JPH064019B2 - Microorganism - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖脂質分解酵素産生能を有する微生物に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a microorganism capable of producing a glycolipid degrading enzyme.

（従来の技術） 糖脂質は細胞表層の主要な構成成分であり、細胞の膜抗
原、血液型物質、相互識別、分化等の重要な膜機能との
関連が注目され、糖鎖の構造と機能の解明が検討されて
いるが、このためには、特異性の高い酵素が重要な役割
を果す。(Prior Art) Glycolipids are major constituents of the cell surface layer, and attention has been paid to their relationship with important membrane functions such as cell membrane antigens, blood group substances, mutual discrimination, and differentiation. The elucidation of Escherichia coli has been investigated, but for this purpose, highly specific enzymes play an important role.

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来糖脂質の糖鎖切断用の酵素として
は、エキソ型糖脂質分解酵素のみが知られ、エンド型糖
脂質分解酵素は知られていない。(Problems to be Solved by the Invention) However, as an enzyme for cleaving a sugar chain of a glycolipid, only an exo-type glycolipid degrading enzyme has been known, and an endo-type glycolipid degrading enzyme has not been known.

（問題点を解決するための手段） 本発明者等は、糖脂質の糖鎖を切断する糖脂質分解酵素
を探索中のところ、エンド型糖脂質分解酵素を産生する
能力を有する微生物を見出し、本発明を達成したもので
ある。(Means for Solving Problems) The present inventors, while searching for a glycolipid degrading enzyme that cleaves a sugar chain of a glycolipid, found a microorganism having an ability to produce an endo-type glycolipid degrading enzyme, The present invention has been achieved.

すなわち、本発明の要旨は糖脂質を資化し、エンド型糖
脂質分解酵素の産性能を有するロドコツカスエスピーＧ
−７４（Rhodococcus sp.Ｇ−７４）にある。That is, the gist of the present invention is to utilize glycolipids and produce Rhodococcus sp.
-74 (Rhodococcus sp. G-74).

以下、本発明を詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明に係るロドコツカスエスピーＧ−７４は、本発明
者らにより東京都町田市で採取した土壌より分離された
ものであり、微工研菌寄第８４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−
８４２４）として寄託されている。The Rhodococcus sp. G-74 according to the present invention was isolated from the soil collected in Machida City, Tokyo by the present inventors, and is based on Microindustrial Research Institute No. 8424 (FERM P-
8424).

上記ロドコツクスエスピーＧ−７４の形態学的特徴、各
種培地上の性状及び生理的、生化学的性質は以下に示す
通りである。The morphological characteristics, properties on various culture media, and physiological and biochemical properties of Rhodococcus sp. G-74 are as shown below.

(1)形態学的特徴（ハート・インフュージヨン寒天培地
上で３０℃、６〜４８時間培養） (イ)細胞形態：培養後、７時間位まで細胞は不均一に伸
長し、菌糸状に生育し、稀に分岐が観察される。その
後、菌糸状細胞はジグザグ状に曲がり、漸次***を繰り
返す。２４時間以降の古い培養では、菌糸の分節（frag
mentation）が生起し、桿状（1.6〜6.6×1.0〜1.2μm）
から球状（1.0〜1.2μm）になる。(1) Morphological characteristics (cultured on Heart Infusion Agar medium at 30 ° C. for 6 to 48 hours) (a) Cell morphology: After culturing, cells grow nonuniformly up to about 7 hours into a mycelium It grows and branches are rarely observed. After that, the mycelial cell bends in a zigzag pattern and repeats gradual division. In the old culture after 24 hours, mycelial segment (frag
mentation) and rod-shaped (1.6 ~ 6.6 × 1.0 ~ 1.2 μm)
To spherical (1.0 to 1.2 μm).

