JPH06503717A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規プロテアーゼ 技術分野 本発明は好アルカリ性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の株に由来する洗浄プロ テアーゼの分野りこ属する。より詳しくは、本発明はバチルスｑの株に由来する 新規のアルカリ性プロテアーゼに関する。

更に、本発明はこのプロテアーゼの調製のための方法、洗浄酵素としてのこのプ ロテアーゼの利用、並びに本発明のプロテアーゼを含んで成る洗浄組成物及び洗 浄添加剤に関する。

背景技術 洗浄酵素は２０年以上も前から市販され、そして現在世界中で粉末及び液状洗剤 の両方における正常洗浄成分としてよく確立されている。低温度洗濯の流行に伴 い、洗浄酵素の消費はこの数年間で上昇している。洗剤において用いられている 酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ及びその他の酵素、 又はそれらの混合物を含んで成る。商業的に最も重要なのはプロテアーゼである 。

洗浄プロテアーゼは天然において発見されたプロテアーゼの単離、それに続く洗 剤における試験により開発されている。はとんどの洗浄プロテアーゼバチルス属 の構成員から得られる。現在、種々の特定された条件で優れた価格／性能の比を 提供する可能性を授ける新しいタイプのプロテアーゼが市場に参入している。

商業的プロテアーゼ製品の例はＡＬＣＡＬＡＳＥ　（商標）　、ＥＳＰＥＲＡＳ Ｅ　（商標）及びＳ、ＩＶＩＮＡｓＥ　（商標）であり、これら全てノボ　ノル ディスクＡ／Ｓデンマーク国より供給されている。これら、及びその他の商業起 源に由来する類似の酵素製品は洗浄溶液中で、即ち、封鎖剤、界面活性剤及び漂 白剤、例えばホウ酸ナトリウムの存在下にお０て８〜１１の範囲におけるｐＨ値 にて活性である。ＡＬＣＡＬＡＳＥプロテアーゼはバチルス　リシエニホルミス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｉｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種の株により生産される。

ＥＳＰＥＲＡＳＨ及び５ＡＶＩＮＡＳＥプロテア一ゼ番よアルカリ性バチルス属 の株の培養により得られる。

発明の概要 本発明により、優れた洗浄能力を有する新規な洗浄プロテアーゼが提供される。

第１の観点において、本発明は見かけ上の分子量２９ＫＤ；ｐ＋約８．８；ｐＨ １０〜１２（２５°Ｃで）の範囲におけるｐＨ最適性；４５〜６５°Ｃ（ｐＨ９ ，５）の範囲における温度最適性を有するプロテアーゼを提供する。

他の観点において、本発明は見かけ上の分子量２９ＫＤ；ｐＩＩＯ２８；ｐＨ１ ０〜１２（２５°Ｃ）の範囲におけるｐＨ最適性；４５〜６５°（（ｐＨ９，５ ）の範囲における温度最適性；及び二天止入慮Ｊ　２０　、ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ、 　４０２６２に由来するプロテアーゼと同−又ムよ部分的に同一の免疫化学的性 質を有するプロテアーゼを提供する。より特別な観点において、このプロテアー ゼは、へ−ｆ）Ｌ、７．　Ｊ２０−の株より得られうる。更により特別な観点に おいて、このフ′ロチアーゼ己まへ±土五１丈主主、　ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ、　４ ０２６２　、又はその突然変異体もしくは変異体より得られうる。

第３の観点において、本発明はべ九土囚１丈呈立の株の生物学的に純粋な単離培 養物を提供する。より特別な観点におし）て、二±ヱ久櫃丈ｌ立の株、ＮＣＩＭ Ｂ　Ｎｏ、　４０２６２　、又はその突然変異体もしくしま変異体を提供する。

第４の観点において、本発明はプロテアーゼの調製のための方法を提供し、ここ でこの方法は、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む適切な栄養培地の中での二 ±土五１丈１１ｍのプロテアーゼ生産株の培養、それに続く所望の酵素の回収を 含んで成る。より特別な観点において１．公ｌニヒムｌ−呈」−２ＮＣＩ門Ｂ　 Ｎｏ、　４０２６２又はその突然変異体もしくは変異体を培養する。

