DE3751338T2

DE3751338T2 - Verfahren zum verleihen bei pflanzen eines widerstands gegen krankheiten und pest sowie neue gene in pflanzen die hierfür kodieren.

Info

Publication number: DE3751338T2
Application number: DE3751338T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Derrick; Jesse Jaynes
Original assignee: Louisiana State University
Current assignee: Louisiana State University
Priority date: 1986-07-25
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1995-11-23
Anticipated expiration: 2007-07-24
Also published as: AU611859B2; DE3751338D1; AU7751487A; EP0330655B1; FI890362A0; EP0330655A1; WO1988000976A1; EP0590301A2; FI890362A; JPH02502513A; EP0590301A3; ATE123528T1; EP0330655A4; US5597946A

Description

Diese Erfindung betriff t ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen sowohl vor Krankheit als auch Schädlingen mittels Genmanipulation zum Einbau in die Pflanze von antagonistischen Mitteln oder Inhibitoren gegen die daraus resultierenden infektiösen oder schädigenden Erkrankungen. Noch spezifischer, Pflanzen unterliegen Erkrankungen, die allgemein als durch Viren, Bakterien oder Pilze verursachte Krankheiten bekannt sind. Darüber hinaus verursachen Schädlinge, wie zum Beispiel verschiedene Insektenarten, unaussprechlichen Schaden an Pflanzen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Einbau des Mittels in die Pflanze selbst bereit, mit dem genannte Erkrankungen angegangen werden können.
Die Entwicklung der Pflanzenbiologie begann in den frühen 40er Jahren, als Experimente durchgeführt wurden, um das biologische Prinzip zu ermitteln, das die Bildung von Kronengallen-Tumoren verursacht. Es wurde gezeigt, daß das Tumor-induzierende Prinzip ein Bakterienplasmid aus dem infektiösen Organismus Agrobacterium tumefaciens ist. Dieses Plasmid wurde biochemisch in außerordentlichem Detail durch Nutzung der derzeitig verfügbaren Techniken der rekombinanten DNA-Technologie charakterisiert. Der Wirkungsmechanismus für Infektionen bestand in der Entdeckung, daß das Bacterium seine Reaktion durch eigentliche Insertion eines kleinen Fragments des bakteriellen Plasmids in den Pflanzennukleus hervorruft, wo es inkorporiert wird und als ein Pflanzengen funktioniert. Diese Entdeckung öffnete die Tür zur Verwendung von Agrobacterium und seiner Plasmide als Vehikel, um Fremd-DNA zum Pflanzennukleus zu tragen. Es gibt jedoch Limitationen für die Applikation dieser Techniken, und zu ihnen zählen: (1) Empfindlichkeit gegen Infektionen mit dem Agrobacterium-Plasmid und (2) verfügbare Gewebekultur- Technologie für die Regeneration der transformierten Pflanzen. Diese Limitationen haben bedeutet, daß es bisher aufgrund der Unfähigkeit von Agrobacterium, Getreidepflanzen zu infizieren, keine Berichte über eine erfolgreiche Genmanipulation von Getreide gibt.