(ロ)***様式：スナツピング（napping）型 (ハ)運動性：なし (ニ)胞子形成：なし (ホ)グラム染色性：陽性 (ヘ)抗酸性：弱い抗酸性 (2)各種培地上の性状 (イ)３０℃のシユクロース−硝酸塩寒天培地：生育微
弱；コロニー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ロ)３０℃のグルコース−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；期中菌糸なし；拡散性色素な
し (ハ)３０℃のグリセリン−アスパラギン寒天培地：生育
微弱；コロニー色は無色；期中菌糸なし；拡散性色素な
し (ニ)３０℃のスターチ寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ホ)３０℃のチロシン寒天培地：生育微弱；コロニー色
は無色；気中菌糸なし (ヘ)３０℃の普通寒天培地：生育良好；コロニー色は黄
味白色に近い薄橙色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (ト)３０℃のイーストー麦芽寒天培地：生育良好；コロ
ニー色はにぶ橙色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (チ)３０℃のオートミール寒天培地：生育微弱；コロニ
ー色は無色；気中菌糸なし；拡散性色素なし (3)生理的性質 (イ)生育温度範囲（ハートインフュージヨン寒天培
地）：１０〜３７℃ (ロ)空気中での発育：良好 (ハ)嫌気条件下での発育：生育せず (ニ)カタラーゼ：陽性 (ホ)オキシダーゼ：陽性 (ヘ)Ｏ−Ｆテスト：陰性 (ト)酸の生成（グルコース）：陰性 (チ)ゼラチンの液化：陰性 (リ)スターチの加水分解：陰性 (ヌ)脱脂牛乳の凝固、ペプトン化：陰性 (ル)リトマスミルク：変化なし (オ)メラニン様色素の生成（チロシン寒天培地及びペプ
トン−イースト鉄寒天培地）：陰性 (ワ)糖類の資化性（プリドハム−ゴトリーブ寒天培地上
で３０℃、２１日間培養）： Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−フラクトース ± シュクロース − イノシトール − Ｌ−ラムノース − ラフイノース − Ｄ−マンニツト − (カ)糖脂質の資化性（プリドハム−ゴトリーブ寒天培地
上で３０℃、２１日間培養）： ガングリオシド ＋＋ (4)生化学的性質 (イ)ＤＮＡの塩基組成ＧＣ含量：69.5％ (ロ)細胞壁の主要なアミノ酸組成：ＤＬ−ジアミノピメ
リン酸 (ハ)グリコレート：テスト：グリコリル型 (ニ)ミコール酸の総炭素数：Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆ (5)分類学的考察 〔高次の分類学上の位置〕 本菌株は、セルサイクル（cell cycle）に多形性を示
し、培養初期に菌糸状に生育し、古い培養では菌糸の断
裂が起つて、桿状〜球状の細胞になり、細胞の***様式
はスナツピング（snapping）型を示す。また、グラム染
色性は強い陽性を示し、抗酸性染色は弱陽性を呈する。
更に、本菌のＤＮＡのＧＣ含量は69.5％と高いＧＣ量を
示し、細胞壁の主要なアミノ酸組成はＤＬ−ジアミノピ
メリン酸を有し、ペプチドグリカン糖鎖部はグリコリル
型を示す。(B) Division mode: snapping type (c) Motility: None (d) Sporulation: None (e) Gram stain: Positive (f) Anti-acid: Weak anti-acid (2) Properties on various media (A) 30 ° C sucrose-nitrate agar medium: weak growth; colony color is colorless; no aerial hyphae; no diffusible pigment (b) 30 ° C glucose-asparagine agar medium: weak growth; colony color is colorless; No hyphae; no diffusible pigment (c) 30 ° C glycerin-asparagine agar: weak growth; colony color is colorless; no interphase hyphae; no diffusible pigment (d) 30 ° C starch agar: weak growth; colony color Is colorless; no aerial hyphae; no diffusible pigment (e) Tyrosine agar at 30 ° C: weak growth; colony color is colorless; normal agar medium without aerial hyphae (f) 30 ° C: good growth; colony color Light orange close to yellowish white; aerial bacteria No thread; no diffusible pigment (G) 30 ° C yeast-malt agar medium: good growth; colony color is nib orange; no aerial mycelium; no diffusible pigment (H) oatmeal agar medium at 30 ° C: weak growth; Colony color is colorless; no aerial hyphae; no diffusible pigment (3) Physiological properties (a) Growth temperature range (heart infusion agar medium): 10 to 37 ° C (b) Growth in air: good ( C) Growth under anaerobic conditions: Does not grow (d) Catalase: Positive (e) Oxidase: Positive (f) OF test: Negative (to) Acid production (glucose): Negative (h) Gelatin liquefaction : Negative (R) Hydrolysis of starch: Negative (N) Coagulation of skim milk, peptone formation: Negative (L) Litmus milk: No change (E) Formation of melanin-like pigment (tyrosine agar medium and peptone-yeast iron agar medium) ): Negative (wa) sugar utilization (prid ham-go (Cultivation on Trive agar medium at 30 ° C. for 21 days): L-arabinose-D-xylose-D-glucose + D-fructose ± sucrose-inositol-L-rhamnose-rafuinose-D-mannitol- (ca) glycolipid Assimilation (cultivated on Pridham-Gotrieve agar medium at 30 ° C for 21 days): Ganglioside ++ (4) Biochemical properties (a) Base composition of DNA GC content: 69.5% (b) Major amino acid composition of cell wall: DL-diaminopimelic acid (c) glycolate: test: total carbon number of glycolyl type (d) mycolic acid: C _{40 to} C ₄₆ (5) Taxonomic considerations [Higher taxonomic position] This strain is It shows polymorphism in the cell cycle, grows in a hyphal form in the early stage of culture, and in old cultures, hyphal rupture occurs, resulting in rod-shaped to spherical cells. Shows the ping (snapping) type. The Gram stain shows a strong positive, and the acid-fast stain shows a weak positive.
Furthermore, the GC content of the DNA of this bacterium is as high as 69.5%, the major amino acid composition of the cell wall has DL-diaminopimelic acid, and the peptidoglycan sugar chain part shows a glycolyl type.