第５の観点において、洗浄酵素としての酵素の利用を請求する。

より特別な観点において、本発明はこのプロテアーゼを含んで成る洗浄組成物を 提供する。他の特別の観点において、本発明はこのプロテアーゼを含んで成る洗 浄添加剤を提供する。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら更に説明するが、ここで：図１は５ＴＰＰの存 在下及び非存在下（Ｊ２０ｉ口Ｊ２０＋０．１％の５ＴＰＰ）における本発明に 関する酵素の温度とタンパク質分解活性（基質としてカゼインを伴い、Ｐ　Ｈ９ ，５にて）との関係（％比活性）を示し；そして 図２は本発明に関する酵素のｐＨとタンパク質分解活性（基質としてカゼインを 伴い、２５°Ｃにて）との関係（％比活性）を示す。

発明の詳細な開示 漿二立 本発明の酵素を生産できる本発明の新規な微生物は、英国特許第１．２４３．７ ８４号に詳細の好アルカリ性バチルスの選別に関する方法によって本質的に単離 した。かかる培養物の一つ、）＜　％　Ｊｌ、ｉノ」連Ｊ二λ」−をブタベスト 条約に従い１９９０年２月２７日にＮＣＩＭＢ　Ｌ　＋　ｄ　（２３Ｓｔ。

マーチャー　ドライブ、アハーディーンＡＢ、ＩＲＹ、スコツトラント、英国） に受託番号ＮＣＩＭＢ　４０２６２で寄託しである。

本発明の微生物は好気的であり、バチルス属に属する胞子形成細菌である。形態 学的にはこれらは０．６〜０．８ミクロンの径及び２〜３ミクロンの長さを存す る運動性桿菌として説明することができる。

その胞子は円形から楕円形に到り、胞子嚢は中心から末端付近まで膨らんでいな い。増殖のための最適温度は３５〜４０　′Ｃ内であり、そして増殖のための最 適ｐＨは８．５〜ｌｏ内であり、ｐＨ８以下では増殖しない。この微生物は栄養 アガープレート上で黄色いコロニーを形成し、そしてアガーへの色素の拡散は観 察されない。

本発明の微生物は表１に記載する試験結果により更に特徴付けできる。

夫−一七 栄養アガー（Ｄｉｆｃｏ）　ｐＨ９’　士　ｔ　−栄養アガー（Ｄｉｆｃｏ）　 ｐＨ７’　Ｗ　−Ｗ栄養アガー（Ｄｉｆｃｏ）　ｐＨ１１’　＋５０゛Ｃで増殖 １　ｔ　− ＤＳＭ　４８５　：　Ｂ、アルカロフイルス（Ｂ、ａｌｋａｌｏ　ｈｉｌｕｓ） ＤＳＭ　４９７　：　Ｂ　アルカロフイルス亜種　ハロデエーンスー〇主脱０工 却搬− Ｊ２０：旦、榎丈主立、　ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ、　４０２６２Ｗ＝弱 ■＝２日にわたるインキュベーション後に記録。その他の全ては７日にわたるイ ンキュベーション。

２：論文からのデーター。

３：１４日にわたるインキエヘーノヨン後に陽性；７日後では陰性。

欺↓生立暗１ 本発明の微生物は、同化性炭素及び窒素をその他の必須栄養素と共に含む栄養培 地の中で好気的条件のもとで培養されることができ、この培地は既知の技術の原 理に従って構成されている。

適切な炭素源は炭水化物、例えばスクロース、グルコース及びデンプンであるか 、又は穀物種子；麦芽；米及びモロコシ類を含む炭水化物である。この培地に含 ませる炭水化物の濃度は、例えば高くて２５％までそして低くて１〜５％にわた って大きく変えてよく、しかしながら８〜１０％が適切であろう。％はグルコー ス当量として計算した。

栄養培地中の窒素源は無機及び／又は有機物質でありうる。適切な無機窒素源は 硝酸塩及びアンモニウム塩である。有機窒素源の中でかなりの数のものが細菌の 培養を包括する培養工程において一般的に利用されている。その例はダイズ粉； 綿実粉；ビーナツツ粉；カゼイン；コーン；コーン浸は液；酵母抽出物；尿素及 びアルブミンである。更に、この栄養培地は通常の微量元素も含むべきである。

