JPH06501001A

JPH06501001A - ヒトインターフェロン−γ４−１３４，その機能的均等物およびこれらの物質の使用法および組成物

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Publication number: JPH06501001A
Application number: JP3516035A
Authority: JP
Inventors: ナルラ，サットワント・ケイ; ランデル，ダニエル・ジェイ
Original assignee: シェリング・コーポレーション
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-08-29
Publication date: 1994-01-27
Also published as: CA2090478A1; EP0546099B1; DE69104619D1; ATE112686T1; DE69104619T2; AU8640091A; EP0546099A1; WO1992004377A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の名称］ヒト　インターフェロン−γ　４−１３４．その機能的均等物およびこれらの物質の使用法および組成物［技術分野］本発明は特別のヒト　ガンマ　インターフェロン、ＩＦＮと４−１３４およびその機能的均等物およびこれらの物質を用いる方法および組成物に関する。

［背景技術］ヒト　ガンマ　インターフェロン（本明細書では常にＨｕ　ＩＦＮγとして示される）は抗ウィルス、抗増殖および免疫制御活性を持っている（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎ、Ｔｏｄａｖ、６，１３１−１３６（１９８５））、ヒトｒＦＮγに対するｃＤＮＡはクローン化され大腸菌中で発現されて大量の蛋白質Ｈｕ　ＩＦＮγが得られている（Ｇｒａｙ　ｅ工　立上０．■立１隻二二、λ又５．５０３−５０８（１９８２））、いくつかの初期の研究はＴＦＮγのカルボキシ末端がこの分子の重要な構造的および機能的特性を示すであろうことを示唆している（Ｆａｖｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｔｍｍｕ二旦り、　２６：１７−２５（１９８８）＋Ｂｕｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　。

（１９８５）Ｈ，ＫｉｒｃｈｎｅｒおよびＨ，５ｃｈｅｌ　１ｅｋｅｎｓ　（ＩＩ）（ン　−フエロン　シスームの　８　、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ｐＰ４０３−４０９：Ｈｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ。

１旦ｔ、Ｒｅｓ、、５．１４５−１５４　（１９８７）；Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５９．６７９０−６７９７＜１９８４）；Ｒｕ５ｓｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｎｔ、Ｒｅｓ、、８．４３３−４３９（１９８８）：Ｄｏｂｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃ坦几立上旦盈上、ヱ、　１９９−２１６　（１９８８））。これらの研究のほとんどは蛋白分解生成物で実施された。

Ｈｕ　ＩＦＮγは本明細書の配列番号１（請求の範囲の直前の）により定義される１４６アミノ酸残基の配列を持つポリペプチドである。そこで使用された番号は野生型ｒＦＮｒ中のアミノ酸配列を示しており、本所ｍ書の本文中で多照される場合これらの番号がまたアミノ酸配列に使用されている。

多くの研究者がＨｕ　ＩＦＮγのカルボキシ末端変異体について試験した１本研究は天然のＨｕ　ＩＦＮγにおけるカルボキシ末端が不均一であるという観察に刺激を受けたものである。Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ９．は（上記文献）最も長い天然Ｈｕ　ＩＦＮγ種はアミノ酸１３７で終結しているが、他のらのは１３５，１３３，１３２．１３１および１３０で終わっていることを示した。Ｐａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６６．１４５− １４９　（１９８７）はカルボキシル末端でのわずかに異なった不均一性と示した。Ｄｏｂｅｌｉ　ｅｔ　ａｌ、、（上記文献）はカルボキシル末端の欠失を示したＨｕ　ＩＦＮγの遺伝工学による変異形（以下一般に“欠失突然変異体”と称される）の最も完全な分析を行った。彼らはカルボキシル末端から９または１０のアミノ酸が除去された堝きに生物活性が大きく増加（特に抗ウィルスおよび抗増殖活性およびマクロファージ活性化）する事と示した。１４または１８ｐ！基が除去された場合、この活性は完全長分子の活性より低下した。

［発明の開示］魚明凶！約本発明は本明細書の配列番号１の配列における４から１３４の番号を付けた残基の配列により定義されるアミノ酸配列；またはＭｅｔが先頭に付けられた前記配列を持つ、端を切り取った組換えヒト　インターフェロン−γ：またはこれらのポリペプチドの両方のｔ！Ｊ能的均等物牙提供する。驚くべきことに完全長ＨｕＩＦＮγ（１−１４６＞の４番目から１３４番目のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を持つポリペプチドが非常に都合の良い性質を持っていることが発見された。

特に、ＩＦＮγ４−１３４と称される本発明の蛋白質および以下に記載されるようなその機能的均等物はＴＦＮγ４−１３７の抗ウィルス活性を本質的に持っていないが、ＩＦＮγ４−１３７のＨＬＡ−ＤＲ誘導活性を本質的にすべて保持している。従ってＩＦＮγ４−１３４およびその機能的均等物は通常ＩＦＮγの抗ウィルス活性に関係する炎症性副作用を伴うこと−”、（（ＩＦＮγ４−１３７および他の類似のＨｕ　ＩＦＮγの抗原誘導を提供するであろう。ＴＦＮγ４− １３４およびその機能的均等物は抗体応答を増加させるためにワクチンの添加物とじて都合よく使用することができる。ｔｆｓＴＦＮｒ４−１３４およびその機能的均等物はＨ瘍ｍ胞中の表面抗原発現を増加させるので、そのような細胞は繕胞障害性細胞の作用に対しより敏感になり、ＩＦＮｒ４−１３４およびその機能的均等物はそれ故に抗腫瘍剤として使用されるであろう。

本発明はまた、本明細書の配列番号１の配列における４から１３４の番号を付けられた残基の配列により定義されるアミノ酸配列を持つ、端を切りとった組換えヒトインターフェロン−γ、またはその機能的均等物をコードしているＤＮＡ配列を含む組損えベクターも提供し、その組換えベクターは適合した宿主生物体中でＤＮＡ配列の発現を支配できる（即ち、ＤＮＡ１ｖ！列はその発現＃胛配列と作動可能なように結合されている）１本発明はまたさらに、そのような組換えベクター（即ち、微生物中でＩＦＮｒ４−１３４ポリペプチドまたはその機能的均等物を発現できるベクター）と含む微生物を提供する。

