JPH06508036A - 組換えニューロトロフィンの生産および回収 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えニューロトロフィンの生産および回収本出願は、１９９１年６月１２日付 の係属中の出願番号０７／７１５．１８５の一部継続出願であり、その全体を参 照によりここに組み入れる本発明は、神経生物学、分子生物学およびタンパク質 生化学の分野、特に二二一口トロフィンとその生産・回収方法に関するもニュー ロトロフィンは神経系の機能性に関与するタンパク質群である。それらは神経細 胞の成長を刺激し、胚の発生期にはそれらの生存を支援する。これまでに、研究 者らは４種類のニューロトロフィンを同定している：神経成長因子（ＮＧＦ）　 （Ｕｌｌｒｉｃｈｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１ −８２５）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）　（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２）　、神経栄養因 子３　（ＮＴ　−３）　（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９ ０．５ｃｉｅｎｃｅ２４７：１４４６−１４５１）およびニューロトロフィン− ４（Ｈａｌｌｂｏｏｋ、　ｅｔａｌ、、　１９９１．　Ｎｅｕｒｏｎ　６：８４ ５−８５８）　、神経成長因子は末梢および交感神経系並びに脳のコリン作動性 ニュ・−ロンの発達および生存にとって不可欠である。目下、これはアルツハイ マー病に応用すべく試験中である。ＢＤＮＦは中枢神経系の知覚ニューロンの生 存を促進し、パーキンソン病の治療に有望視されている。ＮＴ−３とＮＴ−４は 最近発見されたものであり、それらの生物学的役割が研究されているところであ る。ＮＧＦと同様に、ＮＴ−３は知覚ニューロンと交感神経ニューロンに作用す るらしい。

天然のヒトＮＧＦは３つのサブユニット、つまりα、βおよびγを有する。βサ ブユニットのみが神経栄養活性を示す。β−ＮＣＦはプレープロータンパク質と して生産され、細胞から分泌されて成熟型にプロセシングされる。プレープロー ペプチドは１８７個のアミノ酸残基を含んでいる。プロセシングの間に、プレー およびブロー配列が除かれ、Ｃ末端の２つのアミノ酸残基も除かれる。これによ り、１１８アミノ酸残基より成る成熟タンパク質が生成する。成熟タンパク質は ３つのジスルフィド結合を形成スる６個のシスティン残基を有する。さらに、当 該タンパク質は中性ｐＨで正の電荷をもたらす塩基性アミノ酸を多数含んでいる 。

構造上、ニューロトロフィンは明らかに共通の先祖遺伝子から進化した１つのフ ァミリーを構成している（Ｈｙｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１゜Ｗｏ　９１ １０３５６８）。例えば、ヒトＮＧＦ　（ｈＮＧＦ）のβポリペプチドのアミノ 酸配列はマウスＮＧＦおよびウシＮＧＦと９０％相同である。３種のヒトニュー ロトロフィン、ｈＮＧＦ、ｈＢＤＮＦおよびｈＮＴ−３はアミノ酸レベルで６０ ％の相同性を共有する。

６個のシスティン残基もすべての既知ニューロトロフィンにおいて保存されてお り、ジスルフィド結合が機能にとって重要であることを示唆している。

ニューロトロフィンの天然源は限られている。マウスの顎下腺はＮＧＦに富んで いるが、単離するのが難しく、しかも回収される量が少ない（Ｈｙｍａｎ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９９１．　Ｗｏ　９１１０３５６８）。ｄｅｌ　ＩａＶａｌｌｅ ら（ＥＰ　Ｏ３３３５７４，１９８９）は、クロマトグラフ分画化によりヒト胎 盤から少量のｈＮＧＦを単離したと報告している。

かくして、研究者らは生物学的に活性なニューロトロフィンの容易に手に入る供 給源を確保するために分子遺伝学の方面に歩み始めた。ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよび ＮＴ−３をコードするＤＮＡ配列はすべて単離されている（Ｕｌｌｒｉｃｈ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１−８２５；　Ｈｙｍａｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９９１．　ＷＯ９１１０３５６８；　Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 ＷＯ９１１０３５６９；およびＫａｉｓｈｏ　ｅｔ　ａｌ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅ ｔｔｅｒｓ　２６６：１８７−１９１）。研究者らは、ニューロトロフィンを発 現させるために、これらの配列を用いて動物と動物以外の宿主を形質転換した。

Ｋａｎａｙａら（１９８９，Ｇｅｎｅ　８３：６５−７４）は、成熟ｈＮＧＦを コードするＤＮＡ配列を、酵母のα−接合因子プレープロ配列をコードする配列 に融合させた。これを発現させると、培養上清がα−ｈＮＧＦ抗体により認識さ れるタンパク質を含んでいた。しかしながら、部分精製されたタンパク質は低い 神経栄養活性を示した。その上、発現レベルも低かった。Ｋａｎａｙａらは、こ れらの結果が、成熟化の過程で２個の余分のＣ末端アミノ酸残基を酵母系が除去 できなかったこと、またはｈＮＧＦの折りたたみに問題があったことのいずれか のためであろうと述べている。

Ｃｈａｎら（ＥＰ　Ｏ３７０１７１，１９９０）は昆虫細胞において成熟ｈＮＧ Ｆを生産した。彼らは、プレープローｈＮＧＦの遺伝子をバキュロウィルスＤＮ Ａのポリへドリンプロモーターとリーダー配列に融合させたところ、６μｇ／ｍ ｌのｈＮＧＦが産生されたと報じた。しかし、この生産物の物理的な特性決定は 行われなかった。

また、研究者らは、哺乳動物の発現系においてヒトＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ −３を発現させた。ＢｒｕｃｅとＨｅ１ｎｒｉｃｈ　（１９８９゜Ｎｅｕｒｏｂ ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ａｇｉｎｇ　１０：８９−９４）は、ＣＯＳ細胞において ｈＮＧＦの完全な前駆体をコードするＤＮＡ配列を発現させ、そして調整培地中 でｈＮＧＦの２量体を検出した。しかしながら、彼らはプレープローｈＮＧＦが 成熟ｈＮＧＦに転換される効率を調べなかった。Ｋａｋｉｎｕｍａら（ＩＥＰ　 ０４１４１５１．１９９１）はＣＨＯ細胞において活性ｈＮＧＦを発現させた。

Ｈｙｍａｎら（ＷＯ９１１０３５６８，１９９１）はＣＨＯ細胞においてｈＢＤ ＮＦを発現させた。Ｎａｋａｈａｍａら（ＥＰｏ　３８６７５２、１９９０）お よびＨｏｈｎら（ＷＯ９１１０３５６９，１９９１）はＣＯ８細胞においてｈＮ ”ｒ−３を発現させた。

哺乳動物系は哺乳動物タンパク質の生産にとって最も自然に近い環境を提供する 。ところが、これらの系で大量のタンパク質を生産するには非常に費用がかかる 。従って、あまり費用がかからず、しかもより生産的である系を開発する必要が ある。このような系の１つが大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）である。

研究者らは、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて二二一口トロフィンを発現させようと試み たが、あまり成功しなかった。ＧｒａｙとＵｌｌｒｉｃｈ　（ＥＰ　０１２１３ ３８、１９８４）は、Ｎ−メチオニル−ｈＮＧＦをコードする発現ベクターを構 築し、この遺伝子をＥ、　ｃｏｌｉにおいて発現させた。

彼らはウェスタンプロットでの免疫検出によりｈＮＧＦを同定したと報じたが、 そのタンパク質を単離しておらず、生理活性も実証していない。

ＨｕとＮｅｅｔ　（１９８８，Ｇｅｎｅ：５７−６５）はＥ、　ｃｏｌｉにマウ スＮＧＦを発現させようとした。彼らは成熟マウスＮＧＦをコードするＤＮＡ配 列をクローニングし、その際天然タンパク質のＮ末端アミノ酸であるセリンをメ チオニンに置き換えた。彼らはこのＤＮＡ配列を温度誘導性のラムダＰＬプロモ ーターを有するプラスミドの中に挿入した。この系は他の異種タンパク質を全細 胞タンパク質の１０〜２５％の割合で発現する。彼らはこの遺伝子を発現させ、 そして硫酸アンモニウム沈殿とこれに続くアセテート緩衝液に対する透析により ＮＧＦを単離した。しかし、バイオアッセイで試験したところ、この系はたった ０、０００５〜０．１％のＮＧＦを産生じたにすぎなかった。著者らは、予想に 反して非常に低い収率は細胞に対するＮＧＦの毒性、ｍＲＮＡの不安定性または 翻訳効率の悪さ、あるいは再生された酸化型タンパク質のジスルフ゛　イド結合 のミスマツチのためであろうと推測した。

Ｉｗａｉら（１９８６，Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、　３４：４７２ ４−４７３０）は、Ｅ。

ｃｏｌｉに好まれるコドンを有するｈＮＧＦコード化遺伝子の合成を報告した。

彼らはこの遺伝子をＮ−メチオニル−ｈＮＧＦとして直接、あるいはヒト成長ホ ルモンとの融合タンパク質として発現させた。直接発現は融合タンパク質の発現 のたった４分の１の効率であった。彼らは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより当該タンパク 質を試験したが、他の方法ではそれらを単離しなかった。

Ｄｉｃｏｕら（１９８９，Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２２：１３− １９）は、マウスのプレープローＮＧＦおよびｈＮＧＦのフラグメントを、β− ガラクトシダーゼとの融合タンパク質として発現させたところ、プロテアーゼ阻 害剤の添加が収量を向上させることを見いだした。

要約すると、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいてニューロトロフィンを発現させる従来の試 みは、細胞死、低レベルのタンパク質蓄積、そして実際上生理活性のないタンパ ク質の発現をもたらした。

３、　発明の要約 本発明は、動物以外の宿主細胞から生物学的に活性な組換えニューロトロフィン を生産しかつ回収する方法を提供する。組換えニューロトロフィンの生産方法は 、ニューロトロフィンをコードするＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結された発 現制御配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞を培養することから 成っている。ニューロトロフィンが細胞質中で直接発現される場合、宿主細胞は プロテアーゼ欠損変異株、我々が知っている最良の方法によれば、熱シヨツク調 節遺伝子変異株であることが好ましい。細菌宿主では、ニューロトロフィン遺伝 子を制御可能なプロモーターの支配下におき、そして細胞が後期対数期に達する まで発現を非誘導または抑制することが好ましい。また、ニューロトロフィンを コードするＤＮＡ配列の上流にシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入 すると、生産中にニューロトロフィンを細胞から分泌させることができる。

宿主細胞培養物により産生された生物学的に活性な組換えニューロトロフィンの 回収方法は、強い変性剤を含むが還元剤を本質的に含まない溶液中でニューロト ロフィンを可溶化することから成っている。本発明の一態様によれば、この溶液 はプロテアーゼによるニューロトロフィンの分解を阻止するのに効果的な量のプ ロテアーゼ阻害剤をさらに含んでいる。本発明の他の態様は、さらに、次の段階 ：強い変性剤を弱い変性剤と交換すること；非変性環境におけるニューロトロフ ィンの溶解性を維持するのに効果的な濃度で塩基性アミノ酸または同等物を含む ように当該溶液を調整すること；当該溶液中の他の分子からニューロトロフィン を精製すること；弱い変性剤を除くこと；そして変性剤の非存在下で精製を完結 させること；の一部または全部から成っている。

本発明のさらに別の態様では、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて発現されかつ生理活性形 態で回収されるニューロトロフィン分子がニューロトロフィン−４である。Ｅ、 　ｃｏｌｉでの生理活性ＮＴ−４の発現に向けられる本発明の好ましい態様にお いて、ＮＴ−４は図１１（配列番号＝２２）でｈＮＴ−４について実質的に示し た配列を含む核酸分子によりコードされるか、あるいはこのような配列に少なく とも約７０％相同である配列を含むことができる。

４、　図面の説明 図１は、プラスミドｐＲＰＮ１３３の模式図である。実線はｐＢＲ３２２に由来 するＤＮＡ配列を表し、複製起点（ＯＲＩ）とβ−ラクタマーゼ遺伝子（アンピ シリン耐性’）（Ａｐ）を示しである。このプラスミドに特有な特徴はボックス 領域で示され、矢印は転写または複製の方向を示す。Ｐｉ、はラムダＰＬプロモ ーターを示す。

ｒｂｓ　ｌはファージＴ７φ１．ｌの野生型プロモーターとリポソーム結合部位 である。ｈＮＧＦ遺伝子は成熟ポリペプチドをコードし、２番目のアミノ酸残基 セリンがトレオニンで置換されている。ｃＩ８５７は熱不活化しうるλリプレッ サー遺伝子を示す。

図２は、（Ａ）Ｅ８ニワトリ胚の背板神経節（ＤＲＧ）外植片、および（Ｂ）解 離されたＥ８　ＤＲＧによるＥ、　ｃｏｌｉで生産された組換えヒトＮＧＦに対 する用量−反応曲線を示す。

図３は、野生型ＬａｍＢ　（図３Ａ、配列番号＝１）および合成ＬａｍＢ、すな わちＬａｍＢ１（図３Ｂ、配列番号：２）、ＬａｍＢ２（図３０、配列番号：　 ３）　、ＬａｍＢ５　（図３Ｄ、配列番号：４）およびＬａｍＢ４　（図３Ｅ、 配列番号：５）、のシグナル配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。