本発明の新規なるバチルスの種は好アルカリ性であり、そしてｐＨ８以下では増 殖できないため、その培養は好ましくはアルカリ性のｐＨ値で実施し、このｐＨ は増殖培地の滅菌後の炭酸ナトリウム又は炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウム との混合物のような適切な緩衝液の添加によって得ることができる。タンク型発 酵槽の中での培養のためには人工通気を利用する必要がある。通気の割合は常用 のタンク発酵に用いるのと類似である。

発酵後、液状酵素濃縮物は、この培養液からの粗粒材料の除去により、又は所望 するならば、低温度でのエバポレーション↓こよりもしくは逆浸透によるこの培 養液の濃縮によって提供されうる。最後に、この４縮物に防腐剤を加えることが ある。

固形酵素調製物はＮａｚＳＯ４のような塩又はエタノールもしくはアセトンのよ うな水混和性溶媒による沈殿により精製及び／又は濃縮培養液から調製できる。

培養液中の水の除去は適当な乾燥方法によることができ、例えばスプレー乾燥も 利用できる。

このようにて得られる該プロテアーゼ調製物のタンパク質分解活性は通常１〜５ ０ＣＰＵ／ｇの範囲にある。

タンパク　”　についてのアッセイ タンパク質分解活性は基質としてのカゼインにより決定する。１力ゼインプロテ アーゼ単位（ＣＰＩＩ）は、標準条件、即ち、２５°Ｃ及びＰ　Ｈ９，５での３ ０分間のインキュヘーションのもとて１分間当り１ｍＭの第一アミノ基を遊離さ せる酵素の量（セリン標準品との比較により決定）として定義される。この分析 方法を詳細しているホルダーＡＦ２２８は、ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ、デンマ ーク国への請求により入手でき、このホルダーは本明細書に参考として組入れて いる。

固案 本発明の酵素は新規なる洗浄プロテアーゼである。これはアルカリ性プロテアー ゼであり、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地の中での本発明の 微生物、好ましくはム天土ム１丈旦２０　、　ＮＣ４ＭＢ　Ｎｏ、　４０２６２ 又はその突然変異体もしくは変異体の培養によって得られる。この酵素は組換え ＤＮＡ工学によって得られうる。

本発明のプロテアーゼは以下の特性によって詳細できる。

血皿二化ヱ煎ユ１ ＳＯ５−ＰＡＧＥにより、分子量は２９ＫＤと決定された。ＬＫＢ　Ａｍｐｈｏ ｌｉｎｅ（商標）ＰＡＧプレートでの等電点；気泳動、′、こよりｐ＋は８．８ と決ｉされた。プロテアーゼ活性はＰ’！ＳＦ、α−１−抗トリプシン及び七面 鳥卵白プロテナーゼインヒビターにより阻害される。ＥＤＴＡ及びダイズタンパ ク質インヒビターはプロテアーゼ活性に影響を及ぼさない。

このプロテアーゼはインスリンを、その疎水性アミノ酸のＣ−末端側で切断する 。特に、ヒトインスリンは以下のアミノ酸の間、即ち、Ａ−鎖のＬ　ｅｕ＋ｚ　 Ｔｙｒ＋４において；並びにＢ−鎖のＬｅｕ＋＋　Ｖａｌ＋２゜Ｌｅｕ＋ｓ　Ｔ Ｖｒ＋ｂ及びＣｙｓ＋ｑ　Ｇｌｙｚｏ　（Ｃｙｓはジスルフィドと巳て）におい て切断される。

温度−活性の関係は基質としてのカゼインにより決定される。前記したタンパク 質分解活性についてのアッセイを、１５〜６０°Ｃの間隔を開けてインキュヘー シゴン温度を変える変更を伴って利用した。酵素反応は０．１％のトリポリリン 酸ナトリウム（ＳＴＰＰ）の存在下及び非存在下において実施した。その結果を 表１に示す。この酵素は低くて１５°Ｃから高くて７０℃までの温度にてタンパ ク質分解活性を保有し、そして最適温度（ＳＴＰＰの非存在下）は４５〜６５° Ｃの範囲；より好ましくは５５〜６５°Ｃ；約６０°Ｃである。

