JPH06508261A - Increased expression by second transposed sequence in transformed organisms - Google Patents
Increased expression by second transposed sequence in transformed organismsInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 形質転換生物の第２転位配列による増加発現本発明は、形質転換生物の生産、そ うした方法に有用なりＮＡ調製およびそれによって生産される形質転換動物およ び植物に関する。[Detailed description of the invention] Increased expression by a second transposed sequence in a transformed organism The present invention relates to the production of a transformed organism, its NA preparation and the transgenic animals and animals produced thereby are useful for these methods. and plants.
多くの目的のために形質転換動物が開発され、それらのさらなる開発については 研究が続けられている。それらの用途の中で、形質転換動物は、組換えタンパク 質の生産に関して有力な解決法を提供する。特に、ＷＯ−Ａ−８８００２３９号 に示されているように、問題のタンノ＜り質をエンコードしている遺伝子の発現 は、ヒツジ、ヤギまたはウシのような形質転換家畜の乳腺を標的にすることがで き、該タンパク質生産物は、それらの乳から取り出すことができる。Transgenic animals have been developed for many purposes, and for their further development Research continues. Among their uses, transgenic animals are used to produce recombinant proteins. Providing powerful solutions regarding quality production. In particular, WO-A-8800239 The expression of the gene encoding the protein in question, as shown in can target the mammary glands of transgenic livestock such as sheep, goats or cows. The protein product can then be extracted from the milk.
乳中のタンパク質生産については形質転換動物の使用は、それらの発現が、乳腺 に向けることができるようにして、生殖系列の中に導入される外来遺伝子を必要 とする。他の器官または組織に発現の標的を定めることは、他の目的のために調 製された形質転換動物に重要である。動物の生殖系列の中への外来遺伝子の導入 は、乳中にヒト因子■およびヒトα１−抗トリプシンを発現するために設計した 遺伝子を運搬する形質転換ヒツジの生産を記載しているＷＯ−Ａ−８８００２３ ９号に示されている。乳腺にこうした形質転換（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ）の発現 を向けるために、とられた解決法は、乳タンパク質遺伝子から調節配列＜ｒｅｇ ｕｌａｔｏｒｙ ５ｅｑｕｃｎｃｅｓ）を理解することであり、そして問題の該 生産物の配列をコードしているタンパク質にそれらを接合することであった。実 際に、これは、種々のハイブリッド遺伝子構造物の性能を評価すべきモデル系と しての形質転換ネズミの使用を含んでおり、非常に短い世代時間の該ネズミは、 現実的なタイムスケールの範囲内で行なわれるべき実験を可能にしている。有用 である遺伝構造物として、それは、適度な頻度でかつ適用なレベルで選ばれたモ デル系に発現しなければならない。The use of transgenic animals for protein production in milk allows their expression to occur in the mammary gland. Requires a foreign gene to be introduced into the germline, allowing it to be directed to shall be. Targeting expression to other organs or tissues can be This is important for the produced transgenic animals. Introduction of foreign genes into the germ line of animals was designed to express human factor ■ and human α1-antitrypsin in milk. WO-A-880023 describing the production of transgenic sheep carrying the gene It is shown in No.9. Expression of these transgenes in the mammary gland The solution taken was to direct the regulatory sequence <reg It is important to understand the problem The goal was to conjugate them to a protein encoding the product sequence. fruit In particular, this is a model system in which the performance of various hybrid genetic constructs should be evaluated. This involves the use of transgenic mice as a very short generation time. It allows experiments to be conducted within realistic timescales. useful As a genetic construct that is It must be expressed in the del lineage.
自然と見なすことができる多くのゲノム乳タンパク質遺伝子（すなわち、動物の ゲルに発見されたＤＮＡ配列と同様の立体配置である遺伝子が単離され、前記単 離された遺伝子は、ゲノムクローンと称され、通常イントロンを含有している） は、形質転換ネズミに比較的効率よく発現することが示されている。参考文献と しては、特に、形質転換ネズミにヒツジのβ−ラクトグロブリンをコードしてい る遺伝子の発現に関しては、ＷＯ−Ａ−８８００２３９号の実施例７に著されて いる。他の例としては、ビロッテ（Ｖｉｌｏｔｔｅ）ら（ユーロ、ジエイ、バイ オケム、１８６４３−４８ （１９８９） （Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１ ８６４３−４８９（１９８９））とバイナ（Ｂａｙｎａ）ら（ヌク、アシッズ、 レス、１８２９７７−２９８５ （１９９０） （Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ 、Ｌ８２９７７−２９８５（１９９０））のシステムが挙げられる。すなわち、 こうしたゲノムクローンは、乳腺に効率よく発現を向けるために全ての必須調節 配列を含むようである。Many genomic milk protein genes that can be considered natural (i.e. A gene with a similar configuration to the DNA sequence found in the gel was isolated and The separated genes are called genomic clones and usually contain introns) has been shown to be expressed relatively efficiently in transgenic mice. References and In particular, transgenic mice encode sheep β-lactoglobulin. Regarding the expression of the gene, it is written in Example 7 of WO-A-8800239. There is. Other examples include Vilotte et al. Ochem, 18643-48 (1989) (Eur, J, Biochem, 1 8643-489 (1989)) and Bayna et al. Res, 182977-2985 (1990) (Nuc, Ac1ds, Res , L82977-2985 (1990)). That is, These genomic clones contain all essential regulatory controls for efficient targeting of expression to the mammary gland. It seems to contain an array.
また、問題のＤＮＡ配列をエンコードしているタンパク質に接合された乳タンパ ク質遺伝子の調節要素からなる多数のハイブリッド遺伝子は、形質転換ネズミで 評価されてオリ、ＷＯ−Ａ−８８００２３９号では、問題のタンパク質は、ヒト 因子■およびヒトα１−抗トリプシンであった。Also, a milk protein conjugated to a protein encoding the DNA sequence in question. A large number of hybrid genes consisting of regulatory elements of protein genes have been developed in transgenic mice. In WO-A-8800239, the protein in question was evaluated as factor ■ and human α1-antitrypsin.
しかしながら、このような多くの場合に、ハイブリッド遺伝子の発現レベルは、 商業目的として最適であるものよりかなり低いものである。前記相対的に不完全 に発現している構造物の共通の現象は、それらが使用している相接するＣＤＮＡ 配列で構成されており、それゆえそれらの自然イントロンを欠いていたことであ る。この課題は、外因性のタンパク質をエンコードし、いくつかの、しかし全て でない、それの自然イントロンを含んでいるゲノムからなる構造物の使用を明ら かにしたところのＷＯ−Ａ−９００５１８８号で扱われ、そして克服された。前 記構造物は、相対的に効率よく遂行された。However, in many such cases, the expression level of the hybrid gene is This is considerably lower than what is optimal for commercial purposes. said relatively incomplete A common phenomenon among structures expressed in sequences and therefore lacked their natural introns. Ru. This task encodes exogenous proteins and some, but not all revealed the use of a construct consisting of a genome that does not contain its natural introns. This problem was dealt with and overcome in WO-A-9005188. Before This construction was performed relatively efficiently.
しかしながら、いくつかの事情で、構造物に含まれている自然イントロンを避け ることがめられている。第１には、問題の多くのタンパク質についてはＤＮＡ配 列が、ＣＤＮＡ配列としてのみ有用であり、実際に、ゲノムＤＮＡを単離するこ とよりも標的組織中で多量に得られる組織に転写される対応するｍ ＲＮ Ａ配 列からＣＤＮＡ配列を調製することの方が非常に容易である。第２には、いくつ かの遺伝子は、非常に大きく、たとえそれらがエンコードするタンパク質でも相 じて大きくないものであり、非常に大きいサイズは、実用物質として困難な多数 のまたは全てのイントロンの介在物を作る。However, for some reasons, natural introns contained in constructs are avoided. It is believed that First, the DNA sequence of many of the proteins in question is sequence is useful only as a CDNA sequence and cannot actually be used to isolate genomic DNA. The corresponding mRNA sequence transcribed in the target tissue is more abundant than the target tissue. It is much easier to prepare CDNA sequences from sequences. Second, how many These genes are so large that even the proteins they encode are incompatible. The very large size makes it difficult to use as a practical material. of or all intronic inclusions.
したがって、形質転換として不十分に発現する構造物の発現の効率を高めること が必要である。前記不十分に発現している構造物は、ＣＤＮＡ配列よりなるもの を含むが、ＣＤＮＡ配列からなるものに制限されるものでない。本発明は、前記 方法に関係し、それに関して上記に記載された少なくともいくつかの課題に答え を提供する。本発明は、形質転換動物の生産に特定の適用を持つ一方、また、形 質転換植物の生産における本発明の使用が、それらの生産で同じような課題を解 決するために考慮される。Therefore, increasing the efficiency of expression of constructs that are poorly expressed as transformation is necessary. The poorly expressed construct consists of a CDNA sequence. but is not limited to those consisting of CDNA sequences. The present invention provides the above-mentioned relates to the method and answers at least some of the issues listed above with respect to it. I will provide a. While the invention has particular application in the production of transgenic animals, it also The use of the present invention in the production of transformed plants may solve similar problems in their production. will be taken into consideration to decide.
本発明の第１の目的によれば、第１のＤＮＡ配列を発現することのできる形質転 換動物または植物の調製方法において、該第２ＤＮＡ配列が、該第１配列なしの 状態で導入される場合に、発現のより大きな特異性でおよび／またはより大きな 頻度でおよび／または第１配列が第２配列なしに、形質転換として発現すること ができることよりもより高いレベルで形質転換として発現するかまたは、発現を 調節することができ、第１ＤＮＡ配列および第２ＤＮＡ配列を誘発することので きる動物または植物から細胞または細胞群に相互導入すること、および該細胞（ 群）から生ずるべき形質転換動物または植物を与えることよりなる該方法を提供 するものである。According to the first object of the present invention, a transfectant capable of expressing the first DNA sequence In the method for preparing a converted animal or plant, the second DNA sequence is a DNA sequence without the first sequence. with greater specificity of expression and/or with greater Frequently and/or the first sequence is expressed without the second sequence as a transformant Express as a transfectant at higher levels than is possible or since it can regulate and induce the first DNA sequence and the second DNA sequence. reciprocal introduction into a cell or group of cells from an animal or plant that can providing a transformed animal or plant to be derived from It is something to do.
トランスジェノシスの目的のために動物細胞に導入しているＤＮＡの最も一般に 用いられる方法は、注入（または時々称されるものであるような／、微注入）で ある。これは、本発明によって形質転換動物の生産に関する選択方法である。通 常、数百の線状分子のＤＮＡは、受精させた１つの細胞卵（ｃｅｌｌ ｅｇｇ） の前核（しばしば雄前核）に直接に微注入され、その後続いて、微注入された受 精卵は、凝妊娠の養母の輸卵管に移転され、そして発育がなされる。しかしなが ら、本発明は、紹介の当該方法に制限されるものでなく、どれでも適当な方法が 使用することができる。卵または胚細胞が、胚幹（ＥＳ）細胞であろう場合に、 使用することができる。The most commonly used DNA that is introduced into animal cells for the purpose of transgenosis. The method used is injection (or microinjection as it is sometimes referred to). be. This is the selection method for producing transformed animals according to the invention. General Usually, hundreds of linear molecules of DNA are present in a single fertilized cell egg. microinjected directly into the pronucleus (often the male pronucleus) and then subsequently The fertilized egg is transferred to the oviduct of the pregnant mother and allowed to develop. But long However, the present invention is not limited to this method of introduction, and any suitable method may be used. can be used. If the egg or embryonic cell is likely to be an embryonic stem (ES) cell, can be used.
形質転換植物は、通常、異なる方法によって、一般に調製される。むしろ、ＤＮ Ａは、従来技術、例えば、ＥＰ−Ａ−０１１６７１８号およびＥＰ−Ａ−０２７ ０８２２号に記載されているような良く知られた方法によって無害にした（ｄｉ ｓａｒｍｅｄ） Ｔ ｉプラスミドベクターを用いて植物細胞に形質転換され、 アグロバクテリウムによって運ばれる。Transformed plants are generally prepared by different methods. Rather, D.N. A is based on the prior art, for example EP-A-0116718 and EP-A-027 No. 0822, it was rendered harmless (di sarmed) Ti plasmid vector was used to transform the plant cells, Carried by Agrobacterium.
もしくは、外来ＤＮＡは、電気放電装置を用いて植物細胞に直接に導入すること ができた。当該方法は、アグロバクチリウムが効力のないものであること、例え ば、受容植物が単子葉植物であることが好ましいものである。また、あらゆる種 のあらゆる植物細胞の核ＤＮＡの中でＤＮＡの安定な取り込みについて提供する 任意の他の方法もまた、適当なものである。前記方法には、一般に遺伝子の形質 転換できない植物種に対する適当なそれらのものが含まれる。Alternatively, foreign DNA can be introduced directly into plant cells using an electrical discharge device. was completed. The method ensures that Agrobacterium is ineffective, e.g. For example, it is preferred that the recipient plant is a monocot. Also, all species provides stable incorporation of DNA into the nuclear DNA of every plant cell. Any other method is also suitable. The method generally involves genetic traits. Included are those suitable for plant species that cannot be converted.
上記に記載された方法でのＤＮＡの導入が、該形質転換が遺伝できるものである 前記方法において宿主のＤＮＡの中で（構造センスでなければ、少なくとも機能 上の）組込みに導くようである。したがって、相互導入（Ｃｏ−ｉ ｎｔ ｒｏ ｄｕｃｔｉｏｎ）は、相互組込み（ｃｏ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）に導く。相 互組込は、第１および第２ＤＮＡ配列が次世代に互いに分離する（例えば相互分 離する（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｅ））ことが前記方法で生じるが、これは、ゲ ノムにきわめて類似の物理的部位の組込みと一致している。Introduction of DNA by the method described above is such that the transformation is heritable. In the above method, the DNA of the host (if not structurally sense, then at least functionally) (above) seems to lead to the incorporation. Therefore, mutual introduction (Co-intro duction leads to co-integration. phase Mutual integration is when a first and second DNA sequence separates from each other in the next generation (e.g., when the first and second DNA sequences separate from each other) co-segregation occurs in the method, but this This is consistent with the incorporation of a physical site that is very similar to the nom.
第１および第２ＤＮＡ配列は、受容細胞中にそれらの混合物を導入することによ って（例えば、動物の系統的分類法の場合、注入によって）相互導入した（ｃｏ −１ｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）本発明の１つの実施態様である。しかしながら、２種 の配列が同時に導入されることは必要でなく、代わりに、連続の導入が、実際に 受け入れられることが見出だされている。The first and second DNA sequences are extracted by introducing a mixture of them into the recipient cell. co-introduced (e.g., by injection in the case of systematic taxonomy of animals). -1ntroduced) is one embodiment of the present invention. However, two types It is not necessary that arrays of are introduced simultaneously; instead, successive introductions actually It has been found acceptable.
また、相互導入は、共有結合でまたはそうでなければ連結している第１および第 ２ＤＮＡ配列によって達成され、２種の配列は、単一のＤＮＡ分子に連結される 。本発明の当該実施態様においては、導入されるべききわめて正確な構造物を目 的に適合するように調節することは可能であり、例えば、第１配列が、２種の第 ２配列の間にはさまれ、および／または縦列自然配列（すなわちそれらが頭−頭 か頭−尾かどうか）を決めることができる。Mutual introduction also refers to first and Achieved by 2 DNA sequences, two sequences are linked into a single DNA molecule . This embodiment of the invention aims at very precise structures to be introduced. For example, the first sequence can be adjusted to be compatible with the two types. sandwiched between two arrays and/or tandem natural arrays (i.e. they are head-to-head head-to-tail).
したがって、本発明の第１の方法は、相対的に役に立たない相互導入を含むこと がわかるが、好ましくは、相対的に効率よく発現している形質転換と共に形質転 換し、これは、染色体中の同じ部位でまたはお互いに近くの部位で相互組込みに 導くことができる。Therefore, the first method of the invention involves a relatively useless mutual introduction. However, it is preferable to perform transformation together with relatively efficiently expressed transformation. This is due to reciprocal integration at the same site in the chromosome or at sites close to each other. can lead.
第１ＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡまたは目的のタンパク質をエンコードしている他の ＤＮＡからなり、そして、形質転換の目的が発現であるならば、充分な調節配列 （例えば、助触媒を含んでいるもの）は、例えば、標的組織または器官に、発現 を向けるべ（タンパク質−エンコーディングＤＮ Ａ （ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎ ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ）に適切に連結させる。発現が哺乳動物の乳腺で標的され てなるものである場合に、調節配列は、乳タンパク質、特にβ−ラクトグロブリ ン、α−ラクトアルブミンまたは乳漿酸性タンパク質のような乳漿タンパク質か ら誘発することができる。目的のタンパク質は、形質転換において生産するおよ びできる探求された（糖タンパク質を含む用語としての）任意のタンパク質であ る。薬剤活性を有するもののような、高い価値のあるタンパク質は、本発明の使 用のために特別な候補である。例としては、インスリン、プラスミノーゲン活性 化因子、α１−抗トリプシン、因子■および■のような血液因子、タンパク質Ｃ およびエリトロポエチンが挙げられるが、これらに制限されるものではない。タ ンパク質−コーディンＤＮ Ａ （ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＤＮＡ）で 会合に用いられる調節配列は、５′および／または内部のおよび／または３′調 節配列である。The first DNA sequence is a cDNA or other protein encoding the protein of interest. DNA and, if the purpose of transformation is expression, sufficient regulatory sequences. (e.g., those containing co-catalysts), e.g. (Protein-encoding DNA A) (coding DNA). Expression is targeted in the mammalian mammary gland If the regulatory sequence consists of milk proteins, especially β-lactoglobulin whey proteins such as alpha-lactalbumin or whey acidic protein It can be induced by The protein of interest is produced during transformation. Any protein (as a term that includes glycoproteins) that can be Ru. High value proteins, such as those with pharmaceutical activity, are suitable for use in the present invention. is a special candidate for Examples include insulin, plasminogen activity blood factors, such as α1-antitrypsin, factors ■ and ■, protein C and erythropoietin, but are not limited to these. Ta Protein-coding DNA A (protein-coding DNA) The regulatory sequences used for association may include 5' and/or internal and/or 3' regulatory sequences. It is a clause array.
発現のより大きな特異性でおよび／またはより大きな頻度でおよび／または第１ 配列のみが、発現することができることよりもより高いレベル（しばしばより高 い平均レベル）で、第１配列なしで導入される場合に、第２ＤＮＡ配列は、形質 転換として、発現することができる。したがって、第２ＤＮＡ配列は、第１ＤＮ Ａ配列に比べて相対的に効率よく発現される。発現のより大きな効率は、発現の より大きな頻度によって達成することができる。発現のより大きな頻度は、動物 または植物または第１配列を現に発現する系列のより高い比串を意味し、これは 、事実上および経済上の両方で明らかに重要である。with greater specificity of expression and/or with greater frequency and/or with greater Only sequences that can be expressed at higher levels (often higher When introduced in the absence of the first sequence, the second DNA sequence has a It can be expressed as a transformation. Therefore, the second DNA sequence is similar to the first DNA sequence. It is expressed relatively efficiently compared to the A sequence. Greater efficiency of expression This can be achieved by greater frequency. The greater frequency of expression is in animals or the higher ratio of the plant or line that actually expresses the first sequence; , is clearly important both practically and economically.