本発明はまた薬学的に受容可能な担体または賦形剤と組合わされたＩＦＮｒ４− １３４またはその機能的均等物を含む医薬組成物も提供する。そのような組成物はまた免疫強化量のヒト　リンホカイン、特にＧＭ　ＣＳＦ、Ｇ　Ｃ５Ｆ、Ｍ− ＣＳＦ、ｒＬ−３、ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６およびＩＬ−７から選択される組損えヒト　リンホカインを含んでいてもよい、以下の参考文献〈すべてが本明細書に引例として含まれている）はこれらのリンホカインの一般的文献として引用されたものである：Ｌｅｅ　且１　立上、“喘乳顕細胞における機能的発現によるヒト顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子のｃＤＮＡの単離”。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ、８２；４３６０−４３６４（１９８５）；５ｏｕｚａ　立１　主±、５　組損えヒト顆粒球コロニー刺激因子：正常および白血病骨１１Ｉｓ胞に対する影響”、５ｃｉｅｎｃｅ、２３２：６ｌ−６５（１９８６）；Ｙａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、°゛ヒトＩＬ−３マルチ −Ｃ５Ｆ）二ネズミＴＬ−３に関連した新規造血増殖因子の発現クローニングによる同定”、Ｃｅ１ｌ　４７：３　１０（１９８６）；Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｔ、。

”Ｂ細胞およびＴ細胞刺激活性を発現する、マウスＢ４１胞刺激因子１と相同的なヒト　インターロイキンｃＤＮＡクローンの単離および特徴付け”、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８３　：　５８９４−５８９８　（１９８６）；Ｔａｋａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、、−インターロイキン５．Ｔ［ｉ由来Ｂ細胞分化因子はまたｍ砲障害性Ｔリンパ球も誘導する”、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：４２３４−４２３８（１９８７）；Ｃｈｉｕ　ｅｔａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８５ニア０９９−７１０３　（１９８８）；およびＣｈａｚａｎ　ｅｔ　ａユ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８６　：　５９２３−５９２７　（１９８９）：および以下の特許：ＥＰＡ　Ｏ２０２３００，ＰＣＴ／ＥＰ　８５１００３２６（Ｗｏ　８６１００６３９として公開）およびＰＣＴ／ＵＳ　８６１０２４６４（Ｗｏ　８７１０２９９０として公開）。

本発明の別の実施態様では、ＩＦＮｒ４−１３４またはその機能的均等物を投与することによる、ワクチンに関連した抗体応答を増加させる方法、細胞障害性細胞への腫瘍細胞の感受性を増加させる方法および腫瘍細胞による表面抗原の発現を増加させる方法が提供される。本発明はさらにＩＦＮｒ４−１３４またはそのＩ！能的均等物と一緒にワクチンを含んだ医薬組成物を提供する。

［図面の簡単な説明］図１は完全長ＴＦＮγ（１−１４６）を運ぶプラスミドＰＩＮ５ＧＩＦ５４の構成を示している図式的な表現である。

図２はプラスミドＰＩＮ５ＴＧＩＦ５４およびＰＴＮ５Ｔ４の構成を示している図式的な表現である。

図３はプライマー修復法により誘導されたカルボキシ末端欠失突然変異体を用いるｐＧｒＦ４−１２５およびρＧＩＦ４−１３７の構成を示している図式的表現である。

図４はプラスミドＰＪＦ１３−３−６の構成を示している図式的な表現である。

［発明を実施するための最良の形態］ここに引用されたすべての文献は本明細書の引例として含まれている。

遺伝コードが縮重している為、ＩＦＮｒ４−１３４およびその機能的均等物のアミノ酸配列をコードできる多くの可能なヌクレオチド配列が存在することが理解されるであろう。適当な宿主生物体中、ｒＦＮ１４〜１３４またはその機能的均等物の産生を組換えベクターが支配できさえすればベクター内へ挿入された本発明のＤＮＡ配列のヌクレオチド配列は実際め構造遺伝子の一部ではないヌクレオチド（例えばイントロン）を含んでらよいことを理解しなければならない。

さらに、本質的に生物および免疫学的活性を変化させない蛋白質中のアミノ酸置換が起こることが知られており、記述されている、例えばＮｅｕｒａｔｈｅｔ　ａｌ、＋蛋白質”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９＞、特にページ１４のＩ］６．ｊ！ｌも頻繁に観察された置換はＡｌａ７／Ｓｅｒ、Ｖａｌ、／Ｉ　Ｉｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／’Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、ＡＩａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ、／Ｇｌ　ｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｔ　ａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／′Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉ　ｌ　ｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙであり、逆もまた同じである。

これらの１損はＩＦＮｒ４−１３４アミノ酸配列中の可能な置換を意味し、従ってＩＦＮｒ４−１３４め機能的均等物を提供する。また、別の本発明のＩＦＮｒ４−１３−３１１１Ｗ的均等物は、前に示したような４−１３４配列の番号４のアミノ酸の前に最初にＭｅｔアミノ酸を含んでいるものであろう。本発明の他のＩＦＮｒ４−１３４機能的均等物は前に示したような４−１３４配列の４−および５位の各々のＧＩ　ｎおよび、７′またはＡｓｐが欠失しているであろう、従ってこれらのＩＦＮｒ４−１３４の機能的均等物トハ、１２９７ミ／ａ！（ＭえＧｆｌＦＮｒ６−１３４＞１３０アミノ酸（例えばＩＦＮｒ５−１３４またはＭｅｔ６−１３４ン、１３１アミノ酸（例えばＩＦＮｒ４−１３４才たけＭｅｔ− ５−１３４）または１３２アミノＭ（ＨえばＩＦＮｒ　Ｍｅｔ−４−１３４＞のポリペプチドを意味しており、これらは以下に記載するように抗ウイルスアッセイにおいてＩＦＮｒ４−１３７の抗ウィルス活性の４％未満、好適には３％未満および最も好適には１％未満の活性しかもっていす、以下に記載するようなりラスＩ　ＴＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）め細胞蛍光測定による決定と題されたア・γセイにおいてはＩＦＮｒ４−１３７のＨＬＡ−ＤＲ誘導活性の５０％以上、好適には７０％以上および最も好適には８５％以上の活性であり、これらはこのパラグラフに記載されたＩＦＮｒ４−１３４配列中に１つまたはそれ以上のアミノＭ変異を持っている。本発明の好適な形はその機能的均等物よりもむしろＩＦＮｒ４ −１３４それ自身である。