Die Pflanzengene, wie alle anderen Gene, sind ganz einfach Stränge von Nukleinsäurebasen. Die Funktion synthetischer Gene in der Pflanze kann darin bestehen, ein Genprodukt zu produzieren, welches seinen eigenen intrinsischen Wert besitzt oder ein Genzwischenprodukt zu bilden, wie zum Beispiel mRNA, die eine regulierende Rolle in der Pflanzenzelle spielt. Synthetische Gene sind am nützlichsten, wenn das technische Vermögen nicht vorhanden ist, Gene aus natürlichen Organismen zu isolieren und zu reinigen. Sowohl gereinigte als auch synthetische Gene können bei der Verleihung von Schutz für Pflanzen gegen Krankheit oder Schädlinge verwendet werden. Ein Beispiel der Verwendung synthetischer Gene zur Verleihung von Resistenz gegen Viren und Viroide in Pflanzen ergibt sich aus der Nutzung der Coevolution vieler Viren mit den Pflanzenwirten. Pflanzen und Tiere haben sich als sehr präzise und elegante Mechanismen entwickelt, welche die regulierte Expression ihrer Gene erlauben. Viren haben durch Coevolution die eukaryotische Zelle einer Pflanze durch Mimicking der allgemeinen Struktur der Pflanzengene ausgenutzt und nutzen sie weiterhin aus. Oft ist für die Pflanze das Endergebnis davon Krankheit. Während Pflanzen und Tiere Gefangene ihrer eigenen Evolution sind, so trifft dies auch auf Viren zu, da sie zur Synthese und Translation ihrer eigenen Gene in die Pflanze von der Genregulierung und -expression des Pflanzen- und Tiersystems abhängig sind. Ihre Abhängigkeit wird als der Schlüssel zur Kontrolle der Viruskrankheit erachtet. Es wurde vor kurzem ermittelt, daß Bakterien die Expression einiger Gene auf eine ziemlich neue Weise regulieren. Unter Bedingungen, bei denen die Zelle die Biosynthese eines bestimmten Proteins reprimieren würde, wird ein zusätzlicher Kontrollgrad ausgeübt. Diese neu entdeckte Art der Genkontrolle wird als "micRNA"-Kontrolle bezeichnet und bedeutet "mRNA- interfering complementary RNA" (mRNA-interferierende komplementäre RNA). Diese micRNA oder antisense-RNA ist zum 5'-Ende des Gens komplementär, und wenn sie gebildet wird, hat sie den letztendlichen Effekt, die Menge der messenger- RNA (mRNA) durch Annealing an sie zu reduzieren und sie folglich aus der normalen Proteinsynthese zu entfernen.
Viroide sind einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNA) aus wenigen hundert Nukleotiden. Sie sind die kleinsten bekannten selbstreplizierenden Strukturen und stellen die niedrigste Form des Lebens dar. Sie sind die Erreger für eine Anzahl von Pflanzenkrankheiten und rufen bei einer Reihe von Pflanzen, je nach der Feinstruktur des Viroids und der Empfindlichkeit des Pflanzen-Genotyps, milde bis letale Antworten hervor. Im Fall von Viroiden besteht die Logik darin, die Replikation des krankheitsverursachenden Moleküls zu hemmen. Viroide sind infektiöse Nukleinsäurestücke und besitzen keine Proteinkomponente wie Viren. Unter Verwendung einer für Viren ähnlichen Methodik haben wir die Möglichkeit, die Nukleinsäurereplikation (Transkription genannt) zu blockieren.
Viele Pflanzen enthalten Gene, die Virusresistenz verleihen, und in einigen Fällen ist die Resistenz auf ein einzelnes dominantes Gen zurückzuführen, während in anderen Fällen die Resistenz genetisch komplexer ist, das heißt, daß zur Verleihung von Resistenz mehrere Gene benötigt werden. Während es zur Zeit praktisch unmöglich ist, diese Resistenz-Gene zu identifizieren, isolieren und reinigen und die Chromosomen, welche diese Gene tragen, sogar nicht lokalisiert werden können, kann es durch Nutzung der in vivo gebildeten antisense-Fragmente doch möglich sein, durch Insertion eines einzelnen synthetischen Gens, das letztendlich eine zu spezifischen Regionen des viralen Genoms komplementäre RNA bilden und eine Rolle bei der Unterbrechung der Replikation oder Translation des Virus spielen würde, Virus- und Viroid-Resistenz zu erlangen. Dieses komplementäre oder antisense-Gen wurde für einen bestimmten viralen Erreger spezifisch sein. Mit einer Anzahl dieser antisense-Gene ausgestattete Pflanzen würden sie vor vielen verschiedenen Viruskrankheiten, wie zum Beispiel vor den bei einer Viruskrankheit einer Kartoffel beobachteten Symptomen schützen.
