JPH06506348A - キシラナーゼ、これに対応する組み換えｄｎａ配列、キシラナーゼ含有剤、及びこの剤の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キシラナーゼ、これに対応する組み換えＤＮＡ配列、キシラナーゼ含有剤、及び この剤の使用 本発明は、キシラナーゼ、これに対応する組み換えＤＮＡ配列、ベクター、形質 転換宿主、当該キシラナーゼの製造方法、当該キシラナーゼ含有剤、及び当該剤 の使用を含んで成る。

キシラン、すなわち、植物ヘミセルロースの主成分は、β−■、４−キシロシド 結合により結合したＤ−キシロースのポリマーである。キシランは、酸又は酵素 による加水分解により、キシロース又はキシロ−オリゴマーに分解されることが できる。キシランの酵素による加水分解は、酸により形成される副産物（例えば 、フラン）を伴わずに、遊離の糖を生成する。

キシラナーゼについては、現在、５つの主要な利用性が存在する。

それは＝１）アルコール燃料の製造のための農産物廃棄物の酵素分解、２）ヘミ セルロース分画のインビボにおける分解のための、家畜飼料若しくは飼料成分の 酵素的修飾又は家畜飼料への添加、３）ベーキング剤としての使用＝４）セルロ ース産生の溶解バルブの製造、及び、５）木材バルブの生物−漂白である［Ｄｅ ｔｒｏｙｍ　Ｒ，Ｗ、　［ｎ：Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈバルブ及び製紙工業は、漂 白されたバルブの白色度を強化し、その漂白段階において使用された化学物質の 量を減少させ、そしてそのリサイクル紙の工程においてバルブのフリーネス（ｆ ｒｅｅｎｅｓｓ）を増大させるために１その漂白工程においてキシラナーゼ組成 物を使用している［Ｅｒ１ｋｓｓｏｎ、に、Ｅ、Ｌ、、Ｗｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃ ｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２４（１９９０）ニア９−１０１．；　Ｐ ａ１ｃｅ、Ｍ、Ｇ、Ｒ，Ｂｅｒｎｉｅｒ、ａｎｄ　Ｉ、、Ｊｕｒａｓｅｋ、８ｉ ｏ＋ｅｃｈｎｏ１．ａｎｄクラフトバルブの製造、すなわち、上記バルブ及び製 紙工業において広く使用される工程は、そのリグニンの９０〜９８％を取り除く ための、バルブのアルカリ硫酸塩クツキングを含んでいる。リグニンの残りの２ 〜１０％は、紫外線の中で又は酸化により、より暗色になる傾向をもつ暗褐色の 色を、そのバルブに与える。高品質紙のための白色バルブを得るために、この褐 色は、化学物質、例えば、塩素、二酸化塩素、オゾン、酸素又は過酸化水素を使 用した多段階の漂白工程により、除去されている。

現在、この漂白工程から生じる上記化学物質の環境への影響について大きな関心 が在る。酵素は、前記バルブからのリグニン除去において、いかなる有害副産物 を伴わずに援助することができる。木材中のリグニンがキシランに結合されてい るという報告がある［Ｅｒｉランの限定された加水分解により、リグニンのより 大きな放出が、漂白の間に発生する。従って、漂白に先立ってこのバルブを酵素 的に処理することによって、必要とされている漂白化学物質の量は、これにより 減少するであろう［Ｖｉｉｋａｒｉ、Ｌ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ ｇｓ　ｏｆ３ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｕ１ｐ　ａｎｄＰａｐｅｒ　Ｉ ｎｄｕｓｔｒＹ（１９８６）：６７］　。

技術文献に従って、良好な結果が、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｋ、 　Ｊ、Ｗｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　Ｔｅｃｈｎｏ［、４（１９８９）　：１８７−１ ９８．　：　５ｅｎｉｏｒ、　Ｄ、　Ｊ、　、　ｅｔ　≠戟A　、　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１０（＋９８８）　：９０７−９１２ ］、ここでは、ｐＨ６，０より低い木材バルブのｐＨｍ整を必要としている。

トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　）のキシラナーゼ調製物、すなわち 、Ｐｕｌｐｚｙｍｅ”ＨＡ（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｋから商業的に入 手できる）を、ｐＨ５〜７でのクラフトバルブの脱リグニン化のために使用して もよい。５０″Ｃ及び７より高いｐＨでは、この酵素は、僅かな効果しか示さす なわち、Ｐｕｌｐｚｙｍｅ”Ｈａ（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｋから商業 的に入手できる）を、ｐＨ５〜７でのクラフトバルブの脱リグニン化のために使 用してもよい。５０℃及び７より高いｐＨでは、この酵素は、僅かな効果しか示 さない。

フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）のキシラナ ーゼは、公知である（Ｙｏｓｈｉｏｋａ、Ｈａｔ　ａｌ、、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、４３（３）（１９８１）５７９−５８６）。この租Ｉｌ製物にお いては、それらは、６．０の最適ｐＨ及び６０°Ｃの最適温度をもっている。ｐ Ｈ９では、それらは、ｐＨ６での活性の２５舅を示す。この文書中の情報に従え ば、この酵素は、精製されておらず、そしてそれ故に、有意なセルロース活性を 含むであろう、なぜなら、フミフーラ・インソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ） は、良いセルロース生産者として知られているからである（米国特許第４．４３ ５．３０７号を参照できる）。さらに、この酵素は、セルラーゼに関しては、分 子量、等電点又はアミノ酸組成を特徴付けされておらず、そしてクラフトバルブ に関して、ベーキングにおいて、又は家畜飼料に　ついて、テストされていない 。Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、中に記載されているフミコーラ・イン ソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　ＹＨ−８由来の従来技術の キシラナーゼ調製物及び他の先に示されたキシラナーゼ調製物も、その比較的高 いセルロース含有量をある程度の原因として、クラフトバルブの脱リグニン化に おける使用については同様に好適でない。

従って、本発明の目的は、非常に少量の他の酵素活性、特にセルロース活性又は 他のキシラナーゼ活性をもつ調製物として製造されることができるキシラナーゼ 、並びにクラフトバルブの脱リグニン化における使用、ベーキング剤としての及 び家畜飼料への添加剤としての使用に十分に好適なキシラナーゼを提供すること である。

本発明のキシラナーゼは、それが、以下の部分的アミノ酸配列：Ｔｒｐ−Ｓｅｒ −１１ｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−。

５　Ｔｙｒ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｙ ｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇ撃氏|Ｔｙｒ−Ｌｙ ｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌ ｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−１ｎｄ ６　ＧＩｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒ ｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−。

又はこれに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性をもつ部分 的アミノ酸配列をもつこという事実により、特徴付けられる。

驚くべきことに、酵素活性、例えば、非常に少ない濃度におけるセルラーゼに追 加的なキシラナーゼを含むキシラナーゼ調製物の一部として本発明のキシラナー ゼを製造し得ることが発見された。特に、本発明のキシラナーゼが、紙バルブへ の添加のための剤、ベーキング剤及び家畜飼料への添加剤の全てに対して素晴ら しく好適であるフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）　０８Ｍ１８００から遺伝的に製造された数個のキシラナーゼの中から選ば れた特別のキシラナーゼであることは、注目されるべきである。また、本発明の キシラナーゼが、前記従来技術のキシラナーゼのいずれの比活性よりも大きい比 活性を示すことも見つけられた。最も驚くべきことは、本発明のキシラナーゼが 、全てのこれらの、互いに無関係な技術分野に関して、優れた性質を示すことで ある。

本発明のキシラナーゼは、以下に示すように、ｐＨ８にて、バルブからのリグニ ンの除去において有意な効果を示す。このリグニン除去効果は、以下に示すよう に、従来技術（バチルス・ブミラスＣＢ、　ｐｕｎｉ　１ｕｓ））よりも、有意 に高い。

リグニン除去に関するこの高い性能は、驚くべきことに、本発明のキシラナーゼ 単独により得られる。但し、それは、フミコーラ・インソレンス（ｆ（、１ｎｓ ｏｌｅｎｓ）内の数個のキシラナーゼ成分の中からの１つである。このリグニン 除去のための工程は、ただ１つのキシラナーゼ成分（遺伝子工学により、高い収 率で製造できる）が必要であるという理由から、より経済的である。

驚くべきことに、有意なセルロース活性をもたない本発明のキシラナーゼを製造 することが可能であり、このことにより、リグニン除去のためのこのキシラナー ゼの使用の間のセルロース繊維に対するセルロース分鉢攻撃により引き起こされ る収率ロスを回避している。　以下に示す如く、本発明のキシラナーゼは、驚く べきことに、軟材から、バチルス・ブミラス（Ｂ、　ｐｕｍｉ　１ｕｓ）のキシ ラナゼよりも多いリグニンを除去することができる。但し、この２つのキシラナ ーゼは、非常に近いｐＨ曲線をもっている。

キシラナーゼ（ペントサナーゼの名称が、ベーキング工業においては、一般的に 使用されている。）は、幾つかの以下の目的−ドウの発達（ｄｏｕｇｈ　ｄｅｖ ｅｌｏｐｍｅｎｔ）−ドウの弾性及び安定性の改良 一パンの容量の増加 一クラム（ｃｒｕｍｂ）構造の改良 −抗−カビ発生 のために、小麦粉パンのためのベーキング剤として使用される。

幾つかのキシラナーゼは、これにより修飾されたベントサンがドウの弾性、安定 性及び発達を改善するような方法で、ベントサン（アラヒノキシラン）を分解す ると信じられている。驚くべきことに、本発明のキシラナーゼは、他のキシラナ ーゼ及びキシラン修飾酵素を伴わずに製造されることができ、そしてこのことに より、上記ベントサンの制御された修飾を得ることを可能にしている。