本菌株（Ｇ−７４）は、以上に示した形態的、生理的、
生化学的特性からして、ミコバクテリア料（Mycobacter
iaceae）あるいはノカルデイア科（Nocardiaceae）に所
属するものと考えられる。This strain (G-74) is morphologically, physiologically, and
Based on biochemical properties, Mycobacteria
iaceae) or Nocardiaceae (Nocardiaceae).

一方Journal of General Microbiology、７１巻、７７頁
（１９７２）の記載及びJournal of General Microbiol
ogy、８８巻、２００頁（１９７５）の記載によれば、放
線菌関連群の分類にミコール酸の存在又はその構造をと
り挙げ、これが今日広く受け入れられている。この分類
体系によれば、ミコバクテリア科（Mycobacteriaceae）
の菌はＣ₆₀〜Ｃ₉₀の炭素数のミコール酸を含有し、ノカ
ルデイア科（Nocardiaceae）の菌はＣ₄₀〜Ｃ₆₀の炭素数
のミコール酸を含有する。On the other hand, Journal of General Microbiology, 71, 77 (1972) and Journal of General Microbiol.
According to the description of Ogy, Vol. 88, p. 200 (1975), the classification of actinomycetes-related groups includes the presence or structure of mycolic acid, which is widely accepted today. According to this classification system, mycobacteriaceae (Mycobacteriaceae)
The bacteria contain mycolic acid carbon number of C ₆₀ -C _90, bacteria Nokarudeia family (Nocardiaceae) contains mycolic acid carbon number of C ₄₀ -C _60.

本菌株についてミコール酸の分析を行なつた結果、本菌
株はＣ₄₀〜Ｃ₄₆の炭素数のミコール酸を含有しているこ
とが判明した。よつて、本菌はノカルデイア科に属する
菌種であることが明らかである。As a result of analysis of mycolic acid for this strain, it was found that this strain contains mycolic acid having a carbon number of C _{40 to} C ₄₆ . Therefore, it is clear that this bacterium belongs to the family Nocardia.

〔属レベルの同定〕 バージエイのマニユアル〔Bergey's Manual〕第８版
（１９７４）によれば、ノカルデイア科に属するものと
しては、ノカルデイア（Nocardia）属とシユウドノカル
デイア（Pseudonocardia）属の２種が含まれている。[Identification of genus level] According to Bergey's Manual [Bergey's Manual] Eighth Edition (1974), two species belonging to the family Nocardia include the genus Nocardia and the genus Pseudonocardia. Has been.

とくに、ノカルデイア属は培養初期の形態や気中菌糸の
有無によつて３種の型に大別されていたが、今日では、
これ等のうちＩ、II型に属する菌種の多くは、形態的特
性、細胞壁組成、リン脂質、メナキノン型、ミコール酸
の構造等の相違により、新属ロドコツカス（Rhodococcu
s）属に移されている。In particular, the genus Nocardia was roughly classified into three types according to the morphology in the early stage of culture and the presence or absence of aerial hyphae.
Among these, most of the bacterial species belonging to the type I and type II have a new genus Rhodococcus due to differences in morphological characteristics, cell wall composition, phospholipids, menaquinone type, and structure of mycolic acid.
s) has been transferred to the genus.