第２配列は、遺伝子から誘発されるかまたは遺伝子によって構成されており、好 ましくは、それの会合された調節配列で成し遂げられ、通常、標的器官に発現す る。例えば、発現に関する標的器官が、乳腺である場合、第２ＤＮＡ配列は、乳 タンパク質遺伝子、また特にβ−ラクトグロブリンまたはα〜ラクトアルブミン のような乳漿タンパク質遺伝子またはαＳ１−カゼインのようなカゼイン遺伝子 から誘発されることが好ましいものである。該遺伝子は、第１゜ＤＮＡ配列に用 いられる調節配列が誘発されるものと同じである。第２配列は、人工構造物また は正常な遺伝子である。The second sequence is derived from or constituted by the gene and is preferably Preferably, it is achieved by its associated regulatory sequences and is usually expressed in the target organ. Ru. For example, if the target organ for expression is the mammary gland, the second DNA sequence Protein genes, and especially β-lactoglobulin or α~lactalbumin whey protein genes such as or casein genes such as αS1-casein It is preferable that it be induced from. The gene is used in the first DNA sequence. The regulatory sequences that are present are the same as those that are induced. The second array is an artificial structure or is a normal gene.
形質転換は、本発明によって動物の多くの器官に発現され、該乳腺は、一実施例 に過ぎない。植物においては、形質転換の発現は、必要であれば、ある組織につ いて特異的であってもよい。Transformations can be expressed in many organs of animals according to the invention, the mammary gland being one example. It's nothing more than that. In plants, the expression of transformation can be expressed in certain tissues, if necessary. It may also be specific.
本発明の第２の目的によれば、第１ＤＮＡ配列を発現する形質転換動物または植 物の調製に有用なりＮＡにおいて、第２ＤＮＡ配列が、第１配列なしで形質転換 として導入される場合に、発現のより大きな特異性でおよび／またはより大きな 頻度でおよび／または第１配列が第２配列なしで形質転換として導入される場合 に、発現することができることよりもより高いレベルで発現するかまたは発現を 調節することができる、同じまたは別の分子上の、第１配列および第２ＤＮＡ配 列からなる該ＤＮＡを提供するものである。According to a second object of the invention, a transformed animal or plant expressing the first DNA sequence In the NA that is useful for the preparation of products, the second DNA sequence can be transformed without the first sequence. with greater specificity of expression and/or with greater frequency and/or when the first sequence is introduced as a transformation without the second sequence. to be expressed or expressed at a higher level than can be expressed. a first sequence and a second DNA sequence on the same or another molecule that can be modulated; The present invention provides the DNA consisting of sequences.
第１および第２ＤＮＡ配列は、リンカ−配列でまたはリンカ−配列なしに、該配 列が共有結合で結合されたとみなされる場合に、同じＤＮＡ分子上に体現するこ とができる。The first and second DNA sequences are linked together with or without a linker sequence. When sequences are considered to be covalently linked, they cannot be embodied on the same DNA molecule. I can do it.
もしくは、第１および第２ＤＮＡ配列は、異なるＤＮＡ分子上に与えることがで きる。この場合には、該ＤＮＡは、前記分子の混合物の形かまたは該分子の別の 調製キットをとることができる。Alternatively, the first and second DNA sequences can be provided on different DNA molecules. Wear. In this case, the DNA is in the form of a mixture of said molecules or another of said molecules. Preparation kits are available.
本発明は、単一の第１配列および単一の第２配列の存在に制限されるものではな い。多数の相対的に役に立たずに発現している第１配列は、１またはそれ以上の 相対的に効率よく発現している第２配列によって強化され、そして多数の第２配 列は、１またはそれ以上の第２配列を強化する。The invention is not limited to the existence of a single first sequence and a single second sequence. stomach. A large number of relatively useless expressed primary sequences may contain one or more Enhanced by a relatively efficiently expressed second sequence, and a large number of second sequences The columns reinforce one or more second arrays.
相対的に役に立たずに発現している第１配列に比べて、過剰に存在する多数の相 対的に効率よく発現している第２配列が好ましいものである。例えば、第２配列 の２〜５または１０コピーが、１つの第１配列のコピーごとに存在することがで きる。Compared to the first sequence, which is expressed relatively useless, many complementary sequences exist in excess. A second sequence that is efficiently expressed in contrast to the second sequence is preferred. For example, the second array There may be 2 to 5 or 10 copies of each copy of one first sequence. Wear.
本発明の第３の目的によれば、形質転換として第１配列を発現することのできる 形質転換動物または植物において、該第２配列が該第１配列なし形質転換として 導入される場合に、発現のより大きな特異性でおよび／またはより大きな頻度で および／または第１配列が、第２配列なしで形質転換として発現される場合に、 発現することができるものよりもより高いレベルで発現するかまたは発現を調節 することができる、第１配列および第２配列を有する前記動物または植物を提供 するものである。According to a third object of the invention, the first sequence can be expressed as a result of transformation. In the transformed animal or plant, the second sequence is transformed without the first sequence. with greater specificity of expression and/or with greater frequency when introduced. and/or when the first sequence is expressed as a transformant without the second sequence, Express or regulate expression at a higher level than what can be expressed providing said animal or plant having a first sequence and a second sequence capable of It is something to do.
動物の場合、適当な種としては、（ａ）実施できるもの、および（ｂ）その目的 が、所望の分子の生産に対して本発明を使用することである場合に、実用的な用 途で充分な収率を得ることができるものが挙げられる。マウス、ラット、ハムス ターおよびモルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ）を含む鋸歯動物のような小動 物は、いくつかの適用に関して適当なものであり、ウシ、ヒツジ、ヤギおよびブ タのような家畜動物は、その他に関して好ましいものである。In the case of animals, suitable species include (a) those that can be carried out, and (b) their purpose. is to use the invention for the production of desired molecules. Examples include those that can provide a sufficient yield during the process. mouse, rat, humus Small animals such as serrats, including tar and guinea pigs The product is suitable for several applications, including cattle, sheep, goats and cattle. Domestic animals such as cods are otherwise preferred.
植物の場合、本発明は、意図した適用によって単子葉植物と双子葉植物の両方の 種々の種に適用できる。In the case of plants, the invention applies to both monocotyledonous and dicotyledonous plants, depending on the intended application. Applicable to various species.
本発明の第２および第３の目的の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、第１の 目的のそれと同じである。Preferred features of the second and third objects of the invention are, mutatis mutandis, It is the same as the purpose.
本発明は、以下の実施例によって説明がなされ、比較例で対照されるであろう。The invention will be illustrated by the following examples and contrasted with comparative examples.
該実施例および比較例は、次の図面を参照されたい。For the Examples and Comparative Examples, please refer to the following drawings.
図１は、ヒツジのβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の遺伝子を含む、クローンラ ムダ（λ）Ｓ８１の制限地図を示す。Figure 1 shows a clonal clone containing the ovine β-lactoglobulin (BLG) gene. A restriction map of Muda (λ) S81 is shown.
図２は、マウスおよびヒツジの乳漿タンパク質（比較例２）のＳＤＳ ＰＡＧＥ 分析を示す。Figure 2 shows SDS PAGE of mouse and sheep whey proteins (Comparative Example 2). Show analysis.
図３は、ウサギ抗−β−ラクトグロブリン血清を用いた図２のゲルのウェスタン プロットを示す。Figure 3 is a Western representation of the gel of Figure 2 using rabbit anti-β-lactoglobulin serum. Show the plot.
図４ａおよび４ｂは、プラスミドｐＢＪ１６の構成（比較例４）を示す。Figures 4a and 4b show the construction of plasmid pBJ16 (Comparative Example 4).
図５は、ＢＬＧおよびＡＡＴＤの同時注入（ｃｏ−１ｎｊｅｃｔｉ。Figure 5 shows co-injection of BLG and AATD.
ｎ）によって生じるマウスからのサザンプロットを示し、バンド１が、ＢＬＧ− 特異的バンドであり、バンド２がＡＡＴＤ−特異的バンドである２種の形質転換 （実施例１）の相互分離（ｃｏ−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を表わす。Southern blot from a mouse generated by n), band 1 is BLG- Two transformations in which band 2 is a specific band and band 2 is an AATD-specific band. (Example 1) represents the co-segregation of (Example 1).
図６は、本発明に従ってマウスにＡＡＴＤ形質転換の組織特異的な発現を表わし ているハイブリッド形成実験の結果を示しているノーザンプロットを示す（実施 例１）。Figure 6 depicts tissue-specific expression of AATD transformation in mice according to the present invention. A Northern plot showing the results of a hybridization experiment (performed) is shown. Example 1).
図７は、バンド１がＡＡＴＤ−特異的なバンド（約１６００ｎｔ）であり、バン ド２がＡＡＴＢ−特異的なバンド（約１４００ｎ ｔ）であり、そしてバンド３ がＢＬＧ−特異的なバンド（約８００ｎ ｔ）である本発明に従ってマウスに２ 種の形質転換の存在を示すハイブリッド形成実験の結果を示しているノーザンプ ロットを示す。In Figure 7, band 1 is an AATD-specific band (approximately 1600 nt); Band 2 is the AATB-specific band (approximately 1400 nt), and band 3 is a BLG-specific band (approximately 800 nt) in mice according to the present invention. Northamp showing the results of a hybridization experiment indicating the presence of transformation of species. Indicates lot.
図８は、バンド１がＢＬＧ−特異的なバンドであり、バンド２がＦＩＸＤ−特異 的なバンドであり、そしてバンド３が非特異的な（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆ ｉｃ ）接合バンドであるＦｒＸＤおよびＢＬＧの相互分離を示しているノーザンプロ ットである（実施例２）。In Figure 8, band 1 is a BLG-specific band and band 2 is a FIXD-specific band. Band 3 is a non-specific band. ) Northern protein showing mutual separation of junction bands FrXD and BLG. (Example 2).
図９は、ＢＩＸ系列にＦＩＸＤの組織−特異的な発現を示す（実施タリ２）。Figure 9 shows tissue-specific expression of FIXD in the BIX series (Example 2).
図１０は、バンド１が内因性マウスｆｌＸ転写物（約２６００ｎ ｔ）であり、 バンド２がＦＩＸＡ５１中のＢＬＧ−ＦＩＸ転写物であり、バンド３がＦＩＸＤ 転写物であり、そしてバンド４がＢＬＧ転写物であるＢＩＸマウス中のＦＩＸＤ およびＢＬＧ転写物の検出を図示するノーザンブロノトである。FIG. 10 shows that band 1 is the endogenous mouse flX transcript (approximately 2600 nt); Band 2 is the BLG-FIX transcript in FIXA51, and band 3 is FIXD. FIXD in BIX mice and band 4 is a BLG transcript. and Northern Blonotes illustrating detection of BLG transcripts.
そして図１１は、β−ラクトグロブリン／ウシα−ラクトアルブミン構造物の構 成を示す。Figure 11 shows the structure of the β-lactoglobulin/bovine α-lactalbumin construct. Indicates completion.
比較例１ 特に詳細に述べなかった点は、組換えＤＮＡおよび分子生物学的方法は、マニア ティスら（「モレキュラー クローニング」コールド スプリングハーバ−（１ ９８２））［リコンビナント ＤＮＡＪメソッズ イン エンザイモロジイ ボ リューム６８． （アール、ウーによる編集）。Comparative example 1 One point I did not discuss in particular detail is that recombinant DNA and molecular biological methods are This et al. ("Molecular Cloning" Cold Spring Harbor (1) 982)) [Recombinant DNAJ Methods in Enzymology Bo Rhium 68. (Edited by Earl, Wu).
アカデミツク プレス（１９７９）、「リコンビナントＤＮＡ パートＢ」メソ ッズ イン エンザイモロジイボリューム１００（ウー、グロスマンおよびモー ルドデー１２編集）、アカデミツク プレス（１９８Ｂ）、「リコンビナント ＤＮＡ パートＣ」メソッズ イン エンザイモロジイ ボリューム１０１（ウ ー、グロスマンおよびモールドデー１２編集）、アカデミツク プレス（１９８ ３）および「ガイド ツウ モレキュラー クローニングテクニックス」メソッ ズ イン エンザイモロジイ ボリューム１５２（ニス、エル、ベルガー＆エイ 、アール。Academic Press (1979), “Recombinant DNA Part B” Meso Enzymology Volume 100 (Wu, Grossman and Mau (edited by Ruday 12), Academic Press (198B), “Recombinant DNA Part C” Methods in Enzymology Volume 101 (U) (Eds., Grossman and Moldday 12), Academic Press (198 3) and the “Guide to Molecular Cloning Techniques” method. Zuin Enzymology Volume 152 (Niss, L., Berger & A. ,R.
キメールによる編集）、アカデミツク プレス（１９８７）（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ（”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎ４ｎｇ”Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂ。Edited by Kimeru), Academic Press (1987) (Maniatis et al(“Mo1ecular C1on4ng” Co1d Sprin g Harb.
ｒ（１９８２））”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｉｅ ８８．（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒ，Ｗｕ ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９７９）；”ＲｅｃｏｍｂｉｎＧｒｏｓ ｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄｇａｖｅ、Ｅｄｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ ｓ（１９８３）；”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｐａｒｔ Ｃ”Ｍｅｔｈ ｏｄｓ ｉｎ ｔ：ｎｚｙｍｏ＋ｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ｉｏｔ、（７ｕ、Ｇｒ ｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄｇａｖｅ、Ｅｄｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ（１９８３）； ａｎｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｒｌ Ｅｎｚｙｍｏｔ ｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ １５２（ｅｄｉｔｅｄ ｂＹ Ｓ、Ｌ、Ｂｅｒｇｅｒ＆ Ａ、Ｒ，Ｋｉｍｍｃｌ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７））にした がった。特にことわらない限り、すべての化学品は、イングランド、ドーセ・ノ ド、プールのビーエッチディ ケミカルズ レルテイデイまたはイングランド、 ビーセット、プールのシグマ ケミカル カンパニー（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌ ｓ Ｌｔｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ ｏｒ Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、Ｅｎｇｌａｎ ｄ）から購入した。一般に、すべてのＤＮＡ変更酵素（ｍｎｄｉｔｙｉｎｇ ｇ ｎｚｙｍｃｓ）および制限エンドヌクレアーゼは、イギリス国、ニースト サセ ックス ビーエヌ７１エルシイ、ルイス、ベル ラン、ベーリンガー マンハイ ム ハウス、ビイシーニル社（ＢＣＬ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ Ｈｏｕｓｅ、Ｂｅ１ｌ Ｌａｎｅ、Ｌｅｗｅｓ、Ｅａｓｔ ５ｕｓｓｅｘ ＢＮ７ １ＬＧ、ＵＫ）力）ら購入した。r (1982)) “Recombinant DNA” Methods in Enzymology Volume 88. (edited by R, Wu ), Academic Press (1979); “RecombinGros sman and Moldgave, Eds), Academic Pres. s (1983); “Recombinant DNA part C”Meth ods int:nzymo+ogy Volume iot, (7u, Gr ossman and Moldgave, Eds), Academic Pr. ess (1983); and Guide to Mo1ecular Cl oning Techniques”, Methodsirl Enzymot ogy Volume 152 (edited bY S, L, Berger & A, R. Kimmcl), Academic Press (1987)) I got angry. Unless otherwise noted, all chemicals are manufactured by Doce Nord, England. Do, pool's bhcd chemicals lertidei or england, B-Set, Pool's Sigma Chemical Company (BDH Chemical s Ltd, Poole, Dorset, England or Sigma Chemical Company, Poole, Dorset, England Purchased from d). In general, all DNA modifying enzymes nzymcs) and restriction endonucleases were manufactured by Nyst Sasse, UK. x BN71 Elsie, Lewis, Bell Run, Boehringer Mann High Mu House, BCL, Boehringer Mannhei m House, Be1l Lane, Lewes, East 5ussex Purchased from BN7 1LG, UK).
［略号：ｂｐ−塩基対、ｋｂ−キロベースペア、ＡＡＴ−ヒトα１−抗トリプシ ン、ＢＬＧ−ヒツジβ−ラクトグロブリン、ＦＩＸ＝因子■、Ｅ、ｃｏｌｉ−大 腸菌、ｄＮＴＰｓ−デオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、制限エンドヌ クレアーゼは、例えばＢａｍＨＩのように略語で示し、制限エンドヌクレアーゼ の部位の後ろに一〇の付加、例えば、ＰｖｕＩＩ−０は、認識部位が破壊される ことを表わす。］ ヒツジ肺臓ＤＮＡの調製 膵臓組織は、新たに屠殺した黒綿羊／サフォーク種の羊から調達し、核は、バー チ（ＢｕｒＣｈ）およびウニイントララブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）によって書か れたセル３３ ６５ （１９８３）と実質的に同様にして単離した。核ペレット は、０゜３ＭのＮａＣ１，１０ｍＭのトリスＨＣΩ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ、ｐＨ７，４および４００ｇｇ／ｍ１のプロテナーゼ Ｋ（ビーセット ビーエッチ１７７エヌエツチ、プーレ、ファンシー ロード、シグマ カンパニ ー（Ｓｌｇｍａ Ｃｏ、Ｐａｎｃｙ Ｒｏａｄ、Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ Ｂ Ｈ１７７ＮＨ）に溶解され、３７℃で２時間培養された。繰返しフェノール／ク ロロフォルム抽出は、該調製が完全に除タンパクされるまで行われた。該ＤＮＡ は、エタノール沈殿され、ガラス棒を用いて巻き取られ、７０％ＥｔＯＨ／３０ ％ＴＥ（ＴＥ＝１０ｍＭのトリスＨＣｆＩ％ｐＨ８，０の１ｍＭのＥＤＴＡ）で 洗浄され、大気中で乾燥され、そして１ｍｇ／ｍｇの濃度でＴＥに再懸濁された 。[Abbreviations: bp-base pair, kb-kilobase pair, AAT-human α1-antitryptic BLG-ovine β-lactoglobulin, FIX=factor ■, E, coli-large Enterobacteriaceae, dNTPs-deoxyribonucleotide triphosphates, restriction endonucleases Crease is designated by the abbreviation, e.g. BamHI, restriction endonuclease. Addition of 10 after the site, for example, PvuII-0, destroys the recognition site. represents something. ] Preparation of sheep lung DNA Pancreatic tissue was sourced from freshly slaughtered black cotton sheep/Suffolk sheep; Written by BurCh and Weintraub. Cell 33, 65 (1983). nuclear pellet 0°3M NaCl, 10mM TrisHCΩ, 10mM EDTA, 1% SDS, pH 7.4 and 400 gg/ml proteinase K (Beset) BH 177 NH, Poulet, Fancy Road, Sigma Company -(Slgma Co, Pancy Road, Poole, Dorset B H177NH) and cultured at 37°C for 2 hours. Repeated phenol/chlorine Loloform extraction was performed until the preparation was completely deproteinized. the DNA was ethanol precipitated, rolled up using a glass rod, and diluted with 70% EtOH/30 %TE (TE = 10mM Tris-HCfI% pH 8,0 1mM EDTA) Washed, dried in air, and resuspended in TE at a concentration of 1 mg/mg. .
