JPH06504910A

JPH06504910A - コメ由来の雄ずい特異的プロモーター

Info

Publication number: JPH06504910A
Application number: JP4503955A
Authority: JP
Inventors: ミシエル，フランク; モリオカ，シンジ; シールリンク，トウリーズ; コマリ，トシヒコ
Original assignee: プラント・ジエネテイツク・システムズ・エヌ・ベー
Priority date: 1991-02-08
Filing date: 1992-02-06
Publication date: 1994-06-09
Anticipated expiration: 2018-11-05
Also published as: WO1992013956A1; DE69233636D1; CA2103573C; EP0573443A1; JP3462497B2; US5639948A; CA2103573A1; ATE332381T1; AU1192392A; EP0573443B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

コメ　の雄　い、　・プロモータ一本発明は、植物、特に単子葉植物の雄すい細胞においては遺伝子を優勢にまたは特異的に発現させるが、稔性花粉の生産に関与しない植物の他の部分においては遺伝子を僅かしかまたは全く発現させない、コメから単離されたプロモーターに係わる。該プロモーターは、雄ずい細胞、好ましくはＦｉｓ胞において少なくとも優勢に、好ましくは特異的に遺伝子が発現される形質転換植物の生産に有用である。該プロモーターは特に、欧州特許出Ｉｔ（“ＥＰＡ”）第８９４０１１９４．９号及び第９０４０２２８１．１号（これらの特許は参照により本明細書の一部を構成するものとする）にそれぞれ記載のごとき雄性不稔植物及び雄性稔性回復植物の生産、特にトウモロコシ、コメまたはコムギのような単子葉植物のハイブリッドの生産に有用である。！ｊノと４尤一本発明によれば、配列表に示した配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５の配列を含む、コメから単離された雄花特異的ｃＤＮＡ配列が提供される。更に本発明によれば、かかるｃＤＮＡ配列に対応するコメ遺伝子の雄ずい特異的、好ましくは朽特異的、特にタベータム特異的プロモーター、特に配列表に示した配列番号６のヌクレオチド２８４６の上流に置かれるプロモーターＰＴ７２、配列番号７のヌクレオチド１８０９の上流に置かれるプロモーターＰＴ４２及び配列番号８のヌクレオチド２２６４の上流に置かれるプロモーターＰＥＩが提供される。これらのプロモーターの各々は、そのプロモーターの転写制御下にある構造遺伝子、好ましくは雄性不稔ＤＮＡまたは雄性稔性回復ＤＮＡを含む外来ＤＮＡ配列、好ましくは外来キメラＤＮＡ配列に使用することができ、この配列を使用して、植物、特に単子葉植物の細胞の核ゲノムを形質転換することができる。更に本発明によれば、本発明の外来ＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞から再生される雄性不稔植物または雄性稔性回復植物；かかる植物の細胞、細胞培養物及び種子；並びに、かかる雄性不稔植物及び雄性稔性回復植物を交配することから得られる雄性稔性回復植物及びその種子が提供される。ヨ　’ＡＵ本発明によれば、本発明の外来ＤＮＡ配列を植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入する公知の方法によって植物細胞を形質転換することにより、植物の単一細胞から雄性不稔植物または雄性損性回復植物を生産することができる。外来ＤＮＡ配列は、上流末端（即ち５′末端）では本発明の雄ずい特異的、好ましくはめ特異的、特にタベータム特異的プロモーターに１フレームとして結合されていて該プロモーターの制御下にあり、下流末端（即ち３′末端）ではポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終結（または調節）シグナルに結合されている、少なくとも１つの雄性不稔ＤＮＡまたは雄性損性回復ＤＮＡを含む、それによって、雄性不稔または損性回復ＤＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチドが、植物の雄ずい細胞内で少なくとも優勢に、好ましくは独占的に、生産または過剰生産される。外来ＤＮＡ配列は少なくとも１つのマーカーＤＮＡを含むことができる。マーカーＤＮＡは、少なくとも植物の特定の組織または特定の細胞中に存在するとき、該植物を、少なくともその特定の組織または特定の細胞中にかかるＤＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチドを含まない他の植物と容易に分離または区別し得るようにするＤＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチドをコードするものであり、５′末端では少なくともその特定の組織または特定のａｐｌ中でマーカーＤＮＡの発現を誘導し得る第２プロモーターに結合されていてその制御下にあり、且つ３°末端ではポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終結シグナルに結合されている。マーカーＤＮＡは、雄性不稔または損性回復ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあるのが好ましい、このように雄性不稔または損性回復ＤＮＡとマーカーＤＮＡとを結合することにより、雄性不稔または損性回復ＤＮＡとマーカーＤＮＡとの両方を、形質転換植物細胞から再生された植物の子孫中に高度の確実性で同伴分離（ｊｏｉｎｔ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）することができる、しかしながら場合によってはこのような同伴分離は望ましくなく、マーカーＤＮＡは雄性不稔または損性回復ＤＮＡとは異なる遺伝子座内にある必要がある。本発明の雄性不稔ＤＮＡは、その発現産物（ＲＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチド）が雄ずい細胞、好ましくはめ細胞の代謝、機能及び／または発生を著しく阻害し、従って稔性花粉の産生を阻害する任意の遺伝子または遺伝子フラグメントとすることができる。好ましい雄性不稔ＤＮＡは欧州特許出願第８９４０１１９４．９号に記載されており、例えば、ＲＮａｓｅＴｌまたはｂａｒｎａｓｅのようなＲＮａｓｅ；エンドヌクレアーゼ（例えばＥｃｏＲＩ）のようなりＮａ５ｅ；パパインのようなプロテアーゼ；植物ホルモンの合成を触媒する酵素（例えばインペンテニルトランスフェラーゼまたはＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴ−ＤＮＡの遺伝子１及び遺伝子２の遺伝子産物）；グルカナーゼ；リパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；植物細胞壁阻害物質；または毒素（例えばジフテリア毒素のＡ−フラグメントまたはボッリン（ｂｏｔｕｌｉｎ））をコードするＤＮＡを挙げることができる。雄性不稔ＤＮＡの他の好ましい例としては、その産物が稔性花粉の正常発生に不可欠である遺伝子と相補的なＲＮＡをコードするアンチセンスＤＮＡを挙げることができる。ｍ性不稔ＤＮＡの更に好ましい例としては、稔性花粉の産生に不可欠な産物をコードする遺伝子の所与のターゲット配列を特異的に切断し得るリボチーム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）をコードするＤＮＡを挙げることができる。！ｉ性不稔ＤＮＡの更に別の例としては、雄すい細胞、特に豹細胞を、特定の疾病（例えばＭｉｗ！またはウィルス感染）またはストレス状Ｂ（例えば除草剤）に対して感受性にするが、植物の他の部分は感受性にしない産物をコードするものを挙げることができる。ｂａｒｎａｓｅコーディングＤＮＡのような雄性不稔ＤＮＡを本発明のコメめ特異的プロモーターの制御下に含むベクターの構築は、Ｅ、ｃｏｌｉのような細菌宿主生物において最も都合良く行われる。しかしながら、雄性不稔ＤＮＡの特性及び該ベクターの特定の構成に従い、宿主生物中での雄性不稔ＤＮＡの発現及びそれと同時に起こる宿主生物の生存率の低下に起因し、問題が発生し得る。かかる問題は多数の方法で解決することができる０例えば、雄性不稔ＤＮＡまたは場合によってはその染色体ＤＮＡを、雄性不稔ＤＮＡの発現作用を有意に禁止または阻害する別のＤＮＡ配列と一緒に、同じまたは異なるプラスミド上に含むよう宿主生物を調製することができる。このような他のＤＮＡ配列は例えば、雄性不稔ＲＮＡの蓄積及び翻訳が禁止されるようにアンチセンスＲＮＡをコードするもの、または雄性不稔ＤＮＡの遺伝子産物〔例えばｂａｒｎａｓｅ；Ｈａｒｔ　ｌｅｙ　（１９８８）Ｊ、Ｍｏ　１．Ｂｉｏ　１．、Ｌ、Ｑ、ｊ、　９１３　）を特異的に阻害するタンパク質（例えばｂａｒｓｔａｒ）をコードするものとすることができる。また雄性不稔ＤＮＡは、植物細胞環境においてのみ有効遺伝子産物をもたらすエレメント、例えば植物イントロンを含むことができる。この目的で使用し得るイントロンの例としては、トウモロコシのａｄｈニエＪ伝子包子ｕ　ｅ　ｈ　ｒ　ｓｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｌｂｏｔ（１９９１）Ｍｏ１．Ｇｅｎ。Ｇｅｎｅｔ、ＬＬΣ、８１；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ　ｅｔ　ａ１′（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｆｏｌ、Ｌｉ、９１３）、）ウモロコシの５ｈｕｒｕｎｋｅｎ−包子（Ｖａｓｉｌ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）ＰｌａｎｔＰｂｙｓｉｏｌ、ＬＬ、１５７５）、）ウマゴのｃａｔ−Ｊ伝子（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｔ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（ＮＡＲ″）Ｑ、６７６７）、及びコメのａｃ工ニュＪ伝包子ＭｃＥｔｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｔｈｅ　ＰｌａｎｔＣｅｌｌ　Ｌ、１６３；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１１０９９４８号〕の転写単位のイントロンを挙げることができる。本発明の雄性損性回復ＤＮＡは、その発現産物（ＲＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチド）が、雄すい細胞、特に朽細胞における雄性不稔ＤＮＡの産物の特異的活性を、不活化、中和、阻害、ブロック、ＭＲ１圧Ｍ、または禁止する任意の遺伝子または遺伝子フラグメントとすることができる。