図４は、修飾したＬａｍＢシグナル配列、ＬａｍＢ１およびＬａｍＢ５、のシグ ナル配列プロセシング速度論を示す。我々は相応のＬａｍＢ−ｈＢＤＮＦプラス ミドを含むＢＬ２１／ＤＨ３株を培養した。この株では、Ｔ７　ＲＮＡポリメラ ーゼをコードする遺伝子が染色体に挿入されており、ｌａｃプロモーターの転写 制御下にある（Ｓｔｕｄｉｅｒ　ａｎｄ　Ｍｏｆｆａｔｔ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ｂｉｏｌ、　１８９：１１３−３０）。増殖している細胞にＩ　ＰＴＧを１０分 間加えると、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼが合成される。その後、リファンピシン を加えて０．２ｍｇ／ｍｌとすると、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＲＮＡポリメラーゼによ る転写が阻止されて、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによる転写が起こる。その結果 、ｒｂｓ２のＴ７後期φ１．　ｌプロモーターおよびリポソーム結合部位のすぐ 下流に置かれたＬａｍＢ−ｈＢＤＮＦ遺伝子の選択的転写が生じる。細胞に３５ ３−メチオニンを３０秒間パルスし、その後過剰の非放射性メチオニンでチェー スした。培養物のサンプルをチェース後の図示した時間に採取し、ラベル化タン パク質を５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥとフルオログラフィーで分析した。プロセシン グはＬａｍＢ−ｈＢＤＮＦの前駆体および成熟体のデンジトメトリック走査によ り測定した。

図５は、ｐＲＰＮ１２１の模式図である。実線はｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡ 配列を表し、複製起点（ＯＲＩ）とβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｐ）を示しであ る。このプラスミドに特有な特徴はボックス領域で示され、矢印は転写または複 製（ＯＲＩ）の方向を示す。

を作るためにデザインされた、野生型からの若干のヌクレオチド置換を有するＴ ７φ１．　１プロモーターおよびＴ７φ１．　１リポソ一ム結合部位を示す。Ｌ ａｍＢ２はシグナル配列である。ｈＢＤＮＦｍｙｃが構造遺伝子である。

図６は、ｈＢＤＮＦｍｙｃのファーストＳ−セファ０−ス■１（Ｆａｓｔ　Ｓ− ３ＥＰ）ＩＡＲＯ８Ｅ■ｌ）分画化のタンパク質プロフィールを示す。ＤＥＡＥ クロマトグラフィー後（７）　Ｗ３１１０１ｑＦ−／りＲＰＮ１２１抽出物を、 記載した通りに、１．６　ｃｍＸ　６．５　ｃｍのファーストＳ−セファロース ■カラムで７Ｍ尿素、５０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５゜０．１ｍＭ　ＥＤＴＡによ り分画化した。図示した両分を５ＤＳ−１５％ＰＡＧＥで分析し、タンパク質を クーマシー染色で視覚化した。画分２６〜３ｏをプールした。

図７は、精製方法ノ要約である。Ｗ３１１０１’Ｐ−／ｐＲＰＮ１２１株を増殖 し、誘導し、そして上記のように抽出した。プールしたカラム画分を１５％アク リルアミドゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、クーマシーブルーで染色し た。レーン１．ＤＥＡＥ、Ｌ／−ン２．ファーストＳ−セファロースｏ１；レー ン３．ファーストＳ−セファロース■２；レーン４．Ｃ４逆相ＨＰＬＣ，分子量 標準を示しである。

図８は、精製されたｈＢＤＮＦｍｙｃにょるＥ８ニワトリ胚のＤＲＧ神経突起成 長の刺激についての用量−反応曲線を示す。ｈＢＤＮＦｍｙｃの活性をチャイニ ーズハムスター卵巣細胞系から精製した組換えｈＢＤＮＦと比較する。両タンパ ク質はＣ４逆相ＨＰＬＣで９５％以上に精製した。

図９は、Ｅ、　ｃｏｌｉから精製された組換えｈＢＤＮＦによるＥ８ニワトリ胚 のＤＲＧ神経突起成長の刺激についての用量−反応曲線を示す。ｈＢＤＮＦはＣ ４逆相ＨＰＬＣで９５％以上に精製した。

図１０は、ｐＲＰＮ１４９の模式図である。実線はｐＢＲ３２２に由来するＤＮ Ａ配列を表し、複製起点（ＯＲＩ）とβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｐ）を示しで ある。このプラスミドに特有な特徴はボックス領域で示され、矢印は転写または 複製（ＯＲＩ）の方向を示す。

１ａｃＵＶ５はプロモーターである。ｒｂｓ２は便利な制限部位を作るためにデ ザインされた、野生型からの若干のヌクレオチド置換を有するＴ７φ１．１プロ モーターおよびＴ７φ１．　ｌリポソーム結合部位を示す。ＬａｍＢ１はシグナ ル配列である。ｈＢＤＮＦが構造遺伝子である。

図１１は、ヒトＮＴ−４をコードする単離したヒトゲノミックファージクローン ７−２の一部のＤＮＡ配列である（配列番号：２２；ＡＴＣＣ受託番号ニア５０ ７０）。このゲノミッククローン７−２によりコードされる推定上のｈＮＴ−４ タンパク質をアミノ酸の一文字記号で表しである（配列番号＝２３）。ボックス で囲った領域はｈＮＴ−４プレタンパク質の推定上の開裂部位を表す。矢印はプ レ配列において保存された残基を示す。下線を引いた領域（Ｎ−Ｒ−３）はＮ− グリコジル化のための共通配列を表す。円で囲った領域は開始メチオニンを表す 。スプライス受容部位が塩基対４６１−４６２　（ＡＧ）に存在し、これはイン トロンの３′末端を表す。

図１２は、ｐＲＧ９１の模式図である。実線はｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡ配 列を表し、複製起点（ＯＲＩ）とβ−ラクタマーゼ遺伝子を示しである。このベ クターに特有な特徴はボックス領域で示される。１ａｃＵＶ５はプロモーターで ある。ｒｂｓ　２はファージＴ７φ１．１プロモーターおよびＴ７φ１．１リポ ソ一ム結合部位である。ＬａｍＢ２はシグナル配列である。

プラスミドｐＲＧ９１　（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓ）は、組換えタンパク質の発現と大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ）の細胞周辺腔へのその分泌のためにデザインされた、ｐＢＲ３２２を土台とし たベクターである。このベクターは、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩとＮｒｕ　Ｉ制 限部位の間に挿入された、調節される強い１ａｃＵＶ５プロモーターと、その後 にファージＴ７φ１．１プロモーターおよびリポソーム結合部位を含んでいる。

これらの調節要素はＬａｍＢ２シグナル配列の発現を支配し、このシグナル配列 に組換えタンパク質の遺伝子配列を融合させることができる。唯一のＮｒｕ　Ｉ とＰｖｕ　Ｉ　Ｉ制限部位の間のＤＮＡ配列が欠失されたことにより、プラスミ ドのコピー数が増加する。このプラスミドはアンピシリン（Ａｐ）耐性を付与す る。

図１３は、Ｅ、　ｃｏｌｉにおいて発現されたｈＮＴ−４の用量−反応曲線を示 す。プラスミドｐＲＧ１７３を含むＲＦＪ２６株の誘導培養物からの可溶性タン パク質抽出物について、Ｅ８背根板経節外植片で検定した。この検定法のバック グラウンド活性は０．　２単位であった。

図１４は、ＣＡＴ活性に及ぼすｈＮＴ−４の効果を示す。プラスミドｐＲＧ１７ ３を含むＲＦＪ２６株の誘導培養物からの部分精製抽出物で運動ニューロンに富 む培養物を処理すると、未処理対照（Ｃ−ＮＴ）および緩衝液対照（Ｃ−緩衝液 ）と比較して、４８時間後のＣＡＴ活性が３．６倍（１：２０の希釈で）増加し た。Ｅ。

ｃｏｌｉ抽出物は、運動ニューロンに富む培養物の処理に先立って、以下に記載 するようにセファロース−Ｓカラムにかけた。

（本頁以下余白） 本明細書中において使用される「ニューロトロフィン」という用語は、ニューロ トロフィン族に属する任意の天然物質を指す。

これは、公知のニューロトロフィンとアミノ酸配列相同性を共有しかつ６個の特 徴的なシスティン残基を保存する天然のタンパク質を含む。（これらのタンパク 質の一部は構造的に見ればニューロトロフィン族に属し得るが、神経栄養活性以 外の生物学的活性を示すこともある。）「ニューロトロフィン」という用語はま た、天然のニューロトロフィンから誘導され、もしくはそれを鋳型として生成さ れたアミノ酸配列を有する人工のニューロトロフィンをも指す。その実例として は、相異なる二二一口トロフィン（たとえば、ＮＧＦおよびＮＴ−３）から得ら れたアミノ酸配列または相異なる生物種に由来する同じニューロトロフィン（た とえば、ｈＢＮＤＦおよびブタＢＤＮＦ）から得られたアミノ酸配列から成るキ メラニューロトロフィン、遺伝子配列が点置換、付加または欠失変異を有するよ うなニューロトロフィン、プレープロー配列から誘導されたニューロトロフィン ［たとえば、天然の遺伝子（「完全な長さのニューロトロフィン」）の停止コド ンの直前のコドンによってコードされる２個のカルボキシル末端アミノ酸残基を 有するニューロトロフィン］、並びに神経栄養活性を示すニューロトロフィンの 断片（たとえば、最初の６個のアミノ酸が変化または欠失したもの）が挙げられ る。これらの実例は説明目的のために示されたものであって、定義範囲を限定す るものと解すべきでない。

本発明は、生物学的に活性な組換えニューロトロフィンを生産しかつ回収するた めの方法を提供する。本発明はまた、これらの方法によって得られる精製された 均質な組換えニューロトロフィンをも提供する。本明細書中において使用される 「組換えタンパク質Ｊとは、組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された宿主細胞 において該組換えＤＮＡ分子から発現されたタンパク質を意味する。「組換えＤ ＮＡ分子」とは、相異なる供給源から得られたＤＮＡ配列同士を互いに連結して 成るハイブリッド分子である。サムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）等（１９８９ ，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）は、組換 えＤＮＡ工学に関する多くの常用技術を記載している。

本発明に従って組換えニューロトロフィンを生産するためには、ニューロトロフ ィンをコードするＤＮＡ配列に機能し得る状態で連結された発現調節配列を有す る組換えＤＮＡ分子を用いて形質転換された非動物宿主細胞を培養することが必 要である。発現調節配列がポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に機能し得る状 態で連結されるということは、該発現調節配列が該ＤＮＡ配列の転写および翻訳 を指令しかつ促進することを意味する。形質転換された宿主細胞を培養するため には、細胞の増殖およびＤＮＡ配列の発現のために適した培養条件下で細胞をイ ンキュベートすることが必要である。

二二一口トロフィンをコードするＤＮＡ配列は幾つかの供給源から入手すること ができる。文献中には、４種の公知ヒトニューロトロフィン［すなわち、ｈ　Ｎ 　Ｇ　Ｆ　（Ｇｒａｙ等、　ＥＰ　０１２１３３８．１９８４）、ｈ　Ｂ　Ｄ　 Ｎ　Ｆ　（Ｈｙｍａｎ等、　Ｗｏ　９１１０３５６８）、ｈ　ＮＴ　−３（Ｈｏ ｈｎ等。

Ｗｏ　９１１０３５６９）およびアフリカッメガエルＮ　Ｔ　−４（Ｈａｌ　１ ｂｏｏｋ等。

１９９１、　Ｎｅｕｒｏｎ　６：８４５−８５８）　］並びに多くの非ヒトニュ ーロトロフィンに関するＤＮＡ配列が開示されている。ＰＣＲ増幅のために適し たオリゴヌクレオチドプライマーを作製するための指針を得るためには、これら の配列を参照することが好ましい。ゲノムライブラリーがＰＣＲ鋳型のための適 当なりＮＡ源である。また、ニューロトロフィンｍＲＮＡを発現することが知ら れている細胞のｃＤＮＡライブラリーも有用である。たとえば、ヒト胎児脳ｍＲ ＮＡのｃＤＮＡライブラリーはｈＢＤＮＦに関する配列を含有している。また、 当業界において公知のごとき任意の方法を用いてｃＤＮＡおよびゲノムライブラ リーのスクリーニングを行うことにより、ニューロトロフィンをコードするＤＮ Ａ配列を同定しかつ単離することもできる。あるいはまた、通常のＤＮＡ自動合 成装置を用いて合成または半合成遺伝子を作製することもできる。

研究音速が新しいニューロトロフィンをコードするＤＮＡ配列を発見することは 疑う余地がないが、本発明の方法はこのような二二一口トロフィンを生産しかつ 回収するためにも有用であろう。

一層詳しく述べれば、一般的に言って本発明は、ＮＴ−４またはそれの誘導体も しくは断片をコードする核酸を含む組換え細菌を該細菌によるＮＴ−４またはそ れの誘導体もしくは断片の発現を可能にするような条件下で増殖させ、次いで生 産されたＮＴ−４またはそれの誘導体もしくは断片を回収することによってＮＴ −４またはそれの誘導体もしくは断片を得る方法に関する。好適な実施の態様に おいては、ＮＴ−４はヒトＮＴ−４である。別の実施の態様においては、キメラ タンパク質または融合タンパク質であるＮＴ−４誘導体が生産される。最も好適 な実施の態様においては、生産されるＮＴ−４またはそれの誘導体もしくは断片 は生物学的活性を有する。すなわちそれは、当業界において公知あるいは本明細 書中に記載のごとき任意の方法（たとえば、Ｅ８のＤＲＧ外植片において成長を 促進し得る能力、あるいは後記第９節に記載されるごとく純化された運動ニュー ロン培養物中においてＣＡＴ活性を刺激し得る能力のｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験法） によって測定した場合、ＮＴ−４の公知機能活性の１種以上を示し得るのである 。