Im Gegensatz zur Verwendung eines oder mehrerer synthetischer Gene zum Schutz von Pflanzen gegen Viruskrankheiten, bedient man sich zum bakteriellen Schutz der bekannten Antwort eines Insektes auf eine Bakterieninfektion, um Resistenz gegen Bakterienkrankheiten zu verleihen. Die Puppen von Hyalophora (einem Seidenspinner-Typ) antworten auf Bakterieninfektion durch die Synthese von mRNA, die in der Bildung von circa 15 bis 20 neuen Proteinen kulminiert. Lysozym, das im Eiklar und in menschlichen Tränen gefundene antibakterielle Protein und zwei andere Klassen antibakterieller Peptide, die als Cecropine und Attacine bekannt sind, wurden aus diesen neu synthetisierten Proteinen gereinigt. Es wurde gezeigt, daß Lysozym bei der Einschränkung des Bakterienwachstums wirksam ist. Wenn Lysozym nach Beimpfung einer Agarplatte mit pflanzenpathogenen Bakterien in zwei Konzentrationen auf eine kleine Papierschale gegeben wurde, war die Lysozym-Hemmzone ganz eindeutig.
Diese Proteine besitzen eine ziemliche Breitspektrumaktivität, indem sie gegen viele verschiedene Bakterienarten wirksam sind. Folglich sind die Insekten als ein ziemlich erfolgreiches und neuartiges Mittel zur Bekämpfung von Bakterieninfektionen hervorgegangen. Obwohl ein traditioneller Immunologe der Ansicht sein würde, dar diesem System die Spezifität mangelt, besitzt das Insekt ein ziemlich potentes Arsenal aus mindestens drei verschiedenen Bakterienproteinen, die auf unterschiedliche Weise arbeiten können, um aktiv zu versuchen, den bakteriellen Erreger zu zerstören. Folglich sehen sich eindringende Bakterien einer ungeheuren Herausforderung gegenüber, welche sich nur schwer umgehen lassen wurde. Während ein bakterieller Erreger natürlich resistent gegen ein Toxin sein kann, ist es höchst unwahrscheinlich, dar er gegen alle drei Toxine resistent sein würde. Obwohl die Ermittlung des genauen Wirkungsmechanismus der Proteintoxine erforderlich ist, sind sie vollkommen Prokaryot-spezifisch und scheinen gegen eukaryotische Zellen benign zu sein. Science, Band 223, Seiten 496 - 498, Horsch et al, offenbart transgene Pflanzen, die ein selektierbares Markergen für Kanamycin-Resistenz enthalten. Dieser Literaturhinweis lehrt, daß Pflanzen mit einem Bakterien-Gen transformiert werden können und daß das transformierte Gen exprimiert werden kann.
Andererseits offenbart das EMBO Journal, Band 4, Nr. 8, Seiten 2119-2122, A. Engstram et al, die Existenz von Insekten-Polypeptid-Inhibitoren, welche von Cecropin-Motten als Antwort auf eine Bakterieninfektion sezerniert werden. Der Einbau der sich von der humoralen Antwort in Hyalophora herleitenden Proteine ist ein attraktives genetisches System zum Schutz von Pflanzen vor Bakterienkrankheiten, die einen signifikanten wirtschaftlichen Verlust verursachen. Als ein Beispiel, bei den Hauptkrankheiten der Kartoffel handelt es sich um durch Erwiria carotovora bzw. Pseudomonas solanacearum hervorgerufene bakterielle Weichfäule und bakterielles Welken. Diese Krankheiten sind hauptsächlich für die Einschränkung des Kartoffelwachstums in vielen Gebieten Asiens, Afrikas, Süd- und Mittelamerikas verantwortlich. Die Einführung von für diese antibakteriellen Proteine kodierenden Genen in Getreidepflanzen kann den Schutz von Pflanzen vor von Bakterien hervorgerufenen Krankheiten revolutionieren.
In einer Art, die der des Insekts, das antibakterielles Protein bildet, analog ist, wurde gefunden, daß einige Bakterien natürliche Quellen sind, die Gene enthalten, die für gegen Pilze wirksame Proteine kodieren. Die biochemische Analyse dieser Verbindungen und die letztendliche molekulare Charakterisierung von Genen, welche die Synthese dieser natürlichen Fungizide kodieren, könnten bei der Einschränkung des Umfangs und des Schweregrads von Pilzerkrankungen in Getreidepflanzen von großer Bedeutung sein. Es besteht die Ansicht, daß von 1845 bis 1860 die durch Phytophthora infestans oder dem falschen Mehltau hervorgerufene Pilzkrankheit der Kartoffel die irische Kartoffel-Hungersnot verursachte, in der eine Million Menschen durch Verhungern starben und 1,5 Millionen Menschen aufgrund der durch diesen Pilzschädling hervorgerufenen Dezimierung der Kartoffelernte nach Nordamerika auswanderten.
