JPH06317587A - Antibody and its use - Google Patents
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- JPH06317587A JPH06317587A JP2118191A JP2118191A JPH06317587A JP H06317587 A JPH06317587 A JP H06317587A JP 2118191 A JP2118191 A JP 2118191A JP 2118191 A JP2118191 A JP 2118191A JP H06317587 A JPH06317587 A JP H06317587A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はヒト神経成長因子(ヒト
ＮＧＦ)蛋白質を免疫原として得られるポリクローナル
抗体およびその用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polyclonal antibody obtained by using a human nerve growth factor (human NGF) protein as an immunogen, and its use.
【０００２】[0002]
【従来の技術】神経成長因子(nerve growth factar,Ｎ
ＧＦ)はレヴィ モンタルチーニ(Levi-Monntalcini)[ア
ニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイエン
ス(Ann.N.Y. Acad. Sci.)５５，３３０(1952)]およびコ
ーエン(Cohen)ら[プロシージングス オブ ザ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー(P
roc. Natl. Acad. Sci. USA)４０，１０１４(1954)]に
よって発見され、末梢神経系の分化、成長および生存に
必須な栄養因子である。最近、ＮＧＦは中枢神経系にお
いて、コリン作動性ニューロンの生存を維持する作用を
有することが明らかにされており[ヘフティー(Hehti)，
ジャーナル オブ ニューロサイエンス(Journal of Ne
uroscience)６，２１５５(1986)；畠中(Hatanaka)等、
ディベロプメント オブ ブレイン リサーチ(Dev. Br
ain Res.)３９，８５(1988)]、アルツハイマー病と何ら
かの関連がある因子として注目されている。また、老齢
ラットの脳内にＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が
認められる［ネイチャー(Nature)，３２９，６５(198
9)］ことから、老人性痴ほうの治療薬としても期待され
ている。2. Description of the Related Art nerve growth factor (N)
GF is Levi-Monntalcini [Ann. NY Acad. Sci. 55 , 330 (1952)] and Cohen et al. [Procedures of the National Academy of Science USA]. P
Roc. Natl. Acad. Sci. USA) 40 , 1014 (1954)] and is an essential trophic factor for differentiation, growth and survival of the peripheral nervous system. Recently, NGF has been shown to have an action of maintaining survival of cholinergic neurons in the central nervous system [Hehti,
Journal of Neuroscience
uroscience) 6 , 2155 (1986); Hatanaka and others,
Development of Brain Research (Dev. Br
ain Res.) 39 , 85 (1988)], and has attracted attention as a factor that is associated with Alzheimer's disease. In addition, when NGF is administered into the brain of aged rats, improvement in memory impairment is observed [Nature, 329 , 65 (198).
9)] Therefore, it is expected as a therapeutic drug for senile dementia.
【０００３】雄マウス顎下腺より単離されたＮＧＦ(７
ＳＮＧＦ)は、α、β、γの３種のサブユニットからな
る複合体(α2βγ2)であり、そのうちのβサブユニット
にのみＮＧＦ活性が認められている。βサブユニット
(βＮＧＦ、２.５Ｓ ＮＧＦ)は１１８個のアミノ酸か
らなる同一のポリペプチドの２量体であり、そのアミノ
酸配列はアルゲレッティ(Argeletti)とブラッドショウ
(Bradshaw)[プロシージングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),６８，２４１７(1971)]によっ
て決定されている。NGF (7 isolated from the submandibular gland of a male mouse)
SNGF) is a complex (α 2 βγ 2 ) composed of three subunits of α, β and γ, and NGF activity is observed only in the β subunit. β subunit
(βNGF, 2.5S NGF) is a dimer of the same polypeptide consisting of 118 amino acids, the amino acid sequences of which are Argeletti and Bradshaw.
(Bradshaw) [Proc.s of the National Academy of Sciences USA (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA), 68 , 2417 (1971)].
【０００４】スコット(Scott)らはマウスβＮＧＦのア
ミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いて、マウス顎下腺cＤＮＡライブラリ
ーから、マウスβＮＧＦのクローニングに成功した[ネ
イチャー(Nature)，３０２，５３８(1983)]。さらにア
ルリッチ(Ullrich)らはマウスβＮＧＦ cＤＮＡをプロ
ーブとして用いて、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーか
らＮＧＦ遺伝子をクローニングし、その塩基配列から推
定したヒトＮＧＦのアミノ酸配列がマウスＮＧＦのそれ
と９０％の相同性を有することを示した[ネイチャー(Na
ture)，３０３，８２１(1983)]。Scott et al. Have succeeded in cloning mouse βNGF from a mouse submandibular gland cDNA library using an oligonucleotide synthesized on the basis of the amino acid sequence of mouse βNGF as a probe [Nature, 302]. , 538 (1983)]. Furthermore, Ullrich et al. Cloned the NGF gene from a library of human genomic DNA using mouse βNGF cDNA as a probe, and the amino acid sequence of human NGF deduced from its nucleotide sequence showed 90% homology with that of mouse NGF. Showed to have [Nature (Na
ture), 303 , 821 (1983)].
【０００５】[0005]
【発明が解決すべき課題】このようにヒトＮＧＦ遺伝子
はクローニングされているが、生体からヒトＮＧＦが検
出・単離された報告はほとんどない。ヒトＮＧＦが生体
から検出されない理由の１つとして、今まで主として抗
マウスＮＧＦ抗体を用いていたためと考えられる。Although the human NGF gene has been cloned as described above, there are few reports that human NGF was detected and isolated from a living body. It is considered that one of the reasons why human NGF is not detected in the living body is that anti-mouse NGF antibody has been mainly used until now.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＮＧ
Ｆを検出・定量する目的で、組換え型ヒトＮＧＦを免疫
原として抗体を得た。得られた該抗体を用いることによ
ってヒトＮＧＦを検出・定量することが可能であること
を見出し、さらに研究した結果、本発明を完成した。本
発明は、(１) 分子中に６個のシステイン残基を有し、
Ｎ末端から数えて第１番目のシステイン残基と第４番目
のシステイン残基とが、第２番目のシステイン残基と第
５番目のシステイン残基とが、第３番目のシステイン残
基と第６番目のシステイン残基とが、それぞれジスルフ
ィド結合している活性なヒト神経成長因子(ＮＧＦ)蛋白
質を免疫原として得られるポリクローナル抗体，および
(２) 上記(１)記載の抗体を用いることを特徴とするヒ
トＮＧＦ蛋白質の検出・定量法である。The present inventors have found that human NG
For the purpose of detecting and quantifying F, an antibody was obtained using recombinant human NGF as an immunogen. It was found that human NGF can be detected and quantified by using the obtained antibody, and as a result of further research, the present invention was completed. The present invention has (1) 6 cysteine residues in the molecule,
The first cysteine residue and the fourth cysteine residue counted from the N-terminal, the second cysteine residue and the fifth cysteine residue, the third cysteine residue and the third cysteine residue A polyclonal antibody obtained by using an active human nerve growth factor (NGF) protein in which the 6th cysteine residue is disulfide-bonded as an immunogen, and
(2) A method for detecting and quantifying human NGF protein, which comprises using the antibody according to (1) above.
【０００７】本発明におけるヒトＮＧＦ蛋白質として
は、ヒトＮＧＦおよびそのムテインが挙げられる。ヒト
ＮＧＦとしては胎盤由来の天然物由来のものや合成のも
の、遺伝子工学的手法により製造されたものが挙げられ
る。ヒトＮＧＦとしては、後述の参考例で得られた１２
０個のアミノ酸を有するものが好ましい。該ヒトＮＧＦ
蛋白質は、ヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を含む
ベクターで形質転換され、クローン化されている動物細
胞が産生したヒトＮＧＦ蛋白質であることが好ましい。
ヒトＮＧＦのムテインとしては、ジスルフィド結合して
いる分子中の６個のシステイン残基以外の、元のポリペ
プチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものが
挙げられる。該変異としては、アミノ酸の付加、構成ア
ミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。し
たがって、該ムテインは上記した分子中に６個のシステ
イン残基を有するものである。該アミノ酸の付加として
は、少なくとも１個のアミノ酸が付加しているものが挙
げられる。該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも
１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が欠損しているものが挙
げられる。該他のアミノ酸への置換としては、少なくと
も１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換
されているものが挙げられる。ヒトＮＧＦに少なくとも
１個のアミノ酸が付加しているムテインにおける少なく
とも１個のアミノ酸としては、ペプチドを発現する際に
用いられる開始コドンに基因するメチオニンや、シグナ
ルペプチドは含まれないものである。付加されているア
ミノ酸の数としては、少なくとも１個であるが、ヒトＮ
ＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。さらに好まし
くは、ヒトＮＧＦと相同性(ホモロジー)が認められてお
り、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配列の一部
あるいはすべてが挙げられる。ヒトＮＧＦの少なくとも
１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が欠損しているムテイン
における欠損している構成アミノ酸の数としては、ヒト
ＮＧＦの特徴を失なわない限り何個でもよい。該欠損型
ムテインにおけるアミノ酸の数は、４１個以上であるこ
とが好ましい。The human NGF protein in the present invention includes human NGF and its muteins. Examples of human NGF include natural products derived from placenta, synthetic products, and products produced by genetic engineering techniques. As human NGF, 12 obtained in the reference example described below was used.
Those with 0 amino acids are preferred. The human NGF
The protein is preferably a human NGF protein produced by a cloned animal cell transformed with a vector containing a gene encoding the human NGF protein.
Examples of human NGF muteins include those in which the amino acid sequence of the original polypeptide or protein other than the six cysteine residues in the disulfide-bonded molecule is mutated. Examples of the mutation include addition of amino acids, deletion of constituent amino acids, and substitution with other amino acids. Therefore, the mutein has 6 cysteine residues in the molecule. The addition of the amino acid includes an addition of at least one amino acid. Examples of the deletion of the constituent amino acids include those lacking at least one human NGF constituent amino acid. Examples of the substitution with the other amino acid include substitution of at least one human NGF-constituting amino acid with another amino acid. The at least one amino acid in the mutein in which at least one amino acid is added to human NGF does not include methionine due to the initiation codon used for expressing the peptide and the signal peptide. The number of added amino acids is at least 1, but human N
Any number may be used as long as the characteristics of GF are not lost. More preferably, a part of the amino acid sequence of a protein showing homology with human NGF and showing similar activity.
Or all. The number of missing constituent amino acids in the mutein lacking at least one human NGF constituent amino acid of human NGF may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. The number of amino acids in the defective mutein is preferably 41 or more.
【０００８】ヒトＮＧＦの少なくとも１個のヒトＮＧＦ
構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテイン
における置換される前の少なくとも１個のヒトＮＧＦ構
成アミノ酸の数としては、ヒトＮＧＦの特徴を失なわな
い限り何個でもよい。置換される前の構成アミノ酸の例
としては、システイン以外のものが挙げられる。置換さ
れる前の構成アミノ酸としてシステイン以外のものとし
ては、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、セリ
ン、バリンなどが挙げられる。置換された別のアミノ酸
としては、たとえば、アミノ酸の親水性、疎水性あるい
は電荷の点で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質
をもつものを選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸
がアスパラギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ
酸としてアスパラギン、スレオニン、バリン、フェニル
アラニン、アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパ
ラギン、アルギニンが好ましい。置換される前のアミノ
酸がアルギニンの場合には、置換されたあとのアミノ酸
としてグルタミン、スレオニン、ロイシン、フェニルア
ラニン、アスパラギン酸が挙げられるが、特にグルタミ
ンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がグリシン
である場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、
スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、グ
ルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニ
ンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がセリンで
ある場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、メ
チオニン、アラニン、ロイシン、システイン、グルタミ
ン、アルギニン、アスパラギン酸などが挙げられ、特に
メチオニンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸が
バリンである場合には、置換されたあとのアミノ酸とし
ては、セリン、ロイシン、プロリン、グリシン、リジ
ン、アスパラギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ま
しい。置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギ
ン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニ
ン、セリン、ロイシンが好ましい。上記の置換において
は、２以上の置換を同時に行なってもよい。該ムテイン
は、上記した付加、欠損、置換の２つまたは３つが組み
合わさったものでもよい。At least one human NGF of human NGF
The number of at least one human NGF constituent amino acid before substitution in the mutein in which a constituent amino acid is substituted with another amino acid may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. Examples of constituent amino acids before substitution include those other than cysteine. Examples of the constituent amino acids other than cysteine as the constituent amino acids before substitution include aspartic acid, arginine, glycine, serine, valine and the like. As the other substituted amino acid, for example, one having a property different from the amino acid before the substitution is selected in terms of hydrophilicity, hydrophobicity or charge of the amino acid. Specifically, when the amino acid before substitution is aspartic acid, examples of the amino acid after substitution include asparagine, threonine, valine, phenylalanine, and arginine, with asparagine and arginine being particularly preferable. When the amino acid before substitution is arginine, examples of the amino acid after substitution include glutamine, threonine, leucine, phenylalanine and aspartic acid, with glutamine being particularly preferred. When the constituent amino acid before substitution is glycine, the amino acid after substitution is,
Examples thereof include threonine, leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid, and arginine, with threonine being particularly preferable. When the constituent amino acid before substitution is serine, examples of the amino acid after substitution include methionine, alanine, leucine, cysteine, glutamine, arginine and aspartic acid, with methionine being particularly preferred. When the constituent amino acid before substitution is valine, examples of the amino acid after substitution include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred. As the amino acid after substitution, asparagine, glutamine, arginine, threonine, methionine, serine and leucine are preferable. In the above substitution, two or more substitutions may be performed simultaneously. The mutein may be a combination of two or three of the above additions, deletions and substitutions.
【０００９】該ムテインを製造するためには、特定部位
指向性変異誘発技術(Site-directedmutagenesis)が採用
される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサー
(Lather,R.F.)及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq,J.
P.)，ジェネティック・エンジニアリング(Genetic Engi
neering)、アカデミックプレス社(１９８３年)第３１〜
５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指示さ
れた変異誘発はエム・スミス(Smith,M.)及びエス・ギラ
ム( Gillam,S.)、ジェネティック・エンジニアリング：
原理と方法、プレナムプレス社(１９８１年)３巻、１〜
３２頁、に示されている。In order to produce the mutein, a site-directed mutagenesis technique is adopted. The technology is well known, and is F Racer.
(Lather, RF) and Jay P. Lecoq (Lecoq, J.
P.), Genetic Engineering (Genetic Engi
neering), Academic Press, Inc. (1983) No. 31-
See page 50. Oligonucleotide-directed mutagenesis is described by Smith, M. and Gillam, S., Genetic Engineering:
Principle and Method, Plenum Press Co. (1981) Volume 3, 1
See page 32.
【００１０】該ムテインをコードする構造遺伝子を製造
するためには、たとえば、 (a) ヒトＮＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種
形成させる(この１本鎖で代替すべきアミノ酸に対する
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアン
チセンス・トリプレットを包含する領域に対して上記プ
ライマーは相補的なものである。但し、当該コドンの他
のアミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセン
ス・トリプレットとの不一致はこの限りでない。) (b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)を形成させる、
及び (c) この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。このようにして得
られたプラスミドで適当な宿主を形質転換し、得られた
形質転換体を培地に培養することにより、ムテインを製
造することができる。In order to produce the structural gene encoding the mutein, for example, (a) a single chain D consisting of a single chain of the structural gene of human NGF
The NA hybridizes with the mutant oligonucleotide primer (the primer is complementary to the region containing the codon for the amino acid to be replaced by this single strand, or optionally the antisense triplet that pairs with this codon). (However, this does not apply to the disagreement between the codon for encoding the other amino acid or the antisense triplet in some cases.) (B) The primer is extended with DNA polymerase,
Form a mutant heterodimer,
And (c) replicate this mutant heterodimer. Next, a phage DN carrying the mutated gene
A is isolated and integrated into a plasmid. A mutein can be produced by transforming an appropriate host with the plasmid thus obtained and culturing the obtained transformant in a medium.
【００１１】本発明で用いられるヒトＮＧＦ蛋白質をコ
ードする遺伝子としては、例えばヒトゲノムライブラリ
ーからクローニングによって得られたもの、または化学
合成によって得られたものなどが挙げられる。ヒトＮＧ
Ｆ蛋白質をコードする遺伝子のクローニングは、例えば
ネイチャー(Nature)，３０３，８２１(１９８３)に記載
されている方法で行なうことが出来る。上記のようにし
て得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子は目的
によりそのまま、あるいは制限酵素で切断して使用する
ことができる。上記で得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子をプロモーターの下流に連結するが、この
場合ヒトＮＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの５′末端に
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、またはシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡとプロペプチドをコードす
るＤＮＡを連結させることが望ましい。シグナルペプチ
ドとしては、ヒトＮＧＦ蛋白質を分泌させることが可能
なものであれば何でも良く、具体例としては、ヒト、マ
ウス、ラット、ウシ、およびニワトリのＮＧＦのシグナ
ルペプチド、卵白リゾチームのシグナルペプチドおよび
その変異体、ヒトインターロイキシン−２のシグナルペ
プチドなどが挙げられる。また、プロペプチドとして
は、ヒト、ラット、マウス、ウシ、およびニワトリのＮ
ＧＦのプロペプチドなどが挙げられる。上記の方法の他
に、他の蛋白とヒトＮＧＦ蛋白質との融合蛋白として分
泌生産させたのち、適当なプロテアーゼで切断すること
によってヒトＮＧＦ蛋白質を得ることもできる。The gene encoding the human NGF protein used in the present invention includes, for example, those obtained by cloning from a human genome library, those obtained by chemical synthesis, and the like. Human NG
The gene encoding the F protein can be cloned by the method described in Nature, 303 , 821 (1983), for example. The gene encoding the human NGF protein obtained as described above can be used as it is or after being cleaved with a restriction enzyme depending on the purpose. The gene encoding the human NGF protein obtained above is ligated downstream of a promoter. In this case, the DNA encoding the signal peptide at the 5'end of the DNA encoding the human NGF protein, or the DNA encoding the signal peptide and a pro It is desirable to ligate the DNA encoding the peptide. Any signal peptide may be used as long as it can secrete human NGF protein, and specific examples thereof include human, mouse, rat, bovine, and chicken NGF signal peptides, egg white lysozyme signal peptides, and the like. Examples include mutants and human interleukin-2 signal peptides. Also, as the propeptide, human, rat, mouse, bovine, and chicken N
Examples include GF propeptide and the like. In addition to the above method, a human NGF protein can also be obtained by secreting and producing it as a fusion protein of another protein and human NGF protein and then cleaving it with an appropriate protease.
【００１２】上記のヒトＮＧＦ蛋白質をコードするＤＮ
Ａなどを用いて動物細胞用のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベク
ターを構築する。ヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターの構築
に用いるベクターとしては、例えばpＢＲ３２２および
その誘導体、ＳＶ４０系ベクター、ウシパピローマウイ
ルスベクター、レトロウイルスベクター、ＢＫウイルス
ベクターなどが挙げられる。そのほかにワクシニアウイ
ルス、ＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルスなどの動物
ウイルスをベクターとして用いることもできる。発現ベ
クターに用いるプロモーターとしては、動物細胞で機能
するものであればいずれでもよく、例えば、ＳＶ４０プ
ロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプ
ロモーターなどが挙げられる。発現ベクターには、以上
のほかに、エンハンサー、ＲＮＡスプライシングのシグ
ナル、ポリＡ付加のシグナル、選択マーカーなどを用い
る。発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例
えば、モレキュラー クロヘニング(Molecular Clonin
g)、ア ラボラトリー マニュアル、コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー(A Laboratory Mannul.
Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)に記載さ
れている。DN encoding the above human NGF protein
A or the like is used to construct a human NGF protein expression vector for animal cells. Examples of the vector used to construct the human NGF protein expression vector include pBR322 and its derivatives, SV40 system vector, bovine papilloma virus vector, retrovirus vector, BK virus vector and the like. In addition, animal viruses such as vaccinia virus, EB virus and herpes simplex virus can be used as a vector. The promoter used in the expression vector may be any promoter that functions in animal cells, and examples thereof include SV40 promoter, LTR promoter, and metallothionein promoter. In addition to the above, an enhancer, an RNA splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker and the like are used as the expression vector. The method itself for constructing an expression vector is known, and for example, molecular cloning can be performed.
g), Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (A Laboratory Mannul.
Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).
【００１３】このようにして作製したヒトＮＧＦ蛋白質
発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換する。動物細
胞としては、例えばサルVero細胞、チャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、
マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞などおよびリンパ球系細
胞、例えばマウスＳp２／０などが挙げられる。動物細
胞を形質転換する方法は公知であり、例えば、グラハム
(Graham)の方法[ウィロロジー( Virolory)，５２，４
５６(1973)]などが挙げられる。以上のようにしてヒト
ＮＧＦ発現ベクターで形質転換された動物細胞が得られ
る。Animal cells are transformed with the human NGF protein expression vector thus prepared. Examples of animal cells include monkey Vero cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, mouse C127 cells,
Examples include mouse BALB / 3T3 cells and lymphoid cells such as mouse Sp2 / 0. Methods for transforming animal cells are known, for example, Graham
(Graham) method [Virolory, 52 , 4
56 (1973)] and the like. Animal cells transformed with the human NGF expression vector are obtained as described above.
【００１４】上記のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターで形
質転換された動物細胞を用いてヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子
を安定に発現させる方法としては、ヒトＮＧＦ蛋白質発
現ベクターが導入細胞の染色体に組み込まれる方法と、
導入細胞においてヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターが染色
体に組み込まれることなく安定に存在させる方法があ
る。前者の場合には、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(Ｄ
ＨＦＲ)遺伝子などの増幅系［ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー(J.Mol.Biol.)１５９，６０１
(1982)］を利用してヒトＮＧＦ蛋白質の生産量を増大さ
せることができる。該形質転換された動物細胞は、クロ
ーン化されているものを用いるのが有利である。形質転
換された動物細胞(クローン)を選択する方法自体は公知
であり、例えば実験医学、臨時増刊号、Vol.５，No.１
１，１９８７(羊土社)に記載されている。具体的には、
ヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子と共に選択マーカー遺伝子を指
標にして形質転換株を選択する。この場合、選択マーカ
ーをヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子と同一ベクターに乗せて細
胞に導入しても良く、また選択マーカーをこれよりも多
量のヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子とともに同一のベクターに
導入せずに細胞に導入(co-transformation)しても良
い。これらの選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉
酸還元酵素(ＤＨＦＲ)［メソトレキセート(ＭＴＸ)耐
性］、チミジンキナーゼ、Ecogpt遺伝子(ミコフェノー
ル酸耐性)、neo遺伝子(Ｇ４１８耐性)などが挙げられ
る。さらに、このようにして選択マーカーを用いて得ら
れた形質転換株に対し、くり返しクローン選択を行うこ
とにより、遺伝子産物の高産生能を有する安定な細胞株
を得ることができる。As a method for stably expressing a human NGF protein gene using an animal cell transformed with the above human NGF protein expression vector, a method in which the human NGF protein expression vector is integrated into the chromosome of the introduced cell,
There is a method in which the human NGF protein expression vector is stably present in the introduced cells without being integrated into the chromosome. In the case of the former, for example, dihydrofolate reductase (D
HFR) Amplification system for genes [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.) 159 , 601]
(1982)] can be used to increase the amount of human NGF protein produced. Advantageously, the transformed animal cells are cloned. Methods for selecting transformed animal cells (clones) are known per se, for example, Experimental Medicine, Extra edition, Vol. 5, No. 1
1, 1987 (Yodosha). In particular,
A transformant strain is selected using the selection marker gene as an index together with the human NGF protein gene. In this case, the selectable marker may be placed on the same vector as the human NGF protein gene and introduced into the cell, or the selectable marker may be introduced into the cell together with a larger amount of the human NGF protein gene without introducing into the same vector ( co-transformation). Examples of these selection markers include dihydrofolate reductase (DHFR) [methotrexate (MTX) resistance], thymidine kinase, Ecogpt gene (mycophenolic acid resistance), neo gene (G418 resistance), and the like. Furthermore, by performing repeated clone selection on the transformant strain thus obtained using the selectable marker, a stable cell line having a high ability to produce a gene product can be obtained.
【００１５】このようにして得られた動物細胞を培養す
る際、培地としては、たとえば０.５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地［サイエンス(Science)，１２
２，５０１(1952)］、ＤＭＥＭ培地［ウィロロジー(Vir
ology)，８，３９６(1959)］、ＲＰＭＩ１６４０培地
［ジャーナル オブ アメリカン メディカル アソシ
エーション( J. Am. Med. Assoc.)，１９９，５１９(19
67)，１９９培地［プロシージングス オブ ソサイエ
ティ オブ エクスペリメント バイオロジカルメディ
シン (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ７３，１(195
0))］］などが挙げられる。pＨは約６〜８であるのが望
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing the animal cells thus obtained, the medium is, for example, MEM medium containing 0.5 to 20% fetal bovine serum [Science, 12
2 , 501 (1952)], DMEM medium [Virology (Virology
ology, 8 , 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of American Medical Association (J. Am. Med. Assoc.), 199 , 519 (19).
67), 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 , 1 (195
0))]] and the like. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added if necessary.
【００１６】本発明で用いられるヒトＮＧＦ蛋白質は細
胞内または細胞外に生成、蓄積する。細胞内ヒトＮＧＦ
蛋白質を培養物から抽出するに際しては、培養後公知の
方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや尿素などの蛋白変
性剤を含む緩衝液やトライトンＸ−１００などの界面活
性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分離
によりヒトＮＧＦ蛋白質を含む上澄液を得る方法、ある
いは超音波処理や凍結融解法によって細胞を破壊したの
ち、遠心分離によりヒトＮＧＦ蛋白質を含む上澄液を得
る方法などを適宜用い得る。これらの上澄液や細胞外に
生成、蓄積したヒトＮＧＦ蛋白質を分離、精製するには
自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて実施すれ
ばよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、
硫安沈澱および溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどの特異的親和性を利用する方法、例えば抗体カラ
ムおよび Ｃu2+カラムなどのメタルキレートカラム、逆
相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの疎水性
の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。このようにして、
活性体として、９０％(w/w)以上の純度のもの、さらに
好ましくは、９４％(w/w)以上の純度のものが得られ
る。該純度は、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、生物活性
から測定される。このように、ヒトＮＧＦ蛋白質の純度
９４％以上のものが好ましい。The human NGF protein used in the present invention is produced and accumulated intracellularly or extracellularly. Intracellular human NGF
When extracting proteins from the culture, the cells are collected by a known method after culturing, and the cells are placed in a buffer containing a protein denaturant such as guanidine hydrochloride or urea or a buffer containing a surfactant such as Triton X-100. Cell suspension, followed by centrifugation to obtain a supernatant containing human NGF protein, or sonication or freeze-thaw method to disrupt cells, and then centrifugation to obtain a supernatant containing human NGF protein. A method etc. can be used suitably. In order to separate and purify the human NGF protein produced and accumulated in the supernatant or extracellularly, a known combination and purification method per se may be appropriately combined. These known separation and purification methods include salting out,
Methods utilizing the difference in solubility such as ammonium sulfate precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, and methods utilizing mainly differences in molecular weight such as SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, etc. Methods that utilize differences in charge, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography, such as metal chelate columns such as antibody columns and Cu 2+ columns, hydrophobic phases such as reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC), etc. Examples thereof include a method using a difference and a method using a difference in isoelectric points such as an isoelectric focusing method. In this way
As the active substance, a substance having a purity of 90% (w / w) or more, and more preferably a substance having a purity of 94% (w / w) or more can be obtained. The purity is measured by HPLC, SDS-PAGE and biological activity. Thus, the human NGF protein having a purity of 94% or more is preferable.
【００１７】このようにして得られた本発明で用いられ
るヒトＮＧＦ蛋白質は活性体であり、分子中に６個のシ
ステイン残基を有し、Ｎ末端から数えて第１番目のシス
テイン残基と第４番目のシステイン残基とが、第２番目
のシステイン残基と第５番目のシステイン残基とが、第
３番目のシステイン残基と第６番目のシステイン残基と
が、それぞれジスルフィド結合しているものである。上
記のようにして得られるヒトＮＧＦ蛋白質は免疫学的方
法または生物活性に基づく方法で定量する。前者の例と
しては、バイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチコミュニケーション(Biochem. Biophys. Res.
Commun.)，１５５，４８２(1988)に記載されているエン
ザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)が挙げられる。後者の例
としては、ニワトリ胚脊椎後根神経節(細胞成長因子、
日本組織培養学会編、朝倉書店、１９８４年)、ラット
副腎髄質由来ＰＣ１２細胞［ブレイン リサーチ(Brain
Research)，１３３，３５０(1977)］などにおける神経
腺維の伸長、ラット中隔野コリン作動性ニューロンにお
けるコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導など
を指標とした生物活性測定法が挙げられる。The thus obtained human NGF protein used in the present invention is an active form, has 6 cysteine residues in the molecule, and has the first cysteine residue counted from the N-terminal. The 4th cysteine residue, the 2nd cysteine residue and the 5th cysteine residue, the 3rd cysteine residue and the 6th cysteine residue are respectively disulfide-bonded. It is what The human NGF protein obtained as described above is quantified by an immunological method or a method based on biological activity. Examples of the former are biochemical and biophysical.
Research Communication (Biochem. Biophys. Res.
Commun.), 155 , 482 (1988), and the enzyme immunoassay (EIA). Examples of the latter include chicken embryonic dorsal root ganglia (cell growth factor,
Japan Tissue Culture Society, Asakura Shoten, 1984), rat adrenal medulla-derived PC12 cells [Brain Research (Brain
Research), 133 , 350 (1977)] and the like, and the biological activity measurement method using as an index the elongation of nerve fibers and the induction of choline acetyltransferase activity in rat septal area cholinergic neurons.
【００１８】本発明のポリクローナル抗体を製造するた
めには、以上のようにして製造した免疫原を、温血動物
に接種することにより行なわれる。上記抗体の製造に用
いられる温血動物としては、例えば、哺乳温血動物
(例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラット、マウス、モルモ
ット、ウマ、ブタ)、鳥類(例、ニワトリ、ハト、アヒ
ル、ガチョウ、ウズラ)などが挙げられる。免疫原を、
温血動物に接種する方法としては、動物に接種する免疫
原は、抗体産生をするに有効な量でよく、例えば、ウサ
ギに１回１００μg〜１mgを２００μl〜１mlの生理食塩
水およびフロイントの完全アジュバントで乳化して、背
部ならびに後肢掌皮下に２〜４週間おきに５回〜７回接
種すると抗体を産生させる場合が多い。このようにし
て、温血動物中に形成された抗体を採取する方法として
は、例えばウサギでは、通常最終接種後７日から１２日
の間に耳静脈から採取し、遠心分離して血清として得ら
れる。得られた抗血清は、通常、抗原を保持させた担体
を用いるアフィティクロマトグラフィーで吸着した画分
を回収することによりポリクローナル抗体を精製するこ
とが出来る。The polyclonal antibody of the present invention is produced by inoculating a warm-blooded animal with the immunogen produced as described above. Examples of warm-blooded animals used for the production of the antibody include, for example, mammal warm-blooded animals.
(Eg, rabbit, sheep, cow, rat, mouse, guinea pig, horse, pig), birds (eg, chicken, pigeon, duck, goose, quail) and the like. Immunogen,
As a method for inoculating a warm-blooded animal, the immunogen to be inoculated to the animal may be an effective amount for producing antibodies. In many cases, the antibody is produced by emulsifying with an adjuvant and subcutaneously inoculating the back and palm of the hind limb 5 to 7 times every 2 to 4 weeks. In this way, as a method for collecting the antibody formed in the warm-blooded animal, for example, in the case of rabbit, it is usually collected from the ear vein between 7 and 12 days after the final inoculation and centrifuged to obtain serum. To be The obtained antiserum can be purified as a polyclonal antibody by collecting a fraction adsorbed by affinity chromatography using a carrier carrying an antigen.
【００１９】このようにして得られた抗体は、ヒトＮＧ
Ｆ蛋白質の免疫化学的測定法やWestern ブロッティング
における試薬として用いることができる。また、この抗
体は診断薬の材料としても利用できる。この抗体を用い
るヒトＮＧＦの検出・定量法は常法により行われるが、
酵素免疫測定法を行なうのが好ましい。該方法として
は、例えば担体上に保持された抗体、および担体上に保
持された抗体とは抗原決定部位を異にする抗体に標識剤
を結合させた結合物を用いてヒトＮＧＦ蛋白質を測定す
ることができる。The antibody thus obtained is human NG
It can be used as a reagent in immunochemical assay of F protein and Western blotting. This antibody can also be used as a material for diagnostic agents. The method for detecting and quantifying human NGF using this antibody is performed by a conventional method.
It is preferable to perform an enzyme immunoassay. As the method, for example, the human NGF protein is measured using an antibody retained on a carrier, and a conjugate in which a labeling agent is bound to an antibody having an antigenic determinant site different from that of the antibody retained on the carrier. be able to.
【００２０】ヒトＮＧＦ蛋白質の測定方法において用い
られる担体上に保持された抗体における担体としては、
例えば、ゲル粒子(例、アガロースゲル[例、セファロー
ス４Ｂ、セファロース６Ｂ(ファルマシア・ファインケ
ミカル社(スエーデン)製)]、デキストランゲル[例、セ
ファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セ
ファデックスＧ−２００(ファルマシア・ファインケミ
カル社(スエーデン)製)])、ポリアクリルアミドゲル
[例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイ
オゲルＰ−１００(バイオラッド・ラボラトリーズ社(米
国)製)]、セルロース粒子[例、アビセル(旭化成製)、イ
オン交換セルロース(例、ジエチルアミノエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース)]、物理的吸着剤
[例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッド、アミノアル
キルガラス球、アミノアルキルガラスロッド)、シリコ
ン片、スチレン系樹脂 (例、ポリスチレン球、ポリスチ
レン粒子)、イムノアッセイ用プレート(例、ヌンク社
(デンマーク)製)]、イオン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオ
ン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲＣ−５０(ローム
・アンド・ハース社(米国)製)、ゼオカーブ２２６(パー
ムチット社(西ドイツ)製)］、弱塩基性陰イオン交換樹
脂［例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダウエックス３
(ダウケミカル社(米国)製)］｝などが挙げられる。担体
に抗体を保持させるには、公知の常套手段を応用し得る
が、例えば、“代謝”、第８巻(1971年)、第６９６頁に
記載されているブロムシアン法、グルタールアルデヒド
法などが挙げられる。また、より簡便な方法として物理
的に担体表面に吸着させてもよい。The carrier in the antibody retained on the carrier used in the method for measuring human NGF protein is
For example, gel particles (eg, agarose gel [eg, Sepharose 4B, Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Sweden))], dextran gel [eg, Sephadex G-75, Sephadex G-100, Sephadex G- 200 (Pharmacia Fine Chemicals (Sweden))], Polyacrylamide gel
[Example, Biogel P-30, Biogel P-60, Biogel P-100 (manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA)]], cellulose particles [eg, Avicel (manufactured by Asahi Kasei), ion exchange cellulose (eg, diethylaminoethyl cellulose, Carboxymethyl cellulose)], physical adsorbent
[Examples: glass (eg, glass sphere, glass rod, aminoalkyl glass sphere, aminoalkyl glass rod), silicon piece, styrene resin (eg, polystyrene sphere, polystyrene particle), immunoassay plate (eg, Nunc
(Manufactured by (Denmark))], ion exchange resin (eg, weakly acidic cation exchange resin [eg, Amberlite IRC-50 (manufactured by Rohm and Haas Company (USA)), Zeocurve 226 (manufactured by Palm Chit Company (West Germany)) ], Weakly basic anion exchange resin [eg, Amberlite IR-4B, Dowex 3
(Manufactured by Dow Chemical Company (USA))] and the like. In order to retain the antibody on the carrier, known conventional methods can be applied. For example, the “Bromcyan method” and the glutaraldehyde method described in “Metabolism”, Volume 8 (1971), p. Can be mentioned. Further, as a simpler method, it may be physically adsorbed on the surface of the carrier.
【００２１】標識剤を結合させた抗体における標識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質な
どが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素と
しては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることが
できるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダ
ーゼとしては、種々の起源のものを用いることができる
が、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップ
ル、イチジク、甘薯、ソラマメ、トウモロコシなどから
得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさび
から抽出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ
(horseradish peroxidase)(ＨＲＰ)が好ましい。ペルオ
キシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子として
のＦab′のチオール基を利用するために、あらかじめペ
ルオキシダーゼにマレイミド基を導入したものを用いる
と好都合である。マレイミド基をペルオキシダーゼに導
入する方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基を介
してマレイミド基を導入することができる。そのために
はＮ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレート
誘導体を用いることができ、好ましくはＮ−(γ−マレ
イミドブチルオキシ)サクシイミド(ＧＭＢＳと略称する
こともある)などが良い。従って、マレイミド基とペル
オキシダーゼとの間に一定の基がはいっていることとな
ってもよい。ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させる
には、両者をpＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ない
し５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させるこ
とによって行われる。該緩衝液としては、たとえば、p
Ｈ７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、
たとえば、ゲルクロマトグラフィーなどにより精製する
ことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用
いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２
５［ファルマシア・ファインケミカル社(スエーデン)
製］、バイオゲルＰ−２［バイオラッド・ラボラトリー
ズ社(米国)製］などが挙げられる。The labeling agent in the antibody to which the labeling agent is bound may be a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like, but it is preferable to use an enzyme. As the enzyme, those which are stable and have a large specific activity are preferable, and peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase and the like can be used, but peroxidase is preferable. As the peroxidase, those of various origins can be used, and examples thereof include peroxidase obtained from horseradish, pineapple, fig, sweet potato, broad bean, corn, and the like, and horseradish particularly extracted from horseradish. Radish peroxidase
(horseradish peroxidase) (HRP) is preferred. In binding the peroxidase to the antibody, it is convenient to use peroxidase into which a maleimide group has been introduced in advance in order to utilize the thiol group of Fab ′ as an antibody molecule. As a method for introducing a maleimide group into peroxidase, a maleimide group can be introduced via an amino group of peroxidase. For that purpose, an N-succinimidyl-maleimide-carboxylate derivative can be used, preferably N- (γ-maleimidobutyloxy) succinimide (sometimes abbreviated as GMBS). Therefore, a certain group may be present between the maleimide group and peroxidase. The reaction of GMBS with peroxidase is carried out by reacting both in a buffer solution having a pH of about 6 to 8 at a temperature of about 10 to 50 ° C. for about 10 minutes to 24 hours. Examples of the buffer include p
Examples include H7.0 0.1M phosphate buffer. The maleimidated peroxidase thus obtained is
For example, it can be purified by gel chromatography or the like. Examples of the carrier used when performing the gel chromatography include Sephadex G-2.
5 [Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)
Manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA), and the like.