ドウのｐＨは、このキシラナーゼをベーキング剤としての使用のために好ましく する６、０〜５．５にある。なぜならば、本発明のキシラナーゼの最適ｐＨは、 ５．５〜７．５であるからである。

本発明のキシラナーゼは、ヘミセルロース分画のインビボにおける分解のための 、家畜飼料の修飾のために又は家畜飼料への添加のために使用されることもでき る。本発明のキシラナーゼは、実際には副活性を全くもたない調製物として使用 されることができる。しかるに、フミコーラ・インソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅ ｎｓ）のキシラナーゼ製品により代表される、従来技術のキシラナーゼは、他の キシラナーゼを含む幾つかの副活性を含むであろう。本発明のキシラナーゼ及び 従来技術のキシラナーゼが、ニワトリの飼育試験における体重増加に関して同様 の効果を生ずることが見つかっている。このことは、本発明のキシラナーゼか、 前記の飼料添加物の使用に関して、活性であり、又は前記フミコーラ・インソレ ンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ）のキシラナーゼの１つであることを示している。

さらに、本発明のキシラナーゼは、バッチからバッチへと比率を変化する多くの 異なった副活性を含む従来技術のキシラナーゼとは反対に、非常に純粋なキシラ ナーゼを含み、これにより再現性のある体重増加を得ることができるという有意 な利点を示している。また、本発明のキシラナーゼ、すなわち、単一成分キシラ ナーゼの使用は、より経済的な飼料添加物の可能性にも門戸を開いている。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラナーゼが、フミコーラ・イ ンソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）、０８Ｍ１８００から得ら れた精製キシラナーゼに対して生じた抗体と免疫反応性があるという事実により 特徴付けされる。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラナーゼが、７．５〜９．５ の、好ましくは８．０〜８．５の等電点をもつという事実により特徴付けられる 。

本発明のキシラナーゼの好ましい態様は、このキシラナーゼが、３３０巳ＸＵ／ 　ｍｇ蛋白を超える、好ましくは４００ＥＸＵ／　ｍｇ蛋白を超える比活性を示 すという事実により特徴付けられる。このＥＸＵキシラナーゼ活性単位は、ＡＦ ２９３．９／Ｉ中に定義されている。このＡＦ出版物及び本明細書中に示す他の ＡＦ出版物は、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、Ｎｏｖｏ　ＡｌＩ４．ＤＫ −２８８０Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、Ｄｅｎｍａｒｋからの要求により入手可能であ る。

本発明は、本発明のキシラナーゼをコードすることを特徴とする組み換えＤＮＡ 配列も含んで成る。

本発明の組み換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、それが、以下の部分的ＤＮＡ配 列を含んで成るという事実により特徴付けられる：ＡＴＧ　ＧＴＣＴＣＧ　ＣＴ ＣＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＴＣＣＴＣＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＣＡＣＧ　ＧＣＴ　ＧＴＧ 　ＡＧＣＧＴＴ　ＣＡＧ　ＴＡＣＡＣＣＭＣＣＴＣＧＡＧ　ＧＧＣＡＧＣＣＧＣ ＴＡＣＣＡＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＴＧＧＮＮＮ　ＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＴＴＣ ＧＴＣＧＧＴ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＴＧＧ　ＭＣＣＣＧ　ＧＧＡＡＣＣＧ ＧＣＣＣＣＡＣＧ　ＡＴＣＭＣＴＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣ’ＩＴＣＡＡＣＣＣＣ ＣＡＧ　ＧＧＣＧＡＧ　ＴＡＣＴＡＴ　ＧＴＣＡＴＣＧＡＧ　ＴＣＧ　ＴＡＣＧ ＧＣＡＣＧ　ＴＡＣＡＡＴ　ＣＣＣＧＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡ ＣＭＧ　ＧＧＣＡＣＡ　ＴＴＣＴＡＴ　ＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＡＴ　ＣＡＧ　Ｔ ＡＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴ　ＧＴＧ　ＡＧＣＡＣＣＣＧＴ　ＮＮＮ　ＡＡＣＣＡＧ 　ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＧ　ＧＣＡＣＣＣＧＧＡ　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＧＣＴ　 ＡＧＴ　ＡＣＴ本発明の組み換えＤＮＡ配列の好ましい態様は、それが、以下の ａ）ｐＨＤ４５０中のフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏ ｌｅｎｓ）のキシラナーゼＤＮＡ挿入物 ｂ）ａ）のＤＮＡ挿入物に含まれる成熟キシラナーゼのためのコート領域にハイ ブリダイズし、そして、キシラナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝 子を含んで成り、そして場合により、プロモーター、シグナル若しくはリーダー ・ペプチドのためのコート領域、及び／又は転写ターミネータ−を含んで成るＤ ＮＡ配列 Ｃ）比較的ストリンジェントな条件（１，ＯＸ　ＳＳＣ，０，１％ＳＯＳ、　６ ５°Ｃ）　（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎ１ａｎｕａｌ（Ｃ３Ｈ）を参 照した）の下で、請求項６に示す配列にハイブリダイズするのに十分な相同性を もつＤＮＡ配列 ｄ）　ａ）　、ｂ）若しくはＣ）に定義したＤＮＡ配列の誘導体、又は、ｅ）成 熟キシラナーゼ又はそれらのシグナル・ペプチド若しくはリーダー・ペプチドを コードし、モしてａ）、ｂ）若しくはＣ）のＤＮＡ配列に関してその遺伝子コー ドの意味の範囲内で縮重されているＤＮＡ配列 から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成るという事実により特徴付けられる。

本発明は、本発明の上記組み換えＤＮＡ配列を含んで成るという事実により特徴 付けられる、ベクターも含んで成る。

本発明のベクターの好ましい態様は、上記プロモーターが、アスペルギルス・オ リザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｘａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼのプロ モーターであり、そして／又は上記キシラナーゼ遺伝子が、ＥＣ３−２から単離 されており、そして／又は上記ターミネータ−が、アスペルギルス・オリザエ（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）のＡ＆ＩＧターミネータ−であり、好 ましくはｐＨＤ４５０であるという事実により特徴付けられる。

本発明は、本発明のベクターを含むという事実により特徴付けられる、形質転換 宿主を含んで成る。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒ鉦旦匹） 株であるという事実により特徴付けられる。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）　、アスペルギルス・ニガー（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｘ肚）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）の種に属する株であるという事実により特徴付けされ る。

本発明の形質転換宿主の好ましい態様は、その非形質転換条件においては、キシ ラナーゼを生産しない、又は有意でない量のキシラナーゼのみを生産する微生物 、好ましくはバチルス・エスピー但肛１１１ｕｓ　ｓｐ、）、大腸菌（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）又はす・ノカロミセス・セレビシェ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖ　ｉ　ｓ　１ａ ｅ）であるという事実により特徴付けられる。

本発明は、その方法が本発明の形質転換宿主を使用するという事実により特徴付 けられる、キシラナーゼの製造方法も含んで成る。

本発明は、本発明の方法により製造されるキシラナーゼも含んで成る。

本発明は、好ましくは非−発埃性粒状物、安定化液体又は保護された酵素の形感 での本発明のキシラナーゼであって、このことにより、キシラナーゼが全酵素蛋 白の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％を占めるもの、を含む剤を 含んで成る。

本発明の剤の好ましい態様は、キシラナーゼ活性とセルラーゼ活性との比が、キ シラナーゼ活性（ＥＸＵ／ｇ）とセルラーゼ活性（ＥＣＵ／ｇ）との比として表 されるものとして、１０を超える、好ましくは３０超え、最も好ましくは１００ を超える値をもつという事実により特徴付けられる。このセルラーゼ活性単位Ｅ ＣＵは、ＡＦ３０２−１に記載されて（する。

本発明の上記剤の好ましい態様は、少なくともｌ０ＥＸＵ／ｍｇ酵素蛋白の、好 ましくは少な（とも１００ＥＸＵ１０＋ｇ酵素蛋白の、より好ましく（よ少なく とも３００ＥＸＵ／ｍｇ酵素蛋白の、キシラナーゼ活性を含むことを特徴とする 。

また、本発明は、本発明の上記剤の使用であって、この剤がキシラン分解にため に使用されることを特徴とする使用も含んで成る。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、漂白の前又は一部として、好 ましくはｐＨ値７超えにて、化学ベルブ又はリサイクル紙バルブに関することを 特徴とする。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、小麦粉を含むパンの製造に関 することを特徴とする。

本発明の上記使用の好ましい態様は、この使用が、家畜飼料に関することを特徴 とする。

本発明のキシラナーゼは、以下の方法で製造することができる。

キシラナーゼを、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅ ｎｓ５ＤＳ八ｌ　１８００を培養することにより、米国特許第４．４３５．３０ ７号の例６の最初から縦欄１１行２９までに記載されたように、製造した。凍結 乾燥粉末を、水で希釈し、そして１０％の乾燥物溶液中ｌＯ％まで乾燥し、そし てｐＨをｌＯ％ＨＣＩにより２．３まで低下させた。この混合液を２２°Ｃで５ ０分間放置し、そして次に、ｐＨをＮａ０）１により８．０まで上昇させる。次 に、ｐＨ５，０での液体１ｋｇ当たり２５０ｇのＮａｇ　ＳＯ４による塩沈殿を 実施した。この塩ケーキを、再溶解し、そして次に遠心分離し、そして限外濾過 により洗浄した。最後にこの調製物を凍結した。

