JPH06502633A - 気管抗菌ペプチドの生産と用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 気管抗菌ペプチドの生産と用途 発明の分野 この発明は一般には、ここで気管抗菌ペプチドとして引用さ−れる抗菌ペプチド に関する。より詳細には、この発明は抗菌活性を有する新しい部類のボリブチド 、ペプチドをコード化するｃＤＮＡ配列、およびその生産方法と用途に関する。

発明の背景 哺乳類の気道上皮は、数多くの生理機能の原因となる複組織であり、その一つは 、潜在的に有害な環境上の脅威に対する一つの主要な障壁を形成する。病原菌、 ガス、微粒子などのような気道の病気の原因として知られる吸引因子から気道を 防護する多重防衛機料が確認されている。Ｍ、Ｔ、ニューハウスおよびＪ、ビー ネンストック「気道防衛機料」肺動脈病テキストブック、リトウルブラウン　エ ンド　コンブ社（１９８９）。

これらの多重防衛は、気道の解剖学的設計と局所および循環細胞の生理学的役割 の組合せの結果である。

多種多様の種および組織の抗菌ペプチドが最近分離され、特性付けられたことに よって、動物宿主防衛の新しい成分が明らかにされた。これら各種のペプチドは 普通の配列に依存する科に分類することができるが、活性の二次構造およびもし くは部位は、潜在的微生物病原体に対する防衛に参加するものと考えられている 。セクロビンは構造的に関連する抗菌ペプチドとして初めて特性付けられた科で あり、昆虫類に広（分布していることがわかった。Ｈ，Ｇ、ボーマンおよびり、 ハルトマーク、微生物学年次評論（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）４ １ｔ！　１０３〜１２６頁（１９８７）。これらは感染あるいは外傷に続いて、 虫の幼虫の脂肪体内で組み合わされ発現される。を髄動物においては抗菌ペプチ ドのマゲイニンの科が、ッメガエルの皮膚および胃腸管の腺から分離され、感染 に対し”Ｃ両生類の粘膜面の防衛システムの基礎を形成するものと考えられる。

Ｅ、ソラヴイア、Ｇ、マーテイー二他「ツメガエル顆粒腺分泌物より得たペプチ ドの抗菌物性Ｊ　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、、２２８巻　３３７〜３４０頁（１９８８ ）。

Ｍ、Ａ、ザースロフ［マゲイニン類。ツメガエルの皮膚から得られる抗菌ペプチ ドの部類、二個の活性形態の分離、特性付け、および前駆体の部分ｃＤＮＡ配列 」　全米科学アカデミ−会報　（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ Ａ）。

８４巻　５４４９〜５４５３頁（１９８７）。デフエンジンは人間を含む、いく つかの哨乳類種から分離された食細胞の中で発見され、配列内で８箇の不変残基 で特徴付けることが出来る。Ｊ、Ｅ、ギヤベイ「食細胞の殺菌機能」　免疫学の 現在の見解（Ｃｕｒｒ　０ｐｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ）　１　（１）巻３６〜４０ 頁（１９８８）。

Ｊ、Ｅ、ギヤベイ、Ｒ，Ｗ、スコツト他「人間多形核白血球の抗生蛋白質ｊ全米 科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ　ＮａｔｉＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　８６（ １４）巻５６１０〜５６１４頁（１９８９）。Ｔ、ガンツ「人間多形核白血球に よる抗菌性デフエンジンの細胞外放出」感染と免疫（Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ ）、５５　（３）巻、５６８〜５７１頁（１９８７）、Ｔ、ガンツ、Ｊ、Ａ、メ トカーフ他「好中球殺菌性蛋白質あるいは、細胞毒性蛋白質は二種の疾患、すな わちチェシアツク・東症候群および「特異性］顆粒欠乏症において欠落する」臨 床と治験ジャーナル　ＪＣｌ　ｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、　８２　（２）巻　５５２ 〜５５６頁（１９８８）。Ｔ、ガンツ、Ｊ、Ｒ，レイナー他「家兎マクロファー ジ・デフエンジン遺伝子の構造およびその基管特異性発現」免疫学ジャーナル　 Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３　（４）巻１３５８〜１３６５頁（１９８９）。Ｔ 、ガンツ、Ｍ、Ｅ。

セルステッド他「食細胞顆粒蛋白質の抗菌活性」呼吸器管感染セミナー（Ｓｅｍ ｉｎ　Ｒｓｐｉｒ　Ｉｎｆｅｃｔ）１（２）巻　１０７〜１１７頁（１９８６） 。Ｔ、ガンツ。

Ｍ、Ｅ、セルステッド　他「デフエンジン」欧州血液学ジャーナル（Ｅｕｒ　Ｊ 　Ｈａｅｍａｔｏｌ）、４４　（１）巻　１〜８頁（１９９０ａ）、Ｔ、ガンツ 、Ｍ、Ｅ、セルステッド他「デフエンジン」欧州血液学ジャーナル（Ｅｕｒ　Ｊ 　Ｈａｅｍａｔｏｌ）、４４　（１）巻　１〜８頁（１９９０ｂ）。

Ｔ、ガフ９． 間好中球の天然ペプチド抗体」　臨床と治験ジャーナル（Ｊ　Ｃ１　ｉｎ　Ｉｎ ｖｅｓｔ）　、　７６　（４）巻　１４２７〜１４３５頁（１９８５）、これら のものは、細菌，真菌およびウィルスに対し、試験管内で抗菌活性を有し、これ ら細胞の「酸素非依存型」防衛経路に貢献することが出来る。Ｒ．Ｉ。

レーラー，Ｔ．ガンツ他「酸素非依存型殺菌システム。機能および疾患」化アメ リカ血液と腫瘍崩壊の臨床学（Ｈｅｍａｔ。

１　０ｎｃｏｌ　Ｃ１　ｉ　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ）　、　２　（１）巻１５９〜１ ６９頁（１　９８８）、非骨髄組織源、例λばマウスの小腸管陰窩細胞における デフエンジンの発現も報告されている．Ａ．Ｊ．　ウーレット、Ｒ．Ｍ．グレコ 他「マウス小腸管陰窩上皮内でのクリプトジン、コルテコスタチン／デフエンジ ン前駆体ｍＲＮＡの発生上の規制」　細胞生物学ジャーナル（Ｊ　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌ）、１０８（５）巻　１６８７〜１６９５　（１９８９）。

セクロビン、マゲイニンおよびデフエンジンのすべては陽イオンおよび膜活性の 物性を有し、また、これらのものの殺菌活性は、多分チャンネル形成によって膜 を選択的に***させる能力と対比して二義的であることを、証拠が示唆している 。

Ｃ．Ｌ．ベビン，Ｍ．Ａ．ザスロフ「カエルの皮膚より得られるペプチド」生化 学年刊評論（Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）　５９巻　３９５　〜４１４頁 （１９９０）　、Ｂ．Ｌ．ケイガン、Ｍ．Ｅ．セルステッド他「抗菌デフエンジ ンペプチドは、平坦な脂質二重層膜内に電圧依存型イオン透過チャンネルを形成 する」全米アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　 、　８７　（１）巻２１０〜２１４頁（１９９０）。Ｒ．１．レーラー，Ａ．バ ートン他「人間デフエンジンと大腸菌の相互作用。殺菌活性の機能」臨床と治験 ジャーナル（Ｊ．ＣＩ　ｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ，８４　（２）巻５５３〜５６１頁 （１　９８９）　、Ｍ．Ａ．ザスロフ「マゲイニン類、ツメガエルの皮膚から得 られる抗菌ペプチドの部類．二個の活性形態の分離，特性付け、および前駆体の 部分ｃＤＮＡ配列」全米科学アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　ｓ ｃｉ　ＵＳＡ）、８４巻　５４４９〜５４５３頁（１９８７）。

これらの新しく出現した抗菌活性を有する基本的なシスティンリッチのペプチド の科は、デフエンジンを含めて広く動物の世界で見出された。（Ｔ．ガンツ，Ｍ ．Ｅ．セルステッド他「デフエンジン」欧州血液学ジャーナル（Ｅｕｒ　Ｊ　Ｈ ａｅｍａｔｏｌ）、４４　（１）巻　１〜８頁（１９９０ｂ）ｒ昆虫類デフエン ジン」　（Ｊ．ランバート、Ｅ．ケラと他「昆虫類の免疫：家兎の肺マクロファ ージ殺菌性ペプチドに対し配列相同性である二種の昆虫類の抗菌ペプチドを双翅 目フオルミアテラノーバの免疫血液から分離する」　［刊行された正誤表は全米 科学アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ）５月号　 ８６　（９）巻　３３２１頁（１９８９）でみられる。］］全米科学アカデミー 会報Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌＡｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６　（１）巻２６２〜２ ６６頁。

バクテネシン（Ｄ．ロメオ，Ｂ．スケルラバーユ他「ウシの好中球から精製され た抗菌ドデカペプチドの構造および細菌活性」生物学と化学ジャーナル（Ｊ　Ｂ ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ）。

