JP2970932B2 - Novel heat-stable β-galactosyltransferase, its production method and its use - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規なβ−ガラクトシル基転移酵素、その
製造法及びその用途に関するものであり、さらに詳しく
は、サッカロポリスポラ属等の放線菌に属する微生物が
生産し、高い熱安定性を有する新規なβ−ガラクトシル
基転移酵素およびその製造法並びにその利用法に関す
る。Description: FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a novel β-galactosyltransferase, a method for producing the same and its use, and more specifically, to radiation of Saccharopolyspora and the like. The present invention relates to a novel β-galactosyltransferase produced by microorganisms belonging to fungi and having high thermostability, a method for producing the same, and a method for using the same.

［従来の技術］ 糖や配糖体を更に糖で修飾することにより、それらの
糖や配糖体（以下、「糖類」と略称する）に新たな生理
活性や物性を付与できることが知られている。例えば、
甘味度を増加させたり、苦味を緩和あるいは消去した
り、水に対する溶解度の低い配糖体（漢方薬の有効成分
等にその例が見られる）の水溶性を高めたり、生体内安
定性や腸管吸収性を増加させたりする作用が知られてい
る。[Prior Art] It is known that by further modifying sugars and glycosides with sugars, new physiological activities and physical properties can be imparted to those sugars and glycosides (hereinafter, abbreviated as "saccharides"). I have. For example,
Increases sweetness, reduces or eliminates bitterness, enhances water solubility of glycosides with low solubility in water (examples of active ingredients in traditional Chinese medicine), increases biostability and intestinal absorption The effect of increasing sex is known.

糖の修飾により付与される機能やその程度は、用いら
れる糖および修飾される糖類の種類によって異なるが、
糖類をガラクトシル基で修飾することによって、上述の
目的に対して好ましい効果を得られる例が多く報告され
ており、これに基づき様々な機能性オリゴ糖や機能性配
糖体が開発されてきた。The function imparted by the sugar modification and the degree thereof vary depending on the type of sugar used and the sugar to be modified,
Many examples have been reported in which a saccharide is modified with a galactosyl group to obtain a favorable effect for the above-mentioned purpose, and various functional oligosaccharides and functional glycosides have been developed based on this.

例えば次の式 Gal−（Gal）ｍ−Ｘ （式中、Galはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しくは
配糖体を示し、ｍは整数である）で表されるオリゴ糖ま
たは糖修飾配糖体において、Ｘがグルコース残基（Gl
u）、ｍが０〜４の整数であるオリゴ糖（ガラクトオリ
ゴ糖）は善玉腸内細菌であるビフィズス菌の増殖促進性
物質として知られ（特開昭55−104885号）、またその優
れた甘味度、甘味質、難う蝕性、低カロリー性、加工安
定性、保湿性、水分活性低下能、着色性などにより、食
品素材として幅広く利用されつつある。For example, an oligosaccharide or a sugar-modified glycoside represented by the following formula: Gal- (Gal) m-X (where Gal is a galactose residue, X is a saccharide or glycoside, and m is an integer) In the body, X is a glucose residue (Gl
u) and oligosaccharides (galacto-oligosaccharides) in which m is an integer of 0 to 4 are known as growth-promoting substances for bifidobacteria, which is a good intestinal bacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 55-104885), and their excellent sweetness. It has been widely used as a food material due to its degree, sweetness, poor caries, low calorie, processing stability, moisturizing property, ability to reduce water activity, and coloring.

また、蔗糖のガラクトシル化により、前記式において
Ｘがシュークロース、ｍが０であるガラクトシルシュー
クロース（特開昭64−85090号）が、また、ラクチュロ
ースのガラクトシル化により、前記式中、Ｘがラクチュ
ロース、ｍが０であるガラクトシルラクチュロース（特
開昭63−94987号）がそれぞれ得られ、これらもガラク
トオリゴ糖と同様、新しい機能性食品素材として利用さ
れつつある。更に、甘味配糖体ルブソシドについては、
そのガラクトシル化により甘味度、甘味質の改善が達成
されている（Argic.Biol.Chem.53,2923−2928,1989）。In addition, galactosylation of sucrose gives galactosyl sucrose in which X is sucrose and m is 0 in the above formula (Japanese Patent Application Laid-Open No. 85090/1988), and galactosylation of lactulose gives X in lactulose. , M is 0 (JP-A-63-94987), and these are also being used as new functional food materials like galacto-oligosaccharides. Furthermore, for the sweet glycoside rubusoside,
The degree of sweetness and sweetness have been improved by galactosylation (Argic. Biol. Chem. 53, 2923-2928, 1989).

以上のように、糖類にガラクトシル基あるいはオリゴ
ガラクトシル基を付加させ、ガラクトシル基付加物を製
造するには、β−ガラクトシダーゼのガラクトシル基転
移反応が利用されている。As described above, in order to add a galactosyl group or an oligogalactosyl group to a saccharide to produce a galactosyl group adduct, a galactosyl group transfer reaction of β-galactosidase is used.

この反応は、高濃度のβ−ガラクトピラノシド（例え
ばラクトース）の存在下、いくつかのβ−ガラクトシダ
ーゼが、糖（あるいは配糖体の糖部分）へのβ−Ｄ−ガ
ラクトシル基転移反応を触媒するという事実に基づいて
いる。In this reaction, in the presence of a high concentration of β-galactopyranoside (eg, lactose), some β-galactosidase undergoes a β-D-galactosyl group transfer reaction to a sugar (or a sugar moiety of a glycoside). It is based on the fact that it catalyzes.

酵素のβ−Ｄ−ガラクトシル基転移能の高さは、その
起源によって様々であり、効率良く反応を進めるために
は、高い転移能を持つβ−ガラクトシダーゼを用いる必
要があった。The degree of the β-D-galactosyl group transfer ability of the enzyme varies depending on the origin thereof, and it was necessary to use β-galactosidase having a high transfer ability in order to proceed the reaction efficiently.

従来用いられているβ−ガラクトシダーゼの例として
は、糸状菌アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus or
yzae,特公昭55−104885号）、細菌バチルス・サーキュ
ランス（Bacillus circulans,特公昭62−209780号）、
ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus
thermophilus,Food Chem.10,195−204,（1983））起源
の酵素があり、これらの酵素をラクトースに作用させる
ことにより、実際にガラクトオリゴ糖が製造されてい
る。また、β−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵母菌体の
例としては、リポマイセス（Lipomyces）、ロドトルラ
（Rhodotrula）、シロバシディウム（Sirobasidium）、
ステリグマトマイセス（Sterigumatomyces,日本農芸化
学会誌、63巻、３号、629ページ、1989年）、スポロボ
ロマイセス（Sporoboromyces,特公昭62−208293号）、
クリプトコッカス（Cryptococcus,特公昭60−251896
号、特公昭62−130695号、特公昭61−236790号）、クリ
ベロマイセス（Kluyveromyces、特公昭61−271999号）
などが知られており、これらを利用するガラクトオリゴ
糖の製造も試みられている。Examples of conventionally used β-galactosidase include filamentous fungi Aspergillus oryzae.
yzae, Japanese Patent Publication No. 55-104885), Bacillus circulans (Japanese Patent Publication No. 62-209780),
Streptococcus thermophilus
Thermophilus, Food Chem. 10, 195-204, (1983)), and galacto-oligosaccharides are actually produced by making these enzymes act on lactose. Examples of yeast cells having β-galactosidase activity include Lipomyces, Rhodotorula, Sirobasidium,
Sterigumatomyces (Sterigumatomyces, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry, Vol. 63, No. 3, p. 629, 1989), Sporoboromyces (Sporoboromyces, Japanese Patent Publication No. 62-208293),
Cryptococcus (JP-B-60-251896)
No., Japanese Patent Publication No. 62-130695, Japanese Patent Publication No. 61-236790), Kluyveromyces (Japanese Patent Publication No. 61-271999)
And the production of galactooligosaccharides using these are also being attempted.

通常、β−Ｄ−ガラクトシル基の供与体としては、ラ
クトースを用いるのが産業上もっとも有利である。ラク
トースは牛乳中に多量に含まれ、また、海外において酪
農廃棄物として多量に産出され、原料としてはもっとも
安価であるからである。ちなみに、β−ガラクトシダー
ゼを用いた乳糖分解乳の製造が既に実用化されているこ
と（フードケミカル、第７巻、38−44、（1986））を背
景として、転移活性の高いβ−ガラクトシダーゼを用い
たガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法が近年報告され
た（特開平１−168234号）。Usually, lactose is the most industrially advantageous to use as a donor of the β-D-galactosyl group. Lactose is contained in milk in large amounts, is produced abroad as dairy waste, and is the cheapest raw material. Incidentally, on the background that the production of lactose-decomposed milk using β-galactosidase has already been put into practical use (Food Chemical, Vol. 7, 38-44, (1986)), β-galactosidase having a high transfer activity is used. Recently, a method for producing galacto-oligosaccharide-containing processed milk has been reported (JP-A-1-168234).