１２％の乾燥物溶液中では、このキシラナーゼ調製物は、以下の酵素活性：４４ ４ＣＳＵ／ｍｌ及び１４４ＥＸＵ／ｍｌを示した。ＣＳＵは、セルラーゼ仮性単 位である。ＡＰ２６７を参照のこと。

この調製物を更に、ＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａ）を用いたバッチのイオン交換により精製し、ＡＭＩＣＯＮ限外濾過により濃 縮し、５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００（５−２００（Ｐｈａｒ上でゲル濾過し 、そして高充填Ｓ−Ｓｅｐｈ５−５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒを用いてカチオ ン交換をした。

このキシラナーゼがいかなるセルラーゼ副活性をも示さないことが見出された。

従って、この精製キシラナーゼ製品は、０．　Ｉｃ５Ｕ／ｍｇ蛋白未満のセルラ ーゼ活性を、そして３５０ＥＸＵ／ｍｇ蛋白を超えるキシラナーゼ活性を示した 。この精製キシラナーゼ製品は、分子量２２ｋＤをもっただ１つの５ＤＳ−ＰＡ ＧＥのバンドを示す。二のｐ（を、等電点電気泳動法により８．５に決定した。

この精製キシラナーゼ製品と反応する抗体を以下の方法で製造した。上記精製キ シラナーゼに対する抗血清を、Ｎ、Ａｘｅｌｓｅｎ他により記載された手順：Ａ 　ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　ＱｕａｎＨｔａｔｊｖｅ　［ｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏ ｐｈｏｒｅｓｉｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎｓ、１９７３．Ｃｈａｐｔｅｒ　２３に従ってウサギを免疫化するこ とにより作り出した。精製免疫グロブリンを、この抗血清から、塩沈殿（（ＮＨ ４）　、　ＳＯ，）　、続く透析及びＤＥＡε−５ｅｐａｄｅｘ上イオン交換ク ロマトグラフイーにより得た。この精製キシラナーゼの免疫化学的特徴は、ロケ ット免疫電気泳動（Ｎ、Ａｘｅｌｓｅｎ　ｅｔａｌ、、ｃｈａｐｔｅｒ　２）に より導かれた。先に示した抗体を用いては、前記精製キシラナーゼは、ロケット 免疫電気泳動におけるその陰極に対して移動する単一の了−チを示した。

このキシラナーゼを化学的に特徴付けるために、全アミノ酸組成を、ＩＪｏｏｒ ｅ　ａｎｄ　５ｔｅｉｎ（＋９６３）、ＡＩｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、６ ．８１９−８３１に従う酸加水分解により、そしてＨｅ１ｎｒｉｋｓｏｎ　ａｎ ｄ　ＩＪｅｒｅｄｉｔｈ（１９８４）、Ａｎａｌ、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　１３６．６５−７４（誘導体形成）及びＥｄｅｌｈｏｃｈ（１９６ ７）、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６、　＋９４８−１９５４（１−リブトファ ン決定）に従うこの加水分解混合物中のアミノ酸の定性的及び定量的測定により 、決定した。最後に示した参考文献は、トリプトファン含有量の分光光度測定に ついて記している。以下のアミノ酸組成を見出した。

組成　標準偏差　分子量　アミノ酸　アミノ酸（ｍｏｌｅ％）　に従う　残基の 　残基の概略組成　最大数　最小数 Ａｓｘ（Ｂ）　１３，１６　０．７５　２５　２７　２４Ｇｌｘ（Ｚ）　１２， ９４　０．３７　２５　２５　２４Ｓｅｒ（Ｓ）、　６．０７　０．１６　、　 １２　１２　１１Ｇｌｙ（Ｇ）　１４，０１　０．４８　２７　２８　２５Ｈｉ ｓ（Ｈ）　２，４９　０．１０　５　５　５Ａｒｇ　（日）　４，９１　０．３ ３　９　１０　９Ｔｈｒ（ｒ７，１９　０．０９　１４　１４　１４Ａｌａ（Ａ ）　２，９４　０．２３　６　６　５Ｐｒｏ（Ｐ）　４，１６　０．１３　８　 ８　８Ｔｙｒ（Ｙ）　９，７７　０．２１　１９　１９　１８Ｖａｌ（Ｖ）　６ ，１０　０．３８　１２　１２　１１Ｍｅｔ（Ｍ）　０．９３　０．０７　２　 ２　２Ｃｙｓ（Ｃ）　０．００　０．００　０　０　０１１ｅ（１）　２．６８ 　０．１２　５　５　５Ｌｅｕ（Ｌ）　２，１５　０．０５　４　４　４Ｐｈｅ （Ｆ）　３．５０　０．０７　７　７　７Ｌｙｓ（）Ｑ　２．０９　０．０５　 ４　４　４Ｔｒｐ（Ｗ）　４，８９　０．ｊＯ９１０９Ｔｏｔａｌ　９９．９８ 　１９３　１９８　１８６前記精製キシラナーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、（ 配列番号６） として、見出した。

また、キモトリプシンによる酵素分解の後、３つのペプチドを、配列決定し、こ れにより、これらの１つは、他のペプチドの配列決定の間、副配列（ＳＳ）とし て決定しているＣｈｙｍｏ−２２：　Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−（ｓｓ）　（配列番号２）Ｃｈｙｍｏ−２ ４：　５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ ｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−（配列番号R） ＣＮＢｒによる化学的分解これに続くペブンンによる酵素分解の後、２つのペプ チドを、配列決定する。

ＣＮＢｒ／Ｐｅｐ−１６：　Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ −Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈ秩|Ａｒｇ−Ｔｎｒ −Ｐｈｅ− Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−８ｅｒ−ｌｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−（配列番 号４）本発明のキシラナーゼか、従来技術のキシラナーゼ、例えば、ス本発明を 、以下の例により、説明する。

例１は、キシラナーゼ製造遺伝子の選択並びに遺伝子修飾宿主生物によるキシラ ナーゼの製造について説明している。例２は、キシラナーゼのパイロット・プラ ントにおける製造及びキシラナーゼの精製を説明している。例３は、紙パルプ製 造の間の漂白増強剤としてのキシラナーゼの使用を説明し、そして例４は、ベー キング剤としてのキシラナーゼの使用を説明する。

例１ 培地 ＹＰＤ：　ｌＯｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトン、８．０で８１０ｍ１とし、 オートクレーブにかけ、９０ｍ１の２０％グルコース（滅菌濾過した）を添加し たもの。

１０ＸＢａｓａｌ塩：６６．８ｇの酵母ナイトロンエンベース、ｌｏｏｇのコハ ク酸、６０ｇのＮａＯＨに、ＨｚＯを加えｌｏｏｏｍｌにし、滅菌濾過したもの 。

５Ｃ−ＵＲＡ：　９０ｍ１のｆｏｘ　Ｂａ５ａｌ塩、２２．５ｍｌの２０％カザ ミノ酸、９ｍｌの１％トリブｊ・ファンに、ＨｚＯを加え８０６ｍ１にし、オー トクレーブにかけ、３．６ｍｌの５％トレオニン及び９０ｍ１の２０％グルコー スを添加したもの。

５Ｃ−）１　寒天・アミノ酸を含まない７．５ｇ／Ｉの酵母ナイトロジエンベー ス、１１．３ｇ／ｌのコハク酸、６．８ｇ／ＩのＮａＯＨ、ビタミンを含まない ５゜６ｇ／　ｌのカサミノ酸、Ｏ，１ｇ／ｌのトリプトファン及び２０ｇ／ｌの 寒天（ＢａｃＴｏ）、１２１°Ｃて２０分間オートクレーブにかげ、オートクレ ーブ後、４５０ｍ１の寒天当たり、５５ｍ１の２２％グルコース溶液及び１．８ ｍｌの５％トレオニン溶液を添加したもの。

ＹＮＢ−１寒天・３．３ｇ／ＩのＫＨ，ＰＯ，，１６，７ｇ／ｌの寒天、ＰＨを ７に調整し、１２１℃で２０分間オートクレーブにかけ、オートクレーブ後、４ ５０ｍ１の寒天当たり、アミノ酸を含まない２５ｍ　ｌの１３．６％の酵母ナイ トロンエンベース、２５ｍ１の４０％０％グルツース、１．５ｍｌの１％Ｌ−ロ イシン溶液及び１．５ｍｌの１％ヒスチジン溶液を添加したもの。

ＹＮＢ−１ブロス：　ＹＮＢ−１寒天と同じ組成であるが上記の寒天を含まない もの。

オート・スベルト・キシラン（ｏａｔ　５ｐｅｌｔ　ｘｙｌａｎ）重層ゲル：１ ％アガロース、トリス−マレイン酸緩衝液、　ＰＨ７中の１％オート・スベルト ・キシラン（ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、重層を寒天プ レート上に注ぐ前に、このゲルを沸騰させ、そして次に５５℃まで冷却する。

ＦＧ−４−寒天：　３５ｇ／ｌの寒天、３０ｇ／ｌの大豆粉、１５ｇ／ｌのマル トデキストリン（ＧＩｕｃｉｄｅｘ６）　、５ｇ／ＩのＢａｃｔｏペプトン、ｐ Ｈ７，１２ビＣで４０分間オートクレーブにかけたもの。

ＰＣ−４培地：　３０ｇ／ｌの大豆粉、１５ｇ／ｌのマルトデキストリン（Ｇｌ ｕｃｉｄｅｘ６）　、５ｇ／ＩのＢａｃｔｏペプトン、１２１°Ｃで４０分間オ ートクレーブにかけたもの。