好ましい稔性回復ＤＮＡは欧州特許出願第９０４０２２８１．１号に記載されており、例えば、ｂａｒｎａｓｅの阻害物質であるｂａｒｓｔａｒ；Ｅｃ。ＲＩの活性を阻害するＥｃｏＲＩメチラーゼ；またはプロテアーゼ阻害物質（例えばパパインの阻害物質）をコードするＤＮＡを挙げることができる。稔性回復ＤＮＡの他の例としては、雄性不稔ＤＮＡと相補的なＲＮＡをコードするアンチセンスＤＮＡを挙げることができる。稔性回復ＤＮＡの別の例としては、雄性不稔ＤＮＡによってコードされる所与のターゲット配列を特異的に切断し得るリボチームをコードするＤＮＡを挙げることができる。本発明のマーカーＤＮＡは、マーカーＤＮＡを発現した植物が、マーカーＤＮＡを発現していない植物と容易に区別され得るようにするＲＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチドをコードする任意の遺伝子または遺伝子フラグメントとすることができる。マーカーＤＮＡの例は欧州特許出願第８９４０１１９４．９号に記載されており、例えば、以下のようなタンパク質またはポリペプチドをコードするものとし得る：［物細胞に識別可能な色を与えるもの、例えばジヒドロクルセチン−４−レダクターゼ３コードするＡ１遺伝子（Ｍｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　１１史、６７７−６７８）及びグルクロニダーゼ遺伝子（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　（”ＰＮＡＳ”）８３．８４４７）、植物に特定の形態的特徴、例えば矯小成長または異常葉形を与えるもの；植物にストレス耐性を与えるもの、例えば欧州特許出願に８８４０２ゼをコードする遺伝子によって与えられもの；欧州特許出願第８６３００２９１．１号に記載のご゛とき、植物に病虫害抵抗性を与えるもの、例えば欧州特許公開第８６３００２９１．１号に記載のごとく植物に病虫害抵抗性を与えるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ内毒素をコードする遺伝子によって与えられるもの；欧州特許出願第８８４０１６７３．４号に記載の細菌性ペプチドによって与えられるような、植物に耐細菌性を与えるもの、好ましいマーカーＤＮＡは、除草剤の活性を阻Ｗまなは中和するタンパク質またはポリペプチドをコードするもの、例えば、欧州特許出願第８７４００５４４．０号に記載のごときＢｉａｌａｐｈｏｓ及びホスフィノトリシンのようなグルタミンシンセターゼ阻害物質に対する耐性を与える酵素をコードする１エエＪ伝子及びＬ１１ニヱＪ伝子挙げることができる。マーカーＤＮＡによってコードされるタンパク質またはポリペプチドが意図したように機能するためには、それを植物細胞中で、成熟タンパク質がそのＮ末端で、該成熟タンパク質を葉緑体、ミトコンドリアまたは小胞体といった特定の器官に転位させる別のポリペプチド（“ターゲツティングペプチド”）に結合している前駆体として産生させることが好ましい、かかるターゲツティングペプチド及びそれらをコードするＤＮＡ配列（“ターゲツティング配列”）は公知である１例えばマーカーＤＮＡが、除草剤または葉緑体代謝に作用する別の選択物質に耐性または抵抗性を与えるタンパク質、例えば５ｆｒ（またはｂａｒ）遺伝子またはＬ１１エヱＪ伝子欧州特許公開（“ＥＰ”〕第０．２４２．２３６号〕をコードするならば、かかる遺伝子は、酵素１．５−リブロースビホスフェートカルボキシラーゼ〔Ｋｒｅｂｂｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ（１９８８）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．８ｉｏ１．　ＬＬ、７４５；ＥＰＡ第８５４０２５９６．２号〕の小サブユニットのトランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするような葉緑体ターゲツティング配列を含むのが好ましいが、ＶｏｎＨｅｔｊｎｅ　ｅｔ　ａｌ（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｍ。１、Ｂｉｏ’１．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　９，１０４によって列挙されているような他のトランジットペプチドをコードする他のターゲツティング配列を使用することもできる。雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡを制御するために使用することができる本発明の雄ずい特異的、好ましくは豹特異的プロモーター、例えば配列番号６のヌクレオチド２８４６の上流に置かれるプロモーターＰＴ７２、配列番号７のヌクレオチド１８０９の上流に置かれるプロモーターＰＴ４２、及び配列番号８のヌクレオチド２２６４の上流に置かれるプロモーターＰＥＩは、欧州特許出願第８９４０１１９４．９号に記載のごとき公知の方法で同定及び単離することができる。この点に関して言えば、本発明の配列番号１〜５の各ｃＤＮＡは、コメゲノムの対応領域（即ちそのｃＤＮＡが作製された雄ずい特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡを含む領域）を同定するためのプローブとして使用することができる。かかる雄すい特異的ｍＲＮＡをコードするＤＮＡの上流（即ち５′末端）にあり且つこのＤＮＡのプロモーターを含む植物ゲノムの部分を同定することもできる。マーカーＤＮＡを制御する第２プロモーターは、例えば欧州特許出願第８９４０１１９４．９号に記載のごとき公知の方法で、マーカーＤＮＡによってコードされるＲＮＡ及び／またはタンパク質もしくはポリペプチドの特性に従って、マーカーＤＮＡが１つ以上の特定の組織またはａｒｍ内で選択的に、または植物全体において構成要素として発現されるように選択及び単離することができる。本発明の外来ＤＮＡ配列においては、３′転写終結シグナルまたは“３′末端” は、植物細胞内で適正な転写終結及び／またはｍＲＮＡのポリアデニル化を与え得るもののなかから選択される。転写終結シグナルは、転写されるべき雄性不稔または稔性回復ＤＮＡの天然のものでもよいし、外来または異種のものでもよい、異種３°転写終結シグナルの例としてはオクトビンシンターゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ（１９８４）ＥＭＢＯＪ、３Ｌ、８３５−８４５〕及びＴ− ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄＳｃｈｅ　ｌ　１　（１９８５）ＮＡＲ、ＬＬ、６９８１−６９９８〕のものを挙げることができる０本発明の外来ＤＮＡ配列が１つ以上の構造遺伝子（例えば雄性不稔または稔性回復ＤＮＡとマーカーＤＮＡ）を含む場合、構造遺伝子の３′末端は異なるのが好ましい。植物、特に単子葉植物、とりわけコメ、トウモロコシ及びコムギのようなか穀類においては、マーカーＤＮＡ及び雄性不稔ＤＮＡまたは不稔回復ＤＮＡの本発明に従う発現は、本発明の各外来ＤＮＡ配列の転写単位内の１つ以上、好ましくは１つの適当な位置に、適当な植物イントロン〔Ｌｕｅｈｒｓｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｌｂｏｔ（１９９１）Ｍ。１、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　ＬＬｉ、８１　；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ、Ｌｉ、９１３：Ｖａｓｉｌ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、ＬＬ、１５７５；Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）ＮＡＲＬｆＬ、６７６７；ＭｃＥＩｒｏｙ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）ＴｈｅＰｌａｎｔ　Ｃｅ１１　２．１６３：ＰＣＴ［！ｉｆ際公開第Ｗ０　９１１０９９４８号〕が存在することにより増強され得る。各イントロンは、形質転換される植物種の細胞によって認識可能であり〔植物によるイントロン認識の必要性のため、Ｇｏｏｄａｌｌ　ａｎｄ　Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ（１９８９）Ｃｅｌｌ　旦８，４７３；Ｈａｎｌｅｙ　ａｎｄＳｃｈｕｌｅｒ（１９８８）ＮＡＲＬｆ；Ｌ、７１５９１）照〕、約７０〜７３ｂｐより長（（Ｇｏｏｄａｌｌ　ａｎｄ　Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ（１９９０）Ｐｌａｎｔ　Ｍ。１．８　ｉ　ｏ　１．　ＬＬ、７２７）　、且つ、コードされるｍＲＮＡの５゛末端の近傍、特に非翻訳先導配列内に位置するヌクレオチド配列を有するのが好ましい。植物細胞は、本発明の外来ＤＮＡ配列を用いて慣用の方法で形質転換することができる。形質転換すべき植物がＬｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　染に感受性である場合は、武装解除された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミドである外来ＤＮＡ配列を含むベクターを使用することが好ましい。形質転換は、例えば欧州特許公開第０．１１６．７１８号及び欧州特許公開第０．２７０．８２２号並びにＧｏｕｌｄａｔ　ａｌ（１９９１）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　Ｌｉ、４２６−４３４に記載の方法を使用して実施することができる。好ましいＴｔプラスミドベクターは、境界配列間に位置するかまたは少なくとも右側、境界配列の上流に位置する外来ＤＮＡ配列を含む、勿論、他のタイプのベクターでも、直接遺伝子移入〔例えば欧州特許公開第０゜２２３，２４７号に記載のもの〕、花粉媒介形質転換〔例えば欧州特許公開第０．２７０．３５６号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８５１０１８５６号及び欧州特許公開第０．２７５　。０６９号に記載のもの）、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ原形質体原形転体形質転換米国特許第４，６８４，６１１号に記載のもの〕、植物ウィルス媒介形質転換〔欧州特許公開第０．０６７゜５５３号及び米国特許第４．４０７，９５６号に記載のもの〕、及びリポソーム媒介形質転換〔例えば米国特許第４，５３６．４７５号に記載のもの〕といった方法を使用し、植物細胞を形質転換するのに使用することができる。形質転換すべき植物がコメである場合は、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。