［発明が解決しようとする課題］ ところで、一般に糖転移反応は、糖供与体（ここでは
ラクトース）の濃度が高いほど速やかにかつ収率良く進
行する。そして、このためには反応溶液中のラクトース
の濃度を上げれば良いのであるが、高濃度のラクトース
溶液は、常温では粘度が高いうえに結晶が析出しやす
く、製造工程上での取り扱いが困難であるという問題が
あった。[Problems to be Solved by the Invention] Generally, the higher the concentration of a sugar donor (here, lactose), the faster the transglycosylation reaction proceeds with high yield. For this purpose, the concentration of lactose in the reaction solution may be increased, but a high-concentration lactose solution has a high viscosity at room temperature and tends to precipitate crystals, which makes it difficult to handle in the manufacturing process. There was a problem.

そこで、反応系の温度を上げて（例えば、60℃以
上）、ラクトースの析出を押さえ、粘度を低下させるこ
とが求められていた。また、溶解度を上げることにより
単位体積当たりの反応物（ラクトース等）の仕込み量を
多くすればコスト的にも有利であり、しかも化学反応は
温度が高いほど早く進行するので、反応系の温度を上げ
ることによって、酵素反応速度を大きくし反応時間を短
縮化することも可能となる。更に、反応温度の高温化に
よって雑菌が成育しにくくなり、また、高温によって達
成される高濃度糖の高い浸透圧による静菌作用が働き、
製造工程の雑菌汚染防止にも役立つことが予想される。Therefore, it has been required to increase the temperature of the reaction system (for example, 60 ° C. or higher) to suppress the precipitation of lactose and reduce the viscosity. In addition, it is advantageous in terms of cost to increase the amount of reactants (such as lactose) per unit volume by increasing the solubility, and the higher the temperature, the faster the chemical reaction proceeds. By increasing the rate, it is also possible to increase the enzyme reaction rate and shorten the reaction time. Furthermore, the increase in the reaction temperature makes it difficult for various bacteria to grow, and the bacteriostatic action by the high osmotic pressure of the high-concentration sugar achieved by the high temperature works.
It is expected to be useful for prevention of contamination of various bacteria in the manufacturing process.

このように、高温によるガラクトシル基転移反応は利
点が多いのであるが、このように高温で反応を行なうた
めには、酵素に高い熱安定性が要求される。更に、上記
反応を工業的に有利に利用するためには、付加物の量産
化と製造コストの低減化のために、酵素を固定化し、反
応工程を自動化、連続化することが求められている。As described above, the galactosyl group transfer reaction at a high temperature has many advantages, but in order to carry out the reaction at such a high temperature, the enzyme is required to have high thermal stability. Furthermore, in order to industrially utilize the above reaction industrially, it is required to immobilize the enzyme and to automate and continuously perform the reaction process in order to mass-produce the adduct and reduce the production cost. .

一般に、β−ガラクトシダーゼは高濃度のラクトース
により安定化されるが、これを固定化して、高温で長期
間にわたり繰り返し使用するためには、さらに高度な耐
熱性が要求される。しかし、前述の糸状菌アスペルギル
ス・オリゼー、細菌バチルス・サーキュランス、ストレ
プトコッカス・サーモフィラス起源の酵素、あるいはリ
ポマイセス、ロドトルラ、シロバシディウム、スポロボ
ロマイセス、クリプトコッカス、クリベロマイセスなど
のβ−ガラクトシダーゼ活性をもつ酵母菌体は、熱安定
性が必ずしも高くなく、高温での繰り返し使用には適切
ではない。Generally, β-galactosidase is stabilized by a high concentration of lactose, but in order to immobilize it and use it repeatedly at a high temperature for a long period of time, higher heat resistance is required. However, yeast cells having β-galactosidase activity, such as the aforementioned filamentous fungi Aspergillus oryzae, bacteria derived from Bacillus circulans, Streptococcus thermophilus, or enzymes such as lipomyces, rhodotorula, silobasidium, sporoboromyces, cryptococcus, and criberomyces, However, the thermal stability is not always high and is not suitable for repeated use at high temperatures.

一方、熱安定性を有し、しかも高温繰り返し使用に耐
えうるβ−ガラクトシダーゼとしては、ペシロマイセス
（Paecilomyces varioti）の酵素（Appl.Microbiol.Bio
technol.27,383−388,1988）が知られているが、この酵
素の反応最適pHは3.5であって、例えば牛乳（pH7付近）
中のラクトースを利用する製造工程には不適当であっ
た。On the other hand, as β-galactosidase which is thermostable and can withstand repeated use at high temperatures, an enzyme of Paecilomyces varioti (Appl. Microbiol. Bio
technol. 27, 383-388, 1988), the reaction optimum pH of this enzyme is 3.5, for example, milk (around pH 7)
It was unsuitable for a production process utilizing lactose in the product.

したがって、実際の高温酵素反応に適する酵素の提供
が求められていた。Therefore, it has been required to provide an enzyme suitable for an actual high-temperature enzyme reaction.

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、高いβ−Ｄ−ガラクトシル基転移能な
らびに高い熱安定性をもち、中性域で使用しうる酵素を
自然界より探索した結果、放線菌に属する微生物、特に
サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）、サーモモ
ノスポラ（Thermomonospora）またはサーモアクチノマ
イセス（Thermoactinomyces）に属する菌株中に上記の
目的にかなうβ−ガラクトシル基転移酵素を生産するも
のがあることを見いだした。[Means for Solving the Problems] The present inventors searched from nature for an enzyme which has a high β-D-galactosyl group transfer ability and a high thermal stability and can be used in the neutral region. Microorganisms belonging to Saccharopolyspora, Thermomonospora, or Thermoactinomyces produce a β-galactosyltransferase that fulfills the above-mentioned purpose. I found it.

そして、これらの菌株を液体培養または固体培養する
ことにより耐熱性β−ガラクトシル基転移酵素を生産さ
せ、これを必要に即して精製純化あるいは固定化するこ
とにより、一般式（Ｉ） Gal−（Gal）ｎ−Ｘ （Ｉ） （式中、Galはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しくは
配糖体を示し、ｎは０−４の整数である） で示されるオリゴ糖あるいは糖修飾配糖体の製造に利用
することができることを見出した。Then, these strains are subjected to liquid culture or solid culture to produce a heat-resistant β-galactosyltransferase, which is purified, purified or immobilized as required to obtain the general formula (I) Gal- ( Gal) n-X (I) (wherein Gal represents a galactose residue, X represents a saccharide or glycoside, and n is an integer of 0-4) or a sugar-modified glycoside represented by the following formula: And found that it can be used for the production of

即ち、本発明は、新規な耐熱性β−ガラクトシル基転
移酵素、該酵素の製造法、および該酵素の利用法を提供
するものである。That is, the present invention provides a novel thermostable β-galactosyltransferase, a method for producing the enzyme, and a method for using the enzyme.

本発明の耐熱性β−ガラクトシル基転移酵素は、放線
菌に属する微生物、特にサッカロポリスポラ、サーモモ
ノスポラ、サーモアクチノマイセス等に属する菌株の培
養物から得ることができる。The heat-stable β-galactosyltransferase of the present invention can be obtained from cultures of microorganisms belonging to actinomycetes, particularly strains belonging to Saccharopolyspora, Thermomonospora, Thermoactinomyces and the like.

本発明者らは、前記したように、高い熱安定性を有
し、中性域で作用しうるβ−ガラクトシル基転移酵素生
産菌を自然界より探索した結果、上記に属する菌株中に
目的とする耐熱性β−ガラクトシル基転移酵素を生産す
るものが存在することを見いだしており、その中でも特
に石川県の牧草地土壌から分離したサッカロポリスポラ
に属する菌株、SAM1400株が、目的とする耐熱性β−ガ
ラクトシル基転移酵素をとりわけ多量に生産している。The present inventors have, as described above, a β-galactosyltransferase-producing bacterium having a high thermostability and capable of acting in a neutral region, as a result of natural search, and as a result, a target strain among the strains belonging to the above. Heat-resistant β-galactosyltransferases have been found to exist, among which, in particular, a strain belonging to Saccharopolyspora isolated from pasture soil in Ishikawa Prefecture, the SAM1400 strain is the target heat resistance It produces particularly large amounts of β-galactosyltransferase.