〔International Journal of Systematic Bacteriolog
y、２４巻、２７８頁（１９７０）の記載及びJournal of
General Microbiology、１００巻、９９頁（１９７７）
の記載を参照〕。(International Journal of Systematic Bacteriolog
y, 24, 278 (1970) and Journal of
General Microbiology, 100, 99 pages (1977)
[See the description of].

本菌株（Ｇ−７４）は細胞の***様式から、シユウドノ
カルデイア属とは容易に区別され、Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆の炭素数
を持つたミコール酸を含有していることから、ノカルデ
イア属（Ｃ₄₆〜Ｃ₅₂）とも識別される。This strain (G-74) was easily distinguished from the genus Cyudonocardia by the cell division mode and contained mycolic acid having a carbon number of C _{40 to} C _46. Therefore, the genus Nocardia ( C ₄₆ -C ₅₂₎ also are identified.

以上のとおり、本菌株は１）好気性のグラム陽性菌であ
り、２）多形性で、３）培養初期にプリミテイブ（prim
itive）な菌糸を形成し、すぐに分節して桿状〜球状に
なる、４）ミコール酸（Ｃ₄₀〜Ｃ₄₆）を含有する、５）
ＧＣ含量69.5％の特徴を持つていること等からして、本
菌株は、ロドコツカス（Rhodococcus）属の概念に良く
合致した。As described above, this strain is 1) an aerobic gram-positive bacterium, 2) polymorphic, and 3) primitive (primate) in the early stage of culture.
positive mycelia, and immediately segment into rod-like to spherical form 4) Contains mycolic acid (C _{40 to} C ₄₆ ) 5)
This strain was well in line with the concept of the genus Rhodococcus, since it has a GC content of 69.5%.

よつて、本菌株（Ｇ−７４）は、ロドコツカスエスピー
（Rhodococcus sp.）と同定した。Therefore, this strain (G-74) was identified as Rhodococcus sp.

本発明に係る上記ロドコツカスエスピーＧ−７４は、糖
脂質を基質として培養することにより、培地中にエンド
型糖脂質分解酵素を分泌産生するので、培地から硫安塩
析によつて容易にこの酵素を採取することができる。こ
の微生物の培養に使用される培地は、たとえばペプトン
培地が好適に使用されるが、糖脂質を含むことが必要で
ある。糖脂質としては、たとえば糖鎖にシアル酸が結合
したガングルシド又はそれを含む牛脳アセトンパウダー
が好適に使用される。もちろん、培地中には、上記以外
の各種の炭素源、窒素源等を添加することができる。The Rhodococcus sp. G-74 according to the present invention secretes and produces endo-type glycolipid-degrading enzyme in the medium by culturing with glycolipid as a substrate, and thus the rhodococcus sp. The enzyme can be harvested. As a medium used for culturing this microorganism, for example, a peptone medium is preferably used, but it is necessary to contain glycolipid. As the glycolipid, for example, ganglside in which sialic acid is bound to the sugar chain or bovine brain acetone powder containing the same is preferably used. Of course, various carbon sources, nitrogen sources, etc. other than the above can be added to the medium.

培地のpHは通常５〜９、好適には７附近、温度は２０〜
３５℃程度、好適には28〜30℃が選ばれる。The pH of the medium is usually 5 to 9, preferably around 7, and the temperature is 20 to
About 35 ° C, preferably 28-30 ° C is selected.

培養は、１〜１０日間程度、好ましくは２〜６日間が選
ばれる。The culture is selected for about 1 to 10 days, preferably 2 to 6 days.

酵素の生産に際しては、増殖菌体、休止菌体のいずれを
も用いることができる。In producing the enzyme, both proliferating cells and resting cells can be used.

培養物からの酵素の採取、精製は、たとえば次のような
方法によることができる。The enzyme can be collected and purified from the culture by the following method, for example.

