JPH06507900A

JPH06507900A - 腫瘍性細胞増殖の治療用のサイトカイン受容体を標的とした分子

Info

Publication number: JPH06507900A
Application number: JP5500214A
Authority: JP
Inventors: ウォーターズ，コリー・アン; ポアソン，ルイス・アール
Original assignee: セラゲン・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-05-17
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1994-09-08
Also published as: WO1992020364A1; EP0584251A4; CA2103258A1; EP0584251A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】腫瘍性細胞増殖の治療用のサイトカイン受容体を標的とした分子発明の背景本発明は、腫瘍性細胞の増殖、例えば、癌の治療に関する。

腫瘍性細胞を標的とした薬物を用いての腫瘍性細胞増殖を制限しようとする試みはこれまでに多くあった。モノクローナル抗体および受容体リガンドは共に標的化剤として示唆されてきた。

マーフィー　（Ｍｕｒｐｔ＋ｙ）　（米国特許第４６７５３８２号）は、サイトカイン／インターロイキン−２ハイブリツド蛋白が、免疫系に関与する癌の治療で用いられ得ることを示唆している。

レメストル（ＬｅＭＢｉｓｔｒｅ）ら（ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３３７　：　１１２４．１９９１）は、ジフテリアトキシン／インターロイキン−２ハイブリッド分子を用いＣの慢性リンパ球白血病を持つ患者の治療を記載している。

発明の概要一般に、本発明は、患者において腫瘍性細胞増殖を治療する方法をその要旨とし、ここに、該腫瘍性細胞は非リンパ球かつ非単球起源である。該方法は、腫瘍性細胞で発現されたサイトカイン受容体に特異的に結合できる分子を患者に投与することを含み、該分子は腫瘍性細胞の活性を減少させることができる。該サイトカイン受容体はリンパ球または単球起源の細胞で通常発現されている受容体である。

種々の好ましい具体例において、該腫瘍性細胞は造血幹細胞由来ではな（：該腫瘍性細胞は肉腫であり：該腫瘍性細胞は骨肉腫であり、該腫瘍性細胞は繊維肉腫であり：該腫瘍性細胞は平滑筋肉腫であり、該腫瘍性細胞はカルシノーマであり：および該腫瘍性細胞は横絞筋肉腫である。より好ましい具体例において、該カルシノーマは肺カルシノーマであり、および該カルシノーマは肝細胞カルシノーマである。

好ましい具体例において、該サイトカイン受容体はインターロイキン受容体である。より好ましい具体例において、該インターロイキン受容体はインターロイキン−２受容体であり：該インターロイキン受容体はインターロイキン−４受容体であり、および該インターロイキン受容体はインターロイキン−６受容体である４、なおさらに好ましい具体例において、該インターロイキン−２受容体は高親和性インターロイキン−２受容体である。もう１つの好ましい具体例において、該サイトカイン受容体は非りンバ球および非単球起源の非腫瘍性細胞で発現されていない。

なおさらに他の好ましい具体例において、該分子はサイトカイン受容体を担持する細胞を殺し、該分子は一緒に共有結合した第１および第２の部分を含むハイブリッド分子てあり、該第１の部分は細胞活性を減少させ得る分子を含み、該第２の部分はサイトカイン受容体に特異的に結合できる分子を含む。より好ましい具体例において、該第２の部分はサイトカイン受容体に特異的な抗体のすべてまたはその結合部位を包含し、該第２の部分はサイトカイン受容体についてのりガントのすべてまたはその結合部位を包含し、および該第１の部分は細胞毒を含み。

および該抗体は補体活性化抗体である。さらに、より好ましい具体例において、該サイトカイン受容体はインターロイキン受容体である。なおさらにより好ましい具体例において、該リガントはインターロイキンである。

もう１つの好ましい具体例において、該細胞毒は、酵素的に活性であるが、−膜化された真核細胞受容体結合活性を有しないペプチドトキンンの断片である。

より好ましい具体例において、ベブチドトキンンの該断片はジフテリアトキシンのフラグメントＡおよびサイドシルへのトロンスローケーンランを容易にするための十分なジフテリアトキシンのフラグメントＢを含む。

他の好ましい具体例において、該分子はＤＡＢｓａ。ＩＬ−２であり：該分子はＤＡ８３ｓｓｌＬ　４てあり、該分子はＤＡＢｓｓｅｌＬ　６であり：該分子はＤＡＢ＋５ｇ１Ｌ　２てあり、該分子はＤＡ　Ｂ４＠６１１−　４であり；および該分子はＤＡ８４ｓｓｌＬ　６である。

「非リンパ球および非単球起源」とは、リンパ系幹細胞または単球からの子孫ではないべての細胞、例えば、Ｔリンパ球、８９２８球、およびマクロファージ以外の細胞を意味する。「リンパ球および単球起源」とは、リンパ系幹細胞または単球の子孫の細胞、例えば、Ｔリンパ球、８９２８球、形質細胞、およびマクロファージを意味する。「特異的に結合する」とは、当該分子が他の細胞表面受容体に実質的に結合しないことを意味する。「造血幹細胞起源でない」とは、すべての細胞は多能性幹細胞からの子孫でないすべての細胞を意味する。

本発明の他の特徴および利点はその好ましい具体例の以下の記載、ならびに請求の範囲より明らかであろう。

本発明者らによるｉｎ　ｖｉｔｒｏ毒性実験は、ある種の癌細胞はインターロイキン−４またはインターロイキン−２受容体を標的とする細胞毒に対して感受性である。

従って、これらの後記にて詳細に記載するインターロイキン受容体標的化細胞毒は癌細胞の活性を減少させる手段を提供する。

後記する実験において、種々の癌細胞系は、ジフテリアトキシンの受容体結合ドメイン（細胞内に存在する場合、その単一の分子は蛋白合成をブロックできる）がヒト・インターロイキン−４の一部で置き換えられている融合蛋白（ＤＡＢ３．。

ＴＬ−４）に感受性であることが示される。

種々の細胞系をＤＡＢ３８９１　Ｌ　４に暴露し、蛋白合成のレベルを後記のごとくに測定した。この分析の結果を表１に示すが、そこでは、ＩＣ６゜は蛋白合成で５０％の減少を引き起こすのに要する薬剤濃度と定義されている。横絞筋、平滑筋、肝臓、骨、および肺からの癌細胞系はＤＡ８３ｇｅｌＬ　４に感受性であり；これらの細胞系についてのＩＣＵは１０　１０Ｍないし１０′□８Ｍであることが判明した。