Die Kontrolle von Insektenschädlingen, die ungeheure Verluste von sich von Pflanzen herleitenden Nahrungsmitteln und Fasern verursachen, die direkt den Insekten zugeschrieben werden und als ein Vektor für die Infektion und Ausbreitung anderer Pflanzenerreger die Erhöhung der Toleranz einer Pflanze gegen Insektenschäden erfordert. Genannte erhöhte Toleranz wäre von signifikantem wirtschaftlichem Wert. Ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen vor Insektenschaden besteht in der Verwendung natürlicher Insektizide, wie zum Beispiel eines aus Bacillus thuringiensis isolierten Proteins, welches ein Kristall von hohem Molekulargewicht in den Bakterien bildet, das für die Larven einer Anzahl lepidopteraler Insekten toxisch ist. Es besteht jedoch die Ansicht, daß die Insekten innerhalb weniger Generationen eine Immunität gegen das Toxin entwickeln würden. Folglich werden andere Möglichkeiten in Betracht gezogen. Eine der vielversprechendsten ist die Verwendung eines Enzyms als ein natürliches Insektizid, das unter dem Namen Chitinase bekannt ist. Chitinase ist ein in Bakterien produziertes Enzym, und das Gen, welches dafür kodiert, wurde isoliert. Ein Insekten-Exoskelett und Eingeweide setzen sich aus Chitin zusammen, und es wurde gezeigt, daß jede Unterbrechung des Chitin-Integuments dazu führen wird, daß sich das Insekt eine Infektion aus der natürlichen Umwelt zuzieht, die nach einer sehr kurzen Zeitdauer zum Tode führt. Die Insertion des Enzym-kodierenden Genes für Chitinase in die Pflanze stellt in der Pflanze ein potentes Chitin-auflösendes Enzym bereit, welches das Ausmaß des durch Insekten angerichteten Schadens einschränkt und in zweiter Linie die Ausbreitung anderer Pflanzenkrankheiten begrenzt, die Insekten als einen Vektor verwenden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Schutz einer Pflanze vor einer Pflanzenkrankheit bereitgestellt, die folgendes umfaßt:
Einbau in das Genom der Pflanze von einem oder mehreren Insektengenen, die sich von Hyalophora herleiten, welche einen Polypeptidinhibitor (oder einen Precursor davon) kodieren, der aus der Gruppe ausgewahlt wird, die aus Lysozym, Attacin und Cecropin gegen genannte Pflanzenkrankheit dergestalt besteht, daß die Expression des genannten Insekten-Polypeptidinhibitors in genannter Pflanze dieser Pflanze Resistenz gegen genannte Pflanzenkrankheit verleiht.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt ein Verfahren zum Hemmen einer Pflanzenkrankheit bereit, die aus einer Virus-, Bakterien- und Pilzinfektion oder Insekteninfestation einer Pflanze ausgewählt wird, genanntes Verfahren, welches eine Expression in das Pflanzengenom von einem oder mehreren Genen umfaßt, welche für einen Polypeptidinhibitor oder Inhibitor-Precursor genannter Pflanzenkrankheit kodieren, welcher Inhibitor oder Precursor ein sich aus der humoralen Antwort auf eine Bakterieninfektion von Hyalophora herleitendes Protein ist, worin genannte Expression bevorzugt durch zufällige Ligation eines Plasmids durchgeführt wird, das genanntes für den Inhibitor oder Precursor kodierendes Gen enthält, Aufnahme des den Inhibitor enthaltenden Plasmids in Escherichia coli mit einem Hind-III-17-Fragment von darin inkorpierter T-DNA, Einführen in einen Agrobacterium-Stamm, der ein unmodifiziertes R1-Plasmid dergestalt trägt, daß die Kultivierung mit dem Pflanzengenom zu genannter T-DNA führt, welche die Passagier-DNA (synthetische DNA) enthält, die in das Pflanzengenom eingebaut wird und damit regeneriert werden kann, um einen Hemmeffekt auf die Krankheit zu haben.