ヒツジ肺臓ＤＮＡλ融合遺伝子の構成 λファージＥＭＢＬ３ （フリシャラフらジエイ０モル。Structure of sheep lung DNAλ fusion gene λ phage EMBL3 (Hrisharaf et al. 0 mol.
パイオル、（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ ｅｔ ａｔ Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、） １ ７０ ８２７ （１９８３）’）は、ゲノムライブラリーを構成するた目に用い られた。３０μｇのバクテリオファージＤＮＡは、製造業者によってすすめられ た条件で用いる（イングランド、パツキンガムシア、エールズベリー、グリーン エンド、リンカン ブレイスのアメルシャム インターナショナル ビーエル シー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｉｅ、Ｌｉｎｃｏｌ ｎ Ｐｌａｃｅ、Ｇｒｅｅｎ Ｅｎｄ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈ ａｍｓｈｊｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって供給される）５倍過剰の制限酵素Ｅ ｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化された。消化後、スペルミン塩酸塩が、λＤＮ Ａを沈殿すべく５ｍＭの濃度で添加された。氷上で゛１時間インキュベーション 後、該ＤＮＡは、ペンチミクロフユージ（Ｂｅｎｃｈ ｔｒｉｃｒｏｆｕｇｅ＞ に１５分間１０，０００ｇでベレットされ、７０％ＥｔＯＨ，３００ｍＭのＮａ Ａｃ。Biol, (Frischauf et at J, Mo1. Biol,) 1 70 827 (1983)') is used to construct a genomic library. It was done. 30 μg of bacteriophage DNA was recommended by the manufacturer. (England, Packinghamshire, Aylesbury, Green) End, Lincoln Brace of Amersham International B.L. Amersham International pie, Lincoln n Place, Green End, Aylesbury, Bucking amshjre, England) 5-fold excess of restriction enzyme E Digested with coRI and BamHI. After digestion, spermine hydrochloride is converted into λDN was added at a concentration of 5mM to precipitate A. Incubate on ice for 1 hour After that, the DNA was extracted from Bench tricrifuge. pelleted at 10,000 g for 15 min, 70% EtOH, 300 mM Na Ac.
１００ｍＭのＭｇＣｊＪ２で洗浄され、再ペレットされ、そして最後に１ ｍ ｇ／ｍΩの濃度でＴＥに再懸濁された。Washed with 100mM MgCjJ2, re-pelleted and finally 1 m resuspended in TE at a concentration of g/mΩ.
ヒツジＤＮＡは、制限酵素５ａｕ３Ａ （アメルシャム製（Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ ））で部分的に消化された。１００μｇアリコートの該ヒツジＤＮＡは、３７℃ で２０分間５ａｕ３Ａの種々のｉ！ ［５−４０ユニツト］で消化された。該反 応は、１５ｍＭまでＥＤＴＡの添加によって停止された。消化の程度は、０．６ ％アガロースゲルによる電気泳動によって評価した。適当に消化されたサンプル は、プールされ、ＩＭのＮａＣΩ、２０ｍＭのトリスＨＣ，５ｍＭのＥＤＴＡで ｐＨｓ、０に調製された１０〜４０％ショ糖勾配の３８゜０ｍｇの上に充填され た。これらの勾配は、２４時間２６゜０００ｒｐｍでベックマン ニスダブリ！ −（ＢＥＣＫＭＡＮＮ ５Ｗ）２８のローターで遠心分離された。（ベックマ ン ニスダブりニー（ＢＥＣＫＭＡＮＮ ＳＷ） ２８の語句は、商標である。The sheep DNA was prepared using restriction enzyme 5au3A (manufactured by Amersham (A+nersham)). )) was partially digested. A 100 μg aliquot of the sheep DNA was incubated at 37°C. 5au3A for 20 minutes with various i! [5-40 units] were digested. Applicable The reaction was stopped by the addition of EDTA to 15mM. The degree of digestion is 0.6 % agarose gel electrophoresis. properly digested sample were pooled and prepared in IM NaCΩ, 20mM Tris-HC, 5mM EDTA. Loaded onto 38°0 mg of a 10-40% sucrose gradient prepared at pHs 0. Ta. These gradients were run at 26°000 rpm for 24 hours. - (BECKMANN 5W) Centrifuged with a 28 rotor. (Becma BECKMANN SW 28 is a trademark.
）。).
該ショ糖勾配は、該頂部から分別され、１ｍ、１２の分画が採取された。各分画 でのＤＮＡ分子のサイズ分布は、アガロースゲル電気泳動によって評価され、サ イズで１４〜２１ｋｂのＤＮＡ分子を含む分画がプールされた。ＴＥで２倍に希 釈後、ＥｔＯＨの２容積が添加され、該ＤＮＡが一２０℃で一晩沈殿された。続 いて、該ＤＮＡは、３００ｇｇ／ｍｌ）の濃度までＴＨに再懸濁された。The sucrose gradient was fractionated from the top and 1 m, 12 fractions were collected. Each fraction The size distribution of DNA molecules in the sample was evaluated by agarose gel electrophoresis. Fractions containing DNA molecules of 14-21 kb were pooled. Twice as rare with TE After diluting, 2 volumes of EtOH were added and the DNA was precipitated at -20°C overnight. Continued The DNA was resuspended in TH to a concentration of 300 gg/ml).
７−５１１ｇのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩは、ＥＭＢＬ３を切断し、５ａｕ３Ａで 部分的に消化された２、５μｇのヒツジ肺臓ＤＮＡは、６０ｍＭのトリスＨＣＩ 、６ｍＭのＭｇｃｌ ２．１０ｍＭのＤＤＴ、Ｏ−０１％ゼラチン、０゜２５ ｍＭのｒＡＴＰおよび２５ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼ（ニースト サセック ス、ルイス、ベル ラン、べ一リンガー マンハイム ハウス、ベーリンガー カンパニー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｈｏｕｓｅ、Ｂｅ１ｌＬａｎｅ、Ｌｅｗｅｓ、Ｅａｓｔ ５ ｕｓｓｅｘ））を含む５０．ｃｌの溶液と共に混合され、１４℃で一晩培養され た。7-511g BamHI/EcoRI cleaves EMBL3 and 5au3A A few 5 μg of partially digested sheep lung DNA was added to 60 mM Tris-HCI. , 6mM Mgcl, 2.10mM DDT, O-01% gelatin, 0°25 mM rATP and 25 units of 74 DNA ligase (Neast Sussek) Su, Lewis, Bell Rann, Behringer Mannheim Haus, Boehringer Company (Boehringer Company, Boehringer Mannheim House, Be1l Lane, Lewes, East 5 50. cl solution and incubated overnight at 14°C. Ta.
連結反応後、該ＤＮＡの１μｇアリコートが、製造業者のすすめる方法に伴うア メルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から購入したキットを用いてインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で包装された。該包装されたライブラリーは、大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｌ）菌株ＥＤ８６５４により濃度滴定（ｔｉｔｒｅｄ）された。該ライブラリ ーの算出したサイズは、５．７Ｘ１０６ブラ一ク形成単位（ｐｆＵ）であった。After the ligation reaction, a 1 µg aliquot of the DNA was ligated according to the manufacturer's recommended method. In vitro using a kit purchased from Amersham. It was packaged in vitro. The packaged library is an E. coli ll) Titred with strain ED8654. the library The calculated size was 5.7×106 Black Forming Units (pfU).
滴定の直後、非増幅されたライブラリーのアリコートは、約５０．０００ｐ ｆ ｕ／プレートの密度で大腸菌菌株ＥＤ８６５４を用いて１０Ｘ１０Ｘ２２のペト リ皿（巨大プレート）の上に塗布された。Immediately after titration, an aliquot of the non-amplified library was approximately 50.000 pf 10X10X22 cells using E. coli strain ED8654 at a density of u/plate. It was applied on a large plate.
λゲノムライブラリーの選別 巨大プレートからプラーク−リフト（Ｐｌａｑｕｅ−１１ｆｔｓ）が、２００ｍ ２のニトロセルロース膜（シュレイチャーおよびジュール、ポストファッチ ４ ．Ｄ−３３５４，ジャーマー−−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒａｎｄ ５ｃｈｕｌｌ 、Ｐｏ５ｔｆａｃｈ ４．Ｄ−３３５４，Ｇｅｒｍａｎｙ））の上にベントンお よびディビス（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ） （サイエンス １９６ １８０ （１９７７））の方法に従って行われた。β−ラクログロブリンｃＤＮ Ａクローン（パリ。Selection of λ genomic library The plaque lift (Plaque-11fts) is 200m from the giant plate. 2 nitrocellulose membrane (Schleicher and Joule, Postfatch 4 ．． D-3354, Germer--(Schleicherand 5chull , Po5tfach 4. D-3354, Germany) Benton and Davis (Science 196) 180 (1977)). β-lacroglobulin cDN A Clone (Paris)
ジョエニーーエノージョサス、ｌＲＮＡ、ジュー。シー。JOENIE ENO JOSUS, lRNA, JEW. C.
メルサイアーのｐ９３１−ギフト（ｐ９３１−ｇｉｆｔ ｏｆ Ｊ、Ｃ，Ｍｅｒ ｃｉｅｒ、 ＩＮＲＡ、Ｊｏｕｅｙ−ｅｎ−Ｊｏｓａｓ、Ｐａｒｆｓ））は、リ ッグバイ（Ｒｉｇｂｙ）ら（ジエイ１モル、パイオル、（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、） １１３２３７ （１９７７）’）によって記載された方法によって、１１ ０８ｄｐ／ｍｃ ｇより大きい比活性に３２ｐのｄＣＴＰで翻訳された切れ目で あった。β−ラクログロブリンｃＤＮＡは、バイオシミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ） ６７ ９５９−９７１（１９８５）にメルサイア−（Ｍｅｒｃｉｅｒ）らに よって記載された同様にしてクローン化されたものである。該ｐ９３１クローン の配列は、バイオシミー（旧ｏｃｈ１ｍｉｅ） ６８． １０９７−１１０７ （１９８６）にゲエイ（Ｇａｙｅ）らによって与えられた。フィルターは、セル １５ ６８７ （１９７８）でのマニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの方法 に従って、前対合（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉ ５ｅｄ）され、対合され、そして洗 浄された。最終洗浄は、６８℃でｌＸ５ＥＴ （ＳＥＴとは、０．１５ＭのＮａ Ｃｊ７，２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３ｍのトリスＨＣｆｉでｐＨ８，０である） の中で行った。フィルターは、乾燥状態に乾かされ、フィルムをＸ線にさらす前 にそれらを配向させるために３２ｐでスポットされた。明確に対合しているプラ ークを含む部位は、バストウールピペットの殺菌した鈍い端を用いてつついた（ ｐｉｃｋｅｄ）３２Ｐスポツトとの関係によって巨大プレート上の位置が定めら れた。該最初のプラーク−リフトは、大腸菌ＥＤ８６５４で滴定され、約５００ ／プレートのプラーク密度で直径１５ｃｍのペトリ皿の上に塗布された。これら のプレートは、上述された方法によって再選別され、個々の明らかに対合されて いるプラークは、ファージ緩衝液（ファージ緩衝液は、１０ｍＭのトリスＨＣ１ ，１０ｍＭのＭｇＣｆ１２．０．０１％ゼラチン、ｐＨ７，４である）の１．０ ｍ１に小ようじを用いて０．４ｍｇの再懸濁されたファージ溶液が、大腸菌ＥＤ ８６５４ （ボーズら モル、ジエン、ジエネティクス（Ｂｏｒｇ ｅｔ ａｔ Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） １４６ １９９−２０７ （１９７６ ））に添加され、バクテリア菌叢の融合溶菌を得るために直径９ｃｍペトリ皿上 に十分に塗布された。密集プレー） （Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ｐｌａｔｅｓ）は 、１０ｍｇのファージ緩衝液中にすり落とされ、数滴のクロロフォルムと共に一 晩培養された該頂部ブレーティングアガロースから得られた。細菌砕片は５分間 ５０００ｒｐｍで遠心分離によってペレット化され、該ファージ株が４℃で保存 された。該株は、ｐｆｕ／ｍΩ数を決定するために大腸菌ＥＤ８６５４によって 滴定された。p931-gift of J, C, Mer cier, INRA, Jouey-en-Josas, Parfs)) Rigby et al. 113237 (1977)') With a cut translated by 32p dCTP to a specific activity greater than 08dp/mc g there were. β-Lacroglobulin cDNA is produced by Biochimie. ) 67 959-971 (1985) to Mercier et al. Therefore, it was cloned in the same manner as described. The p931 clone The sequence is Biosimi (formerly och1mie) 68. 1097-1107 (1986) by Gaye et al. The filter is a cell 15, 687 (1978), the method of Maniatis et al. According to the prehybridi5ed, paired and washed Purified. The final wash was carried out at 68°C with lX5ET (SET is 0.15M Na Cj7, 2mM EDTA, pH 8.0 in 0.03m Tris HCfi) I went inside. The filter is dried to a dry state before exposing the film to X-rays. were spotted with 32p to orient them to . Plastics that clearly match The site containing the arc was poked using the sterile blunt end of a bust wool pipette ( The position on the giant plate is determined by the relationship with the 32P spot (picked). It was. The initial plaque-lift was titrated with E. coli ED8654 and approximately 500 / plate onto a 15 cm diameter Petri dish. these The plates were resorted by the method described above and paired to reveal individual Plaques with phage buffer (phage buffer is 10 mM Tris HCl) , 10mM MgCf12.0.01% gelatin, pH 7.4) Using a small toothpick, add 0.4 mg of the resuspended phage solution to E. coli ED. 8654 (Borg et al. Mol, diene, genetics (Borg et at Mo1. Gen, Genetics) 146 199-207 (1976 )) on a 9 cm diameter Petri dish to obtain fused lysis of the bacterial flora. was sufficiently applied. Confluent plates are , scraped into 10 mg of phage buffer and combined with a few drops of chloroform. Obtained from the top plated agarose grown late. Bacterial debris for 5 minutes The phage strain was pelleted by centrifugation at 5000 rpm and stored at 4°C. It was done. The strain was tested by E. coli ED8654 to determine the pfu/mΩ number. titrated.
８Ｘ１０７ｐｆｕは、３７℃で１０ｍ１の１０ｍＭのＭｇＳＯ４中で７Ｘ１０９ 大腸菌セルの上に吸収された。１５分後、２．５ｍ１アリコートが、１１フラス コ中の１００ｍΩのエル ブロース（Ｌ Ｂｒｏｔｈ） ／ １０ ｍＭのＭｇ ＳＯ４に添加された。該バクテリアの再懸濁は、数時間激しく浸とうされ、０Ｄ ５４０が全時間監視された。該０Ｄ５４０における減退（ｆａｌｌ）によって決 定されるような溶菌は、数字間後に生じた。仕上げる場合、０．２ｍΩクロロフ ォルムが各１００ｍΩ培養に添加され、該培養物は、−晩４℃で放置された。8X107 pfu is 7X109 in 10ml 10mM MgSO4 at 37°C. absorbed onto the E. coli cells. After 15 minutes, 1 aliquot of 2.5 ml has 11 fl. 100mΩ L Broth / 10mM Mg in Added to SO4. The bacterial resuspension was immersed vigorously for several hours and 0D 540 were monitored all the time. Determined by the fall in the 0D540. Bacteriolysis, as determined, occurred after several hours. For finishing, 0.2 mΩ Chlorof was added to each 100 mΩ culture and the culture was left overnight at 4°C.
上記細菌砕片は、１５分間１０．０００ｒｐｍで遠心分離にって除去された。１ ０Ｍｇ／ｍ、ＱのＲＮＡ５ｅ Ａおよび１０Ｍｇ ／ ｍΩのＤＮＡ５ｅ Ｉが 、該上澄みに添加され、その後、１時間３７℃で培養された。当該インキュベー ション後、ＮａＣ１が４０ｇ／β添加され、１０％までポリエチレングリコール （Ｐ Ｅ Ｇ）が添加された。該調製は、４°Ｃまで冷却され、該ファージを沈 殿すべく少なくとも２時間放置された。該ファージペレットは、１５分間１０． ０００でペレット化され、１６ｒｒ＋１のファージ緩衝液中に再懸濁された。８ ．ＯｍｆＩの当該懸濁液は、１４゜０ｍｇの超遠心分離管に（ファージ緩衝液中 に溶解した）１、 ５ｍ、Ｑの５６％ＣｓＣ，ｉｌｌ、１．５ｍ１の４５％Ｃｓ ＣΩおよび２．５ｍｇの３１％Ｃｓ Ｃ，ｉｌｌからなる段階（ｓｔｅｐ）勾配 として加層された。該段階勾配は、２０℃でスイングアウトローターで１．５時 間、３５．０００ｒｐｍで遠心分離を行った。該ファージバンドは、針または注 射器で除去され、そして該ファージ粒子の精製を完成するために、第２の段階勾 配の遠心分離が行われた。The bacterial debris was removed by centrifugation at 10,000 rpm for 15 minutes. 1 RNA5e A of 0 Mg/m, Q and DNA5e I of 10 Mg/mΩ are , was added to the supernatant and then incubated for 1 hour at 37°C. The incubation After lysis, 40g/β of NaCl was added and polyethylene glycol was added to 10%. (PEG) was added. The preparation was cooled to 4°C to precipitate the phages. It was left for at least two hours to be preserved. The phage pellet was incubated for 15 minutes at 10. 000 and resuspended in 16rr+1 phage buffer. 8 ．． The suspension of OmfI was added to a 14°0 mg ultracentrifuge tube (in phage buffer). ) 1, 5m, 56% CsC in Q, ill, 45% Cs in 1.5ml Step gradient consisting of CΩ and 2.5 mg of 31% Cs C,ill It was added as The step gradient is 1.5 hours with a swing-out rotor at 20°C. During this period, centrifugation was performed at 35,000 rpm. The phage band is a second step gradient to complete the purification of the phage particles. Centrifugation of the sample was performed.
該精製したファージ粒子は、０．１ＭのＮａＣ，Ｑ、１０ｍＭトリスＨＣ，Ｑ 、１ｍＭＥＤＴＡＳｐＨ８，０の中に透析され、その後、フェノールおよびクロ ロホルムを用いた連続抽出によって除タンパクされた。ＮａＣρ、０．３Ｍの最 終濃度で添加され、その後、ファージＤＮＡは、ＥｔＯＨの２体積の添加によっ て沈殿された。該ＤＮＡは２０分間１０．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離によってペレ ット化され、７０％ＥｔＯＨ１３０％ＴＥで洗浄され、乾燥され、その後２００ −４００ｐｇ／ｍｌの最終濃度までＴＥに再懸濁された。The purified phage particles were mixed with 0.1M NaC,Q, 10mM Tris HC,Q , dialyzed into 1mM EDTA S pH 8.0, followed by phenol and chloride. Proteins were deproteinized by sequential extractions with Roform. NaCρ, the maximum of 0.3M The phage DNA was added at the final concentration and then quenched by adding 2 volumes of EtOH. It was precipitated. The DNA was incubated for 20 minutes at 10. Pellet by centrifugation at OOOrpm. washed with 70% EtOH 130% TE, dried, and then dried at 200 ml. - resuspended in TE to a final concentration of 400 pg/ml.