表１　：ＤＡＢ３ｓｓｌＬ−４に対する癌細胞の感受性細胞系　＊＾ＴＣＣＮｏ　分　類　林ＩＣ３，（Ｍ）Ｈｅｐ　Ｇ２　ロＢ　８０６５　ヒト・肝臓細胞カルシノーマ、２．７Ｘ１０−”肝炎Ｂ− ［＋Ｔ−＋０１１１０　ＣＣＬ　１２］　ヒト・繊維肉腫　３．９Ｘ１０−’＾６７３　（ＩＬ　１５９８　ヒト・横絞筋肉腫　２．７Ｘ　１０−’＾５４９　ＣＣＬ　１８５　ヒト・肺カルシノーマ　２．ｌＸ１Ｏ−８Ｕ−２０Ｓ　ＨＴＢ　９６　ヒト・骨肉腫、骨−次　２．６Ｘ１０−”５Ｋ−ＥＳ−１［ＩＴＢ　８８　ヒト・逝性骨肉腫、骨−次　２．２Ｘ１．０−”５Ｌ−１，１ｉｓ−］　ＨＴＢ８８　ヒト・平滑筋肉腫、外陰部　１．５Ｘ］、０−’＊アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクンラン（ベセスダ、メリーランド州）受託番号＊＊蛋白合成で５０％減少に導＜ＤＡＢ３ｓｓｌＬ　４の濃度これらの癌細胞系の感受性は、多数のインターロイキン−４受容体を発現することが期待されるＴＨＬＶ−１形質転換Ｔ−リンパ球および植物性赤血球凝集素活性化Ｔ−リンパ球のごとき細胞の感受性に匹敵する（表２）。対照的に、ヒト・インターロイキレ −４に認識されないインターロイキン−４受容体を発現する活性化ラント・Ｔ− リンパ球は、ジフテリアトキシンに感受性であるに拘わらず、Ｄ／’１１３１＠９１１−　４に対してほとんど感受性でない（表２）。この結果は、ＤＡＢｓｓｅｌＬ　４はインターロイキン−４受容体発現細胞を選択的に中毒化することを示す。

表２　リンパ細胞および単球に由来する通常および腫瘍性細胞のＤＡＢ３．。

ＩＬ−４感受性細胞または細胞系　分　類　ＩＣ５゜（Ｍ）Ｔ細胞起源ＨＵＴ　１０２／６ＴＧ　ヒト、ＣＴＣＬ、　ＩＩＴＩＪ−Ｉ”　２．９Ｘ１０ −”Ｃ９１／ＰＬ　ヒト、ＨＴＬＶ−Ｉ”、形質転換　６．３Ｘ１０−”Ｂ細胞起源Ｒａｊｉ　ヒト、バーキットリンパ腫ＥＢＶ”　７．２Ｘ１０−”骨髄腫非核細胞Ｕ９３７　ヒト、細網肉腫　２．０ＸＩＯ−’正常Ｐ　ＢＭＣＰ［ｌ＾活性化Ｔ細胞　ヒト　１．６Ｘ１０−ＩＯ非霊長類Ｃｏｎ八−活性化正常同様の一連の実験は、ヒト・横絞筋肉腫細胞系Ａ６７３　（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５９８）は、ジフテリアトキシンの受容体結合ドメインがヒト・インターロイキン−２の一部で置き換えられた融合蛋白（ＤＡＢ４８６１　Ｌ　２）に感受性であることを示した。７．６Ｘ１０−’ＭにおけるＤＡＢ４１１６１Ｌ　２は蛋白合成を５０％減少させた。

インターロイキン受容体標的化細胞毒に対する腫瘍性細胞の感受性についてのアンセイ蛋白合成を測定することによって細胞毒性を評価した。ＤＡ　Ｂｓｇｅ　Ｉ　Ｌ　４（またはＤＡＢａｓａ　Ｉ　Ｌ　２）の存在下および不存在下における［１４Ｃ］ロイシンの取込は以下の通りである。細胞を細胞タイプに適した培養培地中にて９６ウエルマイクロタイタープレートにて平板培養した。ＤＡＢｓｓｊＬ　４　（または１）Ａ　Ｂ４１ｇ　Ｉ　Ｌ　２）を種々の濃度で添加し、［１４Ｃ］ロイシンでのパルス標識化に先立って２０時間、該培養をインキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理し、ガラス繊維製のフィルターマットに収穫し、計数した。ＩＣ，。は［＋４（：］ロインンの取込の５０％減少を導く細胞毒の濃度である。

轡者から得た組織試料（例えば、バイオプシー）から単離した細胞を含めた他の細胞タイプの感受性は前記したごとくに評価できる。また、活性は、調べようとする細胞タイプに適したいずれの標準的な活性アッセイを用いても測定できる。

例えば、トリバンブルー染料排除アッセイを用いて活性を測定できる（クルーズ（ｋｒｕｓｅ）ら、ティン、−・カルチャー・メソソズ・アンド・アプリケーシランズ（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、アカデミツク０プレス（＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、１９８９）。

本発明の方法で有用な分子本発明の方法で有用な分子はガイカイン受容体に標的化される。一般に、本発明で有用な分子を実施し得る３つの方法がある＝　（１）該分子は細胞毒性ドメインを有するゆえ細胞を殺すことができる。（２）該分子（抗体）は補体固定を誘導することによって細胞溶解を引き起こすことができる：および（３）該分子は受容体のりガントの結合または摂取をブロックすることができる。すべての３つの場合において、該分子は受容体担持細胞に対して標的化されていなければならない、これは、受容体のりガント（またはその誘導体の部分）あるいは当該分子の一部としての抗−受容体抗体を含ませることによって達成される。

インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体標的化分子はこれらの３つのアプローチの各側を提供する。ＩＩ、−２のＩＬ−２受容体結合部分および細胞毒を包含する融合分子はインターロイキン−２受容体を担持する腫瘍性細胞を殺すのに使用できる。同様に、前記した分子の第２のタイプ、補体固定抗体は、ＩＬ−２受容体に向けられたこの例において、ＩＬ−２受容体担持細胞を排除することができる。この例において、分子の第３のタイプはその受容体に対するＩＬ−２の結合をブロックする分子であり得る。この分子はインターロイキン−２受容体を担持する腫瘍性細胞が増殖シグナルをＩＬ−２から受け取るのを妨げるであろう。

腫瘍性細胞増殖を治療するのに有用な分子は多数の形態を採ることができる。

ＩＬ−２それ自体が標的化剤である場合、該分子は細胞毒性ハイブリッド分子であり得、そこでは、ＩＬ−２はトキシン分子、好ましくはポリペプチドトキシンに融合している。Ｉ　Ｌ−２Ｒに結合し、ＩＬ−２活性を欠き、かつボナフィド（ｂｏｎａ　ｆｉｄｅ）　Ｉ　Ｌ　−２の結合および／または摂取をブロックするｌｌ−２の誘導体は本発明の方法で有用である。何故ならば、それはＩＬ−２Ｒ担持細胞のＩＬ−２誘導増殖を妨げるであろうからである。抗−ＩＩ、−２Ｒ抗体が標的化剤である場合、細胞毒性ハイブリッド分子は抗体のすべてまたは一部を細胞毒に融合させることによって形成できる。ＩＬ−２／トキシンハイブリツドのようなかかる抗体／トキシンハイブリッドの効率は、そわが結合する細胞によって摂取されるハイブリッド分子に依存している。ＩＬ−２の結合および／または摂取をブロックする抗−ＩＬ−２Ｒ抗体もまた本発明の方法で有用である。溶解性抗−ＩＬ−２Ｒ抗体は、ＩＬ−２Ｒ担持細胞の補体媒介溶解を引き起こすので、本発明で有用である。