【００２２】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、例えば、pＨ６.０の５
mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１Ｍ
リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得られ
たペルオキシダーゼ標識抗体は、例えばゲルクロマトグ
ラフィーなどにより精製することができる。該ゲルクロ
マトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例
えば、セファデックスＧ−２５［ファルマシア・ファイ
ンケミカル社（スエーデン)製］、バイオゲルＰ−２
［バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製］などが挙
げられる。さらにペルオキシダーゼにチオール基を導入
し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良い。
ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるに
は、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことができ、
また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。The reaction between the maleimidated peroxidase and the antibody molecule can be carried out by reacting both in a buffer solution at a temperature of about 0 ° C. to 40 ° C. for about 1 to 48 hours. The buffer solution is, for example, 5 at pH 6.0.
0.1M containing mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt
Examples include phosphate buffer. The peroxidase-labeled antibody thus obtained can be purified by, for example, gel chromatography. Examples of the carrier used when performing the gel chromatography include Sephadex G-25 [Pharmacia Fine Chemical Co. (Sweden)], Biogel P-2.
[Made by Bio-Rad Laboratories (USA)] and the like. Further, a thiol group may be introduced into peroxidase and reacted with a maleimidated antibody molecule.
To directly bind an enzyme other than peroxidase to the antibody, it can be carried out according to the case of peroxidase,
Further, a glutaraldehyde method, a periodic acid method, a water-soluble carbodiimide method, etc. which are known per se are used.
【００２３】本発明の測定系における被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキシ
ダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に測定すべきヒトＮＧ
Ｆ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、
これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗ヒトＮＧＦ
蛋白質抗体との結合物を加えて反応させる。この本測定
系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等
の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液またはその
培養上清が挙げられる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＮＧＦ蛋白質の標
準溶液に対してあらかじめ行い、ヒトＮＧＦ蛋白質の吸
光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作成し
ておく。 ：未知量のヒトＮＧＦ蛋白質を含む分析対象物(被検
試料)について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準
曲線にあてはめ、分析対象物中のヒトＮＧＦ蛋白質の量
を測定する。 また、抗ヒトＮＧＦ蛋白質抗体はWestern ブロッティン
グ［W.N.Burnette, アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry), １１２，１９５(198
1)］によるヒトＮＧＦ蛋白質の検出・定量に利用するこ
とができる。Examples of test samples in the assay system of the present invention include body fluids such as urine, serum, plasma, and cerebrospinal fluid, or extracts of animal cells or fungi or culture supernatants thereof. As an example of the measuring method of the present invention, the case where the labeling agent is peroxidase will be specifically described below, but the present invention is not limited to peroxidase. First :: Human NG to be measured by the antibody retained on the carrier
After the F-containing analyte is added and an antigen-antibody reaction is performed,
The peroxidase and anti-human NGF obtained above were added to this.
A reaction product is added by adding a bound substance to the protein antibody. Examples of test samples in this measurement system include body fluids such as urine, serum, plasma, and cerebrospinal fluid, or extracts of animal cells or fungi or culture supernatants thereof. A substrate of peroxidase is added to the reaction product obtained in step (1), and the enzyme activity of the reaction product is determined by measuring the absorbance or fluorescence intensity of the resulting substance. : The above steps (1) to (3) are performed in advance on a standard solution of a known amount of human NGF protein, and the relationship with the absorbance or fluorescence intensity of human NGF protein is prepared as a standard curve. : The absorbance or fluorescence intensity obtained for an analyte (test sample) containing an unknown amount of human NGF protein is applied to a standard curve to measure the amount of human NGF protein in the analyte. In addition, anti-human NGF protein antibody was analyzed by Western blotting [WNBurnette, Analytical Biochemistry, 112 , 195 (198).
1)] to detect and quantify human NGF protein.
【００２４】以下にWestern ブロッティングの具体例を
示す。ヒトＮＧＦ蛋白質を含む試料を、例えばsample b
uffer［U.K.Laemmli, ネイチャー(Nature), ２２７，６
８０(1970)］に溶解する。この場合、還元剤として２−
メルカプトエタノールを加える場合(還元条件下)と加え
ない場合(非還元条件下)があり、そのいずれでもよい。
この溶液を約１００℃で５分間加熱したのち、電気泳動
にかける。電気泳動としては、蛋白質が分離できるもの
なら何でも良く、具体的には例えばＳＤＳを含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動などが挙げられる。泳動後の
ゲルから蛋白質をニトロセルロース膜に移す。この方法
自体は公知であり、例えば、Burnette の方法［アナリ
ティカル バイオケミストリー(Analytical Biochemist
ry), １１２，１９５(1981)］などが挙げられる。次に
ニトロセルロース膜のヒトＮＧＦを免疫学的方法で検出
する。即ち、ニトロセルロース膜を例えば３％ゼラチン
溶液でブロッキングしたのち、第１抗体反応を行う。第
１抗体として用いるヒトＮＧＦ蛋白質抗体としては抗血
清でも精製したものでも良いが、精製したものの方が好
ましい。ブロッキング後の第１抗体反応の条件として
は、該膜上のヒトＮＧＦ蛋白質が第１抗体と結合できる
条件であれば何でも良く、例えば室温で約４〜１６時間
で行う。上記の第１抗体反応ののち、第２抗体反応を行
う。用いる第２抗体としては、第１抗体と結合でき、か
つ検出が可能なものであれば何でも良く、例えば、標識
酵素と結合したＩgＧなどが挙げら れる。標識酵素の具
体例としては、ホースラディシュパーオキシダーゼ(Ｈ
ＲＰ)、アルカリファスファターゼなどが挙げられる。
第２抗体反応の条件としては第１抗体に第２抗体が結合
できる条件であれば何でも良く、例えば室温で約１時間
行う。上記の第２抗体反応ののち、発色を行い、ニトロ
セルロース膜上のヒトＮＧＦ蛋白質のバンドを検出す
る。上記のWestern ブロッティングでは、約５０ng以上
のヒトＮＧＦ蛋白質であれば検出が可能であり、種々の
量のヒトＮＧＦ蛋白質のバンドの濃さと、被検体のバン
ドの濃さを比較することにより、被検体中のヒトＮＧＦ
蛋白質を定量することもできる。A specific example of Western blotting is shown below. A sample containing human NGF protein is prepared, for example, from sample b
uffer [UKLaemmli, Nature, 227 , 6
80 (1970)]. In this case, 2-
There are cases where mercaptoethanol is added (reducing conditions) and cases where mercaptoethanol is not added (non-reducing conditions), and either of them may be used.
This solution is heated at about 100 ° C. for 5 minutes and then subjected to electrophoresis. Any electrophoresis can be used as long as it can separate proteins, and specific examples thereof include polyacrylamide gel electrophoresis including SDS. Transfer the protein from the gel after electrophoresis to a nitrocellulose membrane. This method is known per se, for example, the method of Burnette [Analytical Biochemist.
ry), 112 , 195 (1981)] and the like. Next, human NGF on the nitrocellulose membrane is detected by an immunological method. That is, after blocking the nitrocellulose membrane with, for example, a 3% gelatin solution, the first antibody reaction is performed. The human NGF protein antibody used as the first antibody may be antiserum or purified one, but the purified one is preferable. The conditions of the first antibody reaction after blocking may be any conditions as long as the human NGF protein on the membrane can bind to the first antibody, for example, at room temperature for about 4 to 16 hours. After the above-mentioned first antibody reaction, a second antibody reaction is carried out. The second antibody used may be any antibody that can bind to the first antibody and can be detected, and examples thereof include IgG bound to a labeling enzyme. Specific examples of the labeling enzyme include horseradish peroxidase (H
RP), alkaline phosphatase and the like.
The condition of the second antibody reaction may be any condition as long as the second antibody can bind to the first antibody, and for example, it is carried out at room temperature for about 1 hour. After the second antibody reaction described above, color is developed and the band of human NGF protein on the nitrocellulose membrane is detected. In the above Western blotting, it is possible to detect a human NGF protein of about 50 ng or more, and by comparing the band density of various amounts of human NGF protein with the band density of the test sample, Human NGF in
It is also possible to quantify the protein.
【００２５】なお、本発明明細書および図面において、
塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatur
e による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づ
くものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関
して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｃ ：シトニン Ｇ ：グアニン Ｔ ：チミン Ａ，Ａla ：アラニン Ｒ，Ａrg ：アルギニン Ｎ，Ａsn ：アスパラギン Ｄ，Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃ，Ｃys ：システイン Ｑ，Ｇln ：グルタミン Ｅ，Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇ，Ｇly ：グリシン Ｈ，Ｈis ：ヒスチジン Ｉ，Ｉle ：イソロイシン Ｌ，Ｌeu ：ロイシン Ｋ，Ｌys ：リジン Ｍ，Ｍet ：メチオニン Ｆ，Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐ，Ｐro ：プロリン Ｓ，Ｓer ：セリン Ｔ，Ｔhr ：スレオニン Ｗ，Ｔrp ：トリプトファン Ｙ，Ｔyr ：チロシン Ｖ，Ｖal ：バリン 後述の参考例６で得られた形質転換ハイブリドーマＣＨ
Ｏ−Ｄ３１−１０は平成１年１１月１５日から財団法人
発酵研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０２１７とし
て寄託されている。また該ハイブリドーマは平成１年１
２月７日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(ＦＲＩ)に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７４として寄
託されている。In the specification and drawings of the present invention,
When displaying abbreviations for bases and amino acids, IUPAC
-IUB Commission on Biochemical Nomenclatur
It is based on the abbreviations based on e or the abbreviations commonly used in this field, and examples are as follows. When amino acids may have optical isomers, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: Deoxyribonucleic acid A: Adenine C: Cytonin G: Guanine T: Thymine A, Ala: Alanine R, Arg: Arginine N, Asn: Asparagine D, Asp: Aspartic acid C, Cys: Cysteine Q, Gln: Glutamine E, Glu : Glutamic acid G, Gly: Glycine H, His: Histidine I, Ile: Isoleucine L, Leu: Leucine K, Lys: Lysine M, Met: Methionine F, Phe: Phenylalanine P, Pro: Proline S, Ser: Serine T, Thr: Threonine W, Trp: Tryptophan Y, Tyr: Tyrosine V, Val: Valine Transformed hybridoma CH obtained in Reference Example 6 described later
O-D31-10 has been deposited at the Fermentation Research Institute (IFO) with a deposit number IFO 50217 from November 15, 1991. In addition, the hybridoma
February 7, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Technology Microbial Industrial Technology Research Institute
(FRI) with deposit number FERM BP-2674.
【００２６】[0026]
【実施例】以下に、実施例、参考例を挙げて、本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
ることはない。 参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(1) ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー［クロンテック(Clontech)社］を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラーグをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド−Ｎ)上に移した後、０.
５Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、フ
ァージＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍ Ｔris−ＨＣl
(pＨ８.０)−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本
メンブランを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２
時間処理することによりＤＮＡをメンブランに固定し
た。一方、既知［ウルリッチ(Ullrich,A.)ら、ネイチャ
ー(Nature)３０３，８２１(1983)］のヒトＮＧＦ遺伝子
を参考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８
kb)を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッ
ポンジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブ
とした。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブ
を含む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣ
l，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt's,
０.５％ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ***ＤＮＡ溶液中
１０ml中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィ
ルターを２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で５
分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、６
０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させ
た後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応する
クローンを検索した。この方法により得られたクローン
λβＬＮ２１１３よりデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）らの方
法(Davisら、［アドバンスト・バクテリアル・ジェネテ
ィクス( Advanced Bacterial Genetics)］,Cold Spr
ing HarborLaboratory 1980)によりファージＤＮＡを抽
出した。次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断
し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出
し、プラスミドpＢluescriptIIＫ(トーヨーボーより購
入)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位を挿入し、プラスミドpＮＧＦ
Ｐ１０７Ｇを得た。挿入された部分の塩基配列をシーク
ナーゼ(トーヨーボー)を用いて決定した(図１〜３の連
続したもの)。決定された塩基配列はネイチャー(Natur
e)，３０３，８２１(1983)に記載されている配列と、蛋
白コード領域では完全に一致した。上記のファージλβ
ＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素ＢglIIで切断し、ヒトＮ
ＧＦを含むＤＮＡ断片(１.８kb)を単離した。一方、動
物細胞用の発現ベクターpＫＳＶ−１０(ファルマシア)
を制限酵素ＢglIIで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を
含むＤＮＡ断片(１.８kb)とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結
した。この反応液を用いてエシェリヒア コリ(Escheri
chia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、アンピシリン耐性
の形質転換体の１つ［エシェリヒア コリ(Escherichia
coli)ＤＨ１／pＭＮＧＦ１０１］から単離したプラス
ミドをpＭＮＧＦ１０１と命名した(図４)。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto. Reference Example 1 Construction of Human NGF Expression Vector (1) λEMBL3 genomic library prepared from human leukocyte DNA [Clontech] was used as Escherichia coli NM
After infecting 538, about 3 × 1 on a soft agar plate
0 4 clones were spread each. After transferring the prag onto a nylon membrane (Amersham, Hibond-N),
After immersing in 5N NaOH-1.5M NaCl solution for 6 minutes to denature the phage DNA, 0.5M Tris-HCl was added.
It was immersed in a (pH 8.0) -1.5 M NaCl solution for 6 minutes. Soak this membrane in 2 × SSC solution, air dry, and then 2 ℃.
The DNA was immobilized on the membrane by treating for a period of time. On the other hand, a DNA encoding human βNGF (0.38) with reference to the human NGF gene of known [Ullrich, A. et al., Nature 303 , 821 (1983)].
(kb) was chemically synthesized, and this was labeled with 32 P using a DNA labeling kit (Nippon Gene Co., Ltd.) as a probe. The DNA-immobilized filter was attached to a 6 × SSC (1 × SSC = 0.15M NaCl) containing a labeled probe.
l, 0.015M sodium citrate), 5 x Denhardt's,
The mixture was incubated in 10 ml of a 0.5% SDS, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA solution at 65 ° C. for 16 hours. After the reaction, the filter was placed in 2 × SSC, 0.1% SDS solution at room temperature for 5
6 times in 1 × SSC, 0.1% SDS solution 3 times each minute
It was washed at 0 ° C for 60 minutes. After the washed filter was dried, a radio-autogram was taken to search for a clone that reacts with the probe. From the clone λβLN2113 obtained by this method, the method of Davis et al. (Davis et al., [Advanced Bacterial Genetics]], Cold Spr
Phage DNA was extracted according to Ining Harbor Laboratory 1980). Next, λβLN2113 was cleaved with SmaI and ApaI, the DNA containing the human NGF gene (about 1 kb) was excised, the SmaI and ApaI sites of plasmid pBluescriptIIK (purchased from Toyo Bo) were inserted, and plasmid pNGF was inserted.
P107G was obtained. The nucleotide sequence of the inserted portion was determined using Sequenase (Toyo Bo) (continuous ones in FIGS. 1 to 3). The determined nucleotide sequence is
e), 303 , 821 (1983), and the protein coding region was completely in agreement. Phage λβ above
LN2113 DNA was cleaved with restriction enzyme BglII to give human N
A DNA fragment containing GF (1.8 kb) was isolated. On the other hand, the expression vector pKSV-10 for animal cells (Pharmacia)
Was cleaved with the restriction enzyme BglII and ligated with the above-mentioned human NGF gene-containing DNA fragment (1.8 kb) using T4 DNA ligase. Using this reaction mixture, Escherichia coli (Escheri
chia coli DH1 was transformed and one of the transformants resistant to ampicillin [Escherichia coli
coli) DH1 / pMNGF101] was named pMNGF101 (FIG. 4).
【００２７】 参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(2) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦ１０７Ｇを制限
酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を
含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb Ｂc
lＩ−ＡpaＩ断片と化学合成フダプターＳＮ１，ＳＮ２
およびＳＮ３(図５および６参照)とを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結したのち、ＢglIIで切断することによ
って０.８ kb ＨindIII−ＢglIIＤＮＡ断片が得られ
た。プラスミドpＳＶ２−ｇｐｔ［サイエンス(Scienc
e),２０９，１４２２(1980)］を制限酵素ＥcoＲＩとＨi
ndIIIで切断し、ＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb
ＥcoＲＩ−ＨindIIIＤＮＡ断片を単離した。次にプラス
ミドpＭＴＶdhfr［ネイ チャー(Nature),２９４，２２
８(1981)］より polyＡ付加領域を含む１.６kbＢglII−
ＥcoＲＩ断片を単離した。上記のＳＶ４０プロモーター
を含む２.６kb ＥcoＲＩ−ＨindIIIＤＮＡ断片、ヒト
ＮＧＦ遺伝子を含む０.８kb ＨindIII−ＢglIIＤＮＡ断
片およびpolyＡ付加領域を含む１.６kb ＢglII−ＥcoＲ
Ｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応液を
用いてエシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１の
形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体［エシ
ェリヒア コリ (Escherichia coli) ＤＨ１／pＭＮＧ
Ｆ２０１］から単離したプラスミドをpＭＮＧＦ２０１
と命名した。Reference Example 2 Construction of Human NGF Expression Vector (2) The plasmid pNGF107G obtained in Reference Example 1 was cleaved with restriction enzymes BclI and ApaI, and a DNA fragment (0.8 kb) containing the human NGF gene was isolated. . This 0.8 kb Bc
lI-ApaI fragment and chemically synthesized folds SN1 and SN2
And SN3 (see FIGS. 5 and 6) and mixed with T4DN
After ligation with A ligase, cleavage with BglII gave a 0.8 kb HindIII-BglII DNA fragment. Plasmid pSV2-gpt [Science (Scienc
e), 209 , 1422 (1980)] with restriction enzymes EcoRI and Hi.
2.6 kb containing SV40 promoter cleaved with ndIII
The EcoRI-HindIII DNA fragment was isolated. Then the plasmid pMTVdhfr [Nature, 294 , 22
8 (1981)], including the polyA addition region, 1.6 kb BglII-
The EcoRI fragment was isolated. 2.6 kb EcoRI-HindIII DNA fragment containing the above SV40 promoter, 0.8 kb HindIII-BglII DNA fragment containing the human NGF gene and 1.6 kb BglII-EcoR containing the polyA addition region.
The I fragment was ligated with T4 DNA ligase. Using this reaction mixture, Escherichia coli DH1 was transformed to obtain an ampicillin-resistant transformant [Escherichia coli DH1 / pMNG.
F201] to a plasmid isolated from pMNGF201
I named it.
【００２８】 参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(3) 参考例２で得られたプラスミドpＭＮＧＦ２０１をＨind
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ Ｋlenowフラグメン
ト反応により平滑化したのち、ＢglIIで切断して約０.
８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ３９
９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切断
後、Ｋlenowフラグメント反応により平滑化したのち、
ＢglIIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。これら
２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環状
化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。次に、ハムス
ターＤＨＦＲcＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８
(特開昭６１−６３２８２に記載)をＣlaＩで切断後アル
カリ性フォスファターゼで処理し、ＣlaＩで切断したp
ＴＢ１０５４より分離精製された２.４kb ＤＮＡ断片
(ＭnＬ ＶＬＴＲ、ヒトＮＧＦ(hＮＧＦ)遺伝子、および
ＳＶ４０ＤＮＡ由来スプライス 領域、ポリ［Ａ］付加
領域を含む)と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応によ
り ヒトＮＧＦ発現ベクターpＴＢ１０５８を構築した
(図７および８参照)。Reference Example 3 Construction of human NGF expression vector (3) Hind the plasmid pMNGF201 obtained in Reference Example 2
Cleavage with III and blunting with the DNA polymerase Klenow fragment reaction, followed by digestion with BglII to about 0.
An 8 kb DNA fragment was isolated. On the other hand, plasmid pTB39
9 (described in JP-A-61-13282) was cleaved with EcoRI and then blunted by Klenow fragment reaction.
Cleavage with BglII gave an approximately 3.9 kb DNA fragment. These two DNA fragments were circularized by T4 DNA ligase reaction to obtain plasmid pTB1054. Then the plasmid pTB348 containing the hamster DHFR cDNA.