好適には、組換えＩＦＮｒ４−１３４またはその機能的均等物はすべての他の蛋白質を実質的に含んでいない、“実質的に含んでいない″とはＩＦＮｒ４−１３４またはその機能的均等物は１％（Ｗ／Ｗ）未満および好適には０．５％（ｗ、 ’ｗ）未満の夾雑蛋白質（特に遺伝子工学宿主細胞（例えば大腸菌）起源の蛋白質および他の形の［ＦＮγ）しか含んでいないことをｉ！味している。

ＩＦＮｒ４−１３４およびその機能的均等物は本分野の通常の技術により製造できる。典型的には、適当なＩＦＮｒ４−１３４またはその機能的均等物のための遺伝子またはｃＤＮＡが最初に製造および単離される。これらのＤＮＡ材料を得るために多くの異なった方法が実施できる。好適には、下記のスキームで図式的に示されているようにＧｒａｙ　立ｔ、ａ１．．（凡二立ニーＮ主上上４人旦ａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８０．５８４２−５８４６　（１９８３））により記載されたプライマー修復法が用いられた０本方法においては、遺伝子上の適当な部位と相補的なオリゴマーが合成され、問題とする遺伝子、この場合ＩＦＮγ４− １４６をコードしている遺伝子、を運ぶ変性ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせるのに使用される。この技術はＩＦＮｒ４−１４６の種々の必要な欠失突然変異体を（）るのに使用できる。

この方法において、配列番号２および３で与えられたオリゴマーがプライマー修復および従ってカルボキシ末端欠失突然変異体の限定に使用できる：それらはＨｕ　ＩＦＮｒの各々１２５または１３７位の後に停止トリ１し・ットを導入する。

最初のＣ（シトシン）は充填されｔＳ旦且ユＩ未満を完全に旦且ユ■認識配列５゜−ＧＴＣＧＡＣ−３°に再構成する。配列番号２または３の配列の各々の最初のトリプレットＣＴＡは停止トリプレットを表わしている（コード鋼上のＴＡＧに対応する）０次のトリプレットＣＧＧまたはＣＡＴは各々ポリペ７チドの最陵のアミノ酸をコードしている（即ち各々１２５Ｐｒｏまたは１３７Ｍｅ　ｔ　）次のスキームはＩＦＮｒの所望の分画をコードするオリゴヌクレオチドを提供するためにＧｒａｙ　ｅｔ、旦、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｆＵＳＡ、＠に引ｍ＞のプライマー修復法がどのように使用できるかを示している。

二本Ｍ’ｌｆｒ片は次に所望の１ラスミド（例えば図３に示されているような）内へ結合される、ここでＸは停止トリプレット分示し、下線を付けたスラッシュ（己）はクレノー断片（３′−５°エキソヌクレアーゼおよび５′−３°ポリメラーゼ）により除去される一本鎖ＤＮＡの一部を示している：ｏＲＩ一旦且±■ 断片を単離。

Ｌｍを分離するため９５℃で変性 ↓　クレノー断片と添加（３’−５’エクソヌ２レア−モ）１　二本誤断片分単離生じる二本鎖断片は次に所望のプラスミド（例えば図３に示されたような）内へ連結される。

社扛ａよび方法ａ　ｅｔａｌ、、（前記文献）により記載されているｐＧｒＦ５と類似しているが、ただし−Ｌｐ＋プロモーターは上主旦　ＵＶ５プロモーターに置換されていた。

本実施例のすべての発現作業およびプラスミド単離作業に大腸菌２９４が使用された。すべての必要な酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓがら購入された。１．、ＰｒＮ５ＴＧＩＦ５４お　ＰＺＮ５Ｔ４の１、、Ａ、ＰＩＮ５ＧＩＦ５４の構築ＰＧＩＦ５４およびＰＩＮＩＡ２がＰ　Ｉ　Ｎ　５　Ｇ　Ｉ　Ｆ　５４楕築のための出発プラスミドとして使用された（図１）、完全長のＩＦＮｒ（１−１４６＞遺伝子を運ぶｐａＴＦ５４からＮ立１■一旦立旦ＲＩ断片をΔａｔＩ一旦立旦ＲＩ切断ＰＩＮＩＡ２プラスミド内へ結きさせた。最終１ラスミドＰＴＮ５ＧＩＦ５４は上２Ｂプロモーターの制御下にある完全長ＩＦＮγ遺伝子を含んでいる。

ｐＧｒＦ５４は５８ＭＧ１０５としても知られている：それは微生物工業技術研究所、工業技術院の一機関、茨城系つくば電束１−１−３（日本）、から入手可能であり、ＥＰＡ　Ｏ１３４６７３に記載されている。ＰＩＮＩＡ２　（大腸菌のリポ蛋白質遺伝子を用いる融通のきく発現クローニング媒介物の構築：Ｋ。