いつくかの分子は２種またはこれを超える分子のすべてまたは一部の融合によって形成されるハイブリッド分子であり得る。該ハイブリッド分子は組換えＤＮＡ分子によってコードされるハイブリッド蛋白であり得るが、この場合、２つのドメインはペプチド結合によって（直接あるいは中間ドメインを通じて）連結されている。別法として、２つのドメインは別に生産でき、また別の化学的連結工程における共有結合によって連結できる。いくつかの場合、ハイブリッド分子の細胞毒ドメインはそれ自体２つの別々の分子から誘導してもよい。

標的化剤としてのインターロイキン−２インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはそのいずれかのＩＬ−２受容体結合誘導体を細胞毒についての標的化剤として使用できる。ＩＬ−２のＤＮＡおよびアミノ酸配列は公知であり（タダッグ（Ｔａｄａｔｓｕｇｕ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３０２　：　３０５．１９８３）、その構造はＸ線結晶解析によって予測されている（プラントツーバー（Ｂｒａｎｄｈｕｂｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３８　：　１７０７．１９８７）。ＩＬ−２の遺伝工学により作製した変異体の分析により、いずれの残基がＩＬ−２Ｒ結合（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、プロ／−デイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ　８５　ニア７０９．１９８９）および生物活性（ニーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、勺イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３４　：　３４９．１９８９　：コリンズら、前掲）に重要かに関する情報がいくらか提供されている。本発明で有用なＩ　Ｌ−２の変異体は、残基７４および残基７９（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、ヌクレイツク・アンズ・リサーチズ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）］、　６　：　１０４５．１９８８によるナンバリング）の間の領域において１個またはそれを超えるアミノ酸残基を欠く欠失突然変異体を含む（ここに、参照して一体化させるゲンバウフｓ　（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ）ら、ＵＳＳＮ３８８゜５５７）。これらの突然変異体はトキシンを効果的にＩｔ、−２Ｒ担持細胞に対して標的化する（ケンハウフェ（Ｇｅｎｂａｕｆｆｅ’）ら、前掲）。一般に、細胞毒を標的化４−るのに有用な１ｆ−２変異体は！１．−２Ｒに効果的に結合し、飲食作用をうけなければならない。ＩＬ−２受容体に結合する種々の変異体の能力は後述する＋　１．− ２　Ｒ結合アッセイでテストできる。

ＩＬ−２受容体を担持する細胞に対して標的化された分子をデザインするにおいて、他の受容体と同様に、１１、−２受容体はいくつかの形態を有し：１の形態を担持し、他の形態を担持しない細胞を標的化するのが望ましいであろうことを認識する必要がある。ヒト・インターロイキン−２受容体は高−１中−１および低−親和性形態を有する。高親和性受容体は〜１．Ｑ−１０Ｍの見掛けのに、を有し、２つのサブユニットｐ５５および（ｐ７０とも呼ばれる）ｐ７５よりなる。細胞表面で発現されると、ｐ７５およびｐ５５の両サブユニットはＩＬ−２に結合できる。該ｐ７５サブユニットは、生親和性受容体（Ｋ、〜８．２Ｘ１０− ’°Ｍ）に対応し、ｐ５５サブユニットは低親和性受容体（Ｋ、〜１−３Ｘ１０ −εＭ）に対応する。該ｐ７５サブユニットは休止状態のＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球／マクロファージ、およびリンホカイン−活性化キラー（１，、ＡＫ）細胞前駆体の表面に発現さね、一方、該高親和性受容体は活性化されたＴ −およびＢ−細胞に発現される。

本発明の方法においては、高親和性受容体を担持する細胞のみを標的化するのが望ましいであろう。これらの状況において、有用な分子は、中または低親和性受容体を担持する細胞にほとんど影響しない濃度にて、高親和性ＩＬ−２受容体を排除または中和する。ＩＬ−２それ自体と同様に、分子がＴＬ−２受容体のすべての３つのクラスにつき親和性を有する場合、低親和性受容体を担持する細胞への有意な結合を許容しない濃度にて該分子を投与することによって選択性は達成される。ハイブリッド分子はＩＬ−２と比較して受容体親和性を変更するかも知れない。かかるハイブリッド分子は、多かれ少なかわ、高親和性ＩＬ−２受容体を担持する細胞につき親和的であり得る。例えば、高親和性受容体を有する細胞は、生親和性受容体を担持する細胞よりも、ジフテリアトキシンおよびＩＬ−２の一部よりなる融合蛋白ＤＡ　Ｂ４１１１１１−−２に対し５００〜１０００倍以上感受性である（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、ニーロビーアン・ジャーナル・オブ・イミュノロンー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　）、２０　：　７８５．１９９０）。

細胞毒は多くの方法でＩＬ−２誘導体に付着させることができる。好ましくは、ＩＬ−２／トキンンハイブリツドは、融合遺伝子の発現によって産生されるハイブリッド蛋白である。別法として、細胞毒およびＩＬ−２誘導体は別々に生産して、非ペプチド結合によって後にカップリングさせることができる。連結方法は後記する。

好ましくは、有用な細胞毒は細胞内に存在する場合にのみ有意に細胞毒性であって、標的化ドメインの不存在下でいずれの所与の細胞からも実質的に排除される。

ペプチドトキンンはこれらの両基準を満たし、容易にハイブリッド分子に一体化される。混合細胞毒、すなわち、２種またはそれを超えるトキシンのすべてまたは一部よりなる細胞毒を用いることもできる。いくつかの有用なトキシンは後期にて詳細に記載する。

標的化剤としてのインターロイキン−４およびインターロイキン−６インターロイキンー４　（ＩＬ−４）は種々の細胞タイプに作用するサイトカインである。

その受容体はＣＤ４＋　Ｔ細胞および単球を含めた多数の細胞タイプに発現される。Ｉ　Ｌ−４はＴ細胞増殖因子として作用でき、ＩＬ−２誘導リンパ球増殖に対して影響を有すると考えられる。

ＩＬ−４受容体担持細胞またはＩＬ−６受容体担持細胞に向けられた細胞毒はＩＬ−２Ｒ担持細胞に向けられる分子の効果を増強し得る。ＩＬ−４およびＩＬ− ６の蛋白およびＤＮＡ配列は公知である（リー（Ｌｅｅ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ）２６３　＋　１０８１７．１９８８　ヒラメ（ｈｉｒａｎｏ）ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）３２４　：　７３．１９８６）。これらのリンホカインはＩＬ−２／トキシンハイブリツド分子と同様のハイブリッドリンホカイン／トキシン分子を創製するのに使用できる。