ｇｙｉ、９５７、Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ　（１９９１）ＰＮＡＳ　ＬＬ、６３８９、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３≦１−．２７４及びＤａｔｔａ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８．７３６によって所定のコメ系統に対して記載されているような最近開発された形質転換法を使用することができる。形質転換すべき植物がトウモロコシである場合は、Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｂｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌＯｇｙ　Ｌ、８３３及びＧｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ　ｅｔａｌ（１９９０）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　、Ｌ、６０３によって所定のトウモロコシ系統に対して記載されているような最近開発された形質転換法を使用することができる。形質転換すべき植物がコムギである場合は、上述のトウモロコシまたはコメに対して記載されたものと類似の方法を使用することができる。単子葉植物、特にコメ、トウモロコシまたはコメのような穀票の形質転換に対しては、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換またはエレクトロボーレーションのような直接ＤＮＡ移入法を使用することが好ましい、このような直接移入法を使用する場合、実質的に雄性不稔または稔性回復ＤＮＡと任意のマーカーＤＮＡとを含む本発明の外来ＤＮＡ配列のみが植物ゲノム中に組み込まれるように、移入するＤＮＡを最小化することが好ましい、この点に関して言えば、本発明の外来ＤＮＡ配列は、細菌宿主生物中のプラスミドにおいて構築及び増幅する場合、当該外来ＤＮＡ配列を用いて植物を形質転換する前に、複製開始点、宿主生物選択のための抗生物質耐性遺伝子などの細菌宿主生物内での増殖に必要なプラスミド配列を、外来ＤＮＡ配列を含むプラスミドの部分から分離しておくのが好ましい。以下の実施例において、本発明の配列番号１〜５のコメｃＤＮＡ配列の単離及び特性分析；コメゲノムから本発明の雄ずい特異的プロモーター、例えば配列番号６のヌクレオチド２８４６の上流に置かれるプロモーターＰＴ７２、配列番号７のヌクレオチド１８０９の上流に置かれるプロモーターＰＴ４２．及び配列番号８のヌクレオチド２２６４の上流に置かれるプロモーターＰＥ１を単離する上での本発明の配列番号１〜５のコメｃＤＮＡ配列の使用；前記各プロモーターを雄性不稔ＤＮＡ及び不稔回復ＤＮＡに融合することによる遺伝子カセットの構築；前記プロモーターカセットからの植物形質転換ベクターの構築：並びに、得られた形質転換ベクターによるコメ、トウモロコシ及びタバコの形質転換を説明する。実施例において特に記載のない限り、組換えＤＮＡを作製及び操作する全ての工程は、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ　ｌ　ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８２＞及びＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、Ｍ。Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。ｒ　Ｍａｎｕａｌ、５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ。ｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）に記載の標準方法によって実施した。プラスミド構築物を作製したとき、制限マツプ作成及び／または配列決定によってクローン化フラグメントの向き及び組込みをチェックした。上記説明及び実施例で参照した配列同定番号を以下に列挙する。

【に１配列番号１：Ｔ７２遺伝子のｃＤＮＡ配列配列番号２：Ｔ２３遺伝子の部分ｃＤＮＡ配列配列番号３：Ｔ４２遺伝子のｃＤＮＡ配列配列番号４ニア１５５遺伝子のｃＤＮＡ配列配列番号５：Ｅ１遺伝子のｃＤＮＡ配列配列番号６：Ｔ７２　ｃＤＮＡにハイブリダイズしたコメゲノムクローンのＤＮＡ配列配列番号７：Ｔ４２　ｃＤＮＡにハイブリダイズしたコメゲノムクローンのＤＮＡ配列配列番号８：Ｅｌ　ｃＤＮＡにハイブリダイズしたコメゲノムクローンのＤＮＡ配列配列番号９ニブラスミドｐＶＥ１０８のＤＮＡ配列え１匠Ｌコメ　の１．、　ｃＤＮＡの　。コメの豹において独占的にまたは少なくとも優勢に発現される遺伝子に対応するｃＤＮＡをクローニングするため、市販のコメ系統０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａの変種ｊ　ａｐ。ｎ１ｃａ、Ａｋｉｈｉｋａｒｉの、減数***前及び減数***前期の小胞子母細胞を担う発育段階にある未熟不穏（大きさ１〜３ｍｍ）、及び減数***中及び減数 ***後の小胞子母細胞を担う発育段階にある不穏（大きさ３〜５ｍｍ）の豹から単離したポリＡ″ｍＲＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｐｌｕｓ　ＲＰＮ　１２５６　Ｙ／Ｚキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＰＬＣ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ。英国）によって、キットの使用手順書に従い、逆転写酵素及びオリゴｄＴプライマーを使用してｃｐＮＡを合成した。Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｃＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔｅｎ−λｇｔｌｏ−ＲＰＮ１２５７−キットを使用し、キットの使用手順書に従ってｃＤＮＡをλｇｔｌｏベクター中にクローニングした。このように得られたｃＤＮＡライブラリー（朽ライブラリーには２１，０００プラーク；不穏ライブラリーには６，０００プラーク）において、陽性プローブとして、コメ未熟ｐｉ　ｍ　ＲＮ　Ａからコピーした標識第１鎖ｃＤＮＡプローブ及びコメ未熟不穏ｍＲＮＡ　（前述の発育段階）からコピーした擦識第１鎖ｃＤＮＡプローブ、陰性プローブとして、コメ実生葉がらコピーした標識第１鎖ｃＤＮＡプローブ及びコメ実生根からコピーした標識第１　ＩＦ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを用いてハイブリダイズすることにより、分別スクリーニングを実施した。９７個の豹及び不穏特異的ｃＤＮＡクローンの候補を選択し、コメのめ及び不穏のｍＲＮＡ（陽性プローブ）並びにコメ不穏の葉、根及び基部（陰性１０−プ）から誘導した標識ｃＤＮＡを用いて再度スクリーニングした。不穏基部は未熟コメ不穏（大きさ３〜６ｍｍ）であり、そこから豹と内花穎及び外花穎の頂部を、無傷の子房を含むよう切除した。この第２選択段階を通過した８２個の候補クローン由来のファージＤＮＡ０．２μｇを、ドツトプロットアッセイにおいて豹特異的発現についてスクリーニングし、陽性プローブとしてコメ未熟率！！ｍ　ＲＮ　Ａ及びコメ末！！！！朽ｍＲＮＡ　（前述の発育段階）からコピーした標識第１ｇＤＮＡプローブ、陰性プローブとしてコメ実生葉、コメ実生根、コメ不穏基部、乾燥コメ種子、コメカルス及び未熟コメ円錐花序軸のｍＲＮＡからコピーした標識第１　Ｈｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを用いてハイブリダイズした（表１参照）。８２個の候補クローンのｃＤＮＡ挿入物を精製し、交差ハイブリダイジング及び／または重複クローンを同定するため、８２個の候補クローンの集合を用いてハイブリダイズした。これによって、相互に交差ハイブリダイゼーションを示さず、従って異なる遺伝子から誘導されたとみられる２２個の朽特異的ｃＤＮＡクローンが同定された。これらのクローンのうち２０個は、コメゲノムにおける単一コピー遺伝子に対応することが判り（サザンハイブリダイゼーションにより試験した；表１参照）　、ｐＧＥＭ２またはｐＧＥＭ７Ｚｆ　（＋）（ＦＲＯＭＥＧＡ、Ｍａｄｉｓｏｎ。Ｗｉ、ＴＪＳＡ）中にサブクローニングした。２０個の候補クローン由来のプラスミドＤＮＡ０．２μｇを、上述のごときドツトプロットアッセイにおいて豹特異的発現についてスクリーニングした。更に分析すると、実際には１８個の異なる挿入物しかないことが判り、これらの押入物を、ノザンプロットにおいて、コメ未熟め、未熟不穏、葉及び根由来の全ＲＮＡ５μｇを用いてハイブリダイズした。試験した１８個のクローンのうち１６１１１が、コメ未熟豹及び未熟率１！（前述の発育段階）中では発現したが、葉及び機中では発現しないことが確認された。一部または全部の配列が決定されたこれらの選択された種々のクローンのうち１２１１１のクローンのプロフィールを表ＩＡ、ＩＢ及びＩＣに示す、１２個のクローン化豹特異的ｃＤＮＡ挿入物を“Ｔ１４６″、“Ｅｌ”、”Ｅ２”、 “Ｔ３４”、“Ｔ７２１、”Ｔｌ５７″、Ｔ１４９”、′Ｔ４２”、′Ｔ１３９ ”、“Ｔ１５５”、７２３”及び“Ｔ１１８”と称した。これらのめ特異的ｃＤＮＡのうちの５つ、即ちＥｌ、Ｔ７２、Ｔ４２、Ｔ１５５及びＴ２３　ｃＤＮＡは更に、小胞子ｔａｒ胞の減数***の前と後との両方で発現し、より高感度の分析では厳密なめ特異的発現を示すことが判った。Ｅｌ、Ｔ７２及びＴ４２ｃＤＮＡにおいては最高発現レベルは減数***前に認められた。これら３つのｃＤＮＡのうち、Ｔ７２　ｃＤＮＡは、豹特異性がある、発現レベルが比較的高い、及び実質的に減数***前に発現するといった盟ましい特性を最も良く合わせ持つとみられる。９０２Ｍプラスミド中にクローニングしたＴ７２、Ｔ２３、Ｔ４２、Ｔ１５５及びＥｌ　ｃＤＮＡの一部または全部の配列をそれぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５に示す、Ｔ７２のｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド３３０個及び１１４１１１１にわたる２つの読み枠（ＯＲＦ）を明らかにしている。１１匠りの−，ｃＤＮＡ　ローンこ　・。の　の、・プロ　−−のａ９０２Ｍプラスミド中にそれぞれクローニングした、実施例１の選択されたＴ７２、Ｔ２３、Ｔ４２、Ｔ１５５及びＥｌ　ｃＤＮＡに対応するＴ７２、Ｔ２３、Ｔ４２、Ｔ１５５及びＥ１遺伝子の調節配列を担うゲノムＤＮＡクローンＰＴ７２、ｐＴ２３、ｐＴ４２、ｐＴ１５５及びｐＥｌを単離するため、コメ変種Ａｋｉｈｉｋａｒｉのゲノムライブラリーを構築した。