酵母発現プラスミドの構築 商業的に入手可能なプラスミドｐＹＥＳ　ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、５ ｐｅｌにより切断し、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡボロメラーゼ＋ｄＮＴＰによりフィ ルインし、そしてＣａ１ｌにより切断した。このＤＮＡをアガロース・ゲル上で サイズ分画し、そして約２０００塩基対のフラグメントを電気溶出により精製し た。前記と同しプラスミドを、Ｃａ１ｌ／Ｐｖｕｌｌにより切断し、そして約３ ４００塩基対のフラグメントを電気溶出により精製した。この２つのフラグメン トを、酵母ＴＰＩプロモーターを含む平滑末端のｓｐｈ　［／εｃｏＲＩフラグ メントに連結した。このフラグメントを、その中でする　内部のｓｐ旧部位がこ の部位のコアを構成している４塩基対の欠失により除去されているプラスミドか ら単離した。さらに、このプロモーターの余分の配列を、Ｂａｌ［エンドヌクレ アーゼ処理、次の５ｐｈｌリンカ−の添加により除去した。最後に、ＥｃｏＲ［ リンカ−を−１゜位に追加した。これらの変更の後、このプロモーターは、ｓｐ ｈ＋−εＣＯＲ［フラグメントに含まれている。元のプロモーターの比較しての その効率は、上記の変更によっては影響されないようである。得られたプラスミ ドｐＹＨＤ１７を図１に示す。

供与体生物 セルロースが豊富な発酵培地内で、十分な通気を確保するためのＳＩｉ　１８０ ０゜ ｍＲＮＡの単離 全ＲＮＡを、約７ｇの菌糸体から単離した。この菌糸体を液体窒素中で凍結し、 そしてＩｇの石英砂を用いて、すり鉢内で粉状に擦り潰した。このＲＮＡをトリ シアン酸グアニジウムにより抽出し、そしてＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、 　＋９８９．上掲書中に本質的に記載されたように、ＣｓＣ１を通して遠心分離 した。ポリＡ　ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース上のりａマドグラフィーにより全 ＲＮＡから単離した。

ＣＤＮＡの合成 製造者の取扱説明書に従って［ｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのｃＤＮＡ合成キットに よりｃＤＮＡ合成を行った。このＤＮＡをＢｓｔｘｌ　リンカ−（Ｉｎｖｉｔｒ ｏｇｅｎ）の添加により発現ベクターに適合させ、そしてアガロース・ゲル上で サイズ分画した。５〜６００塩基対より大きいＤＮＡのみを、本ライブラリーの 構築において使用した。この適合されたｃＤＮＡを、ＢＳｔＸ［により切断され た適切な酵母発現ベクターに連結した。テスト連結（ライブラリーのサイズを決 定するための）の後に、このライブラリーを、プレート当たり約５０００の形質 転換細胞に達する５０個の寒天プレート上に置いた。約５０００の別個のクロー ンを含むそれぞれのプレートに３ｍｌの培地を添加した。このバクテリアを剥ぎ 取り、１ｍｌのグリセロールを添加し、そして５０ブールとして一８０°Ｃで保 存した。

残りの２ｍｌを、ＤＮＡ単離のために使用した。ＤＮＡ量が酵母形質転換細胞の 所望数を与えるのに十分である場合（以下を見よ）は、大量のＤＮＡを、−夜増 殖させた一８０°Ｃの保存バクテリアの５０μｌにより接種された５００ｍ１の 培地（ＴＢ）から調製した。ＤＮＡをこのライブラリーからの２０の別個のクロ ーンから単離し、そしてｃＤＮＡ挿入物について分析に供した。この挿入頻度は 、〉９０％であることが分かり、そしてその平均挿入物サイズは約１４００塩基 対であった。

酵母の形質転換 使用した酵母株は、ｙＮＧ２３＋、　（ＭＡＴ　ａｌｐｈａ、　１ｅｕ２．　ｕ ｒａ３−５２．　ｈｉｓ４−５３９゜ｐｅｐ４−ｄｅｌｔａ　１．ｃｉｒ＋）で あった。１つのコロニーを、１０ｍ１のＹＰＤ中で３０’Ｃで一夜増殖させた。

この培養液の１Ｏ１３０、及び６０μｍを、１００ｍ１のＹＰＤを含む３本の娠 とうフラスコに添加し、そして３０℃で一夜撮とうしなからインキュベートした 。０．３〜０．４に最も近いＯＤｓ。。

をもつ培養液を選択した。この細胞を、８ｅｃｋｍａｎｎ遠心分離機内の５０ｍ １チユーブ中に収穫しく速度６．１０分間）、この細胞を、２　ｘ　５ｍｌの８ ２０に再懸濁し、前記のように遠心分離し、０．１　Ａｌ　１ｉＡｃ、　１Ｏｎ ｔｌのＴｒｉｓ−ＣＩ　、　ｌｄのＥＤＴＡ、ｐＨ７，５を含む５ｍｌのバッフ ァーに再懸濁し、そして再び遠心分離した。この細胞を、５００μｍの上記バッ ファーに再懸濁し、３０°Ｃで６０分間インキュベートした。２５０μｇの担体 ＤＮＡ　（滅菌サケ−***ＤＮＡ　ｌ０ｍｇ／ｍｌ　、以下参照）を添加し、そ して１００μｍの部分を調製した。形質転換されるべきＤＮＡ　（約５μｇ）を 、この１００μｌの部分に添加し、緩やかに混合し、そして３ｏ″Ｃで３０分間 インキュベートした。７００μｌの４０％ＰＥＧ　４０００．０．１　Ｍ　１ｉ Ａｃ、　１０ｍ＆ＩのＴｒｉｓ−ＣＩ　、１ｍ＆ＩのＥＤＴＡ、　ｐ）ｌ　７． ５を添加し、そして３０’Ｃで６０分間インキュベーションを続けた。この形質 転換混合物を、４２℃で５分間、熱ショックに供し、マイクロ遠心分離機内で短 時間回転させ、１００〜２００μｌのＨ，Ｏに再懸濁し、そしてウラシルを含ま ないＳＣ１００ｍｇのサケ−***ＤＮＡを計量し、そして−夜で、１０ｍ１の１ ｏｎｔｌのＴｒｉｓ−ＣＩ　５１ｍ１ＪのＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５（ＴＥ）に溶 解した。次ニコの溶液を、もはや粘度がなくなるまで、氷水中のプラスチック容 器内で音波処理した。次にこの溶液を、フェノール抽出し、モしてＥｔＯＨ沈殿 し、そしてそのペレットを洗浄し、そして５ｍｌのＴＨに再懸濁した。このＯＤ ！＠。を測定し、そしてそしてこの懸濁液を１０ｍｇ／ｍｌ　までＴＢにより希 釈した。

１０からのＤＮＡを、酵母に形質転換し、そして２０−２５．０００コロニーを 含むプレートをそれぞれのプールから得た。このコロニーを剥ぎ取りそしてグリ セロール中に一８０℃で保存した。

このライブラリーからの酵母細胞を、全体として約４００．０００コロニーにな るまでＹＮ８寒天上に塗布した。プレート当たりのコロニーの数は、５０から５ ００まで変化した。４又は５日間の増殖の後、この寒天プレートを５Ｃ−Ｈ寒天 プレートのセット上にレプリカプレートした。これらのプレートを次に、キシラ ナーゼの検出のためにこの寒天プレートをオート・スベルト・キシラン重層ゲル により重層する前に、３０°Ｃで２〜４日間、インキュベートした。４０℃で一 夜インキユベートした後、酵素反応を、Ｃｏｎｇｏ　ｒｅｄに着色した。１０〜 １５ｍ１のＣｏｎｇｏ　ｒｅｄの０．１％溶液をこの重層の上に注ぎ、そして１ ０〜２０分後に除去した。次にこのプレートを、このプレート上に１０〜１５ｍ １の２ＡＩ　Ｎａｃｌを注ぐことによりｌ又は２回洗浄した。このＮａＣＩ溶液 を、１５〜２５分後に除去した。キシラナーゼ−陽性コロニーは、赤い背景上の 透明又は薄赤の明るい領域として、この重層プレート上に同定された。

酵素−陽性コロニーからの細胞を、寒天上の単一コロニー単離のために虚布し、 そして酵素−生産単一コロニーを、同定されたキシラナーゼ−生産コロニーのそ れぞれのために選択した。

キシラナーゼ陽性コロニーの特徴付け １４７個の前記のキシラナーゼ−生産コロニーのそれぞれを単離した。これらの コロニーの幾つかを、５０ｍ１のガラス試験管内の２０ｍ　ｌのＹＮＢ−１ブロ ス中に接種した。この試験管を３０°Ｃで２時間振とうした。

この細胞を３００Ｏｒｐｍで１０分間の遠心分離により収穫した。

この細胞を１ｍｌの０．９Ｍソルビトール、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｐｉ（７ ，５ｉ：再懸濁した。このペレットを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、そ して最大速度で３０秒間回転した。この細胞を、０．４ｍｌの０．９Ｍソルビト ール、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ　、　１４ｍ１Ｊ　β−メルカプトエタノールに再懸 濁した。１００μｍの２ｍｇ／ｍｌのＺｙｍｏｌａｓｅを添加し、そしてこの懸 濁液を、３７℃で３０分間インキュベートし、そして３０秒間回転した。このペ レット（セファロプラスト）を、０．４ｍｌのＴＥに再懸濁した。９０μｌの（ １，５ｍｌの０．５＆ｌ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ　、０．６０１１の２＋１１　 Ｔｒｉｓ−Ｃ１ｐＨ８，０，０，６ｍｌの１０％５ＯＳ）を添加し、そしてこの 懸濁液を６５°Ｃで３０分間インキュベートした。