そこで、本発明において用いることができるβ−ガラ
クトシル基転移酵素産生菌の代表例として、微生物SAM1
400株をあげ、その菌学的特徴を以下に述べる。Therefore, as a representative example of β-galactosyltransferase producing bacteria that can be used in the present invention, the microorganism SAM1
400 strains are listed, and their mycological characteristics are described below.

菌学的特徴： （１）形態学的所見 SAM1400株は、直径0.4〜0.8μｍの基底菌糸および気
中菌糸を形成する。基底菌糸は分岐し、まれに分断が認
められる。気中菌糸は分岐し、その先端に３ないし７
個、まれに10個以上の直鎖状の胞子連鎖を形成する。一
方、気中菌糸を形成していない場合でも、基底菌糸にお
いて２ないし６個の胞子鎖を、寒天培地内部、寒天培地
表面、および表面より気中に向かって形成する。胞子は
球状であり、その大きさは直径0.8〜1.0μｍで、その表
面は平滑である。胞子嚢、菌糸束、菌核などの構造体
は、14日培養後も認められなかった。Mycological characteristics: (1) Morphological findings The SAM1400 strain forms basal hyphae and aerial hyphae having a diameter of 0.4 to 0.8 μm. The basal hypha diverges, and is rarely fragmented. Aerial hyphae diverge, and 3 to 7 at the tip
Spores, and rarely 10 or more linear spore chains. On the other hand, even when the aerial hypha is not formed, 2 to 6 spore chains are formed in the basal hypha inside the agar medium, on the surface of the agar medium, and toward the air from the surface. The spores are spherical, their size is 0.8-1.0 μm in diameter, and their surface is smooth. Structures such as sporangia, hyphal bundles and sclerotia were not observed even after 14 days of culture.

（２）培養所見（55℃、14日間培養） ショ糖・硝酸塩寒天培地； 生 育： 貧 弱 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：灰黄色 可溶性色素：な し グルコース・アスパラギン寒天培地； 生 育： 貧 弱 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：灰黄色 可溶性色素：な し グリセリン・アスパラギン寒天培地； 生 育： 良 好 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：薄黄色 可溶性色素：な し スターチ・無機塩培地； 生 育： 貧 弱 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：黄 色 可溶性色素：な し チロシン・寒天培地； 生 育： 良 好 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：灰黄色 可溶性色素：な し 栄養寒天培地； 生 育： 良 好 気中菌糸： かすか 裏面の色調：黄 色 可溶性色素：な し 酵母エキス・麦芽エキス寒天培地； 生 育： 良 好 気中菌糸： 貧弱、白色 裏面の色調：黄褐色 可溶性色素：な し オートミール寒天培地； 生 育： 良 好 気中菌糸： 形成せず 裏面の色調：黄 色 可溶性色素：な し NaCl寒天培地^＊ 生 育： 良 好 気中菌糸： 豊富、白色 裏面の色調：黄 色 可溶性色素：な し^＊ 10％NaClを含むトリプチケースソイブロス（BBL）＋
２％寒天培地 （３）生理学的所見 生育温度範囲 １％グルコースを含む栄養寒天培地で、50℃、55℃、
65℃での生育が認められ、トリプチケースソイブロス
（BBL）＋２％寒天培地で、30℃、37℃での生育が認め
られた。最適生育温度は50〜55℃と思われた。(2) Culturing findings (cultured at 55 ° C for 14 days) Sucrose / nitrate agar medium; growth: poor weak aerial hyphae: not formed Back color: gray yellow Soluble pigment: none glucose / asparagine agar medium; raw Growth: Poor Low Aerial hypha: Not formed Color of the back side: Gray yellow Soluble pigment: None Glycerin / Asparagine agar medium; Growth: Good Aerobic mycelium: Not formed Color of the back side: Light yellow Soluble pigment: None Starch / inorganic salt medium; Growth: Poor Aerial hypha: Not formed Back color: yellow Soluble pigment: None Tyrosine / agar medium; Growth: Good Aerobic mycel: Not formed Back color : Gray yellow Soluble pigment: None Nutrient agar medium; growth: good aerobic mycelium: faint color of back side: yellow Soluble pigment: none yeast extract / malt extract agar medium; growth: good aerobic mycelium: Poor, white color on the back Tan soluble pigment: Na Shi oatmeal agar; raw rearing: good good aerial mycelium Formation Without the backside of color: yellow soluble pigment: Na Shi NaCl agar ^* Raw education: good aerobic hyphae: rich, white Back color: Yellow Soluble dye: None ^* Trypticase soy broth (BBL) + containing 10% NaCl
2% agar medium (3) Physiological findings Growth temperature range Nutrient agar medium containing 1% glucose at 50 ° C, 55 ° C,
Growth was observed at 65 ° C., and growth was observed at 30 ° C. and 37 ° C. on trypticase soy broth (BBL) + 2% agar medium. The optimal growth temperature seemed to be 50-55 ° C.

ゼラチンの液化（55℃） ゼラチン液化試験用培地のいずれにおいても、生育が
認められなかった。Liquefaction of gelatin (55 ° C.) No growth was observed in any of the gelatin liquefaction test media.

スターチの加水分解： 陰 性 脱脂乳の凝固： 陰 性 脱脂乳のペプトン化： 陰 性 メラニン様色素の生成 ペプトン・酵母エキス・鉄寒天培地： 陰 性^＊ チロシン寒天培地： 陰 性 トリプトン・酵母エキス寒天培地： 陰 性 ^＊ ：培地の底に、薄褐色の色素の沈降が見られる。Starch hydrolysis: Negative skim milk coagulation: Negative skim milk peptone formation: Negative melanin-like pigment formation Peptone / Yeast extract / Iron agar medium: Negative ^* Tyrosine agar medium: Negative trypton / Yeast extract agar Medium: Negative ^* : Light brown pigment precipitates at the bottom of the medium.

硝酸塩の還元： 陽 性 10％NaCl耐性： 陽 性 グアニンの分解： 陽 性 エラスチンの分解： 陰 性 キサンチンの分解： 陽 性 ヒポキサンチンの分解： 陽 性 炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリープ寒天培地、
55℃、17日間培養）： Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−キシロース ＋ ラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ± Ｌ−アラビノース ± Ｄ−フルクトース ＋ ラフィノース − Ｄ−マンニトール ＋ イノシトール ＋ シュクロース − ただし、＋；利用する、±；利用するかどうか疑わし
い、−；利用しない。Nitrate reduction: positive 10% NaCl tolerance: positive Decomposition of guanine: positive Decomposition of elastin: negative Decomposition of xanthine: positive Decomposition of hypoxanthine: availability of positive carbon source (Pridham-Gotryp agar,
(Culture at 55 ° C for 17 days): D-glucose + D-xylose + lactose + L-rhamnose ± L-arabinose ± D-fructose + raffinose-D-mannitol + inositol + sucrose-where +; It is doubtful whether to use,-;

（４）化学分類学的性質 （ａ）2,6−ジアミノピメリン酸 全菌体を、スタネック（Staneck,J.L.）およびロバー
ツ（Roberts,G.D.）の方法（アプライド マイクロバイ
オロジー（Applied Microbiology）,28巻,226ページ,19
74年）に準拠して調べた結果、メソ−2,6−ジアミノピ
メリン酸の存在が認められた。(4) Chemotaxonomic properties (a) 2,6-Diaminopimelic acid All cells were subjected to the method of Staneck, JL and Roberts, GD (Applied Microbiology, Vol. 28, 226 pages, 19
As a result, the presence of meso-2,6-diaminopimelic acid was recognized.

（ｂ）糖 全菌体の加水分解物中に、アラビノースとガラクトー
スの存在が認められた。(B) Sugar The presence of arabinose and galactose was observed in the hydrolyzate of all the cells.

（ｃ）キノン系 MK−９（H4）を主成分として有し、そのほかにMK−９
（H6）、MK−９（H8）、MK−10（H4）、MK−10（H6）、
MK−10（H8）、MK−10（H10）を有していた。(C) Quinone-based MK-9 (H4) as a main component, and in addition, MK-9
(H6), MK-9 (H8), MK-10 (H4), MK-10 (H6),
It had MK-10 (H8) and MK-10 (H10).

（ｄ）リン脂質タイプ フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロ
ールを含む。これは、ルシェバリエM.P.（Lechevalier,
M,P.）およびH.A.ルシェバリエ（H.A.Lechevalier）
（A.Dietz and D.W.Thayer（編）、アクチノマイセート
タクソノミー（Actinomycete Taxonomy）、227−291
頁、1980年）によるＰ−IIIタイプに属する。(D) Phospholipid type including phosphatidylcholine and phosphatidylglycerol. This is the Lechevalier MP
M, P.) And HA Halechevalier
(A. Dietz and DWThayer (eds.), Actinomycete Taxonomy, 227-291)
P. III, p. 1980).