ＮａｋａｍｕｒａおよびＭ、Ｉｎｏｕｙｅ、ＥＭＢＯＪ、１巻、Ｎｏ６．７７１ −７７５．１９８２）が±２２プロモーター源として使用された。

１、Ｂ、ＰＩＮ５Ｔ４の構築ＰｒＮ５ＴＧＩＦ５４中のアンピシリン耐性遺伝子が以下の方法によりテトラサイクリン耐性遺伝子に！き換えられた・クレノーを用いて平滑断端に変換された旦立旦ＲＩ−Δヱ旦■断片が１ラスミドρＢＲ３２２から誘導され、足立ａｒで切断されているＰＩＮ５ＧＩＦ５４内へ連結された。この工程は選択マーカーとしてのテトラサイクリン耐性遺伝子を導入し、挿入欠失によりアンピシリン耐性遺伝子を不活性化させる。ＩＦＮｒ（４−１４６）遺伝子を運ぶ旦立旦Ｒ１−３ａ±■合成断片（Ｔａｎａｋａ　ｅｔ、旦　、”Ｈｕ　ＩＦＮｒのために化学的に合成された遺伝子の大腸菌中での発現”、Ｎｕｃ　１．Ａｃ　ｉｄｓ、Ｒｅｓ。

１１　：６．１７０７−１７２３　＜１９８３））が７ラスミ）’ＰｒＮ５０ＩＦ５４中のＩＦＮｒ（１−１４６１との置き換えに使用された。ＰＩＮ５ＧＩＦ５４を断片を連結してプラスミドＰＩＮ５Ｔ４を得た（図２参照）。

２、ｐＧｒＦ４−１２５およびｐＧｒＦ４−１３７のｆ。

完全長ガンマ　インターフェロンのためのコード配列を含む旦立旦ＲＩ−３旦土１断片がＰＩＮ５ＧＩＦ５４から単離され、Ｇｒａｙ　ｅｔ、ａｌ、、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、前に引用）の方法によるプライマー修復にかけられた。ＩＦＮｒのカルボキシ末端配列への合成オリゴマープライマー（配列番号２および３で与えられており、ＩＦＮｒの所望の分画をコードしている断片を提供するＧ　ｒ　ａ　３／　立１．且ユ、２プライマーの修復法の使用を示している（スキームＩ））はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡシンセサイザーにより製造され、類似体ＩＦＮγ４−１２５および４− １３７を与えるように停止コドンを導入するように設計されていた。これらのプライマーの設計にはまたコード領域の末端への５ａｌＴ部位の導入が含まれている。

５ａｌＴで切断され、平滑断端を作るためにクレノーで処理し、およびＦ、ｒ旦ＲＩで消化されているプラスミドＰＩＮ５］Ｆ５４に１ライマ一修復断片を連結した。得られたプラスミドはｐＧＩＦｌ−１２５およびｐＧＴＦｌ−１３７と名付けられた。ｐＧｒＦ４−１２５およびρＧＩＦ４−１３７を得るために、前記の１ラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ−３ａ土■断片が切り出され、ＨｉｎｄＩＩＩ −３ａ土■で切断されたＰＩＮ５Ｔ４グラスミドに連結された。得られた１ラスミドはｐＧｒＦ４−１２５およびｐＧｒＦ４．−１３７と名付けられたく図３参照）。

３、ｐＧｒＦ４−１３２．ｐＧｒＦ４−１３４およびｐＧｒＦ４−１３５のこれらの１ラスミドはすべて、Ｋｕｎｋｅｌ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９８５．８２：４８８−４９２）により記載されている特定部位突然変異誘発法により得られた。この事を実施するためにｐＧｒＦ４　１３７内へＦ１複製開始点が導入された。最初の工程は旦旦ユｊおよび乱立ｍＨ１部位を含む合成二本鎖オリゴマー断片をｐＧｒＦ４−１３７のΔヱ３」部位へ導入してプラスミドｐＪＦ　１３−３を得ることである（図４参照）、旦立旦■一旦Ａ−タージーン　ファージおよびインビトロ突然変異誘発キットカタログ番号１７０−３５７６）から誘導され、旦立旦Ｔ一旦主ｍＨＩ切断ｐＪＦ１３−３アラスミドと連結されてＩＦＮｒ４−１３７遺伝子を含むプラスミドρＪＦ１３−３ −６を得た。このプラスミドはρＧＩＦ４−１３２の誘導のためのすべての以下の操作に使用された。

３、Ａ、　突然変異誘発プライマー配列番号４のプライマーが使用された。このオリゴマーは各々の位Ｉで他の３つのデオキシヌクレオチド三リン酸で処理されている（オリゴマーの合成時に各々のデオキシヌクレオチド三リン酸に総量で約５％（ｖ／′’ｖ）までの他の３つのデオキシヌクレオチド三リン酸を混合した。ｐＧｒＦ４−１３２は１３３位に停止コドン（Ｔ　Ａ　Ｇ　）を導入する突然変異により、数百の突然変異体のライブラリーから単離された突然変異体の一つであった）。

ｐＧｒＦ４−１３４およびρＧＩＦ４−１３５の１ライマーの各々配列番号５および６で与えられている。これらのオリゴマーの７ライマーはプライマー修復およびカルボキシ末端欠失突然変異体の限定に使用できる；それらは各々ＨｕＩＦＮγの１３４または１３５位の後に停止コドンを導入する。配列番号５の１ライマー中の１２および１３位の隣接塩基対ＡＧおよび配列番号６のプライマー中の１１および１２位のＣＴは必要な停止コドンを導入する突然変異である。

すべてのき成アライマーはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓシンセサイザーを用いて作製された。

３、Ｂ、　一本ＭＤＮＡの製造プラスミドｐＪＦ１３−３−６で大腸菌ＣＪ２３６（ｄｕｔ−、ｕｎｇ　：ＪｏｙｃｅおよびＧｒｉｎｄｌｅｙ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１５８：６３６（１９８４Ｎを形質転換した。入手可能な任意の他の同等な株も使用できる。

Ａｍｐ耐性およびクロラムフェニコール耐性コロニーを単離した。ｐＪＦ１３− ３−６．’ＣＪ２３６を増殖させ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　ｖ。