標的化剤としてのモノクローナル抗体選択したリンホカイン受容体に向けられたモノクローナル抗体はトキンンをその受容体を担持する細胞に向けるのに使用できる。ハイブリッド蛋白分子をコードする融合遺伝子によってコードされたトキシンおよび抗体によって、あるいは別々に産生されたリガンドおよびトキシン分子を連結するのに使用される非ペプチド共有結合によって、これらの抗体または抗体断片を細胞毒に融合させることができる。いくつかの有用なトキシンは後述する。

抗体／トキシンハイブリッドは、ＩＬ、−２Ｒ担持細胞につき前述したのに同様の毒性アッセイを用い、受容体担持細胞を殺すその能力につきテストできる。

本発明の方法で有用なモノクローナル抗体は、ヒト・ＩＬ−２Ｒまたは培養したＴ−リンパ球でマウスを免疫し、マウス肺臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合し、エライザアソセイによって必要なＴ　Ｌ　＋　−２Ｒ結合特性について、得られたハイブリトーマ系によって産生された抗体をスクリーニングすることによって作製できる。抗体の産生およびスクリーニングはウチャマ（Ｕｃｈｉｙａｍａ）ら（ジャーナル・オブ・イミュノロジー０．Ｉｉ＋５ｕｎｏ１．）　１２６　＋１３９３．１９８１）に従って達成できる。

本発明では、無傷のモノクローナルまたはポリクローナル抗体のみならず、免疫学的に活性な抗体断片、例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）ｚ断片、抗体重鎮、抗体軽鎖：遺伝子工学により作製した一本鎖ＦＶ分子（ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第４９４６７７８号）：またはキメラ抗体、例えば、マウス抗体の結合特異性を含有するが、残りの部分のほとんどまたはすべてがヒト起源である「ヒューマナイズド（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）Ｊ抗体を使用できる（ライヒマン（Ｒｅｉｃｔ＋＋５ａｎ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３３２　：　３２３．１９８８）。

トキシン好ましくは、本発明の方法で有用なトキシン分子は、細胞内に存在する場合のみ有意に細胞毒であるペプチドトキシンのごときトキシンである。勿論、これらの状況下で、該分子は標的化受容体を担持する細胞に侵入できなければならない。

この能力は、分子の性質および細胞受容体の性質に依存する。例えば、天然にてリガンドの摂取を可能とする細胞受容体は、その受容体を担持する細胞に侵入するトキシンを包含する分子につき手段を提供するようである。好ましくは、ハイブリッド蛋白分子をコードする組換えＤＮＡ分子を産生ずることによって、ペプチドトキシンをＩＬ−２Ｒ結合ドメインに融合させる。かかるアプローチは組成物のコンンステンシーを保証する。

多くのペプチドトキシンは一般化された真核細胞受容体結合ドメインを有し：これらの例において、該トキシンは受容体非担持細胞の中毒化を防ぐように修飾されなければならない。いずれのかかる修飾も、分子の細胞毒機能を保持する方法でなされなければならない（ヘルス・アンド・ヒユーマン・サービンズ（Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ）の米国部会、米国特許出願４０１４１２号参照）。

可能性として有用なトキシンは、コレラトキシン、リシン、Ｏ−シカ様トキ、／ン（ＳＬＴ−Ｔ、５ＬＴ−ｎ、ＳＬＴ　ｒＩＶ）、ＬＴトキンン、Ｃ３トキンン、シガ（Ｓｈｉｇａ）　トキシン、百日咳トキシン、破傷風トキシン、シュードモナスのエンドトキシン、アロリン（ａｌｏｒｉｎ）、ザポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、モデンン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、およびゲラニン（ｇｅｌａ口ｉｎ）を包含する。

ジフテリアトキシンをヘースとした分子ジフテリアトキシンは本発明の方法で有用な分子を生産するのに使用できる。

その配列が公知のジフテリアトキシンは、ここに参照して一体化させるマーフィー　（ｋｌｕｒｐｈｙ）の米国特許第４６７５３８２号に詳細に記載されている。コリネバクチリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｉ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌される天然ンフー）リアトキシン分子は、当該分子のアミ５ノ末端で出発し、酵素的に活性なフラグメントＡ（アミノ酸Ｇｌｙ＋　Ａｒｇｕｅ３）およびフラグメントＢ（アミノ酸Ｓ　ｅ　ｒ　１９４　Ｓ　ｅ　ｒ　５３５）として特徴付けられるいくつかの機能性ドメインよりなり、これは、トランスローケーンマンドメインおよび一般化された細胞結合ドメイン（アミノ酸残基４７５ないし５３５）を包含する。

４７７子す７トキンンが感受性真核細胞を中毒化する方法は、少な（とも以下のｒ稈を含む　（ｉ）感受性細胞の表面の特異的受容体へジフテリアトキシンの結合ドメインが結合する。（ム）その受容体へ結合しつつ、該トキシン分子は飲食作用・ｊへ胞に内在化される：　（ｉｉｉ）内在化に先立ち、あるいは飲食作用小胞内において、ト・キ、：、分子はフラグメントＡおよびＢの間で蛋白分解性切断を受ける。

（ｔｖ）飲食作用・ｊ１胞のｐＨが６未鳩まで低下するにつれ、トキシンは核内体膜を横切り、フラグメントＡのサイドシルへの送達を容易とする；　（Ｖ）フラグメントＡの触媒活性（すなわち、「伸長因子２」なる用語の真核細胞蛋白合成のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド−依存性アデニンニリン酸（ＡＤＰ）リボンル化）は中毒化細胞の死滅を引き起こす。サイドシルに導入されたフラグメント２・〜の単一分子は細胞の蛋白合成装置を阻害し、細胞を殺すのに十分にようである。

ノユードモナスエキソトキンンＡによる、および恐らくはある種の他の天然トキシンによる細胞死滅化の機構は非常に似ている。

１）ＡＢａｓｓ　Ｉ　Ｌ　２、すなわち、ジフテリアトキシンの受容体結合ドメインがヒト−ＩＬ−２の一部で置き換えられた融合蛋白（ウィリアムス（ｆｉｌｌｉａｍｓ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）３５　：　２０６７３．１９９０；ウィリアムス（ｆｉｌｌｉａｍｓ）、プロティン・エンジニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、　）　１　：　４９３．１９８７）は、本発明の方法で有用な分子の例である。この分子はＩ　Ｌ−２Ｒ発現腫瘍細胞およびリンパ球を選択的に殺す（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ら、ニーロビーアン・ジャーナル・オブ・イミュノロジー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　２０　：　７８５．１．９９０；キヨカ’７　（ｋｉｙｏｋａｗａ）　ラ、キャンサー・リサーチーズ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　）　４９　：　４０４２．１９８９）、その活性化リンパ球を殺す能力のため、ＤＡ８４８１１１Ｌ　２は移植片拒絶を制御するのに（バナヶウッッｘ　（Ｐａｎｋｅｖｙｃｚ）ら、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）　４７　：３１８．１９８９：キソクマン（Ｋｊｃｋｍａｎ）ら、トランスプランテーション４７３２７．１９８９）、またある種の自己免疫障害を治療するのに（フォルテ（Ｆｏｒｔｅ）ら、イミュノトキシンについての第２回国際シンポジウム、１９９０）使用されてきた。