本発明の特定の実施の態様においては、ヒトＮＴ−４をコードする配列が大腸菌 発現系において発現され、また下記に開示されるような精製方法の使用によって 有用な量のヒトＮＴ−４が製造される。こうして発現されるヒトＮＴ−４をコー ドする核酸は、核酸ｐＲＧ１７３　（ＡＴＣＣ受託番号７５１３１）またはＨＧ ７−２　（ＡＴＣＣ受託番号７５０７０）中に含有され、あるいは図１１中に示 されたもの（配列番号：２２）であり得る。また、かかる核酸は、当業界におい て公知のごとき任意の方法または以下に記載される手順によって単離することが できる。すなわち、公知のＮＴ−４配列または公知のニューロトロフィン由来の 保存アミノ酸配列に対応した全ての可能なコドンを表わす５°および３゛オリゴ ヌクレオチドの混合物がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーと して使用される。ヒト（もしくはその他の哺乳動物）のｃＤＮＡまたはゲノムラ イブラリーの一次および二次ＰＣＲ増幅反応の結果としてＰＣＲ産物が単離され るが、このＰＣＲ産物を３２ｐ標識プローブとして使用することによってＮＴ− ４をコードする完全な長さのｃＤＮＡまたはゲノムクローンを単離することがで きる。本明細書中において使用される「ヒトニューロトロフィン−４」という用 語は、アフリカッメガエルのＮＴ　−４０（ａｌｌｂｏｏｋ等、　１９９１．　 Ｎｅｕｒｏｎ　６：８４５−８５８）に対する任意のヒト相同体［たとえば、別 種のものではあるが相同な（たとえば、少なくとも約７０％の相同性を有する） ニューロトロフィン分子を含む］を意味するものと理解すべきである。

文献中には、形質転換された非動物宿主においてＤＮＡ配列を発現するために有 用な各種の発現調節配列が開示されている。その実例としては、細菌の場合、ｌ ａｅ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、λＰＬプロモーター、Ｔ７後期プロモ ーター、およびｆｄコートタンパク質の調節領域が挙げられる。また、酵母の場 合には、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、Ｇａ１４プロモーター、Ｈ ｉｓプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、アルカリホスフ ァターゼプロモーターおよびα接合因子プロモーターが挙げられる。制御可能な 発現調節配列が好適であるが、中でも大腸菌における発現のためには温度誘導可 能なλＰ、Ｐａモーター、１ａｃＵＶ５プロモーターおよびＴ７φ１、　１プロ モーターが最も好適である。

文献中にはまた、細菌および真菌宿主のために適した各種の発現ベクター／宿主 系、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、コスミッドおよびそれらの誘導 体が開示されている。これらの系の実例としては、細菌に対してはｃｏｌ　Ｆｉ ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＲＰ９、λファージ、Ｍ１３およびフィラ メント状ウィルスが挙げられ、また酵母に対しては２μが挙げられる。細菌にお いて好適なプラスミドは、宿主細胞中において安定でありかつ細胞１個当り２０ 〜２００コピーという中位のコピー数で存在するものである。本発明者等は、ｐ ＢＲ３２２から誘導されたプラスミド、たとえばパナヨタトス（Ｐａｎａｙｏｔ ａｔｏｓ、　１９８７、ｔ！ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、ｉｎ：　Ｐｌａｓｍｉｄｓ−Ａ　Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｅｄ、　Ｈｅｒｄｙ、　Ｋ、、　ＩＲＬ 　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）によって 記載されたようなものを使用した。中でも、リジエネロン・ファーマシューティ カルズ社（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、） によって開発されかつ下記に一層詳しく記載されるようなＲＰＮ系のプラスミド が好適である。

当業界においてはまた、異種タンパク質を発現させるために有用な多くの非動物 宿主が公知であって、その中には大腸菌、バシラス属、ストレプトミセス属、サ ツカロミセス属およびピキア・パストリスが含まれる。本発明においては大腸菌 が好適である。

形質転換された宿主細胞を培養すれば、二二一口トロフィンの発現が達成される 。本発明者等は、細菌において発現されたニューロトロフィンが細胞内のプロテ アーゼ［特に、異種タンパク質に対する「熱ショック」応答の一部として誘導さ れるもの（Ｇａｆｆ等、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｅｄ、　 Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：６６４７−６６５１）］による分解を受け易いことを 見出した。それ故、宿主細胞としてプロテアーゼ欠損突然変異体を使用すること が好ましい。

熱シヨツク遺伝子の発現は、熱シヨツク調節遺伝子（たとえば、大腸菌のｈｔｐ Ｒ遺伝子）によって調節される。ｈｔｐＲ遺伝子の突然変異体は、熱シヨツクプ ロテアーゼ遺伝子の発現が欠如していると共に、熱シヨツク応答に寄与するその 他の遺伝子の発現も欠如している。本発明者等は、熱シヨツク調節遺伝子突然変 異体（特にｈｔｐＲ−遺伝子突然変異体）において組換え二二一口トロフィンを 発現させれば、収量が顕著に向上することを見出しＣｌ３７株が好適である。こ の菌株はバーバード大学のアルフレッド・ゴールドバーブ（Ａｌｆｒｅｄ　Ｇｏ ｌｄｂｅｒｇ）教授から入手することができる。ゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅ ｒｇ）等の米国特許第４７５８５１２号明細書中には、その他の適当な菌株も記 載されている。もう１つの好適な大腸菌株はＲＦＪ　２６である。

ニューロトロフィンは、それらを発現する細菌細胞にとって有毒である。それ故 、収量を最大限に増加させるためには、高密度の細菌培養物（たとえば、後期対 数期にある培養物）においてのみニューロトロフィン発現を誘発することが好ま しい。本発明者等は、λＰＬプロモーターおよびｃ１８５７温度感受性リプレッ サーに基づく誘発可能な系を使用した。ニューロトロフィンの生産は、通例、培 養温度を３０分間にわたって４２℃にシフトさせ、次いで３〜２０時間にわたり ３８〜４２℃でインキュベーションを続けることによって誘発される。なお、活 発に増殖している細胞において１６時間以上にわたり発現を誘発することは、結 局は細胞死をもたらす。

大腸菌がニューロトロフィンを蓄積し得ない場合には、ニューロトロフィン遺伝 子またはタンパク質が有する１種以上の性質に原因することがある。ニューロト ロフィンｍＲＮＡの構造、特に翻訳開始点に近接した構造が、効率の良い翻訳を 妨げることがある。あるいは、ニューロトロフィンがそれのｍＲＮＡと直接に反 応することによってそれ自身の合成を妨げることもあり、また大腸菌のＤＮＡ複 製／転写／翻訳機構中の何らかの成分と直接もしくは間接に反応することもある 。

本発明の別の実施の態様に従えば、ニューロトロフィンが細胞内に発現される代 りに、それが大腸菌の細胞周辺腔内に分泌される。これは、成熟したニューロト ロフィンにシグナル配列を融合することによって達成される。ニューロトロフィ ン遺伝子の５′末端にシグナル配列遺伝子を融合すれば、効率の良い翻訳にとっ て一層有利なヌクレオチド配列が翻訳開始点に近接して付与され、それによって 高レベルのニューロトロフィン蓄積をもたらすことができる。その上、細胞周辺 腔内にニューロトロフィンを隔離すれば、それがタンパク質合成のために必要な 何らかのサイドシル成分に干渉することが防止される。それはまた、ニューロト ロフィンがサイドシル中のプロテアーゼの作用を受けることをも防止する。更に また、成熟したニューロトロフィンを細胞周辺腔内に分泌させれば、タンパク質 の適正な折りたたみにとって一層有利な環境を与えることもできる。

シグナル配列を付与するためには、二二一口トロフィンをコードするＤＮＡ配列 がニューロトロフィンに関するＤＮＡ配列と同じ枠内にありかつ宿主細胞にとっ て適したシグナルまたはリーダー配列をコードする融合遺伝子を５°側から３′ 側に向かって含有するような組換えＤＮＡ分子を作製すればよい。文献中には、 かかる組換えＤＮＡ分子の作製に際して有用な数種のシグナル配列が記載されて いる。たとえば、大腸菌においてはＬａｍＢ、０ｍｐＡおよびＰｈｏＡが有用で ある（Ｄｅｎｅｆｌｅ等、　１９８５．　Ｇｅｎｅ　８５：４９９−５１０；　 Ｗｏｎｇ等、　Ｇｅｎｅ　６８：１９３−２０３）。本発明においてはＬａｍＢ が好適であり、また特にＬａｍＢのｍＲＮＡの翻訳効率を高める修飾ＬａｍＢシ グナル配列が好適である。本発明者等は、修飾ＬａｍＢシグナル配列に関する遺 伝子を次のようにして作製した。

すなわち、ＧまたはＣをＡまたはＴで置き換えることにより、ＬａｍＢの幾つか のコドンの第３ヌクレオチドに縮重置換が施された。これらの置換はＬａｍＢシ グナルペプチドのアミノ酸配列を変化させないが、任意の二次構造中における可 能な水素結合の数を減少させる。これは、ＬａｍＢのｍＲＮＡ中のかかる領域に 関連する可能な二次構造の安定性を低下させる。本発明者等はまた、大腸菌によ って最も頻繁に使用されるコドンに一層良く近似させるため、コドン使用モデル に基づくコドン変化を導入した。

本発明者等はまた、ＬａｍＢ前駆体タンパク質を成熟タンパク質に変換する際の プロセシング効率を高めるための修飾をＬａｍＢシグナル配列に施した。天然の ＬａｍＢは、１０個のアミノ酸残基から成る疎水性コアを有している。数種の大 腸菌シグナル配列に関する突然変異解析によって示唆される通り、疎水性コア領 域の長さはシグナル配列活性に対して強い影響を及ぼすことがある。本発明者等 は、１０個までの疎水性アミノ酸残基を追加することによって疎水性領域の長さ を増大させれば、Ｌ　ａ　ｍ　Ｂ融合前駆体ポリペプチドのプロセシング効率が 向上することを見出した。

この場合、６個未満が好適であり、また４個が最も好適である。

追加される疎水性アミノ酸の種類は重要でなく、またそれらを疎水性コア領域に 追加する際の正確な位置も重要でない。とは言え、本発明においては、疎水性領 域のＮ末端付近の好都合な制限部位にテトラペプチドＬｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ− Ｌｅｕ　（ｒＬＡＶＬ」）（配列番号：６）を追加することが好ましい。なお、 修飾しａｍＢシグナル配列に関する特定の遺伝子が実施例７中に記載されている 。

本発明に従えば、宿主細胞を収穫し、それらを溶解し、溶解物を遠心し、次いで 溶解物ペレットを採取することにより、宿主細胞の培養物から組換えニューロト ロフィンが遊離される。通例、細胞の収穫は遠心法によって行われる。細胞の収 穫後におけるニューロトロフィンの分解を阻止するため、５０ｍＭ−ＥＤＴＡ中 に細胞を再懸濁することが好ましい。次いで、細胞が直ちに使用されるか、ある いは後の使用のために凍結される。当業界においては細胞を溶解させるために役 立つ多くの手段が公知であって、その中には酵素的手段（たとえば、リゾチーム ）、化学的手段（たとえば、アルカリや５ＤＳ）および機械的手段（たとえば、 フレンチプレスや流体力学的剪断機）が含まれる。なお、ニューロトロフィンが 損害を受ける恐れが少ないという点で機械的手段が好適である。本発明において は、１００００ｐｓｉの圧力下で細胞をフレンチプレスまたはスタンスデッド（ ＳＴＡＮＳＴＥＤ■）細胞破壊装置に通すことによって細胞を溶解することが好 ましい。溶解物ペレットの採取は、約１５０００Ｘｇで遠心することによって行 われる。

本発明はまた、細胞培養物中において生産された組換えニューロトロフィンを回 収するための方法をも提供する。かかる方法は、ニューロトロフィンに適用され てきた従来の組換えタンパク質回収方法に付随する問題点を解消するものである 。

天然のニューロトロフィンは中性の緩衝液中に可溶である。しかるに、大腸菌か ら得られた組換えニューロトロフィンは不溶性タンパク質としての挙動を示す。

組換え二二一口トロフィンはサイドシル画分中において検出され、そして細胞周 辺腔に排出された場合に浸透ショック法、スフ二ロプラスト化法または凍結融解 法のごとき標準的な技術を用いて回収されてきた［ボクナー（Ｂｏｃｈｎｅｒ） 等の米国特許第４６８０２６２号］。しかしながら、組換えニューロトロフィン は細胞中の総ニューロトロフィンの小部分としてしか単離することができない。

細菌において発現された多くの哺乳動物タンパク質は不溶性を示す。異質のイオ ン環境中において生産された場合、それらは正しく折りたたまれることがなく、 従って通常は隠されている疎水性領域が露出する。その結果、かかるタンパク質 は凝集物を形成し、そして封入体として析出する。文献中には、これらのタンパ ク質のシスティン残基が少なくとも部分的に還元またはミス対合を受けているこ とが示唆されている（ＴｓｕＪｉ等、　１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒ ｙ　２６：３１２９−３１３４）。