(Described in JP-A-61-63282) was digested with ClaI, treated with alkaline phosphatase, and digested with ClaI.
2.4 kb DNA fragment separated and purified from TB1054
(Including MnL VLTR, human NGF (hNGF) gene, and SV40 DNA-derived splice region and poly [A] addition region) was mixed to construct human NGF expression vector pTB1058 by T4 DNA ligase reaction.
(See Figures 7 and 8).
【００２９】参考例４ ＣＨＯ細胞の形質転換 ファルコンシャーレ(直径６cm)に５％牛胎児血清を含む
ハム１２培地を入れ、ハムスターＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞
を３７℃で一晩培養した。培養後、この細胞(７×１０5
個／ディッシュ)を、実施例１で得られたヒトＮＧＦ発
現ベクターpＴＢ1058(１０μg)を用いてグラハムらの方
法［ヴィロロジー(Virology)５２：４５６−４６７(197
3)］に従って形質転換した。４時間３７℃で培養後、新
たな培地に代えて培養を続けた。２日後に、５％透析牛
胎児血清および３５μg／mlのプロリンを含むダルベッ
コ改変ＭＥＭ培地で液替えを行って、以後この選択培地
で培養を続けると約２〜３週間後に、ＤＨＦＲ+となっ
て増殖した細胞がコロニーを形成した。Reference Example 4 Transformation of CHO Cells Hamster 12 medium containing 5% fetal bovine serum was placed in a Falcon dish (diameter 6 cm), and hamster DHFR - CHO cells were cultured at 37 ° C. overnight. After culturing, the cells (7 × 10 5
Cells / dish) using the human NGF expression vector pTB1058 (10 μg) obtained in Example 1 by the method of Graham et al. [Virology 52 : 456-467 (197).
3)]. After culturing at 37 ° C. for 4 hours, the culture was continued by replacing with a new medium. Two days later, the liquid was changed with Dulbecco's modified MEM medium containing 5% dialyzed fetal bovine serum and 35 μg / ml proline, and when the culture was continued in this selective medium, DHFR + was obtained after about 2 to 3 weeks. Proliferated cells formed colonies.
【００３０】参考例５ 形質転換体のクローニングおよ
びヒトＮＧＦ遺伝子 の発現 参考例４で得た形質転換細胞のクローニングを、公知の
方法(例えばリミテッド ダイリューション法)に従って
行ない、形質転換体(クローン化されたもの)ＣＨＯ−Ｄ
５，ＣＨＯ−Ｄ４２およびＣＨＯ−Ｍ３６を得た。クロ
ーニング終了後は、各クローン細胞を、５％牛胎児血
清，３５μg／mlのプロリン，５０IU／mlペニシリンお
よび５０μg／mlストレプトマイシンを含むダルベッコ
改変ＭＥＭ培地にて培養した。分離された各クローンの
細胞はリンブロディッシュにまき、細胞が約８０％コン
フルエントになった時、新しい培地と交換して、７２時
間培養後、培養上清中のＮＧＦをＥＩＡ［ベーリンガー
社；バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.,１
５５，４８２(1988))］で定量した。ヒトＮＧＦ生産量
の高いクローンを表１に示す。なお、形質転換されてい
ないＣＨＯ細胞の培養上清にはＮＧＦは検出されなかっ
た。 以上の結果から、ヒトＮＧＦ遺伝子を恒久的に発現する
ＣＨＯ細胞は該遺伝子を一時的に発現するＣＯＳ細胞よ
りも多量のヒトＮＧＦを生産することができることが明
らかになった。Reference Example 5 Cloning and transformation of transformants
Expression of human and human NGF gene Cloning of the transformed cells obtained in Reference Example 4 was performed according to a known method (for example, limited dilution method) to obtain transformants (cloned) CHO-D.
5, CHO-D42 and CHO-M36 were obtained. After the completion of cloning, each clone cell was cultured in Dulbecco's modified MEM medium containing 5% fetal bovine serum, 35 μg / ml proline, 50 IU / ml penicillin and 50 μg / ml streptomycin. The cells of each isolated clone were spread on Lymbrodishes, and when the cells became about 80% confluent, the medium was replaced with a new medium, and after culturing for 72 hours, NGF in the culture supernatant was transferred to EIA [Boehringer; Chemical Biophysical Research Communication (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1
55 , 482 (1988))]. Table 1 shows clones with high human NGF production. NGF was not detected in the culture supernatant of untransformed CHO cells. From the above results, it was revealed that CHO cells that permanently express the human NGF gene can produce a larger amount of human NGF than COS cells that transiently express the gene.
【００３１】 参考例６ ヒトＮＧＦ高産生ＣＨＯ細胞株 実施例３と同様の方法で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｄ
３１を１０nＭメントレキセート(ＭＴＸ)を含むダルベ
ッコ改変ＭＥＭ(５％牛胎児血清３５μg/mlプロリンを
含む)にて培養した。このクローンは、この濃度のＭＴ
Ｘでは正常な増殖を示したので、ＭＴＸ濃度を１００n
Ｍに上げて継代し培養をつづけた。更に、ＭＴＸ濃度を
１μＭとすると大半の細胞が死滅したが、３〜４日に液
替を行って培養を続けると１０5個の細胞当り数個の細
胞がコロニー状に増殖をはじめた。 これらの細胞が十
分増殖したのち、１０μＭ ＭＴＸの培養液にて継代す
ると再び大半の細胞が死滅し、数個の細胞が、コロニー
状に増殖をはじめた。このようにして得られた細胞は１
０μＭ ＭＴＸ存在下に、安定した正常な増殖を示し、
又ＭＴＸを含まない培養液に戻して増殖させ数代継代し
たのち、１０μＭＭＴＸ存在下に培養しても正常に増殖
した。この１０μＭ ＭＴＸに耐性のＣＨＯ−Ｄ３１−
１０細胞(ＩＦＯ ５０２１７，ＦＥＲＭ ＢＰ−２６
７４)を参考例５と同じ条件で培養したところ、４mg／l
のヒトＮＧＦが培地中に生産されている ことがＥＩＡ
で分かった。Reference Example 6 Human NGF Highly Producing CHO Cell Line Transformant CHO-D obtained by the same method as in Example 3
31 was cultured in Dulbecco's modified MEM (containing 35 μg / ml proline of 5% fetal bovine serum) containing 10 nM mentholxate (MTX). This clone has this concentration of MT
X showed normal growth, so the MTX concentration was 100n.
It was raised to M and subcultured to continue culture. Furthermore, when the MTX concentration was 1 μM, most of the cells died, but when the liquid was changed on 3 to 4 days and the culture was continued, several cells started growing in colony form per 10 5 cells. After these cells proliferated sufficiently, when subcultured in a culture medium of 10 μM MTX, most of the cells died again, and a few cells began to grow in a colony. The cells thus obtained are 1
Shows stable normal growth in the presence of 0 μM MTX,
Further, after returning to a culture solution containing no MTX and proliferating it for several passages, it was proliferated normally even when cultured in the presence of 10 μM MTX. CHO-D31- resistant to this 10 μM MTX
10 cells (IFO 50217, FERM BP-26
No. 74) was cultured under the same conditions as in Reference Example 4 to give 4 mg / l.
Of human NGF in EIA
I understand.
【００３２】参考例７ ヒトＮＧＦの単離 参考例６で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を５％
牛胎児血清，３５μg／mlプロリン，５０IU／mlペニシ
リン，５０μg／mlストレプトマイシンおよび１０μＭ
メソトレキセートを含むダルベッコ改変培地で５％炭酸
ガス中で、３０℃、７日間大量に培養したところ、培地
中に２.４mg／lのヒトＮＧＦが生産されていることがＥ
ＩＡで分かった。培養液を遠心分離し、その培養上清
２.２lにＡＰＭＳＦを最終濃度０.１mＭになるように添
加し、０.２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正したのち遠心分離
した。得られた上清を０.１Ｍリン酸緩衝液 pＨ６.０−
１mＭ ＥＤＴＡで平衡化させたＳ- Sepharose カラム
(２.６cm×１４cm)に吸着させ、０.１Ｍリン酸緩衝液p
Ｈ６.０−０.１５Ｍ ＮaＣl−１mＭ ＥＤＴＡ−１０％
グリセロールで洗浄したのち、５０mＭ Ｔris−ＨＣl
pＨ７.５−０.７Ｍ ＮaＣl−１mＭ ＥＤＴＡ−１０
％グリセロールで溶出した。ヒトＮＧＦを含むフラクシ
ョンを集め、ダイアフローセル(タイプＹＭ１０，アミ
コン社)で約３０倍に濃縮した。得られた濃縮液を２０m
Ｍ Ｔris−ＨＣl pＨ７.４−０.５Ｍ ＮaＣl−１mＭ
ＥＤＴＡ−１０％グリセロールで平衡化させたSephac
ryl Ｓ−１００ＨＲ(２００ml，１.６cm×１００cm)で
ゲルろ過した。ヒトＮＧＦを含むフラクションを集めセ
ントリプレップ１０(アミコン社)で約１０倍に濃縮し
た。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦ
を精製した。すなわち、該濃縮液を Asahipak ＯＤＰ−
５０(１０.０mmID×２５０mmL)カラムにかけ、０.１％
トリフルオロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリルの濃
度勾配にかけ、ヒトＮＧＦの精製標品１.２mg(アミノ酸
分析より)を得た。本精製の要約を表２に示す。ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および逆相ＨＰＬＣ
の結果、得られた組換え型ヒトＮＧＦの純度は９４％で
あった。Reference Example 7 Isolation of human NGF 5% of the cell line CHO-D31-10 obtained in Reference Example 6 was used.
Fetal bovine serum, 35 μg / ml proline, 50 IU / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin and 10 μM
When cultured in Dulbecco's modified medium containing methotrexate in 5% carbon dioxide at 30 ° C. for 7 days in a large amount, 2.4 mg / l of human NGF was produced in the medium.
I found it in IA. The culture solution was centrifuged, and to 2.2 l of the culture supernatant, APMSF was added to a final concentration of 0.1 mM, pH was adjusted to 6.0 with 0.2N acetic acid, and then centrifuged. The resulting supernatant is used as a 0.1 M phosphate buffer solution pH 6.0-.
S-Sepharose column equilibrated with 1 mM EDTA
Adsorbed to (2.6 cm x 14 cm), 0.1M phosphate buffer p
H6.0-0.15M NaCl-1 mM EDTA-10%
After washing with glycerol, 50 mM Tris-HCl
pH 7.5-0.7M NaCl-1 mM EDTA-10
Eluted with% glycerol. Fractions containing human NGF were collected and concentrated about 30 times with a diaflow cell (type YM10, Amicon). 20m of the obtained concentrate
M Tris-HCl pH 7.4-0.5M NaCl-1 mM
Sephac equilibrated with EDTA-10% glycerol
Gel filtration was carried out with ryl S-100HR (200 ml, 1.6 cm x 100 cm). Fractions containing human NGF were collected and concentrated about 10 times with Centriprep 10 (Amicon). The obtained concentrate was subjected to reverse phase HPLC to obtain human NGF.
Was purified. That is, the concentrated solution was added to Asahipak ODP-
50% (10.0mm ID x 250mmL) column, 0.1%
By subjecting to a concentration gradient of 0-90% acetonitrile containing trifluoroacetic acid, 1.2 mg (from amino acid analysis) of a purified sample of human NGF was obtained. A summary of this purification is shown in Table 2. SDS
-Polyacrylamide gel electrophoresis and reverse phase HPLC
As a result, the purity of the obtained recombinant human NGF was 94%.
【００３３】 表２ 組換え型ヒトＮＧＦの精製の要約 ──────────────────────────── 液量 全蛋白 全ヒトＮＧＦ 収率 (ml) (mg) (mg) (％) ──────────────────────────── 培養上清 2,200 11,000 5.3 100 S-Sepharose 4.5 24 5.0 94 Sephacryl S-100 2.5 3.7 4.7 89 逆相ＨＰＬＣ 1.3 1.6 30 ──────────────────────────── こうして得られた精製標品を１６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、銀染色を行ったところ、１３キロ
ダルトン(kDa)の単一なバンドが認められた。得られた
精製ヒトＮＧＦをガラス製加水分解用試験管にとり減圧
下で乾燥後、４％チオグチコール酸を含む５.７Ｎ塩酸
を加えて減圧下に封管したのち、１１０℃，２４時間加
水分解した。加水分解後、塩酸を除去し、残渣を０.０
２Ｎ塩酸に溶解してアミノ酸分析を実施した。その結果
を表３に示す。Table 2 Summary of purification of recombinant human NGF ──────────────────────────── Liquid volume Total protein Total human NGF yield Rate (ml) (mg) (mg) (%) ──────────────────────────── Culture supernatant 2,200 11,000 5.3 100 S- Sepharose 4.5 24 5.0 94 Sephacryl S-100 2.5 3.7 4.7 89 Reversed phase HPLC 1.3 1.6 30 ──────────────────────────── When the purified sample was subjected to 16% polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining was performed, a single band of 13 kilodalton (kDa) was observed. The obtained purified human NGF was placed in a glass hydrolysis test tube, dried under reduced pressure, added with 5.7 N hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid, sealed under reduced pressure, and then hydrolyzed at 110 ° C. for 24 hours. . After hydrolysis, hydrochloric acid was removed and the residue was adjusted to 0.0
Amino acid analysis was carried out by dissolving in 2N hydrochloric acid. The results are shown in Table 3.
【００３４】 表３ アミノ酸組成 ───────────────────────── アミノ酸 実験値 1) 理論値 2) ───────────────────────── Ａsp＋Ａsn １３.０ １３ Ｔhr ９.７ １０ Ｓer ９.２ １１ Ｇlu＋Ｇln ６.６ ６ Ｐro ２.９ ３ Ｇly ７.３ ７ Ａla ６.９ ７ Ｖal １２.８ １３ Ｍet ２.１ ２ Ｉle ６.１ ６ Ｌeu ３.２ ３ Ｔyr ２.３ ２ Ｐhe ７.３ ７ Ｌys ９.１ ９ Ｈis ３.９ ４ Ａrg ７.３ ８ Ｔrp ３.０ ３ 合 計 １２０ ───────────────────────── 1) Ａsp＋Ａsnを１３として計算した。 2) ヒトＮＧＦ遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸
配列から計算した。 なお、Ullrich らはマウスβＮＧＦとの比較から、ヒト
ＮＧＦが１１８個のアミノ酸からなると推定している
［ネイチャー(Nature),３０３巻，８２１頁(1983
年)］。精製ヒトＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列を気相プ
ロテインシーケンサー(アプライドバイオシステム社モ
デル４７０Ａ)を用いて決定した。その結果を表４に示
す。Table 3 Amino acid composition ───────────────────────── Amino acid experimental value 1) Theoretical value 2) ────────── ───────────────── Asp + Asn 13.0 13 Thr 9.7 10 Ser 9.2 11 Glu + Gln 6.6 6 Pro Pro 2.9 3 Gly 7.3 7 Ala 6.9 7 Val 12.8 13 Met 2.1 2 Ile 6.1 6 Leu 3.2 3 Tyr 2.3 2 Phe 7.3 7 Lys 9.1 9 His 3.9 4 Arg 7.3 8 Trp 3.0 3 Total 120 ───────────────────────── 1) Asp + Asn was calculated as 13. 2) Calculated from the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of human NGF gene. Ullrich et al. Have estimated that human NGF consists of 118 amino acids by comparison with mouse βNGF [Nature, 303, 821 (1983).
Year)]. The N-terminal amino acid sequence of purified human NGF was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems model 470A). The results are shown in Table 4.
【００３５】 表４ Ｎ末端アミノ酸配列 ─────────────────────────── ＰＴＨ−アミノ酸 ＤＮＡより推定さ サイクル Residue p mole れるアミノ酸配列 ─────────────────────────── １ Ｓer ６０５ Ｓer ２ Ｓer ４９５ Ｓer ３ Ｓer ３８４ Ｓer ４ Ｈis ７８５ Ｈis ５ Ｐro ７０５ Ｐro ６ Ｉle ７６７ Ｉle ７ Ｐhe ８２９ Ｐhe ８ Ｈis ３４１ Ｈis ９ Ａrg ７００ Ａrg １０ Ｇly ４２５ Ｇly １１ Ｇlu ４７８ Ｇlu １２ Ｐhe ５１７ Ｐhe １３ Ｓer ９７ Ｓer １４ Ｖal ４６７ Ｖal １５ − Ｃys １６ Ａsp ２９７ Ａsp １７ Ｓer ５８ Ｓer １８ Ｖal ３９２ Ｖal １９ Ｓer ７３ Ｓer ２０ Ｖal ４７６ Ｖal ２１ Ｔrp ９５ Ｔrp ２２ − Ｖal ２３ Ｇly １６６ Ｇly ２４ Ａsp １７９ Ａsp ２５ Ｌys ２４５ Ｌys ２６ Ｔhr ７４ Ｔhr ２７ Ｔhr １０２ Ｔhr ２８ Ａla １７９ Ａla ─────────────────────────── 精製ヒトＮＧＦ２.９n moleを分析に用いた。Table 4 N-terminal amino acid sequence ─────────────────────────── PTH-Amino acid Sequence deduced from amino acid ─────────────────────────── 1 Ser 605 Ser 2 Ser 495 Ser 3 Ser 384 Ser 4 His 785 His 5 Pro 705 Pro 6 Ile 767 Ile 7 Phe 829 Phe 8 His 341 His 9 Arg 700 Arg 10 Gly 425 Gly 11 Glu 478 Glu 12 Phe 517 Phe 13 Ser 97 Ser 58 Ser 97 Ser 14 Ser 14 Ser 97 Asp 17 Ser 18 Sr 2 Ser 17 Asp 17 Ser 2 Ser 17 Asp 17 Ser 18 Ser 2 Asp 2 73 Ser 20 Val 476 Val 21 Trp 95 Trp 22-Val 23 Gly 166 Gly 24 Asp 179 Asp 25 Lys 245 Lys 26 Thr 7 The Thr 27 Thr 102 Thr 28 Ala 179 Ala ─────────────────────────── purified human NGF2.9N mole was used for the analysis.
【００３６】ヒドラジン分解［Natita ら、ジャーナル
オブ バイオケミストリー(J. Biochem.),５９，１７
０(1966)］で調べた精製ヒトＮＧＦのＣ末端アミノ酸は
アラニンであった。ＰＡＧ等電点電気泳動法(新版電気
泳動実験法、電気泳動学会編、文光堂、1989年)で調べ
た結果、得られたヒトＮＧＦの等電点はpＨ９−１０で
あり、マウスＮＧＦ( Collaborative Research Incor
porated )のそれとほぼ同じであった。ブレイン リサ
ーチ(Brain Research),１３３，３５０(1977)，エクス
ペリメンタル セル リサーチ(Experimental Cell Res
earch),１４ ５，１７９(1983)およびジャーナル オブ
ニューロサイエンス リサーチ(Journal of Neurosci
ence Research),１７，２５(1987)に記載されている方
法に従い、ＰＣ１２細胞の神経突起の伸長 (neurite ou
tgrowth)を指標にして、精製ヒトＮＧＦの活性を測定し
たところ、精製ヒトＮＧＦはマウス２.５Ｓ−ＮＧＦの
標準品(和光純薬)と同程度の活性を示した。ディベロプ
メンタル バイオロジー (Developmental Biology),１
１１，６２(1985)に記載されている方法に従い、ニワト
リ胚の脊髄後根神経節(dorsal rootganglia；ＤＲＧ)に
対する精製ヒトＮＧＦの作用を調べた。その結果、精製
ヒトＮＧＦは脊髄後根神経節(ＤＲＧ)由来の神経細胞の
神経突起の伸長および生存を促進した。Degradation of hydrazine [Natita et al., Journal of Biochemistry (J. Biochem.), 59 , 17]
0 (1966)], the C-terminal amino acid of purified human NGF was alanine. As a result of examination by PAG isoelectric focusing method (new edition electrophoretic experiment method, edited by Electrophoretic Society, Bunkodo, 1989), the isoelectric point of human NGF obtained was pH 9-10, and mouse NGF ( Collaborative Research Incor
It was almost the same as that of porated). Brain Research, 133 , 350 (1977), Experimental Cell Res
earch), 14 5, 179 ( 1983) and the Journal of Neuroscience Research (Journal of Neurosci
ence Research), 17 , 25 (1987) according to the method described in neurite outgrowth of PC12 cells (neurite ou).