ＤＡＢ４ｓａＩＬ　２はＭｅｔ、、続いてＩＬ−２のアミノ酸残基２ないし１３３に融合した成熟ジフテリアトキシンのアミノ酸残基１ないし４８５よりなる。

かくして、ＤＡＢ４１＋６１Ｌ　２は、当該分子の酵素的活性部分をコードするシフテリアトキノンフラグメントＡのすべて、およびフラグメントＢの一部を包含する。

ＤＡ　Ｂ４ｓ６１　Ｌ　２に存在するフラグメントＢの一部は一般化された受容体結合ドメインは包含しないが、サイドシルへの酵素的活性部分の送達を容易とするトランスローケーンマンドメインを包含する。

ＤＡＢ４８６１Ｌ　２およびＤＡＢｓｇｅｌＬ　２の調製ＤＡＢｕ＋５ｌＬ−２は、ＤＡＢ＜５ａｌＬ　２をコードするプラスミドｐＤＷ２４（ウィリアムス（ｆｉｌｌｉａｍｓ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、）、２６５：２０６７３．１９９０、但し、ａｍｐ ’はｋ　ａ　ｎ　’によって置き換えられている）を有するイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）で産生された。該蛋白は免疫アフィニティークロマトグラフィ・−および高圧液体クロマトグラフィ−によって精製した（ウィリアムスら、前掲）。

ＤＡＢｓｍｅＩＬ−２は、ＩＬ−４をＩ　Ｌ−２で置き換えることによって、ＤＡＢ、。ＩＬ〜４につき後記するごとくに調製できる。

ＤＡＢｓｍｅＩＬ　４およびＤＡＢ＜５ａｌＬ−２の調製ヒト・インターロイキン−４をコードする合成遺伝子を合成した（ミリケン／バイオサーチ（Ｍｉｌｌｊｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　７５００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装Ｗ）。ＩＬ−４配列（ヨドタ（ＹｏｄｏｔＢ）ら、プロンイーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ザイエンノズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８３　：　５８９９４．１９８６）を修飾してイー・コリの好ましいコドン用法に一体化させ（デボエル（ｄｅＢｏｅｒ）ら、マキンマイジング・シーン・エクスブレンタン（ｉｌａｘｉｍｉｚｉｎｇ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、レズキオフ（［１ｅｚｎｉｋｉｏｆｆ）ら編、１９８６、バターワーズ（Ｂｕｔｔｅｒｖｏｒｔｈｓ）、ボストン）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を付加して続いてのクローニング工程を容易とした。ＩＬ−４コーディング配列（Ｈ４ｓ’ないしＳｅ、１２９）をｐＤＷ２７ブラスミドに挿入した。ｐＤＷ２７は、天然ジフテリアトキシンのアミノ酸３８８ないし４８５に対応するＤＮＡを欠失することによってｐＤＷ２４（ウィリアムスら、ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉａｓ、　Ｃｈｅｍ、）２６５　：１１８８５．１９９０）から誘導される。ＤＡＢ４１１１＋ＩＬ−４はＩ　Ｌ−２をｌｌ−４で置き換えることによってＤＡＢｉｓｇｌＬ　２につき前記したごと＜ｉ：Ｅｌ製できる。

ＤＡ８３ｓ、ｌＬ　４の細胞毒仕種々の細胞タイプの活性を減少させるＤＡＢ、。ＩＬ−４の能力は蛋白合成アッセイの阻害を用いて測定した：このアッセイの結果は表３に示す。ＩＣ，。（Ｍ）は蛋白合成を５０％減少させるのに必要なりＡＢ、。ＩＬ〜４の濃度である。

ラットのＣｏｎＡ活性化した正常稗臓リンパ球は、いずれの他の細胞または細胞系よりも、ＤＡ８３ｓｓｌＬ−４に対して感受性がかなり低かった。ラット・インターロイキン−４受容体はヒト・インターロイキン−４に結合しないので、この結果はＤＡＢ３ｓｏｌＬ−４の特異性を示す。これらのラット細胞はジフテリアトキシン／ラット・インターロイキン−２ハイブリツド分子に感受性である。

ＤＡＢ、。Ｉ　Ｌ　−６およびＤＡＢ４８６１　Ｌ　６の調製ヒト・インターロイキン−６をコードする合成遺伝子を合成した（ミリゲン（Ｉｌｉｌｌｉｇｅｎ）、／バイオサーチ（Ｂｉｎｓｅａｒｃｈ）　７５００　Ｄ　Ｎ　Ａ合成装！Ｉ）。Ｉ　Ｉ−−５の配列（レベル（Ｒ６ｖｅｌ）ら、ＥＰＡ８６１１．４０４．９）を修飾してイー・コリの好ましいコドン用法に一体化させ（デボエル（ｄｅＢｏｅｒ）ら、前掲）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を付加して引き続いてのクローニング工程を容易とした。

全ＩＬ−６暗号配列をＤＡＢ３ｓｅｌＬ−４につき前記したごとくにｐＤＷ２７ブラスミドに挿入した。ＤＡＢ＜ａｓｌＬ−６はＩｔ−２をＩＬ〜６で置き換えることによってＤＡＢｓｍｅＩＬ　２につき前述したごと（に産生できる。

混合トキシン本発明で有用ないくつかの分子の細胞毒性部分は、混合トキシン分子によって提供できる。混合トキシン分子は、２つの異なるポリペプチドトキシンから誘導された分子である。一般に、ジフテリアトキシンに関連して前記したごと（、ポリペプチドトキシンは、−膜化された真核細胞結合の原因となるドメインに加えて、酵素的に活性な部分およびトランスローケーンタンドメインを有する。結合およびトランスローケーンタンドメインは、各々、細胞の認識およびトキシンの侵入に必要である。酵素的に活性なドメインは、当該分子が細胞内に入ると、細胞毒性活性の原因となるドメインである。

トランスローケーンタンドメインを有することが知られている天然に存在する蛋白はジフテリアトキシン、シュードモナスエキソトキシンＡ、および恐らくは他のペプチドトキシンを包含する。ジフテリアトキシンおよびシュードモナスエキソトキシンＡのトランスローケーンタンドメインはよ（特徴付けられており（例えば、ホヒ（Ｈｏｃｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８２　：１６９２．１９８５、コロンバラティ（Ｃｏｌｏｍｂａｔｔｉ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２６１　＋　３０３０．１９８６　；およびブレーズ（Ｄｅｌｅｅｒｓ）ら、ＦＥＢＳ−レターズ（１，ｅｔｔｅｒｓ）　１６０　：　８２．１９８３）、他の分子におけるかかるドメインの存在および位置はハウアング（ｌｌｗａｎｇ）ら（セル（Ｃｅｌｌ）４８　：　］　２９．１９８７；およびグレイ（Ｇｒａｙ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）ＵＳＡ８１　：　２６４５．１９８４）が使用している方法によって測定できる。