文献中には、封入体から組換えタンパク質を精製するための標準的な方法が記載 されている［たとえば、ビルグー（Ｂｕｉ　１ｄｅｒ）等の米国特許第４６２０ ９４８号、ハーシェンソン（Ｈｅｒｓｈｅｎｄｏｎ）等の米国特許第４９６１９ ６９号、およびハング（Ｈｕｎｇ）等の米国特許第４７３４３６２号の明細書を 参照されたい］。これらの方法は、強い変性剤および還元剤を含有する溶液中に タンパク質を溶解する操作を含んでいる。強い変性剤を弱い変性剤と交換した後 、中性溶液中においてタンパク質を復元してから酸化することによって正しいジ スルフィド結合が生成される。

これらの方法によって得られる組換えニューロトロフィンの大部分は生物学的に 不活性である。その原因の一部は、二二一口トロフィンの三次構造の複雑さにあ ると考えられる。タンパク質を変性させかつスルフヒドリル基を還元した後には 、かかるポリペプチドは適正な構造に再び折りたたまれて正しいジスルフィド結 合の適正な立体配置をとることがない。更にまた、本発明者等の結果によれば、 組換えニューロトロフィンが形成する凝集体は典型的な封入体でないことが示唆 される。

本発明者等は、宿主細胞の不溶画分から生物学的に活性な組換え二二一口トロフ ィンを回収する方法を発見した。本質的にこの方法は、還元剤の使用を回避する ことによってタンパク質の正しい酸化状態を維持しながら二二一口トロフィンを 強い変性剤中に可溶化するというものである。精製に際してジスルフィド結合を 還元することは、精製されたニューロトロフィンポリペプチドの活性を破壊する 。文献（たとえば、Ｔｓｕｊｉ等、　１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　 ２６：３１２９−３１３４）中には、封入体中の不溶性組換えタンパク質は不正 に生成されもしくは還元されたジスルフィド結合を有するはずであると記載され ていることを考えると、これは予想外の結果である。

ニューロトロフィンを回収するためにはまた、強い変性剤が弱い変性剤で置き換 えられる。しかるに本発明者等は、ヒスチジンのごとき塩基性アミノ酸またはそ れの同等物を添加すれば、弱い変性剤の除去に伴う復元過程に際してニューロト ロフィンを容易に可溶状態に維持し得ることを見出した（Ｐｒｉｏｒ等、　１９ ９０．　ＷＯ９０１０６７６４）。

これらの発見は、組換え二二一口トロフィンの挙動に関する新しいモデルを示唆 している。宿主細胞によって生産された組換スニューロトロフィンポリペプチド の大部分は適正に折りたたまれ、そして正しいジスルフィド結合を生成するもの と考えられる。

更にまた、ニューロトロフィンは高いｐＨを有しかつ中性のｐＨにおいて正に帯 電しているから、それらは細胞中において負に帯電した分子（たとえば、ＤＮＡ 、ＲＮＡおよびその他のタンパク質）と会合を生じるものと考えられる。その結 果、それらは中性のｐＨにおいて不溶性となる。塩基性アミノ酸はそれらの解離 を助けるのである。

一層詳しく述べれば、宿主細胞培養物によって生産された組換えニューロトロフ ィンを回収するための本発明方法は、強い変性剤を含有するが還元剤を本質的に 含有しない溶液中にニューロトロフィンを溶解することによってそれを変性させ る工程を含んでいる。本明細書中において使用される「変性剤」という用語は、 水素結合の破壊またはタンパク質の熱力学的環境の変更を通して三次構造および 二次構造を少なくとも部分的に喪失させることにより、水溶液中において溶解さ れたタンパク質を可逆的に展開する化合物を指す。強い変性溶液としては、４〜 ９Ｍの濃度のグアニジン塩（たとえば、塩酸グアニジン）およびアルカリ金属チ オシアン酸塩（たとえば、チオシアン酸ナトリウム）、並びに７〜９Ｍの濃度の 尿素が挙げられる。好適な変性溶液は７〜９Ｍ塩酸グアニジンである。好適な条 件はｐＨ７，０〜９．０および室温である。なお、最も好適なものはｐ）Ｉｓ、 ｏの８Ｍ塩酸グアニジンである。

また、この工程に際してはシスティン残基中のイオウ原子の正しい酸化状態を維 持することも必要である。さもないと、任意の生物学的に活性なニューロトロフ ィンを回収し得る能力が失われる恐れがある。それ故、溶液は本質的に還元剤を 含有しないものでなければならない。還元剤を本質的に含有しない溶液とは、タ ンパク質のジスルフィド結合が維持される溶液である。本発明の実施に際してジ スルフィド還元剤（たとえば、β−メルカプトエタノールまたはジチオトレイト ール）をたとえ少量でも添加すれば、精製ニューロトロフィンの活性が破壊され ることになる。

組換えニューロトロフィンがメタロプロテイナーゼによる分解を受け易いことは 明らかである。それ故、メタロプロテイナーゼ阻害剤を含有する溶液中にニュー ロトロフィンを回収することが好ましい。そのためには、ＥＤＴＡのごとき重金 属キレート剤が好適である。ＥＤＴＡの濃度は、少なくとも１ｍＭの最小値から 約２００ｍＭの最大値までの範囲内にあればよい。５〜８０ｍＭの濃度が好適で あり、また５０ｍＭが最も好適である。キレート化された重金属イオンを溶液か ら透析した後、ＥＤＴＡを還元もしくは脱離することができる。なお、ラングレ ー等（Ｌａｎｇｌｅｙ等。

１９９０、　ＥＰ　０３９８７５３）はメタロプロテイナーゼ阻害剤として有用 なペプチドを記載している。

本発明の回収方法はまた、下記のごとき工程の１つ以上を含むことができる。ニ ューロトロフィンを可溶化した後、溶液中の強い変性剤が弱い変性剤と交換され る。弱い変性溶液としては、ｐＨ７，０〜９．０および室温の条件下にある４〜 ９Ｍ好ましくは６〜８Ｍの尿素である。最も好適な弱い変性溶液は、７Ｍ尿素、 ５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｌｏｍＭ−ＮａＣ１および５ｍＭ−ＥＤＴＡを含むｐ Ｈ８，０の溶液である。好適な交換方法は透析である。強い変性剤が７３０〜９ ．０Ｍの尿素である場合、この工程の弱い変性剤はより低い濃度の尿素であるこ とが好ましい。

ニューロトロフィンを復元するためには、溶液から弱い変性剤が除去される。好 適な除去方法は非変性溶液に対する透析または透析濾過である。なお、θ〜ＩＭ −ＮａＣ１を非変性溶液として使用することが好ましい。

回収方法におけるもう１つの工程は、溶液中に存在するその他の汚染物から組換 えニューロトロフィンを精製することである。

そのためには、当業界において公知のごとき典型的なタンパク質単離技術のうち の任意のものを使用することができる。なお、Ｓ−セファロース（Ｓ−３ＥＰＨ ＡＲＯ５Ｅ■）上における陽イオン交換、ＤＥＡＥ−セファロース（Ｄｔ！ＡＥ −３ＥＰＩ（ＡＲＯ８Ｅ■）上における陰イオン交換、および逆相高圧液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む三段階単離法が好適なである。かかる単離工 程はニューロトロフィンの可溶化後における任意の段階で開始することができ、 また変性剤の交換および除去工程を通して継続することができる。なお、尿素相 において精製を開始することが好ましい。なぜなら、この薬剤はイオン交換クロ マトグラフィーを妨害することがなく、また部分的な精製は非変性溶液中へのニ ューロトロフィンの溶解を一層容易にするからである。

本発明者等は、二二一口トロフィンがかなりの程度まで精製されなければ、弱い 変性剤を除去した場合にニューロトロフィンが溶液から析出することを見出した 。溶解性は、ニューロトロフィンの純度および溶液中におけるその他の汚染物の 性質に依存するのである。たとえば、ＤＮＡのごとく負に帯電した分子は非常に 純粋なニューロトロフィンの溶解をも妨げる。それ故、塩基性アミノ酸または同 等物（たとえば、インドール酢酸）を含有するように非変性溶液を調整すること により、非変性溶液中におけるニューロトロフィンの溶解性が維持される。この 物質の濃度は、ニューロトロフィンを溶解状態に維持するために有効なものでな ければならない。塩基性アミノ酸の溶液としては、１０ｍＭより高い濃度のヒス チジン、リシンおよびアルギニン並びにそれらの塩が挙げられる。中でも２０〜 ５００ｍＭの濃度のヒスチジンが有用であり、また２０〜ｌｏＯｍＭの濃度のヒ スチジンが最も好適である。なお、変性溶液中のニューロトロフィンが変性剤の 除去前に十分に精製されていれば、この工程は省くことができる。

結果は、本発明の方法によって一貫して同じＮ末端アミノ酸を有する均質なニュ ーロトロフィン分子が生産されることを示している。それに対し、哺乳動物のＣ ＨＯ細胞系においてニューロトロフィンを発現させた場合には、様々なＮ末端ア ミノ酸を有するニューロトロフィン分子の混合物が生産されることが判明した。

それ故、本発明の方法によって生産される組換えニューロトロフィンは特異なも のであるように思われる。

本発明の方法はまた、ニューロトロフィンに類似した生化学的性質を有するその 他のタンパク質を回収するためにも有用である。

すなわち本発明の方法は、細菌１月こおいて正しく折りたたまれて適正なジスル フィド結合を生成するが、通常の回収技術において変性および還元を受けると適 正なジスルフィド結合を有するように復元することが非常に困難であるタンパク 質を回収するために有用である。かかるタンパク質の中には、約９．０より高い ｐＨを有しかつ少なくとも２個のジスルフィド結合を含有するタンパク質が含ま れる。［候補分子としては、分泌型白血球プロテアーゼインヒビター（Ｍｉｌｌ ｅｒ等、　１９８９．　Ｊ、　ＢａＣｔｅｒｉＯｌＯｇ＞’　１７１：２１６６ −２１７２）オ、Ｊ：び完全な長さの組換えＣＤ　４　（Ｆｉｓｈｅｒ等、　１ ９８９．　ＷＯ８９１０１９４０）が挙げられる。］ 後記の実施例中に記載されるごとく、本発明によれば生物学的に活性なヒトニュ ーロトロフィン−４の発現が開示される。ヒトＮＴ−４ＤＮＡ配列をＤＮＡプラ スミドベクターｐＲＧ９１中にサブクローン化したところ、ｐＲＧ１７３が得ら れた。このｈＮＴ−４含有プラスミドを用いて大腸菌株ＲＦＪ　２６が形質転換 され、次いで本明細書中に記載された方法を用いて培養系から生物学的に活性な ＮＴ−４が回収された。とは言え、本発明はかがる特定の実施の態様のみに限定 されるべきでない。たとえば、ヒトＮＴ−４をコードするＨＧ　７−２の領域と 実質的に相同な任意の核酸配列を使用することにより、本明細書の全体にわたっ て記載されもしくは当業者にとって公知である任意の数のＤＮＡプラスミド発現 ベクターを作製することができる。また、これらの発現ベクターを用いて任意の 数の大腸菌株を形質転換し、それによって有用な量の生物学的に活性なＮＴ−４ を生産することができるのである。

本発明が一層明確に理解されるようにするため、以下に実施例が示される。これ らの実施例は例示を目的としたものに過ぎないのであって、決して本発明の範囲 を制限するものと解すべきでない。

６、実施例二大腸菌による組換えｈＮＧＦの生産および回収公知のヒトＮＧＦ配 列［リジェネロン・ファーマシューティヵルズ社製のナンシー（Ｎａｎｃｙ）　 Ｉ　ｐ　］を使用しながら、成熟したヒトＮＧＦ　（ｈＮＧＦ）遺伝子を担持す るＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅によってヒトゲノムＤＮＡから増幅した。その際には 、オリゴデオキシヌクレオチドプライ？−ＰＡＮ−２０（５°−ＡＡＧＣＧＧＴ ＣＧＡ　ＣＡＴＣＴＯＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴ　ＡＧＡＧＧＴＧＡＡＴ　 ＴＣＴＣＡＧＴＡ−３”）（配列番号ニア）およびＥＶＤ−３（５°−ＧＧＣＡ ＧＧＣＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡ　ＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴ　ＧＣＴＧ−３°） （配列番号二８）を使用した。これらのプライマーは、ヒトＮＧＦ遺伝子の５゛ 末端に５ａｌｌ制限部位を組込みかつ３′末端にＥａｇｌ制限部位を組込むよう に設計された。ＰＡＮ−２０を用いて５゜末端に５ａｌＩ部位を組込むためには 、成熟したｈＮＧＦタンパク質のアミノ末端配列から２番目のアミノ酸をセリン から（構造的に類似したアミノ酸である）トレオニンに変化させることが必要で あった。８個のＮ末端アミノ酸については３種の公知ニューロトロフィンの配列 同一性が限られていることを考慮すれば、かかる保存的なアミノ酸変化は活性に 影響を及ぼさないはずである。

更にまた、この位置におけるアミノ酸残基の同一性は他の生物種から得られたＮ ＧＦにおいて保存されていない（Ｉｂａｎｅｚ等、　１９９０、　ＥＭＢＯＪ、 　９：１４７７−１４８３）。それに加えて、ＰＡＮ−２０は得られるタンパク 質の配列に影響を及ぼさないようにしなからＮＧＦ遺伝子のこの領域のＧ＋Ｃ含 量を低下させるように設計された。