２６３巻　９５７３〜９５７５頁（１９８８））、「サベシン」　（Ｋ．松山お よびＳ１名取「ペレグリーナ肉蝿（サルコファーガ・ペレグリーナ）の胚性細胞 系の一種であるＮＩＨ−３ａｐｅ−４培地から３種の抗菌蛋白質の精製」生物学 と化学ジャーナル（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ）、２６３巻１７１１２〜１７１１ ６頁（１９８８））および［ロイヤリシンＪ（Ｓ、ａ［原および、１．今井他「 ロイヤルゼリー内の効力のある抗菌蛋白質」生物学と化学ジャーナル（Ｊ　Ｂｉ ｏｌＣｈｅｍ）、２６５巻　１１３３３〜１１３３７頁（１９９０））。デフエ ンジンは３０乃至３４個のアミノ酸と３個の二硫化結合を持つ基本ペプチドであ る。骨髄および非骨髄組織双方より得られる既知の特性付けられたデフエンジン はすべて、系統群内で６個の不変システィンを含め高度に保持されたアミノ酸残 基を有してる。この発明の気管抗菌ペプチドのカルボキシ末端の近くの対のシス ティン残基を除けば、これらのペプチドの間で共通残基あるいはその他の残基を 分かち合うものはない。更に、既知のデフエンジンｃＤＮＡｓすべでの５′領域 は、種に交差してさえも顕著に保持されており、しかも気管抗菌ペプチドのｃＤ ＮＡではこの共通領域との類似性は見出されない。抗菌ペプチドを含む他のシス ティンと比較しても類似性を示すことはない。

ｆａｓｔＰの修飾（ＩＢＩ）を利用するＮＲＢＦ蛋白質データベースの公知資料 調査、Ｄ、Ｊ、　リップマン、Ｗ、Ｒ，ピアソン「迅速かつ敏感な蛋白質類似性 調査」科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２７巻　１４３５〜１４４１頁（１９８５） 、およびインテリジエネティック・サーチなどにおいてこの発明の気管抗菌ペプ チドを開示する蛋白質配列は見出されなかった。

ライスコンシン大学遺伝子分析ソフトウェアを利用するジエンバンク、データベ ースのヌクレオチドベースの調査、Ｊ、デヴエロー、Ｐ、ヘーバーり他ｒＶＡＸ に関する包括的な一組の配列分析プログラム」核酸残基（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ 。

Ｒｅ５）１２巻３８７〜３９５頁（１９８４）においても同じように開示されて いなかった。

発明の要約 この発明により、新規な気管抗菌ペプチド（Ｔｒａｃｈｅａｌ　Ａｎｔｉｍｉｃ ｒｏｂＬａｌ　Ｐｅｐｔｉｄｅ、以下ＴＡＰと称する）および新規なＴＡＰの前 駆体が提供される。

この発明により、ＴＡＰをコードする新規なｃＤＮＡおよびＴＡＰ前駆体をコー ドする新規なｃＤＮＡを提供される。

この発明により、ＴＡＰをコードするｃＤＮＡが生産される新規な蛋白質および ＴＡＰ前駆体をコードするｃＤＮＡから生産される新規な蛋白質が提供される。

この発明により配列識別番号３で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を 少なくとも一部あるいは全体として有する蛋白質で構成される実質的に精製され 分離された新規な哨乳類ＴＡＰ前駆体が提供される。

この発明により、配列識別番号１で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列 、および少なくとも同じ抗菌活性を少な（とも一部あるいは全体として有する蛋 白質で構成される実質的に精製され分離された新規な哨乳類ＴＡＰが提供されＴ ＡＰおよびＴＡＰをコードするｃＤＮＡの新規な使用方法および診断方法が提供 される。

ＴＡＰをコードするＤＮＡで形質転換された新規な組換型宿主細胞あるいは前記 宿主細胞によりＴＡＰの発現が十分な新規な組換型宿主細胞の一部が提供される 。

組換型宿主細胞を培養することを含む新規なＴＡＰ生産方法が提供され、そこで は前記宿主の細胞内に形質転換された組換型ＤＮＡはＴＡＰをコード化するＤＮ Ａ配列を有し、前記コードされた配列を前記形質転換細胞に発現することを可能 にする適切な調節対照配列と操作上連結されている。

適当な発現システムで発現の可能な新規な組換型ベクターが提供され、それは前 記発現システムと両立する対照配列と操作上連続されたＴＡＰをコード化するＤ ＮＡ配列で構成される。

気道の他の防衛システムを補完するために、哨乳類の繊毛状の気道粘膜がペプチ ドベースの抗菌活性を含んでいることを出願人は発見した。哺乳類気管粘膜のエ キスで見出されたおびただしい新規なペプチドは、効力のある抗菌活性を基礎と してここで分離される。この分子は以下で気管抗菌ペプチド（ＴＡＰ）として引 用される。

図面の簡単な説明 第１図　ウシの気管より得られる抗菌ペプチドの精製Ａ、Ｐ−３０ゲル濾過クロ マトグラム：抗菌活性を有する両分がマークされる。

Ｂ、Ｐ−３０画分の抗菌プレート定量分析。各画分２μβが大腸菌菌株Ｄ３１菌 叢上にスポットされ、３７℃で一晩保温された。

Ｃ，Ｐ−３０抗菌画分のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム。

２６分間で溶離された抗菌画分が矢印でマークされる。

Ｄ、イオン交換ＨＰＬＣから得られる抗菌画分の逆相ＨＰＬＣクロマトグラム。

第２図　ＴＡＰのアミノ酸配列および関連するヌクレオチド配列 Ａ、ペプチドアミノ酸配列分析、質量スペクトル分析およびＣＤＮＡ配列分析の 組合せに基づ＜ＴＡＰのアミノ酸配列（配列識別番号１）。矢印はエドマン分解 分析から得られた結果を示す：配列ｌは直接アミノ末端分析からのものであり、 配列２は続く臭化シアン反応切断およびＨＰＬＣ精製である。

システィン残基は続（還元および４−ビニルピリジン処理で決定された。

Ｂ、ＰＣＲ増幅に使用される縮重オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（配列 識別番号６．配列識別番号７および配列識別番号１２）。オリゴヌクレオチドの １：１混合物が上流プライマーとして使用された。

使用略語：Ｙ＝Ｃ，Ｔ、Ｒ＝Ａ、Ｇ、Ｄ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｂ＝Ｃ，Ｇ、Ｔ、下段の 文字はサブクローニングを促進するためのオリゴヌクレオチドに含まれる５゛フ ランキング配を示す。

Ｃ，ｃＤＮＡスクリーニングに使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配 列（配列識別番号８および配列識別番号９）、配列の選択は部分ペプチド配列お よびコドン利用表に準拠した。

Ｄ、ジデオキシ配列分析から得られるウシＴＡＰ　ｃＤＮＡの部分ヌクレオチド 配列（配列識別番号２）。

第３図　ヌクレオチド配列（配列識別番号４）およびＴＡＰ前駆体の予示された アミノ酸配列（配列識別番号３）。アミノ酸番号印字は開始コドンで始まる。残 基２７で始まる成熟ペプチド（配列識別番号１）は下線を付している。ポリアデ ニリル化シグナルはボックスされている。

図４ＴＡＰ（配列識別番号１）メツセージのノーザンプロット分析。レーン１． 全体で１０μｇのウシ気管ＲＮＡ。

レーン２．全体で１０μｇのウシ肺ＲＮＡ。

発明の詳細な説明 ここで使用される「抗菌」という用語は、微生物を殺すかもしくはその増殖を抑 圧するものとして引用する。

ここで使用されているように、ｒＴＡＰＪは、配列識別番号１で定義される蛋白 質と事実上同一のアミノ酸配列を少なくとも一部もしくは全体として有し、また 同蛋白質と少なくとも同一の抗菌活性を有する蛋白質として引用する。前記抗菌 活性は、少なくともＴＡＰ　１１００ｕ／ｍＩ２の濃度で後記（第１Ｉ表）の条 件の下では、大腸菌Ｋ１２菌株Ｄ３１の成長を事実上阻害するものとして定義さ れる０便宜上、配列識別番号３で定義される蛋白質と少なくとも一部もしくは全 体として事実上同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、以後ＴＡＰ前駆体として 引用される。

この発明のＴＡＰ蛋白質は、もしそれが懸濁しているか溶液内にある場合には、 その環境のｐＨに依存し、あるいはそれが固型の形態の場合には結晶化している か沈殿しているかの環境に依存して、薬剤として受容できる塩の形態もしくは中 性の形態にすることができる。例えば、蛋白質の遊離アミノ基は、塩酸、燐酸あ るいは硫酸などの無機酸、あるいは例えば酢酸、グリコール酸、コハク酸あるい はマンデル酸のような有機酸と酸付加塩を形成することが可能である。遊離カル ボキシル基は、ナトリウム、カリウム、あるいはカルシウムの水酸化物などの無 機塩基、およびピペリジン、グルコサミン、トリメチルアミン、塩素、カフェイ ンなどの有機塩基を含む塩基類と塩を形成することが可能である。加えて、蛋白 質は、脂質、サツカリドなどの生物学的素材と組合せ、あるいはアミノ基のアセ チル化、あるいはスルフヒドリル基の酸化などのような側鎖の変性によって修飾 される。