Die Erfindung wird mittels eines spezifischen Beispiels nur mit Bezug auf die folgende ausführliche Beschreibung weiter beschrieben.
Das erfindungsgemäß vorgesehene Verfahren stellt einen Inhibitor für eine Anzahl unerwünschter Pflanzenerkrankungen bereit, einschließlich Bakterien-, Virus- und Pilzinfektionen und Insekten-Infestationen. Anfänglich wird das Verfahren zur Hemmung von Pflanzenkrankheiten, besonders durch Bakterieninfektionen verursachte Pflanzenkrankheiten betrachtet. Es ist bekannt, daß Bakterieninfektionen bei bestimmten Insekten eine antibakterielle Antwort hervorrufen. Wie vorstehend darauf hingewiesen wurde, synthetisieren Puppen von Hyalophora mRNA, die zur Bildung von 15 bis 20 neuen Proteinen führen, aus denen Lysozym, Cecropin und Attacin gereinigt wurden.
Das Lysozym-Gen und Protein wurden aus sich von Hyalophora herleitendem Plasmid pBR322 gewonnen, das durch Kleanthis xanthopoulos bereitgestellt wird. Das Lysozym-Gen wurde aus dem Plasmid pBR322 durch Digestion mit dem Enzym Pst I entfernt. Das sich ergebende Fragment wurde gereinigt und mit dem Bal-31-Enzym zur Entfernung des 3'-Poly-dG- Schwanzes gereinigt. Dann wurde der wie folgt gezeigte Adapter
nach Digestion mit Enzym Xmn I an das Fragment ligiert. Dann wird das Fragment mit Sal I digeriert und in das Plasmid pB322 kloniert. Das Lysozym-Gen wurde durch Digestion mit Enzym Bgl II gewonnen und in den Pflanzenvektor pMON237 eingefügt.
Das Lysozym-Gen, das für antibakterielle Proteine kodiert, wurde identifiziert und enthält die folgende Nukleotid- Sequenz:
Dieses Lysozym-Gen produziert ein begleitendes Protein oder Polypeptid, welches über die folgende Aminosäuresequenz verfügt:
Auf eine etwas ähnliche Weise wurden das Attacin-Gen und sein begleitendes Protein, das als ein Teil des Plasmids pBR322 aus Kleanthis xanthopoulos erhalten wurde, entfernt, mit geeigneten Start- und Stopp-Aminosäuren versehen und in einen Pflanzenvektor zum Einschluß in einen geeigneten Wirt zum Wachstum und Testen auf antibakterielle Eigenschaften in Pflanzenzellen eingefügt. Das Attacin-Gen wurde aus pBR322 durch Digestion mit dem Enzym Pst I anhand von herkömmlichen Verfahren entfernt. Das sich ergebende Plasmidfragment wurde gereinigt und mit FnuDII und Dra I digeriert. Das Adapter-Oligonukleotid
wurde durch Ligation an das Fragment angeheftet. Dann wurde das den Adapter enthaltende Fragment mit Sal I digeriert und in Plasmid pBR322 kloniert. Das Attacin-Gen in voller Länge wurde dann durch Digestion mit Bgl II aus pBR322 erhalten und in den Pflanzenvektor pMON237 eingefügt und hatte das Start-Methionin am Amino-Ende (N-Terminus). Der Pflanzenvektor pMON237, der das antibakterielle Attacin-Gen enthält, verleiht diese antibakterielle Eigenschaft an Pflanzen, die aus Pflanzenzellen mit dem pMON237 eingefügt gebildet werden.