増幅されたＤＮＡ断片を制限エンドヌクレアーゼ５ａｉｌおよびＥａｇＩで消化 し、次いでｐＲＰＮ５０　（リジェネロン・ファーマシューティカルズ社製）の ５ａｌＩおよびＥａｇ１部位の間に連結してプラスミドｐＲＰＮ１０２を得た。

ｐＲＰＮ５０は、プロモーター挿入部位にλＰＬプロモーターを挿入することに より、発現プラスミドｐ　Ｎ　Ｋ　Ｓ　９７　（Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ、　１ ９８７．　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、　ｉｎ：　Ｐｌａｓｍｉｄｓ−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａ ｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｅｄ、　Ｈｅｒｄｙ、　Ｋ、、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ 、　０ｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ。

Ｄ、　Ｃ，）から誘導されたものである。

３０℃における抑制を容易にすると共に、４２℃での熱ショックによる抑制解除 を可能にするため、ｐＲＰＮｌ　０２中にｃＩ８５７λＰｔ、リプレッサー遺伝 子を組込んだ。各々の末端にＮｒｕＩ制限部位を生成するプライマーＥＶＤ−２ ６（５’　−ＣＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴ−３°）（配列番号： ９）およびＥＶＤ−２７（５°−ＴＣＴＴＧＣＴＣＧＣＧＡＧＴＴＡＴＣＡＧ　 ＣＴＡＴＧＣＧ−３°）（配列番号：ｌＯ）を使用しながら、このＤＮＡ配列の ＰＣＲ増幅を行った。この８２１ｂｐの断片は、ＰＲＭ構成プロモーターを含有 する領域内においてｃ１８５７コード配列から７０ｂｐだけ上流側に伸びると共 に、ｃＩ８５７終止コドンをａｓｂｐだけ越えて伸びている。ＰＣＲられた候補 物のスクリーニングを行うことにより、ｈＮＧＦ遺伝子と同じ転写方向を有する ｃ１８５７挿入体を含むプラスミドを探したところ、プラスミドｐＲＰＮ１３３ （図１）が得られた。

プラスミドｐＲＰＮ１３３はＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号７５０２９を 付与された。

ＲＰＮ１３３を用いて大腸菌のｈｔｐＲ１′・Ｒｔｓｌｏｎ−突然変異株を形質 転換することによってｐＲＰＮｌ　３３／ＬＣ１３７を得た。

２リツトルのフラスコ内において、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬ Ｂ培地４００ｍＬニｐＲＰＮ　１３３／ＬＣｌ　３７を接種し、そして振盪しな がら２８℃でインキュベートした。

後期対数期（これらの条件下でＯＤ　６＊。＝１．　０〜２．０）において、■ 晩にわたってインキュベートした培養物に対し５５℃に予熱されたＬＢ培地４０ ０ｍＬを添加し、次いで振盪しながら４２℃で５時間にわたりインキュベーショ ンを続けることによってｈＮＧＦ合成を誘発した。

遠心法によって細胞を収穫し、そして細胞ペレットを一２０℃で貯蔵した。細胞 ペレット（１，０〜２．５ｇ）を融解し、２゜、ＯｍＬの緩衝液Ａ（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ−ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）中に再懸濁し、１０００ ０ｐｓｉでスタンステッド細胞破壊装置に通し、そして４℃で１５分間にゎたり ２３０００Ｘｇで遠心した。こうして得られたペレットを、２Ｍ塩酸グアニジン および５　ｍ　Ｍ　−Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む溶液（ｐＨ８，０）１０、ＯｍＬで ２回洗った。

組換えｈＮＧＦを可溶化するため、ポッターホモジエナイザーを使用しながら、 ８Ｍ塩酸グアニジンおよび５ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ８，Ｏ）４０ｍＬ 中にペレットを再懸濁した。次いで、懸濁液を２３０００Ｘｇで１５分間にわた り遠心した。

２リツトルの緩衝液Ｂ　（７Ｍ尿素、１００ｍＭヒスチジン、０．１ｍＭ−ＥＤ ＴＡ、ｐＨｅ、Ｏ）に対し、上澄み液を２５℃で２０時間にわたり透析した。そ の間、緩衝液を２回取換えた。得られた透析液を４℃において２３０００Ｘｇで １５分間にわたり遠心した。

緩衝液Ｂで平衡化されかつ同じ緩衝液を用いて２８０ｎｍにおける基準吸光度に 達するまで洗浄されたＳ〜セファロースカラム（直径２．５ｃｍＸ高さ６．０ｃ ｍ）上に上澄み液を載せた。次いで、３００ｍＬの緩衝液Ｂ中における０、０− １．０ＭのＮａＣ１勾配を用いてタンパク質を溶出し、そしてｈＮＧＦを含有す る両分を集めた。

１００倍過剰容量の緩衝液Ｃ（７Ｍ尿素、５０ｍＭトリス−ＨＣＬ　０．１ｍＭ −ＥＤＴＡ、ｐＨ８，５）に対し、集められた両分を２５℃で２０時間にわたり 透析した。

毎分２．ＯｍＬの流量の緩衝液Ｃで平衡化されたＤＥＡＥ−セファロースカラム （直径２．５ｃｍＸ高さ７．５ｃｍ）上に透析液を載せた。ｈＮＧＦを含有する 流出画分を集め、そして１００ｍＭヒスチジンおよび０．１ｍＭ−ＥＤＴＡを含 む溶液（ｐＨ６，０）４０容に対して４℃でｌ晩にわたる透析を２回施した。得 られた透析液を４℃において２３０００Ｘｇで１５分間にわたり遠心した。次い で、１００ｍＭヒスチジンおよび０．１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液（ｐＨ６，０ ）で平衡化されたトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ［Ｆ］）ＣＭ６５０５（弱い カオチン交換樹脂）カラム（１゜０　ｃｍＸ　５．　Ｏｃｍ）上に透析液を載せ 、そして０．０−１．０ＭのＮａＣｌ勾配を用いて溶出した。ｈＮＧＦを含有す る両分を集め、そしてミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ■）ＧＶフィルターで濾過 してから４℃で貯蔵した。精製タンパク質のアミノ末端配列を直接配列分析によ って確認した。

外植されかつ解離されたＥ８を髄神経節における神経突起の成長に関し、精製タ ンパク質の生物学的活性を試験した（図２Ａおよび２　Ｂ）　（Ｌｉｎｄｓａｙ 等、　１９８５．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１１２：３１９−３２８）。このよ うな判定基準に基づけば、この方法によって大腸菌から精製された組換えｈＮＧ Ｆはマウスの唾液腺から精製されたＮＧＦと同等の活性を有することが判明した 。

大腸菌における二二一口トロフィンの合成および分泌の両方を容易にするため、 ＬａｍＢに基づくシグナル配列を作製した。ＬａｍＢシグナル配列（Ｆｙ！Ｊ３ Ａ１配列番号：１）は、リジェネロン・ファーマシューティカルズ社において開 発されたｐＲＰＮ系列の発現ベクターに基づく一連の分泌ベクターを作製するた めに選択された天然の大腸菌シグナル配列である。分泌ベクターは、ＬａｍＢシ グナル配列をコードする合成りＮＡ断片をｐＲＰＮＯ９またはｐＲＰＮＩ　６中 にクローン化することによって作製された。

これらのプラスミドは、発現ベクターｐ　Ｎ　Ｋ　Ｓ　９７　（Ｐａｎａｙｏｔ ａｔｏｓ、　１９８７．　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ 　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、ｉｎ：　ＰＩａｓｍｉｄｓ−Ａ　Ｐｒ ａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ｅｄ、　Ｈｅｒｄｙ、　Ｋ、、ＩＲＬ　 Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）中に１ａｃ ＵＶ５プロモーターを挿入することによって誘導されたものである。ＬａｍＢは 、ＬａｍＢの発現がＩａｃＵＶ５またはＴ７φ１．　ｌプロモーターの調節を受 けるように構造遺伝子の挿入部位に挿入された。

かかる合成りＮＡ断片ＬａｍＢ１　（図３Ｂ、配列番号：２）は、野生型のＬａ ｍＢシグナル配列と同じ２５個のアミノ酸をコードしている。しかるに本発明者 等は、ユニークな制限酵素部位を作製しかつ翻訳効率を最大限に高める目的のた め、ヌクレオチド配列を野生型のヌクレオチド配列に対して変化させた。Ｌａｍ Ｂ１はまた、ＣまたはＧをＡまたはＴで置き換えた７箇所の縮重ヌクレオチド置 換を有している。これは、ｍＲＮＡの可能な二次構造の安定性を低下させる。Ｌ ａｍＢ１はまた、数個の新しい制限部位を有している。

本発明者等はまた、ＬａｍＢ１の修飾体としてＬａｍＢ２（図３Ｃ１配列番号＝ ３）を作製した。ＬａｍＢ２を作製するため、ＰＣＲ増幅によってＬａｍＢ１の ３′末端にヌクレオチド変化を施した。このような変化により、平滑末端ＤＮＡ 断片のクローン化を容易にするＥａｇＩ制限部位が導入された。

ＬａｍＢ１に成熟したｈＢＤＮＦを融合させれば、大腸菌における融合タンパク 質の効率良い合成が達成される。合成産物の真正性は、ＤＮＡ依存性の無細胞共 役転写−翻訳タンパク質合成系における選択合成、大腸菌においてＴ７ＲＮＡポ リメラーゼ発現系を使用した産物の選択合成、およびｍｙｃ特異性のモノクロー ナル抗体によるキメラの同定を可能にするＣ末端ｍｙｃタグを有する産物の合成 によって確認された。５ＤＳ−ＰＡＧＥ上における移動度によって証明されるご とく、大腸菌において合成されたこれらの融合タンパク質のいずれもが成熟ｈＢ ＤＮＦにプロセシングされた。ＬａｍＢ１またはＬａｍＢ２を用いて得られる発 現レベルは、総細胞タンパク質の約１−１０％の量でｈＢＤＮＦを蓄積させる。

本発明者等は、プロセシング効率を高めるようにＬａｍＢ１を修飾した。すなわ ち、ＬａｍＢ１のＮｈｅＩ部位に４個のアミノ酸（Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａ　Ｉ− ＬｅｕまたはＬＡＶＬ）を挿入することによってＬａｍＢ５　（図３Ｄ、配列番 号：４）を得た。また、同じ挿入をＬａｍＢ２に施すことによってＬａｍＢ４　 （図３Ｅ、配列番号：５）を得た。このような挿入は、ＬａｍＢ１およびＬａｍ Ｂ２の疎水性コア領域を１０個のアミノ酸から１４個のアミノ酸に延長する。そ の結果、ｈＢＤＮＦ融合タンパク質を成熟ｈＢＤＮＦに変換する際のプロセシン グ効率は５倍に増大するのである（図４）。

細胞周辺腔に排出されたＬａｍＢ５−およびＬａｍＢ４−ｈＢＤＮＦ分子は、野 生型のＬａｍＢ融合物よりも迅速に成熟ｈＢＤＮＦにプロセシングされる。しか しながら、排出される分子はより少ないから、この場合における正味の成熟ｈＢ ＤＮＦ量は増加しない。いずれせよ、ＬａｍＢ５およびＬａｍＢ４がもたらす転 位効率の増大はその他のタンパク質の収量を向上させるはずである。

成するように設計された２本の相補的な合成オリゴヌクレオチド［Ｌ　ａｍＢ　 ８０．　５′−ＡＴＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＣにＴＡＡＧＣＴＴＣＣＧＣＣＴＡＧ ＣＴ　ＧＴＡＧＣＡＧＴＡＧ　ＣＡＧＣＡＧＧＴＧＴＡＡＴＧＴＣＴＧＣＡ　Ｃ ＡＧＧＣＣＡＴＧＧ　ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣ−：ｌ’（配列番号＝ｌｌ）および Ｌａｍ８８８．５’−ＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＴＧ ＣＡＧＡ（配列番号：１２）］として作製された。このＤＮＡ断片をｐＲＰＮ１ ６（リジェネロン・ファーマシューテイカルズ社製）のＳｐｅ　Ｉおよび５ｐｈ Ｉ制限部位に連結してプラスミドｐＲＰＮ５２を得た。

追加の制限部位を生み出すため、このプラスミドに引続いて修飾を施した。すな わち、相補的なオリゴヌクレオチドＬ　ａｍＢ　２Ａ［５°−ＣＡＴＧＧＣＣＡ ＧＴ　ＣＧＧＣＣＧＡＧ−３’　（配列番号：１３）］およびＬａｍ８２Ｂ　［ ５’　−ＧＡＴＣＣＴＣＧＧＣＣＧＡＣＴＧＧ（、−３’　（配列番号：１．４ ）］のアニーリングによって得られた産物から成る合成りＮＡ断片が、ｐＲＰＮ ５２中のＬａｍＢ１シグナル配列におけるユニークなＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ 制限部位の間に挿入された。こうして得られたプラスミドｐＲＰＮ８８はシグナ ルペプチダーゼ認識配列の位置にユニークな制限部位を有するＬａｍＢ２シグナ ル配列を含有しており、それによって該シグナル配列とその他任意のＤＮＡ配列 との融合を容易にする。ｐＲＰＮ８８中におけるＬａｍＢ２シグナル配列は、Ｉ ａｃＵＶ５またはＴ７φ１．１プロモーターによる転写調節を受けると共に、Ｔ ７φ１．１リポソ一ム結合部位による翻訳調節を受ける。

７．２　組換えｈＢＤＮＦｍｙｃの生産および回収ヒトＢＤＮＦｍｙｃは、Ｎ末 端からＣ末端に向かって抗原性の「タグ」に成熟ｈＢＤＮＦを融合させて成るタ ンパク質である。