ＴＡＰの修飾はここで記述される抗菌活性が保持される限り、この定義の範囲内 に含まれる。最終的には、小さなＴＡＰの修飾が蛋白質内で行われることにより 、配列識別番号１で説明された配列に比較して事実上向等もしくはより高められ た抗菌活性を有することが理解される。これらの修飾は部位指向突然変異誘発を 通じて熟考することができ、あるいは、ＴＡＰの生成者である宿主内の突然変異 を通じて偶発的であることもできる。これらすべての修飾は、抗菌活性が続（限 り包含される。

哺乳類気管粘膜の酸性エキス、例えばウシの場合は、ペプチドＴＡＰを豊富な量 で有し、そのペプチドが効力のある抗菌活性を持つことが発見された（第１図） 。哺乳類ＴＡＰ　（配列識別番号１）はサイズ排除（第１図Ａ）、イオン変換（ 第１図Ｃ）、および機能検定として大腸菌菌株に対する抗菌活性を利用した逆相 （第１図Ｄ）クロマトグラフィー画分の組合せで分解された。分離されたペプチ ドの純度（配列識別番号１）は、分析的逆相および毛管ゲル電気泳動（データは 提示されていない）の組合せにより規定された通り９５％以上であった。

分離された素材の収率は、湿潤気管粘膜２μｇ／ｇであった。

哺乳類ＴＡＰ配列識別番号１はアミノ酸配列（データは提示されていない）およ び組成物分析（第１表）により特徴付けられた。質量スペクトラム分析でペプチ ド（配列識別番号１）の分子量が４０８５ダルトンであることが確認された。

前駆体ペプチドに対応するｃＤＮＡ　（配列識別番号４）はクローンされ（第３ 図）、６４個のアミノ酸の読み取り枠を包含する。い（つかの観察を基礎にして 、この読み取り枠の３８個のカルボキシ末端残基が分離ペプチドに対応するもの と考えられる。まず、アミノ酸配列データで確認された３３個のアミノ酸が演鐸 配列の第２６〜５９残基に完全に一直線に合わせる（第２図Ａ（配列識別番号１ ）対第２図Ｄ（配列識別番号２））。第２に、アミノ酸組成物は演鐸アミノ酸配 列に都合よく合致する（第１表）、最後に分離蛋白質の観察された分子イオン、 ４０８５ダルトンは演鐸配列と完全に合致し、６個のシスティン残基はすべて分 子間ジスルフィド結合に関係しているものと予想される。予定されたｐＩ（等電 点）は１３．０であり、また芳香族残基も存在せず、いずれも観察された蛋白質 データと一致する。

微生物のいくつか異なった菌株、そのいくつかのものは、気道病原体である菌株 を、試験管で検定した際に、ウシを源とする哺乳類ＴＡＰ（配列識別番号１）が 、カエルの皮膚から自然発生的に得られる抗菌ペプチドである合成マゲイニン２ −ＮＨ！　（配列識別番号５）と類似の阻害活性を提示した。第■表参照、ＴＡ Ｐ　（配列識別番号１）は大腸菌および肺炎桿菌に対し、もっとも活性であった が、また、それを鵞口瘉カンジダに適用すると著しい抗菌活性が見られ、かくし て、ＴＡＰの活性範囲は細菌および真菌の双方に少なくともわたるものと考えら れる。

ＴＡＰのアミノ酸配列（配列識別番号１）で記述されたように、前駆体ペプチド （配列識別番号３）を含め、これらのポリブチドは技術上周知の標準技術、例え ば商業上利用可能なペプチド合成機、その他の技術によって事実上純粋な形態で ルーチンに合成することができる。

更に、ＴＡＰは、アメリカ合衆国特許番号４６７７０６３で記述されているよう な数多くの周知の組換手法を使用して効率的に提供することができるものと考え られ、前記特許はあたかもすべてここで説明されるかのように引用として組込ま れている。要約すれば、細胞の形質転換、ベクターの構築、メツセンジャーＲＮ Ａの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの準備、その他を行うための大抵の手法は技術 上広〈実施されており、また大部分の実務者は特定の条件と手続を記述する標準 的な資源材料に通じている。しかし便宜上下記の文節が指針として役立つであろ う。

原核生物はもっともしばしば大腸菌の各種菌株で代表されるしかし他の微生物菌 株もまた使用することができ、桿菌５例えば枯草菌、多種多様な種のシュードモ ナス、あるいは細菌の菌株などがそれである。そのような原核生物システムでは 、宿主と両立できる一つの種から得られる複製部位および制御配列を含むプラス ミドベクターが使用される。例えば大ＩＩｉ菌は、ポリパー他、遺伝子（Ｇｅｎ ｅ）（１９７７）２巻　９５　頁で示されるように、大腸菌種から得られるプラ スミド、ｐＢＲ３２２の派生体を利用し典型的に形質転換される。ｐＢＲ３２２ はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含み、かくして、 望ましいベクターを構築する際に保持できるか破壊できるのかいずれかである追 加のマーカーを提供する。通常使用される原核生物制御配列は、リポソーム結合 部位配列と一緒に、随意にオペレーターを伴い転写開始プロモーターを含み、ベ ータラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトース（１ａｃ）プロモーター システム（チャン他、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７７）１９８巻　１ ０５６頁およびトリプトファン（ｔ　ｒ　ｐ）プロモーターシステム（ゲラデル 他、核酸残基（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ　ｓ　）（１９８０）８巻　 ４０５７頁）またラムダ誘導ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リポソーム結合 部位（シマタケ他、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）（１９８１）２９２巻　１２ ８頁）のような通常使用されるプロモーターを含む。

細菌に加えて、酵母菌などの真核微生物も宿主として使用できる。パン酵母であ るサツカロミセス・セレビシェの実験室菌株がもっともよく使用されるが、数多 くの他の菌株も普通に用いられる。２ミクロンの複製原点を採用するベクターが 、Ｊ、Ｒ，ブローチ「酵素化学における方法論Ｊ　（ＭｅｔｈＥｎｚ）（１９８ ３）、１０１巻　３０１頁で説明されている一方、酵母菌の発現に適した他のプ ラスミドベクターも知られている。（例えば、ステインチコーム他、ネイチャー 誌（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７９年）２８２巻　３９頁、チェンベ他、遺伝子（Ｇ ｅｎｅ）（１９８０）１０巻　１５７頁、およびり、イラーク他、「酵素化学に おける方法論Ｊ　（ＭｅｔｈＥｎｚ）（１９８３）１０１巻　３００頁参照のこ と）。酵母菌ベクターの制御配列は解糖酵素合成のためのプロモーターを含む（ ヘス他「高等酵素要件ジャーナル（Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｑ）（１９ ６８）７巻　１４９頁。ホランド他、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）（１ ９７８）１７巻４９００頁）、技術上周知の追加のプロモーターは、３ホスホグ リセリン酸キナーゼ（ヒッツェマン他、生物学と化学ジャーナル（Ｊ　Ｂｉｏｌ 　Ｃｈｅｍ）（１９８０）２５５巻２０７３頁）のプロモーターおよび、グリセ ルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカ ルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー ゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソ メラーゼ、ホスホグリコン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどその他の 解糖酵素のためのプロモーターを含む。成長条件により制御される転写の有利性 を更に有する他のプロモーターは、アルコール脱水素酵素２．イソシトクロムＣ １酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、マルトーゼおよびガラク トーゼに関係する酵素（ホランド、前掲文献）に掛るプロモーター領域のもので ある。また、ターミネータ−配列はコード配列の３′末端にあることが望ましい ものと考えられる。このようなターミネータ−は酵母菌派生遺伝子のコード配列 に続く３′未翻訳領域で見出される。説明されるベクターの多くは、プラスミド ｐｅｎｏ４６を含むエノラーゼ遺伝子（Ｍ、Ｊ、ホランド他、生物学と化学ジャ ーナル（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）（１９８１）２５６巻、１３８５頁）、ある いはＹＥｐｌ　３から得られるＬＥＵ２遺伝子（Ｊ、ブローチ他、遺伝子（Ｇｅ ｎｅ）（２９７８）８巻　１２１頁）から派生する制御配列を含むが、プロモー タと両立する酵母菌を含むベクターはいずれも複製の原点およびその他の配列が 適切である。

勿論ではあるが、多細胞微生物から派生する真核生物宿主細胞培養で、ポリペプ チドをコードする遺伝子を発現することもできる。例えば「組織培養コアカブミ ックプレス社、クルーズおよびバダーリン編（１９７３）を参照のこと。有用な 宿主細胞系は、ＶＥＲＯ，ヒーラ細胞、チャイニーズハムスター子房（ＣＨＯ） 細胞を含む。そのような細胞の発現ベクターは通常哺乳類の細胞に両立するプロ モーターおよび制御配列、例えばシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）からの通 常利用される初期プロモーターあるいは後期プロモーター（ファイヤーズ他。

ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７８）２７３巻　１１３頁）、あるいはポ リオーマ、アデノウィルス２．ウシ乳頭腫、あるいはトリ肉腫ウィルスから派生 するその他のウィルスプロモーターなどを含む、ｆｆｉ！乳類細胞宿主システム 形質転換の一般的様相については、例えば、アメリカ合衆国特許４３９９２１６ 号でアクセルにより記述されている。更に、発現を最適にするためには「エンハ ンサ−」領域が重要であるようにみえる。これらは一般的には非コードＤＮＡ領 域にあるプロモータ領域の上流もしくは下流で見出された配列である。必要とあ ればウィルス源から複製の原点を得ることができる。

しかし、染色体への組込みは真核生物におけるＤＮＡの複製にとっては普通の機 能である。植物細胞も今や宿主として利用でき、ツバリンシンターゼプロモータ ーおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞と両立する制御配列が利 用できる。（Ａ、デビッカー他、分子応用遺伝子ジャーナル（Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ’ ｐｐｌ　Ｇｅｎ）（１９８２）１巻　５６１頁）。

使用される宿主細胞に依存して、形質転換はそのような細胞に適切な標準技術を 使用して行われる。全米科学アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　 Ｓｃ　ｉ）　（ＵＳＡ）（１９７２）６９巻　２１１０頁にＳ、Ｎ、コーエンに より記述されている塩化カルシウムを採用するカルシウム処理、あるいは［分子 クローニング：実験室マニュアルＪ　（１９８８）コールドスプリングハーバ− プレス社刊で記述されている方法は、堅固な細胞壁障壁を含む原核生物あるいは 他の細胞に利用することができる。アグロバクテリウムツメファシェンス（Ｃ， Ｈ，ショー他、遺伝子（Ｇｅｎｅ）（１９８３）２３巻３１５頁）は、ある種の 植物細胞により利用できる。そのような細胞壁のない哨乳類の細胞に対しては、 「ウィルス学」（Ｖ　ｉ　ｒｏ　ｌ　ｏｇｙ）、（１９７８）５２巻　５４６頁 にあるグラハムおよびヴアンデル・ニブのリン酸カルシウム沈殿法が利用できる 。酵母菌への形質転換は、Ｐ、ヴアン・ゾリンゲン、細菌ジャーナル（Ｊ　Ｂａ ｃｔ）（１９７７）１３０巻９４６頁およびＣ，Ｌ、シャオ他、全米アカデミ− 会報（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ）　（ＵＳＡ）（１９７９）７６ 巻　３８２９頁の方法に従って行うことができる。

ｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーは、コロニーハイブリッド形成処理を利用 してふるい分けることができる。一般には各マイクロタイブタレートは二重ニト ロセルロース濾紙（Ｓ＆ＳタイプＢＡ−８５）上に複製され、コロニーは３７℃ で１４〜１６時間５０ＬＬｇ／ｍＩ２アデニル酸（Ａｍｐ）を含む■−寒天上で 成長することが許される。コロニーは溶解され、ＤＮＡはフィルターに固定して ５００ｍＭの苛性ソーダ、１．５Ｍの塩化ナトリウムで５分間配列処理され、５ 倍の標準クエン酸塩溶液（ＳＳＣ）でそれぞれ５分間、２回にわたり洗滌される 。濾紙は８０℃で２時間空気乾燥される。二重濾紙はＤＮＡハイブリッド形成緩 衝液（５倍のＳＳＣ，ｐＨ７，０の５倍チンハート溶液（ポリビニルピロリドン にフィコールおよびウシ血清アルブミンを加えたもの、それぞれＩＸｏ、０２％ ）、ｐＨ７，０の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、０．２％ＳＤＳ、ポリウリ ジル酸２０　ＬＬｇ　／　ｍ　９および変性サケ***ＤＮＡ５０μｇ／ｍｆｆ） をフィルター当たり１０ｍｊ２で６〜８時間４２℃でプレハイブリッド形成され る。

このサンプルは望ましい緊縮調節に依存する条件の下でキナーゼ化プローブでハ イブリッド形成することができる。典型的な標準緊縮調節条件は、４２℃で２４ 〜３６時間プローブを含むＤＮＡハイブリッド形成緩衝液１〜５ｍＩ２／フィル ターで使用することになる。より高度の緊縮調節のためには高温でより短い時間 が採用される。一般にフィルターは、４回それぞれ３０分３７℃で２倍ＳＳＣ， ０，２％ＳＤＳおよびｐＨ７のリン酸ナトリウム緩衝液５０μＭで洗滌され、次 いで２回２倍ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳで洗滌され、空気乾燥の後−７０℃で ２日乃至３日間オートラジオグラフィーで記録される。

望ましいコードおよび制御配列を含む適切なベクターの構築は、技術上周知であ る標準連結反応および制限技法を採用する。分離されたプラスミド、ＤＮＡ配列 、あるいは合成オリゴヌクレオチドは切断され、仕立て直され、望ましい形態に 再連結される。

部位特異性ＤＮＡの切断は、ＤＮＡを一般に技術上周知の条件下で適切な制限酵 素（あるいは２個以上の制限酵素）で処理する事により達成され、その詳細な説 明は商業的に利用可能な制限酵素の製造業者により明記されている。例えばニュ ーイングランド　バイオラブ社製品カタログを参昭の事。一般には１Ｍｇのプラ スミドあるいはＤＮＡ配列は約２０ｕｆ２の緩衝液内で１単位の酵素により切断 される。保温培養時間は約１時間から２時間３７℃で実行可能であるが、その変 形もかなりできる。各保温培養の後、蛋白質はフェノール／クロロフォルムを使 い、次いでエーテル抽出で除去され、核酸はエタノールを用いる沈殿および、セ ファデックス　デキストランゲルＧ−５回転カラムを通す事により水性分画で回 収される。もし望まれるならば標準の技法を使ってポリアクリルアミドゲル電気 泳動あるいはアガロースゲル電気泳動により、切断断片のサイズ分離を実施する ことができる。サイズ分離に関する一般的叙述は「酵素化学における方法論Ｊ　 １９８０年６５巻　４９９〜５６０頁に見出すことができる。

制限切断断片はｐＨ７，６のトリスヒドロキシメチルアミノメタン（以下トリス という）５０ｍＭ、塩化ナトリウム５０ｍＭ、塩化マグネシウム６ｍＭ、ジチオ トレイトール６ｍＭおよびデオキシヌクレオシド三リン酸５５−１ＯＬＬ内で２ ０℃から２５℃で約１５分から２５分の保温培養時間を利用し、４個のデオキシ ヌクレオシド三リン酸分子（ｄＮＴＰｓ）の存在下で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ エ　（フレノウ）の巨大断片を処理することで平滑末端にすることができる。フ レノウ断片は５′付着末端で充填されるが、４個のｄＮＴＰｓが存在していでも 、突出した３′一本鎖を砕（ことになる。もし望ましければ、選択的修復が、付 着末端の性格により示される範囲内でｄＮＴＰｓの１個のみもしくは選択された ｄＮＴＰｓを供給することにより達成することができる。フレノウで処理された 後、混合物はフェノール／クロロホルムおよびエタノール沈殿、それに続くセフ ァデックス、Ｇ−５０回転カラムの通過により抽出される。Ｓ１ヌクレアーゼを 使った適切な条件下での処理でいずれの一本鎖部分も加水分解を生じる。

合成オリゴヌクレオチドはメットウチ他（アメリカ化学会ジャーナル（Ｊ　Ａｍ 　Ｃｈｅｍ　５ｏｃ）　（１９８１）１０３巻　３１８５頁）のトリエステル法 、あるいは商業的に利用可能な自動オリゴヌクレオチド合成機を使って調製する ことができる。アニーリングに先立ち、あるいは標識化のための一本鎖のキナー ゼ化は、ｐＨ７，６のトリス５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、　ジチオト レイトール５ｍＭ、アデノシン三リン酸１−２ｍＭ、γ３２ｐ−アデノシン三リ ン酸１．７Ｍｍｏｌｓ　（２，９ｍＣ１／ｍｍｏｌｅ）、スペルミジン０．１ｍ Ｍ、エチレンジアミン四酢酸ＥＤＴＡ０．１ｍＭの存在下でＯ，ｌｎｍｏｌｅの 基質に対して例λば約１０単位のポリヌクレオチドキナーゼを過剰に使用して達 成することができる。

連結は下記の！Ｍ１！状態および温度の下で１５〜３０με量で実施することが できる：ｐＨ７，５の塩化トリス２０ｍＭ。

塩化マグネシウム１０ｍＭ、ジチオトレイトール１０ｍＭ。

Ｇ５Ａ３３μｇ／ｍＩ２．塩化ナトリウムｌｏｍＭ−５０ｍＭ。

および（「付着末端」結合に対し）アデノシン三すン＃４０μＭ、Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼ０．０１〜０．０２　（ワイス）単位、温度Ｏ℃、か、あるいは（「平滑 末端Ｊ結合に対し）アデノシン三すン酸１ｍＭ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ　０．３− ０．６（ワイス）単位、温度１４℃の標準状態および温度である。

分子間「付着末端」結合は、全ＤＮＡ濃度３３〜１００μｇ／ｍｆｆ（全末端濃 度５〜１０１００ｎで通常達成される。分子間平滑末端結合（通常はリンカ−Ｄ ＮＡの１０〜３０＠モル過剰を用いる）は全末端濃度１ｔＬＭで達成される。