１の有用なＩＬ−２／混合トキノンハイブリッド分子はイー・コリのシカ様トキシンの酵素的に活性なＡサブユニット（カルダーウッド（Ｃａｌｄｅｒｗｏｏｄ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（ＰｒｏｃＮａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、）ＬＪＳＡ８４　：　４３６４．１９８７）をジフテリアトキシンのトランスローケーンタンドメイン（アミノ酸残基２０２ないし４６０）に、および目、−２に融合することによって形成される。

この３部分ハイブリッド分子５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ’　／ＩＬ−２は、前記したＤＡ８４ａｓ　Ｉ　Ｌ−２と同様に、本発明の方法で有用である。該３部分ハイブリッドのｒＬ−２部分は、当該分子のＩＬ−２Ｒ担持細胞への特異的付着を引き起こし、ジフテリアトキシンのトランスローケーンタンドメイン部分はシカ様トキシンの酵素的活性なＡサブユニットに作用して標的化細胞へ挿入させる。ジフテリアトキシンと同様に、シカ様トキシンの酵素的に活性な部分は、当該細胞の蛋白合成装置に作用して蛋白合成を妨げ、か＜シ、て該細胞を殺す。これらの２つのタイプのハイブリッドトキシン間の差異は、その酵素的活性の性質である＋ＤＡＢ＜５ａｌＬ　２の酵素的部分は、伸長因子２のニコチンアミドアデニンノヌクレオチドによってＡＤＰ−リボンル化を触媒し、それにより、蛋白合成に必要なこの因子を不活化し、その一方で、５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ’　／ＩＬ−２の酵素的部分は臨界的部位においてリポソームＲＮＡを切断でき、それにより、当該リポソームを不活化できるリボヌクレアーゼである。５ＬＴ−Ａ／ＤＴＢ’／ＩＬ−２ハイブリツドは、従って、ＤＡＢ＜５ｓｒＬ−２と同一の症状の治療として有用であり、それで置き換えたり、それと−緒に使用できるであろう。

トキシンの結合リガンドへの連結有用なハイブリッド分子の結合リガンドおよび細胞毒はいくつかの方法で連結できる。ハイブリッド分子を融合遺伝子の発現によって産生ずるならば、ペプチド結合は細胞毒と結合リガンドの間の連結として働く。別法として、該トキシンおよび結合リガントを別々に産生じ、非ペプチド共有結合によって後にカップリングさせることができる。

例えば、共有結合連結は、ジスルフィド結合の形態を採り得る。この場合、ＩＬ −２Ｒ結合リガンドが蛋白、例えば、ＩＬ−２である場合、ＩＬ−２をコードするＤＮＡは、ここに参照して一体化させるマーフィ（ｌｌｕｒｐｔ＋ｙ）らの米国特許第３１３５９９号に記載されているごとくに、余分なシスティンコドンを含有するように設計できる。該システィンは当該分子の１ｌ−２Ｒ結合活性に干渉しないように位置させなければならない。例えば、システィンコドンはＩｔ− ２の成熟形態のＰｒｏ”をコードするＤＮＡの丁度上流に挿入することができる。トキノン分子は、システィンと反応性のスルフヒドリル基で誘導体化されていなければならない。ペプチドトキシンの場合、これは、当該トキシンをコードするＤＮＡ配列に７ステインコドンを挿入することによって達成できる。別法として、スルフヒドリル基は、それ自体あるいはシスティン残基の一部として、固相ポリペプチド法を用いて導入することができる。例えば、スルフヒドリル基のペプチドヘノ導入はヒスキー０１ｊｓｋｅｙＸベブタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）３　：　１３７．１９８１）に記載されている。また、誘導体化は、ここに参照して一体化させるバカ（Ｂａｃｈａ）らの米国特許第４４６８３８２号にペプチドホルモンの誘導体化につき記載されている方法に従って行うこともできる。同様に、蛋白はＤＮＡまたは蛋白化学レベルで誘導体化することもできる。スルフヒドリル基の蛋白への導入は、マツセン０１ａａｓｅｎ）ら（ニーロビーアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　）　１３４　：　３２．１９８３）に記載されている。次いで、細胞毒およびＩＬ−２Ｒ結合リガンドを生産し、精製し、両硫黄基を還元し、約１：５ないし】：２０の比でトキシンとリガンドを混合し、室温にてジスルフィド結合の形成を完了まで進行させ（一般に２０ないし３０分）ることによって、精製した分子間にジスルフィド結合を形成させた。次いで、混合物をリン酸緩衝化生理食塩水に透析して未反応リガンドおよびトキンン分子を除去した。次いで、セファデックスクロマトグラフィー等を行−】で、サイズに基づき所望のトギシンーリガンド接合体をトキンンートギンンおよびリガンド−リガンド接合体から分離する。

Ｉ　Ｌ−２受容体結合およびＩＬ−４受容体結合についてのアッセイ高親和性（ンユＯｕ）ら、ジャーナル・イブ・バイオロジカル・ケミストリー（）、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ａ、）２６２　：　５７２３．１９８７）または中親和性受容体（ロブ（Ｒｏｂ）ら、プロンーディングズ・イブ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、Ｓｃｊ、）ＵＳＡ８４　：　２００２．１９８７）についての】Ｌ−２Ｒアツセイを用いて種々の分子のＩＬ −２Ｈ結合能を測定することができる。種々の分子のＩＬ−４Ｈ結合活性はパーク（Ｐａｒｋ）らによって記載されているアッセイ（ジャーナル・イブ・エクスベリメンタル・メデイシン（Ｊ、　Ｅｘｐｌｌｅｄ、）１６６　：　１７６．１．９８４）またはフｔツクスウェル（Ｆｏｘｗｅｌｌ）らによって記載さねているアッセイ（ニーロビーアン・ジャーナル・イブ・イミュノロジ−（Ｅｕｒ、Ｊ、ｆｍｕｎｏｌ、）１９　：１６３７．１９８９）を用いて測定できる。

毒性についての了、セイ本発明の分子（抗体および）＼イブリッド分子双方）は、後述するごときア・ソセイじより、標的化受容体を担持する細胞の活性を減、少させる能力につきスクリーニングできる。