即ち、まず上記の菌株の培養液を、遠心分離して上清を
採取し、固形硫安を飽和溶液の８０％になるように添加
して塩析し、沈澱物を蒸留水に溶解し、カラムクロマト
グラフイーにより精製することにより精製する。That is, first, the culture solution of the above strain was centrifuged to collect the supernatant, and solid ammonium sulfate was added to 80% of the saturated solution for salting out. The precipitate was dissolved in distilled water, and the column was dissolved. Purify by purifying by chromatography.

次に、この酵素の理化学的性質について詳細に説明する
が、酵素活性の測定は以下の方法によつた。Next, the physicochemical properties of this enzyme will be described in detail. The enzyme activity was measured by the following method.

〔酵素活性の測定〕[Measurement of enzyme activity]

酵素液 １００μ 基 質 １００μ 〔0.1Ｍの酢酸緩衝液（pH６．０）に５mg／mlの牛脳ガ
ングリオシド及び１mg／mlのＴＤＣ（タウロデオキシコ
ール酸ナトリウム、界面活性剤）を加えたもの〕 上記の酵素液及び基質を混合し、３７℃で酵素活性の強
さに応じて、１時間〜１夜間反応させた後、反応液１０
０μを採取し、パーク・ジヨンソン（Park-Johnson〕
法により還元力を測定し、１分間に１μmolのグルコー
スに対応する還元力を生じる酵素量を１単位とする。反
応液は薄層クロマトグラフイーで分析してオリゴ糖及び
セラミドが生じているかどうかを確認する。Enzyme solution 100μ Substrate 100μ [0.1M acetate buffer (pH 6.0) plus 5mg / ml bovine brain ganglioside and 1mg / ml TDC (sodium taurodeoxycholate, surfactant)] After mixing the enzyme solution and the substrate and reacting at 37 ° C. for 1 hour to 1 night depending on the strength of the enzyme activity, the reaction solution 10
0μm was sampled and parked by Park-Johnson
The reducing power is measured by the method, and the amount of the enzyme that produces the reducing power corresponding to 1 μmol glucose per minute is defined as 1 unit. The reaction solution is analyzed by thin layer chromatography to confirm whether oligosaccharides and ceramide are produced.

〔酵素の理化学的性質〕[Physicochemical properties of enzymes]

(イ)作 用 糖脂質に作用し、糖鎖とセラミドの間を切断してオリゴ
糖とセラミドを生成する。(B) Working It acts on glycolipids and cleaves between sugar chains and ceramide to produce oligosaccharides and ceramides.

動物界に広く存在していることが知られているスフイン
ゴ糖脂質は、スフインゴ塩基の第一級アルコール性水酸
基がグリコシド結合によつて単糖又はオリゴ糖と結合
し、更に脂肪酸がスフインゴ塩基に酸アミド結合したも
のであり、このスフインゴ塩基と脂肪酸からなる部分を
セラミドと呼んでいる。（脂質の化学、３６５頁、１９
７４年、東京化学同人社発行）。Sphingoglycolipid, which is widely known to exist widely in the animal kingdom, is composed of a primary alcoholic hydroxyl group of the sufingo base bound to a monosaccharide or an oligosaccharide through a glycosidic bond, and further a fatty acid is added to the sufingo base to form an acid. It is an amide-bonded one, and the portion consisting of this sphingo base and fatty acid is called ceramide. (Lipid Chemistry, 365, 19
1974, issued by Tokyo Kagaku Dojinsha).

この酵素は、この糖脂質に作用して、オリゴ糖の糖鎖と
セラミドの間を切断してオリゴ糖とセラミドを生成する
作用を有する。This enzyme acts on this glycolipid to cleave between the oligosaccharide sugar chain and ceramide to produce oligosaccharide and ceramide.

即ち、ガングリオシド（ganglioside）系列の酸性糖脂
質、例えば、ＧＴ、ＧＴ_1a、ＧＤ_1b、ＧＭ_1a、ＧＭ₂、
ＧＭ₃（脂質の化学、３８９〜３９１頁、１９７４年、
東京化学同人社発行）、及びラクトシルセラミド、パラ
グロポシド、フコシルペンタグリコシルセラミドのよう
な中性糖脂質等を分解して、オリゴ等とセラミドを生成
する。That is, ganglioside series acidic glycolipids such as GT, GT _1a , GD _1b , GM _1a , GM ₂ ,
GM ₃ (Lipid Chemistry, pages 389-391, 1974,
(Published by Tokyo Kagaku Dojinsha Co., Ltd.), and neutral glycolipids such as lactosylceramide, paragloposide, and fucosylpentaglycosylceramide are decomposed to produce oligos and ceramides.