「ベクター断片」を利用するベクター構築の際に、ベクター断片は５′　リン酸 塩を除去しベクターの再結合を阻害するために細菌性アルカリ性ホスファターゼ （ＢＡＰ）で処理することができる。ＢＡＰ消化は一価のナトリウム陽イオンお よび二価のマグネシウム陽イオンの存在下で６０℃約１時間でベクターμｇ当り ＢＡＰ約１ユニットを使用し、トリス約１５０ｍＭ、ｐＨ８で処理することがで きる。核酸断片を回収するために、調製品はフェノール／クロロホルムおよびエ タノール沈殿により抽出され、セファデックスＧ−５０回転カラムの利用で脱塩 される。代替案としては、望ましくない断片の制限酵素消化を追加して、二重に 消化されてきたベクター内で再結合を防止することができる・ 配列修飾を必要とするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡから派生するベクタ一部分 に対しては、突然変異誘発を指向する部位特異性プライマーを利用することがで きる。これは限定された誤対合、望ましい突然変異を代表する場合を除き、突然 変異を誘発する一本鎖ファージＤＮＡに相補性のプライマー合成オリゴヌクレオ チドを使用して実施される。要約すれば、合成オリゴヌクレオチドは、ファージ を相補する鎖の合成を指向するプライマーとして使用され、その結果生じる二本 鎖ＤＮＡはファージ支持宿主細菌に形質転換される。形質転換細菌培養は寒天の 上にプレートされ、ファージに潜伏する単一細胞からプラーク形成を可能にする 。

理論的には新規プラークの５０％は突然変異形態を一本鎖として有するファージ を含むであろうし、また５０％は本来の配列を持つであろう。生成するプラーク は正対合のハイブリッド形成を可能にする温度でキナーゼ化合成プライマーでハ イブリッド形成することができるが、そこでの本来の鎖での誤対合はハイブリッ ド形成を阻害するにも十分である。プローブでハイブリッド形成されるプラーク は、その後採集され、培養され、かくしてＤＮＡが回収される。

プラスミド構築の正しい連結は、まず適切な宿主を連結混合物で形質転換するこ とにより確認される。広く適応する形質転換細胞は技術上理解されるように、ア ンピシリン、テトラサイクリンあるいは他の抗生物質抵抗性、あるいはプラスミ ド構築のモードに準拠するその他のマーカーを利用して選択される。形質転換細 胞より得られるプラスミドは、全米科学アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　 Ａｃａｄ　５ｃｉ）（ＵＳＡ）（１９６９）６２巻　１１５９頁のり、Ｂ、フレ ウェル他による方法に従って準備することができるし、また選択的にはクロラム フェニコール増幅（Ｄ、Ｂ、フレウェル、ＪＢａｃｔｅｒｔｏｌ　（１９７２） １１０巻　６６７頁）に従って準備することもできる。分離ＤＮＡはＦ、スネー ガー他、全米アカデミ−会報（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉ）（ＵＳ Ａ）（１９７７）７４巻　５４６３頁のジデオキシ法による制限により分析され およびもしくは配列され、更にはメツシング他　Ｆ、５ｕｐＰ、核酸残基（Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅ５）（１９８１）９巻　３０９頁、あるいはマグ ザム他、酵素化学における方法論（１９８０）６５巻　４９９頁の方法により分 析される。

第３の代替案として、ＴＡＰは下記に記述されているように、哺乳類の気管から 直接調製することができる。

またこの発明により、細菌あるいは菌類などの微生物感染を治療する方法が提供 され、その方法としては抗微生物に有効な量のＴＡＰをそのような治療の必要な 哺乳類に投与することが含まれる。そういう治療は、例えば座瘉、火傷、眼の感 染９合喉剤、脱臭剤あるいは局所殺菌剤などの治療に全身あるいは局所で投与す ることができる。ＴＡＰは接触消毒剤としても使用することができる。

抗菌剤として使用するためにＴＡＰは有効量のＴＡＰおよび通常の無毒の担体、 それも当業者に周知の担体を含む薬品組成物に製剤することができる。その組成 物は組成物の形態に合致した投与の経路を経て与えられる。そのような組成物は 例えば溶液、懸濁液、乳濁液、その他類似の通常の液状調製品の形態で、口腔、 経静脈、皮下、筋肉経由で投与することができる。

組成物は蛋白質が有用であると期待される計算の下で一般的には約０．１から約 １００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量の抗菌有効量で投与することができる。

ここで開示される発明のその他の効用は哺乳類における各種゛の遺伝子研究に対 するマーカーとしてＴＡＰのｃＤＮＡ配列を使用することを含む。この種のマー カーは、それぞれＴＡＰ遺伝子の欠損に直接起因しないとすれば、このマーカー に連結する遺伝子に関連する疾病を診断するのに利用することができる。加λて そのような遺伝子マーカーは、他の遺伝子マーカーと同じように、育種の目的の ための制限断片長子型（ＲＦＬＰ）研究に使用することができる。

更にまた、ＴＡＰが哺乳類の気管内で見出された感染に対する宿主の防衛の一部 を表すことから、ＴＡＰの過発現はある微生物の存在により誘発されるものと考 えられる。従ってＴＡＰの量がより多く存在することは、特定の微生物の存在も しくは感染状態の初期であることを示すものである。技術上周知である免疫測定 法あるいはその他の方法でのＴＡＰの蛋白質測定、もしくは周知のハイブリット 形成技法によるＴＡＰメツセンジャーＲＮＡの測定は、感染の診断用具として役 立てることができる。

材料と方法 一般的方法論 あらゆる試薬は特に注記のない限りニューシャーシー州フィリップスバーグ市ベ ーカー社もしくはペンシルヴアニア州ビッツバーグ市フィッシャー社の標準試薬 グレードのものであった。あらゆる細菌培地はミシガン州デトロイト市ディフコ 社のものを使用した。制限酵素はミドランド州ゲイザーズバーグ市ベテスダリサ ーチラボラトリーより購入し、製造業者の実験記録に従って使用された。オリゴ ヌクレオチドプローブは、ガンマ−［”Ｐｌ　ｄＣＴＰ　（３０００Ｃｉ／ｍｍ ｏｌ、プラウエア州つィルミントン市デュポン社）およびＴ４ポリヌクレオチド キナーゼ（カリフォルニア州うホーラ市ストラータジエン社）を使用し、約１０ ’　ＤＰＭ／Ｐｍｏ　１の比活性であると末端標識されていた。二本鎖ＤＮＡプ ローブは、アルファー［”Ｐｌ　ｄＣＴＰ　（８００Ｃｉ／ｍｍｏ　１．プラウ エア州つィルミントン市デュポン社）およびランダムオリゴヌクレオチドブライ マーを伴うＴ７　ＤＮＡ　ポリメラーゼ（ストラータジエン社）と標識されてい た。精製プラスミドＤＮＡは、Ｔ７ボリメラーゼを伴うジデオキシ終結法を利用 して配列された。

（ニー・ニス・バイオケミカルズ社） 組織 成牛の気管（気管分岐間の近位で長さ約４０ｃ＋ａ）の部分が地元の食肉処理工 場からなまのまま得られた。組織は直ちに湿った水の上に置かれ２−３時間内で 処理された。予備実験で示した所では、組織の即時処理は歩留りのさらなる著し い改善はみられなかった。上皮および着生結合組織は下部結合組織および軟骨か ら氷の上に切り裂かれ、直ちに液体窒素内に置かれた。

氷結組織はそれから次の処理の前に数ケ月間−７０℃で貯蔵された。

蛋白質分解 氷結気管上皮は液体窒素の下で乳鉢と乳棒で粉砕された。氷結組織粉は（Ｖ／Ｖ 　：単位体積当たり溶液濃度）１０％の沸騰酢酸中に置かれた。この溶液は室温 にまで温度を低下させ、３０分間１０℃で２３０００Ｘｇで遠心分離された。生 成した上澄は３０ｍＪのアリクオツドに分割され、各アリクオツドはＣＬ８　５ ｅｐ−Ｐａｋ　カートリッジ（マサチューセッツ州ベッドフォード市ミリボアコ ーポレーション）に適用された。これおよび以下の処理すべては室温で実施され た、カートリッジはトリフルオル酢酸（ＴＦＡ）０．１％の水（バッファーＣ） 溶液で洗滌され、その後４ｒｒ＋１２のアセトニトリル１０．１％ＴＦＡ　（６ ０：　４０．Ｖ／Ｖ　・バッフｙ−Ｄ）　で溶離された。カートリッジ溶離物は 乾燥され、ｐＨ７，４，６Ｍグアニジニウム−塩酸１−２ｍ１２／トリス−塩酸 　２０ｍＭで再懸濁された。この溶液は蟻酸アンモニウム、ｐＨ４，１゜５０ｍ Ｍで前もって平衡化されていたバイオゲルＰ−３０カラム（４０ｃ■Ｘ２．５ｃ ｍ径、バイオラッド社）に適用された。排除限界は４０キロダルトンであった。