When the activity of purified human NGF was measured using tgrowth) as an index, the purified human NGF showed an activity similar to that of the standard mouse 2.5S-NGF product (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Developmental Biology, 1
11 , 62 (1985), the effect of purified human NGF on the dorsal root ganglia (DRG) of chicken embryos was investigated. As a result, purified human NGF promoted neurite outgrowth and survival of nerve cells derived from dorsal root ganglion (DRG).
【００３７】 参考例８ 分子内ジスルフィド結合の解析 参考例７で得られた精製ヒトＮＧＦを用いて、その分子
内ジスルフィド結合の位置を決定した。凍結乾燥した精
製ヒトＮＧＦ(５３０μg)に０.２mlの０.９％ＮaＣl溶
液と０.８mlの０.０１Ｍ ＨＣlとを加えて溶解した。
この溶液のpＨは２.２であった。これに重量比で１/50
になるように、１mg／mlのペプシン(Sigma社)溶液を１
０.６μl加えて、３７℃で２２時間反応させた。反応後
９５０μlを採取し、５０μlの２５０mＭリン酸緩衝液
(pＨ６.０)を加えて反応を停止したものをペプシン消化
物とした。ペプシン消化物をＨＰＬＣに付し、ペプチド
マッピングを行った。ＴＳＫ−ゲルＯＤＳ−１２０Ｔカ
ラム(東ソー社、０.４６×２５cm)を用いて、０.０５％
ＴＦＡ(Ａ)および９９.９５％アセトニトリル０.０５％
ＴＦＣ(Ｂ)の混合物を以下の溶出プログラムに従って流
した。流速は１ml／min，検出波長は２２０nmおよび２
８０nm。 一方、ペプシン消化物５０μlに１００mＭ ＤＴＴ溶液
を１０μl加え、室温で３時間放置してジスルフィド結
合を還元したサンプルを同じようにＨＰＬＣに付し、ペ
プチドマッピングを行った。これら２つのペプチドマッ
ピングを比較することにより、ジスルフィド結合を有す
るペプチドを固定した後、このペプチドを単離し、気相
プロテインシークエンサー末端(ＡＢＩ社)アミノ酸配列
を分析した。Reference Example 8 Analysis of Intramolecular Disulfide Bond Using the purified human NGF obtained in Reference Example 7, the position of the intramolecular disulfide bond was determined. Lyophilized purified human NGF (530 μg) was dissolved by adding 0.2 ml of 0.9% NaCl solution and 0.8 ml of 0.01M HCl.
The pH of this solution was 2.2. 1/50 by weight ratio
1 mg / ml pepsin (Sigma) solution
0.6 μl was added and the mixture was reacted at 37 ° C. for 22 hours. After the reaction, collect 950 μl and collect 50 μl of 250 mM phosphate buffer.
(pH 6.0) was added to stop the reaction, which was used as a pepsin digest. The pepsin digest was submitted to HPLC for peptide mapping. Using a TSK-gel ODS-120T column (Tosoh Corp., 0.46 × 25 cm), 0.05%
TFA (A) and 99.95% acetonitrile 0.05%
The mixture of TFC (B) was run according to the following elution program. Flow rate is 1 ml / min, detection wavelength is 220 nm and 2
80 nm. On the other hand, 10 μl of 100 mM DTT solution was added to 50 μl of digested pepsin, and the mixture was left at room temperature for 3 hours to reduce disulfide bonds. After immobilizing the peptide having a disulfide bond by comparing these two peptide mappings, the peptide was isolated and the amino acid sequence of the gas phase protein sequencer end (ABI) was analyzed.
【００３８】その結果、本ペプチドは以下に示す配列−
１、配列−２、および配列−３を含み、かつ３個のジス
ルフィド結合を持つ大きなペプチドであることがわかっ
た。 配列−２ 54 58 60 65 Ｆ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｒ− 70 73 Ｇ−Ｉ−Ｄ−Ｓ− 配列−３ 102 105 110 115 Ｉ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−Ｌ−Ｓ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｖ− 120 Ｒ−Ｒ−Ａ 次に、このペプチド(２０６０pmol)を減圧下に濃縮乾固
した後０.３mlの５０mＭ酢酸ナトリウム(pＨ６.０)に溶
解した。この溶液に０.４８μg(１４pmol)のサーモライ
シン(和光純薬工業(株))を加えて、３７℃で２０時間反
応させた後、上記と同一の条件下で、ＨＰＬＣに付し、
ペプチドマッピングを行った。ただし、以下の溶出プロ
グラムを使用した。 さらに、ジスルフィド結合の位置を決定するために、上
記ペプチドをＤＴＴで還元処理したサンプルを同じよう
にＨＰＬＣに付し、ペプチドマッピングを行った。ペプ
チドマッピングの比較から、ジスルフィド結合を含む３
個のフラグメント(フラグメント−１、フラグメント−
２、フラグメント−３)を固定し、それぞれ取得した。
フラグメント−１、フラグメント−２、およびフラグメ
ント−３のアミノ末端アミノ酸配列を分析した。その結
果を表５に示す。一方、これらのフラグメントを過ギ酸
で酸化し、システイン残基をシステイン酸に変換した
後、アミノ酸分析を行った結果、いずれのフラグメント
にも２残基ずつのシステイン酸が検出された。As a result, this peptide has the sequence shown below.
It was found to be a large peptide containing 1, sequence-2, and sequence-3 and having three disulfide bonds. Sequence-2 54 58 60 65 F-E-T-K-C-R-D-P-N-P-V-D-S-G-C-R- 7073 G-I-D-S- Sequence -3 102 105 110 115 I-R-I-D-D-T-A-C-V-C-V-L-S-R-K-A-V-120 R-R-A Next, this peptide ( 2060 pmol) was concentrated to dryness under reduced pressure and then dissolved in 0.3 ml of 50 mM sodium acetate (pH 6.0). 0.48 μg (14 pmol) of thermolysin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to this solution, reacted at 37 ° C. for 20 hours, and then subjected to HPLC under the same conditions as above,
Peptide mapping was performed. However, the following elution program was used. Furthermore, in order to determine the position of the disulfide bond, a sample obtained by subjecting the above peptide to reduction treatment with DTT was similarly subjected to HPLC to perform peptide mapping. Comparison of peptide mapping revealed that 3 including disulfide bond
Fragments (fragment-1, fragment-
2. Fragment-3) was immobilized and obtained respectively.
The amino terminal amino acid sequences of Fragment-1, Fragment-2, and Fragment-3 were analyzed. The results are shown in Table 5. On the other hand, these fragments were oxidized with performic acid to convert cysteine residues into cysteic acid and amino acid analysis was performed. As a result, two cysteic acids were detected in each fragment.
【００３９】 これらの結果から、精製ヒトＮＧＦのジスルフィド結合
の位置は、Ｃys15−Ｃys80，Ｃys58−Ｃys108およびＣy
s68−Ｃys110であると結論された。このジスルフィド結
合様式を図９に示す。[0039] From these results, the position of the disulfide bonds of purified human NGF is, Cys 15 -Cys 80, Cys 58 -Cys 108 and Cy
It was concluded that this was s 68 -Cys 110 . This disulfide bond mode is shown in FIG.
【００４０】 実施例１ 抗ヒトＮＧＦポリクローナル抗体の作製 参考例７で得られたヒトＮＧＦをRibi Adjuvand (RIBI
Immunochem. Res. Inc.)とよく混合し、その混合物を
ウサギ(ニュージーランドホワイト，体重約１.５kg,
雌)の背部皮下に注射した。一匹当りのヒトＮＧＦ接種
量は１００μgであった。以後１０日毎に同量のヒトＮ
ＧＦとRibi Adjuvand(RIBI Immunochem. Res. Inc.)と
の混合物を同じウサギに５〜７回注射した。上記のよう
にして免疫したウサギから採取して得られた血液を遠心
分離し、抗血清を得た。得られた抗血清の抗体価をヒト
ＮＧＦを抗原とするＥＬＩＳＡで測定した結果、高い抗
体価(８回；１６,０００倍)が認められた。上記の抗血
清をプロテインＡ−Sepharose カラム（Pharmacia Fine
ChemicalsCo.,Ltd.,Sweden ０.２Ｍ ＮaＣlを含む０.
１Ｍリン酸緩衝液 (pＨ７.０)で平衡化したカラム(１m
l)に血清を加え、同緩衝液で十分洗浄後、０.２Ｍを含
む１％酢酸で溶出した。）により精製し、抗ヒトＮＧＦ
抗体ＩgＧ画分を得た。Example 1 Preparation of Anti-Human NGF Polyclonal Antibody The human NGF obtained in Reference Example 7 was converted into Ribi Adjuvand (RIBI
Immunochem. Res. Inc.), and the mixture was mixed with rabbit (New Zealand White, body weight about 1.5 kg,
Female) was subcutaneously injected into the back. The amount of human NGF inoculated per animal was 100 μg. The same amount of human N every 10 days thereafter
The same rabbit was injected with a mixture of GF and Ribi Adjuvand (RIBI Immunochem. Res. Inc.) 5-7 times. The blood obtained from the rabbit immunized as described above was centrifuged to obtain antiserum. As a result of measuring the antibody titer of the obtained antiserum by ELISA using human NGF as an antigen, a high antibody titer (8 times; 16,000 times) was observed. The above antiserum was applied to a Protein A-Sepharose column (Pharmacia Fine
Chemicals Co., Ltd., Sweden 0.2M including 0.2M NaCl.
Column (1 m) equilibrated with 1M phosphate buffer (pH 7.0)
Serum was added to l), washed thoroughly with the same buffer, and then eluted with 1% acetic acid containing 0.2M. ), Anti-human NGF
An antibody IgG fraction was obtained.
【００４１】 実施例２ ＥＩＡ法を用いたヒトＮＧＦの定量 ９６ウエルのポリスチレンマイクロタイタープレート(F
alcon Co.,Ltd.,USA)に実施例１で得た１００μg／mlの
抗ヒトＮＧＦ ＩgＧ画分を１０μlずつ分注し室温で２
時間置き、ＩgＧ画分をマイクロタイタープレートに付
着させた。このプレートを０.４Ｍ ＮaＣl，０.１％Ｂ
ＳＡ，０.１％ＮaＮ3および１mＭ ＭgＣl2を含む０.１
Ｍ Ｔris−ＨＣl buffer(pＨ７.６)で、２回洗った
後、同じbufferを加え(１３０μl／ウエル)室温で２時
間置いた。次にスタンダードヒトＮＧＦを含む液２０μ
lを加え、室温で４時間ゆっくり振盪した後上記buffer
で２回洗浄した。洗浄後、ビオチンラベルした抗ヒトＮ
ＧＦ ＩgＧ液(３５ng／ml)を３０μl／ウエル加え、一
晩４℃で振盪し、上記bufferで２回洗浄した。抗ヒトＮ
ＧＦ ＩgＧ画分のビオチンラベルは HSU, S.-M., Rain
e, L. and Faugen,H. Use of avidin-biotin peroxid
ase complex(ABC) in immunoperoxidase techniques: A
comparison between ABC and unlabelled antibody(P
AP) procedures. J. Histochem.Cytochem., 29(4), 577
-580(1981)の方法を用いた。次に３０μlのストレプト
アビシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ complex を加え
１時間室温で振盪した後、上記buffer で３回洗浄し
た。このプレートに６０mＭの４−methylumbelliferyl
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを３０μl加え室温で４時
間インキュベートし、１３０μlの０.１Ｍ glycine−Ｎ
aＯＨ buffer(pＨ１０.３)を加えて反応を停止させた
後、Fluorometry により蛍光強度(Excitation ３６０n
m；Emission ４５０nm)を測定した。参考例７で得られ
たヒトＮＧＦを用いてこのＥＩＡを行って得た標準曲線
は図１０に示すようになった。この曲線から本ＥＩＡは
下限１Pg／２０μl／well程度迄のヒトＮＧＦを検出で
きることがわかった。Example 2 Quantification of human NGF using EIA method 96-well polystyrene microtiter plate (F
alcon Co., Ltd., USA), 100 μg / ml of the anti-human NGF IgG fraction obtained in Example 1 was dispensed in 10 μl aliquots, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2
After a period of time, the IgG fraction was attached to the microtiter plate. This plate was washed with 0.4M NaCl, 0.1% B
SA, 0.1% containing 0.1% NaN 3 and 1 mM MgCl 2
After washing twice with M Tris-HCl buffer (pH 7.6), the same buffer was added (130 μl / well) and the plate was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Next, a solution containing standard human NGF 20μ
l and slowly shaken at room temperature for 4 hours, then add the above buffer
It was washed twice with. After washing, biotin-labeled anti-human N
GF IgG solution (35 ng / ml) was added at 30 μl / well, shaken overnight at 4 ° C., and washed twice with the above buffer. Anti-human N
The biotin label of the GF IgG fraction is HSU, S.-M., Rain
e, L. and Faugen, H. Use of avidin-biotin peroxid
ase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: A
comparison between ABC and unlabelled antibody (P
AP) procedures. J. Histochem. Cytochem., 29 (4), 577
-580 (1981) was used. Next, 30 μl of streptavicin-β-D-galactosidase complex was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour, and then washed 3 times with the above buffer. Add 60 mM 4-methylumbelliferyl to this plate.
30 μl of -β-D-galactosidase was added and incubated at room temperature for 4 hours to obtain 130 μl of 0.1M glycine-N.
After adding aOH buffer (pH 10.3) to stop the reaction, fluorescence intensity (Excitation 360n) was measured by Fluorometry.
m; Emission 450 nm) was measured. The standard curve obtained by carrying out this EIA using the human NGF obtained in Reference Example 7 is shown in FIG. From this curve, it was found that this EIA can detect human NGF up to a lower limit of about 1 Pg / 20 μl / well.
【００４２】 実施例３ 種々の動物由来ＮＧＦの抗原性の比較 実施例２に示された抗ヒトＮＧＦＩgＧ画分を用いたＥ
ＩＡ法により、種々の動物由来ＮＧＦの抗原性を比較検
討した。すなわち、実施例２と同一方法を用い、種々の
ＮＧＦの標準曲線を求め、図１１に示した。図１１か
ら、ウシ，モルモット，マウス，ヘビ由来ＮＧＦの順に
免疫交差性が低下することが分かった。図１１は、実施
例２で得られた本発明の抗ヒトＮＧＦポリクローナル抗
体を用いたＥＩＡによる種々のＮＧＦの標準曲線を示
す。図１１において─●─はヒトＮＧＦの，─○─はウ
シＮＧＦの，─△─を黒くぬった印はモルモットＮＧＦ
の，─△─はマウスＮＧＦの，─□─を黒くぬった印は
ヘビ（コブラ）毒ＮＧＦの結果をそれぞれ示す。Example 3 Comparison of antigenicity of NGF derived from various animals E using the anti-human NGFI IgG fraction shown in Example 2
The antigenicity of various animal-derived NGFs was compared and examined by the IA method. That is, using the same method as in Example 2, standard curves of various NGFs were determined and shown in FIG. From FIG. 11, it was found that the immunoreactivity decreases in the order of bovine, guinea pig, mouse, and snake-derived NGF. FIG. 11 shows standard curves of various NGF by EIA using the anti-human NGF polyclonal antibody of the present invention obtained in Example 2. In FIG. 11, ∘∘ indicates human NGF, ∘∘ indicates bovine NGF, and ∑ indicates black guinea pig NGF.
, ∑ indicates the results of mouse NGF and ∘ indicates the results of snake (cobra) venom NGF.
【００４３】[0043]
【発明の効果】本発明ではヒトＮＧＦを抗原として用い
た抗体を得るが、ヒトＮＧＦ全蛋白質であるためこのポ
リクローナル抗体は多くのエピトープを認識する多種の
抗体の混合物として得られる。従って本発明のヒトＮＧ
Ｆの検出・測定法によると、微量のＮＧＦを高感度で測
定することができるので、ヒトの体液や組織中のＮＧＦ
を有利に検出・測定することができ、また疾病の診断法
としても用いることができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, an antibody using human NGF as an antigen is obtained. Since it is a human NGF whole protein, this polyclonal antibody can be obtained as a mixture of various antibodies recognizing many epitopes. Therefore, the human NG of the present invention
According to the method for detecting and measuring F, a very small amount of NGF can be measured with high sensitivity, so NGF in human body fluids and tissues can be measured.
Can be advantageously detected and measured, and can also be used as a diagnostic method for diseases.
【００４４】[0044]
【図１】，[Figure 1]
【図２】およびFIG. 2 and
【図３】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。FIG. 3 is the cloned human N obtained in Reference Example 1.
The nucleotide sequence of the GF gene and the amino acid sequence translated therefrom are shown.
【図４】は、参考例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ１０１の 構築図を示す。FIG. 4 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF101 obtained in Reference Example 1.
【図５】およびFIG. 5 and
【図６】は、参考例２で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮ ＧＦ２０１の構築図を示す。FIG. 6 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMN GF201 obtained in Reference Example 2.
【図７】およびFIG. 7 and
【図８】は、参考例３で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＴＢ １０５８の構築図を示す。FIG. 8 shows a construction diagram of human NGF expression vector pTB1058 obtained in Reference Example 3.
【図９】は、参考例８で得られた、精製ヒトＮＧＦのジ
スルフィド結合様式の解析図を示す。FIG. 9 shows an analysis diagram of the disulfide bond mode of purified human NGF obtained in Reference Example 8.
【図１０】は、実施例２で得られた、本発明の抗ヒトＮ
ＧＦポリクローナル抗体を用いたヒトＮＧＦのＥＩＡの
標準曲線を示す。FIG. 10 shows the anti-human N of the present invention obtained in Example 2.
The standard curve of EIA of human NGF using a GF polyclonal antibody is shown.
【図１１】は、実施例３で得られた、種々のＮＧＦの標
準曲線を示す。FIG. 11 shows standard curves of various NGF obtained in Example 3.
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成３年９月１３日[Submission date] September 13, 1991
【手続補正５】[Procedure Amendment 5]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】全文[Correction target item name] Full text
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【書類名】明細書[Document name] Statement
【発明の名称】抗体およびその用途Title: Antibody and its use
【特許請求の範囲】[Claims]
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はヒト神経成長因子(ヒト
ＮＧＦ)蛋白質を免疫原として得られるポリクローナル
抗体およびその用途に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a polyclonal antibody obtained by using a human nerve growth factor (human NGF) protein as an immunogen, and its use.
