒＬｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｐｈｅ（ｆＮＬＬＰ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、Ｃ５ａ、及び これらの混合物からなる群より選ばれる請求項３３記載のアッセイ系。
35. ３５．ＣＲ３モジュレータ活性に対して拮抗する能力を薬剤その他の物質に対し てスクリーニングするアッセイ系であって、ＣＲ３モジュレータ及び前記薬剤そ の他の物質を接種した純粋なＣＤ１８分子からなり、前記薬剤あるいは物質の作 用が、純粋なＣＤ１８に対するＥＣ３ｂｉの減退した結合力により測定するよう にしたアッセイ系。
36. ３６．ＣＲ３モジュレータ活性に対して拮抗する能力を薬剤その他の物質に対し てスクリーニングするアッセイ系であって、ラベルしたＣＲ３モジュレータ及び 前記薬剤その他の物質を接種した観察可能な細胞の試験標本もしくは純粋なＣＤ １８からなり、前記薬剤あるいは物質の活性が、細胞の標本もしくは純粋なＣＤ １８に対するラベルされたＣＲ３モジュレータの減退に結合力により測定される アッセイ系。
37. ３７．細胞の試験標本が多形核白血球である請求項３５又は３６記載のアッセイ 系。
38. ３８．細胞の試験標本がセルラインビアリングＣＤ１８である請求項３５又は３ ６記載のアッセイ系。
39. ３９．血清又は水性媒体中のＣＲ３モジュレータを示す試験キットであって、Ａ ．ＣＲ３モジュレータ又はその特定の結合相手に直接又は間接に検出可能なラベ ルを着合させることにより得られる、所定量のラベルされた免疫化学的に反応性 のある成分（ここで前記ＣＲ３モジュレータは、ＣＤ１８の活性を高める作用物 質に応じて多形核白血球により合成され、前記ＣＤ１８に間接に結合する）； Ｂ．他の反応剤；及び Ｃ．前記キットの使用説明書、からなるキット。
40. ４０．試験対象から所定量の白血球を収集することを含む診断法であって、前記 白血球を収集する前に、十分な量の前記白血球の結合を阻止するために有効な、 ＣＲ３モジュレータの合成／活性に対する拮抗物質を、前記試験対象の内皮に投 与することからなり、この場合、前記ＣＲ３モジュレータは、ＣＤ１８の活性を 高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、ＣＤレセプタに直接結合 するものである診断法。
41. ４１．敗血症その他の感染性又は非感染性損傷中、肺その他の器官への白血球の 流入を抑制する方法であって、ＣＲ３モジュレータの合成／活性に対する拮抗物 質の治療量を投与することを含む方法において、前記ＣＲ３モジュレータが、Ｃ Ｄ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、ＣＤレセ プタに直接結合するものである方法。
42. ４２．前記拮抗物質が静脈内投与される請求項４１記載の方法。
43. ４３．前記拮抗物質が経口投与される請求項４１記載の方法。
44. ４４．白血球の流入が感染により生じる請求項４１記載の方法。
45. ４５．白血球の流入が非感染性外傷により生じる請求項４１記載の方法。
46. ４６．白血球の流入が内毒素ショックにより生じる請求項４１記載の方法。
47. ４７．白血球の流入が成人呼吸困難症により生じる請求項４１記載の方法。
48. ４８．感染が、髄膜炎、脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸クローン病、皮膚 炎、乾せん、及び成人呼吸困難症からなる群から選ばれる病的状態と関係してい る請求項４４記載の方法。
49. ４９．白血球の流入が、急性過敏症、慢性過敏症、宿主移植病、悪性貧血、糖尿 病、関節リウマチによる発赤、白血球漏出を含む疾病、抗原−抗体複合媒介疾病 、移植拒絶反応からなる群から選ばれる免疫不全の結果である請求項４１記載の 方法。
50. ５０．白血球の流入が、関節リウマチ、全身性エリマトーデス、マジョグレン氏 症、多筋炎、皮膚糸状菌症、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫多発神経炎、多発 硬化症、天ほうそう、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー氏症、心臓切開後遺 症、自己免疫甲状腺炎、グレーブス氏症、１型糖尿病、アジソン氏病、自己免疫 卵巣炎、自己免疫精巣炎からなる群から選ばれる免疫障害の結果である請求項４ １記載の方法。