これは、Ａｋｉｈｉｋａｒｉ実生葉ＤＮＡを５ａｕ３ＡＩで部分消化し、スクロース勾配遠心分離によって１８〜２２ｋｂ大のフラクションを精製し、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで切断した（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆｆ　ｅｔ　ａｌ（１９８３）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。ＬＬ更、８２７及びＰｏｕｗｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ（１９８８）、Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（ＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＵｐｄａｔｅ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍに記載のごとく〕バクテリオファージλＥＭＢＬ３リプレースメントベクター中にクローニングすることにより行なった。ライブラリーを、ＰＴ７２、ＰＴ２３、ｐＴ４２、ｐＴ１５５及びｐＥｌ　全ｃＤＮＡクローンの各々でスクリーニングし、対応するゲノムクローンの制限マツプを決定した。ｐＴ７２、ＰＴ２３、ＰＴ４２、ｐＴ１５５またはｐＥｌにハイブリダイズした対応ゲノムクローンの配列を決定したＣＭａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ（１９７７）ＰＮＡＳ　７先、５６０）、ｐＴ７２、ｐＴ’：２３、ｐＴ４２、ｐＴ１５５またはｐＥｌとゲノムクローンの配列を比較して相同領域を同定した。５つの遺伝子（Ｔ７２、Ｔ２３、Ｔ４２、Ｔ１５５及びＥｌ）の各々について、該遺伝子を発現するコメ組織のｍＲＮＡに逆転写酵素を使用してプライマー伸長することにより、転写開始部位を決定した。５つの遺伝子の各々のプロモーターにおいて、転写開始部位の上流に’ＴＡＴＡ ”コンセンサス配列ボックスが認められた。ＡＴＧ翻訳開始部位は、ＤＮＡ配列決定によって判ったところでは、各クローンの翻訳読み枠内の最も上流のＡＴＧコドンとして、またコメにおいて合成されるｍＲＮＡ上の最初にアクセス可能なＡＴＧコドンとして決定された。ｐＴ７２、ｐＴ４２及びｐＥｌにそれぞれハイブリダイズしたゲノムクローンＧＴ７２、ＧＴ４２及びＧＥＬの一部のＤＮＡ配列をそれぞれ配列番号６、配列番号７及び配列番号８に示す、各配列において、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位を示す、各配列において、ＡＴＧ翻訳開始コドンで始まり、その対応ｃＤＮＡ配列と重なり合う読み枠が同定されている。各配列におけるプロモーター領域は、コーディング配列のＡＴＧｇ訳開始コドンの上流にあって、その直前から開始している。この点に間して言えば、ヌクレオチド１から始まりＡＴＧコドンの直前のヌクレオチドで終わるＤＮＡは、各配列のプロモーター領域とみなすことができる。しかしながら、問題の異種コーディング配列（例えばｂａｒｎａｓｅまたはＲＮａｓｅＴｌをコードする配列）の朽特異的発現を与えるのに好ましい各プロモーターの領域の部分は、そのＡＴＧコドンの上流の約１５００〜約１７００ｂｐにしか広がっておらず、ＡＴＧコドンの上流の約３００〜５００ヌクレオチドにのみ広がる各プロモーター領域のより小さい部分でさえ、異種コーディング配列の豹特異的発現を与えるのに十分である。各プロモーター領域において、転写開始部位とＡＴＧ翻訳開始の間に位置する非翻訳先導配列は好ましいが、異種コーディング配列の朽特異的発現に不可欠とは考えられず、先導配列は他の遺伝子、例えば植物遺伝子の非翻訳先導配列によって置き換えることができる。ｃＤＮＡ　ｐＴ７２にハイブリダイズした２０ｋｂｐゲノム５ａｕ３ＡＩフラグメントが見付かった。ｃＤＮＡＰＴ７２にハイブリダイズしたこのクローンの４．６ｋｂｐ　ＥｃｏＲＩフラグメントをｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　２中にサブクローニングし、得られたプラスミドを“ｐＧ７７２”と命名した、ｐＴ７２　ｃＤＮＡと相同な領域の３°末端に最も近いＥｃｏＲＩ部位の上流にある全部で３６７２ｂｐの配列を決定した。この配列を配列番号６に示す、プライマー伸長によって、転写開始はこの配列の位！２７６５にあることが判明した。ＴＡＴＡボックスは位置２７３３と２７３９の間に位置することが推定され、転写開始コドンは位置２８４６に位置する０位置２８４６の上流の配列は、問題のコーディング配列の豹特異的、特にタペータム特異的発現のためのプロモーター領域ＰＴ７２として使用することができる。このプロモーター領域の好ましい部分は、位置的１２４２から位置的２８４５に広がると考えられるが、プロモーター領域は、位置１〜２８４５の全配列を含んでもよい、約特異的プロモーターとして作用し得る最小領域は、配列番号６においては位置２８４６の上流の約３００〜５００ｂｐに広がると考えられる。同様に、ｃＤＮＡＰＴ４２にハイブリダイズしたゲノム５ａｕ３ＡＩフラグメント（長さはやはり約２０ｋｂｐ）を回収した。ｃＤＮＡ　ｐＴ４２にハイブリダイズしたこのクローンの５ｋｂｐ　Ｈｉｎｄｒｌｌフラグメントを９０２Ｍ２中にサブクローニングし、得られたプラスミドを“ｐＧＴ４２”と命名した。ｐＴ４２　ｃＤＮＡと相同な領域内に位置するＨｉｎｄＩ１１部位の上流にある全部で２３７０ｂｐの配列を決定した。この配列を配列番号７に示す。プライマー伸長によって、転写開始はこの配列の位置１７８０にあることが判明した。ＴＡＴＡボックスは、位置１７４８と１７５５の間に位置すると推定され、翻訳開始コドンは位置１８０９に位置する１位置１８０９の上流の配列は、問題のコーディング配列のめ特異的、特にタベータム特異的発現のためのプロモーター領域ＰＴ４２として使用することができる。このプロモーター領域の好ましい部分は位置的２７５から位置的１８０８に広がると見られるが、プロモーター領域は、位置１〜１８０８の全配列を含んでもよい、朽特異的プロモーターとして作用し得る最小領域は、配列番号７においては位置１８０９の上流の約３００〜５００ｂｐに広がると考えられる。同様に、ｃＤＮＡ　ｐＥｌにハイブリダイズしたゲノム５ａｕ３ＡＩフラグメント（長さはやはり約２０ｋｂｐ）を回収した。ｃＤＮＡ　ｐＥｌにハイブリダイズしたこのクローンの６ｋｂｐ　Ｐｖｕｌｌフラグメントを９０２Ｍ２のＳｍａ　Ｉ部位中にサブクローニングし、得られたプラスミドを“ｐＧＥｌ”と命名した。ｐＥｌ　ｃＤＮＡと相同な領域内に位置するＰ　ｖ　ｕ　１１部位の上流にある全部で２４０７ｂｐの配列を決定した。この配列を配列番号８に示す。プライマー伸長によって、転写開始はこの配列の位置２２１１にあることが判明した。ＴＡＴＡボックスは、位置２１８１と２１８７の間に位置すると推定され、翻訳開始コドンは位置２２６４に位置する０位置２２６４の上流の配列は、問題のコーディング配列のめ特異的、特にタベータム特異的発現のためのプロモーター領域ＰＥＩとして使用することができる。このプロモーター領域の好ましい部分は位置的５７２から位置的２２６３に広がると見られるが、プロモーター領域は、位置１〜２２６３の全配列を含んでもよい、朽特異的プロモーターとして作用し得る最小領域は、配列番号８において位置２２６４の上流の約３００〜５００ｂｐに広がると考えられる。夾」Ｌ理」− の１．　プロ　−−一）　へ　プロモー　−セ・・　の実施例２の５つのめ特異的遺伝子の各々の、プロモーターを含む５°調節配列を、ｐＭＡＣ５−８Ｃ欧州特許出願第８７４０２３４８．４号〕のポリリンカー中にサブクローニングした。これにより、特定部位突然変異誘発反応に使用するための一重ＨＤＮＡを単離するのに使用するベクターが生成された。特定部位突然変異誘発〔欧州特許出願第８７４０２３４８．４号〕を使用し、各豹特異的遺伝子の５°調節配列のＡＴＧ翻訳開始コドンを取り巻く配列を修飾して、対応認識部位が各雄性不稔及び聴性回復ＤＮＡの５′末端（これらは後述する実施例４において５°調節配列に結合される）にある固有の制限酵素認識部位を生成した。得られた各プラスミドは新たに生成された制限部位を含んでいた。各々新たに生成された制限部位を挟む正確なヌクレオチド配列を決定し、それが、対応するコメ朽特異的遺伝子の５′調節配列とは、新たな制限部位を生成した置換箇所しか異ならないことを確認した。え１１Ｌ３のプロモー　−セ・・ト　２の、。ロ　−−１）ム　づ　べ　− 欧州特許出願第８９４０１１９４．９号及び第９０４０２２８１．１号に記載の方法により、実施例３のプロモーターカセットを使用して、本発明の外来キメラＤＮＡ配列を含む植物形質転換ベクターを構築した。各ベクターは、実施例２で単離した５つの豹特異的遺伝子の各々に対応する朽特異的プロモーターの１つを含む５°調節配列を含んでいる。５°調節配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍ　１ｏｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓｃＨａｒｔｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒ。ｇｅｒｓｏｎ（１９７２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌ（３）、２４３−２５０）由来のｂａｒｎａｓｅをコードする雄性不稔ＤＮＡ　（欧州特許出願箱８９４０１１９４．９号〕またはｂａｒ’５ｔａｒｃＨａｒｔｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓｏｎ（１９７２）、ｌ、−［；Ｈａｒｔｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｗｅａｔｏｎ（１９７３）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　ＩＬ支（１６）、５６２４−５６２６〕をコードする稔性回復ＤＮＡ　（欧州特許出願箱９０４０２２８１．１号〕のいずれかの上流にあり、それと同じ転写単位内にあり、そしてそれを制御する。各雄性不稔または稔性回復ＤＮＡの下流にはツバリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）シンターゼ遺伝子（Ａｎ　ｅｔ　ａｊ（１９８５）ＥＭＢＯＪ、４（２）、２７７〕の３’末端がある。各キメラＤＮＡ配列は更に、ホスフィノトリシン耐性をコードするｓｆｒ遺伝子〔欧州特許出願箱８７４００５４４．０号〕及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄＳｃｈｅ　ｌ　１　（１９８５）ＮＡＲＬｌ、６９８７）の３′末端シグナルにフレーム内で結合された３５８３プロモーター（Ｈｕｌｌ　ａｎｄ　Ｈｏｗｅｌｌ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６，４８２−４９３）を含む。