カラムは同じ蟻酸アンモニウム　バッファーで展開され、各両分（２ｍｇ）は凍 結乾燥され、水（０，１ｍｆｆ）で再懸濁され、前記の通り抗菌活性が検定され た。Ｍ、Ａ、ザスロフ「マゲイニン類、ツメガエルの皮膚から得られる抗菌ペプ チドの部類、二個の活性形態の分離、特性付け、および前駆体の部分ｃＤＮＡ配 列」全米科学アカデミ−会報、８４巻　５４４９〜５４５３頁（１９８７）。活 性画分はプールされ、スルホエチルイオン交換ＨＰＬＣカラム（ミツトランド州 コロンビア市ポリ・ニルシー社）に適用される。バッファーＡからバッファーＢ への４５分線型溶溶離配はｌ　ｍ　１２７　ｍ　ｉ　ｎの流量で使用された。バ ッファーＡはｐＨ５，３，アセトニトリル２５冗／リン酸カルウム５ｍＭの成分 を含み、バッファーＢはバッファ〜Ａと同一成分の地理化ナトリウムＩＭを含ん でいた。２６分で溶離された画分だけが顕著な抗菌活性を持つことが予備実験で 立証された。引き続く分離において、この画分は逆相ＨＰＬＣカラムに適用され 、１ｍ１２／ｍｉｎで線型勾配バッファーＣからバッファーＤを用いて分画され た。２８．５分で溶離した最大画分は凍結乾燥され、約０．５ｍｇ／ｍ！２の濃 度で水中で再懸濁された。

蛋白質配列分析 分離されたペプチドは自動加水分解を伴うアミノ酸分析装置（カリフォリニア州 フォスター市、ＡＢＳ社アプライド　バイオシステム　モデル４２０）を使用し てアミノ酸分析が行われた。配列分析はパルス付液相配列装置（ＡＢＳ社アプラ イドバイオシステム　モデル４７７Ａ）でエドマン分解法により決定された。配 列分析に先立ち、システィン残基がスルフヒドリル還元で確認され続いて４−ビ ニルピリジンと反応された。

Ｍ、Ｅ、セルステッド、Ｓ、Ｓ、ハーウィッグ、他「３種のヒト好中球デフエン ジンの一次構造」治療と治験ジャーナル７６（４）巻　１４３６〜１４３９頁（ １９８５）。ペプチドのＣ末端部は臭化シアンで切断された後ＨＰＬＣで分解さ れた。

Ｐ、検子「限定Ｎ末端配列分析」蛋白質精製へのガイド。ドイツチャー編、アカ デミープレス刊（１９９０）。システィン残基は配列分析に先立ちスルフヒドリ ル還元で確認され、続いて４−ビニルピリジンの反応が行われる。Ｃ，Ｇ、ワイ ルド、Ｊ、Ｅ、グリフイス他「ヒト好中球ペプチド４の精製と特性付け。デフエ ンジン科の新規なメンバー」生物化−学ジャーナＪＬ、２６４（１９）巻　１１ ２００〜１１２０３頁質量分光学 未還元のペプチドの分子量は１０００分解能でＪＥＯＬＨｘｌｌＯ質量分光計（ ボルチモア郡メリーランド大学構造生化学センター）およびＶａｃｃ−＝８ＫＶ で操作されるＶＧ分析ＺＡＢ２−３Ｅ高次場質量分光計（ペンシルヴアニア州ウ ェス・トチニスター市　エムスキャン社）で高速原子衝撃により個別に決定され た。

ＰＣＲ増幅 ＰＣＲ製品は、アンチセンスプライマーとしての縮重オリゴヌクレオトｆド　５ ’−ＧＡＧＣＴＣＤＧＴＩＣＣＤＡＴＹＴＧＹＴＴＣＡＴ、配列識別番号７．セ ンスプライマーとしての５′−ＧＡＡＴＴＣＡＡＹＣＣＨＧＴＢＡＧｉＴＧＹＧ ＴＴ。

配列識別番号１２および５’　−ＧＡＡＴＴＣＡＡＹＣＣＨＧＴＢＴＣＹＴＧＹ ＧＴＴ、配列識別番号６の１：ｌ混合物および鋳型としての（規模により分画前 の）ウシ気管のＤＮＡのプールを使用して得られた。ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ）増幅に対する一般実験記録、Ｒ，に、佐伯、Ｄ、Ｈ，ゲルファント他「耐 熱性ＤＮＡポリメラーゼを伴うＤＮＡのプライマー指向酵素増幅」科学、２３９ 巻　４８７〜４９１頁（１９８８）は遺伝子増幅キット（セタス）より得る試薬 を使用しているが、縮重プライマーを使用して修飾された。鋳型ＤＮＡの最終濃 度は０．２％ｇ／ｍρで、プライマーのそれは１μＭであった。

９４℃での初期変性の後に、反応は９４℃で１分間、５５℃で１分間、更に７２ ℃で３分間保温された。バンドはポリアクリルアミドゲル内での電気泳動の後、 電気溶離により精製された。

ｃＤＮＡクローニング ｃＤＮＡライブラリー構築のため使用される技法および試薬は、その他注記され ない限りカリフォルニア州すンディエゴ市インヴイトローゲン社のものであった 。全メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）は、チャーブウィン他「リボヌクレア ーゼで強化された源より得られる生物活性リボ核酸の分離」生化学１８巻、５２ ９４〜５２９９頁（１９７９）の実験記録に従い使用されたウシ気管上皮から分 離された。ポリ（Ａ”″）（ポリアデニル酸陽イオン）ｍＲＮＡはオリゴｄＴセ ルロースカラム（３′−＞５’社）を使用して選択される。ウシ気管上皮より得 られるポリＡ強化ＲＮＡは、商業的に利用可能なオリゴｄＴプライマー（インヴ イトローゲン社）を使用して逆転写された。第二鋼ｃＤＮＡはＤＮＡ−ＤＮＡ雑 種および大腸菌ポリメラーゼＩのりボヌクレアーゼＨ消化を利用して合成された 。

Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼは平滑末端ｃＤＮＡを研磨するために使用され、その 後、半リン酸化Ｎ　Ｏｔ　−１／　Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ−１アダプターが平滑末端連 結反応で加えられた。このｃＤＮＡの一部（０，３μｇ）はアガロースゲル電気 泳動によってサイズ分画され、画分（３００−３０００塩基対）は電気溶離で回 収された。ｃＤＮＡはＥｃｏＲ−１消化ラムダｇｔｌｏ（ストラータジエン社） に連結され、組換えファージはギガバック−ゴールド・パッケージング抽出（ス トラータジエン社）を用いてパッケージされた。約５Ｘ１０’個の独立ファージ が得られると共に、１０６個のファージは３ｘ　１０’　／１５０ｍｍプレート の密度でＣ６００ｈｆｆｆ−大腸菌菌叢の上で培地された。コロニー／プラーク ふるい分はフィルター（デュポン社）を使用して重複リフトが行わた。フィルタ ーは下記３個のプローブ部を使用して配列的にふるい分けた： ５′−ＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＴＧＴＴＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣ ＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴ−３′、配列識別番号１０．５’　−ＡＡＴＡＡＡＧＧ ＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡ ＡＣＡＧＡＴＴＧＧ−３′、配列識別番号１１．およびＰＣＲ製品。

ＰＣＲ−ＢＴ４０．１　（配列は決定させず、製品はここでＰＣＨの下で詳細に 示されるものより派生する）がそれであった。ふるい分けの標準状態は修飾され 下記のとおりであった：オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリッド形 成および洗滌に対しては５０℃、６ＸＳＳＣ，二本鎖プローブに対してはそれぞ れ３７℃、５ＸＳＳＣ／フォルムアミド２０％およびハイブリット形成および洗 滌に対しては５５℃、６ＸＳＳＣであった。

選択されたクローンはプラーク精製され、ＤＮＡは液状ライゼート（溶菌液）か ら得られた。ｃＤＮＡ挿入断片はＥｃｏＲＩ消化により得られ、ブルースクリプ トプラスミド（ストラータジェン社）にサブクローンされた。

ノーザンブロッティング分析 ＲＮＡはフォルムアルデヒドの存在の下でアガロースゲル電気泳動で分画され、 中細管法によりナイロン膜（ナイトラン、シュライヒャー　アンド　シュニル社 ）にブロッティングされた。放射性物質で標識されたＤＮＡプローブは、フォル ムアミド２０％／　５　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ／　５　ｘダンハート溶液／５ＤＳ０． １％内で４２℃でハイブリッド形成され固定化ＲＮＡにされ、Ｏ，ｌＸ５ＳＣ／ ＳＤＳ　０．１％、６５℃で洗滌された。

抗菌検定 精製期間中の抗菌活性は、ザスロフの文献に記述されたプレート検定により決定 された。「マゲイニン類。ツメガエルの皮膚により得られる抗菌ペプチドの部類 ・二個の活性形態の分離、特性付け、および前駆体の部分ｃＤＮＡ配列」全米科 学アカデミ−会報、８４巻　５４４９〜５４５３頁（１９８７）。

各両分（２−５μ２）の濃縮アリクウオットとは、バクトドリブトン１０ｇ／β 、酵母菌抽出物５ｇ／Ｉ２．アガロース０．７５％（シグマ社）、トリスｐＨ７ ，４のもの２５ｍＭ。