【０００２】[0002]
【従来の技術】神経成長因子(nerve growth factar,Ｎ
ＧＦ)はレヴィ モンタルチーニ(Levi-Monntalcini)
〔アニュアル ニューヨーク アカデミー オブ サイ
エンス(Ann. N.Y. Acad. Sci.)５５，３３０(1952)〕お
よびコーエン(Cohen)ら〔プロシージングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユーエ
スエー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)４ ０，１０１４
(1954)〕によって発見され、末梢神経系の分化、成長お
よび生存に必須な栄養因子である。最近、ＮＧＦは中枢
神経系において、コリン作動性ニューロンの生存を維持
する作用を有することが明らかにされており〔ヘフティ
ー(Hehti)，ジャーナル オブ ニューロサイエンス(Journ
al of Neuroscience)６，２１５５(1986)；畠中(Hatana
ka)等、ディベロプメント オブ ブレイン リサーチ
(Dev. Brain Res.)３９，８５(1988)〕、アルツハイマ
ー病と何らかの関連がある因子として注目されている。
また、老齢ラットの脳内にＮＧＦを投与すると、記憶障
害の改善が認められる〔ネイチャー(Nature)，３２９，
６５(1989)〕ことから、老人性痴ほうの治療薬としても
期待されている。2. Description of the Related Art nerve growth factor (N)
GF) is Levi-Monntalcini
[Ann. NY Acad. Sci. 55 , 330 (1952)] and Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA]. 4 0, 1014
(1954)] and is an essential trophic factor for the differentiation, growth and survival of the peripheral nervous system. Recently, NGF has been shown to have an action to maintain the survival of cholinergic neurons in the central nervous system [Hehti, Journal of Neuroscience (Journ
al of Neuroscience) 6 , 2155 (1986); Hatanaka (Hatana
ka), etc., Development of Brain Research
(Dev. Brain Res.) 39 , 85 (1988)], which has been attracting attention as a factor having some relation with Alzheimer's disease.
Moreover, when NGF is administered into the brain of aged rats, improvement in memory impairment is observed [Nature ( 329 ),
65 (1989)], it is expected as a therapeutic drug for senile dementia.
【０００３】雄マウス顎下腺より単離されたＮＧＦ(７
ＳＮＧＦ)は、α、β、γの３種のサブユニットからな
る複合体(α2βγ2)であり、そのうちのβサブユニット
にのみＮＧＦ活性が認められている。βサブユニット
(βＮＧＦ、２.５Ｓ ＮＧＦ)は１１８個のアミノ酸か
らなる同一のポリペプチドの２量体であり、そのアミノ
酸配列はアルゲレッティ(Argeletti)とブラッドショウ
(Bradshaw)〔プロシージングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス ユーエスエー(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA),６８，２４１７(1971)〕によ
って決定されている。NGF (7 isolated from the submandibular gland of a male mouse)
SNGF) is a complex (α 2 βγ 2 ) composed of three subunits of α, β and γ, and NGF activity is observed only in the β subunit. β subunit
(βNGF, 2.5S NGF) is a dimer of the same polypeptide consisting of 118 amino acids, the amino acid sequences of which are Argeletti and Bradshaw.
(Bradshaw) (Proc. Of the National Academy of Sciences USA)
Natl. Acad. Sci. USA), 68 , 2417 (1971)].
【０００４】スコット(Scott)らはマウスβＮＧＦのア
ミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプ
ローブとして用いて、マウス顎下腺cＤＮＡライブラリ
ーから、マウスβＮＧＦのクローニングに成功した〔ネ
イチャー(Nature)，３０２，５３８(1983)〕。さらにア
ルリッチ(Ullrich)らはマウスβＮＧＦ cＤＮＡをプロ
ーブとして用いて、ヒトゲノムＤＮＡのライブラリーか
らＮＧＦ遺伝子をクローニングし、その塩基配列から推
定したヒトＮＧＦのアミノ酸配列がマウスＮＧＦのそれ
と９０％の相同性を有することを示した〔ネイチャー(N
ature)，３０３，８２１(1983)〕。Scott et al. Have successfully cloned mouse βNGF from a mouse submandibular gland cDNA library using an oligonucleotide synthesized on the basis of the amino acid sequence of mouse βNGF as a probe [Nature, 302]. , 538 (1983)]. Furthermore, Ullrich et al. Cloned the NGF gene from a library of human genomic DNA using mouse βNGF cDNA as a probe, and the amino acid sequence of human NGF deduced from its nucleotide sequence showed 90% homology with that of mouse NGF. It has been shown to have [Nature (N
ature), 303 , 821 (1983)].
【０００５】[0005]
【発明が解決すべき課題】このようにヒトＮＧＦ遺伝子
はクローニングされているが、生体からヒトＮＧＦが検
出・単離された報告はほとんどない。ヒトＮＧＦが生体
から検出されない理由の１つとして、今まで主として抗
マウスＮＧＦ抗体を用いていたためと考えられる。Although the human NGF gene has been cloned as described above, there are few reports that human NGF was detected and isolated from a living body. It is considered that one of the reasons why human NGF is not detected in the living body is that anti-mouse NGF antibody has been mainly used until now.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒトＮＧ
Ｆを検出・定量する目的で、組換え型ヒトＮＧＦを免疫
原として抗体を得た。得られた該抗体を用いることによ
ってヒトＮＧＦを検出・定量することが可能であること
を見出し、さらに研究した結果、本発明を完成した。本
発明は、(１) 分子中に６個のシステイン残基を有し、
Ｎ末端から数えて第１番目のシステイン残基と第４番目
のシステイン残基とが、第２番目のシステイン残基と第
５番目のシステイン残基とが、第３番目のシステイン残
基と第６番目のシステイン残基とが、それぞれジスルフ
ィド結合している活性なヒト神経成長因子(ＮＧＦ)蛋白
質を免疫原として得られるポリクローナル抗体，および
(２) 上記(１)記載の抗体を用いることを特徴とするヒ
トＮＧＦ蛋白質の検出・定量法である。The present inventors have found that human NG
For the purpose of detecting and quantifying F, an antibody was obtained using recombinant human NGF as an immunogen. It was found that human NGF can be detected and quantified by using the obtained antibody, and as a result of further research, the present invention was completed. The present invention has (1) 6 cysteine residues in the molecule,
The first cysteine residue and the fourth cysteine residue counted from the N-terminal, the second cysteine residue and the fifth cysteine residue, the third cysteine residue and the third cysteine residue A polyclonal antibody obtained by using an active human nerve growth factor (NGF) protein in which the 6th cysteine residue is disulfide-bonded as an immunogen, and
(2) A method for detecting and quantifying human NGF protein, which comprises using the antibody according to (1) above.
【０００７】本発明におけるヒトＮＧＦ蛋白質として
は、ヒトＮＧＦおよびそのムテインが挙げられる。ヒト
ＮＧＦとしては胎盤由来の天然物由来のものや合成のも
の、遺伝子工学的手法により製造されたものが挙げられ
る。ヒトＮＧＦとしては、後述の参考例で得られた１２
０個のアミノ酸を有するものが好ましい。該ヒトＮＧＦ
蛋白質は、ヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を含む
ベクターで形質転換され、クローン化されている動物細
胞が産生したヒトＮＧＦ蛋白質であることが好ましい。
ヒトＮＧＦのムテインとしては、ジスルフィド結合して
いる分子中の６個のシステイン残基以外の、元のポリペ
プチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものが
挙げられる。該変異としては、アミノ酸の付加、構成ア
ミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。し
たがって、該ムテインは上記した分子中に６個のシステ
イン残基を有するものである。該アミノ酸の付加として
は、少なくとも１個のアミノ酸が付加しているものが挙
げられる。該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも
１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が欠損しているものが挙
げられる。該他のアミノ酸への置換としては、少なくと
も１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換
されているものが挙げられる。ヒトＮＧＦに少なくとも
１個のアミノ酸が付加しているムテインにおける少なく
とも１個のアミノ酸としては、ペプチドを発現する際に
用いられる開始コドンに基因するメチオニンや、シグナ
ルペプチドは含まれないものである。付加されているア
ミノ酸の数としては、少なくとも１個であるが、ヒトＮ
ＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。さらに好まし
くは、ヒトＮＧＦと相同性(ホモロジー)が認められてお
り、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配列の一部
あるいはすべてが挙げられる。ヒトＮＧＦの少なくとも
１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸が欠損しているムテイン
における欠損している構成アミノ酸の数としては、ヒト
ＮＧＦの特徴を失なわない限り何個でもよい。該欠損型
ムテインにおけるアミノ酸の数は、４１個以上であるこ
とが好ましい。The human NGF protein in the present invention includes human NGF and its muteins. Examples of human NGF include natural products derived from placenta, synthetic products, and products produced by genetic engineering techniques. As human NGF, 12 obtained in the reference example described below was used.
Those with 0 amino acids are preferred. The human NGF
The protein is preferably a human NGF protein produced by a cloned animal cell transformed with a vector containing a gene encoding the human NGF protein.
Examples of human NGF muteins include those in which the amino acid sequence of the original polypeptide or protein other than the six cysteine residues in the disulfide-bonded molecule is mutated. Examples of the mutation include addition of amino acids, deletion of constituent amino acids, and substitution with other amino acids. Therefore, the mutein has 6 cysteine residues in the molecule. The addition of the amino acid includes an addition of at least one amino acid. Examples of the deletion of the constituent amino acids include those lacking at least one human NGF constituent amino acid. Examples of the substitution with the other amino acid include substitution of at least one human NGF-constituting amino acid with another amino acid. The at least one amino acid in the mutein in which at least one amino acid is added to human NGF does not include methionine due to the initiation codon used for expressing the peptide and the signal peptide. The number of added amino acids is at least 1, but human N
Any number may be used as long as the characteristics of GF are not lost. More preferably, a part of the amino acid sequence of a protein showing homology with human NGF and showing similar activity.
Or all. The number of missing constituent amino acids in the mutein lacking at least one human NGF constituent amino acid of human NGF may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. The number of amino acids in the defective mutein is preferably 41 or more.
【０００８】ヒトＮＧＦの少なくとも１個のヒトＮＧＦ
構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテイン
における置換される前の少なくとも１個のヒトＮＧＦ構
成アミノ酸の数としては、ヒトＮＧＦの特徴を失なわな
い限り何個でもよい。置換される前の構成アミノ酸の例
としては、システイン以外のものが挙げられる。置換さ
れる前の構成アミノ酸としてシステイン以外のものとし
ては、アスパラギン酸、アルギニン、グリシン、セリ
ン、バリンなどが挙げられる。置換された別のアミノ酸
としては、たとえば、アミノ酸の親水性、疎水性あるい
は電荷の点で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質
をもつものを選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸
がアスパラギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ
酸としてアスパラギン、スレオニン、バリン、フェニル
アラニン、アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパ
ラギン、アルギニンが好ましい。置換される前のアミノ
酸がアルギニンの場合には、置換されたあとのアミノ酸
としてグルタミン、スレオニン、ロイシン、フェニルア
ラニン、アスパラギン酸が挙げられるが、特にグルタミ
ンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がグリシン
である場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、
スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、グ
ルタミン酸、アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニ
ンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がセリンで
ある場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、メ
チオニン、アラニン、ロイシン、システイン、グルタミ
ン、アルギニン、アスパラギン酸などが挙げられ、特に
メチオニンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸が
バリンである場合には、置換されたあとのアミノ酸とし
ては、セリン、ロイシン、プロリン、グリシン、リジ
ン、アスパラギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ま
しい。置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギ
ン、グルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニ
ン、セリン、ロイシンが好ましい。上記の置換において
は、２以上の置換を同時に行なってもよい。該ムテイン
は、上記した付加、欠損、置換の２つまたは３つが組み
合わさったものでもよい。At least one human NGF of human NGF
The number of at least one human NGF constituent amino acid before substitution in the mutein in which a constituent amino acid is substituted with another amino acid may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. Examples of constituent amino acids before substitution include those other than cysteine. Examples of the constituent amino acids other than cysteine as the constituent amino acids before substitution include aspartic acid, arginine, glycine, serine, valine and the like. As the other substituted amino acid, for example, one having a property different from the amino acid before the substitution is selected in terms of hydrophilicity, hydrophobicity or charge of the amino acid. Specifically, when the amino acid before substitution is aspartic acid, examples of the amino acid after substitution include asparagine, threonine, valine, phenylalanine, and arginine, with asparagine and arginine being particularly preferable. When the amino acid before substitution is arginine, examples of the amino acid after substitution include glutamine, threonine, leucine, phenylalanine and aspartic acid, with glutamine being particularly preferred. When the constituent amino acid before substitution is glycine, the amino acid after substitution is,
Examples thereof include threonine, leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid, and arginine, with threonine being particularly preferable. When the constituent amino acid before substitution is serine, examples of the amino acid after substitution include methionine, alanine, leucine, cysteine, glutamine, arginine and aspartic acid, with methionine being particularly preferred. When the constituent amino acid before substitution is valine, examples of the amino acid after substitution include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred. As the amino acid after substitution, asparagine, glutamine, arginine, threonine, methionine, serine and leucine are preferable. In the above substitution, two or more substitutions may be performed simultaneously. The mutein may be a combination of two or three of the above additions, deletions and substitutions.
【０００９】該ムテインを製造するためには、特定部位
指向性変異誘発技術(Site-directedmutagenesis)が採用
される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサー
(Lather,R.F.)及びジェイ・ピー・レコック(Lecoq,J.
P.)，ジェネティック・エンジニアリング(Genetic Engi
neering)、アカデミックプレス社(１９８３年)第３１〜
５０頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指示さ
れた変異誘発はエム・スミス(Smith,M.)及びエス・ギラ
ム( Gillam,S.)、ジェネティック・エンジニアリング：
原理と方法、プレナムプレス社(１９８１年)３巻、１〜
３２頁、に示されている。In order to produce the mutein, a site-directed mutagenesis technique is adopted. The technology is well known, and is F Racer.
(Lather, RF) and Jay P. Lecoq (Lecoq, J.
P.), Genetic Engineering (Genetic Engi
neering), Academic Press, Inc. (1983) No. 31-
See page 50. Oligonucleotide-directed mutagenesis is described by Smith, M. and Gillam, S., Genetic Engineering:
Principle and Method, Plenum Press Co. (1981) Volume 3, 1
See page 32.
【００１０】該ムテインをコードする構造遺伝子を製造
するためには、たとえば、 (a) ヒトＮＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖Ｄ
ＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと雑種
形成させる(この１本鎖で代替すべきアミノ酸に対する
コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアン
チセンス・トリプレットを包含する領域に対して上記プ
ライマーは相補的なものである。但し、当該コドンの他
のアミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセン
ス・トリプレットとの不一致はこの限りでない。) (b) ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、
突然変異性ヘテロ二量体(heteroduplex)を形成させる、
及び (c) この突然変異性ヘテロ二量体を複製する。次に、突
然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮＡを単離
し、プラスミドへ組み込む。このようにして得られたプ
ラスミドで適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換
体を培地に培養することにより、ムテインを製造するこ
とができる。In order to produce the structural gene encoding the mutein, for example, (a) a single chain D consisting of a single chain of the structural gene of human NGF
The NA hybridizes with the mutant oligonucleotide primer (the primer is complementary to the region containing the codon for the amino acid to be replaced by this single strand, or optionally the antisense triplet that pairs with this codon). (However, this does not apply to the disagreement between the codon for encoding the other amino acid or the antisense triplet in some cases.) (B) The primer is extended with DNA polymerase,
Form a mutant heterodimer,
And (c) replicate this mutant heterodimer. The phage DNA carrying the mutated gene is then isolated and integrated into a plasmid. A mutein can be produced by transforming an appropriate host with the plasmid thus obtained and culturing the obtained transformant in a medium.
【００１１】本発明で用いられるヒトＮＧＦ蛋白質をコ
ードする遺伝子としては、例えばヒトゲノムライブラリ
ーからクローニングによって得られたもの、または化学
合成によって得られたものなどが挙げられる。ヒトＮＧ
Ｆ蛋白質をコードする遺伝子のクローニングは、例えば
ネイチャー(Nature)，３０３，８２１(１９８３)に記載
されている方法で行なうことが出来る。上記のようにし
て得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子は目的
によりそのまま、あるいは制限酵素で切断して使用する
ことができる。上記で得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコー
ドする遺伝子をプロモーターの下流に連結するが、この
場合ヒトＮＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの５′末端に
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、またはシグナル
ペプチドをコードするＤＮＡとプロペプチドをコードす
るＤＮＡを連結させることが望ましい。シグナルペプチ
ドとしては、ヒトＮＧＦ蛋白質を分泌させることが可能
なものであれば何でも良く、具体例としては、ヒト、マ
ウス、ラット、ウシ、およびニワトリのＮＧＦのシグナ
ルペプチド、卵白リゾチームのシグナルペプチドおよび
その変異体、ヒトインターロイキシン−２のシグナルペ
プチドなどが挙げられる。また、プロペプチドとして
は、ヒト、ラット、マウス、ウシ、およびニワトリのＮ
ＧＦのプロペプチドなどが挙げられる。上記の方法の他
に、他の蛋白とヒトＮＧＦ蛋白質との融合蛋白として分
泌生産させたのち、適当なプロテアーゼで切断すること
によってヒトＮＧＦ蛋白質を得ることもできる。The gene encoding the human NGF protein used in the present invention includes, for example, those obtained by cloning from a human genome library, those obtained by chemical synthesis, and the like. Human NG
The gene encoding the F protein can be cloned by the method described in Nature, 303 , 821 (1983), for example. The gene encoding the human NGF protein obtained as described above can be used as it is or after being cleaved with a restriction enzyme depending on the purpose. The gene encoding the human NGF protein obtained above is ligated downstream of a promoter. In this case, the DNA encoding the signal peptide at the 5'end of the DNA encoding the human NGF protein, or the DNA encoding the signal peptide and a pro It is desirable to ligate the DNA encoding the peptide. Any signal peptide may be used as long as it can secrete human NGF protein, and specific examples thereof include human, mouse, rat, bovine, and chicken NGF signal peptides, egg white lysozyme signal peptides, and the like. Examples include mutants and human interleukin-2 signal peptides. Also, as the propeptide, human, rat, mouse, bovine, and chicken N
Examples include GF propeptide and the like. In addition to the above method, a human NGF protein can also be obtained by secreting and producing it as a fusion protein of another protein and human NGF protein and then cleaving it with an appropriate protease.
【００１２】上記のヒトＮＧＦ蛋白質をコードするＤＮ
Ａなどを用いて動物細胞用のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベク
ターを構築する。ヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターの構築
に用いるベクターとしては、例えばpＢＲ３２２および
その誘導体、ＳＶ４０系ベクター、ウシパピローマウイ
ルスベクター、レトロウイルスベクター、ＢＫウイルス
ベクターなどが挙げられる。そのほかにワクシニアウイ
ルス、ＥＢウイルス、単純ヘルペスウイルスなどの動物
ウイルスをベクターとして用いることもできる。発現ベ
クターに用いるプロモーターとしては、動物細胞で機能
するものであればいずれでもよく、例えば、ＳＶ４０プ
ロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプ
ロモーターなどが挙げられる。発現ベクターには、以上
のほかに、エンハンサー、ＲＮＡスプライシングのシグ
ナル、ポリＡ付加のシグナル、選択マーカーなどを用い
る。発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例
えば、モレキュラー クロヘニング(Molecular Clonin
g)、ア ラボラトリー マニュアル、コールド スプリ
ング ハーバー ラボラトリー(A Laboratory Mannul.
Cold Spring Harbor Laboratory)(1982)に記載さ
れている。DN encoding the above human NGF protein
A or the like is used to construct a human NGF protein expression vector for animal cells. Examples of the vector used to construct the human NGF protein expression vector include pBR322 and its derivatives, SV40 system vector, bovine papilloma virus vector, retrovirus vector, BK virus vector and the like. In addition, animal viruses such as vaccinia virus, EB virus and herpes simplex virus can be used as a vector. The promoter used in the expression vector may be any promoter that functions in animal cells, and examples thereof include SV40 promoter, LTR promoter, and metallothionein promoter. In addition to the above, an enhancer, an RNA splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker and the like are used as the expression vector. The method itself for constructing an expression vector is known, and for example, molecular cloning can be performed.
g), Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (A Laboratory Mannul.