（ｅ）ミコール酸 菌体内にミコール酸を含まない。(E) Mycolic acid Mycolic acid is not contained in the cells.

これらの結果から、SAM1400株の細胞壁は、メソ−2,6
−ジアミノピメリン酸とガラクトース、アラビノースを
含む、IV−Ａタイプと判断される。From these results, it was found that the cell wall of the SAM1400 strain was meso-2,6
-It is determined to be an IV-A type containing diaminopimelic acid, galactose and arabinose.

形態的特徴としては、SAM1400株は気中菌糸を形成
し、分岐して平滑な球状の胞子を連鎖上に着生する。胞
子の連鎖は短く、その数は３〜７個が普通で、まれに10
個以上の胞子連鎖も認められる。その一方で、気中菌糸
の形成が認められないときには、基底菌糸において、胞
子連鎖の形成が認められた。これは、基底菌糸から短い
胞子柄（認められない場合もある）の先に２〜６個の平
滑な球状の胞子が寒天培地表面より上に向かって連鎖す
るものである。キノン系はMK−９（H4）を主成分として
有し、リン脂質タイプはＰ−IIIで、ミコール酸を含ま
ない。グアニン、ヒポキサンチン、キサンチンを分解
し、エラスチンを分解せず、30〜65℃で生育し、10％Na
Clに耐性を示す。As a morphological feature, the SAM1400 strain forms aerial hyphae and diverges to form smooth, spherical spores on the linkage. The spore chain is short, usually 3-7, rarely 10
More than one spore chain is also observed. On the other hand, when the formation of aerial hypha was not observed, the formation of a spore chain was observed in the basal hypha. This is one in which 2 to 6 smooth spherical spores are linked from the basal hypha to a short spore stalk (sometimes not recognized) and upward from the surface of the agar medium. The quinone system has MK-9 (H4) as a main component, the phospholipid type is P-III, and does not contain mycolic acid. Decomposes guanine, hypoxanthine and xanthine, does not decompose elastin, grows at 30-65 ° C, and contains 10% Na
Shows resistance to Cl.

以上の菌学的性質より、S.T.ウイリアムス（S.T.Will
iams）編の、バージェイズ マニュアル オブ システ
マティック バクテリオロジー、第４巻、1989年（Will
iams,S.T.（ed.）,Bergey's Manual of Systematic Bac
teriology,vol4,1989）に従って、本菌株の分類学的位
置を求めたところ、SAM1400株はファエニア・レクチヴ
ィルグラ（Faenia rectivirgula）に属する放線菌であ
ることが判明した。From the above mycological properties, ST Williams (STWill
iams), Barjay's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 4, 1989 (Will
iams, ST (ed.), Bergey's Manual of Systematic Bac
When the taxonomic position of the strain was determined according to teriology, vol 4, 1989), it was found that the SAM1400 strain was an actinomycete belonging to Faenia rectivirgula.

そこで、F.レクチヴィルグラ（F.rectivirgula）の基
準菌株と同種と同定された菌株２株を入手し、SAM1400
株と培養性状、生理的性状及びキノン系の比較試験を行
った。その結果を第１表に示す。Therefore, two strains identified as the same species as the reference strain of F. rectivirgula were obtained, and SAM1400 was obtained.
Comparative tests of strains, culture properties, physiological properties and quinones were performed. Table 1 shows the results.

第１表に示すようにSAM1400株とF.レクチヴィルグラ
の基準株を含む３株は、非常に良く一致する菌学的性質
を示した。 As shown in Table 1, three strains, including the SAM1400 strain and the reference strain of F. lectiwigla, showed very good mycological properties.

以上のことから、本発明者らはSAM1400株をF.レクチ
ヴィルグラであると同定した。しかしながら、コーン−
ウエンデッシュ（Korn−Wendisch）ら（インターナテョ
ナル ジャーナル オブ システマティック バクテリ
オロジー（International Journal of Systematic Bact
eriology）39巻、430−441頁、1989年）は、菌体脂肪酸
組成、キノン系、リン脂質タイプ等の化学分類学的性質
によって、ファエニア属はサッカロポリスポラ属と同一
であるとし、F.レクチヴィルグラをサッカロポリスポラ
属に移し、新組合せ、サッカロポリスポラ・レクチヴィ
ルグラ（Saccharopolyspora rectivirgula）を提唱して
いる。Based on the above, the present inventors identified the SAM1400 strain as F. lectivirgra. However, corn
Korn-Wendisch et al. (International Journal of Systematic Bact
eriology), Vol. 39, pp. 430-441, 1989) states that the genus Phaenia is the same as the genus Saccharopolyspora due to the chemical taxonomic properties of the fatty acid composition of the cells, quinones, and phospholipid types. He has transferred Lecci Virgra to the genus Saccharopolyspora and has proposed a new combination, Saccharopolyspora rectivirgula.

そこで、本発明者らは、コーン−ウエンデッシュら
（インターナテョナル ジャーナル オブ システマテ
ィック バクテリオロジー（International Journal of
Systematic Bacteriology）39巻、430−441頁、1989
年）に従い、本菌株をサッカロポリスポラ・レクチヴィ
ルグラと同定した。Thus, the present inventors have proposed Corn-Wendesh et al. (International Journal of Systematic Bacteriology).
Systematic Bacteriology) 39, 430-441, 1989
This strain was identified as Saccharopolyspora lectivirula.

なお、SAM1400株は、サッカロポリスポラ・レクチヴ
ィルグラSAM1400株（Saccharopolyspora rectivirgula
SAM 1400）と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に、受託番号微工研条寄第2768号（FERM BP−276
8）として寄託されている。In addition, SAM1400 strain is Saccharopolyspora rectivirgula strain SAM1400 strain.
No. 2768 (FERM BP-276).
8).

また、他の属に属する本発明の新規β−ガラクトシル
基転移酵素産生微生物の例としては、サーモアクチノマ
イセスsp.SAM1544（Thermoactinomyces sp.SAM 154
4）、サーモアクチノマイセスsp.SAM1545（Thermoactin
omyces sp.SAM 1545）、サーモモノスポラsp.SAM1546
（Thermomonospora sp.SAM 1546）、サーモモノスポ
ラsp.SAM1547（Thermomonospora sp.SAM 1547）等が
挙げられる。Examples of the novel β-galactosyltransferase-producing microorganism of the present invention belonging to other genera include Thermoactinomyces sp. SAM1544 (Thermoactinomyces sp. SAM1544).
4), Thermoactinomyces sp.SAM1545 (Thermoactin
omyces sp.SAM 1545), Thermomonospora sp.SAM1546
(Thermomonospora sp.SAM 1546), Thermomonospora sp.SAM1547 (Thermomonospora sp.SAM1547) and the like.

これらの微生物も、それぞれ工業技術院微生物工業技
術研究所に、受託番号微工研条寄第2769号（FERM BP−2
769）、同2770号（FERM BP−2770）、同2771号（FERM B
P−2771）、同2772号（FERM BP−2772）として寄託され
ている。These microorganisms are also supplied to the Institute of Microbial Industry and Technology of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, respectively, under the accession number No. 2769 (FERM BP-2).
769), No. 2770 (FERM BP-2770), No. 2771 (FERM B
P-2771) and No. 2772 (FERM BP-2772).

上記各微生物を利用する新規β−ガラクトシル基転移
酵素の製造は、常法にしたがって当該微生物を培地に接
種し、これを培養することにより行なわれる。The production of a novel β-galactosyltransferase utilizing each of the above microorganisms is carried out by inoculating the microorganism with a medium according to a conventional method and culturing the medium.

各菌株の培養は、通常行なわれている通気攪拌培養、
振盪培養、静置培養等の液体培養法もしくは固体培養法
により行なうことができる。Culture of each strain is performed by aeration and stirring culture, which is usually performed.
It can be performed by a liquid culture method such as shaking culture or static culture or a solid culture method.

培地は、炭素源として、ラクトース、グルコース、シ
ュクロース、デンプンなど、窒素源としてペプトン、酵
母エキス、尿素、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、
無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウムなどや、また必要に応じてMn²⁺,Zn²⁺,Ni
²⁺等の微量金属、ビオチン、チアミンなどのビタミン類
等を適宜加えたものを用いる。The culture medium contains, as a carbon source, lactose, glucose, sucrose, starch, etc., and a nitrogen source such as peptone, yeast extract, urea, ammonium sulfate, amino acids, etc.
As inorganic salts, potassium phosphate, magnesium sulfate,
Calcium chloride, etc., and if necessary, Mn ²⁺ , Zn ²⁺ , Ni
A substance to which trace metals such as ²⁺ and vitamins such as biotin and thiamine are appropriately added is used.