ＮａＦ５０ｍＭを含有するベトリ皿の上で大腸菌菌株Ｄ３１菌叢上にスポットさ れ、３７℃で一晩保温された（Ｈ，Ｄ、スタイナー、Ａ、ハルトマーク他「昆虫 の免疫性に含まれる二種の抗菌蛋白質の配列および特異性」科学、２９２巻　２ ４６〜２４８頁（１９８１） ペプチドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）は０．２Ｘトリブチカーゼ大豆肉汁（ＴＳＢ ）内で細菌２．５ｘｌＯ’を保温し、９６ウエルマイクロタイタプレートで一晩 ３７℃でペプチドの濃度を増加して決定された。

結果 ペプチドの分離 ウシ気管上皮は酸の中で抽出され、ゲル濾過ｎバイオゲルＰ−３０でサイズ分画 された（第１図Ａ）。気管抽出の溶離プロフィルは（２２０ｎｍでモニターされ ）紫外線吸収で二つのピークを示した。抗菌活性は１３画分（空隙容量）から６ ０画分（含有容量）までに対し大腸菌菌株Ｄ３１を使用して検定された。（Ｈ， Ｄ、スタイナー、Ａ、ハルトマーク他、前掲文献（１９８１））。３２−３６画 分は清澄な殺菌帯で明示されるように顕著な活性を示した（第１図Ｂ）、これら の画分はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛋白質の銀染色（データ は提示されていない）により分析された際のペプチド領域（すなわち５０００ダ ルトン以下）に対応した。

抗菌画分はプールされた後、イオン交換ＨＰＬＣで分画された（第１図（：）、 ２５．６分間で分離されたピークは、唯一検出できる抗菌活性を含んでいた。こ のピークは集められ、更に逆相ＨＰＬＣによって精製された（第１図Ｄ）。ここ ではＣＨｉ　ＣＮで溶離した蛋白質の単一の層を成したピーク（矢印）および抗 菌活性（データは提示されていない）が存在した。全歩留りは上皮（湿潤重量） の約２μｇ／ｇであった。ペプチドの純度は、単一の基本帯で示された分析（デ ータは提示されていない）用ＨＰＬＣおよび酸ポリアクリルアミド電気泳動で検 定されたように９５％以上であった。

ＴＡＰの蛋白質配列分析 精製ペプチドは自動液相配列およびアミノ酸組成物分析（第１表）を使用して蛋 白質配列分析を受けた。アミノ末端残基は直接分析され、更に、カルボキシ末端 残基は臭化シアン切断に従って分析された（第２表Ａ）、蛋白質配列分析により 決定された配列は３４４３分子量と予定された。精製ペプチドの分子量は質量分 光学分析で４０８５．５と決定され、蛋白質配列が不完全であることを示した。

ペプチド配列の残りの部分はクローンｃＤＮＡの分析で演鐸された。

第１表 ＴＡＰのアミノ酸分析 アミノ酸組成物は精製ＴＡＰ　（配列識別番号ｌ）の２００ｐｍｏｌを加水分解 した後で決定された。その結果は蛋白質ｍｏ１当りのアミノ酸ｍｏｌで発現され た。

ＴＡＰ　ｃＤＮＡのクローニング 縮重オリゴヌクレチトプライマー（配列識別番号６．配列識別番号１２および配 列識別番号７）は第２図Ｂで示されているように、アミノ酸１−６　（ＢＴ−４ ０−１およびＢＴ４０−２）およびアミノ酸２１−２６　（ＢＴ−４０−３）ｉ ：それぞれ対応するように設計された。センスプライマー１（配列識別番号６） および２（配列識別番号１２）は５′末端と一体化したＥｃｏＲ１認識部位をも ち、またアンチセンスプライマー３（配列識別番号７）はその５′末端に５ｓｔ ｌ認識部位を有していた。これらのプライマーは鋳型ＤＮＡとしてウシ気管ｃＤ ＮＡを使用するＰＣＲとして用いられ、また１−２６アミノ酸をコードするヌク レオチド配列を増幅するものと期待された。主要なりＮＡ製品は長さを９０塩基 対あり、ペプチドの一次構造、および選択されたオリゴヌクレオチドプライマー に基礎をおくものと期待された。これはペプチドをコード化するｃＤＮＡがライ ブラリー内に存在し、プローブ合成のためのＤＮＡ鋳型を生成することを示すも のであった。

ウシ気管上皮より得るｃＤＮＡライブラリー（約１０’独立ラムダｇｔ、ｉｏフ ァージ）は、３個のプローブを同時に使用してふるい分けられた。３個のプロー ブはＰＣＲ製品（配列なし、ここで記載されているＰＣＲとして得られる製品） 、および公開コドン頻度図を使用するペプチド配列識別番号ｌに準拠して設計さ れた２個の「最良推量」合成オリゴヌクレオチドプローブ（配列識別番号１０お よび配列識別番号１１）であった。Ｒ，レイズ「アミノ酸配列データより演鐸さ れた合成オリゴヌクレオチドプローブ。理論的実践的考察」分子生物学ジャーナ ル、１８３巻　１〜１２頁（１９８５）。（１５個ある内の）３個のプローブの ２個でハイブリッド形成されるクローンだけが正であると見做され、その内の７ 個は更に詳細に分析された。いくつかの正のクローンはプラーク精製され、挿入 断片はブルースクリプトプラスミドにサブイクローンされた（ストラータジェン 社）。すべての挿入断片はほぼ同一サイズのものであり、ＤＮＡ配列分析はそれ らの一つで実施された。

ｃＤＮＡクローンｐＢＴ４０−４．４．配列識別番号４の配列は第３図で示され る。

前駆体蛋白質のｃＤＮＡ配列（第３図、配列識別番号４）は第１ＡＴＧコドン（ ３５塩基）からの長さが６４個のアミノ酸の読み取り枠を含んでいる。Ｎ末端ア スパラギン残基で始まり、配列識別番号２の１１３−２２５ヌクレオチドでコー ド化された配列識別番号１の演鐸されたアミノ酸配列はアミノ酸データと完全に 一致する（第２図Ｄ）。ペプチド分析により溶離した配列の大部分のカルボキシ ル末端残基を越える５個の残基に広がる読み取り枠は、次いで枠内終止コドンに つながる。

このクローンから得られるペプチドのアミノ酸配列は予言では４０９１個の分子 量を有している。もしすべてのシスティン残基がジスルフィド結合に含まれるな ら、質量分光計データと完全に一致してこれらは予言分子量を４０８５個に下げ るであろう、この予言ペプチドのアミノ酸組成物はペプチドのデータとうまく合 致する。

ノーザンブロツティング分析 肺全体より分離され気管粘膜から分離されたＲＮＡは、プローブとしてのｃＤＮ Ａ挿入断片（配列識別番号４）を利用するノーザノブロッティング分析を受けた （第４図）、緊縮状態の下でｃＤＮＡ　（配列識別番号４）プローブは、ウシ肺 ＲＮＡと同一サイズのより少なめの種と共にウシ気管ｍＲＮＡ内で約４００塩基 対の豊富なメツセージを認識した。ゲルを染色する臭化エチジウム（データは提 示されていない）およびウシアルファチューブリンプローブのハイブリッド形成 （第９図）によって立証されるように、二つのレーンはＲＮＡの同一量を有して いた。

ＴＡＰの抗菌活性 ここで記述された方式で得られる精製されたウシＴＡＰは、試験管内での抗菌活 性を決定するために細菌のいくつかの菌株でテストされた。第■表で示される結 果は、ＴＡＰ　（配列識別番号１）がグラム陽性およびグラム陰性細菌に対し、 抗菌活性を有していたことを示す。加えてこのペプチドは鵞ロ癒カンジダ菌に顕 著な活性を有している。ペプチド、配列識別番号ｌの観察された活性は、ここで 使用された検定において合成マゲイニン−２−ＭＨＩ　（配列識別番号５）と同 程度の大きさにある。

第■表 ＴＡＰ　（配列識別番号１）およびマゲイニン２−ＮＨＩ　（配列識別番号５） の抗菌活性 最小阻害濃度は微生物的２．５Ｘ１０’を適当量のベブチド５０，２５，１２． ５，６．２５あるいは３．１２５μｇ／　ｍ　１２と共に０．２５ＸＴＳＢで保 温することで決定された。