活性のｐＨ依存性を同一の手順により、７〜１１のｐＨ範囲における予め決めた ｐＨ値に緩衝液を調整して決定した。その結果を図２に示す。この酵素は低くて ６から高くて１１までのｐＨ値にてタンパク質分解活性を保有し、最適ｐＨはｐ Ｈ１Ｏ−ｐＨ１２の範囲；約ｐＨ１１にある。

本発明のプロテアーゼは４０°Ｃで６０分間、並びにヨーロッパ及び米国タイプ の洗浄剤における過硼酸塩及びＮ０ＢＳのような漂白剤を伴う又は伴わない両方 の洗浄条件のもとて安定である。

免疫化ヱ阿血１ 免疫化学的性質は交差反応同定試験によって免疫学的に決定できる。この同定試 験はよく知られたアウターロー二−二重免疫拡散手順により、又はＮ、Ｈ，Ａｘ ｅｌｓｅｎ　；　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　１ｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉＬ−ａ ｔｉｏｎ！ｎ−Ｇｅｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　；　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃ ｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌ−ｉｃａＬｉｏｎｓ　（１９８３）第５及び１４章 に従うタンデム交差免疫電気泳動によって実施できる。「抗原性同一」及び「部 分的抗原性同−Ｊなる語がこの本の第５．１９及び２０章に説明されている。

モノ特異性抗血清は、ウサギを本発明の精製プロテアーゼにより免疫することで 上記の方法に従って作った。免疫原をフロイントのアジュバントと混ぜ、そして ２迎ごとにウサギに皮下注射した。全体で８週間にわたる免疫期間の後に抗血清 が得られ、そしてイムノグロブリンをこれよりＮ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ　（前述 ）に記載の通りに調製した。

アウターロー二−二重免疫拡散試験は、本発明のプロテアーゼと、既知ノアルカ リ性セリンプロテアーゼ、ＡＬＣＡＬＡＳＥ　（商標）、５ＡＶＩＮＡＳＥＣ商 標）　、ＥＳＰＥＲＡＳＥ　（商標）、ズブチリシンＢＰＮ　’及びプロテアー ゼＡＰＩ−２１との交差反応を示さなかった。

迭企凹虜立 本発明の洗浄組成物は陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、両性もしくは両電 解性型、又はその混合でありうる１又は複数の界面活性剤を含んで成りうる。陰 イオン界面活性剤の典型例は線状アルキルヘンゼンスルホ＊　−ト（ＬＡＳ）　 、アルキルスルフェート（Ａｓ）；アルファーオレフィンスルホネート（ＡＯ５ ）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）及び天然脂肪酸のアルカリ金属 塩である。非イオン界面活性剤の例はアルキルポリエチレングリコールエーテル ；ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル；スクロース及びグルコー スの脂肪酸エステル；並びにポリエトキシル化アルキルゲルコンドのエステルで ある。

本発明の洗浄組成物は当業界において既知のその他の洗浄成分、例えばビルダー 、漂白剤、漂白活性剤、耐蝕剤、封鎖剤、土壌再付着防止剤、香料、酵素及び漂 白剤のための安定剤、製剤化補助剤、蛍光増白剤、発泡促進剤、キレート剤、充 填剤、布帛ソフトナー等を含むこともある。本発明の洗浄剤は実質的にＪ　、　 Ｆ　ａｌｂｅ　（Ｆ　ａｌｂｅ。

Ｊ、　；　５ｕｒｆａｃｔａｎｔｓ　ｉｎ　Ｃｏｎｓｕｍｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　； 　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ　１９８７＋　特に表題’　Ｆ　ｒａｍｅｆ ｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　１ｉｑｕｉｄ　／ｐｏｉｉｄｅｒ　ｈｅａｖ ｙ−ｄｕｔｙ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ　Ｊの章〕に詳細されている通りに製剤化 されうる。