培養温度は生育できる温度範囲ならとくに限定されな
いが、50℃付近が望ましい。また、培養は、24〜192時
間程度行なわれる。The culture temperature is not particularly limited as long as it can grow, but is preferably around 50 ° C. The culture is performed for about 24-192 hours.

かくして得られた培養物から本発明のβ−ガラクトシ
ル基転移酵素を採取するには、まず遠心分離法や濾過法
などにより培養物をブロス画分と菌体画分に分画する。
β−ガラクトシル基転移酵素活性画分につき、さらに限
外濾過、透析、塩析、溶媒沈殿、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラ
フィー、疎水性クロマトグラフィー、等電点沈殿など周
知の方法を、単独あるいは組み合わせて行なうことによ
り、β−ガラクトシル基転移酵素の濃縮あるいは精製標
品を得ることができる。In order to collect the β-galactosyltransferase of the present invention from the culture thus obtained, the culture is first fractionated into a broth fraction and a cell fraction by a centrifugation method, a filtration method, or the like.
For the β-galactosyltransferase active fraction, well-known methods such as ultrafiltration, dialysis, salting out, solvent precipitation, ion exchange chromatography, gel chromatography, adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, isoelectric point precipitation, etc. , Alone or in combination, to obtain a concentrated or purified preparation of β-galactosyltransferase.

以上のようにして分離、精製された、本発明の耐熱性
β−ガラクトシル基転移酵素のうち、サッカロポリスポ
ラ・レクチヴィルグラSAM1400の産生する酵素の酵素化
学的性質はつぎのとおりである。Among the thermostable β-galactosyltransferases of the present invention separated and purified as described above, the enzyme produced by Saccharopolyspora lectivirgra SAM1400 has the following enzymatic properties.

酵素化学的性質： （１）作 用 転移反応： β−Ｄ−ガラクトピラノシドGal−X1モルと、ガラ
クトシル基受容体Y1モルとから、あらたなβ−Ｄ−ガラ
クトピラノシドGal−Y1モルと、X1モルを生成する。こ
こで、Ｘ、Ｙはいずれも水以外の化合物で、糖あるいは
アグリコンである。Enzyme chemical properties: (1) Action Transfer reaction: From 1 mol of β-D-galactopyranoside Gal-X and 1 mol of galactosyl group receptor Y, a new β-D-galactopyranoside Gal-Y1 mol is formed. To produce X1 moles. Here, both X and Y are compounds other than water, and are sugars or aglycones.

加水分解： １モルのβ−Ｄ−ガラクトピラノシドGal−Ｘを加
水分解し、１モルのＸと１モルのガラクトースを生成す
る。Hydrolysis: One mole of β-D-galactopyranoside Gal-X is hydrolyzed to produce one mole of X and one mole of galactose.

（２）pH安定性 0.01M酢酸緩衝液（pH3.5−6.5）、0.01Mリン酸緩衝液
（pH6.0−8.0）、あるいは0.01Mピロリン酸緩衝液（pH
8.0−9.5）中で55℃、15分間インキュベートし、各pHで
の残存活性を測定した結果、pH5.0以上で安定であっ
た。(2) pH stability 0.01 M acetate buffer (pH 3.5-6.5), 0.01 M phosphate buffer (pH 6.0-8.0), or 0.01 M pyrophosphate buffer (pH
8.0-9.5), the mixture was incubated at 55 ° C for 15 minutes, and the residual activity at each pH was measured. As a result, it was stable at pH 5.0 or higher.

（３）熱安定性 0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）中にて、30〜80℃で１時
間インキュベートし、各温度における残存活性を測定し
た結果、60℃まではほぼ安定であった。また1Mラクトー
スを含有する0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）中で、65℃、
24時間処理し、残存活性を測定した結果、失活は認めら
れなかった。(3) Thermal stability Incubation was carried out in a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.2) at 30 to 80 ° C. for 1 hour, and the residual activity at each temperature was measured. As a result, it was almost stable up to 60 ° C. . In 0.01M phosphate buffer (pH 7.2) containing 1M lactose, 65 ° C,
After treating for 24 hours and measuring the residual activity, no inactivation was observed.

（４）最適pH 0.1Mリン酸緩衝液（pH6.0−8.0）における最適pHは7.
2であった。(4) Optimum pH The optimum pH in a 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0-8.0) is 7.
Was 2.

（５）基質特異性 各種のβ−ガラクトピラノシドおよびその類縁体につ
いて、基質濃度10mMにおける加水分解反応を行なった結
果を第２表に示す。(5) Substrate specificity Table 2 shows the results of hydrolysis of various β-galactopyranosides and their analogs at a substrate concentration of 10 mM.

（６）分子量 TSK−G3000SW−XLカラムを用いた高速液体ゲルクロマ
トグラフィー（移動相:0.15M KClを含む0.01Mリン酸緩
衝液pH7.2,流速:1.0ml/min）により、オリエンタル酵母
社製の各種標準タンパク質との相対溶出保持時間から分
子量を求めた結果、本酵素の分子量は140,000±20,000
であった。 (6) Molecular weight By high performance liquid gel chromatography using a TSK-G3000SW-XL column (mobile phase: 0.01 M phosphate buffer pH 7.2 containing 0.15 M KCl, flow rate: 1.0 ml / min), manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd. As a result of calculating the molecular weight from the relative elution retention time with various standard proteins, the molecular weight of this enzyme was 140,000 ± 20,000
Met.

（７）サブユニット分子量およびサブユニット構造 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により本酵素
のサブユニットの分子量を求めたところ、140,000±20,
000であった。ファスト−ゲル（Phast−Gel）電気泳動
装置を用い、各種標準蛋白質との相対移動度から求め
た。本酵素は単量体と思われる （８）阻害剤 本酵素はHg²⁺,Cu²⁺,などの金属イオンおよびエチレン
ジアミン四酢酸により阻害された（第３表）。(7) Subunit molecular weight and subunit structure The molecular weight of the subunit of the present enzyme was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis to be 140,000 ± 20,
000. Using a fast-gel (Phast-Gel) electrophoresis apparatus, the relative mobility with various standard proteins was determined. (8) Inhibitor This enzyme was inhibited by metal ions such as Hg ²⁺ , Cu ²⁺ , and ethylenediaminetetraacetic acid (Table 3).

（９）活性測定 ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの
加水分解の活性測定は、基質の加水分解により生成する
ｐ−ニトロフェノールを分光学的に追跡することにより
行なった。 (9) Activity measurement The activity of hydrolysis of p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside was measured by spectroscopically tracking p-nitrophenol generated by hydrolysis of the substrate.

すなわち、0.01Mのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシドを含有する0.01Mリン酸緩衝液（pH7.
2）0.60mlに、0.10mlの酵素液を加え、405nmにおける吸
光度の増加を55℃において追跡した。ｐ−ニトロフェノ
ールの生成量（μmol）を、pH7.2におけるｐ−ニトロフ
ェノールの分子吸光係数（ε₄₀₅＝1.34×10⁴）を用いて
計算により求めた。ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドの加水分解により定義した酵素１単位
（pNPGU）は、１分間に１μmolのｐ−ニトロフェニル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシドを加水分解する酵素量であ
る。ラクトースの加水分解の活性測定は、基質の分解に
より生成するグルコースを分光学的に定量することによ
り行なった。すなわち、0.1Mのラクトースを含有する0.
01Mリン酸緩衝液（pH7.2）0.90mlに、0.10mlの酵素液を
加え、55℃で10分間反応させ、33％トリクロロ酢酸0.05
mlを加えて反応を停止させた。反応停止させた上記反応
液0.1mlに、ベーリンガーマンハイム社製グルコース定
量キット1.0mlを加え、室温で45分間放置したのち、660
nmにおける吸光度を測定した。ラクトースの加水分解に
より定義した酵素１単位（LU）は、１分間に１μmolの
ラクトースを加水分解する酵素量である。That is, a 0.01 M phosphate buffer containing 0.01 M p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (pH 7.
2) 0.10 ml of the enzyme solution was added to 0.60 ml, and the increase in absorbance at 405 nm was followed at 55 ° C. The production amount (μmol) of p-nitrophenol was determined by calculation using the molecular extinction coefficient of p-nitrophenol at pH 7.2 (ε ₄₀₅ = 1.34 × 10 ⁴ ). One unit of enzyme (pNPGU) defined by the hydrolysis of p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside is 1 μmol of p-nitrophenyl- / min.
The amount of the enzyme that hydrolyzes β-D-galactopyranoside. The activity of lactose hydrolysis was measured by spectrophotometrically quantifying glucose produced by decomposition of the substrate. That is, 0.1 containing lactose 0.1M.
0.10 ml of the enzyme solution was added to 0.90 ml of a 01 M phosphate buffer (pH 7.2), and reacted at 55 ° C. for 10 minutes.
The reaction was stopped by adding ml. To 0.1 ml of the reaction solution after the reaction was stopped, 1.0 ml of a glucose quantification kit manufactured by Boehringer Mannheim was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 45 minutes.
The absorbance at nm was measured. One unit (LU) of the enzyme defined by the hydrolysis of lactose is the amount of the enzyme that hydrolyzes 1 μmol of lactose per minute.