え１１１の　ペー　ム、　ロ・プロモー　−の　こｂａｒｓ　Ｃａｒ　−ベ　−の本発明のタペータム特異的ＰＴ７２プロモーター（実施例２）の制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡ（Ｈａｒｔｌｅｙ　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓｏｎ（１９７２）ＩＬ）と、３５Ｓ３プロモーター〔欧州特許公開第０．３５９．６１７号〕の制御下にある除草剤耐性遺伝子ｂａｒ〔欧州特許公開第０．２４２，２３６号〕とを担っておりコメ（実施例７）及びトウモロコシ（実施例８）の形質転換に使用することができる適当なベクターを、以下に概略を説明する４ステツプからなる方法で構築した。配列番号９に示した配列を有するプラスミドｐＶＥ１０８を使用した。スｊ！Ｌグ」− Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ−ＤＮＡのｎｏｓ遺伝子の３゛非翻訳末端を担うＤＮＡフラグメントを、プライマーとして下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬ３及びＣＡＳＯＬ４）を用いたポリメラーゼ連頒反応〔ＰＣＲ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）、１Ｊｉ）によってｐＶＥ１０８から増幅した。ＣＡＳＯＬ３　：５°　−ＴＧＣＣＣＡ　ＴＣＧ　Ａ［；［；　にＴ＾　＾ＣＣＴＣＣにへ＾　ＧＣＡ　にＡＴ　ＣにＴ　ＴＣ＾−３゜ＣＡＳＯＬ４：５’−ＣＣＡ　＾丁Ｔ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＣＡＣにＴＧ　ＴＴＣＣＣに　ＡＴＣＴＡ’Ｇ　Ｔ＾＾　ＣＡＴ−３’得られたフラグメントを回収し、ＥｃｏＲＩ及びＮｃ。 ■で切話し、同じ酵素で切断したプラスミドｐＶＥ１０８の大フラグメントに連結し、プラスミドｐＴｓＸ１１を得た。ムｌ！Ｌｚ」− タペータム特異的プロモーターＰＴ７２及びｂａｒｓｔａｒ遺伝子を含むフラグメントを以下のように構築した。１）ｂａｒｓｔａｒコーディング配列を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーとして下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬｌ　３Ｔ７２及びＣＡＳＯＬｌ４）を用いたＰＣＨによってｐＭＴ４１６　ＣＨａｒｔ　ｌｅｙ　（１９８８）Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、２０２，９１３）から増幅した。ＣＡＳＯＬ１３Ｔ７２　：５°−Ｃ［；Ｇ　ＣＡ（：＾＾ＣＡＣＡ　ＣＴＣＡＣ（：　にＣＧ　ＡＴＣ＾晶＾＾＾にＣＡ　ＧＴＣＡＴＴ＾＾Ｃ−３′ＣＡＳＯＬ１４：５’　−Ｇ［：に　ＣにＴ　ＴＡＣＣＴＴ＾＾Ｃ晶＾にＴＡ　Ｔ（：Ａ　ＴＧＣＴＧ＾−３゜２）実施例２のＰＴ７２プロモーターの制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディング配列を担うＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてｉ）ステップ１のゲル精製ＰＣＲ産物、１ｉ）ＣＡＳＯＬｌ４、及び１ｉｉ）下記のオリゴヌクレオチド（７７２ＰＯＬ１）を用いたＰＣＨによってｐＴ７２（実施例２）から増幅した。７７２ＰＯＬ１５°−ＴＧ［；　ＣＣＡ　ＴＣＧ　Ａ（：ＣＴＡＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＣＡＧ＾＾ＣＡＧＧ　ＡＴＡ　ＧＣ＾＾−３゜最終的なフラグメントは、ＰＴ７２プロモーターの制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディング配列だけでなく、５ ′末端にはＭｓｃ　１．Ｎｃｏ　Ｉ−Ｎｈｅ　Ｉ及びＮｏｔＩに対する制限部位を含むリンカ−配列を、３′末端にはＢｓｔＥＩＩ制限部位及び３ヌクレオチドのスペーサー（ＧＧＧ）をも含む。匹ｊし二２ゴしステップ２の最終フラグメントを回収し、ＮｃｏＩ及びＢｓｔＥＩＩで切断し、同じ酵素で切断したプラスミドｐＴＳＸＩＩ（ステップ１）の大フラグメントに連結し、プラスミドｐＴｓＸ１１−Ｔ７２を得た。区ｊ二り工Ａ− ３５８３プロモーターを含むフラグメントを、プライマーとして下記の２つのオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによってｐＤＥ９　Ｃ欧州特許公開第０．３５９．６１７号〕から増幅した。５’　−Ｔ（：Ｇ　ＣＣＡ　ＴＣＣＴＴＡ　ＴＡに　ＡＧＡ　ＣＡに　ＡＧＡ　ＴＡ［；　ＡＴＴ　Ｔ−３′５′−Ｇ＾＾にＣＴ　ＡＧＣ＾＾Ｔ　ＣＣＣＡＣＣ＾Δ＾＾ＣＣＴＣ＾＾ＣＣＴ−３゜得られたセグメントを回収し、ＮｃｏＩ及びＮｈｅｌで切断し、同じ酵素で切断したｐＴｓＸｌ　１−Ｔ７２　（ステップ３）の大フラグメントに連結し、得られたプラスミドを“ｐＪＶＲｌ−７７２”と命名した。ＰＴ７２プロモーターに代えてＰＥＩプロモーターを用いて構築するため、ステップ２においてＣＡＳＯＬ１３Ｔ７２及びＴ７２ＰＯＬ１に代えて下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬｌ　３Ｅ１及びＥＩＰＯＬＩ）をそれぞれ使用し、上述の４ステツプ法を実施した。ＣＡＳＯＬ１３Ｅ１　：５’　−ＧＡＧ　ＡＴＣＣＡＴ　ＣＡＡＧＣＣＧＴＣにＣに　ＡＴＧ＾＾＾＾＾＾ＧＣＡ　ＣＴＣＡＴＴ＾＾Ｃ−３゛ＥＩＰＯＬＩ　：５°−Ｔ（：ＩＩ：　ＣＣＡ　Ｔにに　ＡにＣＴＡに　Ｃｆ；Ｇ　ＣＣに　ＣＡ（：　ＡＴＣＣＴＴ　ＣＴＧ　ＴにＴ　ＣＡＴ　ＴＣ−３゜ステップ３後に得られたプラスミドを“ｐＴＳＸｌｌ−Ｅｌ”と命名し、ステップ４後に得られたプラスミドを“ｐＪＶＲｌ−Ｅｌ”と命名した。ＰＴ７２プロモーターに代えてＰＴ４２プロモーターを用いて構築するため、下記の点を変更して上述の４ステツプ法を実施した。１）ステップ２においてＣＡＳＯＬ１３Ｔ７２及びＴ７２ＰＯＬ１に代えて下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬ１３Ｔ４２及びＴ４２ＰＯＬ１）をそれぞれ使用した：ＣＡＳＯＬ１３Ｔ４２　：５’　−ＣＡＡ　ＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　Ｔ（：＾＾＾＾＾＾Ｇ　ＣＡＣＴＣＡ　ＴＴ＾＾Ｃ−３゛７４２ＰＯＬ１　：５−ＣＣＴ　Ａｌｌ：ＣＧ［；ＣＣＧＣＡＴＣＧＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＣＣＧＣＣＡＧ−３゜２）ステップ２で得られたフラグメントを以下のようにｐＴｓＸｌｌ（ステップ３）中に挿入した：フレノウを用いてフラグメントをプラント末端にし、ＢｓｔＥＩＩで切断し、次いで、（フレノウを用いて充填した）Ｎｃｏｒ及びＢｓｔＥｒＩで切断したｐＴｓＸｌ　１の大フラグメントに連結した。得られたプラスミドを“ｐＴｓＸｌ　１−７４２”と命名した。３）３５Ｓ３プロモーターの制御下にあるｂａ工」包子を担うｐＪＶＲｌ−Ｔ７２のＮｏｔＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを、同じ酵素で切断したｐＴｓＸｌ　１−ＴＡ２の大フラグメントに連結した。得られたプラスミドを“’ｐＪＶＲ１−７４２”と命名した。プラスミドｐＵｃＮｅｗｌ　（実施例６）から出発して他の構築物も作製した。まず、ｐ　Ｕ　ＣＮ　ｅ　ｗ　ｌ上に存在するｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡ′６：Ｘｈｏ　Ｉで消化することにより除去し、再度連結し、プラスミドｐ　Ｕ　ＣＮ　ｅ　ｗ２を得た。各々がコメ朽特異的プロモーターの制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡと３５８３プロモーターの制御下にあるｂａ＋ −遺伝子とを担う、ｐ　ＪＶＲ１−Ｔ７２、ｐＪＶＲｌ−Ｅｌ及びｐＪＶＲｌ− Ｔ４２由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄｌｌＩフラグメントを、ｐＵＣＮｅｗ２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ１１部位に挿入し、それぞれｐＪＶＲ３−Ｔ７２、ｐＪＶＲ３−Ｅｌ、ｐＪＶＲ３−ＴＡ２を得た。それぞれ実施例７及び８に記載したようにコメ及びトウモロコシを形質転換するために、プラスミドｐＪＶＦ１３−Ｔ７２、ｐＪＶＲ３−ε１、ｐＪＶＲ３−ＴＡ２、ｐＪＶＲｌ−Ｔ７２、ｐＪＶＲｌ−Ｅｌ及びｐＪＶＲｌ−ＴＡ２を使用した。公知のＴ−ＤＮＡベクターｐＧＳＣ１７００またはＰＧＳＣ１７０１ＡのＨｉｎｄｌｌＩ及び（フレノウを用いて充填した）ＸｂａＩ部位間に（３５Ｓ３−ｂ立工汲びコメ豹特異的プロモーターｂａｒｎａｓｅキメラ遺伝子を含む）ｐＪＶＲｌ−７７２、ｐＪＶＲｌ−Ｅｌ及びｐＪＶＲｌ−ＴＡ２の適当な（フレノウを用いて充填した）　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒｌ−Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメントをクローニングすることにより、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　介ｇｅｔ形質転換用のＴ−ＤＮＡベクターを作製した。ｐＧｓｃ１７００は、１９８８年３月２１日ｆ寸けでｔｈｅ　Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｆｉｉｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒｗｅｇ　ＩＢ、Ｄ−３３０Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅ　ｉ　ｇ、Ｇｅ　ｒｍａｎｙにＤＳＭ寄託番号４４６９で、またｐＧｓｃ１７０１Ａは１９８７年１０月２２日付けでＤＳＭにＤＳＭ寄託番号４２８６で寄託されている。実施例９に記載のごとくタバコを形質転換するためにこのＴ−ＤＮＡベクターを使用した。因４１脛Ｊ工の　ペー　ム、ブロモ−−の　に　７ｂａｒｎａｓｅ　ｐ　ベ　−の実施例２のタペータム特異的ＰＴ７２、ＰＴ４２及びＰＴＥ１プロモーターを、実施例４のｂａｒｎａｓｅコーディング雄性不稔ＤＮＡ及びｂａｒｓｔａｒコーディング稔性回復ＤＮＡを含む植物形質転換ベクター中に直接クローニングした。配列番号９に示した配列を有するプラスミドｐＶＥ１０８を使用した。プラスミドは、３５８３プロモーター〔欧州特許公開箱０．３５９．６１７号〕の制御下にあり且つツバリンシンターゼ遺伝子の３゛調節配列を有する１１ＬＪ伝子〔欧州特許公開箱０．２４２，２３６号〕と、Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍのＴＡ２９遺伝子〔欧州特許公開箱０．３４４，０２９号〕のタベータム特異的プロモーターの制御下にあり且つツバリンシンターゼ遺伝子の３゛調節配列を有するｂａｒｎａｓｅ遺伝子とを含むキメラ遺伝子を含む、ｂＵＪＪｉ伝子の構包子発現のためには、欧州特許公開箱０．