Das Attacin-Gen, das für antibakterielles Protein kodiert, wurde identifiziert und enthält die folgende Nukleotidsequenz:
Dieses Attacin-Gen bildet ein begleitendes Protein oder Polypeptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Darüber hinaus und auf ähnliche Weise wurde das Cecropin- Gen produzierende antibakterielle Protein, das in Piasmid pBR322 erworben wurde, das aus Kleanthis xanthopoulos erhalten wurde, zur Erhaltung eines Plasmidfragments pCPFL1 zuerst mit Restriktionsenzymen Pst I und HinPII ausgeschnitten. Das sich ergebende 260-Basenpaar-Fragment wurde gereinigt und mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um den HinPII-Ort auszufüllen. Das sich ergebende Fragment wurde dann mit T4-DNA-Ligase behandelt und der synthetische Adapter C3, der wie folgt identifiziert ist,
wurde an das Fragment angeheftet. Das neue Genfragment wurde dann an pBR322 ligiert, das mit den Restriktionsenzymen XmnI und AatII gespalten wurde. Es wurden Klone gewählt, welche den korrekten Ampicillinsensitiven Genotyp enthalten, mit XmnI ausgeschnitten und mit einem synthetischen Adapter ligiert, der als C5 identifiziert wurde, welcher die folgende Nukleotidsequenz besitzt:
Das sich ergebende Fragment wurde mit E. coli retransformiert. Das Cecropin-Gen wird durch Digestion mit Bgl II aus E. coli gewonnen und in den Pflanzenvektor pMON237 eingefügt. Folglich wird das Cecropin-Gen ohne sein 'Leit'-Peptid (Leader-Peptid) und mit einem geeigneten Start-Methionin am Amino-Ende (N-Terminus) und dem korrekten Translationsterminations-Signal (Stopp-Signal) am Carboxy-Ende (C-Terminus) regeneriert.
Das Cecropin-Gen wurde identifiziert und besitzt die folgende Nukleotidsequenz:
Dieses Cecropin-Gen bildet ein begleitendes Protein oder Polypeptid mit einer antibakteriellen Aminosäuresequenz wie folgt:
Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys
Die Agrobacterium tumefaciens-Mikroben, welche die von Insekten gebildeten antibakteriellen Proteine enthalten, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren produziert wurden, erhielten die Bezeichnungen pAT-LYS, pAT-ATN und pAT-CN für die, welche Gene enthalten, die für Lysozym-, Attacin- bzw. Cecropin-Proteine kodieren. Diese neuen Mikroben sind zur Reproduktion und Aufrechterhaltung verfügbar und werden von dem Erfinder an der Louisiana State University, Baton Rouge, Louisiana, konserviert, bis zu der Zeit, wenn eine Hinterlegung bei einer kommerziellen Hinterlegungsstelle erforderlich ist, für den Fall, wenn der vorliegende Antrag zugelassen wird. Im Hinblick auf die vorliegenden Entdeckungen und Erfindungen ist ein anderes Merkmal dieser Erfindung eine Zusammensetzung, die ein Plasmid umfaßt, das in einer Mikrobe enthalten ist, welche eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das sich von der humoralen Antwort auf eine Bakterieninfektion von Hyalophora herleitet. Besonders die vorliegende Erfindung enthält eine Zusammensetzung, in welcher die Mikrobe Agrobacterium tumefaciens ist. Noch spezieller, die Zusammensetzung dieser Erfindung enthält eine solche Mikrobe, in welcher das Polypeptid aus Lysozym, Attacin, Cecropin und einem Gemisch davon ausgewählt wird.