本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素は、上記の酵素
化学的諸性質から新規であると判断された。The β-galactosyltransferase of the present invention was determined to be novel based on the above-mentioned enzymatic properties.

［実施例］ 次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。[Examples] Next, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.

実施例 １ ラクトース3.0％、アミノサンV3（甜菜抽出物）1.4
％、グルタミン酸１ナトリウム塩0.2％、酵母エキス0.1
％、リン酸１カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.05％
を含有する培地（pH7.2）100mlずつを500mlマイヤーフ
ラスコにいれ、120℃１気圧にて15分間オートクレーブ
殺菌したものに、SAM1400株を１白金耳ずつ植菌し、55
℃にて120時間通気攪拌培養した。培養終了後、培養物
を遠心処理して得た上清2.2リットルを、10mMリン酸緩
衝液（pH7.2）で平衡化したイオン交換樹脂セパビーズ
（SEPABEADS）FP−DA13カラム（三菱化成製、5cm×20c
m）に負荷し、上記緩衝液、次いで0.3M塩化カリウムを
含有する上記緩衝液でカラムを洗浄後、0.5M塩化カリウ
ムを含有する上記緩衝液にてβ−ガラクトシル基転移酵
素を溶出した。活性画分を限外濾過法にて濃縮し、10mM
リン酸緩衝液（pH7.2）に対して透析した。Example 1 Lactose 3.0%, Aminosan V3 (Sugar beet extract) 1.4
%, Glutamic acid monosodium salt 0.2%, yeast extract 0.1
%, 1% potassium phosphate, 0.05% magnesium sulfate
A SAM1400 strain was inoculated in a loop of 100 ml each containing 100 ml of a medium (pH 7.2) into a 500 ml Meyer flask and autoclaved at 120 ° C. and 1 atm for 15 minutes.
The culture was carried out with aeration and stirring at 120 ° C for 120 hours. After completion of the culture, 2.2 liters of the supernatant obtained by centrifuging the culture was subjected to ion exchange resin Sepabeads (SEPABEADS) FP-DA13 column (Mitsubishi Chemical, 5 cm) equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2). × 20c
m), and the column was washed with the above buffer solution and then with the above buffer solution containing 0.3 M potassium chloride. After that, β-galactosyltransferase was eluted with the above buffer solution containing 0.5 M potassium chloride. The active fraction was concentrated by ultrafiltration, 10 mM
Dialysis was performed against a phosphate buffer (pH 7.2).

実施例 ２ 上記透析内液を、10mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡
化したイオン交換樹脂DEAE−セファロース（DEAE−Seph
arose）CL−6B（ファルマシア製、2.8cm×20cm）に負荷
し、上記緩衝液、次いで、0.2M塩化カリウムを含有する
上記緩衝液にてカラムを洗浄後、0.2Mから0.6Mの塩化カ
リウムの直線濃度勾配（総量400ml）をかけることによ
りβ−ガラクトシル基転移酵素を溶出した。活性画分を
限外濾過法にて濃縮した後、0.15M塩化カリウムを含む1
0mMリン酸緩衝液（pH7.2）で平衡化したTSKゲルG3000SW
−XL（東ソー製）に、濃縮液を数回に分けて負荷し、ク
ロマトグラフィーを行なった（流速、1.0ml/min;検出、
280nmにおける吸光度）。活性画分を限外濾過法にて濃
縮し、10mMリン酸緩衝液（pH7.2）に対して透析した。Example 2 An ion exchange resin DEAE-Sepharose (DEAE-Sephose) was prepared by equilibrating the above dialysis solution with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2).
arose) CL-6B (manufactured by Pharmacia, 2.8 cm × 20 cm), and the column was washed with the above buffer solution and then with the above buffer solution containing 0.2 M potassium chloride. The β-galactosyltransferase was eluted by applying a linear concentration gradient (400 ml in total). After concentrating the active fraction by ultrafiltration, 1 containing 0.15M potassium chloride
T3000 gel G3000SW equilibrated with 0 mM phosphate buffer (pH 7.2)
-XL (manufactured by Tosoh Corporation) was loaded with the concentrated solution in several portions and chromatography was performed (flow rate, 1.0 ml / min; detection,
Absorbance at 280 nm). The active fraction was concentrated by ultrafiltration and dialyzed against 10 mM phosphate buffer (pH 7.2).

以上の操作によりえられた精製β−ガラクトシル基転
移酵素の総活性は240pNPGU、比活性は10pNPGU/mgであっ
た。The total activity of the purified β-galactosyltransferase obtained by the above operation was 240 pNPGU, and the specific activity was 10 pNPGU / mg.

実施例 ３ ラクトース5gを0.05M酢酸緩衝液（pH6.0）に溶解して
10mlとし、これに実施例１で得られたβ−ガラクトシル
基転移酵素標品10pNPGUを加え、65℃で４時間反応させ
た。反応液を95℃で５分間処理して反応を停止させ、１
部分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオンパ
ックKS801カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（移動相、水；カラム温度、70℃；流速、1ml/min;検
出、示差屈折計）で分析することにより、反応液の糖組
成を決定した。反応液には、７％の四糖以上のオリゴ
糖、21％の三糖類、48％の二糖類、及び24％の単糖類
（いずれも全糖に対する重量％）が含まれていた。Example 3 Lactose (5 g) was dissolved in 0.05 M acetate buffer (pH 6.0)
The volume was adjusted to 10 ml, and the β-galactosyltransferase preparation 10pNPGU obtained in Example 1 was added thereto, followed by reaction at 65 ° C for 4 hours. The reaction was treated at 95 ° C. for 5 minutes to stop the reaction.
The fraction was diluted 10-fold and analyzed by high performance liquid chromatography using a Shodex Ionpack KS801 column (mobile phase, water; column temperature, 70 ° C; flow rate, 1 ml / min; detection, differential refractometer). As a result, the sugar composition of the reaction solution was determined. The reaction solution contained 7% or more oligosaccharides of tetrasaccharide or more, 21% of trisaccharides, 48% of disaccharides, and 24% of monosaccharides (all by weight based on total sugars).

実施例 ４ 5gの酸素固定化用担体FE4612（オルガノ製）を４％Na
OH中50℃で２時間攪拌し、純水にて洗浄後、５％グルタ
ルアルデヒド15mlに懸濁し１時間攪拌する。その後、担
体を10mMリン酸緩衝液にて洗浄し、1000Uの酵素を含む1
0mMリン酸緩衝液中に懸濁し、２時間攪拌して固定化す
る。担体を10mMリン酸緩衝液にて洗浄し、これを固定化
β−ガラクトシル基転移酵素とした。固定化における活
性収率は87％であった。固定化β−ガラクトシル基転移
酵素1gを、60％（w/v）ラクトースを含有する0.05M酢酸
緩衝液（pH6.0）100mlに懸濁し、65℃で24時間攪拌し反
応を行なった。反応液の１部分を10倍に希釈してこれを
ショーデックス・イオンパックKS801カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィー（移動相、水；カラム温度、
70C;流速、1ml/min;検出、示差屈折計）で分析すること
により、反応液の糖組成を決定した。反応液には、３％
の四糖以上のオリゴ糖、25％の三糖類、58％の二糖類、
及び14％の単糖類（いずれも全糖に対する重量％）が含
まれていた。また、以上の反応を１サイクルとしてこれ
を繰り返し、固定化β−ガラクトシル基転移酵素の活性
半減期を１次反応に従うものとして計算により求めたと
ころ、固定化β−ガラクトシル基転移酵素の活性半減期
は少なくとも300サイクル以上と求められた。Example 4 5 g of oxygen-immobilizing support FE4612 (manufactured by Organo) was added to 4% Na
The mixture is stirred in OH at 50 ° C. for 2 hours, washed with pure water, suspended in 15 ml of 5% glutaraldehyde, and stirred for 1 hour. Thereafter, the carrier was washed with 10 mM phosphate buffer and contained 1
Suspend in 0 mM phosphate buffer and stir for 2 hours to immobilize. The carrier was washed with a 10 mM phosphate buffer and used as immobilized β-galactosyltransferase. The activity yield in immobilization was 87%. 1 g of the immobilized β-galactosyltransferase was suspended in 100 ml of a 0.05 M acetate buffer (pH 6.0) containing 60% (w / v) lactose, and stirred at 65 ° C. for 24 hours to carry out a reaction. One part of the reaction solution was diluted 10-fold and then subjected to high performance liquid chromatography using a Shodex Ionpack KS801 column (mobile phase, water; column temperature,
70C; flow rate, 1 ml / min; detection, differential refractometer) to determine the sugar composition of the reaction solution. 3% in the reaction solution
Oligosaccharides of more than tetrasaccharides, 25% trisaccharides, 58% disaccharides,
And 14% of monosaccharides (both by weight based on total sugars). The above reaction was repeated as one cycle, and the activity half-life of the immobilized β-galactosyltransferase was calculated by assuming that it follows the primary reaction. Was required to be at least 300 cycles or more.