組換えβ−ラクトグロブリンクローンの特徴前記に記載された０、５μｇアリコ ートのＤＮＩＩ製試料は、種々の制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙ ｍｅｒ） 、および０゜６％および１％アガロースゲルでの電気泳動によって分 析された単一または複消化物の生産物によって制限された。Characteristics of recombinant β-lactoglobulin clones 0.5 μg aliquots as described above The original DNII sample was treated with various restriction enzymes. mer) and separated by electrophoresis on 0°6% and 1% agarose gels. limited by single or double digest products analyzed.
こうしたゲルのＤＮＡは、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）の方法（ジエイ９モル、 パイオル、（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ）９８５０３ （１９７５））によってハイ ボンド（１４ＹＢＯＮＤ）膜（アメルシャム インターナショナル、リトル チ ャルフォント、パックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌ ｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｓ）に関するニトロセルロースフィル ターに移され、そして標識したｐ９３１の３２ｐに対合された。使用された該生 産物は、本質的に上記に記載されたものと同様であり、そして該対合されたフィ ルターは、オートラジオグラフィーによって分析された。５′および３′末端の ｐ９３１制限地図から使用している多くの制限酵素および特異的なプローブが組 立てられ、そしてβ−ラクトグロブリン遺伝子の大きさおよび配向が決定された （図１参照）。The DNA in these gels was prepared using the method of Southern (9 mol. Biol, (J, Mo1. Biol) 98503 (1975)). 14YBOND membrane (Amersham International, Little Town) font, Pax (Amersham International, L nitrocellulose fill (Chalfont, Bucks) and was paired with labeled 32p of p931. The raw material used The product is essentially as described above and Luther was analyzed by autoradiography. 5' and 3' ends Many of the restriction enzymes and specific probes used were assembled from the p931 restriction map. were constructed and the size and orientation of the β-lactoglobulin gene was determined. (See Figure 1).
同一のβ−ラクトグロブリンクローンおよび、正確な位置の該５′および３゛末 端の遺伝子は、ＤＮＡ配列決定によって直接に確認された。使用している適当な 制限部位および断片は、プラスミドベクターおよびＭ１３ベクター中でサブクロ ーン化された。配列決定は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ方法（ピ ーエヌアイエス（ＰＮＡＳ） ７４ ５４６Ｂ （１９７７））を用いて行われ た。Identical β-lactoglobulin clones and the 5' and 3' ends in the correct locations The terminal genes were directly confirmed by DNA sequencing. suitable for use Restriction sites and fragments are subcloned in plasmid vectors and M13 vectors. It has been turned into a Sequencing was performed using the dideoxy method of Sanger et al. - Performed using PNAS 74 546B (1977)) Ta.
形質転換マウスにヒツジβ−ラクトグロブリンをエンコードしている遺伝子の発 現 形質転換マウスは、本質的にメソード イン エンザイモロジイ １０１巻（１ ９８３）、（ウー、グロースマンおよびモルデーブ編集）、アカデミツクアカデ ミツク プレス ｐｐ４１１〜４３２においてゴートンおよびルードル（Ｇｏｒ ｄｅｎ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ、ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ ｏｇｙ Ｖｏｌ １０１（１９８３）、（Ｅｄｓ、Ｗｕ、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａ ｎｄ Ｍｏ１ｄａｖｅ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓｐｐ４Ｌ１−４３２） によって書かれた技術によって発生された。Expression of the gene encoding ovine β-lactoglobulin in transgenic mice current The transgenic mouse is essentially a method in Enzymology Volume 101 (1 983), (edited by Wu, Grossman and Moldave), Academia Mitsuku Press, pp411-432, Gorton and Rudol (Gorton den and Ruddle, in Methods in Enzymol ogy Vol. 101 (1983), (Eds, Wu, Grossman a nd Moldave, Academic Presspp4L1-432) Generated by technology written by.
クローンλ５Ｓ−１（図１）の１６．２ｋｂの５ａｌＩ断片を運搬するいくらか の形質転換マウスが生産された。これらの１種、Ｂ−Ｌａｃ７、雌は、５ａｌＩ 断片の１５〜２０コピーを運搬することがわかった。Ｂ−Ｌａｃ７は、多くの回 数交配させ、５Ｓ−Ｉ配列を遺伝した多くの子孫が生産された。Some cells carrying the 16.2 kb 5alI fragment of clone λ5S-1 (Figure 1) of transgenic mice were produced. One of these, B-Lac7, female is 5alI It was found to carry 15-20 copies of the fragment. B-Lac7 has been used many times. Several crosses were made and many progeny were produced that inherited the 5S-I sequence.
乳は、−腹の子（ｌｉｔｔｅｒ）の誕生後８〜１２日のマウスから得られた。こ れは、４時間の間に前もって取り除いた状態にし、２０分間待ち、その後手で個 々の乳腺をマツサージした後で、０．３ＩＵオキシトシン（シグマ）＆７μｇ／ ｇ動物のヒブノルム／ヒブノベル（Ｈｙｐｎｏｒｍ／Ｈｙｐｎｏｖｅｌ）（フレ ッケニル、ベット、シック。１９８３年１２月１０日、ｐ ５７４ （Ｆｌｅｃ ｋｎｅｉｌ、Ｖｅｔ、Ｐｅｃ、Ｄｅｃ １０１９８３．ｐ５７４））の腹膜腟内 注射によって成し遂げられた。乳は、５０ｐｇ毛細管に採取された。Milk was obtained from mice 8-12 days after litter birth. child This should be pre-removed for 4 hours, then waited 20 minutes and then manually removed. After pine surgery of each mammary gland, 0.3 IU oxytocin (Sigma) & 7 μg/ g Animal Hypnorm/Hypnovel (French) Okkenil, Bet, Chic. December 10, 1983, p. 574 (Flec kneel, Vet, Pec, Dec 101983. p574)) peritoneal vaginal accomplished by injection. Milk was collected into 50 pg capillary tubes.
マウス乳は、蒸留水に１：５の割合に希釈され、脱脂するためにベンチ遠心分離 機内で簡単に遠心分離され、カゼインが４．６の最終ｐＨになるまでＩＮのＨＣ Ｎの添加によって沈殿された。ベンチ遠心分離機内で遠心分離後、乳漿タンパク 質が取り除かれ、５％トリクロロ酢酸で沈殿され、そしてラエミール化ａｅｍｍ ｌｉ） （ネーチャー ２７７゜６８０−６８４ （１９７０）（図２には、マ ウスおよびヒツジの乳漿タンパク質のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。）レーン１ は遺伝標識タンパク質、２は正常マウス乳漿、３はヒツジ乳漿、４は正常マウス 乳漿、５はＢ−１ａｃ７乳漿、６はＢ−１ａｃ７乳漿（２，５Ｘ５）である。該 遺伝標識飛跡およびヒツジ乳漿中のβ−ラクトグロブリンに対応する該バンドは 矢印で示した。）にしたがってポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析さ れた。ヒツジβ−ラクトグロブリンに対してウサギ内で高められた抗血清は、ゲ ル電気泳動によって分解されたサンプルでウェスタンブロッティング（バーネッ ト、アナラ、バイオケム、 （Ｂｕｒｎｅｔｔ、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅａ＋、 ） 、１１２． １９５〜２０３ （１９８１））によってヒツジβ−ラクトグ ロブリンを検出するために用いられた。図３は、ウェスタンプロット分析を示す 。該ウェスタンプロットは、ウサギ抗β−ラクトグロブリン血清および抗つサギ Ｉｇペルオキシダーゼ血清と反応された。Mouse milk was diluted 1:5 in distilled water and bench centrifuged to defatte. Briefly centrifuged in-flight and HC IN until the casein reaches a final pH of 4.6. Precipitated by addition of N. After centrifugation in a bench centrifuge, whey proteins The protein was removed, precipitated with 5% trichloroacetic acid, and the laemyl aemm li) (Nature 277°680-684 (1970) (Figure 2 shows the SDS PAGE analysis of mouse and sheep whey proteins is shown. ) lane 1 is genetically marked protein, 2 is normal mouse whey, 3 is sheep whey, 4 is normal mouse whey Whey, 5 is B-1ac7 whey, 6 is B-1ac7 whey (2,5X5). Applicable The genetic marker track and the band corresponding to β-lactoglobulin in sheep whey are Indicated by an arrow. ) analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis according to It was. Antiserum raised in rabbits against sheep β-lactoglobulin was Western blotting (Burnet) with samples resolved by electrophoresis Burnett, Anal, Biochea+, ), 112. 195-203 (1981)) used to detect Robulin. Figure 3 shows Western blot analysis . The Western blot was performed using rabbit anti-β-lactoglobulin serum and anti-heron serum. It was reacted with Ig peroxidase serum.
（レーン１は遺伝標議タンパク質、２はヒツジ乳漿、３はＢ−１ａｃ７乳漿、４ は正常マウス乳漿、５は精製したβ〜ラクトグロブリン、６はクーマシー着色し たヒツジ乳漿（ｎ平行の実験（ｒｕｎ ｎ ｐａｒａｌｌｅｌ））である。）。(Lane 1 is genetic standard protein, 2 is sheep whey, 3 is B-1ac7 whey, 4 is normal mouse whey, 5 is purified β-lactoglobulin, and 6 is Coomassie-stained. sheep whey (run n parallel). ).
この分析は、β−ラクトグロブリンがマウス乳の中に分泌されたことを示し、５ Ｓ−１がＢ−１ａｃ７に高レベルで発現されであることを表わしている。当該ク ローンは、おそらく、形質転換マウスの乳腺に高レベルの発現を確かめるために 必要な配列をすべて含む、すなわち、類似の種、すなわち形質転換ヒツジに、も はや同様でないとしても、有効に作用することを予期することができる。したが って、当該クローンから誘発した融合遺伝子は、またヒツジ乳腺に（効率よく） 発現することが予期される。This analysis showed that β-lactoglobulin was secreted into mouse milk and showed that 5 This shows that S-1 is expressed at high levels in B-1ac7. The relevant Perhaps to confirm high levels of expression in the mammary glands of transgenic mice. Contains all the necessary sequences, i.e. also in similar species, i.e. transgenic sheep. Although it is no longer the same, it can be expected to work effectively. However, Therefore, the fusion gene induced from the clone was also (efficiently) introduced into the sheep mammary gland. expected to occur.
比較例３ λ５３−１ （図７）から１０．５ｋｂの５ａｌＩ−ＸｂａＩ断片が、１６．２ ｋｂの５ａｌＩ断片（シモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ）ら（ネーチャー ３２８ ５３ ０−５３２ （１９８７）参照）の代わりに用いられた以外は、比較例２の方法 に従った。λ５Ｓ−１から誘発した該１０．５ｋｂ断片は、そのプラスミド上の ＸｂａＩおよび５ａｌＩ部位でプラスミドｐＰｏｙｌ （ＷＯ−Ａ−８８００２ ３９号およびレイズ（Ｌａｔｈｅ）ら（ゲン（Ｇｅｎｅ）５７ １９３−２０１ （１９８７））の中にクローン化された。得られたプラスミドは、ｐＳＳ １ ｔ ｇＸＳと称された。高レベルの発現が、再度得られた。Comparative example 3 The 10.5 kb 5alI-XbaI fragment from λ53-1 (Fig. 7) is 16.2 kb 5alI fragment (Simons et al. (Nature 328 53) 0-532 (1987))) was used instead of the method of Comparative Example 2. I followed. The 10.5 kb fragment derived from λ5S-1 was Plasmid pPoyl (WO-A-88002 No. 39 and Lathe et al. (Gene) 57 193-201 (1987)). The obtained plasmid is pSS1 It was called tgXS. High levels of expression were again obtained.
β−ラクトグロブリン融合遺伝子の同化乳腺に発現したα１−抗トリプシンに対 してヒツジβラクトグロブリンおよびＤＮＡコーディング（ｃｏａｔｎｇ）から のＤＮＡ配列要素よりなる同化している融合遺伝子について使用した戦略（ｓｔ ｒａｔｅｇｙ）は、本実施例に書かれている。図４ａおよび４ｂは、該方法を総 括する。該解決法は、λクローンである、ヒツジβ−ラクトグロブリンに関する 遺伝子を含むλ５Ｓ−１から誘発される配列を利用し、そしてその単離および特 徴は、ＷＯ−Ａ−８８００２３９号（ファーマス−ティカル プロテインズ エ ルティディ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｌｔｄ）およ びアリ＆クラーク（１９８８）ジャーナル オブ モレキュラー バイオシミー １９９ 、４１５−４２６ （Ａｌｉ＆ＣＩａｒｋ（１９８８）Ｊｏｕｒｎａ ｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９．４１５−４２６）に よって概説されている。Assimilation of the β-lactoglobulin fusion gene against α1-antitrypsin expressed in the mammary gland from sheep β-lactoglobulin and DNA coding (coatng) The strategy used for assimilating fusion genes consisting of DNA sequence elements of st rate) is written in this embodiment. Figures 4a and 4b summarize the method. summarize. The solution concerns ovine β-lactoglobulin, which is a lambda clone. Utilizing sequences derived from λ5S-1 containing genes and their isolation and characterization The characteristics are as per WO-A-8800239 (Pharmaceutical Proteins E. Lutidi (Pharmaceutical Proteins Ltd) and Biari & Clark (1988) Journal of Molecular Biosimy 199, 415-426 (Ali & CIark (1988) Journal l of Molecular Biology 199.415-426) Therefore, it is outlined.
特に、構造物ＡＡＴＤの同化が記載されている。当該構造物は、ＢＬＧ配列によ って隣接したヒトα１−抗トリプシンに関するｃＤＮＡを含む。該５′フランキ ング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列は、５ａｌＩからＰｖｕＩＩ−ＯＢＬＧ配列まで を含む。該ＢＬＧとＡＡＴ配列との間の融合点は、該ＢＬＧ第１構造配列の該５ ゛−翻訳されていない領域内にある。該３′フランキング配列は、ＢＬＧの構造 配列６および７、およびＸｂａ１部位と同じくらい離れたＢＬＧ遺伝子の該３′ フランキング配列からなる。当該構造物は、介在配列を含まず、試験するために 設計されたであろうとなかるうといずれにせよ、上記に記載された５゛および３ ゜ＢＬＧ配列は、ＡＡＴに関するそれによって例示されるようにヒト血漿タンパ ク質をエンコードしているｃＤＮＡの有効な哺乳類の特異的な発現に向けるのに 充分である。In particular, the assimilation of structure AATD is described. The structure is based on the BLG sequence. Contains the cDNA for adjacent human α1-antitrypsin. The 5' Franchi The flanking sequence is from 5alI to PvuII-OBLG sequence. including. The fusion point between the BLG and the AAT sequence is the 5th point of the BLG first structural sequence. - Located in an untranslated area. The 3' flanking sequences conform to the structure of BLG. sequences 6 and 7, and the 3' of the BLG gene as far away as the Xba1 site. Consists of flanking arrays. The construct does not contain any intervening sequences and is 5 and 3 as described above, whether designed or otherwise. The BLG sequence is human plasma protein as exemplified by that for AAT. To direct efficient mammalian-specific expression of cDNA encoding protein That's enough.
プラスミドｐｓｓ１ｔｇｓｐＸ （ＷＯ−Ａ−８８００２３９号に記載された）ｐｓｓｌｔ ｇＸｓから約６．６ ｋｂの５ｐｈＩ−ＸｂａＩ制限断片を精製したゲルは、ｓｐｈ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化された（同ＷＯ−Ａ−８８００２３９号に記載された）ｐＰｏｌｙｌ（ レイズ、ビロッティ＆クラーク化ａｔｈｅ、 Ｖｉ Ｉｏｔｔｅ＆ＣＩａｒｋ） 、１９８７．ジエネ（Ｇｅｎｅ） ５７ 、 １９３−２０１ ）を精製したゲ ルにＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合された。Plasmid pss1tgspX Approximately 6.6 from psslt gXs (described in WO-A-8800239) The gel purified 5phI-XbaI restriction fragment of sphI and XbaI pPolyl (described in WO-A-8800239) digested with I Rays, Bilotti & Clark athe, Vi Iotte & CIark) , 1987. Gene 57, 193-201) The DNA was ligated to the DNA using T4 DNA ligase.
［ベクターｐＰｏ １ ｙ Ｉは、フランス国、ストラスプール。[Vector pPo 1 y I Strasspool, France.
６７０８５、ルー ヒユーマン １１．ＬＧＭＥ−ＣＮＲ８およびＵ１８４ Ｉ ＮＳＥＲＭ、アール、レイズ教授（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｒ，Ｌａｔｈｅ、ＬＧ ＭＥ−ＣＮＲ３ａｎｄ Ｕ１８４１ＮＳＥＲＭ、１１ ｒｕｅ Ｈｕａ＋ａｎｎ 、６７０８５．Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、Ｆｒａｎｃｅ）から自由に入手できる。67085, Lou Heuman 11. LGME-CNR8 and U184 I NSERM, Professor R, Lathe, LG ME-CNR3and U1841NSERM, 11 rue Hua+ann , 67085. Strasbourg, France).
］。充分な大腸菌株ＤＨＲａ （ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） −Ｂ ＲＬ ）の形質 転換後、適当なりローンは、制限酵素分析によって同定された。]. Characteristics of sufficient E. coli strain DHRa (Gibco-BRL) After conversion, suitable clones were identified by restriction enzyme analysis.
プラスミドｐＢＪ５ ｐｓｓｌｔｇｓｐＸから該由来の複製を含んでなるＰｖｕｌｌ制限断片を精製し たゲルは、［自己結合を促進するために（ルーシエ＆ハワードーフランダース（ １９８５）ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｒｕｓｃｈｅ＆Ｈａｗａｒｄ− Ｆｌａｎｄｅｒｓ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｅｃｈ ） １３ 、 １９９７−２００８）］ １１ｍのへキサミン塩化コバルト、２ ５ｍＭのＫＣＩの存在下でＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて自己結合された。充分 な大腸菌株ＤＨＲａ （ギブニア （Ｇｉｂｃｏ） −Ｂ ＲＬ ）の形質転換 後、適当なりローンは、制限酵素分析によって同定された。Plasmid pBJ5 The Pvull restriction fragment comprising the derived copy was purified from pssltgspX. [To promote self-association] [Lucier & Howard-Flanders] 1985) Nuclear Acid Research (Rusche & Howard- Flanders (1985) Nucleic Ac1ds Re5eaech ) 13, 1997-2008)] 11m hexamine cobalt chloride, 2 Self-ligated using T4 DNA ligase in the presence of 5mM KCI. sufficient Transformation of E. coli strain DHRa (Gibco-BRL) Afterward, suitable clones were identified by restriction enzyme analysis.