３５９，６１７号に記載のものとは５５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−３ｔｕＩが欠失していることが異なる等価の３５８３プロモーターも使用される。まず、（Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼエの大フラグメントークレノウを用いて充填した）プラスミドｐＶＥ１０８の大きなＮｃｏＩフラグメントを、プライマーとして２つのオリゴヌクレオチド：５゛−＾ＴＴ　ＡＴＡ　ＧＡＧ　ＡにＡ　ＧＡＧ　ＡＴＡ　にＡＴ　ＴＴ−３゜５’−ＧＣ＾＾ＴＣＣＣＡ　ＣＣ＾＾＾＾ＣＣＴ　にＡＡ　ＣＣＴ−３゜を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した、欧州特許公開箱０．３５９，６１７号に記載の３５８３プロモーターのフラグメントに連結した。ｂａｒｎａｓｅ遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コドンのところにＮｃｏＩ部位が再構築されているプラスミドを“ｐＶ２１０８ｄｅｌ”と命名した。このプラスミドではｂａ工】包子ＡＴＧ翻訳開始コドンの位置のＮｃｏＩ部位が失われている。次いで、ｐＶＥ１０８ｄｅｌをＮ　ｃ　ｏ　、Ｉで消化し、フレノウを用いて充填し、下記のＤＮＡフラグメントのいずれかに連結した：１、下記のプライマーを用いてｐＧＴ７２からＰＣｒ（増幅して得られた１６０２ｂｐのフラグメント。５゛−＾ＴＴ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　＾＾Ｃ八ＣＧ　ＡＴＡ　ＧＣ−３゜５’−ＧＣＣＧＴｆｌ：　ＡＧＴ　ＣＴＣＴＴＣＴ（：ＣＣＧ−３゜ｐＧＴ７２由来のプロモーターフラグメントがｂａｒｎａｓｅコーディング配列に対して適正に配置されている得られたプラスミドをｐＶＥ１０８−Ｔ７２”と命名した。２、下記のプライマーを用いてＰＧＴ４２からＰＣＲ増幅して得られた１５３２ｂＰのフラグメント。５’−ＣＣＡ　ＴＧＣＣＡＧ　ＡＧＣＡＣＧ　ＧＣＣＡＧ−３′５’−ＧＴＣにＴＣＴＡＧ　Ｔ（：ＧΔＣＧ　ＡＧに　ＧＣＡ　ＣＴＴ　Ｇ−３’ｐＧ７４２由来のプロモーターフラグメントがｂａｒｎａｓｅコーディング配列に対して適正に配置されている得られたプラスミドを°’ｐＶＥ　１０８−Ｔ４２”と命名した。３、下記のプライマーを用いてｐＧＥｌからＰＣＲ増幅して得られた１６９０ｂｐのフラグメント。５’−ＣＣＴ　ＣＡＩＩ：　ＡＴＣＣＴＴ　ＣＴに　ＴにＴ　に＾−３゜５°− にＣＧ　ＡＣＧ　ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＴＧＧ　ＡＴＣＴＣＴ　ＴにＣ−３’ｐＧ７７２由来のプロモーターフラグメントがｂａｒｎａｓｅコーディング配列に対して適正に配置されている得られたプラスミドを“ｐＶＥ１０８−Ｅｌ”と命名した。また、この実施例の上記プライマーを使用し、コメゲノム゛ＤＮＡから直接ＰＣＲ増幅することにより得られた対応プロモーターフラグメントをｐＶＥ１０８ｄｅｌ中にクローニングすることにより、プラスミドｐＶＥ１０８−Ｔ７２、ｐＶＥ１０８−Ｔ４２及びｐｖＥ１０８−Ｅｌを直接得た。また、本発明のタベータム特異的プロモーターＰＴ７２、ＰＴＥ　１またはＰＴ４２（実施例２）の制御下にあるｂａｒｎａｓｅコーディングＤＮＡと、３５Ｓ３プロモーターの制御下にあるｂａＬＪ伝子と包子っており、コメ（実施例７）及びトウモロコシ（実施例８）の形質転換に使用し得る適当なベクターを、実施例５の４ステツプ法によって構築した。しかしながら、ステップ２で使用したオリゴヌクレオチドは、ｂａｒｓｔａｒ遺伝子にではなくてｐＭＴ４１６中のｂａｒｎａｓｅ遺伝子に相補的であった。この点に関して言えば、ＣＡＳＯＬｌ　３Ｔ７２はＣＡＳＯＬＩ５Ｔ７２”Ｉｆき換え、ＣＡＳＯＬ１３Ｔ４２ＧＩＣＡＳＯＬ１５Ｔ４２ｔ’置き換え、ＣＡＳＯＬＩ　３Ｅ　１はＣＡＳＯＬ１５Ｅ１で置き換え、ＣＡＳＯＬｌ４はＣＡＳＯＬｌ６で置き換えた。これらの置き換えたオリゴヌクレオチドは下記の通りである。ＣＡＳＯＬ１５Ｔ７２　：５°−ＣにＧ　ＣＡＧ＾＾［：　ＡＣＡ　ＣＴＣＡＣに　ＧＣＣＡＴに　にＴＡ　ＣＣＧ　ＧＴＴ　ＡＴＣ＾＾Ｃ＾ＣＣ−３’ ＣＡＳＯＬ１５Ｔ４２　：５゛−Ｃ＾＾　ＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＴ　ＡＧＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＴＧに　ＴＡＣＣＧＧ　ＴＴ＾ＴＣ＾＾ＣＡ　ＣＧ−３’ ＣＡＳＱＬ１５Ｅ１　：５°−ＧＡＧ　ＡＴＣＣＡＴ　Ｃ＾＾にＣＣにＴＣにＣに　ＡＴに　ＧＴＡ　ＣＣＣにＴＴ　ＡＴＣ＾＾Ｃ＾ＣＧ−３” ＣＡＳＯＬｌ６　：５°−ＧにＧ　ＧにＴ　ＴＡＣＣＴＴ　八ＴＣＴＧＡ　ＴＴＴ　ＴＴに　ＴＡ＾　ＡＧＣＴＣＴ　Ｇ−３’ステツプ４後に得られた最終的な構築物をそれぞれ° ゛ｐＪＶＲ２−Ｔ７２”、”ｐＪＶＲ２−Ｅｌ”及び”ｐ　ＪＶＲ２−７４２” と命名した。ｂａｒｎａｓｅコーディングＤＮＡを含む全てのベクター構築物を、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＷＫ６においてプラスミドｐ′ＭＣ５−ＢＳ中に作製した。プラスミドｐＭｃ５−ＢＳは、ｔａｃプロモーター（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）ＰＮＡＳ　８０，２１）の制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡ遺伝子を含んでおり、ｐＭＴ４１６（Ｈａｒｔｌｅｙ　（１９８８）Ｊ、Ｍｏ１．ＢＬｏｌ。ＩＬ？、−、９１３）のＥｃｏＲＩ−Ｈｉ　ｎｄｌｌＩフラグメントを、ｐＭｃ　５−８　（１９８８年５月３日イ寸けでＤＳＭにＤＳＭ寄託番号４５６６で寄託されている〕中にクローニングすることにより構築しな、ＰｈｏＡシグナル配列から始まりｂａｒｓｔａｒコーディング領域の翻訳開始コドン直前のヌクレオチドで終わる配列を、５ｏｌＪａｚｉ　ｅｔ　ａｌ（１９８５）Ｇｅｎｅ　１Ｌ、１９９に記載の一最方法に従うループアウト突然変異誘発（ｌｏｏｐｉｎｇ− ｏｕｔ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって欠失させた。ｐＭｃ５−ＢＳ上にキメラｂａｒｎａｓｅコーディング配列及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を担うｐＵｃ１８誘導プラスミドにおいてアンピシリン耐性遺伝子が可能となることで、２種の抗生物質が与えられたプレート上で株を安定に維持することができたり、任意の１つのプラスミドを選択することができる。正常に抑制されていれば、このプロモーターからの遺伝子発現は、−ｉに使用されるｌａＣオペロンインデューサーＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド）を付加することにより誘導することができる。或いは、ｔａｃプロモーターの制卸下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡを、本発明のコメ豹特異的プロモーターの制御下にあるｂａｒｎａｓｅコーディングＤＮＡを担うものと同じプラスミド中に、以下のように挿入した。第１ステツプにおいては、下記の３つのＤＮＡフラグメントを連結することにより新たなプラスミドを構築したニーｐＵｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔａｌ　（１９８５）Ｇｅｎｅ　１Ｌ、１０３）由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬ９及びＣＡＳＯＬｌｌ）を用いたＰＣＲによってｐＵｃ１９から増幅した。ＣＡＳＯＬ９二５’　−ＣＣＡ　＾ＴＴ　Ｃ＾＾　ＧＣＴ　丁（：Ａ　ＣＧＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣＧＣＡ　ＣＴＴ−３’ＣＡＳＯＬＩＩ　：５’　−ＴＧＣＧＧＡ　（：ＴＡ　ＡＧＣＴＣＧ　Ａ（：ＣＣ＾＾　＾＾＾　ＧにＡ　ＴＣＴ　ＴＧＡＣＣＴ　ＡＧ−３’ −ｐＵｃ１９の複製開始点を含む別のＤＮＡフラグメントを、下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬｌ　０及びＣＡＳＯＬｌ２）を用いたＰＣＨによってｐＵｃ１９から増幅した。ＣＡＳＯＬＩＯ：５’−ＧＧ＾＾ＴＴ　ＣＴに　ＡＴＣＡにに　ＣＣ＾＾ＣＧ　ＣＧＣＧにＧ　ＧＡＣ−３’ＣＡＳＯＬＩＺ　：５’−ＴＣＴＴ＾＾ＴＡＣＧＡＴ　Ｃ＾＾ＴにＧ　ＣＴＣ（：Ａに　ｉｃｙ　ＣＡＴ　ＧＡＣＣＡＡ　ＡＡ丁　ＣＣＣ丁ＴＡ−３’ −ｔａｃプロモーターのｌ１１ｇ１下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡを含む更に別のＤＮＡフラグメントを、下記の２つのオリゴヌクレオチド（ＣＡＳＯＬｌ７及びＣＡＳＯＬｌ８）を用いたＰＣＨによってｐＭｃ５−ＢＳから増幅した。ＣＡＳＯＬｌ７　：５’　−ＣにＣＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＣＣＣＣＡＴ−３’ＣＡＳＱＬ１８　：５°−ＣＣ（：　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＣＡ　ＴＴに　ＡＴＣＧＴＡ　ＴＴ＾　八Ｇ＾−３゜上記３つのフラグメントをＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、相互に連結した。得られたプラスミドは、ｐＵｃ１９に類似であるが、ｌａｃ領域が欠失しており、ポリリンカーが変性されており、β−ラクタマーゼ遺伝子とｐＵＣ１９の複製開始点との間に挿入されたｔａｃプロモーターの制御下にあるｂａｒｓｔａｒコーディングＤＮＡ（このＤＮＡはβ−ラクタマーゼ遺伝子と同じ向きである）を有しており、これを“ｐＵｃＮ’ｅｗｌ”と命名した。各々が、本発明のコメ豹特異的プロモーターのいずれかの制御下にあるｂａｒｎａｓｅコーディングＤＮＡと３５８３プロモーターの制御下にあるｂａ工遺伝子とを担う、ｐＪＶＲ２−Ｔ７２、ｐＪＶＲ２−Ｅｌ及びｐＪＶＲ２−Ｔ４２由来のＥｃｏＲＩ− ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのそれぞれをｐＵ　ＣＮ　ｅ　ｗ　ｌのＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ１１１部位に挿入し、それぞ１ＰＪＶＲ４−７７２、ｐＪＶＲ４− Ｅｌ及びＰＪＶＲ４−Ｔ４２を得た。それぞれ実施例７及び８に記載のごとくコメ及びトウモロコシを形質転換するため、プラスミドｐＶＥ１０８−Ｔ７２、ｐＶＥ１０８−Ｔ４２、ｐＶＥ１０８− Ｅｌ、ＰＪＶＲ２−Ｔ７２、ｐＪＶＲ２−Ｔ４２、ｐＪＶＲ２−Ｅｌ。ｐＪＶＲ４−７７２、ｐＪＶＲ４−Ｔ４２及びｐＪＶＲ４−Ｅｌを使用した。