８０μｌの５１１　ＫＯＡｃを添加し、そしてこの懸濁液を氷上で少なくとも６ ０分間インキュベートし、そして最大速度で１５分間回転した。この上澄み液を ＥｔＯ）Ｉ（室温）を満たした新しい試験管に移し、次に十分であるが緩やかに 混合し、そして３０秒間回転した。このペレットを冷７０％ＥｔＯＨで洗浄し、 ３０秒間回転し、そして室温で乾燥した。このペレットを５０μｍのＴＥに再懸 濁し、そして１５分間回転した。この上澄み液を新しいチューブに移した。２． ５μｌのｌｏｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅを添加し、次に３７°Ｃて３０分間インキ ュベートし、そして５００μｌのイソプロパツールを緩やかに混合しながら添加 した。この混合液を３０秒間回転し、そして上澄み液を除去した。このペレット を冷９６％ＥｔＯＨで濯ぎ、そして室温で乾燥した。このＤＮＡを約１００μｌ ／ｍｌの最終濃度になるまで、５０μｌの水に溶解した。

上記のＤＮＡを、漂準的な手順により、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）に形質転換した 。２つの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）コロニーを、上記の形質転換のそれぞれから単 離し、そしてＤＮＡ挿入物を切除する制限酵素Ｈ４ｎｄ［Ｉ［及びＸｂａ！を用 いて分析した。これらのコロニーの１つからのＤＮＡを、酵母に形質転換し、そ して酵素活性について再スクリーニングしｔ二。

上記陽性コロニーの幾つかのＤＮＡ配列を部分的に決定した。このＤＮＡ配列に 基づき、１５個のクローンを、同一ファミリーとして分類した。このキシラナー ゼ・ファミリーの配列は、本発明の精製キシラナーゼのアミノ酸配列と、最大の 相同性を示した。部分的な配列を請求項５に表す。

ｐＹＥＳ２中にキシラナーゼＨｉｎｄｌｔＩ／Ｘｂａ［ｃＤＮＡフラグメントを 含むした。このキシラナーゼｃＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄｌＩ［／Ｘｂａ ｌによる解裂により、上記クローンの１つから単離した。このＨｌｏｄｌｌ［／ Ｘｂａ［フラグメントを、電気溶出されたアガロースゲル電気泳動（こより精製 し、そして連結反応の準備をした。このＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄ１１１／ Ｘｂａｌ処理されたｐＨＤ４１４（以下参照）に連結し、そしてｃＤＮＡ力くア スペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）由来のＴＡ ＫＡプロモーター及びアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ ｇｅｒ）由来のＡＩＩＧターミネータ−の転写制御下にあるところのｐＨ０４５ ０を作り出した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ’）中で上記ＤＮＡを増幅した後、このプラスミドを、以 下に記載するように、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　。

ｒｖｚａｅ）に形質転換した。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）発現ベクターの構築ベクターｐＨＤ ４１４（図２）は、プラスミドｐ７７５（欧州特許第２３８０２３号）の誘導体 である。このプラスミドに対して、ｐＨ０４１４は、プロモーターとターミネー タ−との間にユニーク制限部位のひも（ｓｔｒｉｎｇ）をもっている。このプラ スミドを、ターミネータ−の３゛末端で、約２００塩基対の長いフラグメント（ 不所望のＲＥ部位を含む）を除去することにより、そして次に、プロモーターの ５゛末端で、約２５０塩基対の長いフラグメント（これも不所望の部位を含む） を除去することにより構築した。この２００塩基対の領域を、Ｎａｒｄ（上記ｐ ＵＣベクター内に位置する）及びＸｂａ　［（ターミネータ−のちょうと３゛） による解裂、これに続く、生成末端のｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮ ＴＰによるフィルイン、ゲル上でこのベクター・フラグメントの精製、並びにこ のベクター・フラグメントの再連結により除去した。このプラスミドは、ｐＨＤ ４１３と呼ばれた。ｐＨＤ４１３を、５ｔｕｌ（このプロモーターの５゛末端に 位置する）及びＰｖｕ［［（上記ｐＵＣベクター内の）により切断し、ゲル上で 分画し、そして再連結し、ｐＨＤ４１４を得た。図２は、プラスミドｐＨＤ４１ ４のマツプであり、図中、“ＡλＩＧターミネータ−“は、アスペルギルス・ニ ガー（Ａ、　ｎｉｇｅｒ　）のグルコアミラーゼ・ターミネータ−を示し、そし て“ＴＡＫＡプロモーター”は、アスペモーターを示している。

アスペルギルス・オリザ−？−（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）の形 質転摩１００ｍ１　のＹＰＤ（Ｓｈｅｒｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｕｅｊｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８１）を、アスペルギルス・オリザエ（Ａ、　 ｏｒｙｚａｅ）の胞子により接種し、又は、そして３７°Ｃで約２日間振とうし ながらインキュベートする。この培地をミラクロス軸１ｒａｃｌ。

ｔｈ）を通しての濾過により収穫し、そして２００ｍ１の０．６　Ｍ　Ｌ！ｇｓ Ｏａで洗浄する。この菌糸体を１５ｍ１の１．２＆Ｉ　＆ＩｇＳＯ−、ｌＯｍ＆ Ｉ　ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ・５，８に懸濁する。この懸濁液を氷上で冷却し、そ して１２０ｍｇのＮｏｖａｚｙｍ商標登録２３４を含む１ｍｌのバッファーを添 加する。５分後、１ｍ■の１２ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ　ｔｙｐｅ　Ｈ ２Ｓ）を添加し、そして多量のプロトプラストが顕微鏡下で観察されたサンプル 内に見られるまで続けられる緩やかな攪拌を伴い、３７°Ｃで１．５〜２．５時 間、インキュベートする。

この懸濁液をミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）を通して濾過し、濾液を滅菌チ ューブに移し、そして５ｍｌの０．６Ｍソルビトール、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、　ＰＨ・７．０により重層する。遠心分離を１００ｇで１５分間行い、 そしてプロトプラストを前記Ｍｇ５Ｏａクツシヨンの頂上から回収する。２容の ５ＴＣ（１，２Ｖソルビトール、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ＰＨ□７． ５．１０ｍ１Ｊ　ＣａＣ１２）を、上記プロトプラスト懸濁液に添加し、そして この混合液を１０００ｇで５分間、遠心分離する。このプロトプラストのペレッ トを３ｍｌのＳＴＣに再懸濁し、そして再ペレット化する。これを繰り返す。

最後に、このプロトプラストを０．２〜１ｍｌのＳＴＣに再懸濁する。

１００μｌのプロトプラスト懸濁液を、１０μｌのＳＴＣ中で、適切なりＮＡの ５〜２５μｇと共に混合する。プロトプラストを、ｐ３ＳＲ２（アスペルギルス ・ニジュランス（Ａ、　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）のａｍｄｓ遺伝子担持プラスミド） と共に混合する。この混合液を、室温で２５分間放置する。０．２ｍｌの６０％ ＰＥＧ　４０００（ＢＤＨ２９５７６）　、１０ｍ＆Ｉ　ＣａＣ１を及びＩＯｍ ＆Ｉ　ＴｒｉＳ−ＭＣＩ、ＰＨ＝７．５を添加し、そして注意して混合しく２回 ）、そして最後に、０゜８５ｍ１の上記と同一の溶液を添加し、そして注意して 混合する。この混合液を室温で２５分間放置し、２５００ｇで１５分間回転し、 そしてこのペレットを２ｍｌの１２Ｎ＋ソルビトールに再懸濁する。もう１回沈 殿させた後、このプロトプラストを適切なプレート上に塗布する。プロトプラス トを、１．０Ｍシュクロース、ｐＨ＝７．０、窒素源としてのｌｏｍＡＩアセト アミド及び背景の増殖を抑制するための２０ｍＭ　ＣｓＣ１を含む最小プレート （Ｃｏｖｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１１３（１９６６） ５１−５６）上に塗布する。３７°Ｃて４〜７日間のインキュベーションの後、 胞子を拾い上げ、そして単一クローンについて塗布する。この手順を繰り返し、 そして第２回目の単離後の単一クローンの胞子を、定義された形質転換細胞とし て保存する。

アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるキシラナーゼの発現１１個 の形質転換細胞を得て、そして接種し、そしてＹＰＧ−寒天上で維持した。８つ の選ばれた形質転換細胞のそれぞれを、ＹＰＧ−寒天斜面から、１５０ｍ１のＦ Ｇ−４培地を満たす５００ｍ１振どうフラスコ上に接種した。良好な通気を確保 するために十分な攪拌を伴う４日間の発酵の後、この培養液を２０００ｇで１０ 分間遠心分離し、この上澄み液を分析した。最も良いものは、７２ＥＸＵ／ｍｌ を産生じた。非形質転換宿主株からの背景は全くない。この株を、Ａｘｙ４０／ ８と命名する。

例２ 上記株Ａｘｙ４０／８を、以下の方法で、パイロット・プラント規模において発 酵した。

以下の組成をもつ寒天基質をＦｅｒｎｂａｃｈフラスコ内に調製した・シュクロ ース　３０　ｇ／Ｉ ＫＨｚＰＯ−１ｇ／ｌ ＮａＮ０．　３　ｇ／ｌ ＆１ｇＳＯ４，７Ｈｚ　ＯＯ，５ｇ／ｌＦｅＳＯ４，７Ｈｔ　０　０．Ｏ１ｇ／ ｌＫＣｌ　０．５　ｇ／ｌ 寒天　２５　ｇ／ｌ ｐＨを、６４〜６．５の間に調整し、＋２１”ｃで２０分間、オートクレーブに かけた。