１旦３．３　１１，１９８７；ＲＷｕおよびり、Ｇｒｏｓｓｍａｎ１４．においてＶｉｅ　＋　ｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇにより記載されているごとくヘルパー　ファージＭ１３ＫＯ７に感染させた。−夜増殖させた後、細胞を遠心分離し、上澄液に５分の１容量の２．５Ｍ　ＮａＣ１，、’２０°６ポリエチレングリコールを添加した。混自物を氷上で６０秒間インキュベートし、遠心分離した。ベレットは３ｍｌの１０ｍＭ　トリス。ＨＣＩ、ｐＨ８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液に再恕濁した。

ＲＮａｓｅ　（３０μｇ）を加え、混合糊を３７℃で２０分間インキュベートし、次に１０テイナーゼＫ　（６００μｇ）を加え、６５゛Ｃで３０分インキュベートを続けた。この溶液とフェノール−クロロホルム＜１　：　１）溶液で４回およびクロロホルムで１回抽出し、続いて０．３Ｍの最終濃度、ｐＨ５，２，になるまで酢酸ナトリウムを添加した。２容量のエタノールを次に加えた。遠心分離により一本鎖ＤＮＡを集め、７０％エタノールで洗浄し、真空下乾燥させ、１００μｌの１０ｍＭ　トリス、ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８溶液に再溶解した。

３、Ｃ１部位特異的突然変異誘発ｐＪＦ１３−３−６からの一本鎖ＤＮＡ（前記工程３Ｂ参照）が部位特異的突然変異誘発の実施に使用された。すべての実験において２ピコモルの合成オリゴマー（ｐＧｒＦ４−１３２．ｐＧｒＦ４−１３４およびｐＧｒＦ”４−１３５に対する）および１Ｍｇの一本鎖ＤＮＡが１０μｍの２０ｍＭトリス・ＨＣｌ、２ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，４中で再対合された。３ｕｌの１０×合成Ｍ衝液［１００ｍＭトリス、ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２０ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７，４）、３ｔｔ１のＡＴＰ：　３ｔｔ＋の１．２５ｍＭの各々のデオキシヌクレオチド三リン酸く即ち、アデノシン、チミジン、グアノシン、シトシン）、９μｍの水、１μｌのクレノーおよび１μＩのＴ４　ＤＮＡリガーゼを加えて容量ｔ３０μｍに増やした１反応後は１５℃で一夜インキユベートされた。二本鎖ＤＮＡ（ρＧＩＦ４−１．３２．ｐＧＩＦ４−１３４またはρＧＩＦ４−１３５）で続いて大腸菌２９４を形質転換した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、短くなったガンマ　インターフェロン分子の産生でコロニーをスクリーニングし、さらに配列決定して同一性を確認した（Ｓａｎｇｅｒ　ｉｌ　虹　、（旦二旦ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４．５４６３−５４６７の方法により）、適切な旦旦旦ＲＩ−互旦ユ■断片を単離し旦旦旦ＲＩ一旦且↓Ｉ切断ＰＩＮ５Ｔ４内へクローン化した。

４、　１−１０　ＩＦＮｒの　１！ｌ！六　の大腸菌２９４中、３７℃で一夜０．Ｄ、ａｇｏ〜６まで増殖させ欠失突然変異体を発現させた。ａｉ′胞を採取し、２０ｍＭ　トリス・ＨＣｌ１５ｍＭベンズアミジン、ｐＨ７，５（［１液Ａ）中にＯ，Ｄ、、、、＝１２０で再懸濁し、Ｍａｎｔ。

ｎ−Ｇａｕｌｉｎ　ホモゲナイザーで破壊した。不溶物は４℃にて１６０００ｘｇで１０分間遠心分離して除去した。上澄液は４℃にて１０容量の２０ｍＭトリス、ＨＣＩ、１ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭベンズアミジン、ｐＨ７，５（１！１１液Ｂ）セファロース６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上へのせた。カラムはＡ　２１゜こ１になるまでＭ衝液Ｂで洗浄し、続いて２５ｍＭイミダゾールを含むｌＩ衝液Ｂ突然変異体を含む単一の主蛋白質ピークをプールした。この方法によりＮ′！＃されたＴＦＮｒ４−１３７の比活性は２Ｘ１０’単位／ｍｇであった。

本発明のＩＦＮγ４−１３４およびその機能的均等物および前記の他の欠失突然変異体の活性は下記の方法Ａ−Ｃにより決定できる。

ミノ酸およびペニシリン−ストレプトマイシンを含むＲＰＭ１１６４０中、３７ ℃および５９６ｃｏ＝で湿度がＭ御されたインキュベーター内で増殖させた。１ｘｌＯｓの、および９８９５以上が生存可能な細胞を、種々のＩＦＮγ誘導体をｍ１当り０１からＬｏｎｇの範囲の濃度で補給した培地中で４８＃！間インキュベートした。実験終了時に細１１２１分１度１％ＦＢＳと含むリン酸榎衝化塩浴液（ＰＢＳ）で洗浄し、２０μｇのマウスＴ　ｇ　Ｇ　＋抗−ヒトＨＬ、Ａ−ＤＲ（Ａｔ　Ｉ　ａｎ　ｔ　ｉ　ｃＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎｃ、）を含むＲＰＭ１１６４０を洗浄ベレットに加えた。氷上で３０汁間インキュベーションした後、細胞を１％ＦＢＳ含有ＰＢＳトベーシランでチャンネル９０ＭＦＴより高いシフトが観察された。ＩＦＮγ４− １３７、ＩＦＮγ４−１３５．ＩＦＮγ４−１３４．ＩＦＮγ４−１３２およびＩＦＮγ４−１２５の結果は下記表■のカラム３に示されている。