プラスミドｐＵＣβ１ａｃＡ オズウエルＤＮＡサービス、デパートメント オブ ケミストリー、ユニバーシ ティ オブ ニブインバラ（ＯｓｗｅｌＩ ＤＮＡ ５ｅｒｖｉｃｅ、Ｄｅｐａ ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ、ＬＩｎｉｖｅｒｓｌｔｙ ｏｆＥ ｄｉｎｂｕｒｇｈ）によって合成した、ヒツジβ−ラクトグロブリンｃＤＮＡ配 列（ガイ（Ｇａｙｅ）ら（１９８６）バイオシミー（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ） ６ ８． １０９７−１１０７）の塩基１１７−１５９を含む、２種の好意的な（ｃ ｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ） ４４マー（４４−ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドは 、５ａｉｌおよび５ｔｙｒの好意的な末端を生じるためにアニールされた。アニ ールされたオリゴヌクレオチドは、その後、β−Ｌｇ９３１（ゲイ（Ｇａｙｅ） ら、オブ ジット（ｏｐ ｃｉｔ））を精製したゲルおよびＳａｌｌ−３ｍａＩ で消化されてなるｐＵｃ１９（ユナイデット キングダム、エムケイ９３エツチ ビー。Plasmid pUCβ1acA Oswell DNA Service, Department of Chemistry, University Tea of Nibuinburgh (Oswel I DNA 5service, Depa rtment of Chea+1stry, LIniverslty ofE ovine β-lactoglobulin cDNA sequence synthesized by (Gaye et al. (1986)) Biochimie 6 8. 1097-1107) and two favorable (c complementary) 44-mer oligonucleotide is , 5ail and 5tyr were annealed to produce favorable ends. Ani The purified oligonucleotide was then transformed into β-Lg931 (Gaye). et al., object (opcit) purified gel and Sall-3maI pUc19 (United Kingdom, MK93H) digested with Bee.
パックス、セントラル ミルトン ケインズ、ミツドサマー ブルヴアード、フ ァーマシカ ハウス、ファーマシカーエルケイビイ バイオチクノロシイ（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ Ｂｉ。Pax, Central Milton Keynes, Midsummer Boulevard, Fu Pharmacica House, Pharmacica L.K. Biochiknoloshii (Ph armacia-LKB Bi.
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｏｕｓｅ、Ｍｉｄｓｕｍｍｅｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ、Ｂｕｃ ｋｓ、ＭＫ９３ＨＰ、ＬＩＫ））を精製したゲルの等モル量にＴ４ ＤＮＡリガ ーゼを用いて結合された。充分な大腸菌株ＪＭ８３ （メッシング（１９７９） リコンビナント ＤＮＡ テクニカル プリチン、ＮＩＨパブリケーション Ｎ ｏ、７９−９９．２．Ｎｏ、２ （１９７９）、４３−４８参照（ｓｅｅ Ｍｅ ｓｓｉｎｇ （１９７９）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃａ ｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ、７９−９９．２ ．Ｎｏ、２（１９７９） 、４３−４８））の形質転換後、適当な組換体は、制 限分析によって定量された。technology, Pharmacia House, Midsummer Boulevard, Central Milton Keynes, Buc ks, MK93HP, LIK)) was added to an equimolar amount of the gel purified with T4 DNA ligator. conjugated using conjugatease. Sufficient E. coli strain JM83 (Messing (1979) Recombinant DNA Technical Puritin, NIH Publication N o, 79-99.2. No. 2 (1979), 43-48 (see Me ssing (1979) Recombinant DNA Technica l Bulletin, NIH Publication No. 79-99.2 ．． No. 2 (1979), 43-48)), suitable recombinants are Quantified by limit analysis.
プラスミドｐＢＪ７ プラスミドｐＵＣβ１ａｃＡからＨｉｎｃｌＩ−３ｍａ■制限断片を精製したゲ ルは、Ｓｍａ Ｉでの部分的な消化によって線状にしたｐＢＪ５を精製したゲル にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合された。充分な大腸菌株ＤＨ５α（ギブコ （Ｇｉｂｃｏ） −Ｂ ＲＬ ）の形質転換後、適当なりローンは、制限酵素分 析によって画定された。Plasmid pBJ7 The HinclI-3ma restriction fragment was purified from the plasmid pUCβ1acA. The gel was prepared by purifying pBJ5 linearized by partial digestion with SmaI. were ligated using T4 DNA ligase. Sufficient E. coli strain DH5α (Gibco (Gibco)-BRL), a suitable clone is prepared with restriction enzymes. determined by analysis.
プラスミドｐＢＪ８ ｐＢＪ８から該由来の複製を含んでいるＰｖｕｌＩ制限断片を精製したゲルは、 ［自己結合を促進するために（ルーシエ＆ハワードーフランダース（１９８５） ヌクレイツク アシッド リサーチ（Ｒｕｓｃｈｅ＆Ｈａｗａｒｄ−Ｆｌａｎｄ ｅｒｓ （１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｅｃｈ）１ ３ ． １ ９９７−２００８） コ １ｍＭのへキサミン塩化コバルト、２５ｍＭ のＫＣＩの存在下でＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて自己結合された。充分な大腸 菌株ＤＨ５α（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） −Ｂ ＲＬ ）に形質転換後、適当なり ローンは、制限酵素分析によって同定された。Plasmid pBJ8 A gel purified PvulI restriction fragment containing the derived replication from pBJ8 was [To promote self-association (Lucier & Howard-Flanders (1985) Nucleitsk Acid Research (Rusche & Howard-Fland) ers (1985) Nucleic Ac1ds Re5eaech) 1 3 ．． 1997-2008) 1mM hexamine cobalt chloride, 25mM were self-ligated using T4 DNA ligase in the presence of KCI. sufficient large intestine After transformation into strain DH5α (Gibco-BRL), appropriate Loans were identified by restriction enzyme analysis.
プラスミドｐＵＣ８αｌＡＴ、７３ α１−抗トリプシンのＭ変異体をエンコードしている充分な長さのｃＤＮＡを含 んでいるプラスミドｐ８α１ｐｐｇは、ドイツ連邦共和国、ハイデルベルク デ ィー６９００、マイヤーホーフストラッセ １．ヨーロピアン モレキュラー バイオレット ラボラトリイー、リカード コルテス教授（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｐｌｃｃａｒｄｏ Ｃｏｒｔｅｓｅ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｅｙｅｒｈｏｆｓｔｒａｓｓｅ １．Ｄ−６９００Ｈｅｌｄｅｌｂｅｒｇ、Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ） （シリベルト、プント＆コルテス（Ｃ１ｌ１ｂｅｒｔ ｏ、 Ｄｅｎｔｅ＆Ｃｏｒｔｅｓｅ） （１９８５）セル ４１，５３１−５４ ０）から調達した。今日ＡＡＴとして知られているＢＬＧ−ＡＡＴまたはｐｓｓ ｌｔｇＸｓＴＡＲＧの構造物に用いた戦略（ｓｔｒａｔｅｇｙ）は、Ｃ１−抗ト リプシンｃＤＮＡの３′末端でポリアデニル化シグナル配列が除去されることを 必要としたＷＯ−Ａ−８８００２３９号に記載した。Plasmid pUC8αlAT, 73 Contains a full-length cDNA encoding the M variant of α1-antitrypsin. The containing plasmid p8α1ppg was purchased from Heidelberg, Germany. 6900, Mayerhofstrasse 1. European Molecular Violet Laboratory, Professor Ricardo Cortez Plccardo Cortese, European Mo1ecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1. D-6900 Heldelberg, Federal Republic of Germany) (Ciliberto, Punto & Cortes (C1l1bert) o, Dente & Cortese) (1985) Cell 41, 531-54 0). BLG-AAT or pss known today as AAT The strategy used for the construction of ltgXsTARG was The polyadenylation signal sequence is removed at the 3' end of the lipsin cDNA. It was described in WO-A-8800239.
ポリアデニル化シグナルは、下記の方法で取り除かれた。The polyadenylation signal was removed in the following manner.
プラスミドｐ８αｌｐｐｇＤＮＡは、ＰｓｔＩで消化され、該消化生産物は、０ ．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウム（シグマ）を含有している調製済の１％アガロ ースゲル内に電気泳動によって分離された。約１４００ｂｐの適当な断片は、Ｕ Ｖランプ（アメリカ合衆国、カルフォルニア州、サン ガブリエル、ウルトラ− バイオレット プロダクツ。Plasmid p8αlppg DNA was digested with PstI and the digestion product was ．． Prepared 1% agaro containing 5 μg/ml ethidium bromide (Sigma) separated by electrophoresis in a microscopy gel. A suitable fragment of approximately 1400 bp is U V Lamp (Ultra, San Gabriel, California, USA) Violet Products.
インク（Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｅｄｕｃｔｓ、Ｉｎｃ、Ｓａｎ Ｇａ ｂｒｉｅｌ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、ＵｓＡ）の照射によって定着された。一枚 の透析膜は、該バンドの前に挿入され、続いて該ＤＮＡ断片が、該膜の上に電気 泳動された。該ＤＮＡは、該透析膜から溶離され、製造業者によって推薦される 方法を用いている、゛エリュティップディ’ （’Ｅｌｕｔｉｌ）Ｄ’） ［西 ドイツ、ダッセル、ディー３３５４．ポストファッチ ４．スフレラシャ−およ びジュール（Ｓｃｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｕ１１．Ｐｏ５ｔｆａｃｈ ４．Ｄａｓｓｅｌ、Ｗ、Ｇｅｒｍａｎｙ）］の使用によって単離された。１４０ ０ｂｐＰｓ ｔ■断片を精製したゲルは、ＴａｑＩで消化され、上記に記載され たと同様にして調製済の１％アガロースゲル上で電気泳動された。ポリアデニル 化シグナル配列を含んでいるＣ１−抗トリプシンｃＤＮＡの３′末端からなる約 ３００ｂｐのＴａｑＩ−ＰｓｔＩ断片は、溶離され、そしてｃＤＮＡの５′部分 を含む１０９３ｂｐのＴａｑＩ−ＴａｑＩ断片である場合に、上記に記載された と同様にしてエリュティップ（Ｅｌｕｔｉｌ））を用いて精製された。該プラス ミドベクターｐＵＣ８（ユナイデット キングダム、エムケイ９３エツチピー、 パックス、セントラル ミルトン ケインズ、ミツドサマー ブルヴアード、フ ァーマシカ ハウス。Ink (Ultra-Violet Preducts, Inc., SanGa briel, California, UsA). one sheet A dialysis membrane is inserted in front of the band, and the DNA fragment is then electrically charged onto the membrane. It was electrophoresed. The DNA is eluted from the dialysis membrane and recommended by the manufacturer. 'Elutil D') [West Dee 3354, Dassel, Germany. Postfatch 4. soufflé racha and Screicher and 5chu11.Po5tfach 4. Dassel, W., Germany)]. 140 The gel purified 0 bp Ps t fragment was digested with TaqI and purified as described above. Electrophoresis was performed on a 1% agarose gel prepared in the same manner as above. Polyadenyl The ca. The 300 bp TaqI-PstI fragment was eluted and the 5' portion of the cDNA 1093 bp TaqI-TaqI fragment containing the above-mentioned It was purified using Elutil in the same manner as above. The plus Midvector pUC8 (United Kingdom, MK93 HTS, Pax, Central Milton Keynes, Midsummer Boulevard, Fu Armashika House.
ファーマシカーエルケイビイ バイオチクノロシイ（Ｐｈａｒ■ａｃｉａ−ＬＫ Ｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｏｕｓｅ、Ｍｉｄｓ ｕｍｍｅｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅ ｓ、Ｂｕｃｋｓ、ＭＫ９ ３ＨＰ、ＩＪＫ）） が、ＡｃｃＩおよびＰｓｔＩで 消化され、フェノール／クロロフォルムが抽出され、そしてＤＮＡが、エタノー ル沈殿によって回収された。ｐ８αｌｐｐｇから３００ｂｐのＴａｑｌ−Ｐｓｔ ｌ断片が、ＡｃｃＩで切断したｐＵＣ８にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて結合さ れ、Ｐｓｔｌおよび連結反応生産物が、アンピシリン耐性に対して大腸菌株ＤＨ ＝１（ユナイデット キングダム、スコツトランド、ペイズリ ビーエイ３４イ ーエフ、レンツリュー ロード。Pharmacica LK Biotechnology (Pharacia-LK) B Biotechnology, Pharmacia House, Mids summer Boulevard, central Milton Keyne s, Bucks, MK9 3HP, IJK)) with AccI and PstI The DNA is digested, the phenol/chloroform is extracted, and the DNA is was recovered by precipitation. Taql-Pst of 300 bp from p8αlppg The l fragment was ligated to pUC8 cut with AccI using T4 DNA ligase. , Pstl and the ligation product were used in E. coli strain DH against ampicillin resistance. = 1 (United Kingdom, Scotsland, Paisley B.A. 34) -F, Renzlieu Road.
トライプント ハウス、ビーオー ボックス ３５．ギブコーＢ ＲＬ （Ｇｉ ｂｃｏ−ＢＲＬ、ＰＯＢｏｘ ３５．Ｔｒｉｄｅｎｔ Ｈｏｕｓｅ、Ｒｅｎｆｒ ｅｗＲｏａｄ、Ｐａ１ｓｌｅｙ ＰＡ３４ＥＦ、５ｃｏｔｉａｎｄ、ＵＫ））を 形質転換するために用いられた。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性コロニ ーから単離された。該適正な（ｃｏｒｒｅｃｔ）組換体は、ＡｃｃＩおよびＰｓ ｔＩを用いて二重消化による約３００ｂｐの断片の放出によって同定された。発 生した該ブラスミトハ、ｐＵＣＶ８．３’ ＡＴ、３と称せられた。Tripunto House, B-O Box 35. Gibko B RL (Gi bco-BRL, POBox 35. Trident House, Renfr ewRoad, Pa1sley PA34EF, 5cotiand, UK)) used for transformation. Plasmid DNA is used to isolate ampicillin-resistant colonies. isolated from. The correct recombinant is AccI and Ps It was identified by double digestion with tI releasing a fragment of approximately 300 bp. Departure The resulting plasmid was named pUCV8.3'AT,3.
プラスミドｐＵＣＶ８．３’ ＡＴ、３は、寒天ゲルから単離サレタ線状にした （ｌｉｎｅａｒｉｓｅｄ）ｐＵＣＶ８． ３’ ＡＴ。Plasmid pUCV8.3'AT,3 was isolated from an agar gel and linearized. (linearised) pUCV8. 3' AT.
３に対応するＢｓ ｔＮＩおよび該断片で部分的な消化：こ供された。ｐＵＣＶ ８．３’ ＡＴ、３中に７種、ベクター中に５種、およびＣ１−抗トリプシンの ３′−翻訳されて０ない配列に対応する領域に２種のＢｓ ｔＮＩ部位が存在す る。線状にしたＢｓ ｔＮＩおよびＤＮＡを精製したゲルは、それがｃＤＮＡ挿 入断片のの３′末端を結合するところのｐＵＣ８ポリリンカー中で切断するＰｓ ｔＩで消化された。Partial digestion with Bs tNI corresponding to 3 and the fragment was performed. pUCV 8.3' AT, 7 types in 3, 5 types in vector, and C1-antitrypsin There are two types of Bs tNI sites in the region corresponding to the 3′-translated non-zero sequence. Ru. The linearized BstNI and DNA purified gel showed that it was the cDNA insert. Cut Ps in the pUC8 polylinker where it joins the 3' end of the input fragment. Digested with tI.
Ｐｓｔｉで消化されたＤＮＡは、過剰のｄＮＴＰＳの存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメ ラーゼで修復され、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで自己消化された。ポリアデニル化シグ ナル配列を含むＢｓ ｔＮＩ−Ｐｓ ｔ Ｉ断片は、当該生産物によって欠失し た。該結合した物質を用いて、アンピシリン耐性の大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株Ｄ Ｈ−１に形質転換された。プラスミドＤＮＡは、アンピシリン耐性コロニーから 単離された。適正なりローンは、制限分析およびｐＵＣ８，３°ＡＴ、３との比 較によって同定された。該適正なりローンは、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌＩＩ からの単一部位の保持、ＰｓｔＩ部位の欠損、および小さなＰｖｕＩＩ断片の部 位の減退によって確認された。該適正なりローンは、ｐＢ５と称された。The Psti-digested DNA was digested with T4 DNA polymer in the presence of excess dNTPS. and autolyzed with T4 DNA ligase. polyadenylated sig The BstNI-PstI fragment containing the null sequence is deleted by the product. Ta. Using the bound substances, ampicillin-resistant Escherichia coli (E. coli) strain D It was transformed into H-1. Plasmid DNA was obtained from ampicillin-resistant colonies. isolated. Appropriate loans are determined by restriction analysis and the ratio of pUC8,3°AT,3 Identified by comparison. The suitable loans are BamHI and HindlII. Retention of a single site, deletion of the PstI site, and part of the small PvuII fragment from This was confirmed by the decline in the number of The appropriate loan was designated pB5.
プラスミドｐＢ５のＤＮＡは、Ａ ｃ、 ｃ Ｉで消化され、フェノール／クロ ロホルムは抽出れ、さらにＤＮＡはエタノール沈殿によって回収された。Ａｃｃ Ｉで分解したｐＢ５のＤＮＡは、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＢＣＬ）で 処理された。該反応は、１０ミリモルまでＥＤＴＡが添加され、そして１０分間 ６５℃で熱することによって停せされた。該ＤＮＡは、エタノールによる沈殿に よって２種のフェノール／クロロホルムおよび１種のクロロホルムで抽出後、回 収された。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、ｐＢ５に上記の１０９３ｂｐのＴａｑｌ−Ｔ ａｑＩ断片を結合するために用いられ、ＡｃｃＩで分解され、さらにホスファタ ーゼ処理したＤＮＡおよび結合した生産物を、アンピシリン耐性で大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩ （ギブ：］−ＢＲＬ製）に形質転換するために用いら れた。適正なりローン（ｐＵＣ８ｃＫＩＡＴ、７３）の同定は、９０９ｂｐのＨ ｉｎｆ １断片、１０９３ｂｐのＴａｑＩ断片および８７ｂｐのＢａｍＨＩ断片 の制限分析−存在によって証明された。The DNA of plasmid pB5 was digested with Ac, cI and phenol/chlorinated. Roform was extracted and DNA was recovered by ethanol precipitation. Acc The pB5 DNA digested with I was digested with calf intestinal alkaline phosphatase (BCL). It has been processed. The reaction was carried out until 10 mmol of EDTA was added and the reaction was run for 10 min. It was stopped by heating at 65°C. The DNA was precipitated with ethanol. Therefore, after extraction with two types of phenol/chloroform and one type of chloroform, It was collected. T4 DNA ligase injects the above 1093 bp Taql-T into pB5. Used to join the aqI fragment, digested with AccI, and further digested with phosphatase. The enzyme-treated DNA and the ligated product were transformed into ampicillin-resistant Escherichia coli (E. coli) strain HBIOI (Gibb: ]-BRL). It was. Identification of the appropriate loan (pUC8cKIAT, 73) was performed using the 909 bp H inf1 fragment, 1093bp TaqI fragment and 87bp BamHI fragment Restriction analysis of - proven by existence.