上記Ｆｅｒｎｂａｅｈフラスコを、胞子懸濁液により接種し、そして３０℃で５ 日間、培養した。

以下の組成をもつ基質を５００リツターの種母発酵槽内に調製した 酵母エキス、５０％　６　ｋｇ ポテト澱粉　９　ｋｇ ＣａＣＯｚ　０．１５ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　＋６１　１５０　ｍｌＴｅｒｍａｍｙｌ商標登録６０（Ｌ） 　”　）９　ｇ”　）　Ｔｅｒｍａｍｙｌは、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／ Ｓから入手できるα−アミラーセである。

水道水を、約２２５　リッターの全容量まで添加した。ｐＨをＨ３ＰＯ。

により約６．５に調整した。

上記基質を１２１″Ｃて１５時間上記種母発酵槽内て滅菌する前に、温度を、６ ０から９０°Ｃまて３０分間で上昇させ、９０℃で３０分間保った。

接種前の最終容量は、約３００リツターであった。

前記ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコの胞子懸濁液を、上記の種母発酵槽に移した。種 母発酵の条件は 発酵槽の形式　約２３の高さ／直径比をもつ、従来の通気及び攪拌発酵槽 撹拌　２５０ｒｐｎ＋ 通気　分当たり３００　Ｎｌ空気 温度　３４゛Ｃ 時間　約２４時間 てあ−）ｔ：。

接種後約３５時間目に、１５０　’Ｊ　ツタ−を上記種母発酵槽から主発酵槽に 移した。

以下の組成をもつ基質を２５００リツターの主発酵相内に調製しγこ：へＩｇｓ ｏ　４，７Ｈ、０２，６ｋｇ ＫＨ，Ｐｏ、　２．６　ｋｇ Ｋ２ＳＯ４３，９ｋｇ 微量金属溶液　６５０　ｍｌ ポテト澱粉　３９、Ｏｋｇ 酵母エキス、５０％　２８．６　ｋｇ 尿素　５．２　ｋｇ クエン酸　１．０５３ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　＋６１　６５０　ｍｌＴｅｒｍａｍｙｌ商標登８６０（Ｌ） 　３９　ｇ微量金属溶液は、以下の組成をもつ ２ｎＳ０４．７Ｈ２０１４，３ｇ／ｌ Ｃｕ５Ｏ＜　、７Ｈ２０２，５ｇ／ｌ ＮｉＣ１ｔ　、６Ｈ２００，５ｇ／ｌ Ｆｅ５０　ａ　、７Ｈ２０１３，５ｇ／ｌＮＩｎＳＯ４，１（ｚｏ　８．５　ｇ ／ｌクエン酸、１水塩　３．Ｏｇ／ｌ 水道水を約９００リツターの全容量まで添加した。ｐＨをＨＩ　ＰＯ４により約 ６．５に調整した。

温度を、６０から９０°Ｃまて３０分間で上昇させ、９０℃で３０分間保った。

次に、円（を、上記基質を１２３°Ｃて１５時間上記主発酵槽内で滅菌する前に 、４．５にＴｆ４整した。接種前の最終容量は、約１３００す・ンターであった 。

次に１５０リツターの種母培養液を添加した。発酵条件は：発酵槽の形式　約２ ７の高さ／直径比をもつ、従来の通気及び攪拌発酵槽 攪拌・２５Ｏｒｐｍ（２つのタービン翼）通気二分当たり１５００　ｎｌ空気、 １３０時間目に１７０ＯＮ！／分に上昇させる 温度：３４℃ 時間：約１３０時間 であった。

発酵開始２５時間後に、マルトデキストリン溶液を、１２時間で１リツタ一／時 間から４リツタ一／時間まで増加させる速度で、上記主　発酵槽に、無菌的に添 加した。このデキストリン溶液を、５５０リツ　ターのフィード・タンク内に、 以下の組成を伴って調製した。

ポテト澱粉　１８４　ｋｇ ビオチン　０．０４ｇ チアミン　０．４ｇ クエン酸　０．２ｋｇ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ　＋６１　２００　ｍｌＴｅｒｍａｍｙｌ商標登１６０Ｌ　３ ６０　ｍｌ水道水を約３００リツターの全容量まで添加した。上記基質を＋２３ °Ｃで１．５時間、投与タンク内で滅菌する前に、９０°Ｃで６０分間、保った 。投与開始前の最終容量は、約４００リツターであった。

発酵開始２５時間後に、ｐＨを７．３〜７．４にＮＨ３により制御した。

約１３０時間時間の後、上記発酵工程を停止した。約１８５０リツターの培養液 を約５°Ｃまて冷却し、そして以下の方法に従って前記酵素を回収した。

上記培養液をｐＨ７で遠心分離し、遠心分離物を、濾過助剤としてＨｙｆｌｏ　 ５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌ珪藻土を使用して５ｅｉｔｚフイルター・シー１−　ＣＴ Ｙｐｅ　５ｕｐｒａ　ＥＫＳ　Ｎｅｕ）上て濾過した。濾液のＰＨを４．７に調 整し、そしてこの濾液を、限外濾過を使用して５％の乾燥物含有量まで濃縮した 。

さらに、蒸発により、３０％の乾燥物含有量までの濃縮を実施した。

この濃縮物のｐＨを、６．５に調整し、そしてこの濃縮物を、濾過助剤として１ （ｙｆｌｏ　５ｕｐｅｒ−Ｃｅｌｌを使用してフレーム・フィルター上で濾過し 、そして５ｅｉｔｚフイルター・シート（Ｔｙｐｅ　５ｕｐｒａ　ＥＫＳ　Ｎｅ ｕ）上で滅菌濾過した。

この濃縮物を、以降の本明細書中で、調製物ｌとして定義する。

調製物１は、５３３ＥＸＵ／ｇのキシラナーゼ活性を示す。

調製物ｌを、以下のように精製した。

全体として２００．０００εＸＵを、２５％硫酸アンモニウムにより沈殿させた 。この沈殿物を５００ｍ１の水に溶解し、そしてＤｏｗ　Ｄｅｎｍａｒｋ　Ａ／ Ｓからの膜ＧＲ９０ＰＰを用いたＡｍ１ｃｏｎ限外濾過ｃｅｌｌ上で洗浄した。

導電率を１．７ｍｓまで減少させた。この収量は、１５０．０ＯＯＥＸＵであっ た。ｐＨを５゜０に調整し、そしてサンプルを０．４５ミクロンのフィルターを 通して濾過し＋００．０ＯＯＥＸＵの収量を得た。このサンプルを、２００ｍ１ のＳ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ高速カラム・クロマトグラフィー及びＰＨ５，０の２ ０ｍ１ｊ酢酸ナトリウムを含むバッファーを使用した、カチオン交換クロマトグ ラフィーにより処理した。キシラナーゼは、このｐＨでは上記カラムに結合した 。キシラナーゼを、上記と同しバッファー中に１に＋の塩化ナトリウムを含む線 型グラジェントを使用して溶出した。全体として７５゜０００ＥＸＵを、Ｅ　２ ｔｏ　４．１をもツ１６０ｍ１中に回収した。これは、Ｅ　ｔｓ。

当たり１１４ＥＸＵに対応する。

ペプチド・マツピング及びその比活性の測定及び特徴付けのために、上記キシラ ナーゼを、最終精製段階により、高い純度で得た。

サイズ・クロマトグラフィー５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５により、上記キシラナーゼ 小部分を、高（精製した。この精製キシラナーゼは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ内に分子 ！２２ｋＤをもつ単一バンド、及びＰｈａｒｍａｃｉａ　ＩＥＦゲルを用いた等 電点電気泳動内に８．２の等電点をもつ単一）くンドをもっている。

生来のキシラナーゼ及び上記のように精製された本発明のクローン化キシラナー ゼは、精製された生来のキシラナーゼに対して生じたウサギ血清と等しく反応す る。ロケット免疫電、気泳動法の使用により、等しいＥＸＵに基づ（両方の酵素 が、同一の免疫沈降物を作り出す。

上記のＥＸＵ法の使用により、着色キシラン上の上記精製キシラナーゼの活性は 、Ｅ２１゜当たり１３０ＥＸＵであり、又はｍｇ蛋白当たり４５０ＥＸＵである 。この吸光係数は、３．５６２１゜である。

酊 本例においては、従来技術のバチルス・ブミラス（Ｂ、　ｐｕｍｉ　［ｕｓ）を 、本発明のキシラナーゼと比較した。例２に記載シタ調製物２を、この比較のた めに使用した。軟材バルブに関しては、本発明のキシラナーゼが有意により良い 漂白増強効果を与えることが判明した。

本発明のキシラナーゼ：フミコーラ・インソレンス（Ｈ，ｉ口５ｏｌｅｎｓ）の キシラナーゼ液体調製物、５３３　ＥＸＵ／ｇ従来技術のキシラナーゼ：バチル ス・ブミラス（Ｂ、　ｐｕｍｉ　Ｉｕｓ）のキシラナーゼ液体調製物、１０７０ 　ＥＸＵ／ｇ伍火ブ スウェーデンの工場からの未漂白軟材。このノくルブを洗浄し、風乾し、そして 冷室内で、く５°Ｃで保存した。

このバルブを水中に、〉１２時間、浸漬し、その後、それを、１％Ｄｓ　、　ｔ ｏ、ｏｏｏ戻り（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎｓ）での実験室的バルブ剤中で、Ｉくルブ 形成する。

表１ 保管後測定されたバルブについてのデータ以下の２つの段階： ｌ）酵素処理 ２）　（Ｄ５０Ｃ５０）Ｅ脱リグニン化をそれぞれに含んで成る２つの漂白試験 を実施した。