Das Verfahren zur Hemmung von Pilzen umfaßt die Auswahl, das Klonieren und die Insertion von Genen, die für antifungale Verbindungen in einen geeigneten Pflanzenvektor kodieren. Bestimmte natürlich vorkommende Bakterien produzieren Toxine für Pilze. Genannte Bakterien halten ein Gen/Gene zurück, die für die Produktion dieser antifungalen Verbindungen kodieren. Die DNA, die von diesen, die antifungale Verbindung produzierenden Bakterien getrennt wird, wird isoliert, in einen Lambda-Vektor shot-gunkloniert und anschließend zur Transfektion von E. coli verwendet. Außerdem kann die gleiche DNA unter Verwendung der von Werneke et al, Gene 38 (1985), 73 - 84 beschriebenen Pseudomonas-Vektoren pWS3 und pWS6 direkt in Pseudomonas shot-gun-kloniert werden. Die sich ergebenden Transformanten werden ausplattiert und mit dem einzelligen Eukaryoten Rhodotorula als Indikator übersprüht. Dieses leistungsfähige Selektionswerkzeug lokalisiert die DNA (Gene), die für die antifungalen Toxinverbindungen kodiert und charakterisiert sie genügend, um durch geeignete Pflanzenvektoren in der zuvor beschriebenen Weise ihre Expression in eine Pflanze zu ermöglichen. Insertion der antifugalen Verbindungen als dafür kodierende Gene oder DNA stellt Pflanzenspezies mit antifugalen Eigenschaften bereit.
Im großen und ganzen wird auf die gleiche Weise eine Spezies, die ein Chitinase-Enzym bereitstellt, zur Identifikation, zum Klonieren, zur Insertion in einen Pflanzenvektor und zur Produktion einer Pflanze ausgewählt, die Chitinase-Enzym bildet. Es wurde festgestellt, daß bestimmte Spezies des Bakterien-Genus Vibrio ein sehr aktives Chitinase-Enzym bilden. Folglich stellt ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt durch Bereitstellung einer Chitinase-Enzym produzierenden Pflanze ein Verfahren zur Hemmung von Insekten-Infestation und Insektenschaden für Pflanzen bereit. Die DNA oder das Gen, die für die Produktion des Chitinase-Enzyms kodieren, können mittels Digestion durch das Restriktionsenzym Hind 111 aus der Vibrio-Bakterien-DNA ausgeschnitten werden. Eine DNA- Sequenz-Analyse kann zur Bestimmung der geeigneten Start- und Stopp-Positionen des Gens eingesetzt werden. Darüber hinaus ist zum Implantieren des gewünschten Gens in das Pflanzengenom Klonieren erforderlich, wie zuvor für die in Pflanzenvektoren eingefügten antibakteriellen Kodierungsgene beschrieben wurde.
Das Verfahren zum Hemmen von Viren und Viroiden schließt die Bereitstellung eines antisense oder komplementären Oligonukleotids ein, welches die Replikation des Virus oder Viroids hemmt oder verhindert oder welches die Translation des Virus hemmt. In-vitro-Verfahren, die sich ein 41-Basen- DNA-Oligonukleotid mit der Sequenz:
zunutze machen, blockieren wirkungsvoll 98% der Translation eines Virusgenoms. Dieses Verfahren wurde durch Hybridisierung der DNA an das Virus in einem Reaktionsgemisch von 8 ul durchgeführt, das 20 mM Hepes, pH 7,6, 0,1 M NaCl und 1 mM ETDA enthält. Die RNA- Konzentration des Virus betrug 0,5 mg/ml, und die DNA wurde in einem 5fach molaren Überschuß zugegeben. Im allgemeinen wurden die Reaktionsgemische 10 Minuten bei 70ºC erhitzt, woran sich eine Inkubation bei 45ºC für 3 Stunden anschloß. Der Vorgang zur Bestimmung der viralen RNA-Translation wird in einem zellfreien Proteinsyntheseschema, wie zum Beispiel in einem RNA-Kaninchen-Retikulozyten-Lysat-System, das von Shih et al in Proceedings of the National Academy of Science of the U.S.A., 75, 5807-5811 (1978) und im Journal of Virology, 30, 472-480 (1979) beschrieben wurde, die beide durch Bezugnahme, wie im vollen aufgezeigt, enthalten sind. Aufgrund der Hybridisierung wurde die virale Translation wirkungsvoll blockiert.