プラスミドｐＢＪ１２ プラスミドｐＵＣ８ぽＩＡＴ、７３は、ＡｃｃｌおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化さ れ、ポリアデニル化シグナルなしでα１−抗トリプシンｃＤＮＡを含んで得られ た断片を、過剰のｄＮＴＰｓの存在下で、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリ メラーゼのフレノウ断片を用いて末端修復された。当該平滑な末端にした（ｂｌ ｕｎｔ ｅｎｄｅｄ）断片は、ＰｖｕＩＩで線状にしたｐＢＪ８を精製したゲル にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて精製し、結合したゲルであった。形質転換に適当 な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ａ （ギブｍ１−ＢＲＬ製）の適正なりロー ンは、制限分析によって同定された。Plasmid pBJ12 Plasmid pUC8poIAT, 73 was digested with Accl and HindIII. obtained containing α1-antitrypsin cDNA without a polyadenylation signal. The fragments were injected into E. coli DNA polypeptides in the presence of excess dNTPs. The ends were repaired using the Flenow fragment of merase. The blunt ends were made (bl unt ended) fragment was obtained by gel purifying pBJ8 linearized with PvuII. was purified using T4 DNA ligase and bound to the gel. Suitable for transformation E.coli strain DH5a (manufactured by Gibb m1-BRL) The components were identified by restriction analysis.
プラスミドｐｓｓ１ｔｇｓＰｓ ＷＯ−Ａ−８８００２３９号に記載されたｐｓｓｌｔｇＸＳから単離した約４． ２ｋｂの５ａｌｌ−５ｐｈｌの制限酵素断片を精製したゲルは、５ａｌＩおよび ｓｐｈ Ｉで消化したｐＰｏｌｙｌ（ラス、ビロツティ＆クラーク（Ｌａｔｈｅ 、 Ｖｉ Ｉｏｔｔ＆Ｃ１ａｒｋ）、１９８７年、ジーン（Ｇｅｎｅ）、５７巻 、ページ１９３〜２０１）を精製したゲルの等モル量で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを 用いて結合された。形質転換に適当な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＨＩ （ギブ コーＢＲＬ製）の適正なりローンは、制限酵素分析によって同定された。Plasmid pss1tgsPs 4. isolated from pssltgXS described in WO-A-8800239. The gel purified the 2 kb 5all-5phl restriction enzyme fragment. pPolyl digested with sph I (Lathe, Bilotti & Clark) , Viott & C1ark), 1987, Gene, vol. 57 , pages 193-201) in an equimolar amount of gel purified T4 DNA ligase. combined using Escherichia coli (E. coli) strain DHI (Gib Correct clones (manufactured by Co. BRL) were identified by restriction enzyme analysis.
プラスミドｐＢＪ１ プラスミドｐＳＳ ｔ ｇＳｐＳは、ＢｇｌｌＩで消化され、過剰のｄＮＴＰｓ の存在下、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼのタレノウｍ１片を用 いて末端修復された。平滑末端は、ＨｉｎｄＩＩＩ合成リンカ−（Ｕ Ｓ Ａ、 エムエイ０１９１５−５５１０、ビバリー、トザーロード３２、ニューイングラ ンド バイオラブズ アイエヌシ−（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｌｎｃ、３２ Ｔｏｚｅｒ Ｒｏａｄ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ ０１９１５− ５５ＬＯ，ＵＳＡ） ）を用いて修飾され、そして得られた断片は、自己結合［ ルーシエ＆ハワードーフランダース（１９８５）ヌクレイツク アシッド リサ ーチ（Ｒｕｓｃｈｅ＆Ｈａｗａｒｄ−Ｆｌａｎｄｅｒｓ （１９８５）Ｎｕｃｌ ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｅｃｈ）１３． １９９７−２００８） ］を 促進するために、１ｍＭへキサミン塩化コバルト、２５ｍＭＫＣΩの存在下、Ｔ ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己結合された。形質転換に適当な大腸菌（Ｅ、ｃｏ ｌｉ）株ＤＨ５α（ギブコーＢＲＬ製）の適正なりローンは、制限分析によって 同定された。Plasmid pBJ1 Plasmid pSS t gSpS was digested with BgllI and excess dNTPs Using a piece of Escherichia coli (E. coli) DNA polymerase in the presence of The end was repaired. Blunt ends were linked with HindIII synthetic linkers (USA, MA 01915-5510, Beverly, 32 Tozer Road, New England. New England Biolabs lnc, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915- 55LO, USA)) and the resulting fragment was self-linked [ Lucier & Howard Flanders (1985) Nucleitsk Acid Lisa Rusche & Howard-Flanders (1985) Nucl eic Ac1ds Re5eaech)13. 1997-2008)] T in the presence of 1 mM hexamine cobalt chloride, 25 mM KC 4 DNA ligase. Escherichia coli (E, co) suitable for transformation li) The appropriate loan for stock DH5α (manufactured by Gibcor BRL) is determined by restriction analysis. Identified.
プラスミドｐＢ Ｊ １６ （ＡＡＴＤ）ｐＢＪｌからＨｉｎｄＩ ｌｌ−５ｐ ｈＩ断片を精製したゲルおよびｐＢＪ １２から５ｐｈＩ−Ｘｂａ！断片を精製 したゲルは、ＨｉｎｄＩ Ｉ ＩおよびＸｂａｌで消化したｐＵＣ１９（ユナイ デット キングダム、エムケイ９３エツチビー、パックス、セントラル ミルト ン ケインズ。Plasmid pBJ16 (AATD) pBJl to HindIll-5p Gel purified hI fragment and pBJ 12 to 5phI-Xba! Purify the fragment The gel was prepared using pUC19 (Uni Debt Kingdom, MK 93 ET, Pax, Central Milt Keynes.
ミツドサマー ブルヴアード、ファーマシカ ハウス、ファーマシカーエルケイ ビイ バイオチクノロシイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｏｕｓｅ、Ｍｉｄｓｕｍａ＋ｅｒ Ｂｏｕｌ ｅｖａｒｄ、ｃｅｎｔｒａｌ Ｍｉｌｔｏｎ Ｋｅｙｎｅｓ、Ｂｕｃｋｓ、ＭＫ ９３ＨＰ、ＵＫ））を精製したゲルにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合された。Midsummer Boulevard, Pharmasica House, Pharmasica L.K. Pharmacia-LKB Biotechno logy, Pharmacia House, Midsuma+er Bowl evard, central Milton Keynes, Bucks, MK 93HP, UK)) was ligated to a purified gel using T4 DNA ligase.
形質転換に適当な大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（ギブコーＢＲＬ製）の適 正なりローンは、制限酵素分析によって同定された。E. coli strain DH5α (manufactured by Gibcor BRL) suitable for transformation. Positive loans were identified by restriction enzyme analysis.
微注入によるｐＢＪ １６からのＡＡＴ−Ｄ断片の単離プラスミドｐＢＪ １６ は、ＨｉｎｄＩ Ｉ ＩおよびＸｂａＩで消化され、そして得られた８、０ｋｂ のＡＡＴＤ断片は、ＥＤ８１濾紙（ドレッチェンら（１９８１年）、アナリティ カル バイオケミストリー、１１２巻、ページ２８５〜２９８ （Ｄｒｅｔｚｅ ｎ ｅｔ ａｌ （１９８１） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ １１２，２８５−２９８））を用いてゲルから単離された。ＤＥ８１濾紙 から分離後、該ＤＮＡは、フェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈 殿され、最後に微注入によって用意のできたＴＥ緩衝液（１０ｍＭ）リス−塩酸 、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸濁された。Isolation of AAT-D fragment from pBJ 16 by microinjection Plasmid pBJ 16 was digested with HindII and XbaI, and the resulting 8.0 kb The AATD fragment of ED81 filter paper (Dretchen et al. (1981), Cal Biochemistry, Volume 112, Pages 285-298 (Dretze n et al (1981) Analytical Biochemist ry 112, 285-298)). DE81 filter paper After separation, the DNA was extracted with phenol/chloroform and ethanol precipitated. TE buffer (10mM) Lis-HCl was precipitated and finally prepared by microinjection. , 1mM EDTA, pH 8).
比較例５ 上記比較例４に記載された該ＡＡＴＤ構造物が、ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の 実施例１に記載された方法によって形質転換マウスを得るために用いられた。種 々の組織から単離されたＲＮＡは、ＡＡＴＤ転写物の存在について実験がなされ 、メスからの乳がウェスタンブロッティングによってα１−抗トリプシンの存在 について検定された。これらの分析の両方が、ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実 施例２に記載されている。結果を下記表１に示す。Comparative example 5 The AATD structure described in Comparative Example 4 is the same as that of WO-A-9005188 The method described in Example 1 was used to obtain transgenic mice. seed RNA isolated from various tissues was tested for the presence of AATD transcripts. , the presence of α1-antitrypsin in milk from females was determined by Western blotting. was tested for. Both of these analyzes are based on the implementation of WO-A-9005188. Described in Example 2. The results are shown in Table 1 below.
表１ マウス 転 写 ＲＮＡ ＡＴＴタンパク質”ＡＡＴＤ１２ ＧＯ雌 −− ＡＡＴＤ１４ Ｇｏ雌 −− ＡＡＴＤ３Ｌ ＧＯ雌 −− ＡＡＴＤ３３ ＧＯ雌 ３．９ｔ、ｔｇ／ｍ（ＩＡＡＴＤ９ マウス−系列 − − ＡＡＴ２Ｌ マウス−系列 −− ＡＡＴＤ４Ｌ マウス−系列 −− ＡＡＴＤ４７ マウス−系列 −− ★：ニラニスタンプロッティングよび／またはＥＬＩＳＡによって分析した。Table 1 Mouse transcription RNA ATT protein "AATD12 GO female -- AATD14 Go female -- AATD3L GO female -- AATD33 GO female 3.9t, tg/m (IAATD9 mouse-series- − AAT2L mouse series -- AATD4L mouse series -- AATD47 mouse series -- ★: Analyzed by Niranistan plotting and/or ELISA.
ＡＡＴＤを運搬する形質転換マウスの１／８のみが、乳タンパク質の分析によっ て決定されたのと同様の形質転換を発現した。発現のレベルは、まったく低く、 繰り返された試みにもかかわらず、ＡＡＴＤ ＲＮＡ転写物に相当するものは、 乳腺に検出されなかった。Only 1/8 of transgenic mice carrying AATD were detected by milk protein analysis. Similar transformations were expressed as determined by the method. The level of expression is quite low; Despite repeated attempts, the equivalent of the AATD RNA transcript remains Not detected in mammary glands.
実施例１ ｐｓｓｌ ｔ ｇＸＳ （ＢＬＧ）から調製した１０．５ｋｂの５ａｌＩ−Ｘｂ ａｌ断片よりなる、比較例１および３において調製したβ−ラクトグロブリン構 造物および比較例３ （ＡＡＴＤ）において調製したＧ１−抗トリプシン構造物 は、約３μｇ／ｍＤの全ＤＮＡ濃度に等モル比で前述と同様にしてマウスエラグ （ｍｏｕｓｅ ｅｇｇｓ）の中に同時注入した。Example 1 10.5kb 5alI-Xb prepared from pssltgXS (BLG) β-lactoglobulin constructs prepared in Comparative Examples 1 and 3 consisting of al fragments G1-antitrypsin construct prepared in Comparative Example 3 (AATD) Mouse Elag was added as described above in an equimolar ratio to a total DNA concentration of approximately 3 μg/mD. (mouse eggs).
２０匹の形質転換創始マウスが、サザンブロッティングによって検出され、これ らのうち１１匹が、ＡＡＴＤとＢＬＧ配列の双方を運搬することが分かった。こ れらのマウスは、ＢＡＤ （ＢＬＧおよびＡＡＴＤ）と命名された。９／１１匹 が０１子孫まで両方の形質転換を伝達した。それぞれの２種の形質転換株は、共 に分離されていた（図５）ことを示した各系列における多くの子孫を解析するこ とで、これらが共に非常に接近して組込まれ、そしてたいていは、同じ部位で相 互組込みされたことを表している。Twenty transgenic founder mice were detected by Southern blotting; Of these, 11 were found to carry both AATD and BLG sequences. child These mice were named BAD (BLG and AATD). 9/11 animals transmitted both transformations to 01 progeny. The two transformed strains of each Analysis of the many descendants in each lineage showed that they were segregated (Figure 5). , they are integrated together very close together and are often mutually exclusive at the same site. This indicates that they have been mutually integrated.
図５は、ＡＡＴＤおよびＢＬＧの相互分離を示す。ＡＡＴＤおよびＢＬＧの同時 注入から得られる種々のＢＡＤ系列からのＤＮＡサンプルは、ＥｃｏＲＩで制限 され、サザンプロットされ、そして、２種の形質転換の５°末端に対合したＥｃ ｏＲＩ−８ｐｈＩ断片でプローブされた。ＢＬＧおよびＡＡＴＤの形質転換株は 、ＥｃｏＲＩ消化によって区別することができ、特異的なＥｃｏＲＩ断片が指示 される（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ） ｏ多くの０１動物からＤＮＡが解析されている 。同じ系列（ｌｉｎｅ＞ （例えば、ＢＡＤＩ、ＢＡＤ９９など）からの０１動 物中の類似パターンのＡＡＴＤおよびＢＬＧ制限断片は、相互分離のしるしく１ ｎｄｉｃａｔｉｖｅ）である。FIG. 5 shows the mutual separation of AATD and BLG. AATD and BLG simultaneously DNA samples from various BAD series obtained from injections were restricted with EcoRI. and Southern blotted and paired Ec Probed with oRI-8phI fragment. The transformed strains of BLG and AATD are , can be distinguished by EcoRI digestion, and specific EcoRI fragments are indicated. indicated o DNA has been analyzed from many 01 animals . 01 movement from the same series (line> (e.g. BADI, BAD99, etc.) The similar pattern of AATD and BLG restriction fragments in the sample is a sign of mutual separation. ndative).
系列ＢＡＤ９３は、Ｇ１世代において分離している相互組込みした座を有するこ とを注意されたい。Lineage BAD93 may have separate interintegrated loci in the G1 generation. Please note that.
ＡＡＴＤのｍＲＮＡの発現は、二重形質転換マウスの９系列のすべてで解析され ている。発現したサイズのＡＡＴＤ転写物は、９系列の中から６系列において乳 房ＲＮＡで検出され、このうち３系列が低レベルで、１系列が中間レベルで、そ して２系列が高レベルでＡＡＴＤのｍ ＲＮ Ａ ヲ発現した。ＡＡＴＤ転写物 は、他の組織（図６）では検出されなかった。AATD mRNA expression was analyzed in all nine lines of double-transgenic mice. ing. AATD transcripts of the size expressed were found in milk in 6 out of 9 lineages. of which 3 sequences were detected at low level, 1 sequence was at intermediate level, and Two lines expressed high levels of AATD mRNA. AATD transcript was not detected in other tissues (Fig. 6).
図６は、ＢＡＤ系列においてＡＡＴＤの組織に特異的な発現を示す。種々の組織 から調製したＲＮＡは、ヒトＡＡＴに特異的な配列でプローブされた。約１６０ ０ｎｔのＡＡＴＤ転写物（矢印で示されたＤ）は、ＢＡＤマウス９９゜３および ＢＡＤ１３５．１３の乳腺に特異的に見られる。Figure 6 shows tissue-specific expression of AATD in the BAD lineage. various organizations RNA prepared from was probed with sequences specific for human AAT. Approximately 160 The 0 nt AATD transcript (arrowed D) was isolated from BAD mice 99°3 and It is specifically seen in mammary glands with BAD135.13.
形質転換ＡＡＴＢ （矢印で示されたＢ）からの約１４００ｎｔの転写物は、形 質転換ＡＡＴＢ３５ （３５Ｍ）の乳腺で発現した。ここで、ＣＭは、比較マウ ス乳腺ＲＮＡ（ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実施例２も参照）。Ｓａは唾液腺 、Ｈは心臓、Ｋは腎臓、Ｓｐは膵臓、Ｌは肝臓、Ｍは乳腺。The approximately 1400 nt transcript from transformed AATB (arrowed B) is of the form It was expressed in the mammary gland of transformed AATB35 (35M). Here, CM is a comparison mouse. mammary gland RNA (see also Example 2 of WO-A-9005188). Sa is salivary gland , H is heart, K is kidney, Sp is pancreas, L is liver, and M is mammary gland.
ヒトα１−抗トリプシンは、２種の高く発現している系列で測定され、それぞれ 約１４０μｇ／ｍｆｌと約６００μｇ ／ ｍΩ （２種の平均値）で算出され た。また、ＢＬＧ形質転換株は、発現について分析されており、ＡＡＴＤのｍＲ ＮＡを発現した該６系列が、ＢＬＧのｍＲＮＡを発現したのに対して、ＡＡＴＤ のｍＲＮＡに関して明らかに負の３種のＡＡＴＤ系列は、明らかにＢＬＧ （図 ７に示した代表的な例）を発現していない。図７は、ＢＡＤマウマウにＡＡＴＤ およびＢＬＧ転写物の検出を示す。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）膜の上ヘブロッ トされた乳腺（Ｍ）および肝臓（Ｌ）のＲＮＡサンプルは、ＡＡＴ （αＩＡＴ ）でプローブされた。Human α1-antitrypsin was measured in two highly expressed lines, each with Calculated as approximately 140μg/mfl and approximately 600μg/mΩ (average value of two types) Ta. BLG transformants have also been analyzed for expression and mR of AATD. The six lines that expressed NA expressed BLG mRNA, whereas AATD The three AATD sequences that are clearly negative with respect to the mRNA of BLG (Fig. (Representative example shown in 7). Figure 7 shows BAD Mau Mau to AATD and detection of BLG transcripts. Heblot on Hybond membrane The extracted mammary gland (M) and liver (L) RNA samples were AAT (αIAT ) was probed with.
約１６００ｎ ｔにおけるＡＡＴＤ転写物は、ＢＡＤ７ウス１．１．１，２．３ ６．８．１０７．２．１５８．３．９９．９９．３および１３５．１３から乳腺 ＲＮＡサンプルに検出できる。該フィルターは取り除かれ、そしてＢＬＧに特異 的なプローブ（ＢＬＧ）に再対合され、また同様のサンプルは、ヒツジ乳腺のＲ ＮＡ （ＳＭ）に検出され、約８００ｎ ｔのＢＬＧ転写物に強くハイブリッド 形成を示した。ここで、ＡＡＴＢ３５は、約１４００ｎ ｔのＡＡＴＢ転写物を 含む形質転換系列ＡＡＴＢ３５からの乳腺ＲＮＡであり、ＣＭは比較マウスサン プルである。The AATD transcript at approximately 1600 nt was found in BAD7us1.1.1,2.3 Mammary glands from 6.8.107.2.158.3.99.99.3 and 135.13 Can be detected in RNA samples. The filter was removed and BLG specific A similar sample was repaired to the sheep mammary gland R Detected by NA (SM) and strongly hybridized to the approximately 800 nt BLG transcript. showed formation. Here, AATB35 has an AATB transcript of approximately 1400 nt. CM is the mammary gland RNA from the transgenic line AATB35, and CM is the comparison mouse sample. It is a pull.