51. ５１．敗血症その他の感染性あるいは非感染性外傷により生ずる炎症を有する患 者の肺その他の器官における炎症を治療する方法であって、治療を要する患者に 対してＣＲ３モジュレータの合成／活性の拮抗物質の治療量を投与することを含 む方法において、前記ＣＲ３モジュレータが、ＣＤ１８の活性を高める作用物質 に応じて多形核白血球により合成され、前記ＣＤ１８レセプタに直接結合するも のである方法。
52. ５２．前記拮抗物質が静脈内投与される請求項５１記載の方法。
53. ５３．前記拮抗物質が経口投与される請求項５１記載の方法。
54. ５４．白血球の流入が感染により生じる請求項５１記載の方法。
55. ５５．白血球の流入が非感染性外傷により生じる請求項５１記載の方法。
56. ５６．白血球の流入が内毒素ショックにより生じる請求項５１記載の方法。
57. ５７．白血球の流入が成人呼吸困難症により生じる請求項５１記載の方法。
58. ５８．感染が、髄膜炎、脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸クローン病、皮膚 炎、乾せん、及び成人呼吸困難症からなる群から選はれる病的状態と関係してい る請求項５４記載の方法。
59. ５９．白血球の流入が、急性過敏症、慢性過敏症、宿主移植病、悪性貧血、糖尿 病、関節リウマチによる発赤、白血球漏出を含む疾病、抗原−抗体複合媒介疾病 、移植拒絶反応からなる群から選ばれる免疫不全の結果である請求項５１記載の 方法。
60. ６０．白血球の流入が、関節リウマチ、全身性エリマトーデス、マジョグレン氏 症、多筋炎、皮膚糸状菌症、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫多発神経炎、多発 硬化症、天ほうそう、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー氏症、心臓切開後遺 症、自己免疫甲状腺炎、グレープス氏症、Ｉ型糖尿病、アジソン氏病、自己免疫 卵巣炎、自己免疫精巣炎からなる群から選ばれる免疫障害の結果である請求項５ １記載の方法。
61. ６１．抗感染物質が患者に投与される場合の炎症を除去するあるいは減少させる 方法であって、抗感染物質の投与前、投与と同時、あるいは投与後に、ＣＲ３モ ジュレータの合成／活性に対する拮抗物質の治療量を投与する方法において、前 記ＣＲ３モジュレータが、ＣＤ１８レセプタの活性を高める作用物質に応じて多 形核白血球により合成され、前記ＣＤレセプタに直接結合するものである方法。
62. ６２．前記抗感染物質がベータラクタム抗生物質である請求項６１記載の方法。
63. ６３．前記拮抗物質が静脈内投与される請求項６１記載の方法。
64. ６４．前記拮抗物質が経口投与される請求項６１記載の方法。
65. ６５．炎症が内毒素ショックにより生じる請求項６１記載の方法。
66. ６６．炎症が感染原因による成人呼吸困難症により生じる請求項６１記載の方法 。
67. ６７．炎症が、髄膜炎、脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸クローン病、皮膚 炎、乾せんからなる群から選ばれる病的状態と関係している請求項６１記載の方 法。
68. ６８．炎症が、急性過敏症、慢性過敏症、宿主移植病、悪性貧血、糖尿病、関節 リウマチによる発赤、白血球漏出を含む疾病、抗原−抗体複合媒介疾病、移植拒 絶反応からなる群から選ばれる免疫不全の結果である請求項６１記載の方法。
69. ６９．炎症が、関節リウマチ、全身性エリマトーデス、マジョグレン氏症、多筋 炎、皮膚糸状菌症、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫多発神経炎、多発硬化症、 天ほうそう、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー氏症、心臓切開後遺症、自己 免疫甲状腺炎、グレープス氏症、Ｉ型糖尿病、アジソン氏病、自己免疫卵巣炎、 自己免疫精巣炎からなる群から選ばれる免疫障害の結果である請求項６１記載の 方法。
70. ７０．哺乳動物における炎症の治療方法であって、哺乳動物に対し、ＣＲ３モジ ュレータの細胞レセプタに対するＣＲ３モジュレータの結合を遮断することので きる、ＣＲ３モジュレータに特異性のある物質、ＣＲ３モジュレータの合成を抑 制することのできる物質、ＣＲ３モジュレータの拮抗物質として作用することの できる物質、及びこれらの混合物、からなる群から選ばれた物質の炎症治療量を 投与することからなり、ここでＣＲ３モジュレータは、ＣＤ１８レセプタの活性 を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、前記ＣＤレセプタに直 接結合するものである方法。