実施例 ５ サーモモノスポラsp.SAM1546、同sp.SAM1547、サーモ
アクチノマイセスsp.SAM1544および同sp.SAM1545の４菌
株を、500mlのフラスコ中、100mlのラクトース３％、ペ
プトン0.2％、酵母エキス0.02％、KH₂PO₄0.2％、NaCl0.
3％及びMgSO₄・H₂O0.01％を含む倍地（pH7.2）を用い、
55℃で４日間振盪培養してβ−ガラクトシル基転移酵素
を得た。Example 5 Four strains of Thermomonospora sp.SAM1546, sp.SAM1547, Thermoactinomyces sp.SAM1544 and sp.SAM1545 were placed in a 500 ml flask, 100 ml of lactose 3%, peptone 0.2%, and yeast extract 0.02. _{%, KH 2 PO 4 0.2%} , NaCl0.
Using a medium (pH 7.2) containing 3% and 0.01% of MgSO ₄ .H ₂ O,
The mixture was shake-cultured at 55 ° C for 4 days to obtain β-galactosyltransferase.

得られたβ−ガラクトシル基転移酵素は、それぞれ第
４表に示すような性質を有するものであった。The resulting β-galactosyltransferases had the properties shown in Table 4, respectively.

実施例 ６ アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）起
源のラクターゼ（ヤクルト本社製、ラクターゼＹ−A
O）、バシルス・サーキュランス（Bacillus circulan
s）起源のラクターゼ（大和化成製、ビオラクタ）、お
よび本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素を、それぞれ
0.01Mリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、0.1mg/mlの溶液
を調製した。各酵素溶液を60℃で１時間インキュベート
した後、ただちに氷冷した。次いで、各酵素の残存活性
をそれぞれの説明書に記載してある最適条件に従い測定
した結果、アスペルギルス・オリゼー起源のラクター
ゼ、バシルス・サーキュランス起源のラクターゼ、およ
び本発明のβ−ガラクトシル基転移酵素の残存活性は、
それぞれ１％、１％および96％であった。 Example 6 Lactase derived from Aspergillus oryzae (Lactase Y-A, manufactured by Yakult Honsha)
O), Bacillus circulan
s) Lactase of origin (Daiwa Kasei, Violacta) and β-galactosyltransferase of the present invention
It was dissolved in a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 0.1 mg / ml solution. Each enzyme solution was incubated at 60 ° C. for 1 hour and immediately cooled on ice. Next, the residual activity of each enzyme was measured according to the optimal conditions described in the respective instructions.As a result, lactase derived from Aspergillus oryzae, lactase derived from Bacillus circulans, and β-galactosyltransferase of the present invention were determined. The residual activity is
They were 1%, 1% and 96%, respectively.

実施例 ７ ラクトース0.5gを0.05M酢酸緩衝溶液（pH6.0）に溶解
した溶液に、サーモモノスポラsp.SAM1546、サーモモノ
スポラsp.SAM1547、サーモアクチノマイセスsp.SAM1544
およびサーモアクチノマイセスsp.SAM1545の各培養物よ
り得たβ−ガラクトシル基転移酵素、1pNPGUを加えて最
終容量1.0mlとし、65℃で８時間反応させた。Example 7 In a solution in which 0.5 g of lactose was dissolved in a 0.05 M acetate buffer solution (pH 6.0), Thermomonospora sp.SAM1546, Thermomonospora sp.SAM1547, and Thermoactinomyces sp.SAM1544 were added.
Β-galactosyltransferase obtained from each culture of Thermoactinomyces sp. SAM1545 and 1 pNPGU were added to a final volume of 1.0 ml, and reacted at 65 ° C. for 8 hours.

反応液を95℃で５分間処理して反応を停止させ、１部
分を10倍に希釈してこれをショーデックス・イオンパッ
クKS−801カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（移動相、水；カラム温度、70℃；流速、1ml/min;検
出：、示差屈折計）で分析することにより反応液の糖組
成を決定した。The reaction solution was treated at 95 ° C. for 5 minutes to stop the reaction. One part was diluted 10-fold, and the resulting solution was subjected to high performance liquid chromatography using a Shodex Ionpack KS-801 column (mobile phase, water; column). Temperature, 70 ° C .; flow rate, 1 ml / min; detection: differential refractometer) to determine the sugar composition of the reaction solution.

この結果、いずれの起源のβ−ガラクトシル基転移酵
素を用いた場合でも、反応液には３〜７％の４糖以上の
オリゴ糖、18〜21％の３糖類、48〜52％の２糖類および
21〜26％の単糖類（いずれも全糖に対する重量％）が含
まれていた。As a result, no matter which β-galactosyltransferase was used, the reaction solution contained 3 to 7% of oligosaccharides of 4 or more saccharides, 18 to 21% of trisaccharides, and 48 to 52% of disaccharides. and
It contained 21-26% monosaccharides (all by weight relative to total sugars).

実施例 ８ サッカロポリスポラ・レクチヴィルグラ（Saccharopoly
spora rectivirgula）のβ−ガラクトシル基転移酵素を
利用した、ガラクトオリゴ糖を含有する乳糖分解乳の製
造： 牛乳（乳糖濃度4.8％、無脂乳固形分濃度8.3％）を60
℃に加温し、これにサッカロポリスポラ・レクチヴィル
グラから得たβ−ガラクトシル基転移酵素を乳糖1gあた
り16〜24LU添加し、４〜７時間反応させた。次いでショ
ーデックス・イオンパックKS801カラムを用いた高速液
体クロマトグラフィー（移動相、水；カラム温度、70
℃；流速、1.0ml/min;検出、示差屈折計）により、上記
処理後の牛乳中の糖組成を分析した。その結果は第５表
のとおりであった。なお、ガラクトシル基転移酵素のラ
クトース加水分解活性は、上記反応後もほぼ100％残存
していた。Example 8 Saccharopoly
Production of lactose-decomposed milk containing galacto-oligosaccharides using β-galactosyltransferase of S. spora rectivirgula): Milk (concentration of lactose 4.8%, non-fat milk solids concentration 8.3%) of 60%
The mixture was heated to ℃, and β-galactosyltransferase obtained from Saccharopolyspora lectivirgra was added thereto in an amount of 16 to 24 LU per 1 g of lactose, followed by reaction for 4 to 7 hours. Then, high performance liquid chromatography using a Shodex Ionpack KS801 column (mobile phase, water; column temperature, 70
° C; flow rate, 1.0 ml / min; detection, differential refractometer) to analyze the sugar composition in the milk after the above treatment. The results are as shown in Table 5. In addition, the lactose hydrolysis activity of the galactosyltransferase remained almost 100% after the above reaction.

実施例 ９ ガラクトオリゴ糖を含有する乳糖分解乳の製造におけ
る、サッカロポリスポラ・レクチヴィルグラから得たβ
−ガラクトシル基転移酵素の牛乳中での安定性をさらに
詳しく調べた。 Example 9 β from Saccharopolyspora lectivirgra in the production of lactose-decomposed milk containing galactooligosaccharides
-The stability of galactosyltransferase in milk was further investigated.

牛乳（乳糖濃度4.8％、無脂乳固形分濃度8.3％）を6
0、65、70℃の各温度に加温し、これにサッカロポリス
ポラ・レクチヴィルグラのβ−ガラクトシル基転移酵素
を牛乳1mlあたり24pNPGU添加し、反応を開始した。反応
中の酵素の残存活性を求めるため、反応開始後１、２、
４、８時間後に、反応液の一部（0.02ml）をサンプリン
グして1.0mlの牛乳に添加し、60℃で１時間反応させ、
その牛乳中の乳糖の減少速度を測定した。また、これと
同様の実験を、バシルス・サーキュランス（Bacillus c
irculans）のβ−ガラクトシダーゼ（ビオラクタ、大和
化成製）についても行ない、比較した。この結果を第６
表に示す。6 milk (4.8% lactose, 8.3% non-fat milk solids)
The mixture was heated to 0, 65, and 70 ° C., and β-galactosyltransferase of Saccharopolyspora lectivirgra was added thereto at 24 pNPGU per 1 ml of milk to start the reaction. After the start of the reaction, 1, 2,
After 4 or 8 hours, a part (0.02 ml) of the reaction solution was sampled, added to 1.0 ml of milk, and reacted at 60 ° C. for 1 hour.
The rate of reduction of lactose in the milk was measured. In addition, a similar experiment was performed with Bacillus circulans.
irculans) (violacta, manufactured by Daiwa Kasei) and compared. This result is the sixth
It is shown in the table.