ＩＬ−２担持細胞に対する毒性は以下のごとにテストできる。培養したＨＵＴ１０２／６ＴＧ　（ラド（Ｔｓｕｄｏ）ら、プロンーデイングズ・イブ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８３　：９６９４．１９８６）またはＹＴ２Ｃ２（テノギワリ（Ｔｅｓｈｉｇｉｗａｒｊ　）ら、ジャーナル・イブ・１クスベリメンタル・メデイシン０．　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）１６５　：２２３．１９８７）細胞を、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）　、２ｍＭ　１−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌベニンジン、１０（ｂ１ｇ／ｍｌステレブトマインン、および１０％胎児ウン血清（ハセルトン（Ｈａｚｅｌ　ｔｏｎ）、レネクセア（Ｌｅｎｅｘａ）、カンザス州）を補足したＲＰＭＩ　１６４０培地（ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）、グランド・アイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）、ニューヨーク州））に維持する。完全培地中のウェル当たり１×１０５の濃度にて、細胞を、９６−ウェルＶ−底プレート（リンブローフロラ・ラボラトリーズ（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マクリーン（ＭｃＬｅａｎ）、ノクーンニア州）に接種する。トキンン候捕物を添加して種々の濃度（１０−１２Ｍないし１０−’Ｍ）とし、該培養を５％ＣＯ０雰囲気中、３７℃にて１８時間インキュベートする。

インキュベーンランに続き、１７０ｘｇにて５分間プレートを遠心し、培地を除去し、８μＣｉ／ｍ＋　（３Ｈ−ロイシン、ニュー・イングランド・ヌクレアー＜Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチュセ・ソツ州）を含有する１００μｍ無ロイシン培地（ＭＥＭ、ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））で置き換えた。３７℃でさらに９０分後、１７０Ｘｇにて５分間プレートを遠心し、セル・ノ＼−ベスター（ｃｅｌｌ　ｈａｒｖｅｓｔｅｒ）　（ヌ、カドロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）、スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）、ノ（−ジニア州）を用い、ガラス繊維フィルター上に収集する。フィルターを洗浄し、乾燥し、標準的ブ；方法により計数する。培地単独で培養した細胞を対照として供した。

ＩＬ−４Ｒを担持する細胞に対する毒性は、ＭＬＡ　１４４細胞（ラビン（Ｒａｂｉｎ）ら、ジャーナル・イブ・イミュノロジ−（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）　１２７　：　１８５２．１９８１）または）ｌｔＪＴ　１０２／６ＴＧ細胞を利用することを除き、ＩＬ−２Ｒ担持細胞につき前記したのと同様のア・ソセイによってテストすることができ、ウェル当たりＩ　Ｘ　１０５細胞にて接種し、４０時間インキュベートする。

血！一般に、本発明の分子は静注によって投与する。まｔ二、皮下投与することもできる。本発明の方法で有用な分子の投与量は、基質が細胞毒、溶解性抗体、またはｌ　Ｌ−２Ｒブロッキング分子であるか否かのごとき因子に依存して変動する。

細胞内にて作用する毒性分子の場合、細胞摂取の程度は重要な因子であり、透過性の低い分子は高用量で投与しなければならない。

６０人を超える患者に相１／’ＩＩ臨床プロトコルにてＤＡ８４ｓｇｌＬ　２を摂取させた。最大許容用量（ＭＴＤ）にて治療した患者の約３０９６における一過性無症候肝トランスアミナーセ上昇によってＭＴＤを確立した。抗−腫瘍効果がほぼ４０％の憶者で観察され、応答はＢ−細胞白血病およびリンパ腫、皮膚Ｔ −細胞リンパ腫およびホンキシ病（レメストル（Ｌｅｋｌａｉｓｔｒｅ）ら、ブラッド（Ｂ１．ｏｏｄ）　３６０ａ　アブストラクト１４２９．１９９０　；ウッドワース（Ｗｏｏｄｖｏｒｔｈ）ら、ヒト・レトロウィルス学についての第４回国際会議、１９９１）において見られた。

１０”Ｍ　ＤＡＢ４，６１Ｌ−２の血清濃度が悪性発現ＩＬ−２受容体をもつ患者で達成された。抗−腫瘍効果が高治療抵抗性白血病／リンパ腫患者で観察され、これらの効果はすべての患者にお１ブる可溶性ＩＬ−２Ｒレベルの上昇の存在にも拘わらず起こった。この観察は、可溶性ＴＬ−２Ｒが高親和性インターロイキン−２受容体へのＩＬ−２の結合に干渉しないことを示唆するデータに合致する。

動物およびヒトの研究は、ＤＡＢ４ｓｓ　Ｉ　Ｌ　２が一般的な免疫抑制効果を有しないことを示した（レメストル（ＬｅＭａｊｓｔｒｅ）、前掲；ウッドワース（ｆｏｏｄｗｏｒｔｈ）ら、前掲）。

実験は、高親和性ＩＬ−２受容体を担持する細胞によるＤ　Ａ　Ｂ　４ｓａ　ｌ　ｌ　２の結合および内在化は、暴露３０分以内に起こることを示し、その結果数時間内に蛋白合成の最大阻害が起こる。従って、該分子は血清半減期がむしろ短くとも効果的である。

一般に、ＩＬ−２受容体に標的化された薬物は血管負傷後直ちに（例えば、数分またはそれ以内）投与する。好ましくは、治療は、血小板および白血球の蓄積前に始める。裸出バルーンカテーテル負傷の動物モデルを用いて、血小板の凝集および血栓の形成が負傷直後に起こること、および白血球付着は数時間内に始まることが示された。血管形成術の５日後に死亡した患者の検死により、増殖する平滑筋細胞が拡張領域を侵しつつあることが明らかにされた（オースチン（＾ｕｓｔｊｎ）ら、ツヤ−ナル・イブ・アメリカン・カレッジ・イブ・カルジオロブ− （Ｊ、　Ａｍｅｒ、　０ａ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ。）６°３６９．１９８５）。

一旦開始されたら、内皮細胞の再生は１ないし２週間内に完了する。血管壁の再内皮化は平滑筋細胞の増殖を阻害するようなので（イブ（Ｉｐ）ら、ジャーナル・イブ・アメリカン・カレッン・イブ・カルシオロジー０．＾ｍｅｒ、　Ｃｏ１１．　Ｃａｒｄｉｏｌ、）１５：１６６７．１９９０）、はんの数週間治療を継続すればよい。従って、内皮細胞の再生を可能とするのに適当な期間にわたって、本発明の化合物を周期的に投与するのが望ましい。

ハイブリッド分子は、非修飾分子として、あるいは治療上許容される塩、例えば、生理食塩水と混合した、医薬上許容される塩の形態で投与することができる。

好ましい塩の例は治療上許容される有機塩、例えば、酢酸、乳酸、マＬツイン酸、クエン酸、またはサリチル酸である。例えば、ハイブリッド分子は精製し、２ミクロンフィルターを用いて滅菌濾過し、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（０，１５ＭＮａＣ］　；　００．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，２）に懸濁することができる。

他の具体例内因性ＩＬ−２の利用をブロックするＩＬ−２の誘導体は、ＩＬ−２Ｒ担持細胞の増殖を妨げるのに有用である。１１−２を欠く活性化細胞は増殖せず、ＩＬ− ２によって供される必須の同化刺激の不存在下では、結局は死滅するであろう。