イで使用可能な他の適した細胞株はＭＤＢＫ＃胞株（ＡＴＣＣ番号６０７１　）、ヒト繊維芽細胞株ＧＭ２５０４ＡおよびＡＧ１７３２（Ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍｕｔａｎｔ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｃａｍｄｅｎ　Ｎ、Ｊ、）およびヒト細胞株ＷＩＳＨ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２５）である、′Ｍ音波処ＦＪｒＦＮｒ発現細胞からの可溶性抽出物がルーチンの仕事としてアッセイされた。クーマシーブリリアント　ブルー色素で染色されたゲルをスキャンすることにより、突然変異体の発現レベルがＨｕ　ＩＦＮγ（４−１３７）対照抽出物に対して規格化された。たくさんの繰返しのアッセイに基づいておりくすべての試料は少なくとも６回は検定された）、抗ウイルスアッセイは±２５−５０％の精度であった。

ＴＦＮｒ４−１３７．ＩＦＮｒ４−１３５．ＩＦＮｒ４−１３４、ＩＦＮｙ４− １３２およびｒＦＮγ４−１２５の結果は下記表Ｉのカラム２に示されている。

Ｃ０μ容体の　ムアｌセイＣ，ｉ、＋ｚｓ■−標Ｈ−ＩＵ　ＴＦＮ７の製造がアッセイのためにプールされた。

ＦＢＳおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含む冷ＲＰＭ１１６４０培地に１゜１０％（ｖ、′ｖｌ熱不熱性活性化ウシ胎児血清び０．０２％アジ化ナトリウムと：１．Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ）中で同転させｆ、−、ＦＳ７１細胞を含む反応温き物は１．０％　（ｖ、−’ｖ　）熱不活性化ウシ胎児血清、０．０２％アジ化ナトリウムおよび５％（Ｗ／Ｖ）シラ糖を含む１５０ μｍのＲＰＭ［６４０中で回転させた。アッセイチューブを液体窒素中で凍結させ、細胞ベレットを切り出し、γ−カウンター中でその放射活性を決定した。結果は下記表■のカラム４および５に示されている。

同様な試験がヒーラ細胞に対して実施され、表１のカラム４２および３の活性試験において各々次の結果を得た７３％および２〜４％、ＩＦＮγ４−１３４による処理に敏感なＷ４または対応するｍ胞株がこれらの試験で同定でき、必要ならＩｉ瘍から誘導されｆＳ＃胞株に対しインビトロで実施される。そのような方法により、この方法でＩＦＮｒ４−１３４に敏感な腫瘍（細胞＊＊性細胞へのそれらの感度が増加するであろう）が同定できる。

ｒ　ルボ　シル、車この欠失突然変異体に対するすべての活性が１００％として定義された：池の欠失突然変異体に対するすべての活性はＩＦＮγ４−１３７に関連した活性に対するパーセントとして表現されている。

’　ＦＳ７１線縫芽署胞に対してＩＦＮγ４−１３７は２−３７１０”単位、／ ′ｍｇの比活性をもっており、池のＩＦＮγのすべての抗ウィルス活性はこの活性に対するパーセントとして表現されている。

”４−１．３７はｌ−１−２ｎ’ｍｌでＩ／、最大応答を与える。

表■はカルボキシル末端のどのような欠失が受容体結合および生物活性の両方に影響を及ぼすかを示している０本発明の欠失突然変異体ＩＦＮγ４−１３４はＨＬＡ−ＤＲ誘導活性の減少は示していないが、非常に低い抗ウィルス活性しか持っていす、この目的からすると、同様の低ウィルス活性を持ってはいるがＨＬＡ −ＤＲ誘導活性が顕著に低い欠失突然変ｊ１体ＩＦＮγ４−１３２よりも優れている。

これらのデータはまた抗ウィルス作用、特に抗ウィルス作用に付随する副作用を示さないＨＬＡ−ＤＲ誘導の有用な誘導剤となり得る独特の性質をＨｕ　ＩＦＮ γ４−１３４が持っていることを示している。これらの独特の性質により、Ｈｕ　ＴＦＮγ４−１３４は免疫が抑制された患者における免疫応答の促進および色々な種類のヒトの癌における化学療法の添加物として治療的使用法が見い出せそうである。

Ｈｕ　ＩＦＮγ４−１３４はまたワクチンに関連して抗体応答を増加させるのに有用である。ワクチンは例えば細菌またはウィルス疾患に対するものでもよいし、多価であってもよい、ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物な包含するのが有用であるワクチンにはコレラ、ジフテリア、発疹チフス、パラチフス、破傷風、百日咳、結核、小児麻痺、天然痘、インフルエンザ、肝炎、狂犬病、黄熱病などのような疾患に対するワクチンが含まれる。もちろんワクチンの組成物のどれもある種の環境下ではＩＦＮγを不活性化すべきではないことは当業者には明らかであろうし、特に家畜病治療のワクチンが使用される場合、投与の直前にＩＦＮγとワクチンを混きするのがより適切であろう。

本発明のＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物は医薬組成物として投与できる。そのような組成物は治療有効量のＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物および医薬担体または賦形剤を含んでいる。医薬担体はＨｕＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物を患者へ与えるのに適切な任意の適合した無毒の物質であろう０例えば無菌水、アルコール、脂肪、ろうおよび不活性固形物が担体に含まれるであろうし、薬学的に受容可能な添加物（例えばＨ斬化剤、分散剤）もまた含まれていてもよい、一般的にそのような薬剤の非経口投与に有用な組成物はよく知られている、例えばＲｅｍ１ｎ　ｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｔｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、１４版（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８０）を参照されない。

もしくは本発明の組成物は身体に移植可能な薬剤運搬システムにより患者の身体内へ導入してもよい；例えばＵｒｑｕｈａｒｔ　ｅｔ、旦、、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、Ｔｏｘｉｃｏｌ、２４巻、　１９９−２３６ベージ（１９８４）を参照されたい。

Ｈｕ　ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物は通常非経口で、好適には静脈内へ投与される１通常のｒｖ投与セットまたは皮下蓄積から徐々に投与もできる。