かかるタグは、アミノ酸配列ＥＱＫＬＩ　５ＥＥＤＬ　（配列番号：１５）を有 するペプチドである。これら１０個のアミノ酸残基はヒトのｃ−ｍｙｃプロト腫 瘍遺伝子に由来している。このタグを認識する抗体は、試料中のｈＢＤＮＦｍｙ ｃを同定するために有用である［Ｅｖａｎ等、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　５：３６１０−３６１６、また［神経栄養活性を検出するための試験系ｊ と称するスクイント（Ｓｑｕｉｎｔｏ）等の米国特許出願箱０７１５３２１２８ ３号明細書（引用によって本明細書中に併合される）も参照されたい］。

ＬａｍＢ２シグナル配列およびｈＢＤＮＦｍｙｃタンパク質から成る融合タンパ ク質を作製するため、オリゴヌクレオチドプライマーＮ８−ｈＢＤＮＦ　［５° 　−ＣＣＣＡＣＴＣＴＧＡ　ＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＡＧＧＧ−３′　（配列 番号：１６）］およびＣ２−ｈＢＤＮＦｍｙｃ　［５°−ＧＣＴＡＴＧＣＧＧＣ ＣＧＣＴＡＣＡＧＡＴ　ＣＣＴＣＣＴＣ−３’　（配列番号：１７）］を用いて ｐＣＤＭ８−ｈＢＤＮＦｍｙｃ　（リジェネロン・ファーマシューティカルズ社 製）からｈＢＤＮＦｍｙｃのＤＮＡ配列をｈＢＤＮＦｍｙｃをコードするＤＮＡ 配列はまた、１０個のアミノ酸から成るｍｙｃタグをコードするＤＮＡ配列に成 熟ｈＢＤＮＦをコードするＤＮＡ配列を融合させることによっても得ることがで きる。成熟ｈＢＤＮＦをコードするＤＮＡ配列は、記載のごときＰＣＲ増幅ニヨ ッテ単離され６　（Ｈｙｍａｎ等、　１９９１．　ＷＯ０９１１０１５６８）。

１０個のアミノ酸から成るｍｙｃペプチドタグをコードする二本鎖ＤＮＡ配列は 化学的に合成することができる。本実施例の目的のためには、かかるｈＢＤＮＦ ｍｙｃハイブリッドＤＮＡ配列の５°および３゛末端にそれぞれＢａ１ｌおよび ＥａｇＩ制限部位が付与される。

低いことに注意すべきである（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　ｏ 　ｐ　ＲＰ　Ｎ９８においては、ＬａｍＢ２シグナル配列はｈＢＤＮＦｍｙｃタ ンパク質の成熟部分に融合しているから、シグナルペプチダーゼ認識配列の位置 における切断はプロタンパク質プロセシング部位に対して＋１の位置にあるヒス チジン残基から始まるｈＢＤＮＦｍｙｃタンパク質を生み出すはずである（Ｌｅ ｉｂｒｏｃｋ、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２）。

ｐＲＰＮ９８中におけるユニークなＮｒｕ！およびＰｖｕ１１部位間のＤＮＡ配 列を欠失することにより、プラスミドのコピー数を制御する配列（Ｔｗｉｇｇ　 ａｎｄ　５ｈｅｒｒａｔｔ、　１９８０．　Ｎａｔｕｒｅ　２８３：２１６−２ １８）を除去した。こうして得られたプラスミドｐＲＰＮ１２１（図５）は、親 プラスミドよりも約３倍大きいコピー数を有している。

プラスミドｐＲＰＮ１２１はＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号７５０２８を 付与された。

ｐＲＰＮｌ　２１を用いて大腸菌（７）Ｗ３１１０ＩｑＦ−株を形質転換するこ とによってＷ３１１０　Ｉ’　Ｆ−／ｐＲＰＮＩ　２１を得た。

２リツトルのフラスコ内において、５００ｍＬのＬＢ培地にＷ３１１０１ＱＦ− ／ｐＲＰＮ１２１を接種し、そして振盪しながら３７℃で後期対数期（ＯＤ　６ ９゜＝約１．　０）に達するまで増殖させた。その後、最終濃度が１％（Ｗ／Ｖ ）となるようにラクトースを添加し、そして３７℃で１晩にわたって培養物に通 気した。遠心法によって細胞を収穫し、０．２Ｍ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８゜０ ）で１回洗い、次いで細胞ペレットを一７０℃で凍結した。

細胞ベレット（約５ｇ）を融解し、そして０．２Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８， ０）、ｌ　ｍＭ　Ｃａ　Ｃ１２および２５単位のミクロコツカスヌクレアーゼ［ ベーリンガー・マンハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）社製］を 含む溶液２ＯｍＬ中に再懸濁した。この細胞懸濁液を８０００ｐｓｉの圧力下で フレンチプレスに通し、次いでＳＡ６００ローターを使用しながら４℃において １５０００ｒｐｍて１５分間にわたり遠心した。０．２Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ ８，０）　、１０ｍＭ−ＥＤＴＡおよび２％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−ｉｏ ｏを含む溶液３０ｍＬ中に再懸濁し、室温で１時間にわたり静かに揺り動かし、 次いで５Ａ６００■ローターを使用しながら４℃において１５０００ｒｐｍで１ ５分間にわたり遠心した。

２０ｍＬの２Ｍ塩酸グアニジンでベレットを２回洗った。ポッターホモジェナイ ザーを使用しながら、８Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ８ ，５）、１０ｍＭ−ＮａＣ１およびＩｍＭ−ＥＤＴＡを含む緩衝液１０ｍＬ中に ペレットを再懸濁した。同じ緩衝液を用いてこの抽出液を２０ｍＬに調整した。

７Ｍ尿素、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５）、１０ｍＭ−ＮａＣ１およ び１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液１００容に対し、抽出液を室温で１晩にわたり透 析した。

７Ｍ尿素、５０ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ８，５）および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含 む緩衝液を毎分３ｍＬの流量で通すことによって平衡化されかつ同じ緩衝液を用 いて基底レベルに達するまで洗浄されたＤＥＡＥゼータ・ブレツブ（ＤＥＡＲＺ ＩＥＴＡ−ＰＲＢＰ）ディスク［キューノ社（Ｃｕｎｏ、　Ｉｎｃ、）、メリデ ン、コネティカット州］上に透析液を載せた。

流出画分を５０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，０）となし、次いで７Ｍ尿素、５０ｍ Ｍヒスチジン（ｐＨ５，０）および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液１００容に対し て４℃で１晩にわたり透析した。

７Ｍ尿素、５０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，０）および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む緩 衝液を毎分１ｍＬの流量で通すことによって平衡化されかつ同じ緩衝液を用いて 基底レベルに達するまで洗浄された１、６ｃｍＸ６．５ｃｍのＳ−セファロース カラム上に透析液を載せた。２００ｍ１の溶液中における０、０〜１．ＯＭのＮ ａＣ１勾配を用いてタンパク質を溶出し、そしてｈＢＤＮＦｍｙｃを含有する両 分を集めた（図６）。

５０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，０）　、５０ｍＭ−ＮａＣ１および１ｍＭ−ＥＤ ＴＡを含む溶液２００容に対し、ｈＢＤＮＦｍｙＣを含有する両分を透析した。

５０ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，０）　、５０ｍＭ−ＮａＣ１およびｌ　ｍ　Ｍ　 −Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含む緩衝液を毎分１ｍＬの流量で通すことによって平衡化さ れかつ同じ緩衝液を用いて基底レベルに達するまで洗浄された１、６ｃｍＸ１． ５ｃｍのＳ−セファロースカラム上に透析液を載せた。２００　ｍ　ｌの溶液中 における０、０〜１．ＯＭのＮａＣ１勾配を用いてタンパク質を溶出し、そして ｈＢＤＮＦｍｙｃを含有する画分を集めた。

この試料中のｈＢＤＮＦｍｙｃ　（純度的８５％）を０．４５ｃｍＸ５．Ｏｃｍ のＣ４逆相カラム［バイダック（ＶＹＤＡＣ■）］上に直接に載せ、そして毎分 ０．７５ｍＬの流量で供給される８０ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸中におけ る０〜６７％のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。ピーク画分は９５％以上 の純度を有していた（図７）。

Ｎ末端アミノ酸配列を分析したところ、精製タンパク質は均一なＮ末端を有する 真正のｈＢＤＮＦｒｒｒｙｃであることが確認された（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ、　１ ９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２）。

精製されたｈＢＤＮＦｍｙｃは、Ｅ８ニワトリ胚に由来するを髄神経節（ＤＲＧ ）外植片および下神経節外植片からの神経突起成長を促進すると共に、Ｅ８ニワ トリＤＲＧからの解離ニューロンの生存および樹状突起成長を促進するという点 で生物学的活性を有していた（図８）。この活性は、ＤＲＧ外植片を用いて試験 した場合、哺乳動物細胞抽出物から精製された組換えヒトＢＤＮＦと同等であっ た。試験した物質は図７中のレーン４に相当している。

７．３　組換えｈＢＤＮＦの生産および回収ｈＢＤＮＦｍＶｃの生産および回収 に関連して記載された方法を用いて完全な長さの成熟した組換えｈＢＤＮＦの生 産および回収を行ったところ、同様な生物活性を有するタンパク質が得られた（ 図９）。ＬａｍＢ１−ｈＢＤＮＦ融合タンパク質を発現するプラスミドＩ）ＲＰ Ｎ１４９（図１０）の作製は、ｐＲＰＮｌ　２１の作製と同様である。上記のご ときＬａｍＢ１の合成りＮＡ断片をｐＲＰＮＯ９（リジェネロン・ファーマシュ ーティヵルズ社製）のｓｐｈ　ＩおよびＳｐｅ　Ｉ制限部位にクローン化してプ ラスミドｐＲＰＮ３１を得た。また、オリゴヌクレオチドプライマーＮ１−ｈＢ ＤＮＦ　［５°　−ＡＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＧＡ　ＧＧＧＧＡＧ ＣＴＧ−３’　（配列番号：　ｌ　８）　］およびＣＩ−ｈＢＤＮＦ　［５’　 −ＧＣＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＴＴＴＡＡＴＧＧ　ＴＣＡＡ ＴＧＴＡＣ−３’　（配列番号：１９）］を用いてｐＣＤＭ８−ｈＢＤＮＦ　（ リジェネロン・ファーマシューティカルズ社製）から成熟ｈＢＤＮＦのＤＰＮ６ ６を得た。（上記のごとく）より大きいコピー数をもたらすｐＢＲ３２２配列の ＮｒｕＩ−Ｐｖｕｌｌ欠失をｐＲＰＮ６６に施してプラスミドｐＲＰＮＩ　４９ を得た。このプラスミドにおいては、ＬａｍＢ１−ｈＢＤＮＦの発現は１ａｃＵ Ｖ５並びにＴ７φ１．１プロモーターおよびリポソーム結合部位による調節を受 ける。プラスミドｐＲＰＮｌ　４９はＡＴＣＣに寄託され、そして受託番号７５ ０２７を付与された。

ｐＲＰＮ１４９を用いて大腸菌株１ｑＦ−Ｗ３１１０を形質転換（７た。次いで 、実施例７中に記載された手順に従って組換えｈＢＤＮＦを生産しかつ回収した 。

８、実施例：組換えｈＮＴ−３の生産および回収ｈＮＧＦおよびｈＢＤＮＦに関 連して記載された方法と同様な方法によってヒトＮＴ−３が生産されかつ回収さ れる。

完全な長さの成熟ｈＮＴ−３をコードするＤＮＡ配列が、ヒトの脳細胞に由来す るｃＤＮＡライブラリー［Ｈｏｈｎ等、　１９９１．　ＷＯ９１１０３５６９（ 引用によって本明細書中に併合される）］からＰＣＲ増幅される。その際には、 オリゴヌクレオチドプライマーＥＶＤ−４５［５°−ＣＣＴＡＴＧＣＡＧＡ　Ｇ ＣＡＴＡＡＧＡＧＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡ−３°　（配列番号：２０）コおよびＥ ＶＤ−７［５’　−ＧＴＡＡＧＧＧＣＧＧ　ＣＣＧＡＡＧＴＴＴＡ　ＡＴＡＡＡ ＴＡＡＡＧ　ＧＴＣ−３°　（配列番号：　２１）　］が使用される。これらの プライマーは、ラットＮＴ−３に関するＤＮＡ配列（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ 等、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１）から誘導されたものであ る。センスプライマーはヒトＮＴ−３の配列とほぼ同じである。アンチセンスプ ライマーはヒト遺伝子の終止コドンから約１００塩基対だけ下流側にハイブリダ イズする。

このＤＮＡ断片は、ｐＲＰＮ８８のＢａ１ｌおよびＥａｇ１部位に挿入してｈＢ ＤＮＦのＤＮＡ配列を置き換えるために適したＣ末端のＥａｇＩ制限部位を有し ている。こうして得られたプラスミドを用いて大腸菌株ＩＱＦ−Ｗ３１１０が形 質転換される。

次いで、実施例７の場合と同様にして組換えｈＮＴ−３が生産されかつ回収され る。大腸菌から精製された組換えｈＮＴ−３は、ホーン等（Ｈｏｈｎ等、　１９ ９１．　ＷＯ０９１１０３５６９）　ｉ、：よッテ記載されたものと同様なニュ ーロトロフィン活性を示すものと期待される。