したがって、少なくとも大部分のＡＡＴＤの発現については、活性をもって発現 するＢＬＧ遺伝子と関連があると思われる。比較例５の結果と本実施例の結果を 比較することによって、ＢＬＧとともにＡＡＴＤの同時注入（および、おそら（ 相互組込み）は、ＡＡＴＤの発現の効率を著しく増幅させると思われる。ＲＮＡ データを考慮すると、ＡＡＴＤを単独で注入したとき、Ｏ／８匹の動物が形質転 換を発現した。ＢＬＧとともに同時注入した（および、おそらく相互組込みした ）とき、ＡＡＴＤのｍＲＮＡの発現は、以下の表２に示されるように、６／９匹 の動物に検出された。Therefore, at least the majority of AATDs are expressed with activity. It seems to be related to the BLG gene. The results of Comparative Example 5 and the results of this example By comparing co-injection of AATD with BLG (and possibly ( (mutual integration) appears to significantly amplify the efficiency of AATD expression. RNA Considering the data, O/8 animals were transformed when AATD was injected alone. The change occurred. Co-injected with BLG (and possibly co-incorporated) ), the expression of AATD mRNA was found in 6/9 mice, as shown in Table 2 below. detected in animals.
表２ マウス／ ＲＮＡ１ タンパク質 系列 αＩＡＴ ＢＬＧ αＩＡＴ２ＢＬＧ ３□ 旦ｇ、／ｍｌ） 匡Ｃ１Ｌ ＢＡＤＬ ＋ ＋ ４．８ ９ ＢＡＤ３６ ＋ ＋ １．２ １．１ ＢＡＤ９９ ＋ ＋ １３７ １．７ ＢＡＤ１０７ ＋ ＋ ２４ ２．４ ＢＡＤ１３５ ＋ ＋ ８１０ １．７ＢＡＤ１４４ − − − − ＢＡＤＬ５ｇ ＋ ＋ １ １．６ ＢＡＤ形質転換マウスにおける発現 １、ｍＲＮＡ転写物は、すべてのおよびポリＡ＋ＲＮＡのノーザンプロット（ｎ ｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）で検出された。Table 2 Mouse/RNA1 protein Series αIAT BLG αIAT2BLG 3□ Dang, /ml) Tadashi C1L BADL + + 4.8 9 BAD36 + + 1.2 1.1 BAD99 + + 137 1.7 BAD107 + + 24 2.4 BAD135 + + 810 1.7 BAD144 - - - - BADL5g + + 1 1.6 Expression in BAD transgenic mice 1, mRNA transcripts were analyzed by Northern blot (n (other blot).
２、ａｌＡＴは、感度＞０．２μｇ／ｍｊ２のＥＬＩ ＳＡによって決定された 。ＢＡＤ系列の値については、２匹のマウスからの平均を表わす。2, alAT was determined by ELI SA with sensitivity >0.2μg/mj2 . For BAD series values, the average from two mice is represented.
３、ＢＬＧは、ＢＬＧ標準を参照することによって５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でデ ンシトメータによって（ｄｅｎｓｉｔｏａ＋ｅｔｒｆｅａｌｔｙ）算出した。3. BLG is decoded on a 5DS-PAGE gel by reference to BLG standards. (densitoa+etrfealty) was calculated using a densitometer.
４、発現は、当該系列からの２種の動物の中から一方のみに検出された。4. Expression was detected in only one of the two animals from the line.
比較例６ 問題のポリペプチドをエンコードしているＤＮＡ配列が因子ＩＸをエンコードす る以外は、実施例４ （ＡＡＴＤの構成）の方法を繰り返した。ｐ５’ Ｇ３’ ＣＶＩ ［ＷＯ−Ａ−８８００２３９号参照］から挿入した１５５３ｂｐより なるＮｈｅｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ＦＩＸ Ｄを発生するために、ｐＢＪ １２に関して上記と同様にしてｐＢＪ８のＰｖｕ１１部位の中に挿入された。Comparative example 6 The DNA sequence encoding the polypeptide in question encodes factor IX. The method of Example 4 (Construction of AATD) was repeated except that: p5' G3' From 1553bp inserted from CVI [see WO-A-8800239] The Nhel-HindIII fragment was added to pBJ to generate FIXD. 12 was inserted into the Pvu11 site of pBJ8 as described above.
比較例７ 前記比較例６に記載した該ＦＩＸ構造物が、ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実施 例１に記載された方法によって形質転換マウスを発生するために用いられた。種 々の組織から単離されたＲＮＡが、ＦＩＸ転写物の存在について実験がなされ、 そして、メスからの乳がウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡに よって、因子ＩＸの存在について解析がなされたが、これらの解析の双方は、Ｗ Ｏ−Ａ−９００５１８８号の実施例２に記載されたのと同様である。該結果は、 下記表３に示す。Comparative example 7 The FIX structure described in Comparative Example 6 was prepared according to the implementation of WO-A-9005188. The method described in Example 1 was used to generate transgenic mice. seed RNA isolated from various tissues was tested for the presence of FIX transcripts, Milk from females was then subjected to Western blotting and/or ELISA. Thus, although analyzes were made for the presence of factor IX, both of these analyzes Similar to that described in Example 2 of No. OA-9005188. The result is It is shown in Table 3 below.
ＦＩＸ Ｄ １１ ＧＯ雌 −− ＦＩＸ Ｄ １４ ＧＯ雌 −− ＦＩＸ ０１６ ＧＯ雌 −− ＦＩＸ Ｄ １７ Ｇｏ雌 −− ＦＩＸ Ｄ Ｌ８ ＧＯ雌 −− ＦＩＸ Ｄ ２０ マウス−系列 −−ＦＩＸ Ｄ ２３ マウス−系列 −− ＦＩＸ Ｄ ２４ ７ウス一系列 −−ＦＩＸ Ｄ ２Ｂ マウス−系列 −− ★；ウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬ Ｉ ＳＡによって分析され た。FIX D 11 GO female -- FIX D 14 GO female -- FIX 016 GO female -- FIX D 17 Go female -- FIX D L8 GO female -- FIX D 20 Mouse series --FIX D 23 Mouse series -- FIX D 24 7 mouse series --FIX D 2B mouse series -- ★; analyzed by Western blotting and/or ELISA Ta.
ＦＩＸ Ｄを運搬する形質転換マウスのいづれも、乳タンパク質の分析によって または乳腺ＲＮＡのノーザンブロッティングによって決定したのと同様に、形質 転換を発現ｐｓｓ１ｔｇＸｓ （ＢＬＧ）から調製した１０．５ｋｂの５ａｉｌ −ＸｂａＩ断片を含んでいる比較例１および３で調製したβラクトグロブリン構 造物および比較例３ （ＦＩＸＤ）で調製した因子ＩＸ構造物は、約３μｇ／ｍ ｆｌの全ＲＮ Ａ ａ度１：おいて３ＢＬＧ：ＩＦＩＸ Ｄ（７）（−／Ｉ、比 にすることを除いては、前記と同様にしてマウスエラグ中に同時注入された。３ ０匹の形質転換創始マウスがサザンブロツティングによって検出され、そしてこ れらの２０匹がＦＩＸおよびＢＬＧ配列の双方を運搬することが分かった。これ らのマウスは、ＢＩＸ（ＢＬＧおよびＦＩＸＤ）と称せられた。１２／１３匹が ０１子孫まで両方の形質転換株を伝達した。それぞれの２種の形質転換株は、共 に分離されていた（図８）ことを示した各系列における多くの子孫を解析するこ とで、これらが共に非常に接近して組込まれ、そしてたいていは、同じ部位で相 互組込みされたことを表している。Both transgenic mice carrying FIXD were detected by milk protein analysis. or traits as determined by Northern blotting of mammary gland RNA. The 10.5kb 5ail prepared from pss1tgXs (BLG) expressing transformation - β-lactoglobulin constructs prepared in Comparative Examples 1 and 3 containing the XbaI fragment; The Factor IX construct prepared in Comparative Example 3 (FIXD) was approximately 3 μg/m fl's total RN A degree 1: 3 BLG: IFIX D (7) (-/I, ratio Co-injected into mouse elags as described above, except that 3 0 transgenic founder mice were detected by Southern blotting and this Twenty of these were found to carry both FIX and BLG sequences. this These mice were designated BIX (BLG and FIXD). 12/13 fish Both transformants were transmitted to 01 progeny. The two transformed strains of each Analysis of many descendants in each lineage showed that they were segregated (Figure 8). , they are integrated together very close together and are often mutually exclusive at the same site. This indicates that they have been mutually integrated.
図８は、ＦＩＸ ＤおよびＢＬＧの相互分離を示す。ＦＩＸ ＤおよびＢＬＧの 相互組み込みから得られる種々のＢＩＸ系列からのＤＮＡサンプルは、ＢａｍＨ Ｉで制限され、サザンプロットされ、そして２種の形質転換株の５゜末端に対合 されたＥｃｏＲＩ−５ｐｈｌ断片でプローブされた。ＢＬＧおよびＦＩＸ Ｄの 形質転換株は、ＢａｍＨＩによる消化によって区別することができ、そして特異 的なりａｍＨＩ断片が指示される。多くの０１動物からＤＮＡが解析されている 。同じ系列（すなわち、Ｂ ｌＸ３４、ＢＩＸ９９）からの６１動物中の類似の パターンのＦＩＸＤおよびＢＬＧの制限断片は、相互分離のしるしである。FIG. 8 shows the mutual separation of FIX D and BLG. FIX D and BLG DNA samples from various BIX series obtained from mutual integration were BamH I, Southern blotted, and paired with the 5° ends of the two transformants. The probe was probed with the EcoRI-5phl fragment. BLG and FIX D Transformants can be distinguished by digestion with BamHI, and specific The amHI fragment is indicated. DNA has been analyzed from many 01 animals. . Similar in 61 animals from the same lineage (i.e. BIX34, BIX99) The restriction fragments of the patterns FIXD and BLG are indicative of mutual separation.
系列ＢＩＸ２９は、０１世代において分離している相互組込みした座を有するこ とに注意せよ。Lineage BIX29 may have separate interintegrated loci in the 01 generation. Be careful.
ＦＩＸ ＤのｍＲＮＡの発現は、２種の形質転換マウスの１２系列中の１１系列 において解析されている。発現した大きさのＦＩＸ Ｄ転写物は、すべてのこれ らの系列において***ＲＮＡで検出され、このうち４系列は低レベルで、４系列 は中間レベルで、そして３系列が高レベルで、ＦＩＸ ＲＮＡを発現した。（与 えられた系列の個々のマウスの間の発現のレベルにおいて、いくつかの変化は、 いくつかの場合に認められた。）。ＦＩＸ Ｄ転写物は、他の組織（図９）では 検出されなかった。The expression of FIXD mRNA was found in 11 out of 12 lines of two types of transgenic mice. It has been analyzed in The expressed size of the FIXD transcript is were detected in breast RNA in these lineages, 4 of which were at low levels; expressed FIX RNA at intermediate levels and three lines at high levels. (Give Some variations in the level of expression between individual mice of the derived line recognized in some cases. ). FIX D transcripts were found in other tissues (Figure 9). Not detected.
図９は、ＢＩＸ系列におけるＦＩＸ Ｄの組織に特異的な発現を示す。種々の組 織から調製したＲＮＡは、ＦＩＸに特異的な配列でプローブされた。約１８００ ｎ ｔのＦＩＸＤ転写物（矢印で示した）は、ＢＩＸマウス１２，１．３０．２ および３３．１の乳腺に特異的に見られる。内因性のＦＩＸ遺伝子（矢印Ｂ）か らの約２６００ｎ ｔの転写物は、肝臓サンプルに存在する。そして、ＣＭは、 比較マウスの乳腺ＲＮＡ （ＷＯ−Ａ−９００５１８８号の実施例２も参照）、 ＣＬは比較肝臓ＲＮＡである。Ｓａは唾液腺、Ｈは心臓、Ｋは腎臓、Ｓｐは膵臓 、Ｌは肝臓、Ｍは乳腺である。ＦＩＸＡ５１、第２ＦＩＸ形質転換株を運搬する 形質転換マウスからの乳腺ＲＮＡ、ＦＩＸ Ａは、約２４０ＯｎｔのＦＩＸ転写 物（矢印Ａ）を発現する。ヒト因子■Ｘは、解析されている（下記表４を参照） 。１ｏ系列のうち６系列からマウスの乳において検出された。また、該ＢＬＧ形 質転換株は、発現について解析されおいて、該解析された系列すべてが、ＢＬＧ のｍＲＮＡを発現することを表わし、またＢＬＧのｍＲＮＡを発現した。Figure 9 shows tissue-specific expression of FIXD in the BIX series. various sets RNA prepared from tissue was probed with FIX-specific sequences. Approximately 1800 FIXD transcripts (indicated by arrows) of nt BIX mouse 12,1.30.2 and 33.1 are found specifically in the mammary glands. Endogenous FIX gene (arrow B)? A transcript of approximately 2600 nt is present in liver samples. And the commercial is Comparative mouse mammary gland RNA (see also Example 2 of WO-A-9005188), CL is comparison liver RNA. Sa is salivary gland, H is heart, K is kidney, Sp is pancreas , L is liver, and M is mammary gland. FIXA51, carrying the second FIX transformant Mammary gland RNA from transgenic mice, FIX A, is a FIX transcript of approximately 240 Ont. (arrow A). Human factor ■X has been analyzed (see Table 4 below) . It was detected in the milk of mice from 6 of the 1o series. In addition, the BLG type The transformants have been analyzed for expression and all the analyzed lines are BLG , and also expressed BLG mRNA.
図１０は、ＢＩＸマウスにおいてＦＩＸ ＤおよびＢＬＧ転写物の検出を示す。Figure 10 shows detection of FIX D and BLG transcripts in BIX mice.
ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）膜の上ヘブロットされた乳腺（Ｍ）および肝臓（Ｌ ）のＲＮＡサンプルは、ＦＩＸの特異的な配列でプローブされた。約１８００ｎ ｔのＦＩＸ Ｄ転写物は、Ｂ Ｉ Ｘ７ウス３４．１．３７゜１．４３．３．６ ６．２．１０．３．１２．１．３ｏ、４．３３．１．２２．１３．２９および１ ３１．２から乳腺ＲＮＡサンプルにおいて検出できる。ひからびた（ ５ｅｒｅ ）フィルターは、取り除かれ、ＢＬＧ−特異的なプローブ（ＢＬＧ）に再対合さ れ、そして同様のサンプルは、約８００ｎｔのＢＬＧ転写物にハイブリッド形成 を示し、ここで、ＦＩＸ５１は、約２４０ｉ０ｎｔのＦＩＸ Ａ転写物を含む形 質転換マウスＦＩＸ Ａ５１からの乳腺ＲＮＡであり、ＣＭは比較マウスサンプ ルである。Mammary gland (M) and liver (L) blotted onto Hybond membrane. ) RNA samples were probed with specific sequences of FIX. Approximately 1800n The FIX D transcript of t is B I X7 us34.1.37°1.43.3.6 6.2.10.3.12.1.3o, 4.33.1.22.13.29 and 1 31.2 can be detected in mammary gland RNA samples. Hikarabita (5ere) ) The filter is removed and re-paired with the BLG-specific probe (BLG). and a similar sample hybridized to an approximately 800 nt BLG transcript. , where FIX51 is a form containing a FIXA transcript of approximately 240i0 nt. Mammary gland RNA from transgenic mouse FIX A51, CM is comparison mouse sample It is le.
比較例６の結果と本実施例の結果を比較することによって、ＢＬＧとともにＦＩ Ｘ Ｄの同時注入（および、おそらく相互組込み）は、ＦＩＸ Ｄの発現の効串 を著しく増幅させると思われる。ＲＮＡデータのみを考慮すると、ＦＩＸ Ｄを 単独で注入した場合に、０／９匹のマウス系列が形質転換を発現した。ＢＬＧと 共に同時注入した（および、おそらく相互組込みした）とき、ＦＩＸ ＤのｍＲ ＮＡの発現は、表４に示されるように、１１／１１系列において検出され、そし てＦＩＸタンパク質は、ＲＮＡが有用でなかったところのそれ以降の系列の乳に 検出された。By comparing the results of Comparative Example 6 and the results of this example, it was found that both BLG and FI Co-injection (and possibly mutual incorporation) of XD may affect the effect of FIXD expression. is expected to significantly amplify the Considering only RNA data, FIX D When injected alone, 0/9 mouse lines developed transformation. BLG and When co-injected together (and possibly inter-incorporated), the mR of FIXD Expression of NA was detected in the 11/11 series and The FIX protein was found in milk in later series where RNA was not useful. was detected.
表４ ＢＩＸ形質転換マウスにおける発現 ＩＸ マウス／ ＲＮＡＩ タンパク質 ｆｌＸ ＢＬＧ ｆｌＸ ２ＢＬＧ ’１３１ ＋ ＋ 十−４− 注記： １、ｍＲＮＡ転写物は、すべての乳腺ＲＮＡのノーサンプロット上で検出した。Table 4 Expression in BIX-transformed mice IX Mouse/RNAI protein flX BLG flX 2BLG '131 + + 10-4- Note: 1, mRNA transcripts were detected on the Northam plot of all mammary gland RNAs.
２、ＦＩＸは、ウェスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡによって検 出した。2. FIX can be detected by Western blotting and/or ELISA. I put it out.
３、ＢＬＧは、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ）で着色された ５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出した。3. BLG was colored with Coomassie blue. Detected on 5DS-PAGE gel.
ｎ、ｄ、は、検出されず（ｒ＋ｏｔ ｄｅｔｅｃｔ）である。n, d, are not detected (r+ot detect).
実施例３ βラクトグロブリン／ウシα−ラクトアルブミン構造物（ＢＬＧ／ａ １ ａｃ ＴＲ，Ｄ−−ＢＡＴ）は、以下の方法で調製された。ヒツジのトロフォブラスチ ン（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｆｎ）をエンコードしているＤＮＡのセグメントに 融合したウシα−ラクトアルブミン遺伝子から誘発した調節配列からなる３、Ｏ ｋｂのＸｈｏＩ断片は、プラスミドベクターから摘出された。（当該プラスミド 構造物の全詳細については、スチンネックレー（Ｓｔｉｎｎａｋｒｅ）ら（１９ ９１年）、エフイービーニス レターズ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ） 、２８ ４ １゜ページ１９〜２２を参照。）。当該断片は、ユニーク（ｕｎｉｑｕｅ） Ｓ ａ ｌ １部位（図１１）でプラスミドｐｓｓ１ｔｇｓ（ＷＯ−Ａ−８８０ ０２３９号を参照）の中に直接挿入された。ＢＬＧ遺伝子に連結したａｌａＴＲ 遺伝子よりなる得られた１３．５ｋｂの挿入断片は、Ｘｂａｌによる消化によっ て、プラスミドベクターから摘出された。当該断片は、ゲル電気泳動によって精 製され、そして、前述のように、マウスエラグの直接微注入のために用いられた 。Example 3 β-lactoglobulin/bovine α-lactalbumin structure (BLG/a 1 ac TR, D--BAT) was prepared by the following method. sheep trophoblasti The segment of DNA that encodes the trophoblastfn 3,O consisting of regulatory sequences derived from the fused bovine α-lactalbumin gene. The XhoI fragment of kb was excised from the plasmid vector. (The plasmid concerned Full details of the structure can be found in Stinnakre et al. (19 1991), FEBS Letters, 28 4 1゜See pages 19-22. ). The fragment is unique Plasmid pss1tgs (WO-A-880 No. 0239). alaTR linked to BLG gene The resulting 13.5 kb insert consisting of the gene was digested with Xbal. was extracted from the plasmid vector. The fragments were purified by gel electrophoresis. were prepared and used for direct microinjection of mouse elags as previously described. .