Im Falle von Viroiden wurde die Replikation im PSTV (Potato Spindle Tuber Viroid) durch Hybridisierung synthetischer DNA-Fragmente an die PSTV in der Mitte der konservierten Region verhindert, die bei allen bekannten Viroiden vorhanden zu sein scheint und von der angenommen wird, daß sie für die Replikation wichtig ist. Die synthetischen DNA- Fragmente verfügen über die Oligonukleotidsequenz und Identifikation wie folgt:
Diese Hybridisierung wurde durch Annealing der verschiedenen Oligonukleotidfraktionen an gereinigte, infektiöse PSTV-RNA durchgeführt. Das Probengemisch wurde 5 Minuten auf 90ºC erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Diese Gemische wurden dann in PSTV-empfindliche Tomatenpflanzen inokuliert und den Symptomen Gelegenheit gegeben, sich zu entwickeln. Die Ergebnisse sind der Tabelle unten zu entnehmen. Tabelle des Molverhältnisses von Zusammensetzungen, die in Tomatenpflanzen inokuliert wurden Inokulum Molverhältnis Infizierte Tomatenpflanzen (#infiziert/#inokuliert) allein * PSTVf ist eine DNA von PSTV in voller Länge.
Wenn Hybridisierung auftritt, wurde die weitere Replikation des PSTV-Moleküls blockiert.
Die synthetische DNA-Transkription-Blockierung für Viroide und die synthetische DNA-Translations-Blockierung für Viren werden in einen Pflanzenvektor eingefügt, um Pflanzen zu produzieren, die nicht empfindlich gegen die beschriebenen Viroide und Viren sind.

Claims

1. Verfahren zum Schutz einer Pflanze vor einer Pflanzenkrankheit, welches den Einbau in das Genom der Pflanze von einem oder mehreren sich von Hyalophora herleitenden Genen umfaßt, die einen Polypeptid-Inhibitor oder einen Precursor davon gegen eine Pflanzenkrankheit kodieren, bei welchem Polypeptid-Inhibitor es sich um einen handelt, der sich von der humoralen Antwort auf eine Bakterieninfektion von Hyalophora herleitet und aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lysozym, Attacin und Cecropin dergestalt besteht, daß die Expression des genannten Polypeptid-Inhibitors in genannter Pflanzenzelle der genannten Pflanzenzelle Resistenz gegen genannte Pflanzenkrankheit verleiht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das eine oder mehrere Gene aus Hyaloohora isoliert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das eine oder mehrere Gene synthetische Gene sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, in welchem genannte Pflanzenkrankheit eine Bakterien-, Virus- oder Pilzinfektion ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in welchem genannte Pflanzenkrankheit eine Bakterieninfektion ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, in welchem das genannte eine oder mehrere Gene das Polypeptid Cecropin kodieren.

7. Pflanzenzelle, die ein oder mehrere sich von Hvaloohora herleitende, exprimierbare Gene umfaßt, welche einen Polypeptid-Inhibitor oder einen Precursor davon gegen eine Pflanzenkrankheit kodieren, bei welchem Polypeptid- Inhibitor es sich um einen handelt, der sich von der humoralen Antwort auf eine Bakterieninfektion von Hyalophora herleitet und aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lysozym, Attacin und Cecropin besteht, dergestalt, daß die Expression des genannten Polypeptid-Inhibitors in genannter Pflanzenzelle genannter Pflanzenzelle Resistenz gegen genannte Pflanzenkrankheit verleiht.

8. Pflanzenzelle nach Anspruch 7, worin das eine oder mehrere exprimierbare Gene aus Hyalophora isoliert werden.

9. Pflanzenzelle nach Anspruch 7, worin das eine oder mehrere Gene synthetische Gene sind.

10. Agrobacterium-Vektor zum Transformieren einer Pflanzenzelle, worin genannter Vektor ein oder mehrere sich von Hyalophora herleitende Gene umfaßt, die einen Polypeptid-Inhibitor oder einen Precursor davon gegen eine Pflanzenkrankheit kodieren, bei welchem Polypeptid- Inhibitor es sich um einen handelt, der sich von der humoralen Antwort auf eine Bakterieninfektion von Hyalophora herleitet und aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lysozym, Attacin und Cecropin besteht.

11. Agrobacterium-Vektor nach Anspruch 10, worin das eine oder mehrere Gene aus Hyalophora isoliert werden.

12. Agrobacterium-Vektor nach Anspruch 10, worin das eine oder mehrere Gene synthetische Gene sind.