（３５Ｓ３−ｂａｒ及びコメ豹特異的７０−Ｔニー９−−　ｂａｒｎａｓｅキメラ遺伝子を含む）ｐＶＥ１０８−Ｔ７２、ｐＶＥ１０８−Ｔ４２、ｐＶＥ１０８＝Ｅ１、ｐＪＶＲ２−Ｔ７２、ｐＪＶＲ２−Ｔ４２、ｐＪＶＲ２−Ｅｌ、Ｐ、ＪＶＲ４−Ｔ７２、ｐＪＶＲ４−Ｔ４２及びｐＪＶＲ４−Ｅｌの適当な（フレノウを用いて充填した）　Ｅ　ｃ　ｏ　ＰＬ　Ｉ　ＸｂａＩフラグメントを、公知のＴ−ＤＮＡベクターｐｃｓＣ１７００（ＤＳＭ４４６９）またはｐＧＳ（’１７０１Ａ（ＤＳＭ４２８６）のくフレノウを用いて充填した）ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｂａＩ部位の間にクローニングすることにより、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｔｕｍ　介植物形質転換用のＴ−ＤＮＡベクターを作製した。このＴ−ＤＮＡベクターを実施例９に記載のタバコの形質転換に使用した。１ｍ６の　ベ　−二　コメの転」ＬＤａｔｔａ　ｅｔ　ａｌ（１９９Ｑ）、ＬｊＬによって記載された方法を使用し、コメ系統０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ変種Ｃｈｉｎｓｕｒａｈ　ｂｏｒｏ　ＩＩの原形質体を、実施例５及び６に記載の植物形質転換ベクターによって形質転換し、原形質体から形質転換植物を再生した。また、コメ変種Ｇｕｌｆｍｏｎｔ、Ｌｅｍｏｎｔ、ｌＲ２６、ｌＲ３６、Ｉ　Ｒ５４及びｌＲ７２由来の未熟胚を、実施例５及び６の適当なプラスミドＤＮＡを担う金粒子で攻撃し、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ　ｅｔ　ａｌ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９，９５７によって記載された方法によって胚から形質転換植物を再生した。この点に関して言えば、雄性不稔ＤＮＡ及び雄性損性回復ＤＮＡを用いた形質転換を、ｐＪＶＲ２−Ｔ７２、ｐＪＶＲ２−Ｅｌ、ｐＪＶＲ２− Ｔ４２、ｐＶＥ１０８−Ｔ７２、ｐＶＥ１０８−Ｅｌ、ｐＶＥ１０８−Ｔ４２、ｐＪＶＲｌ−Ｔ７２、ｐ　ＪＶＲ１−Ｅ　１及びｐＪＶＲｌ−７４２（実施例５及び６）を使用して、直接に、または、ＰＴ７２を含む７ラスミド及びＰＴ４２を含むプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＥＩを含むプラスミドをＥｃ。ＲＩ及びＰｓｔｌで消化して適当に直線化してから、実施した。またかかる形質転換は、雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡと選択可能なマーカーＤＮＡとを含む本発明の外来ＤＮＡ配列によッテ、ｐＪＶＲ４−Ｔ７２、ｐＪＶＲ４−Ｅｌ、ｐＪＶＲ４−Ｔ４２、ｐＪＶ、Ｒ３−Ｔ７２、ｐＪＶＲ３−Ｅｌ及びｐＪＶＲ３−Ｔ４２　（実施例５及び６）を使用し、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、次いでアガロースゲル電気泳動またはスクロース勾配遠心分離によって大きさにより分画してから実施してもよい、そうすると、各外来配列を回収し、ＸｈｏＩで消化することができ、そうしたら、フラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰを用いた反応において充填し、酵素な熱失活させた後、ＤＮＡをＥｃｏＲＩで更に消化し、ストレプトアビジンアガロースカラムＣＳ　ｉ　ｇｍａ）またはストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｐｒｏｍｅｇａ）においてビオチニル化Ｘ　ｈ　ｏ　Ｉ末端を除去する。雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡのいずれかを＃御する実施例２のタベータム特異的ＰＴ７２、ＰＴ４２またはＰＥＩプロモーターを含む各形質転換植物は、花を除いて正常である。この点に関して言えば、タベータム特異的プロモーターの制御下にある雄性不稔ＤＮＡを含む各植物は、タペータム細胞中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成せず、タベータム特異的ブロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡを含む各植物はタペータム細胞中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成する。１厳匠Ｌ６の　′　ベ　−に　ト　モロコン１」１！１」１Ｆｒｏｍｍ　ｅｔ　ａｔ（１９９０）：ｌによって記載された方法を使用し、Ｂ　７３　Ｘ　ＬＬ支鉦）ウモロコシ系統の胚形成（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ）浮遊培養体を、実施例５及び６に記載の植物形質転換ベクターを用いて形質転換し、胚形成浮遊培養体から形質転換植物を再生した。また、ｌヱユ−ＸＡ上旦玉訃ウつロコシ系統由来の未熟胚を、実施例５及び６の１ラスミドＤＮＡを担う金粒子を用いて形質転換し、実施例７に記載のごとく胚から形質転換植物を再生した。雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡのいずれかを制御する実施例２のタペータム特異的プロモーターＰＴ７２、ＰＴ４２またはＰＥＩを含む各形質転換植物は花を除いて正常であった。この点に関して言えば、タベータム特異的プロモーターの制御下にある雄性不稔ＤＮＡを含む各植物は、タペータム細胞中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成せず、タベータム特異的プロモーターの制御下にある稔性回復ＤＮＡを含む各植物はタペータム細胞中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成する。えＬ匠Ｌ６の　多　ベ　−に　７　バフ０ｍ工欧州特許出願第８９４０１１９４．９号及び第９０４０２２８１．１号に記載の方法を使用し、実施例４，５及び６で得られた外来キメラＤＮＡ配列を含む植物形質転換ベクターを用いてＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒＬｕｍ　介移入することにより形質転換した。各々が雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡのいずれかを制御する実施例２の朽特異的プロモーターのいずれか１つを含む形質転換タバコ植物は花を除いて正常であった。この点に関して言えば、豹特異的プロモーターの制御下にある雄性不稔ＤＮＡを含む各植物は、豹中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成せず、豹特異的プロモーターの制御下にある雄性損性回復ＤＮＡを含む各植物はめ中で少なくとも優勢にかかるＤＮＡを発現し、従って正常花粉を生成する。言うまでもなく、本発明のめ特異的コメプロモーターの使用は特定の植物の形質転換に制限されることはない、コメプロモーターは、遺伝子発現を制御し得る任意の穀物、好ましくはかかる発現が穀物の雄すい細胞において少なくとも優勢、好ましくは特異的に起こる任意の穀物に有効となり得る。更に本発明のプロモーターの使用は、雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡの制御に制限されることはなく、雄ずい細胞において任意の遺伝子の発現を選択的に制御するために使用することができる。更に本発明は、上記実施例に記載の、特定の雄ずい特異的、好ましくはめ特異的、特にタベータム特異的プロモーターに制限されることはない、むしろ本発明は、植物の雄すい細胞、好ましくはめ細胞、特にタペータム細胞において雄性不稔ＤＮＡまたは稔性回復ＤＮＡのような構造遺伝子の発現を選択的に制御するために使用し得る実施例２のものに等価のプロモーターを包含する。実際、実施例２の各プロモーターのＤＮＡ配列は、雄ずい細胞、特に朽細胞の転写アクチベーターを含むポリメラーゼ複合体のプロモーターを認識する能力を実質的に変性しないという条件で、ヌクレオチドの一部を他のヌクレオチドで１き換えることにより改変することができる。表１：選択された種々のクローンのプロフィール表１＾表ＩＢ表ＩＣ注釈ニー不穏基部の細分類：１：６〜６．５鵬−の“白色”不穏。２ａ、２ｂ、２ｃ　：　３〜５ｍｓの未熟不穏；３つの分類は、同じタイプの組織の異なるバッチ由来の異なるａ＋ＲＮ＾試料に対応する（不穏基部の！！製物は豹残渣が混入していた可能がある）。 −１〜９は発現レベルに対応しており、０はバックグラウンド（挿入物のないｐＧＥＭ２を用いて得られるハイブリダイゼーション）以下のハイブリダイゼーションレベルに相当する。一空白箇所：未測定。一輪ＲＮ＾サイズ：ノザンプロットによって測定した値。 −コピー数：試験した制限酵素（＾ｖａｌ、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌｌＩ。ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄｌＩｌ、Ｋｐｎｌ、Ｍｓｐｌ、Ｒｓａｌ及び５ａｃｌ）のうち大部分で消化された＾ｋｉｈｉｋａｌｉ葉ゲノムＤＮ＾のサザンプロットにおいてｃＤＮ＾挿入物をプローブとして用いて検出されたハイブリダイジングバンド数に対応する。配列表１．一般情報ｉ　）　出願人：　ＰＬＡＮＴ　ＧＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭＳ　ＮＪ。ｉｉ）発明の名称：コメ由来の雄ずい特異的プロモーター１ｉｉ）配列の数＝９配列番号１　：　ｃＤＮＡ　Ｔ７２配列番号２　：　ｃＤＮＡ　Ｔ２３配列番号３　：　ｃＤＮＡ　Ｔ４Ｚ配列番号４　：　ｃＤＮＡ　ＴｉＳ２配列番号５　：　ｃＤＮＡ　Ｅｌ配列番号６　：　ｃＤＮＡ　Ｔ７２にハイブリダイズしたゲノムＤＮΔ配列番号７　：　ｃＤＮＡ　Ｔ４２にハイブリダイズしたゲノムＤＮ＾配列番号８　：　ｃＤＮＡ　ＥｌにハイブリダイズしたゲノムＤＮ＾配列番号９ニブラスミドｐＶＥ１０８ｉｖ）連絡先二Ａ、宛先：　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｎ、Ｖ。Ｂ、番地：　ＰＩａｔｅａｕｓＬｒａａｔ　２２゜Ｃ１郵便番号及び都市：　９０００　にｈｅｎｔ。０１国名：　Ｂｅｌｇｉｕｍ ■）コンピュータ読取り形式：Ａ、媒体タイプ　５．２５インチ両面高密度１．ＺＭｂフロッピーディスクＢ、コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣ／ＡＴＣ，オペレーティングシステム：　ＤＯＳ　ｖｅｒｓｉｏｎ３．３Ｄ、ラフｌ−ウェア：　ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃＬ５．１ｖｉ）最新出願データ二人手不可能ｖｉｉ）過去出願データ：１９９１年２月８日出願欧州特許出願第９１４００３１８．１号１９９１年９月２７日出願欧州特許出願第９１４０２５９０．３号１９９１年１２月１０日出願欧州特許出願第９１４０３３５２．