(ロ)基質特異性 上記のように、この酵素は、オリゴ糖とセラミドとが結
合した糖脂質の、糖鎖とセラミドとの間を切断してオリ
ゴ糖を生成する。即ち、所謂エンドグリコシダーゼ活性
を有するが、単糖は生成しない。換言すれば、エキソグ
イコシダー活性は有しない。(B) Substrate specificity As described above, this enzyme cleaves between the sugar chain and the ceramide of the glycolipid in which the oligosaccharide and the ceramide are bound to produce an oligosaccharide. That is, it has a so-called endoglycosidase activity, but does not produce a monosaccharide. In other words, it does not have exo-guicoside activity.

また、グルコース、ガラクトース等の単糖とセラミドと
が結合したセレブロシド（cerebroside）は分解しな
い。Further, cerebroside, which is a combination of ceramide and a monosaccharide such as glucose or galactose, is not decomposed.

更に、特筆すべきことは、この酵素は糖脂質におけるセ
ラミドに直接結合するグルコースとセラミドの間を切断
するのみでなく、例えば、トリガラクトシルセラミドの
ようなセラミドに直接結合するガラクトースとセラミド
の間を切断する作用をも有することである。Furthermore, it should be noted that this enzyme not only cleaves between glucose and ceramide, which directly bind to ceramide in glycolipids, but also, for example, between galactose and ceramide, which directly binds to ceramides such as triggeractosylceramide. It also has a function of cutting.

(ハ)至適pH ６ (ニ)安定pH ５〜９ (ホ)作用最適温は３７℃であり、３０〜４０℃の範囲で
適用可能である。(C) Optimum pH 6 (d) Stable pH 5-9 (e) The optimum action temperature is 37 ° C, and it is applicable in the range of 30-40 ° C.

(ヘ)分子量 ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約６６０００である。(F) Molecular weight The molecular weight by SDS-10% polyacrylamide gel electrophoresis is about 66000.

なお、本酵素はセフアデツクスＧ−１００ゲル過にお
いては、ボイドボリュ―ム（void volume）位置に溶出
された（見かけ上の分子量約１５万）。In the Sephadex G-100 gel, the enzyme was eluted at the void volume position (apparent molecular weight about 150,000).

(ト)安定性 ３７℃で一夜間安定であり、また、凍結乾
燥品は−２５℃で少なくとも数ケ月間安定である。(G) Stability It is stable at 37 ° C overnight, and the freeze-dried product is stable at -25 ° C for at least several months.

(チ)阻害 酵素活性は銅イオン及び水銀イオンにより阻
害されるが、カルシウムイオン及びマグネシウムイオン
による影響はない。(H) Inhibition The enzyme activity is inhibited by copper ion and mercury ion, but not by calcium ion and magnesium ion.

(リ)活性化 酵素の基質に対する活性は界面活性剤の添
加により顕著に増大する。即ち、反応の際に、前記ＴＤ
Ｃを０．５mg／ml添加すると、無添加の場合に比して反
応は２．５倍に増大する。(I) Activation The activity of the enzyme on the substrate is remarkably increased by the addition of the surfactant. That is, during the reaction, the TD
Addition of 0.5 mg / ml of C increases the reaction 2.5 times as compared to the case of no addition.

この酵素を利用して以下の事項を解明することができ
る。The following matters can be elucidated using this enzyme.

(1)糖脂質における糖鎖の役割を知ることができる。(1) To understand the role of sugar chains in glycolipids.

(2)本酵素で切り出したオリゴ糖は、簡単な方法によつ
て〔^３Ｈ〕−標識又は２−アミノピリジンその他の螢光
物質による標識をすることができ、このため、従来の数
百倍の感度で糖鎖の構造決定ができる。(2) The oligosaccharide cut out with this enzyme can be labeled with [ ³ H] -labeled or a fluorescent substance such as 2-aminopyridine by a simple method. The structure of sugar chains can be determined with the sensitivity of.