５０°Ｃ，ｐＨ８，０（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー）。処理 時間及び投与量を以下の見出し”酵素処理゛の下に記載する。

（Ｄ５０Ｃ５０） ４５分間、４０℃、５％ＤＳ、最終ｐＨ：１．９〜２．９ａＣＬ−倍数：０．＋ ５．０．１９．０．２３．０．２７６０分間、６０℃、１２％ＤＳ、最終ｐＨ＋ Ｉ０．６〜１２，２ＮａＯＨ投与量を、脱リグニン化段階における塩素化合物か ら、［０，５−（ｋｇ　Ｃ１ｔ／ｌｏｎ　＋　Ｃｌ０ｔ／１ｏｎ）　＋　３］　 ｋｇ／ｌｏｎのように計算する。

この漂泊段階を、水浴中で温められたプラスチック・バッグ内で行った。このバ ッグを、一定間隔で、手によって、こねた。

酵素処理 バルブの２つのサンプルを、同一の酵素段階＝１つは本発明のキシラナーゼによ るもの、そして他方は従来技術のキシラナーゼによるもの、において処理した。

この処理時間は３時間であり、そして投与量は＋０００εＸＵ／ｋｇであった。

その後、このバルブを冷水で十分に洗浄した。第３のサンブル一対照−に、酵素 の添加なしで、同様の処理を行った。

本実験においては、上記２つの酵素間の有意差が見られた。

酵素処理後に測定されたカッパ数及び吸光度を、表２に表す。

（Ｄ５０Ｃ５０）Ｅ脱リグニン化 上記３つのサンプルのそれぞれから、それぞれ約１７ｇのバルブの４つの部分を 、異なった投与量の活性塩素により、脱リグニン化した。その後、カッパ数及び ＩＳＯ白色度の値を測定した。この結果を、表３に示す。

表３から、本発明のフミコーラ・インソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅ口Ｓ）のキシ ラナーゼが、従来技術のキシラナーゼよりも顕著に低いカッパ数及びより良好な 白色度を提供することが、明らかとなる。表３から、本発明のキシラナーゼに関 するカッパ数が、従来技術のキシラナーゼに関するカッパ数よりも、はんの僅か に小さいことが明らかになった場合には、この僅かな差異は、使用した活性塩素 の、より多量の、かつ有意な節約に対応する。

ｊ停　Ｉ−ハ慟−！−飯ハ　ムＩ　で々貴　ｔ、ｒ千　所午要ｔｒｌ　のノく゛ ノ上ｈｔ、ｉらめ１°対照のカッパ数に関する倍数 本実験において使用されたバルブに関して、本発明のキシラナーゼが、従来技術 のキシラナーゼよりも、より高い漂泊増強効果を作り出すてあろうという結論を 導くことができる。

本例は、ベーキング剤としての本発明のキシラナーゼの使用について説明する。

キシラナーゼ（名称ペントサナーセがベーキング産業において一般的に用いられ ている）を、以下の幾つかの目的−トウの発展 一トウの弾性及び安定生の改善 一バンの容積の増加 一クラム（ｃｒｕｍｂ）構造の改良 −抗−カヒ発生 のために、小麦粉のためのベーキング剤とし７て使用する。

調製物Ｉを、小麦パンにどいてテストし、そしてそれは、ノくンの品質に関して 非常に良好な効果をもっている。この酵素は、十分なドウを柔らかくする効果を もっている。４３〜１５０ＦＸＵの調製物ｌの添加は１．５〜２０％分のロール の容積を増加させ、そしてクラム構造い。これは、商業的な製品と比べてより良 い効果をもっている。このキシラナーゼ活性以外ＦＸＵは、ＡＦ２９３．６中に 定義されている。

従来技術のキシラナーゼのベーキング剤は、様々な酵素活性を含んで成る。しか るに、本発明のベーキング剤は、キシラナーゼ活性以外の酵素活性を非常に少な く含有して製造されることができる。

従って、本発明のベーキング剤の使用により、１つのベーキング操作から次のベ ーキング操作までの、より定常的な特徴をもつパン製を得ることができる。

一小麦粉　１０１００ Ｏ塩　ｌｅｇ −砂糖　１６ｇ −酵母　５０ｇ 上記成分を、らせん型トウ練り機により混合した。次にこのトウを２分間低速で 、５分間高速でこねた。このドウの温度は、約２６〜２８°Ｃてあった。１０分 間静置した後、このトウを分割し、そして３０ロール（ｒｏｔ　ｌ）と１０−フ （ｌｏａｆ）とを作った。３３°Ｃ１湿度８０％での、ロールについて４５分間 、そしてローフについて４０分間のプルーフィング時間（ｐｒｏｏｆｉｎｇ　ｔ ｉｍｅ）の後、このロール及びローフを、２２０″Ｃて、それぞれ、１５分間、 及び３０分間、ベーキングした。

斐 アミラーゼ活性のない調製物１においては、その宿主生物（＝より作られたアミ ラーゼ活性を、従来のクロマトグラフィー技得テ（こよりにする。

上記のクラムの柔らかさを、５Ｍ５−Ｔｅｘｔｕｒｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ上で測 定する。２５ｍｍの直径をもつプランジャーを、パンの１１ｍｍ厚のスライスの 中央の上に押し当て、速度３．３ｍｍ／秒を用いての、このプランジャーが二の クラム３ｍｍを押し潰すために必要な力を記録し、そしてこれを、上記のクラム の柔らかさとして表す。次にこの値を、再計算して１０００指数を定義した上記 対照サンプルに比較しての相対値とする。

クラムの柔らかさのための上記指数が低くなればなる程、そのクラムは柔らかい 。

ドウ発展及びクラム構造についての特徴を、肉眼観察評価：十は、ドウが正常で あること、及びクラムが粗い構造を伴って同様に正常であることを意味し、そし て＋＋は、ドウが対照よりも柔らかく、かつ弾性があること、及びクラム構造が 均一であり、絹状であることを意味している：に従って与える。

ベントパン商標、すなわち、Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓから入手できる 商業的調製物は、フミコーラ・インソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ）由来の異 なるキシラナーゼを、そしてフミコーラ・インソレンス（Ｈ，１ｎｓｏｌｅｎｓ ）の他の酵素活性をも含む従来技術のベーキング剤である。本発明のキシラナー ゼが、より大きな容積及びより柔らかいクラムを提供するので、従来技術のベー キング剤よりも高い性能をもっていることが、以上のことにより明らかである。

従来技術のキシラナーゼに比・＼て、本発明のキシラナーゼに関する最も重要な ベーキングの利点は、本発明のキシラナーゼが実質的に副活性を全くもたないベ ーキング剤として使用可能であり、そしてこのことによりバッチからノλノチま で非常に均一な性質をもつパンを作ることができるという事実である。

配列表 （１）一般情報・ （ｉ）出願人　ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ（１、発明の名称、 キシラナーゼ、これに対応する組み換えＤＮＡ配列、キシラナーゼ含有剤、及び この剤の使用（ｉｉｉ）配列数ニア （１ｖ）連絡先・ （Ａ）宛て先：ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ（Ｂ）番地　ノボ　 アレ（Ｎｏｖｏ　Ａ１１６）（Ｃ）市：　ＤＫ−２８８０バグスバード（Ｂａｇ ｓｖａｅｒｄ）（Ｅ）国・デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ）（Ｖ）コンピューター 読込形態： （Ａ）媒体形式：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：［ＢＩＪ　ｐｃ互換機（Ｃ）オペレーティングシステム ：ＰＣ−ＤＯ３／ＩＪｓ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェアー：Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒ ｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃１．２５（Ｖ口ｌ）弁理士／代理 人情報 （Ａ）氏名、バッハニール（ＢＡＣＨ，Ｎ１ｅｌｓ）（Ｂ）登録番号：　ＧＡ　 ２４３０７ （Ｃ）参照／事件番号・３５８８．２０４−ＷＯ（ＩＸ）遠距離通信情報 （Ａ）　を話・＋４５４４４４８８８８（Ｂ）ファックス：　＋４５４４４９３ ２５６（Ｃ）テレックス：　３７３０４ （２）配列番号１に関する清紐・ （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）形　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー二重鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名・フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）（Ｂ）法名　ＤＳＭ　１８００ （ｘｌ）配列：配列番号ｌ： （２）配列番号２に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ、９アミノ酸 （Ｂ）形二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）ＣＢ）法名：ＤＳへ１１８００ （ｘｉ）配列：配列番号２ （２）配列番号３に関する情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）長さ・１２アミノ酸 （Ｂ）形二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｖｌ）起源： （Ｂ）法名：　ＤＳＭ　１８００ （ｘｉ）配列：配列番号３： （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）長さ＝２４アミノ酸 （Ｂ）形、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （目）配列の種類・ペプチド （ｖｌ）起源。

（Ａ）生物名・フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）（Ｂ）法名　ＤＳ八へ　１８００ （Ｘｌ）配列　配列番号４ Ｖａｔ　５ｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅｌ　５　１０　１５ （２）配列番号５に関する情報。