所与のＩＬ−２誘導体のＩＬ−２機能への干渉能はシュ（Ｊｕ）らによって記載されているごときＩＬ−２生物活性アツセイでテストできる（ジャーナル・イブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）２６２　：　５７２３．１９８７）。トキ、／ンが不活化されてしまっているＩＬ−２Ｒ／）キシンノ＼イブリットもまたＩＬ−２受容体をブロックするのに使用できる。非毒性突然変異体ンフテリアトキシン分子は記載されており（ウチダ（Ｕｃｈｉｄａ）ら、ジャーナル・イブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）２４８　：　３８３８．１９７３）、この分子は非毒性ＩＬ −２／ジー２リアトキシンハイブリッドを生産するのに使用できる。かかるハイブリッド分子の例については、ここに参照して一体化させるスブルルガ（Ｓｖｒｌｕｇａ）らの米国特許第５９０１１３号を参照されたい。

ＩＬ−２の結合および／または摂取に干渉するモノクローナル抗体は、ｌ　Ｌ− ２を奪われたＩＬ−２Ｒ担持細胞は増殖しないゆえ、本発明の方法で有用である。ブロックするモノクローナル抗体は、シュＯｕ）ら（前掲）の方法を用いて、ＩＬ−２生物活性へのその干渉能につきテストすることができる。

補体を誘導するモノクローナル抗体はＩＬ−２Ｒ担持細胞を破壌するのに使用できる。補体誘導抗体は一般にＩｇＧ１．１ｇＧ２．１ｇＧ３、およびＴｇＭイソタイプのものである。モノクローナル抗−ＴＬ−２Ｒ抗体は、補体依存性細胞毒性テストを用いて、以下の如く、補体誘導能につきスクリーニングできる。

ヒト・Ｔ−リンパ球およびＥＢＳ形賞転換Ｂ−リンパ球を６ＩＣ，クロム酸ナトリウムで標識し、標的細胞として使用する。これらの細胞はハイブリドーマ培養上澄および補体とともにインキュベートし、次いで、上澄を収集し、ガンマカウンターて計数する。活性化Ｔ−リンパ球に対して毒性を示すが、休止Ｔ−またはＢ−リンパ球に対しては示さない１澄みを選択し、次いで、さらにスクリーニングに付して、（レオナルト（Ｌｅｏｎａｒｄ）ら（ブロノーディングズ・イブ・ナショナル・アカデミ−・イブ・サイエン・／ズ（Ｐｒｏｃ、ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８０　：　６９５７．１９８３）に詳細に記載されている）５０ｋｄ糖蛋白ＩＬ−２受容体を沈殿させる（すなわち、それと特異的に反応性の）抗体を含有する上澄を選択する。

所望の抗−ＩＬ−２受容体抗体を常法を用いて上澄から精製する。

Claims

【特許請求の範囲】

１．医薬上許容される担体と、非リンパ球および非単球起源の腫瘍性細胞に発現されたサイトカイン受容体に特異的に結合できる分子とを混合することよりなり、該サイトカイン受容体はリンパ球および単球起源の細胞に通常発現されるものであり、該分子は該腫瘍性細胞の活性を減少できることを特徴とする非リンパ球および非単球起源の該腫瘍性細胞の増殖によって特徴付けられる肉腫を治療するための医薬品の製法。
２．該腫瘍性細胞が造血幹細胞起源でない請求の範囲第１項記載の方法。
３．該肉腫が骨肉腫である請求の範囲第１項記載の方法。
４．該肉腫が繊維肉腫である請求の範囲第１項記載の方法。
５．該肉腫が平滑筋肉腫である請求の範囲第１項記載の方法。
６．該肉腫が横紋筋肉腫である請求の範囲第１項記載の方法。
７．医薬上許容される担体と、非リンパ球および非単球起源の腫瘍性細胞に発現されたサイトカイン受容体に特異的に結合できる分子とを混合することよりなり、該サイトカイン受容体はリンパ球および単球起源の細胞で通常に発現されるものであり、該分子は該腫瘍性細胞の活性を減少できることを特徴とする該腫瘍性細胞の増殖によって特徴付けられる肺カルシノーマを治療するための医薬品の製法。
８．該サイトカイン受容体がインターロイキン受容体である請求の範囲第１項記載の方法。
９．該インターロイキン受容体がインターロイキン−２受容体である請求の範囲第８項記載の方法。
１０．該インターロイキン−２受容体が高親和性インターロイキン−２受容体である請求の範囲第９項記載の方法。
１１．該インターロイキン受容体かインターロイキン−４受容体である請求の範囲第８項記載の方法。
１２．該インターロイキン受容体がインターロイキン−６受容体である請求の範囲第８項記載の方法。
１３．該分子が該サイトカイン受容体を担持する細胞を殺す請求の範囲第１項記載の方法。
１４．該分子が、一緒に共有結合により連結した第１および第２の部分よりなるハイブリッド分子であり、該第１の部分が細胞活性を減じることができる分子よりなるものであって該第２の部分が該サイトカイン受容体に特異的に結合できる分子よりなる請求の範囲第１項記載の方法。
１５．該第２の部分が該サイトカイン受容体に対して特異的な抗体のすべてまたはその結合部分よりなる請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．該第２の部分が該サイトカイン受容体についてのリガンドのすべてまたはその結合部分よりなる請求の範囲第１４項記載の方法。
１７．該サイトカイン受容体がインターロイキン受容体である請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．該リガンドがインターロイキンである請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．該第１の部分が細胞毒よりなる請求の範囲第１４項記載の方法。
２０．該細胞毒が酵素的に活性であるが一般化された真核細胞受容体結合活性を有しないペプチドトキシンの断片である請求の範囲第１９項記載の方法。
２１．ペプチドトキシンの該断片がジフテリアトキシンのフラグメントＡおよびサイトゾルヘのトランスローケーションを容易とするための充分なジフテリアトキシンのフラグメントＢよりなる請求の範囲第２０項記載の方法。
２２．該分子がＤＡＢ３８９ＩＬ−２である請求の範囲第２１項記載の方法。
２３．該分子がＤＡＢ３８０ＩＬ−４である請求の範囲第２１項記載の方法。
２４．該分子がＤＡＢ３８０ＩＬ−６である請求の範囲第２１項記載の方法。
２５．該分子がＤＡＢ４８６ＩＬ−２である請求の範囲第２１項記載の方法。
２６．該分子がＤＡＢ４８６ＩＬ−４である請求の範囲第２１項記載の方法。
２７．該分子がＤＡＢ４８６ＩＬ−６である請求の範囲第２１項記載の方法。
２８．該抗体が補体活性化抗体である請求の範囲第１５項記載の方法。
２９．該サイトカイン受容体が非リンパ球および非単球起源の非腫瘍性細胞に発現されない請求の範囲第１項記載の方法。