Cold Spring Harbor Laboratory) (1982).
【００１３】このようにして作製したヒトＮＧＦ蛋白質
発現ベクターを用いて動物細胞を形質転換する。動物細
胞としては、例えばサルVero細胞、チャイニーズハムス
ターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１２７細胞、
マウスＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞などおよびリンパ球系細
胞、例えばマウスＳp２／０などが挙げられる。動物細
胞を形質転換する方法は公知であり、例えば、グラハム
(Graham)の方法〔ウィロロジー( Virolory)，５２，４
５６(1973)〕などが挙げられる。以上のようにしてヒト
ＮＧＦ発現ベクターで形質転換された動物細胞が得られ
る。Animal cells are transformed with the human NGF protein expression vector thus prepared. Examples of animal cells include monkey Vero cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, mouse C127 cells,
Examples include mouse BALB / 3T3 cells and lymphoid cells such as mouse Sp2 / 0. Methods for transforming animal cells are known, for example, Graham
(Graham) method [Virolory, 52 , 4
56 (1973)] and the like. Animal cells transformed with the human NGF expression vector are obtained as described above.
【００１４】上記のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターで形
質転換された動物細胞を用いてヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子
を安定に発現させる方法としては、ヒトＮＧＦ蛋白質発
現ベクターが導入細胞の染色体に組み込まれる方法と、
導入細胞においてヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターが染色
体に組み込まれることなく安定に存在させる方法があ
る。前者の場合には、例えばジヒドロ葉酸還元酵素(Ｄ
ＨＦＲ)遺伝子などの増幅系〔ジャーナル オブ モレ
キュラー バイオロジー(J.Mol.Biol.)１５９，６０１
(1982)〕を利用してヒトＮＧＦ蛋白質の生産量を増大さ
せることができる。該形質転換された動物細胞は、クロ
ーン化されているものを用いるのが有利である。形質転
換された動物細胞(クローン)を選択する方法自体は公知
であり、例えば実験医学、臨時増刊号、Vol.５，No.１
１，１９８７(羊土社)に記載されている。具体的には、
ヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子と共に選択マーカー遺伝子を指
標にして形質転換株を選択する。この場合、選択マーカ
ーをヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子と同一ベクターに乗せて細
胞に導入しても良く、また選択マーカーをこれよりも多
量のヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子とともに同一のベクターに
導入せずに細胞に導入(co-transformation)しても良
い。これらの選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉
酸還元酵素(ＤＨＦＲ)〔メソトレキセート(ＭＴＸ)耐
性〕、チミジンキナーゼ、Ecogpt遺伝子(ミコフェノー
ル酸耐性)、neo遺伝子(Ｇ４１８耐性)などが挙げられ
る。さらに、このようにして選択マーカーを用いて得ら
れた形質転換株に対し、くり返しクローン選択を行うこ
とにより、遺伝子産物の高産生能を有する安定な細胞株
を得ることができる。As a method for stably expressing a human NGF protein gene using an animal cell transformed with the above human NGF protein expression vector, a method in which the human NGF protein expression vector is integrated into the chromosome of the introduced cell,
There is a method in which the human NGF protein expression vector is stably present in the introduced cells without being integrated into the chromosome. In the case of the former, for example, dihydrofolate reductase (D
HFR) Amplification system for genes etc. [J. Mol. Biol. 159 , 601]
(1982)] can be used to increase the amount of human NGF protein produced. Advantageously, the transformed animal cells are cloned. Methods for selecting transformed animal cells (clones) are known per se, for example, Experimental Medicine, Extra edition, Vol. 5, No. 1
1, 1987 (Yodosha). In particular,
A transformant strain is selected using the selection marker gene as an index together with the human NGF protein gene. In this case, the selectable marker may be placed on the same vector as the human NGF protein gene and introduced into the cell, or the selectable marker may be introduced into the cell together with a larger amount of the human NGF protein gene without introducing into the same vector ( co-transformation). Examples of these selection markers include dihydrofolate reductase (DHFR) [methotrexate (MTX) resistance], thymidine kinase, Ecogpt gene (mycophenolic acid resistance), neo gene (G418 resistance) and the like. Furthermore, by performing repeated clone selection on the transformant strain thus obtained using the selectable marker, a stable cell line having a high ability to produce a gene product can be obtained.
【００１５】このようにして得られた動物細胞を培養す
る際、培地としては、たとえば０.５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス(Science)，１２
２，５０１(1952)〕、ＤＭＥＭ培地〔ウィロロジー(Vir
ology)，８，３９６(1959)〕、ＲＰＭＩ１６４０培地
〔ジャーナル オブ アメリカン メディカル アソシ
エーション( J. Am. Med. Assoc.)，１９９，５１９(19
67)，１９９培地〔プロシージングス オブ ソサイエ
ティ オブ エクスペリメント バイオロジカルメディ
シン (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. ７３，１(195
0))〕〕などが挙げられる。pＨは約６〜８であるのが望
ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing the animal cells thus obtained, the medium is, for example, MEM medium containing 0.5 to 20% fetal bovine serum [Science, 12].
2 , 501 (1952)], DMEM medium [Virology (Virology
ology, 8 , 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of American Medical Association (J. Am. Med. Assoc.), 199 , 519 (19).
67), 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 , 1 (195
0))]] and the like. The pH is preferably about 6-8. Culturing is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added if necessary.
【００１６】本発明で用いられるヒトＮＧＦ蛋白質は細
胞内または細胞外に生成、蓄積する。細胞内ヒトＮＧＦ
蛋白質を培養物から抽出するに際しては、培養後公知の
方法で細胞を集め、塩酸グアニジンや尿素などの蛋白変
性剤を含む緩衝液やトライトンＸ−１００などの界面活
性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させたのち、遠心分離
によりヒトＮＧＦ蛋白質を含む上澄液を得る方法、ある
いは超音波処理や凍結融解法によって細胞を破壊したの
ち、遠心分離によりヒトＮＧＦ蛋白質を含む上澄液を得
る方法などを適宜用い得る。これらの上澄液や細胞外に
生成、蓄積したヒトＮＧＦ蛋白質を分離、精製するには
自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて実施すれ
ばよい。これらの公知の分離、精製法としては、塩析、
硫安沈澱および溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する
方法、透析法、限外ろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィ
ーなどの特異的親和性を利用する方法、例えば抗体カラ
ムおよび Ｃu2+カラムなどのメタルキレートカラム、逆
相高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)などの疎水性
の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の
差を利用する方法などが挙げられる。このようにして、
活性体として、９０％(w/w)以上の純度のもの、さらに
好ましくは、９４％(w/w)以上の純度のものが得られ
る。該純度は、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、生物活性
から測定される。このように、ヒトＮＧＦ蛋白質の純度
９４％以上のものが好ましい。The human NGF protein used in the present invention is produced and accumulated intracellularly or extracellularly. Intracellular human NGF
When extracting proteins from the culture, the cells are collected by a known method after culturing, and the cells are placed in a buffer containing a protein denaturant such as guanidine hydrochloride or urea or a buffer containing a surfactant such as Triton X-100. Cell suspension, followed by centrifugation to obtain a supernatant containing human NGF protein, or sonication or freeze-thaw method to disrupt cells, and then centrifugation to obtain a supernatant containing human NGF protein. A method etc. can be used suitably. In order to separate and purify the human NGF protein produced and accumulated in the supernatant or extracellularly, a known combination and purification method per se may be appropriately combined. These known separation and purification methods include salting out,
Methods utilizing the difference in solubility such as ammonium sulfate precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, and methods utilizing mainly differences in molecular weight such as SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, ion exchange chromatography, etc. Methods that utilize differences in charge, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography, such as metal chelate columns such as antibody columns and Cu 2+ columns, hydrophobic phases such as reverse phase high performance liquid chromatography (HPLC), etc. Examples thereof include a method using a difference and a method using a difference in isoelectric points such as an isoelectric focusing method. In this way
As the active substance, a substance having a purity of 90% (w / w) or more, and more preferably a substance having a purity of 94% (w / w) or more can be obtained. The purity is measured by HPLC, SDS-PAGE and biological activity. Thus, the human NGF protein having a purity of 94% or more is preferable.
【００１７】このようにして得られた本発明で用いられ
るヒトＮＧＦ蛋白質は活性体であり、分子中に６個のシ
ステイン残基を有し、Ｎ末端から数えて第１番目のシス
テイン残基と第４番目のシステイン残基とが、第２番目
のシステイン残基と第５番目のシステイン残基とが、第
３番目のシステイン残基と第６番目のシステイン残基と
が、それぞれジスルフィド結合しているものである。上
記のようにして得られるヒトＮＧＦ蛋白質は免疫学的方
法または生物活性に基づく方法で定量する。前者の例と
しては、バイオケミカル アンド バイオフィジカル
リサーチコミュニケーション(Biochem. Biophys. Res.
Commun.)，１５５，４８２(1988)に記載されているエン
ザイムイムノアッセイ(ＥＩＡ)が挙げられる。後者の例
としては、ニワトリ胚脊椎後根神経節(細胞成長因子、
日本組織培養学会編、朝倉書店、１９８４年)、ラット
副腎髄質由来ＰＣ１２細胞〔ブレイン リサーチ(Brain
Research)，１３３，３５０(1977)〕などにおける神経
腺維の伸長、ラット中隔野コリン作動性ニューロンにお
けるコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の誘導など
を指標とした生物活性測定法が挙げられる。The thus obtained human NGF protein used in the present invention is an active form, has 6 cysteine residues in the molecule, and has the first cysteine residue counted from the N-terminal. The 4th cysteine residue, the 2nd cysteine residue and the 5th cysteine residue, the 3rd cysteine residue and the 6th cysteine residue are respectively disulfide-bonded. It is what The human NGF protein obtained as described above is quantified by an immunological method or a method based on biological activity. Examples of the former are biochemical and biophysical.
Research Communication (Biochem. Biophys. Res.
Commun.), 155 , 482 (1988), and the enzyme immunoassay (EIA). Examples of the latter include chicken embryonic dorsal root ganglia (cell growth factor,
Japan Tissue Culture Society, Asakura Shoten, 1984), rat adrenal medulla-derived PC12 cells [Brain Research (Brain
Research), 133 , 350 (1977)] and the like, and the biological activity measurement method using as an index the elongation of nerve fibers and the induction of choline acetyltransferase activity in rat septal area cholinergic neurons.
【００１８】本発明のポリクローナル抗体を製造するた
めには、以上のようにして製造した免疫原を、温血動物
に接種することにより行なわれる。上記抗体の製造に用
いられる温血動物としては、例えば、哺乳温血動物
(例、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ラット、マウス、モルモ
ット、ウマ、ブタ)、鳥類(例、ニワトリ、ハト、アヒ
ル、ガチョウ、ウズラ)などが挙げられる。免疫原を、
温血動物に接種する方法としては、動物に接種する免疫
原は、抗体産生をするに有効な量でよく、例えば、ウサ
ギに１回１００μg〜１mgを２００μl〜１mlの生理食塩
水およびフロイントの完全アジュバントで乳化して、背
部ならびに後肢掌皮下に２〜４週間おきに５回〜７回接
種すると抗体を産生させる場合が多い。このようにし
て、温血動物中に形成された抗体を採取する方法として
は、例えばウサギでは、通常最終接種後７日から１２日
の間に耳静脈から採取し、遠心分離して血清として得ら
れる。得られた抗血清は、通常、抗原を保持させた担体
を用いるアフィティクロマトグラフィーで吸着した画分
を回収することによりポリクローナル抗体を精製するこ
とが出来る。The polyclonal antibody of the present invention is produced by inoculating a warm-blooded animal with the immunogen produced as described above. Examples of warm-blooded animals used for the production of the antibody include, for example, mammal warm-blooded animals.
(Eg, rabbit, sheep, cow, rat, mouse, guinea pig, horse, pig), birds (eg, chicken, pigeon, duck, goose, quail) and the like. Immunogen,
As a method for inoculating a warm-blooded animal, the immunogen to be inoculated to the animal may be an effective amount for producing antibodies. In many cases, the antibody is produced by emulsifying with an adjuvant and subcutaneously inoculating the back and palm of the hind limb 5 to 7 times every 2 to 4 weeks. In this way, as a method for collecting the antibody formed in the warm-blooded animal, for example, in the case of rabbit, it is usually collected from the ear vein between 7 and 12 days after the final inoculation and centrifuged to obtain serum. To be The obtained antiserum can be purified as a polyclonal antibody by collecting a fraction adsorbed by affinity chromatography using a carrier carrying an antigen.
【００１９】このようにして得られた抗体は、ヒトＮＧ
Ｆ蛋白質の免疫化学的測定法やWestern ブロッティング
における試薬として用いることができる。また、この抗
体は診断薬の材料としても利用できる。この抗体を用い
るヒトＮＧＦの検出・定量法は常法により行われるが、
酵素免疫測定法を行なうのが好ましい。該方法として
は、例えば担体上に保持された抗体、および担体上に保
持された抗体とは抗原決定部位を異にする抗体に標識剤
を結合させた結合物を用いてヒトＮＧＦ蛋白質を測定す
ることができる。The antibody thus obtained is human NG
It can be used as a reagent in immunochemical assay of F protein and Western blotting. This antibody can also be used as a material for diagnostic agents. The method for detecting and quantifying human NGF using this antibody is performed by a conventional method.
It is preferable to perform an enzyme immunoassay. As the method, for example, the human NGF protein is measured using an antibody retained on a carrier, and a conjugate in which a labeling agent is bound to an antibody having an antigenic determinant site different from that of the antibody retained on the carrier. be able to.
【００２０】ヒトＮＧＦ蛋白質の測定方法において用い
られる担体上に保持された抗体における担体としては、
例えば、ゲル粒子(例、アガロースゲル〔例、セファロ
ース４Ｂ、セファロース６Ｂ(ファルマシア・ファイン
ケミカル社(スエーデン)製)〕、デキストランゲル
〔例、セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１
００、セファデックスＧ−２００(ファルマシア・ファ
インケミカル社(スエーデン)製)〕)、ポリアクリルアミ
ドゲル〔例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６
０、バイオゲルＰ−１００(バイオラッド・ラボラトリ
ーズ社(米国)製)〕、セルロース粒子〔例、アビセル(旭
化成製)、イオン交換セルロース(例、ジエチルアミノエ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース)〕、物
理的吸着剤〔例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッ
ド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロ
ッド)、シリコン片、スチレン系樹脂 (例、ポリスチレ
ン球、ポリスチレン粒子)、イムノアッセイ用プレート
(例、ヌンク社(デンマーク)製)〕、イオン交換樹脂
｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩ
ＲＣ−５０(ローム・アンド・ハース社(米国)製)、ゼオ
カーブ２２６(パームチット社(西ドイツ)製)〕、弱塩基
性陰イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、
ダウエックス３(ダウケミカル社(米国)製)〕｝などが挙
げられる。担体に抗体を保持させるには、公知の常套手
段を応用し得るが、例えば、“代謝”、第８巻(1971
年)、第６９６頁に記載されているブロムシアン法、グ
ルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、より簡
便な方法として物理的に担体表面に吸着させてもよい。The carrier in the antibody retained on the carrier used in the method for measuring human NGF protein is
For example, gel particles (eg, agarose gel [eg, Sepharose 4B, Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Sweden))], dextran gel [eg, Sephadex G-75, Sephadex G-1
00, Sephadex G-200 (Pharmacia Fine Chemical Co. (Sweden))], polyacrylamide gel [eg, Biogel P-30, Biogel P-6]
0, Biogel P-100 (manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA))], cellulose particles [eg, Avicel (manufactured by Asahi Kasei), ion exchange cellulose (eg, diethylaminoethyl cellulose, carboxymethyl cellulose)], physical adsorbent [eg. , Glass (eg, glass spheres, glass rods, aminoalkyl glass spheres, aminoalkyl glass rods), silicon pieces, styrene resins (eg polystyrene spheres, polystyrene particles), immunoassay plates
(Eg, Nunc (Denmark))], ion exchange resin {eg, weakly acidic cation exchange resin [eg, Amberlite I
RC-50 (manufactured by Rohm and Haas Company (USA)), Zeocurve 226 (manufactured by Palmchid Company (West Germany)), weakly basic anion exchange resin [eg, Amberlite IR-4B,
Dowex 3 (manufactured by Dow Chemical Company (USA))] and the like. In order to retain the antibody on the carrier, a known conventional method can be applied, for example, “Metabolism”, Vol. 8 (1971).
Year), and the bromocyan method and the glutaraldehyde method described on page 696. Further, as a simpler method, it may be physically adsorbed on the surface of the carrier.
【００２１】標識剤を結合させた抗体における標識剤と
しては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質な
どが挙げられるが、酵素を用いるのが好ましい。酵素と
しては、安定で比活性の大きなものが好ましく、ペルオ
キシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等を用いることが
できるが、ペルオキシダーゼが好ましい。ペルオキシダ
ーゼとしては、種々の起源のものを用いることができる
が、その例としてはたとえば西洋わさび、パイナップ
ル、イチジク、甘薯、ソラマメ、トウモロコシなどから
得られるペルオキシダーゼが挙げられ、特に西洋わさび
から抽出されたホースラディッシュ ペルオキシダーゼ
(horseradish peroxidase)(ＨＲＰ)が好ましい。ペルオ
キシダーゼと抗体を結合するにあたり、抗体分子として
のＦab′のチオール基を利用するために、あらかじめペ
ルオキシダーゼにマレイミド基を導入したものを用いる
と好都合である。マレイミド基をペルオキシダーゼに導
入する方法としては、ペルオキシダーゼのアミノ基を介
してマレイミド基を導入することができる。そのために
はＮ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレート
誘導体を用いることができ、好ましくはＮ−(γ−マレ
イミドブチルオキシ)サクシイミド(ＧＭＢＳと略称する
こともある)などが良い。従って、マレイミド基とペル
オキシダーゼとの間に一定の基がはいっていることとな
ってもよい。ＧＭＢＳをペルオキシダーゼに反応させる
には、両者をpＨ約６ないし８の緩衝液中で約１０ない
し５０℃の温度で約１０分ないし２４時間反応させるこ
とによって行われる。該緩衝液としては、たとえば、p
Ｈ７.０の０.１Ｍリン酸緩衝液などが挙げられる。この
ようにして得られたマレイミド化ペルオキシダーゼは、
たとえば、ゲルクロマトグラフィーなどにより精製する
ことができる。該ゲルクロマトグラフィーを行う際に用
いられる担体としては、例えば、セファデックスＧ−２
５〔ファルマシア・ファインケミカル社(スエーデン)
製〕、バイオゲルＰ−２〔バイオラッド・ラボラトリー
ズ社(米国)製〕などが挙げられる。The labeling agent in the antibody to which the labeling agent is bound may be a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance or the like, but it is preferable to use an enzyme. As the enzyme, those which are stable and have a large specific activity are preferable, and peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, glucose oxidase and the like can be used, but peroxidase is preferable. As the peroxidase, those of various origins can be used, and examples thereof include peroxidase obtained from horseradish, pineapple, fig, sweet potato, broad bean, corn, and the like, and horseradish particularly extracted from horseradish. Radish peroxidase
(horseradish peroxidase) (HRP) is preferred. In binding the peroxidase to the antibody, it is convenient to use peroxidase into which a maleimide group has been introduced in advance in order to utilize the thiol group of Fab ′ as an antibody molecule. As a method for introducing a maleimide group into peroxidase, a maleimide group can be introduced via an amino group of peroxidase. For that purpose, an N-succinimidyl-maleimide-carboxylate derivative can be used, preferably N- (γ-maleimidobutyloxy) succinimide (sometimes abbreviated as GMBS). Therefore, a certain group may be present between the maleimide group and peroxidase. The reaction of GMBS with peroxidase is carried out by reacting both in a buffer solution having a pH of about 6 to 8 at a temperature of about 10 to 50 ° C. for about 10 minutes to 24 hours. Examples of the buffer include p
Examples include H7.0 0.1M phosphate buffer. The maleimidated peroxidase thus obtained is
For example, it can be purified by gel chromatography or the like. Examples of the carrier used when performing the gel chromatography include Sephadex G-2.