非経口投与の場合、Ｈｕ　ＴＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物は通常薬学的に受容可能な非経口用担体と注射に適した一回服用剤形に処方されるであろう〈例えば溶液、懸濁液または乳濁液）、そのような担体は本質的に無毒で非治療性である。そのような担体の例は通常の塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性担体もまた使用してもよい、好適な担体は５％デキストロース／塩溶液である。担体はまた等強性および化学的安定性を促進する物質のような少量の添ｆＭ物を含んでいてもよい、Ｈｕ　ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物は好適には凝集体、分解産物および夾雑蛋白質を実賀的に含まない精製された形で、約５から５００μｇ／ｍｌの濃度（好適には２０から２５０μｓ／ｍ　Ｉ　）で処方される。

Ｈｕ　ＩＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物に対する投与計画の選択はポリペプチドの血清代謝回転速度およびポリペプチドへの標的細胞の近づき易さのようないくつかの因子に依存している。

特定の状態に対する本発明の化合物の適当な投与量の決定は当業者によりなされるであろう９通常処置は最適量より少ない用量で開始される。その後、その情況で最適の効果が達成されるまで少量ずつ用量を増加させる。都きがよいのは総日用量を分割し、必要に応じ一日の間に少しずつ投与することであろう。

Ｈｕ　ＩＦＮｒ４−１３４またはその機能的均等物の投与量および頃度は患者め年令、状態および＃め大きさ並びに処１されている徴候の重症度のような因子を考えに入れて関与する臨床医の判断に従って調節されるであろう。

投与計画に従うと、患者に投与されるＨｕ　ＴＦＮγ４−１３４またはその機能的均等物の量は好適には副作用の受容可能なレベルに一致させ最大にされる：それ故投与される量は処置されている疾患の重症度に一部依存している。好適には用量は一日当り約０．１から５００μｇ／ｋｇ、より好適には一日当り約１から５０μｇ、／ｋｇである。

典型的な推しようされる投与計画は、治療の助けを達成するための２から４に分割された１μｇｉ’日から５ｍｇ１日（好適には２０μｇ、／日から１ｍｇ７日）の非経口投与である。

本発明の前述の実施例の記載は例示および説明の目的で示されてきたものである。これらは本発明を余す所なく述べたものではなくまた記載されたそのま）の形に制限することをｉｉ：ＩｌＩしているわけではなく、明らかに前記の技術として多くの修正および変形が可能である。実施例は本発明の原理およびその実際的な応用の説明に選択および記述されたものであり、そのため当業者はそれによりそのような実施例および企図された特定の使用に適した本発明の変形の適切な使用および実施が可能になる０本発明の範囲はここにｆ１随された請求の範囲により定義される。

配列表（１）一般的情報（ｉ）　出願入　：　Ｎａｒｕｌａ、Ｓａｔｗａｎｔ　Ｋ、；Ｌｕｎｄｅｌｌ、Ｄａｎｉｅｌ　Ｊ。

（ｉｉ）発明の名称　ヒト　インターフェロン−γ２その機能的均等物およびこれらの物質の使用法および組成物（ｉｉｉ　）　配列数゛　６（ｉｖ）　連絡住所：（Ａ１　名宛友：　Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂ＞　ストリート：　Ｏｎｅ　Ｃｉｒ＠ｌｄａ　Ｆａｒｍｓ（Ｃ）市：　Ｎａｄｉｓｏｎ（Ｄ＞州：　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ（Ｅ）　国：ｕＳ＾（Ｆ）　ジ・ソ１コード：　０７９４０（ｖ）　コンピューターが読取り可能な形（Ａ＞　メディア　タイプ：フロｌビーディスク（Ｂ）　コンピューター：アップル　マツキントラシュ（Ｃ）　オペレーティング　システム：マツキントラシュ　６．０．５（Ｄ）　ソフトウェアー：マイクロンフト　ワード−１，０ＯＢ（ｒｉ　）　現在の出願データ・（Ａ）　出願番号：（Ｂ）　出願日：（Ｃ）　分類：（癲）以前の出願データ：（Ａ）　出願番号：　５７６．２４５（Ｂ）　出願日：　１９９０年８月３１日（−ｉｉ）　代理人、′代８！店　情報：＜Ａ）　名前：　Ｂｌａｓｄａｌｅ、Ｊｏｈｎ　Ｈ，Ｃ。

（Ｂ）　登録番号：　３１，８９５（Ｃ＞　照会／゛覚書番号：　ＪＢＯ１５９Ｋ（ｉｘ）　電話通信情報＜Ａ）　電話：　２０１−８２２−７３９８（Ｂ）７アツ’）ス：２０１−８２２−７０３９（Ｃ）　テレックス＋２１９１６５（２）配列番号１の配列情報＜ｉ）　配列特性：（Ａ＞配列の長さ：１４６アミノ酸（Ｂ）配列の型：　アミノ酸（Ｃ）鎖の数・一本饋（Ｄ）トボロジ一二直線状（マｉ）起源：（Ａ）生物体、ヒト（ｘ）発表悄！＋１：（Ａ）著者：Ｇｒａｙ　旦１１上・（Ｂ１表Ｈ：大ＷＩＩｉ！Ｉおよびサル細胞におけるヒト免疫インターフェロン　ｃＤＮＡの発現（Ｃ）１１１誌：Ｎａｔｕｒｅ（Ｄ）巻＝２９５（Ｅ）出版：１９８２年２月１１日（Ｆ）ページ＋　５０３−５０８（Ｇ）日付：１９８２年（ｘｉ）配列記載・配列番号１：（３）配列番号２の配列情報（ｉ）配列特性・（Ａ＞配列の長さ＝２４塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）ｌ［の数ニー重鎖（Ｄントポロジー二直線状（１１）分子型：ＤＮＡ（ｖｌｉ）直接の起源：［合成］のアミノ酸をコードしている（すなわち１２５Ｐｒｏ）。

（ｘｉ）配列記！！：配列番号２：ＣＴＡ　ＣＧＧ　（、ｒ、Ａ　ＣＡＧ　ＴＴＣＡＧＣＣＡＴ　＾＾Ｃ２４（３）配列番号３の配列情報（ｉ＞配列特性：（Ａ）配列の長さ：２４塩基（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）！Ｉの数ニ一本票（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ＞分子の型：ＤＮＡ（ｖｉ）直接の起源＝［合成］の最凌のアミノ酸をコードしている（即ち１３７Ｍｅｔ）。