本発明の洗浄組成物は洗浄液１　’）　ンター当り０．０００５−０．５　ＣＰ ［Ｉのタンパク質分解酵素に相当する量における本酵素調製物を含みうることか 現状考えられる。

本発明の洗浄組成物は任意の常用の形態、例えば粉末、液状等において製剤化さ れうる。

本発明の洗浄組成物は好都合には、■又は複数のその他の酵素、例えば洗浄組成 物に通常音まれているリパーゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；及び／又はペルオキ シダーゼ、並びに他の起源のプロテアーゼを含みうる。

本発明のプロテアーゼは、該洗浄プロテアーゼを含む別々の添加剤を加えること により、又は異なる洗浄酵素を含んで成る組合せ添加剤を加えることにより、洗 浄組成物の中に含ませることができる。

本発明の添加剤、即ち、独立添加剤又は組合せ添加剤は、例えば顆粒、液状、ス ラリー等として製剤化されうる。好ましい洗浄添加製剤は無粉塵性顆粒、液状、 特に安定液体、スラリー又は保護化酵素である。無粉塵顆粒は例えば英国特許第 Ｌ３６２，３６５号又は米国特許第４，１０６．９９１号に従って製造でき、そ して当業界に周知の方法によって任意的に被覆されうる。この洗浄酵素は粒状化 の前後で混合さイ１．“ノる。液状酵素調製物は例えばボリエナレングリコール のよ−・なポリオール；糖又は塘アルコール；乳酸又は硼酸を確立されている方 法に従って加えることにより安定化されうる。その他の酵素安定剤は当業界によ く知られている。保護化酵素はヨーロッパ特許出潮第２３８，２１６号に開示さ れた方法に従って調製できる。

以下の実施例は本発明を更に説明する。

実施例１ ）＜　％　ＪＬｉ　Ｘ　Ｊλ」−を、以下の組成の培地（リットル当り＞　１０ ０　ｄを含む５００戚のハンフル付きエーレンマイヤーフラスコの中で、ロータ リーシェーキングテーブル上で（３００ｒ、ｐ、ｍ、）　２５°Ｃで培養した。

ポテトデンプン　１００ｇ 粉砕した大麦　５０ｇ ダイタイプ粉　２０ｇ ＮａｚＨＰＯ４ｘ　ｉ　２Ｈ２０９ｇ Ｐ　１ｕｒｏｎｉｃ　（商標）　０．１　ｇカゼイン酸ナトリウム　１０ｇ 培地の中のデンプンをα−アミラーゼにより液化し、そしてこの培地を１２０° Ｃで４５分間加熱することによって滅菌した。

滅菌後、この培地のｐＨを０．１Ｍのセスキ炭酸ナトリウムの溶液１０−の添加 により９．７に調整した。

５日間のインキユベーシヨンの後、この培養物のタンパク質分解活性を前記した 方法を用いて決定した。

培養後のこの培養液の酵素活性は１２０　ＣＰＵ／４２であった。

実施例２ 純粋な酵素調製物を以下の通りに調製した：実施例１の通りに調製した発酵培養 培地を遠心Ｌ７て固形物ｎ・と除去した。この遠心物乙こ１／２容量のアセトン を加え、次いでこの沈渣を遠心して除去し、そして廃棄した。この遠心物に更に 全体で２容量のアセトンを加えた。この沈渣を遠心により除去し、そして以下の 緩衝液に溶かした＝０．１Ｍの硼酸：０．０１Ｍのジメチルグルタル酸；　０． ００２　Ｍの塩化カルシウム；ｐＨ７，０に調整。

この溶液から該酵素をアフィニティークロマトグラフィーにより単離した。タン パク質分解活性を有する両分をプールし、１４ｗ１シ、そしてＵＦ−セルの中で 緩衝液で洗い、そして凍結乾燥した。