(3)本酵素は糖脂質に対して特異的に作用し、糖蛋白質
に対しては作用しないので、微量の試料についても、糖
蛋白質であるか、糖脂質であるかの識別を容易に行なう
ことができる。(3) Since this enzyme specifically acts on glycolipids and does not act on glycoproteins, it is easy to distinguish between a small amount of sample whether it is a glycoprotein or a glycolipid. be able to.

以上の事項から、本酵素を使用して例えば細胞表層のウ
イルス・レセプター、細胞毒素（例えばコレラトキシ
ン）のレセプター、特異的ガン抗原、発生・分化に伴う
特異抗原等の構造決定及び糖鎖の役割などを調べること
が可能となり、その結果、それらに対する診断薬、治療
薬等の開発が期待される。From the above, using this enzyme, structural determination of, for example, viral receptors on the cell surface, receptors for cytotoxins (eg, cholera toxin), specific cancer antigens, specific antigens involved in development / differentiation, and roles of sugar chains It will be possible to investigate such factors, and as a result, development of diagnostic agents, therapeutic agents, etc. for them is expected.

（実施例） 以下、実施例により本発明をさらに説明する。(Examples) Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples.

実施例 (1)菌の培養と培養上清の調製 ロドコツカスエスピーＧ−７４（Rhodococcus sp.Ｇ−
７４）（微工研菌寄第８４２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−８４
２４））を、ポリペプトン0.5％、イーストエキス0.1
％、塩化ナトリウム0.2％及び誘引剤（ガングリオシド
0.1％又は牛脳アセトンパウダー１％）を含む２０００m
lの液体培地（pH7.0〜7.2）を用いて２８〜３０℃で４
日間培養した後、培養液を遠心分離（６０００rpm、３
０分間）し、上清を採取した。Example (1) Culture of Bacteria and Preparation of Culture Supernatant Rhodococcus sp. G-74
74) (Ministry of Industrial Research, Microbiology No. 8424 (FERM P-84
24)), polypeptone 0.5%, yeast extract 0.1
%, Sodium chloride 0.2% and attractant (ganglioside
2000m containing 0.1% or bovine brain acetone powder 1%)
4 at 28-30 ° C using l liquid medium (pH 7.0-7.2)
After culturing for one day, the culture solution was centrifuged (6000 rpm, 3
For 0 minutes) and the supernatant was collected.

(2)酵素の調製 上記に得た上清液１８００mlに固形硫安を、飽和溶液の
８０％濃度となるように加え５℃で一夜間放置した後、
同温度で４０分間遠心分離（６０００rpm）して沈澱物
を採取し、１２５mlの蒸留水に溶解し、セフアデツクス
Ｇ−１００（セフアデツクスは商標）のカラム（５×８
６cm）に導入し、0.2Ｍの食塩を含む０．０１Ｍの酢酸
緩衝液（pH6.0）を用いて展開して、酵素活性を有する
画分を採取した。こうして得られた本酵素の比活性は
５．８ｍ単位／mg蛋白質であり、他のグリコシダーゼ及
びプロテアーゼ等を全く含まず、構造解析用試薬として
充分使用可能であつた。(2) Preparation of enzyme Solid ammonium sulfate was added to 1800 ml of the supernatant liquid obtained above so that the concentration of the saturated solution was 80%, and the mixture was allowed to stand at 5 ° C overnight,
The precipitate was collected by centrifugation (6000 rpm) at the same temperature for 40 minutes, dissolved in 125 ml of distilled water, and added to a column (5 × 8) of Sephadex G-100 (Sephadex is a trademark).
6 cm) and developed with 0.01 M acetate buffer (pH 6.0) containing 0.2 M sodium chloride to collect a fraction having enzyme activity. The specific activity of the present enzyme thus obtained was 5.8 m units / mg protein, and it did not contain other glycosidases, proteases, etc. at all, and was sufficiently usable as a structural analysis reagent.

（発明の効果） 本発明に係る微生物は、特異性の高いエンド型糖脂質分
解酵素を産生する。(Effect of the Invention) The microorganism according to the present invention produces highly specific endo-glycolipid degrading enzyme.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】糖脂質を資化し、エンド型糖脂質分解酵素
の産生能を有するロドコツカスエスピーＧ−７４（Rhod
ococcus sp.Ｇ−７４）。1. Rhodococcus sp. G-74 (Rhod, which utilizes glycolipids and has the ability to produce endo-type glycolipid-degrading enzymes
ococcus sp. G-74).