（１）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９アミノ酸 （Ｂ）形二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （ｉｉ）配列の種類・ペプチド （ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）（Ｂ）法名：　ＤＳＭ　１８００ （ｘｉ）配列：配列番号５： Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｉｃｅ　Ｇｌｕ　５ａｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇ１ｎ（２）配列番号６に 関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （８）形二アミノ酸、Ｎ−末端 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類：ペプチド （ｖｌ）起源： （Ａ）生物名：フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）（Ｂ）法名・ＤＳＳｉ２１８００ （：＜ｉ）配列・配列番号６゜ （２）配列番号７に関する情報 （１）配列の特徴： （Ａ）長さ、５１６塩基対 （Ｂ）形：核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：　ｒＤＮＡ （ｖｌ）起源 （Ａ）生物名　フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎ ｓ）（Ｂ）法名：　ＤＳＭ　１８００ （ｘｉ）配列　配列番号７ ＡＴＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＴＧＴ　ＣＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣ ＧＧＣＴＧ　ＴＧＡＧＣＴＣ丁ＧＣＣＡＴＴＧＣＴＧＣＣ６O ｃｃ丁Ｔ丁ＴＧＡＣＴ　ＴＣＧＴｒＣＣＴＣＧ　ＧＧＡＣＡＡＣＴＣＧ　ＡＣＧ ＧＣＣＣｎＣＡＧＧＣ丁ＣＧＣＣＡ　ＧＧＴＧＡＣＣＣＣＣP２０ ＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧ　ＧＣＴＧＧＣＡＣＭ　ＣＧＧＣＴＡＣＴＴＣＴＡＣＴＣ ＧＴＧＧ丁　ＧＧＴＣＣＧＡＣＧＧ　ＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧ@１８０ ＧＴＴＣＡＧＴＡＣＡ　ＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡ　ＧＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣ ＡＧＧＴＣＡ　ＧＡＴＧＧＮＮＮＡＡ　ＣＡＣＣＧＧＣＡＡb２４０ ｎＣＧＴＣＧＧＴＧ　ＧＴＡＡＧＣＧＴＴＧ　ＧＡＡＣＣＣＧＧＧＡ　ＡＣＣＧ ＧＣＣＣＣＡ　ＣＧＡＴＣＡＡＣＴＡ　ＣＧＧＣＧＧＣＴＡb３００ ＴＴＣＭＣＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＧ　ＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＧ丁ＣＴＡＣ ＧＧＣＴ　ＧＧＡＣＣＮＮＮＡＡ　ＣＣＣＧＣＴＣＧＴＣ３U０ ＧＡＧＴＡＣＴＡＴＧ　ＴＣＡＴＣＧＡＧＴＣＧＴＡＣＧＧＣＡＣＧ　ＴＡＣＡ ＡＴＣＣＣＧ　ＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＧ@４２０ Ｇ［、ＣＡＣＡｎＣＴ　ＡＴＡＣＣＧＡＣＧＧ　ＣＧＡＴＣＡＧＴＡＴ　ＧＡＣ ＡＴＣＴＴＴＧ　ＴＧＡＧＣＡＣＣＣＧ　ＴＮＮＮＡＡＣＣ`Ｇ　４８０ ＣＣＣＡＧＣＡＴＣＡ　ＣＧＧＣＡＣＣＣＧＧ　ＡＣＧ丁ＣＣＡＧＣＴ　ＡＧＴ ＡＣＴ　５１６取除かれた ＦＩＧ、　２ 国際調査報告 １ｌｌＩｆｉＮｌｅ＊Ｉｌａｅｍｌｅｓ＋ｌｓ＋ｗ。ＰＣＴ１０Ｋ９２１０００ ９９国際調査報告 ＰＣＴ／ＤＫ　９２１０００９９ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｎ　９／２ ４ Ｃ１２Ｒ１：６６） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：６８５） （Ｃ１２Ｎ　９／２４ Ｃ１２Ｒ１：６９） （Ｃ１２Ｎ　１５１５６ Ｃ１２Ｒ１：６４５） （７２）発明者　ダルベーゲ、ヘンリクデンマーク国、デーコー−２８３０ビル ム。

リグステルベーンゲト　６３ Ｉ （７２）発明者　ハルキエル、トルベンゾンマーク国、デーコー−１９００フレ デリクスベルウセー、ボドロフスバイ　６ゲー（７２）発明者　ペデルセン、ラ ース　サービイデンマーク国、デーコー−２８００リングビー、バグスバエルト バイ　６９ベー、１４

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の部分的アミノ酸配列： １【配列があります】，（配列番号１）２【配列があります】，（配列番号２） ３【配列があります】，（配列 番号３） ４【配列があります】，（配列番号 ４） ５【配列があります】，（配列番号５）、及び、 ６【配列があります】 ，（配列番号６） 又は、これに少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％の相同性をもつ部 分的アミノ酸配列をもっているキシラナーゼ。
2. ２．上記のキシラナーゼが、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎ ｓｏｌｅｎｓ），ＤＳＭ１８００かり得られた精製キシラナーゼに対して生じた 抗体と免疫反応性がある、請求項１に記載のキシラナーゼ。
3. ３．前記のキシラナーゼが、７．５〜９．５の、好ましくは８．０〜８．５の等 電点をもつ、請求項１〜２に記載のキシラナーゼ。
4. ４．前記のキシラナーゼが、３３０ＥＸＵ／ｍｇ蛋白を超える、好ましくは４０ ０ＥＸＵ／ｍｇ蛋白を超える比活性を示す、請求項１〜３に記載のキシラナーゼ 。
5. ５．請求項１〜４に記載のキシラナーゼをコードすることを特徴とする組み換え ＤＮＡ配列。
6. ６．以下の部分的ＤＮＡ配列： 【配列があります】（＝配列番号７） を含んで成る、請求項５に記載の組み換えＤＮＡ配列。
7. ７．ａ）ｐＨＤ４５０中のフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎ ｓｏｌｅｎｓ）のキシラナーゼＤＮＡ挿入物 ｂ）ａ）のＤＮＡ挿入物に含まれる成熟キシラナーゼのためのコード領域にハイ ブリダイズし、そして、キシラナーゼ活性をもつポリペプチドのための構造遺伝 子を含んで成り、そして場合により、プロモーター、シグナル若しくはリーダー ・ペプチドのためのコード領域、及び／又は転写ターミネーターを含んで成るＤ ＮＡ配列 ｃ）比較的ストリンジェントな条件（１．０ｘＳＳＣ．０．１％ＳＤＳ．６５℃ ）（Ｔ．Ｍａｎｔｉｓ．Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨ）を 参照した）の下で、請求項６に示す配列にハイブリダイズするのに十分な相同性 をもつＤＮＡ配列 ｄ）ａ）、ｂ）若しくはｃ）に定義したＤＮＡ配列の誘導体、又は、ｅ）成熟キ シラナーゼ又はそれらのシグナル・ペプチド若しくはリーダー・ペプチドをコー ドし、そしてａ）、ｂ）若しくはｃ）のＤＮＡ配列に関してその遺伝子コードの 意味の範囲内で縮重されているＤＮＡ配列 から選ばれたＤＮＡ配列を含んで成る、請求項５又は６に記載の組み換えＤＮＡ 配列。
8. ８．請求項５〜７に記載の組み換えＤＮＡ配列を含んで成るベクター。
9. ９．前記のプロモーターが、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ ｓ　ｏｒｙｚａｅ）のタカアミラーゼ（ｔａｋａａｍｙｌａｓｅ）のプロモータ ーであり、そして／又は前記のキシラナーゼ遺伝子が、ＥＣ３−２から単離され ており、そして／又は前記のターミネーターが、アスペルギルスオリサエ（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）のＡＭＧターミネーターであり、好ましく はｐＨＤ４５０である、請求項８に記載のベクター。
10. １０．請求項８又は９に記載のベクターを含んで成る形質転換宿主。
11. １１．上記の形質転換宿主が、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株で ある、請求項１０に記載の形質転換宿主。
12. １２．前記の形質転換宿主が、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉ ｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　 ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗ ａｍｏｒｉ）の種に属する株である、請求項１０に記載の形質転換宿主。
13. １３．前記の形質転換宿主が、その非形質転換条件においては、キシラナーゼを 生産しないか、又は有意でない量のみのキシラナーゼを生産する微生物、好まし くはバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求 項１０に記載の形質転換宿主。
14. １４．請求項１０〜１３に記載の形質転換宿主によるキシラナーゼの製造方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法により製造されるキシラナーゼ。
16. １６．好ましくは非−発埃性粒状物、安定化液体又は保護された酵素の形態であ って、このことにより、キシラナーゼが全酵素蛋白の少なくとも１０％、好まし くは少なくとも３０％を占める、請求項１〜１４又は１５のいずれか１項に記載 のキシラナーゼを含む剤。
17. １７．キシラナーゼ活性とセルラーゼ活性との比が、キシラナーゼ活性（ＥＸＵ ／ｇ）とセルラーゼ活性（ＥＣＵ／ｇ）との比として表されるものとして、１０ を超える、好ましくは３０超える、最も好ましくは１００を超える値をもつ、請 求項１６に記載の剤。
18. １８．少なくとも１０ＥＸＵ／ｍｇ酵素蛋白の、好ましくは少なくとも１００Ｅ ＸＵ／ｍｇ酵素蛋白の、より好ましくは少なくとも３００ＥＸＵ／ｍｇ酵素蛋白 の、キシラナーゼ活性を含む、請求項１６又は１７に記載の剤。
19. １９．前記の剤がキシラン分解にために使用されることを特徴とする、請求項１ ６〜１８に記載の剤の使用。
20. ２０．上記の使用が、漂白の前又は一部として、好ましくは７を超えるｐＨ値に て、化学パルプ又はリサイクル紙パルプに関することを特徴とする、請求項１９ に記載の使用。
21. ２１．前記の使用が、小麦粉を含むパンの製造に関することを特徴とする、請求 項１９に記載の使用。
22. ２２．前記の使用が、家畜飼料に関することを特徴とする、請求項１９に記載の 使用。