１１の培養培地からの収量は１．２ｇであり、２５．６　ＣＰＵ／　ｇを有して いた。５Ｏ５−ＰＡＧＥによる判定に従い、純度は９０％以上であった。

本実施例に従って調製した酵素調製物の特徴は本明細書のはじめに言及したので 、それを参照していただきたい。

実施例３ 洗企二血 試験は０．００１　；　０．０１及び０．１０　ＣＰＵ＃！の酵素濃度の、実施 例１−２に従って得た該酵素調製物で実施した。

洗浄性能試験は、綿の上に混合汚れ（オリーブ油；ゼラチン；インドインク；カ オリン）を４０°Ｃの等温で１５分間つけることによって行った。

１．５ｇ＃！の商業用米国タイプ液状洗剤を利用した。この洗剤を約６°ｄＨ（ ドイツ硬度（Ｇｅｒｍａｎ　Ｈａｒｄｎｅｓｓ　）　）の水に溶かし、測定され たｐＨは７．８３であった。繊維／洗浄液の比は、Ｌｏｇの繊維／洗浄液１リツ トルとした。洗濯が終えたとき、ｐＨは７．７に変化していた。

洗濯の後に、この布を流水遣水ですすぎ、そして風乾した。４６０ｎｌｌでの規 約反射率（％Ｒ）を測定した。

洗浄性能の測定値として、規約反射率差ΔＲを利用した。これは酵素を加えて洗 濯した後の規約反射率から、酵素を加えないで洗濯した後の規約反射率を差し引 いたものに相当する。

この結果を表３に示す。

表−１ 本発明の酵素Ｊ２０の洗浄性能。規約反射率差ΔＲは商業用米国タイプ液状洗剤 中での洗濯の後に測定。

酵素濃度 ０、０１　１０．３ 規約反射率差は、本発明のプロテアーゼが優れた洗浄能力を有することを示す。

％活性 Ｈ ％活性 Ｃ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年３月２デ日

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の特性： （ａ）２９ＫＤの見かけ上の分子量； （ｂ）約８．８のｐＩ； （ｃ）ｐＨ１０〜１２の範囲における最適ｐＨ（２５℃）；及び（ｄ）４５〜６ ５℃の範囲における最適濃度（ｐＨ９．５）、を有することを特徴とするプロテ アーゼ。
2. ２．以下の特性： （ａ）２９ＫＤの見かけ上の分子量； （ｂ）約８．８のｐＩ； （ｃ）ｐＨ１０〜１２の範囲における最適ｐＨ（２５℃）；（ｄ）４５〜６５℃ の範囲における最適温度（ｐＨ９．５）；及び（ｅ）バチルス種Ｊ２０，ＮＣＩ ＭＢ　Ｎｏ．４０２６２　に由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は 部分的に同一な免疫化学的性質、を有することを特徴とするプロテアーゼ。
3. ３．前記プロテアーゼがバチルス種Ｊ２０の株より得ることができる、請求項１ −２のいづれかに記載のプロテアーゼ。
4. ４．バチルス種Ｊ２０，ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ．４０２６２　又はその突然変異体も しくは変異体より得ることができる、請求項３に記載のプロテアーゼ。
5. ５．バチルス種Ｊ２０の株の生物学的に純粋な単離培養物。
6. ６．前記の株が、バチルス種Ｊ２０，ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ．４０２６２　又はその 突然変異体もしくは変異体である、請求項５に記載の培養物。
7. ７．請求項１〜４のいづれか１項に記載のプロテアーゼの調製方法であって、炭 素及び窒素源並びに無機塩を含む適切な栄養培地の中でのバチルス種Ｊ２０のプ ロテアーゼ生産株の培養、それに続く所望の酵素の回収を含んで成る方法。
8. ８．バチルス種Ｊ２０，ＮＣＩＭＢ　Ｎｏ．４０２６２　又はその突然変異体も しくは変異体を培養する、請求項７に記載の方法。
9. ９．洗浄酵素としての請求項１〜４のいづれか１項に記載のプロテアーゼの利用 。
10. １０．請求項１〜４のいづれか１項に記載のプロテアーゼを含んで成る洗浄組成 物。
11. １１．１又は複数のその他の酵素、特にリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又は ペルオキシダーゼを更に含んで成る、請求項１０に記載の洗浄組成物。
12. １２．顆粒好ましくは無粉塵性顆粒、液体特に安定化液体、スラリー、又は保護 化酵素の形態の施された、請求項１〜４のいづれか１項に記載のプロテアーゼを 含んで成る洗浄添加剤。