生体（ＡＴＣＣ）　最小阻害濃度（μｇ／ｒ＋１）（１）一般情報： （ｉ）出願人：ベヴインズ、チャールズ　Ｌ。

ダイヤモンド、ジル ザスロフ、マイケル （ｉｉ）発明の名称：抗菌ペプチド、ＤＮＡ配列、およびその生産方法と用途 （ｉｉｉｌ配列数：１２ （１ｖ）連絡先： （Ａ）名称：ウッドコック　ウォッシュバーン　カーツマッキーヴイッツ　アン ド　フリユ （Ｂ）ストリート名：ワン　リバテイ　プレース−４６階 （Ｃ）都市名：フィラデルフィア （Ｄ）州名：ペンシルヴアニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ジップコード：１９１０３ （Ｖ）コンピュータ読取りフオーム： （Ａ）記録媒体：３．５インチ　ディスク、記憶容量１．４４　メガバイラ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−ＤＯ３ （Ｄ）ソフトウエア：ワードパーフェクト　５．０（ｖｉｉｉｌ弁護士／代理人 情報： （Ａ）氏名：バトリシア　Ａ、シュレツク（Ｂ）登録番号：　３３７７７ （Ｃ）参照／ドケット番号：ＣＨ−０００５（Ｌｘ）通信情報： （Ａ）電話：　（２１５）５６８−３１００（Ｂ）テレファクス：　（２１５） ５６８−３４３９（２）配列識別番号１に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ二アミノ酸３８個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号１：Ｍｅｔ　１．ｙｓ　Ｇｌｎ　Ｔｉｅ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ（２）配列識別番号２に関する 情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対１１４個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態＝２本鎖 （Ｄ）トポロジー＝ＩＩ型 （×１）配列の記述：配列識別番号２：ＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡ　ＧＣＴＧＴＧＴ ＴＡＧ　ＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＴＣ ＣＴＧＧＡＡＧＣ６０ ＡＴＧＡＡＡＣＡＧＡ　ＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧ　ＴＧＴＴＧＧＧＣＧＧ　ＧＣＡ ＧＴＡＡＡＡＴ　ＧＣＴＧＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧ　１１４ （２）配列識別番号３に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ二アミノ酸６４個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：ｍ型 （×１）配列の記述：識別番号３： （２）配列識別番号４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対３４９個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：ｉｉ型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号４：ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣ ＣＧ　ＣＴＣＧＧＧＡＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧ　ＣＴＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧ ＣＴＣＣＴＣＧ（：　６０ ＧＣＴＣＣＴＣＴＴＣ，ＣＴＧＧＴＣＣＴＧＴ　ＣＴＧＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＡ ＴＴＴＡＣＴ　ＣＡＡＧＧＡＧＴＡＧＧＡＡＡＴＣ（：ＴＧＴ　１２０ ＡＡＧＣＴＧＴＧＴＴ　ＡＧＧＡＡＴＡＡＡＧ　ＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＣ ＧＡＴＣＡＧＧ　ＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＡＡＣＡ　１８０ ＧＡＴＴＧＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＴＧＧＧＣＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡ　ＡＴＧＣＴ ＧＴＡＧＡ　ＡＡＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧ（：ＣＡＡ　２４０ ＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧ　ＧＧＡＴＣＡＡＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＡＡ　Ａ（：Ｔ ＧＣＧＣＣＣＴ　ＴＴＧＡＣＡＧＡＧＣＧＴＣＴＡＡＡＡＴＴ　３００ ＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡ　ＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴ　丁ＣＡＡＡＧＴＴＡＡ　ＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（２）配列識別番号５に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ二アミノ酸２３個 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号５：Ｍｅｔ　Ａｓｎ　５ｅｒ （２）配列識別番号６に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｘｌ）配列の記述：配列識別番号６：ＧＡＡＴＴＣＡＡＹＣＣＨＧＴＢＴ（： ＹＴＧ　ＹＧＴＴ（２）配列識別番号７に関する情報： （Ｌ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対２４個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー：線型 （にｉ）配列の記述：配列識別番号７：ＧＡＧＣＴＣＤＧＴｉ　Ｃ（：ＤＡＴＹ ＴＧＹＴ　ＴＣＡＴ（２）配列識別番号８に間する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対４４個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー：線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号８：ＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴ　ＣＣＴＧＴＧＴ Ｇ（：Ｇ　（：ＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＣＡＴ（２）配列識 別番号９に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対５３個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号９：ＡＡＣＡＡＧＧＧＣＡ　ＴＣＴＧＴＧＴ ＧＣＣＣＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡ　ＴＧＡＡＧＣＡＧＡＴＧＧ （２）配列識別番号１０に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対４４個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー：線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号ｌ０＝ＡＡＴＣＣＴＧＴＡＡ　ＧＣＴＧＴＧ ＴＴＡＧ　ＧＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＧＡＴ（２）配列識別 番号１１に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対５３個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー：線型 （ｘｌ）配列の記述：配列識別番号１１：ＡＡＴＡＡＡＧＧＣＡ　ＴＣＴＧＴＧ ＴＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧＴＧＴ　ＣＣＴＧＧＡＡＧＣＡ　ＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴ ＧＧ （２）配列識別番号１２に関する情報：（ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：塩基対２４個 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖の形態ニー木調 （Ｄ）トポロジー二線型 （ｘｉ）配列の記述：配列識別番号１２：ＧＡＡＴＴＣＡＡＹＣＣＨＧＴＢＡＧ ｉＴＧ　ＹＧＴＴＦＩＧ、旧 ｗ４４ト上きう〈樽０バ（ヤ→） ）−リエ１＼工き→　− フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／Ｃ０７Ｋ　９９：０ ０ （７２）発明者　ベヴインズ、チャールズ　エル。

アメリカ合衆国、ペンシルヴアニア １９０２６　、ドレクセル　ヒル、ロンバーディストリート５２８ Ｉ （７２）発明者　ダイヤモンド、ジル アメリカ合衆国、ペンシルヴアニア １９１５１、フィラデルファア、ラスキン　ロード　７３５１

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）配列識別番号１で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列および少な くとも同じ抗菌活性を有する気管抗菌ペプチド。
2. （２）配列識別番号３で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を有する気 管抗菌ペプチド前駆体。
3. （３）配列識別番号１で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列および少な くとも同じ抗菌活性を有する気管抗菌ペプチドをコードするｃＤＮＡ。
4. （４）配列識別番号３で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を有する気 管抗菌ペプチド前駆体をコードするｃＤＮＡ。
5. （５）配列識別番号４で定義されるｃＤＮＡ配列。
6. （６）配列識別番号２で常識されるｃＤＮＡ配列。
7. （７）配列識別番号１で定義される気管抗菌ペプチド配列。
8. （８）配列識別番号３で定義される気管抗菌ペプチド前駆体配列。
9. （９）請求項３記載のｃＤＮＡから生産される蛋白質。
10. （１０）請求項４記載のｃＤＮＡから生産される蛋白質。
11. （１１）請求項５記載のｃＤＮＡから生産される蛋白質。
12. （１２）請求項６記載のｃＤＮＡから生産される蛋白質。
13. （１３）事実上精製され分離される哺乳類気管抗菌ペプチド前駆体であって、配 列識別番号３で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を少なくとも一部有 する蛋白質を含も前駆体。
14. （１４）事実上精製され分離された哺乳類気管抗菌ペプチドであって、配列識別 番号１で定義される蛋白質と事実上同じアミノ酸配列を少なくとも一部有し、ま た少なくとも同じ抗菌活性を有する蛋白質を含むペプチド。
15. （１５）哺乳類源がウシである請求項１３記載の事実上精製され分離された哺乳 類気管抗菌ペプチド前駆体。
16. （１６）哺乳類源がウシである請求項１４記載の事実上精製され分離された哺乳 類気管抗菌ペプチド。
17. （１７）細菌感染の治療法であって、その種の治療を必要とする哺乳類に対し請 求項１記載の気管抗菌ペプチドの抗菌有効量を投与することよりなる治療法。
18. （１８）請求項１記載の気管抗菌ペプチドの有効量よりなる接触消毒薬。
19. （１９）調剤上許容できるキャリアーに請求項１記載の気管抗菌ペプチドの有効 量を含む薬剤組成物。
20. （２０）請求項３記載のｃＤＮＡよりなる遺伝子マーカー。
21. （２１）哺乳類気道の感染を診断する方法であって、（ａ）試験される哺乳類の 気道から採取された標本内に存在する請求項１記載の気管抗菌ペプチド量を測定 し、（ｂ）感染していないことが判明している哺乳類気道から採取された標本内 に存在する請求項１記載の気管抗菌ペプチド量を測定し、 （ｃ）標本（ａ）に存在する請求項１記載の気管抗菌ペプチドの量と標本（ｂ） に存在する請求項１記載の気管抗菌ペプチドの量とを比較する 診断方法。
22. （２２）宿主細胞によって請求項１記載の気管抗菌ペプチドの発現に十分な請求 項３あるいは請求項５のｃＤＮＡもしくはその一部で形質転換された組換え宿主 細胞。
23. （２３）請求項２２記載の細胞で生産された請求項１記載の気管抗菌ペプチド。
24. （２４）請求項１記載の気管抗菌ペプチドを生産する方法であって、組換え宿主 細胞を培養することよりなり、そこで前記宿主細胞に形質転換される組換えＤＮ Ａは請求項１記載の気管抗菌ペプチドをコード化するＤＮＡ配列を有し、前記形 質転換細胞内に前記コード配列の発現を実施することができる適切な調節対照配 列と操作上連鎖している組換えＤＮＡを含む組換え宿主細胞を培養して請求項１ 記載の気管抗菌ペプチドを生産する方法。
25. （２５）適切な発現システム内で発現可能な組換えベクターであって、前記発現 システムと両立できる対照配列と操作上連鎖する請求項１記載の気管抗菌ペプチ ドをコード化するＤＮＡ配列よりなる組換えベクター。