オリゴヌクレオチドＮ１−ＮＴ４　［５’　−ＣＣＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＡＡ ＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＴＣＧ−３’　（配列番号：２３）］およびＣ１− ＮＴ４　［５°−ＧＧＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＡＣＧＣＣ ＧＧＣＴＧＣＧＧＴＴＧＧＣ−３°　（配列番号：２４）］をブプライマとして 使用しながら、ヒトＮＴ−４（ｈＮＴ−４）遺伝子の推定成熟領域をコードする ＤＮＡ配列をＮＴ−４のＨＯ２−２ＤＮＡからＰ　ＣＲｉ、：よって増幅した。

オリゴヌクレオチドＣ１−ＮＴ４は、ＮＴ−４遺伝子の３゛側にＥａｇｌ制限部 位を付与するものである。ＰＣＨによって生成された断片をＥａｇｌで消化し、 そしてＭｓｃｌ−Ｅａｇｌで消化されたｐＲＧ９１中にクローン化した。こうし て得られたプラスミドｐＲＧ１７３は、１ａｃＵＶ５およびＴ７φ１、■プロモ ーターによる転写調節並びにＴ７φ１．　ｌリポソーム結合部位による翻訳調節 を受けるｈＮＴ−４の成熟領域（ＨＯ２−２から翻訳される配列中のアミノ酸残 基８１の位置にあるグリシン）にＬａｍＢシグナル配列を融合させたものから成 っていた。

このプラスミドはまた、プラスミドコピー数を増大させるｒｏｐｌ欠失を有して いた。かかる構造は、精製されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析、精製された プラスミドのＤＮＡ配列分析、ｐＲＧ１７３によってコードされると推定される 近似サイズのタンパク質のｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成、ｐＲＧ　１７３によってコー ドされると推定される近似サイズを有し、（後述のごとき）神経突起成長刺激活 性を有し、かつアミノ酸配列分析によって決定される適当なＮ末端［ＧＶＳＥＴ ＡＰＡＥ　（配列番号：２５）］を有するタンパク質のｉｎ　ｖｉｖｏ合成によ って確認された。

１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加したＬＢ培地を使用しながら、ｐＲＧ１７ ３で形質転換された大腸菌株ＲＦＪ２６の培養物５ｍｌを通気下において３７℃ で１晩にわたり増殖させた。１晩にわたってインキュベートした培養物を５００ ｍｌのＬＢ培地中に希釈し、モしてＯＤ５．。＝５．３に達するまで増殖させた 。

この時点において、１％（Ｗ／Ｖ）となるようにラクトースを添加することによ ってｈＮＴ−４の発現を誘発し、そして培養物を通気下で１晩にわたり増殖させ た。次いで、遠心法により細胞を集め、そして−７０℃で凍結した。細胞ペレッ ト（７，２グラム）を融解し、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）およ び５０ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液７３ｍ１中に再懸濁し、次いでスタンスデッド 細胞破壊装置に連続して３回通すことによって溶解した。溶解物を２６０００Ｘ ｇで１０分間にわたり遠心したところ、可溶画分を含有する上澄み液８３ｍ１が 得られた。この可溶画分を５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，５）に対して４ ℃で５時間にわたり透析し、２０ｍＭ−ＭＥＳ　（ｐＨ６，０）で１０倍に希釈 し、２０ｍＭ−ＭＥＳ　（ｐＨ６，０）で平衡化された高速Ｓ−セファロースカ ラム上に載せ、次いでＬＭ−ＮａＣＩを含む２０ｍＭ−ＭＥＳ　（ｐＨｅ、Ｏ） によって溶出した。Ｈ８のＤＲＧの成長を刺激するヒト組換えＮＴ−４タンパク 質は、ＬＭ−ＮａＣ１による洗液中に回収された。

８Ｍ塩酸グアニジン、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，５）、１０ｍＭ−Ｎ ａＣ１および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液８３ｍ１中に不溶画分を再懸濁して均 質化した。７Ｍ尿素および５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（１）Ｈ８，５）を含む溶 液に対してこの不溶画分を透析し、そして７Ｍ尿素および５０ｍＭトリス−ＨＣ Ｉ（ｐＨ８，５）を含む溶液で平衡化された高速ＤＥＡＥ−セファロースカラム 上に載せた。流出画分を集め、７Ｍ尿素、１００ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，５） および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液に対して透析し、そして７Ｍ尿素、１００ｍ Ｍヒスチジン（ｐＨ５，５）および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液で平衡化された 高速Ｓ−セファロースカラム上に載せた後、同じ緩衝液中における０〜ＩＭのＮ ａＣ１勾配を用いてｈＮＴ−４を溶出した。ｈＮＴ−４を含有する画分を集め、 そして１００ｍＭヒスチジン（ｐＨ５，５）および１ｍＭ−ＥＤＴＡを含む溶液 に対して透析した。ｈＮＴ−４タンパク質の約９５％が不溶物と共に分画された 。

９．３．運動ニューロン濃縮培養物の調製これらの実験のためには、スプラグ− ドーリ−系ラット［Ｈ２Ｏまたはジビックーミラ−（Ｚｉｖｉｃ−Ｍｉｌｌｅｒ ）社製］から得られた胚（ＥＩ４）を使用した。妊娠ラットを二酸化炭素窒息に よって殺した後、胚を迅速に取出し、そして水冷培地中に浸してから以後の処置 を行った。妊娠１４日日間ラット胚から無菌的にを髄を取出した。このを髄を（ 第１を髄神経節の位置において）延髄の尾側で切断し、そして感覚神経節および 付着する髄膜を除去した。

次いで、このを髄を腹側部分と中間背側部分とに分割して別々に培養した。腹側 のを髄組織を小片に切断し、そしてＰＢＳに０゜１％トリプシン（ＧＩＢＣＯ製 ）およびデオキシリボヌクレアーゼタイプｌ　［シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を 溶解した溶液中において３７℃で２０分間にわたりインキュベートした。トリプ シン溶液を除去し、洗浄し、そして４５％のイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）、 ４５％のハム栄養素混合物Ｆ１２　（Ｆ１２）、５％の熱不活性化ウシ胎児血清 （ＧＩＢＣＯ製）、５％熱不活性化ウマ血清（ＧＩＢＣＯ製）、グルタミン（２ ｍＭ）、ペニシリンＧ（０，５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０，５μ ｇ／ｍｌ）から成る培地で置換した。次いで、パスツールピペットを通して穏や かに粉砕することによって組織を機械的に解離させた後、上澄み液を集め、そし てナイロン繊維［テトコ（Ｔｅｔｋｏ）社製のナイテックス（Ｎｆｔｅｘ）　、 ４０μｍ）で濾過した。濾過済みの細胞懸濁液に対し、シュナールおよびシャフ ナ−（Ｓｃｈｎａａｒ　ａｎｄ　５ｃｈａｆｆｎｅｒ、　１９８１、　Ｊ、　Ｎ ｅｕｒｏｓｃｉ、　１：２０４−２１７）によって記載された分画方法の変法を 施した。全ての工程は４℃で実施した。Ｆ１２：ＭＥＭ（１：ｌ）培地中にメト リザミドを溶解し、そして１８％メトリザミドクッション（０，５ｍ１）、３ｍ ｌの１７％メトリザミド、３ｍｌの１２％メトリザミド、および３ｍｌの８％メ トリザミドから成る不連続勾配を形成した。上記のごとくにして得られた濾過済 みの腹側を髄細胞懸濁液（２，５ｍ１）を段階勾配上に重ねた後、スイングアウ トローター［ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ）　ＨＢ　４　］を用いてチューブを２ ５００ｇで１５分間にわたり遠心した。遠心の結果、３つの細胞層、すなわち（ ０〜８％界面における）画分Ｉ、（８〜１２％界面における）画分Ｉ■および（ １２〜１７％界面における）画分ＩＩＩが得られた。各々の界面から細胞を少量 （約１ｍ１）だけ取出し、そして５０％Ｆ１２および５０％ＭＥＭから成りかつ グルタミン（２ｍＭ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０ ０μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレッシン（１００μＭ）お よび亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）を添加した無血清規定培地（Ｂｏｔｔｅ ｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　５ａｔｏ、　１９７９．　ＰＮＡＳ　７６：５１４−５ １７）で２回洗った。血球計数器を使用しながら、トリパンブルーの存在下で生 細胞数を算定した。次いで、ポリ−■、−オルニチン（シグマ社製、１０μｇ／ ｍｌ）およびラミニン（ＧＩＢＣＯ製、１０μｇ／ｍｌ）を予め塗布した６ｍｍ ウェル内に（運動ニューロンに富む）分画された腹側を髄細胞を１０００００個 ／ｃｍ”の密度でプレートした。プレートした日に、ＮＴ−４による処理を施し た。はぼ１００％の相対湿度を有する９５％空気１５％ＣＯ２雰囲気を使用しな がら、無血清規定培地中において３７℃で培養を継続した。２日目（４８時間後 ）に細胞を収穫し、そしてコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の測定 を行った（Ｆｏｎｎｕｍ、　１９７５．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅ＋ｎ、　２４ ：４０７−４０９）。

９．４．結果 ｐＲＧｌ　７３／ＲＦＪ　２６を誘発後１晩にわたってインキュベートした培養 物から精製操作によって得られた可溶画分が、Ｅ８のＤＲＧ外植片に関して試験 された。図１３は、Ｅ８のＤＲＧ外植片からの神経突起成長が用量に依存して刺 激されたことを示している。

また、不溶画分をＥ８のを髄神経節（ＤＲＧ）外植片に関して試験したが、生物 学的活性は認められなかった。

不溶画分のＩＭ−ＮａＣ１による洗液から回収された組換えヒトＮＴ−４タンパ ク質の活性が、前記第９．３節に記載されたごとくにして調製された解離運動ニ ューロン培養物およびその他の試験系において試験された。ｌ：２０の希釈度で 組換えヒトＮＴ−４を添加したところ、処理後４８時間の運動ニューロン濃縮培 養物中におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ活性が３．６倍に増加した。

かかる３、６倍の増加は、未処理対照（Ｃ−ＮＴ）および緩衝液対照（Ｃ−緩衝 液）に対して測定されたものである（図１４）。

リポソーム結合部位並びにＬａｍＢシグナル配列の下流側にバクテリオファージ ＨＧ７−２のＮＴ−４コード領域をサブクローン化することによってプラスミド ｐＲＧ１７３が得られた。ｐＲＧ１７３を用いて大腸菌株ＲＦＪ２６を形質転換 し、次いでｐＲＧｌ　７３／ＲＦＪ　２６の大量培養を誘発したところ、生物学 的に活性な形態の組換えヒ）ＮＴ−４が発現された。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ原核生物 発現系において生物学的に活性な形態のヒトＮＴ−４を発現し得ることは、組換 えヒトＮＴ−４、ペプチドまたはそれらの誘導体の生産を治療目的および診断目 的のために大規模化することを実質的に容易にするものである。

このように本実施例は、ヒトＮＴ−４が発現されるようにしてヒトＮＴ−４をコ ードするＤＮＡ配列を原核生物系において転写および翻訳し得ることを示すと共 に、精製後にも活性が存続し得るようにしてそれの生物学的に活性な形態に精製 操作を施し得ることを示している。

１０、微生物の寄託 特許手続きのための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、 組換えＤＮＡ分子ｐＲＰＮ１３３　（ｈＮＧＦ）、ｐＲＰＮｌ　２１　（ｈＢＤ ＮＦｍｙｃ）およびｐＲＰＮ１４９（ｂＢＤＮＦ）は１９９１年６月７日に、ｐ ＲＧｌ　７３　（ＮＴ−４）は１９９１年１０月２８日に、組換えバクテリオフ ァージＨＧ７−２は１９９１年８月２２日にアメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（１２３０１バークローン・ドライブ、ロックビル、メリーランド 州２０８５２）に寄託され、そして下記のごとき受託番号を付与された。

組換えＤＮＡ分子　ＡＴＣＣ受入れ番号ｐＲＰＮｌ　３３　（ｈＮＧＦ）　７５ ０２９ｐＲＰＮｌ　２１　（ｈＢＤＮＦｍｙｃ）　７５０２８ｐＲＰＮ１４９　 （ｈＢＤＮＦ）　７５０２７ｐＲＧ１７３　（ｈＮＴ−４）　７５１３１ＨＧ７ −２　（ヒトＮＴ−４ゲノムクローン）　７５０７０本発明の範囲は、寄託され た微生物または本明細書中に記載された特定の実施の態様によって制限されるべ きでない。実際、上記の説明および添付の図面に基づけば、本明細書中に記載さ れた実施の態様以外にも本発明の様々な変更態様が当業者にとって自明となろう 。かかる変更態様は後記請求の範囲内に含まれることが意図されている。

本明細書中には様々な出版物が引用されているが、それらの全体が引用によって 本明細書中に併合される。

上記には本発明の幾つかの実施の態様が記載されているが、基本的な実施の態様 を変更することによって本発明の方法および組成物を使用するその他の実施の態 様が得られることは明らかである。それ故、本発明の範囲が前記明細書および後 記請求の範囲によってコードされる全ての変更態様を包括すると共に、本発明が 本明細書中に例示された特定の実施の態様によって限定されるべきでないことは 言うまでもない。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２Ａ ｎｇ／ｍｌ　ｈＮＧＦ ＦＩＧ、２Ｂ 八八 ＦＩＧ、５ Ｊ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、１０ ＜　ｈａ−←　ｃ　ト υ←　ｔｐｏ　Φ　Ｌ）Ｌｌ　べ闇　０区＜　（！ｌ　％ＯＬＩ　Ｌ５　ＬＪ ＦＩＧ、１２ 容量（ｕＬ） ＦｆＧ、１３ ＦＩＧ、１４ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１ ０２ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，ＮＯ，ＲＵ ＦＩ （７２）発明者　ファンドル、ジェームス　ビー。