７号２、配列群ｍ：配列番号１配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：４４６ｂｐ鎖の数：二本鎖トポロジー；直鎖状配列の種類：　ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源：生物基：コメ器官：豹配列の特徴二　−ヌクレオチド（ｎｔＨ〜ｎｔ２１　：クローニングアダプター配列 −ｎｔ２：２〜ｎｔ４２９　：　ｃＤＮＡ　Ｔ７−ｎｔ４３０〜ｎｔ４４６　：クロー二ン′グアダブター配列ｃＤＮＡ配列の最初から始まる読み枠 −ｎｔ２２〜ｎｔ１４４ −ｎｔ２３〜ｎｔ３３４ −ｎｔ２４〜ｎｔｌ１９配列：Ｔ７２と命名されたｃＤＮＡ３、配列群ｍ：配列番号２配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　３４７ｂＰ鎖の数二二本鎖トポロジー二直原状配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源：生物基：コメ器官：豹配列の特徴二　−ヌクレオチド（ｎｔ）１〜ｎｔ３３２　：ｃＤＮＡ　Ｔ２３ −ｎｔ３３３〜ｎｔ３４７　：クローニングアダプター配列配列二Ｔ２３と命名されたｃＤＮＡの一部４、配列詳細：配列番号３配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　２９４ｂｐ鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源：生物名：コメ器官：豹配列の特徴二　−ヌクレオチド（ｎｔ）１〜ｎｔ１６：クローニングアダプター配列 −ｎｔ　１７〜ｎｔ２８４　：　ｃＤＮＡ　Ｔ４−ｎｔ２８５〜ｎｔ２９４　：クローニングアダプター配列配列二Ｔ４２と命名されたｃＤＮＡ５、配列群ｍ：配列番号４配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　２６８ｂＰ鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の檻類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源：生物名：コメ器官二朽配列の特徴二　−ヌクレオチド（ｎｔ）１〜ｎｔ７　：クローニングアダプター配列 −ｎｔ８〜ｎｔ２５３　：　ｃＤＮＡ　Ｔｌ　５−ｎｔ２５４〜ｎｔ２６８　：クローニングアダプター配列配列：Ｔ１５５と命名されたｃＤＮＡ６、配列詳細：配列番号５配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：６１７ｂｐ鎖の数：二本鎖トポロジー二直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ　ｔｏ　ｍＲＮＡ起源：生物名：コメ器官：豹配列の特徴：　−ヌクレオチド（ｎｔ）１〜ｎｔ５８：クローニングアダプター配列 −ｎｔ５９−ｎｔ５９３　：　ｃＤＮＡ　Ｅｌ−ｎｔ５９４〜ｎｔ６１７：クローニングアダプター配列配列二Ｅ１と命名されたｃＤＮＡ７、配列詳細：配列番号６配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　３６２７ｂｐ鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種ｇ［ニゲツムＤＮＡ起源：生物名：０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ配列の特徴：　−ｎｔｌ〜ｎｔ２８４５：豹特異的ＰＴ７２プロモーターを含む配列 −ｎｔ２７６５　ニプライマー伸長によって決定された転写開始部位 −ｎｔ２８４６：Ｔ７２遺伝子の転写のＡＴＧｒＭ始；この位置から下流の配列は配列番号１のｃＤＮＡの配列と重複する。配列：ＧＴ７２と命名された○ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ由来のゲノムＤＮＡＧＡＣＡＡＴＡＣＡＴ　ＣＡＡＧＴλ入ｋＴＣ：　ｋｋｋｃｋ’ＦＩ”Ｗｂ　ｋｋ甲ｅ”ｋＱｈＭ！！”　’Ｆｅ〒ＭｌｌｌＱｌｌ　ＫＭ８．配列群Ｓ：配列番号７配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　２３７０ｂｐ鎖の数二二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：生物基：０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ配列の特徴：　−ｎｔｌ〜ｎｔ１８０８：Ｐｉ特異的ＰＴ４２プロモーターを含む配列 −ｎｔ１７４８〜ｎｔ１７５５　：ＴＡＴＡボックス −ｎｔ１７８０ニプライマー伸長によって決定された転写開始部位 −ｎｔ　１８０９　：　Ｔ４２遺伝子の転写のＡＴ　Ｇ　ｒＭ始、この位置から下流の配列は配列番号３のｃＤＮＡの配列と重複する。配列：　ＧＴ４２と命名された０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ由来のゲノムＤＮＡ１！ｌ’！ａ’ｌ’ａｆｆｌ〒Ｃ〒ＣαＧＧＴＧＣＴ　ＧＣ（：Ｃ（Ｊ’ｆ’ＧＧＡ　ＣＡＴＣＡＣＣσＴＣＴＣＣＴ！’ＣＣＴＧＣ５０ＧＣＧＧＡＧＡＴＡＧ　ＴＴ入ＡＣＧＣＧＧＣＣＣＡＣＧＴ’！’ＧＴＧ　ＣＴＡＴＡＧＣＣＣＧ　ＴＣＡＣ！’ＣＴＣＧＣ１４ｓ。９．配列詳細二配列番号８配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　２４０７ｂｐ鎖の数二二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類ニゲツムＤＮＡ起源：生物基：０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ配列の特徴：　−ｎｔｌ　〜ｎｔ２２６３：ｉ特異的ＰＥＩプロモーターを含む配列 −ｎｔ２１８１〜ｎｔ２１８７　：ＴＡＴＡボックス −ｎｔ２２１１ニプライマー伸長によって決定された転写開始部位 −ｎｔ２２６４　：　Ｅｌ遺伝子のＡＴＧ転写開始部位；この位置から下流の配列は配列番号５のｃＤＮＡの配列と重複する。配列：ＧＥｌと命名された０ｒｙｚａ　５ａｔｉｖａ由来のゲノムＤＮＡＴＧＡＴ入ＧＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＣＡＴ　（：ＣＴ！’ｒＧＴＣＭ　ＴＴＣＡＡＧＴＡＴＣＡＧＴＴＣＴＴＩＴＣ５０〒ｅ’：ｈｈｋ〒ｃｅλｋ　ｋｋｃＣＡｃλＴｃＧ　Ｇｃｗ！１ＣＡＧＡＧＡＧ　ＡＡＧ’！’ｒＡＴＧＡＴ　入ＡＡＡＧＧＣＡＣＴ　１４T０１０、配列群ｍ：配列番号９配列の型：ヌクレオチド配列配列の長さ：　５６２０ｂｐ鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の穫類ニブラスミドＤＮＡ配列の特徴：　−ｎｔｌ〜ｎｔ３９５：ｐＵｃ１８誘導配列 −ｎｔ３９６〜ｎｔ８０２：Ａ　ｒｏｂａｃ　ｔ　ｅ　ｒ　ｉ　ｕｍＴ−ＤＮＡ由来のツバリンシンターゼ遺伝子から誘導されたポリアデニル化部位を含む３′ 調節配列 −ｎｔ８０３〜ｎｔｌ１３８：ｂａｒｎａｓｅ遺伝子のコーディング配列特異的プロモーターから誘導された配列−ｎｔ１６８４〜ｎｔ２５１６　：カリフラワーモザイクウイルス単離体ＣａｂｂＢ−Ｊから誘導された“３５５３　” １０モ一ター配列 −ｎｔ２５１７〜ｎｔ３０６８　：ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｂａｒ）のコーディング配列＝ｎｔ３０６９〜ｎｔ３３５６　：友ＬＬＬｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ−ＤＮＡノパリ〉′シンターゼ遺伝子から誘導されたポリアデニル化部位を含む３’Ｗ節配列 −ｎｔ３３５７〜ｎｔ５６２０　：　ｐＵｃ１８誘導配列配列：　ｐＶＥ４０８と命名ｇｔＬｒ、：、Ｅ　、　ｃ　ｏ　１　ｉ　ＴｖＺオイテ複製可能なプラスミドＤＮＡＣＴＴＴｋ）ｈＧＴｋｋ　ＡＡＡＣＴＴＴＧＡＴ　ＴＴＧＡＧＴＧＡＴＧ　ＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴ　ＧＴＴＡＣＡＣＴＴＩＩ；　１２００ÅＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣｋＧ　ＧＡＡＣＣＧＴＡ入Ａ　ＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴ　ＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴ　コ５ＯＯＴＴ’ｒＣＣＡＴＡＧＧ　ＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡ　ＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴ　ＣＧＡＣＧＣＴＣＭ　３Ｂ５０ＰＣＴ／ＥＰ　９２１００２７４フロントページの続き（５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／８２（３１）優先権主張番号　９１４０３３５２．７（３２）優先日　１９９１年１２月１０日（３３）優先権主張国　欧州特許機構（ＥＰ）ＦＩ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ。ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ（７２）発明者　手鞠　敏彦静岡県磐田郡豊田町東原７００

Claims

【特許請求の範囲】

１．配列番号１のＴ７２ｃＤＮＡ、配列番号２のＴ２３ｃＤＮＡ、配列番号３のＴ４２ｃＤＮＡ、配列番号４のＴ１５５ｃＤＮＡまたは配列番号５のＥ１ｃＤＮＡ、特にＴ７２ｃＤＮＡに対応するＤＮＡ配列を有する遺伝子の上流に置かれる、コメゲノムＤＮＡから単離することができる雄ずい特異的植物プロモーターであって、特に、配列番号６のヌクレオチド２８４６の上流に置かれるプロモーターＰＴ７２、配列番号７のヌクレオチド１８０９の上流に置かれるプロモーターＰＴ４２、配列番号８のヌクレオチド２２６４の上流に置かれるプロモーターＰＥ１。
２．請求項１に記載のプロモーターと、該プロモーターの制御下にある構造遺伝子とを含む、植物を形質転換するのに適した外来の、好ましくはキメラＤＮＡ配列。
３．前記構造遺伝子が雄性不稔ＤＮＡまたは雄性稔性回復ＤＮＡである請求項２に記載の外来ＤＮＡ配列。
４．外来キメラＤＮＡ配列である請求項２または３に記載の外来ＤＮＡ配列。
５．請求項２から４のいずれか一項に記載の外来ＤＮＡ配列を用いて形質転換された植物細胞または植物細胞培養体。
６．実質的に請求項５に記載の植物細胞からなる植物またはその種子。
７．請求項２から４のいずれか一項に記載の外来ＤＮＡ配列を含む請求項６に記載の植物のゲノム。
８．前記構造遺伝子が雄性不稔ＤＮＡである請求項６に記載の雄性不稔植物。
９．前記構造遺伝子が雄性稔性回復ＤＮＡである請求項６に記載の稔性回復植物。
１０．請求項８に記載の雄性不稔植物と請求項９に記載の雄性稔性回復植物とのハイブリッドである雄性稔性回復植物または該雄性稔性回復植物の種子。
１１．単子葉類である請求項６から１０のいずれか一項に記載の植物。