実施例４ β−ラクトグロブリン遺伝子のＤＮＡ配列へのすべての対照は、ＥＭＢＬ取得の Ｎｏ、Ｘ１２８１７ （ハリス（ＨａｒｒｉＳ）う、エフエイ７−ル（ＮＡＲ） 、１６巻、ページ１０３７９〜８０ （１９７８年））で割り当てられた配列 のナンバリングを用いている。Example 4 All controls to the DNA sequence of the β-lactoglobulin gene were obtained from EMBL. No, X12817 (Harris), FA7-R (NAR) , Volume 16, Pages 10379-80 (1978)) numbering is used.
プラスミドｐＵＣ，ＰＭ ベクターｐＵｃ１８ （ヤーニッシューベロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ ）ら（１９８５年）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、３３巻、ページ１０３〜１１９）の 多発性クローニング部位は、除去され、合成の；二重鎖された、新しい制限部位 、Ｐｖｕｌ／Ｍｒｕ Ｉ／Ｓａ Ｉ Ｉ／ＥｃｏＲＶ／Ｘｂａ Ｉ／Ｐｖｕ Ｉ ／ＭｌｕＩよりなるオリゴヌクレオチドで置換され、制限部位ＥｃｏＲＩおよび ＨｉｎｄＩ Ｉ Ｉで適合する５゛−突出（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）によって、隣 接された。ｐＵｃ１８のＤＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩの両方で切 断され、該５′−末端リン酸基は、当該開始物質の再連結反応Ｃｒｅｌ Ｉｇａ ｔｉ。Plasmid pUC, PM Vector pUc18 (Yanisch-Perron ) et al. (1985), Gene, vol. 33, pages 103-119). Multiple cloning sites are removed and synthetic; double-stranded, new restriction sites , Pvul/Mru I/Sa I I/EcoRV/Xba I/Pvu I /MluI, with restriction sites EcoRI and By matching 5'-overhangs in HindI I I was touched. pUc18 DNA was cut with both EcoRI and HindlII. cleavage, and the 5'-terminal phosphate group undergoes a religation reaction of the starting material. Ti.
ｎ）を防止するために、子ウシ腸ホスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｍ ａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で除去された。新しいリンカ−ＤＮＡは、ｐＵ ｃ１８の中へ結合された。新しい多発性クローニング部位の反対側に（ａｃｒｏ ｓｓ） Ｄ Ｎ Ａ配列が確認された。n) to prevent calf intestinal phosphatase (Calf Intestim al Phosphatase). The new linker DNA is pU Combined into c18. Opposite the new multiple cloning site (acro ss) DNA sequence was confirmed.
この新しいベクターは、ｐＵＣ，ＰＭと称した。This new vector was named pUC,PM.
プラスミドｐＵＣＸＳ プラスミドｐｓｓ１ｔｇＸｓ（上記比較例参照）からβ−ラクトグロブリン遺伝 子が５ｓｌｌおよびＸｂａＩ断片上に摘出され、プラスイミドｐＵＣＸＳを与え るために５ａｌＩおよびＸｂａＩで切断する、ベクターｐＵＣ，ＰＭの中に再ク ローン化された（ｒｅｃｌｏｎｅｄ）。Plasmid pUCXS β-lactoglobulin gene from plasmid pss1tgXs (see comparative example above) Pups were excised on 5sll and XbaI fragments to give plasmid pUCXS. Re-clipped into the vector pUC, PM, cut with 5alI and XbaI to Recloned.
プラスイミドｐ Ｕ ＣＸ Ｓ ／ ＲＶプラスミドｐｓｓ１ ｔ ｇＳＥ （ ＷＯ−Ａ−８８００２３９号参照）は、ポジション７５４での５ｐｈ１部位から ２０５０でのＥｃｏＲＩ部位までのβ−ラクトグロブリン遺伝子配列、そしてポ ジション１１４８でのユニークＮｏｔＩに及ぶ領域を含む。当該挿入断片は、５ ゛ −翻訳されていないβ−ラクトグロブリンｍＲＮＡにある単一のＰｖｕＩＩ 部位（８３２）を含む。当該部位の中には、プラスミドｐｓｓ１ｔｇｓＥ／ＲＶ を与えるために酵素ＥｃｏＲＶについて認識部位をエンコードしている２本鎖の 、８ｂｐ、ＤＮＡリンカ−で連結した平滑末端が存在した。ｓｐｈ ＩおよびＮ ｏｔＩによって結合したＤＮＡ配列は、その後、摘出され、そしてプラスミドｐ ＵＣＸＳ、すなわち、β−ラクトグロブリン遺伝子プロモーターおよび転写開始 の３゛の調節下、い（つかの付加ＤＮＡ配列の挿入を許容するような前記方法に おいて入れたβ−ラクトグロブリン遺伝子の中に有効に導入しているユニークＥ ｃｏＲＶ部位、の中に等量の断片を置換するために用いられた。得られたプラス ミドは、ｐＵＣＸＳ／ＲＶと称された。Plasimide p U CX S / RV plasmid pss1 t gSE ( (see WO-A-8800239) from the 5ph1 site at position 754. β-lactoglobulin gene sequence up to the EcoRI site at 2050, and the Contains the region spanning the unique NotI at position 1148. The inserted fragment is 5 ゛ -Single PvuII in untranslated β-lactoglobulin mRNA Includes site (832). In this site, plasmid pss1tgsE/RV A double-stranded chain encoding the recognition site for the enzyme EcoRV to give , 8 bp, blunt ends connected with a DNA linker were present. sph I and N The DNA sequence ligated by otI is then excised and the plasmid p UCXS, i.e., β-lactoglobulin gene promoter and transcription initiation 3. The above method allows for the insertion of some additional DNA sequences under the control of Unique E that has been effectively introduced into the β-lactoglobulin gene coRV site, was used to replace equivalent fragments into the coRV site. obtained plus The mido was designated pUCXS/RV.
プラスミドｐＵＣ８Ｖ 転写開始部位（プロモーター）の５′に位置する４、２ｋｂｐのβ−ラクトグロ ブリン遺伝子のみを含んでいるｐＵＣＸＳ／ＲＶの誘発体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖ ｅ）は、ｐＵＣ，ＰＭの中にＳａ Ｉ Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片をサブクローニング （ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）によって構成したもので、該プラスミドは、ｐＵＣ８ ｖと称された。Plasmid pUC8V A 4 or 2 kbp β-lactoglobin located 5' of the transcription start site (promoter) A derivative of pUCXS/RV containing only the bulin gene e) Subcloning the SaII-EcoRV fragment into pUC, PM (subcloning), and the plasmid was pUC8 It was called v.
プラスミドｐＢＬＡｃ１００ β−ラクトグロブリン遺伝子の３′フランキング配列の断片は、すべてのイント ロンを除去するような前記方法でサブクローン化された。ｐＵｃＸｓ／ＲＶのプ ラスミドＤＮＡは、一定の濃度のＤＮＡで、より低い濃度の酵素で実行できる酵 素滴定によってＳｍａ Ｉで部分的に消化された。Plasmid pBLAc100 Fragments of the 3' flanking sequence of the β-lactoglobulin gene contain all integrants. was subcloned in the manner described above to remove the lon. pUcXs/RV Lasmid DNA is an enzyme that can be run with a fixed concentration of DNA and a lower concentration of enzyme. Partially digested with SmaI by elementary titration.
該Ｓｍａ Ｉタンパク質は、フェノール−クロロフォルム抽出およびエタノール 沈殿によって除去され、そして該ＤＮＡは、水中に再懸濁された。当該ＤＮＡは 、次に酵素ｘｂａＩで完全に消化された。該ＤＮＡは、Ｓｍａ Ｉ部位、ポジシ ョン５２８６で一度切断し、そしてその後、ＸｂａＩで切断され、２．１ｋｂｐ の大きさの特性吸収帯を与えた。The Sma I protein was extracted with phenol-chloroform and ethanol. Removed by precipitation, the DNA was resuspended in water. The DNA is , then completely digested with the enzyme xbaI. The DNA has a Sma I site, a positive cut once with section 5286 and then with XbaI, resulting in a 2.1 kbp gave a characteristic absorption band of size .
当該吸収帯は、アガロースゲル切片から精製され、そしてプラスミドｐＢＬＡｃ １００を与えるためにｐＢｓＩＩｓＫ＋（ユナイテッド キングダム、ケンブリ ッジ、ケンブリッジ サイエンス パーク、ストラタゲン エルティディ（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ Ｌｔｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ５ｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ、 Ｃａａ＋ｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ））を切断するＳｍａｌおよびＸｂａＩの中に結合 された。The absorption band was purified from agarose gel sections and plasmid pBLAc pBsIIsK+ (United Kingdom, Cambridge) to give 100 Cambridge Science Park, Stratagene LTI (St. ratagene Ltd, Cambridge 5science Park, Combined into Smal and XbaI that cleaves Caa+bridge, UK) It was done.
プラスミドｐＭＡＤ β−ラクトグロブリンクローニングベクターｐＭＡＤは、β−ラクトグロブリン 遺伝子プロモーターおよび３′ −フランキング配列の調節下、ｃＤＮＡｓの迅 速な挿入を許容することによって構成された。前記構造物は、イントロンを含ん でいない。該プラスミドｐＢＬＡｃ１００は、ＥｃｏＲＶおよび５ａｌｌの両方 の消化によってオーブンされ、該ベクター断片は、精製したゲルであった。この 中には、Ｓａ Ｉ Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片としてプラスミドｐＵＣ８ｖから４．２ ｋｂｐプロモーターが結合された。当該構造物は、ｐｓＴｌと称され、４．２ｋ ｂｐプロモーターおよび２１ｋｂｐの３′フランキング配列をエンコードしてい るβ−ラクトグロブリンミニ遺伝子を構成する。ユニークＥｃ。Plasmid pMAD β-lactoglobulin cloning vector pMAD is β-lactoglobulin cloning vector pMAD. The rapid production of cDNAs under the control of gene promoters and 3'-flanking sequences configured by allowing fast insertion. The structure includes an intron. Not there. The plasmid pBLAc100 contains both EcoRV and 5all. The vector fragment was gel purified. this 4.2 from plasmid pUC8v as a SaII-EcoRV fragment. kbp promoter was attached. The structure is called psTl and is 4.2k bp promoter and 21 kbp 3' flanking sequences. It constitutes a β-lactoglobulin minigene. Unique Ec.
ＲＶ部位は、いくつかの付加ＤＮＡ配列の平滑末端クローニングを与えるために 存在する。酵素Ｍ １ ｕ Ｉで新規なβラクトグロブリン遺伝子構造物の摘出 を許容するために、５ＰＴ１からの完全なミニ−遺伝子は、Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔ■ 断片上で摘出され、標準条件下、ＤＮＡ末端がフレノウポリメラーゼで平滑にさ れ、そして平滑末端がｐＭＡＤを与えるためにｐＵＣ，ＰＭのＥｃｏＲＶ部位の 中にクローＫｐｎＩ部位によってフランクした、タンパク質Ｃ遺伝子の１４５０ ｂｐのｃＤＮＡは、プラスミドｐＷＡＰＣ２の形成において得られた。該ｃＤＮ Ａは、ＫｐｎＩ断片として摘出され、３゛突出がＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理 することによって平滑され、断片ゲルが精製され、そして平滑末端がｐＭＡＤの ＥｃｏＲＶの中にクローン化された。The RV site is used to allow for blunt-end cloning of some additional DNA sequences. exist. Extraction of novel β-lactoglobulin gene construct using enzyme M1uI The complete mini-gene from 5PT1 is The fragments were excised and the DNA ends were blunted with Freneau polymerase under standard conditions. and the blunt ends of the EcoRV site of pUC,PM to give pMAD. 1450 of the protein C gene, flanked by clone KpnI sites in bp cDNA was obtained in the formation of plasmid pWAPC2. The cDN A was excised as a KpnI fragment and the 3' overhang was treated with T4 DNA polymerase. fragment gel purified and the blunt ends of pMAD Cloned into EcoRV.
配向は、制限消化によって決定され、ＤＮＡ配列によって確認された。当該構造 物は、プラスミドｐｃＯＲＰ２であり、β−ラクトグロブリン遺伝子５′および ３′フランキング配列の転写調節下、タンパク質ＣｃＤＮＡを含む。Orientation was determined by restriction digestion and confirmed by DNA sequencing. The structure The product is plasmid pcORP2, which contains β-lactoglobulin gene 5' and Contains the protein C cDNA under the transcriptional control of 3' flanking sequences.
イントロンは、存在しない。Introns do not exist.
微注入に対するｐｃＯＲＰ２からＣ０ＲＰ２断片の単離プラスミドｐｃＯＲＰ２ は、Ｍ １ ｕ Ｉで完全に消化され、得られた７、７５ｋｂのｐｃＯＲＰ２断 片は、電気泳動分離後、１％寒天ゲルから摘出された。該ＤＮＡは、プレバーゲ ン（ＰＲＥＰＡＧＥＮＥ） （登録商標）キット（バイオラット（Ｂｉｏｒａｄ ））を用いてアガロース切片から精製され、希釈および微注入のために用意ので きたＴＥ緩衝液に溶離された。Isolation of C0RP2 fragment from pcORP2 for microinjection Plasmid pcORP2 was completely digested with M1uI, resulting in a 7.75 kb pcORP2 fragment. Pieces were excised from a 1% agar gel after electrophoretic separation. The DNA is PREPAGENE (registered trademark) kit (Biorad )) and prepared for dilution and microinjection. It was eluted in the TE buffer.
形質転換マウスの生産 形質転換マウスは、ゴートン（Ｇｏｒｄｏｎ）およびルードル（Ｒｕｄｄｌｅ） によって書かれた「メリーズ イン エンザイモロジイーＪ、１０１巻、［（１ ９８３）、ウー、グロスマンおよびモルディプ編集コ、アカデミツク ブレス ｐｐ４１１−４３２ （”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”、Ｖ ｏｌ １０１． ［（１９８３）Ｅｄａ、Ｗｕ、Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍ ｏ１ｄａｖｅ コ 、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ４１１−４３２）と して事実上、直接−前核（ｐｒｏ−ｎｕｃｌｅａｒ）注入によって発生された。Production of transgenic mice Transgenic mice are Gordon and Ruddle. Mary's in Enzymology J, Volume 101, [(1 983), edited by Wu, Grossman and Moldip, Academic Breath. pp411-432 (“Methods in Enzymology”, V ol 101. [(1983) Eda, Wu, Grossman and M. o1dave Co., Academic Press pp411-432) virtually generated by direct pro-nuclear injection.
該「β−ラクトグロブリン」構成物および「タンパク質Ｃ」構成物は、全体濃度 ６μｇ ／ ｍρで、等モル比と非等モル比（タンパク質Ｃに対して１：３）の 両方で同時注入された。１２匹の創始マウスが生産され、すべてのものは、両方 の形質転換を組込まれた。The "β-lactoglobulin" and "Protein C" components have a total concentration of 6μg/mρ, equimolar ratio and non-equimolar ratio (1:3 for protein C). Both were co-injected. Twelve founder mice were produced, all with both integrated transformation.
マウスエラグの中にＣ０ＲＰ２ ＤＮＡの単独の注入は、形質転換マウスの１１ 系列の世代に発生した。乳は、これらのマウスから採取され、ＥＬＩＳＡによっ てタンパク質Ｃの存在について解析された。該ＥＬ Ｉ ＳＡは、二重抗体サン ドイッチ原理に基づいてなされ、タンパク質Ｃを誘発するヒト血漿に対して調達 したウサギポリクローナル抗体が用いられた。該ＥＬＩＳＡは、１１００ｎ／ｍ １と同等の低いレベルでタンパク質Ｃを測定することができるが、形質転換Ｃ０ ＲＰ２マウス乳（表５参照）の１１系列のいずれからもタンパク質Ｃを検出する ことは不可能であった。Single injection of C0RP2 DNA into mouse elags resulted in 11% of transgenic mice. It occurred in a series of generations. Milk was collected from these mice and tested by ELISA. The presence of protein C was analyzed. The EL I SA is a double antibody sample. Made on the German principle and sourced for human plasma inducing protein C A rabbit polyclonal antibody was used. The ELISA is 1100n/m Protein C can be measured at levels as low as 1, but transformed C0 Protein C is detected in any of the 11 series of RP2 mouse milk (see Table 5). That was impossible.
表５ 単独のＣ０ＲＰ２構成物よりなる形質転換マウスの乳におけるヒトタンパク質Ｃ のレベル ９４−４−ｖｅ 表５（続き） ヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子（ＵＣＸＳ／ＲＶ）と共にＣ０ＲＰ２構造物 の同時注入は、３種の形質転換系列の世代に生じた。表６は、上記に記載された ＥＬＩＳＡによって測定されたと同様にしてこれらのマウスから取られた乳サン プルにおけるタンパク質Ｃのレベルを示す。Table 5 Human protein C in the milk of transgenic mice consisting of a single C0RP2 construct level of 94-4-ve Table 5 (continued) C0RP2 construct with ovine β-lactoglobulin gene (UCXS/RV) Co-injection of 0.00000000000000000000000000000000000000000.0000000000000000000000000000 000 000 000000 Table 6 is as described above. Milk samples taken from these mice as determined by ELISA Levels of protein C in the pulls are shown.
表６ ＣＯＲＰ２構成物およびヒツジβ−ラクトグロブリン遺伝子（ＵＣＸＳ／ＲＶ） の両方よりなる形質転換マウスの乳におけるヒトタンパク質Ｃのレベル マウス 系列 タンパク質Ｃの濃度 ９９−２ １．７μｇ／ｍｕ １０２−７ １５μｇ／ｍ＃ １０３−４ −ｖｅ Ｆ／Ｇ、ｌ、ａ Ｐｖｕｒｌ消化および自己結合 フレノウ平滑したＨｉｎｃＩＩＩ−ＡｃｃＩＡＡＴ ｃＤＮＡに消化されかつ結 合されたＰｖｕＩＩＢ通り結合：ＨｉｎｃｌＩＩＩ−ＸｂａＩ ｐＵｃ１９Ｈｉ ｎｄＩＩＩ−３ｐｈｌ ｐＢＪＩ ＳｐｈＩ−Ｘｂａｌ ｐＢＪ１２またはｐＢＪ９ＡＴ−Ｄ ０’ｌｌ ％ 補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成 ５年 ６月２４日Table 6 CORP2 construct and ovine β-lactoglobulin gene (UCXS/RV) Levels of human protein C in the milk of transgenic mice consisting of both Mouse series protein C concentration 99-2 1.7μg/mu 102-7 15μg/m# 103-4-ve F/G, l, a Pvurl digestion and self-ligation The Frenow blunted HincIII-AccIAAT cDNA was digested and ligated. Combined PvuIIB binding: HinclIII-XbaI pUc19Hi ndIII-3phl pBJI SphI-Xbal pBJ12 or pBJ9AT-D 0'll% Copy and translation of written amendment) Submission form (Article 184-8 of the Patent Act) June 24, 1993
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