71. ７１．敗血症その他の感染性又は非感染性損傷中、肺その他の器官への白血球の 流入を抑制する薬剤組成物であって、ＣＲ３モジュレータに対する拮抗物質の有 効量、及び薬学的に受け入れられる担体、を含み、前記ＣＲ３モジュレータが、 ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、ＣＤレ セプタに直接結合するものである組成物。
72. ７２．前記組成物が静脈内投与に適した形である請求項７１記載の組成物。
73. ７３．前記組成物が経口投与に適した形である請求項７１記載の組成物。
74. ７４．前記拮抗物質が感染症を治療するために十分な量存在する請求項７１記載 の組成物。
75. ７５．前記拮抗物質が非感染外傷と関係する炎症を治療するために十分な量存在 する請求項７１記載の組成物。
76. ７６．前記拮抗物質が内毒素ショックを治療するために十分な量存在する請求項 ７１記載の組成物。
77. ７７．前記拮抗物質が成人呼吸困難症を治療するために十分な量存在する請求項 ７１記載の組成物。
78. ７８．感染が、髄膜炎、脳炎、関節炎、ブドウ膜炎、炎症性腸クローン病、皮膚 炎、乾せん、及び成人呼吸困難症からなる群から選ばれる病的状態と関係してい る請求項７４記載の組成物。
79. ７９．前記拮抗物質が、関節リウマチ、全身性エリマトーデス、マジョグレン氏 症、多筋炎、皮膚糸状菌症、硬皮症、重症筋無力症、自己免疫多発神経炎、多発 硬化症、天ほうそう、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー氏症、心臓切開後遺 症、自己免疫甲状腺炎、グレープス氏症、Ｉ型糖尿病、アジソン氏病、自己免疫 卵巣炎、自己免疫精巣炎からなる群から選ばれる免疫障害を治療するために十分 な量存在している請求項５１記載の組成物。
80. ８０．哺乳動物における炎症治療のための製薬組成物であって、Ａ．ＣＲ３モジ ュレータの活性に対する拮抗物質、前記ＣＲ３モジュレータの合成を抑制するこ とができる物質、同等物及びその結合相手、これらの混合物、もしくはこれらに 特異性のある相手、からなる群より得られた治療有効量の物質であって、前記Ｃ Ｒ３モジュレータがＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球によ り合成され、前記ＣＤ１８レセプタに直接結合するものである物質；と Ｂ．薬学的に受け入れられるキャリア、とを含む組成物。
81. ８１．前記ＣＲ３モジュレータが酸性の両親和性脂質あるいは脂質状化合物であ り、強塩基で処理された後でもその活性を保持し、約３４０ダルトンの分子量を 有する請求項８０記載の組成物。
82. ８２．メバロン酸合成の生合成産物から由来し、イソプレノイド構造を有する請 求項８１記載の組成物。
83. ８３．ＣＤ１８の付着促進能力を活性化し、Ｃ３ｂｉの結合位置でレセプタＣＲ ３の結合を増大させ、内皮細胞、フィブリノーゲン被覆基質及び脂質ＩＶａに対 する多形核白血球結合力を増大し、ＬＦＡ−１に媒介される白血球付着力を増大 する請求項８０，８１もしくは８２項記載の組成物。
84. ８４．全血液によるＴＮＦの産生を誘導するものでなく、多形核白血球の脱顆粒 化を生じさせるものでない請求項８３記載の組成物。
85. ８５．哺乳動物における感染性及び非感染性疾病を治療するための製薬組成物で あって： Ａ．ＣＲ３モジュレータ、前記ＣＲ３モジュレータの合成及び／もしくは活性を 促進しうる物質、前記ＣＲ３モジュレータの活性を模倣しうる物質、及びその混 合物からなる群より選ばれた物質の治療有効量であり、前記ＣＲ３モジュレータ が、ＣＤ１８の活性を高める作用物質に応じて多形核白血球により合成され、前 記ＣＤ１８レセプタもしくはその特異性のある結合相手に直接結合するものであ る；及び Ｂ．薬学的に受け入れられるキャリア。
86. ８６．前記ＣＲ３モジュレータが酸性の両親和性脂質あるいは脂質状化合物であ り、強塩基で処理された後でもその活性を保持し、約３４０ダルトンの分子量を 有する請求項８５記載の組成物。
87. ８７．メバロン酸合成の生合成産物から由来し、イソプレノイド構造を有する請 求項８６記載の組成物。
88. ８８．ＣＤ１８の付着促進能力を活性化し、Ｃ３ｂｉの結合位置でレセプタＣＲ ３の結合を増大させ、内皮細胞、フィブリノーゲン被覆基質及びリピドＷａに対 する多形核白血球結合力を増大し、ＬＦＡ−１媒介白血球付着力を増大する請求 項８５，８６もしくは８７項記載の組成物。
89. ８９．全血液によるＴＮＦの産生を誘導するものでなく、多形核白血球の脱顆粒 化を生じさせるものでない請求項８８記載の組成物。