実施例 10 耐熱性β−ガラクトシル基転移酵素を緩衝液Ａ、Ｂに
対して４℃で一晩透析した。また、耐熱性β−ガラクト
シル基転移酵素をエチレンジアミン四酢酸（EDTA,終濃
度、1mM）と４℃で１時間インキュベート後、緩衝液Ｃ
に対して４℃で一晩透析した。 Example 10 A thermostable β-galactosyltransferase was dialyzed against buffers A and B at 4 ° C. overnight. After incubating heat-stable β-galactosyltransferase with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, final concentration, 1 mM) at 4 ° C. for 1 hour, buffer C
Was dialyzed overnight at 4 ° C.

各透析内液を、60℃で５、10、30、60、120、240分間
加熱処理し、各時間ごとにその一定量をサンプリングし
た後、ただちに氷冷し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを基質として「酵素化学的性質
（９）」に記載した方法に基づき酵素の残存活性を測定
した。Each dialysis solution was heat-treated at 60 ° C. for 5, 10, 30, 60, 120, and 240 minutes, and a fixed amount was sampled at each time, immediately cooled with ice, and p-nitrophenyl-β-D −
Using galactopyranoside as a substrate, the residual activity of the enzyme was measured based on the method described in “Enzyme chemical properties (9)”.

なお、緩衝液Ｃは0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）であ
り、緩衝液Ａ、Ｂは20μM MnCl₂および20μM ZnCl₂をそ
れぞれ含む緩衝液Ｃである。Buffer C is a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.2), and buffers A and B are buffer C containing 20 μM MnCl ₂ and 20 μM ZnCl ₂ respectively.

得られた結果を第１図に示す。 The results obtained are shown in FIG.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、マンガンおよび亜鉛イオンが熱安定性に及ぼ
す作用を示す図面である。FIG. 1 is a drawing showing the effect of manganese and zinc ions on thermal stability.

フロントページの続き (72)発明者 中尾 正宏 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 柴野 裕次 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社基礎研究所内 (72)発明者 天知 輝夫 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社基礎研究所内 (56)参考文献 特開 平１−168234（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−94367（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continuing from the front page (72) Inventor Masahiro Nakao 1-1-1 Wakayamadai, Shimamoto-cho, Mishima-gun, Osaka Prefecture Inside the Basic Research Laboratory of Suntory Limited (72) Inventor Yuji Shibano 1-1-1-1 Wakayamadai, Shimamoto-cho, Mishima-gun, Osaka No. 1 Suntory Limited Basic Research Laboratory (72) Inventor Teruo Achichi 1-1-1 Wakayamadai, Shimamoto-cho, Mishima-gun, Osaka Prefecture Suntory Limited Basic Research Laboratory (56) References JP-A-1-168234 (JP, A) JP-A-58-94367 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】下記の理化学的性質をもつ新規β−ガラク
トシル基転移酵素。 作 用 転移反応： β−Ｄ−ガラクトピラノシドGal−X1モルと、ガラクト
シル基受容体Y1モルとから、あらたなβ−Ｄ−ガラクト
ピラノシドGal−Y1モルと、X1モルを生成する。ここ
で、Ｘ、Ｙはいずれも水以外の化合物で、糖あるいはア
グリコンである。 加水分解： １モルのβ−Ｄ−ガラクトピラノシドGal−Ｘを加水分
解し、１モルのＸと１モルのガラクトースを生成する。 基質特異性 ラクトースおよびｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラク
トピラノシドを加水分解するが、ｐ−ニトロフェニル−
α−Ｄ−ガラクトピラノシドは加水分解しない。 至適pH 5.0〜8.0 pH安定性 55℃,15分間の処理の場合、pH5以上８以下で安定。 熱安定性 0.01Mリン酸緩衝液（pH7.2）中、60℃、１時間のインキ
ュベート後でも80％以上の活性を有する。あるいは、少
なくとも1Mラクトースを含有する同上緩衝液中、65℃で
少なくとも24時間インキュベートした後も、80％以上の
活性を有する。1. A novel β-galactosyltransferase having the following physicochemical properties: Action Transfer reaction: From 1 mol of β-D-galactopyranoside Gal-X and 1 mol of galactosyl group acceptor Y, 1 mol of new β-D-galactopyranoside Gal-Y and 1 mol of X1 mol are produced. Here, both X and Y are compounds other than water, and are sugars or aglycones. Hydrolysis: One mole of β-D-galactopyranoside Gal-X is hydrolyzed to produce one mole of X and one mole of galactose. Substrate specificity Hydrolyzes lactose and p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, but not p-nitrophenyl-
α-D-galactopyranoside does not hydrolyze. Optimum pH 5.0 to 8.0 pH stability Stable at pH 5 to 8 when treated at 55 ° C for 15 minutes. Thermal stability It has an activity of 80% or more even after incubation at 60 ° C. for 1 hour in a 0.01 M phosphate buffer (pH 7.2). Alternatively, it has an activity of 80% or more even after incubation at 65 ° C for at least 24 hours in the same buffer containing at least 1 M lactose. 【請求項２】放線菌に属する微生物により産生される請
求項１項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素。2. The novel β-galactosyltransferase according to claim 1, which is produced by a microorganism belonging to actinomycetes. 【請求項３】放線菌に属する微生物がサッカロポリスポ
ラ（Saccharopolyspora）属、サーモモノスポラ（Therm
omonospora）属またはサーモアクチノマイセス（Thermo
actinomyces）属に属する微生物から選ばれたものであ
る請求項第２項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵
素。3. The microorganism belonging to actinomycete is Saccharopolyspora, Thermomonospora.
omonospora) or Thermoactinomyces (Thermo
The novel β-galactosyltransferase according to claim 2, which is selected from microorganisms belonging to the genus actinomyces. 【請求項４】放線菌に属し、請求項第１項記載の新規β
−ガラクトシル基転移酵素を産生する微生物を培養し、
該培養物よりβ−ガラクトシル基転移酵素酵素を分離、
取得することを特徴とする新規β−ガラクトシル基転移
酵素の製造法。4. The novel β according to claim 1, which belongs to actinomycetes.
Culturing a microorganism that produces galactosyltransferase,
Separating β-galactosyltransferase from the culture,
A method for producing a novel β-galactosyltransferase, which is obtained. 【請求項５】放線菌に属し、請求項第１項記載の新規β
−ガラクトシル基転移酵素を産生する微生物がサッカロ
ポリスポラ（Saccharopolyspora）属、サーモモノスポ
ラ（Thermomonospora）属またはサーモアクチノマイセ
ス（Thermoactinomyces）属に属する微生物である請求
項第５項記載の新規β−ガラクトシル基転移酵素の製造
法。5. The novel β according to claim 1, which belongs to actinomycetes.
The novel β- according to claim 5, wherein the microorganism producing galactosyltransferase is a microorganism belonging to the genus Saccharopolyspora, the genus Thermomonospora, or the genus Thermoactinomyces. A method for producing a galactosyltransferase. 【請求項６】請求項第１項記載の新規β−ガラクトシル
基転移酵素を用いることを特徴とする、次の一般式
（Ｉ） Gal−（Gal）ｎ−Ｘ （Ｉ） （式中、Galはガラクトース残基を、Ｘは糖類若しくは
配糖体を示し、ｎは０−４の整数である） で表されるオリゴ糖または糖修飾配糖体の製造法。6. The following general formula (I): Gal- (Gal) n-X (I) wherein the novel β-galactosyltransferase according to claim 1 is used. Is a galactose residue, X is a saccharide or a glycoside, and n is an integer of 0-4). 【請求項７】請求項第１項記載のβ−ガラクトシル基転
移酵素を獣乳に作用させ、原料乳中の乳糖の一部または
全部を一般式（II） Gal−（Gal）ｎ−Glc （II） （式中、Galはガラクトース残基を、Glcはグルコース残
基示し、ｎは１−４の整数である） で表されるガラクトオリゴ糖に変換することを特徴とす
るガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造方法。7. The β-galactosyltransferase according to claim 1 is allowed to act on animal milk, and part or all of lactose in the raw material milk is converted to Gal- (Gal) n-Glc ( II) wherein Gal represents a galactose residue, Glc represents a glucose residue, and n is an integer of 1-4. Production method.