アメリカ合衆国　１２５２０　ニューヨーク州う　グランジヴイル、オーヘイア ー　ドライブ（番地なし）

Claims (86)

【特許請求の範囲】
1. １．強い変性剤を含み、本質的に還元剤を含まない溶液中でニューロトロフィン を可溶化する段階を含む、動物以外の宿主細胞培養物において産生された組換え ニューロトロフィンの回収方法。
2. ２．強い変性剤が４Ｍ〜９Ｍのグアニジン塩、４Ｍ〜９Ｍのアルカリ金属チオシ アネートまたは７Ｍ〜９Ｍの尿素である、請求項１記載の方法。
3. ３．強い変性剤が７Ｍ〜９Ｍの塩酸グアニジンである、請求項２記載の方法。
4. ４．強い変性剤が８Ｍの塩酸グアニジンである、請求項３記載の方法。
5. ５．強い変性剤を弱い変性剤と交換する段階をさらに含む、請求項１記載の方法 。
6. ６．弱い変性剤が４Ｍ〜９Ｍの尿素である、請求項５記載の方法。
7. ７．強い変性剤が７Ｍ〜９Ｍの塩酸グアニジンで、弱い変性剤が６Ｍ〜８Ｍの尿 素である、請求項６記載の方法。
8. ８．強い変性剤が８Ｍの塩酸グアニジンで、弱い変性剤が７Ｍの尿素である、請 求項７記載の方法。
9. ９．前記溶液がプロテアーゼによるニューロトロフィンの分解を阻止するのに効 果的な量のメタロプロティナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１記載の方法。
10. １０．前記溶液がプロテアーゼによるニューロトロフィンの分解を阻止するのに 効果的な量のメタロプロティナーゼ阻害剤をさらに含む、請求項２記載の方法。
11. １１．前記溶液が１ｍＭ〜２００ｍＭのＥＤＴＡをさらに含む、請求項１０記載 の方法。
12. １２．前記溶液が５ｍＭ〜８０ｍＭのＥＤＴＡをさらに含む、請求項３記載の方 法。
13. １３．前記溶液が５０ｍＭのＥＤＴＡをさらに含む、請求項４記載の方法。
14. １４．前記溶液が５ｍＭ〜８０ｍＭのＥＤＴＡをさらに含む、請求項７記載の方 法。
15. １５．前記溶液が５０ｍＭのＥＤＴＡをさらに含む、請求項８記載の方法。
16. １６．（１）非変性環境におけるニューロトロフィンの溶解性を維持するのに効 果的な濃度で塩基性アミノ酸またはインドール酢酸を含むように前記溶液を調整 すること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項 ５記載の方法。
17. １７．（１）非変性環境におけるニューロトロフィンの溶解性を維持するのに効 果的な濃度で塩基性アミノ酸またはインドール酢酸を含むように前記溶液を調整 すること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項 ６記載の方法。
18. １８．（１）２０ｍＭ〜５００ｍＭのヒスチジンを含むように前記溶液を調整す ること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項６ 記載の方法。
19. １９．（１）２０ｍＭ〜１００ｍＭのヒスチジンを含むように前記溶液を調整す ること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項７ 記載の方法。
20. ２０．（１）２０ｍＭ〜１００ｍＭのヒスチジンを含むように前記溶液を調整す ること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項８ 記載の方法。
21. ２１．（１）２０ｍＭ〜１００ｍＭのヒスチジンを含むように前記溶液を調整す ること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項１ ４記載の方法。
22. ２２．（１）２０ｍＭ〜１００ｍＭのヒスチジンを含むように前記溶液を調整す ること、および（２）弱い変性剤を除くこと、の各段階をさらに含む、請求項１ ５記載の方法。
23. ２３．組換えｈＮＧＦ、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ−３を回収するための、請求項 ３、４、７、８、１２、１３、１４、１５、１９、２０、２１または２２記載の 方法。
24. ２４．２番目のアミノ酸残基としてセリンの代わりにトレオニンを有する組換え ｈＮＧＦ、全長ｈＢＤＮＦおよび全長ｈＮＴ−３を回収するための、請求項２３ 記載の方法。
25. ２５．ニューロトロフィンをコードするＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結され た制御可能な発現制御配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された動物以外の 宿主細胞を培養する段階を含み、該宿主細胞が熱ショック調節遺伝子変異株であ る、組換えニューロトロフィンの生産方法。
26. ２６．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ　ＨｔｐＲｔｍ　ｌｏｎ−変異株である、請求項 ２５記載の方法。
27. ２７．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ　ＨｔｐＲｔｓ　ｌｏｎ−変異株である、請求項 ２６記載の方法。
28. ２８．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ　ＬＣ１３７株である、請求項２７記載の方法。
29. ２９．発現制御配列がλＰＬプロモーターから成る、請求項２６記載の方法。
30. ３０．発現制御配列がλＰＬプロモーターから成る、請求項２７記載の方法。
31. ３１．ｈＮＧＦを生産するための、請求項３０記載の方法。
32. ３２．２番目のアミノ酸残基としてセリンの代わりにトレオニンを有するｈＮＧ Ｆを生産するための、請求項３１記載の方法。
33. ３３．ｐＲＰＮ１３３（ｈＮＧＦ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ　ＬＣ１３７ 株を培養する段階を含む、請求項２５記載の方法。
34. ３４．ｈＮＧＦ、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ−３を生産するための、請求項２６〜 ３０のいずれかに記載の方法。
35. ３５．ニューロトロフィンと同じ読み枠でシグナル配列を５′側から３′側に向 かってコードする融合遺伝子から成るＤＮＡ配列に機能しうる状態で連結された 発現制御配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された動物以外の宿主細胞を培 養する段階を含む、組換えニューロトロフィンの生産方法。
36. ３６．宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉであり、シグナル配列がＬａｍＢまたは修飾Ｌａ ｍＢである、請求項３５記載の方法。
37. ３７．発現制御配列がｌａｃＵＶ５プロモーターとＴ７φ１．１リボソーム結合 部位から成る、請求項３６記載の方法。
38. ３８．シグナル配列がＬａｍＢ１（配列番号：２）、ＬａｍＢ２（配列番号：３ ）、ＬａｍＢ３（配列番号：４）またはＬａｍＢ４（配列番号：５）である、請 求項３７記載の方法。
39. ３９．全長ｈＢＤＮＦを生産するための、請求項３８記載の方法。
40. ４０．シグナル配列がＬａｍＢ１（配列番号：２）である、請求項３９記載の方 法。
41. ４１．ｈＢＤＮＦｍｙｃを生産するための、請求項３８記載の方法。
42. ４２．シグナル配列がＬａｍＢ２（配列番号：３）またはＬａｍＢ４（配列番号 ：５）である、請求項４１記載の方法。
43. ４３．ｐＲＰＮ１４９（ｈＢＤＮＦ）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＩｑＦ−Ｗ １３３０株を培養する段階を含む、請求項３５記載の方法。
44. ４４．ｈＮＧＦ、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ−３を生産するための、請求項３５〜 ３８のいずれかに記載の方法。
45. ４５．強い変性剤を含み、本質的に還元剤を含まない溶液中で組換えタンパク質 を可溶化する段階を含み、該タンパク質が少なくとも９．０のｐＨを有しかつ少 なくとも２個のジスルフィド結合を有する、動物以外の宿主細胞培養物により生 産された組換えタンパク質の回収方法。
46. ４６．プラスミドｐＲＰＮ１３３（ｈＮＧＦ）。
47. ４７．プラスミドｐＲＰＮ１２１（ｈＢＤＮＦｍｙｃ）。
48. ４８．プラスミドｐＲＰＮ１４９（ｈＢＤＮＦ）。
49. ４９．請求項１の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィン 。
50. ５０．請求項５の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィン 。
51. ５１．請求項９の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィン 。
52. ５２．請求項１０の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィ ン。
53. ５３．請求項１６の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィ ン。
54. ５４．請求項１７の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフイ ン。
55. ５５．ｈＮＧＦ、ｈＢＤＮＦまたはｈＮＴ−３である、請求項４９〜５４のいず れかに記載の精製された均質なニューロトロフィン。
56. ５６．２番目のアミノ酸残基としてセリンの代わりにトレオニンを有するｈＮＧ Ｆである、請求項５５記載の精製された均質なニューロトロフィン。
57. ５７．全長ニューロトロフィンである、請求項５５記載の精製された均質なニュ ーロトロフィン。
58. ５８．ＧまたはＣの代わりにＡまたはＴを用いる少なくとも１つの縮重置換を有 する、ＬａｍＢシグナル配列をコードするＤＮＡ配列から成る、修飾ＬａｍＢシ グナル配列遺伝子に関する遺伝子。
59. ５９．７つの縮重置換を有する、請求項５８記載の遺伝子。
60. ６０．ＬａｍＢ１（配列番号：２）またはＬａｍＢ２（配列番号：３）である、 請求項５９記載の遺伝子。
61. ６１．１１〜２０アミノ酸残基の疎水性コア領域を有するＬａｍＢシグナル配列 をコードするＤＮＡ配列から成る、修飾ＬａｍＢシグナル配列遺伝子に関する遺 伝子。
62. ６２．１４アミノ酸残基のコア領域を含む、請求項６１記載の遺伝子。
63. ６３．コア領域がペプチドＬＡＶＬ（配列番号：６）を含む、請求項６２記載の 遺伝子。
64. ６４．ＬａｍＢ３（配列番号：４）またはＬａｍＢ４（配列番号：５）である、 請求項６３記載の遺伝子。
65. ６５．組換えニューロトロフィン−４を回収するための、請求項３記載の方法。
66. ６６．ヒトニューロトロフィン−４を回収するための、請求項６５記載の方法。
67. ６７．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７０を指定されたバクテリオファー ジＨＧ７−２中に含まれかつ図１１（配列番号：２２）に示されるＤＮＡ配列に よりコードされるヒトニユーロトロフィン−４を回収するための、請求項６６記 載の方法。
68. ６８．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３１を指定されたＤＮＡプラスミド ｐＲＧ１７３中に含まれかつ図１２に示されるＤＮＡ配列によりコードされるヒ トニューロトロフィン−４を回収するための、請求項６６記載の方法。
69. ６９．ニューロトロフィン−４を生産するための、請求項２５記載の方法。
70. ７０．ヒトニューロトロフィン−４を生産するための、請求項６９記載の方法。
71. ７１．ヒトニューロトロフィン−４が、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７ ０を指定されたバクテリオファージＨＧ７−２中に含まれかつ図１１（配列番号 ：２２）に示されるＤＮＡ配列によりコードされる、請求項７０記載の方法。
72. ７２．ヒトニューロトロフィン−４が、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３ １を指定されたＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクタ−ｐＲＧ１７３中に含まれかつ図 １２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる、請求項７０記載の方法。
73. ７３．図１２に示される配列を有する、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３ １を指定されたＢ．ｃｏｌｉプラスミドベクタ−ｐＲＧ１７３で形質転換された Ｅ．ｃｏｌｉＲＦＪ２６株を培養する段階を含む、請求項２５記載の方法。
74. ７４．ニューロトロフィン−４を生産するための、請求項３５記載の方法。
75. ７５．ヒトニューロトロフィン−４を生産するための、請求項７４記載の方法。
76. ７６．ヒトニューロトロフィン−４が、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７ ０を指定されたバクテリオファージＨＧ７−２中に含まれかつ図１２に示される ＤＮＡ配列によりコードされる、請求項７５記載の方法。
77. ７７．ヒトニューロトロフィン−４が、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３ １を指定されたＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクタ−ｐＲＧ１７３中に含まれかつ図 １２に示されるＤＮＡ配列によりコードされる、請求項７５記載の方法。
78. ７８．図１２に示される配列を有する、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３ １を指定されたＥ．ｃｏｌｉプラスミドベクタ−ｐＲＧ１７３で形質転換された Ｅ．ｃｏｌｉＲＦＪ２６株を培養する段階を含む、請求項３５記載の方法。
79. ７９．ＤＮＡプラスミドベクタ−ｐＲＰＮ９１。
80. ８０．図１２に示される配列を有する、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３ １を指定されたＤＮＡプラスミドｐＲＧ１７３。
81. ８１．請求項４９の方法により回収される、精製された均質なニューロトロフィ ン−４。
82. ８２．ヒトニューロトロフィン−４である、請求項８１記載の精製された均質な ニューロトロフィン−４。
83. ８３．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５０７０を指定されたバクテリオファー ジＨＧ７−２中に含まれかつ図１１（配列番号：２２）に示されるＤＮＡ配列に よりコードされる、請求項８２記載の精製された均質なニューロトロフィン−４ 。
84. ８４．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５１３１を指定されたＥ．ｃｏｌｉプラ スミドベクタ−ｐＲＧ１７３中に含まれかつ図１２に示されるＤＮＡ配列により コードされる、請求項８２記載の精製された均質なニューロトロフィン−４。
85. ８５．ヒトＮＴ−４が細菌により発現されるような条件下でヒトＮＴ−４をコー ドする組換え核酸を含む細菌を生育させ、そして産生されたヒトＮＴ−４を回収 することから成る、ヒトＮＴ−４の生産方法。
86. ８６．ヒトＮＴ−４が生物学的に活性である、請求項８５記載の方法。