（ｘｉ　）配列記載：配列番号３コＣＴＡ　ＣＡＴ　ＣＴＣＡＧ＾　丁ＣＴ　ｆｆＴ　ＴＡＣＧＣＴ　２４（３）配列番号４の配列情報：（ｉ）配列特性：（Ａ）配列の長さ＝５２塩基（Ｂり配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー零値（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡ（ｖｉｉ　）直接の起ｓ：［合成］ γの突然変異体の単離に使用される。

（ｘｉ＞配列記載：配列番号４：＾＾ＣＴにＣＡＡＡ　Ｃ＾＾　Ｃ＾＾　丁ＣＴ　ＧＡＣＣにＴ　＾＾＾　＾＾Ｔ　ＣＡＴ　（：ＣＡ　ＧＴＣ丁Ｃ＾　４２ＣＡＴ　ＣＧＴ　ＴＴＣ５２（３）配列番号５の配列情報・（ｉ）配列特性：（Ａ＞配列の長さ：２２塩基（Ｂ）配列の型二核酸（Ｃ）＃の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：！Ｅ縁線状ｉｉ）分子の型：　ＤＮＡ（ｉｉ）直接の起源＝し合成］（ｉ×）特色：（Ｄ＞その他の情報：ｐＧＩＰ４　１３４のための１ライマー、このオリゴマーはプライマー修復および従ってカルボキシ末端欠失突然変異体の限定に使用される：これはＨｕ　ｒＦＮγの１３４位の侠に停止コドン分導入する。１２および１３位の隣接する塩基対ＡＧは必要な停止コドンを導入するための突然変異である。

（Ｙｉ）配列記載：配列番号５：ＧＣＧ　ＴＡＡ＾＾（、ＡＴＡ　ＧＣＡ　ＧＡＴ　ＧＴＡ　Ｇ　２２（３）配列番６の配列情報：＜ｉ＞配列特性：（Ａ）配列の長さ：２２塩基（Ｂ）配列の！！！：核酸（Ｃ）ｌｌＩＯ数ニ一本鏝〈重鎖トポロジー：直線状（１１）分子の型：ＤＮＡ（輯）直接の起源：［合成］れる：これはＨｕ　ＩＦＮγの１３５位の後に停止コドンを導入する。１１および１２位の隣接する塩基対ＣＴは必要な停止コドンを導入するための突然変異である。

（ｘｉ）配列記載：配列番号６：ＧＴＡ　＾＾＾　にＡＴ　ＣＣＴ　Ａ（、＾　丁１；Ｔ　Ａｒ、Ｔ　Ｃ２２浄書（内容に変更なし）す補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　５年　３月　１日臼纏

Claims

【特許請求の範囲】

１．本明細書の配列番号１の配列で４から１３４の番号を付けた残基の配列により定義されるアミノ酸配列をもつ、端を切り取った組換え体ヒトインターフェロン−γ；またはＭｅｔが先頭に付けられた前記配列；またはこれらのポリペプチドの各々の機能的均等物。
２．本明細書の配列番号１の配列で４から１３４の番号を付けた残基の配列により定義されるアミノ酸配列をもつ、端を切り取った組換え体ヒトインターフェロン−γ；または実質的に他の宿主蛋白質を含まないその機能的均等物。
３．実質的に他の宿主蛋白質を含まない、本明細書の配列番号１の配列で４から１３４の番号を付けた残基の配列により定義されるアミノ酸配列をもつ、端を切り取った組換え体ヒトインターフェロン−γ。
４．ベクター、および本明細書の配列番号１の配列で４から１３４の番号を付けた残基の配列により定義されるアミノ酸配列をもつ、端を切り取った組換え体ヒトインターフェロン−γ；またはＭｅｔが先頭に付けられた前記配列；またはこれらのポリペプチドの各々の機能的均等物を含む組換え体ベクターであって、かつ適当な宿主生物体中で上記ＤＮＡ配列の発現を指示できる上記組換え体ベクター。
５．微生物中で上記ＤＮＡ配列の発現を指示できる請求項４に記載の組換え体ベクターを含む微生物。
６．請求項１、２または３に記載のＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４ポリペプチドを、薬学的に受容可能な担体または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
７．ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６および／またはＩＬ−７から選択される免疫強化量のヒトリンホカインをさらに含む請求項６に記載の医薬組成物。
８．請求項１、２または３に定義するＨｕ　ＩＦＮｒ４−１３４ポリペプチドとともにワクチンを含む医薬組成物。
９．ワクチンと、有効量の請求項１、２または３に定義するＨｕ　ＩＦＮｒ４− １３４ポリペプチドとを哺乳動物に投与することからなる．ワクチンと関連する抗体応答を増加する方法。
１０．腫瘍細胞をもつ患者に有効量の請求項１、２または３に定義するＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４ポリペプチドを投与することからなる、細胞障害性細胞への前記腫瘍細胞の感受性を増加する方法。
１１．腫瘍細胞に有効量の請求項１、２または３に定義するＨｕ　ＩＦＮγ４− １３４ポリペプチドを投与することからなる、細胞障害性細胞への前記腫瘍細胞の感受性を場加する方法。
１２．腫瘍細胞に有効量の請求項１、２または３に定義するＨｕ　ＩＦＮγ４− １３４ポリペプチドを投与することからなる、腫瘍細胞による表面抗原の発現を増加する方法。
１３．細胞障害性細胞に対し感受性をもつ腫瘍細胞の感度を増加させるためのＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４の使用。
１４．細胞障害性細胞への腫瘍細胞の感受性を増加させるための医薬の製造のためのＨｕ　ＩＦＮγ４−１３４の使用。
１５．Ｈｕ　ＩＦＮγ４−１３４と薬学的に受容可能な担体または賦形剤を混合することからなる、医薬組成物の製造方法。