5 [Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)
Manufactured by Bio-Rad Laboratories (USA), and the like.
【００２２】マレイミド化ペルオキシダーゼと抗体分子
との反応は、両者を緩衝液中で約０℃ないし４０℃の温
度で、約１ないし４８時間反応させることにより行うこ
とができる。該緩衝液としては、例えば、pＨ６.０の５
mＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含む０.１Ｍ
リン酸緩衝液などが挙げられる。このようにして得られ
たペルオキシダーゼ標識抗体は、例えばゲルクロマトグ
ラフィーなどにより精製することができる。該ゲルクロ
マトグラフィーを行う際に用いられる担体としては、例
えば、セファデックスＧ−２５〔ファルマシア・ファイ
ンケミカル社（スエーデン)製〕、バイオゲルＰ−２
〔バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製〕などが挙
げられる。さらにペルオキシダーゼにチオール基を導入
し、マレイミド化された抗体分子と反応させても良い。
ペルオキシダーゼ以外の酵素を抗体に直接結合させるに
は、ペルオキシダーゼの場合に準じて行うことができ、
また、自体公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、水溶性カルボジイミド法などが用いられる。The reaction between the maleimidated peroxidase and the antibody molecule can be carried out by reacting both in a buffer solution at a temperature of about 0 ° C. to 40 ° C. for about 1 to 48 hours. The buffer solution is, for example, 5 at pH 6.0.
0.1M containing mM ethylenediaminetetraacetic acid sodium salt
Examples include phosphate buffer. The peroxidase-labeled antibody thus obtained can be purified by, for example, gel chromatography. Examples of the carrier used when performing the gel chromatography include Sephadex G-25 [manufactured by Pharmacia Fine Chemicals (Sweden)], Biogel P-2.
[Bio-Rad Laboratories (USA)] and the like. Further, a thiol group may be introduced into peroxidase and reacted with a maleimidated antibody molecule.
To directly bind an enzyme other than peroxidase to the antibody, it can be carried out according to the case of peroxidase,
Further, a glutaraldehyde method, a periodic acid method, a water-soluble carbodiimide method, etc. which are known per se are used.
【００２３】本発明の測定系における被検試料として
は、尿、血清、血漿、髄液等の体液、あるいは、動物細
胞や菌体の抽出液またはその培養上清が挙げられる。本
発明の測定方法の例として、標識剤がペルオキシダーゼ
の場合について以下に具体的に説明するが、ペルオキシ
ダーゼに限定されるものではない。 まず、：担体に保持された抗体に測定すべきヒトＮＧ
Ｆ含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行った後、
これに前記で得られたペルオキシダーゼと抗ヒトＮＧＦ
蛋白質抗体との結合物を加えて反応させる。この本測定
系における被検試料としては、尿、血清、血漿、髄液等
の体液、あるいは、動物細胞や菌体の抽出液またはその
培養上清が挙げられる。 ：で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基質
を加え、生じた物質の吸光度もしくは蛍光強度を測定す
ることにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。 ：上記〜の操作を既知量のヒトＮＧＦ蛋白質の標
準溶液に対してあらかじめ行い、ヒトＮＧＦ蛋白質の吸
光度もしくは蛍光強度との関係を標準曲線として作成し
ておく。 ：未知量のヒトＮＧＦ蛋白質を含む分析対象物(被検
試料)について得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準
曲線にあてはめ、分析対象物中のヒトＮＧＦ蛋白質の量
を測定する。 また、抗ヒトＮＧＦ蛋白質抗体はWestern ブロッティン
グ〔W.N.Burnette, アナリティカル バイオケミストリ
ー(Analytical Biochemistry), １１２，１９５(198
1)〕によるヒトＮＧＦ蛋白質の検出・定量に利用するこ
とができる。Examples of test samples in the assay system of the present invention include body fluids such as urine, serum, plasma, and cerebrospinal fluid, or extracts of animal cells or fungi or culture supernatants thereof. As an example of the measuring method of the present invention, the case where the labeling agent is peroxidase will be specifically described below, but the present invention is not limited to peroxidase. First :: Human NG to be measured by the antibody retained on the carrier
After the F-containing analyte is added and an antigen-antibody reaction is performed,
The peroxidase and anti-human NGF obtained above were added to this.
A reaction product is added by adding a bound substance to the protein antibody. Examples of test samples in this measurement system include body fluids such as urine, serum, plasma, and cerebrospinal fluid, or extracts of animal cells or fungi or culture supernatants thereof. A substrate of peroxidase is added to the reaction product obtained in step (1), and the enzyme activity of the reaction product is determined by measuring the absorbance or fluorescence intensity of the resulting substance. : The above steps (1) to (3) are performed in advance on a standard solution of a known amount of human NGF protein, and the relationship with the absorbance or fluorescence intensity of human NGF protein is prepared as a standard curve. : The absorbance or fluorescence intensity obtained for an analyte (test sample) containing an unknown amount of human NGF protein is applied to a standard curve to measure the amount of human NGF protein in the analyte. In addition, anti-human NGF protein antibody was analyzed by Western blotting [WN Burnette, Analytical Biochemistry, 112 , 195 (198).
1)] can be used for detection / quantification of human NGF protein.
【００２４】以下にWestern ブロッティングの具体例を
示す。ヒトＮＧＦ蛋白質を含む試料を、例えばsample b
uffer〔U.K.Laemmli, ネイチャー(Nature), ２２７，６
８０(1970)〕に溶解する。この場合、還元剤として２−
メルカプトエタノールを加える場合(還元条件下)と加え
ない場合(非還元条件下)があり、そのいずれでもよい。
この溶液を約１００℃で５分間加熱したのち、電気泳動
にかける。電気泳動としては、蛋白質が分離できるもの
なら何でも良く、具体的には例えばＳＤＳを含むポリア
クリルアミドゲル電気泳動などが挙げられる。泳動後の
ゲルから蛋白質をニトロセルロース膜に移す。この方法
自体は公知であり、例えば、Burnette の方法〔アナリ
ティカル バイオケミストリー(Analytical Biochemist
ry), １１２，１９５(1981)〕などが挙げられる。次に
ニトロセルロース膜のヒトＮＧＦを免疫学的方法で検出
する。即ち、ニトロセルロース膜を例えば３％ゼラチン
溶液でブロッキングしたのち、第１抗体反応を行う。第
１抗体として用いるヒトＮＧＦ蛋白質抗体としては抗血
清でも精製したものでも良いが、精製したものの方が好
ましい。ブロッキング後の第１抗体反応の条件として
は、該膜上のヒトＮＧＦ蛋白質が第１抗体と結合できる
条件であれば何でも良く、例えば室温で約４〜１６時間
で行う。上記の第１抗体反応ののち、第２抗体反応を行
う。用いる第２抗体としては、第１抗体と結合でき、か
つ検出が可能なものであれば何でも良く、例えば、標識
酵素と結合したＩgＧなどが挙げら れる。標識酵素の具
体例としては、ホースラディシュパーオキシダーゼ(Ｈ
ＲＰ)、アルカリファスファターゼなどが挙げられる。
第２抗体反応の条件としては第１抗体に第２抗体が結合
できる条件であれば何でも良く、例えば室温で約１時間
行う。上記の第２抗体反応ののち、発色を行い、ニトロ
セルロース膜上のヒトＮＧＦ蛋白質のバンドを検出す
る。上記のWestern ブロッティングでは、約５０ng以上
のヒトＮＧＦ蛋白質であれば検出が可能であり、種々の
量のヒトＮＧＦ蛋白質のバンドの濃さと、被検体のバン
ドの濃さを比較することにより、被検体中のヒトＮＧＦ
蛋白質を定量することもできる。A specific example of Western blotting is shown below. A sample containing human NGF protein is prepared, for example, from sample b
uffer [UK Laemmli, Nature, 227 , 6
80 (1970)]. In this case, 2-
There are cases where mercaptoethanol is added (reducing conditions) and cases where mercaptoethanol is not added (non-reducing conditions), and either of them may be used.
This solution is heated at about 100 ° C. for 5 minutes and then subjected to electrophoresis. Any electrophoresis can be used as long as it can separate proteins, and specific examples thereof include polyacrylamide gel electrophoresis including SDS. Transfer the protein from the gel after electrophoresis to a nitrocellulose membrane. This method is known per se, and for example, the method of Burnette [Analytical Biochemist
ry), 112 , 195 (1981)] and the like. Next, human NGF on the nitrocellulose membrane is detected by an immunological method. That is, after blocking the nitrocellulose membrane with, for example, a 3% gelatin solution, the first antibody reaction is performed. The human NGF protein antibody used as the first antibody may be antiserum or purified one, but the purified one is preferable. The conditions of the first antibody reaction after blocking may be any conditions as long as the human NGF protein on the membrane can bind to the first antibody, for example, at room temperature for about 4 to 16 hours. After the above-mentioned first antibody reaction, a second antibody reaction is carried out. The second antibody used may be any antibody that can bind to the first antibody and can be detected, and examples thereof include IgG bound to a labeling enzyme. Specific examples of the labeling enzyme include horseradish peroxidase (H
RP), alkaline phosphatase and the like.
The condition of the second antibody reaction may be any condition as long as the second antibody can bind to the first antibody, and for example, it is carried out at room temperature for about 1 hour. After the second antibody reaction described above, color is developed and the band of human NGF protein on the nitrocellulose membrane is detected. In the above Western blotting, it is possible to detect a human NGF protein of about 50 ng or more, and by comparing the band density of various amounts of human NGF protein with the band density of the test sample, Human NGF in
It is also possible to quantify the protein.
【００２５】なお、本発明明細書および図面において、
塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢ Commission on Biochemical Nomenclatur
e による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づ
くものであり、その例を次にあげる。またアミノ酸に関
して光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｃ ：シトニン Ｇ ：グアニン Ｔ ：チミン Ａ，Ａla ：アラニン Ｒ，Ａrg ：アルギニン Ｎ，Ａsn ：アスパラギン Ｄ，Ａsp ：アスパラギン酸 Ｃ，Ｃys ：システイン Ｑ，Ｇln ：グルタミン Ｅ，Ｇlu ：グルタミン酸 Ｇ，Ｇly ：グリシン Ｈ，Ｈis ：ヒスチジン Ｉ，Ｉle ：イソロイシン Ｌ，Ｌeu ：ロイシン Ｋ，Ｌys ：リジン Ｍ，Ｍet ：メチオニン Ｆ，Ｐhe ：フェニールアラニン Ｐ，Ｐro ：プロリン Ｓ，Ｓer ：セリン Ｔ，Ｔhr ：スレオニン Ｗ，Ｔrp ：トリプトファン Ｙ，Ｔyr ：チロシン Ｖ，Ｖal ：バリン 後述の参考例６で得られた形質転換ハイブリドーマＣＨ
Ｏ−Ｄ３１−１０は平成１年１１月１５日から財団法人
発酵研究所(ＩＦＯ)に受託番号ＩＦＯ ５０２１７とし
て寄託されている。また該ハイブリドーマは平成１年１
２月７日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
(ＦＲＩ)に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７４として寄
託されている。In the specification and drawings of the present invention,
When displaying abbreviations for bases and amino acids, IUPAC
-IUB Commission on Biochemical Nomenclatur
It is based on the abbreviations based on e or the abbreviations commonly used in this field, and examples are as follows. When amino acids may have optical isomers, the L form is shown unless otherwise specified. DNA: Deoxyribonucleic acid A: Adenine C: Cytonin G: Guanine T: Thymine A, Ala: Alanine R, Arg: Arginine N, Asn: Asparagine D, Asp: Aspartic acid C, Cys: Cysteine Q, Gln: Glutamine E, Glu : Glutamic acid G, Gly: Glycine H, His: Histidine I, Ile: Isoleucine L, Leu: Leucine K, Lys: Lysine M, Met: Methionine F, Phe: Phenylalanine P, Pro: Proline S, Ser: Serine T, Thr: Threonine W, Trp: Tryptophan Y, Tyr: Tyrosine V, Val: Valine Transformed hybridoma CH obtained in Reference Example 6 described later
O-D31-10 has been deposited at the Fermentation Research Institute (IFO) with a deposit number IFO 50217 from November 15, 1991. In addition, the hybridoma
February 7, Ministry of International Trade and Industry, Institute of Industrial Technology Microbial Industrial Technology Research Institute
(FRI) with deposit number FERM BP-2674.
【００２６】[0026]
【実施例】以下に、実施例、参考例を挙げて、本発明を
さらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定され
ることはない。 参考例１ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(1) ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンテック(Clontech)社〕を大腸菌ＮＭ
５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上に約３×１
０4クローンずつ撒いた。プラーグをナイロンメンブラ
ン(アマシャム社、ハイボンド−Ｎ)上に移した後、０.
５Ｎ ＮaＯＨ−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸し、フ
ァージＤＮＡを変性させた後、０.５Ｍ Ｔris−ＨＣl
(pＨ８.０)−１.５Ｍ ＮaＣl溶液に６分間浸した。本
メンブランを２×ＳＳＣ溶液に浸し、風乾後８０℃、２
時間処理することによりＤＮＡをメンブランに固定し
た。一方、既知〔ウルリッチ(Ullrich,A.)ら、ネイチャ
ー(Nature)３０３，８２１(1983)〕のヒトＮＧＦ遺伝子
を参考にしてヒトβＮＧＦをコードするＤＮＡ(０.３８
kb)を化学合成し、これをＤＮＡラベリングキット(ニッ
ポンジーン社)を用いて32Ｐで標識したものをプローブ
とした。ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブ
を含む、６×ＳＳＣ(１×ＳＳＣ＝０.１５Ｍ ＮaＣ
l，０.０１５Ｍクエン酸ナトリウム)，５×Denhardt's,
０.５％ＳＤＳ，２０μg／ml変性サケ***ＤＮＡ溶液中
１０ml中で６５℃、１６時間、保温した。反応後、フィ
ルターを２×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で室温で５
分ずつ３回、１×ＳＳＣ，０.１％ＳＤＳ溶液中で、６
０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させ
た後、ラジオオートグラムをとり、プローブと反応する
クローンを検索した。この方法により得られたクローン
λβＬＮ２１１３よりデイヴィス（Ｄａｖｉｓ）らの方
法(Davisら、〔アドバンスト・バクテリアル・ジェネテ
ィクス( Advanced Bacterial Genetics)〕,Cold Spr
ing HarborLaboratory 1980)によりファージＤＮＡを抽
出した。次にλβＬＮ２１１３をＳmaＩとＡpaＩで切断
し、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ(約１kb)を切り出
し、プラスミドpＢluescriptIIＫ(トーヨーボーより購
入)のＳmaＩ，ＡpaＩ部位を挿入し、プラスミドpＮＧＦ
Ｐ１０７Ｇを得た。挿入された部分の塩基配列をシーク
ナーゼ(トーヨーボー)を用いて決定した〔図１〕〜〔図
３〕の連続したもの)（配列表：配列番号１）。決定さ
れた塩基配列はネイチャー(Nature)，３０３，８２１(1
983)に記載されている配列と、蛋白コード領域では完全
に一致した。上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを
制限酵素ＢglIIで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片
(１.８kb)を単離した。一方、動物細胞用の発現ベクタ
ーpＫＳＶ−１０(ファルマシア)を制限酵素ＢglIIで切
断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片(１.８
kb)とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。この反応液を用
いてエシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１の形
質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換体の１つ
〔エシェリヒア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１／pＭ
ＮＧＦ１０１〕から単離したプラスミドをpＭＮＧＦ１
０１と命名した〔図４〕。EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto. Reference Example 1 Construction of Human NGF Expression Vector (1) A λEMBL3 genomic library prepared from human leukocyte DNA [Clontech] was used for Escherichia coli NM.
After infecting 538, about 3 × 1 on a soft agar plate
0 4 clones were spread each. After transferring the prag onto a nylon membrane (Amersham, Hibond-N),
After immersing in 5N NaOH-1.5M NaCl solution for 6 minutes to denature the phage DNA, 0.5M Tris-HCl was added.
It was immersed in a (pH 8.0) -1.5 M NaCl solution for 6 minutes. Soak this membrane in 2 × SSC solution, air dry, and then 2 ℃.
The DNA was immobilized on the membrane by treating for a period of time. On the other hand, a DNA encoding human βNGF (0.38) with reference to a known human NGF gene [Ullrich, A. et al., Nature 303 , 821 (1983)].
(kb) was chemically synthesized, and this was labeled with 32 P using a DNA labeling kit (Nippon Gene Co., Ltd.) as a probe. The DNA-immobilized filter was attached to a 6 × SSC (1 × SSC = 0.15M NaCl) containing a labeled probe.
l, 0.015M sodium citrate), 5 x Denhardt's,
The mixture was incubated in 10 ml of a 0.5% SDS, 20 μg / ml denatured salmon sperm DNA solution at 65 ° C. for 16 hours. After the reaction, the filter was placed in 2 × SSC, 0.1% SDS solution at room temperature for 5
6 times in 1 × SSC, 0.1% SDS solution 3 times each minute
It was washed at 0 ° C for 60 minutes. After the washed filter was dried, a radio-autogram was taken to search for a clone that reacts with the probe. From the clone λβLN2113 obtained by this method, the method of Davis et al. (Davis et al., [Advanced Bacterial Genetics]], Cold Spr
Phage DNA was extracted according to Ining Harbor Laboratory 1980). Next, λβLN2113 was cleaved with SmaI and ApaI, the DNA containing the human NGF gene (about 1 kb) was excised, the SmaI and ApaI sites of plasmid pBluescriptIIK (purchased from Toyo Bo) were inserted, and plasmid pNGF was inserted.
P107G was obtained. The nucleotide sequence of the inserted portion was determined using Sequenase (Toyo Bo) [ consecutive sequence of [Fig . 1 ] to [Fig. 3 ] ) (sequence listing: SEQ ID NO: 1) . The determined nucleotide sequence is Nature, 303 , 821 (1
The sequence described in 983) was completely identical in the protein coding region. A DNA fragment containing human NGF obtained by cleaving the above phage λβLN2113 DNA with a restriction enzyme BglII.
(1.8 kb) was isolated. On the other hand, the expression vector pKSV-10 (Pharmacia) for animal cells was cleaved with the restriction enzyme BglII to give a DNA fragment containing the above human NGF gene (1.8).
kb) and T4 DNA ligase. Using this reaction solution, Escherichia coli DH1 was transformed, and one of the transformants resistant to ampicillin [Escherichia coli DH1 / pM
The plasmid isolated from NGF101] was designated as pMNGF1.
It was named 01 [ Fig. 4 ] .
【００２７】 参考例２ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(2) 参考例１で得られたプラスミドpＮＧＦ１０７Ｇを制限
酵素ＢclＩおよびＡpaＩで切断し、ヒトＮＧＦ遺伝子を
含むＤＮＡ断片(０.８kb)を単離した。この０.８kb Ｂc
lＩ−ＡpaＩ断片と化学合成フダプターＳＮ１（配列
表：配列番号２），ＳＮ２（配列表：配列番号３）およ
びＳＮ３（配列表：配列番号４）〔図５〕および〔図
６〕参照)とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した
のち、ＢglIIで 切断することによって０.８ kb ＨindI
II−ＢglIIＤＮＡ断片が得られた。プラスミドpＳＶ２
−ｇｐｔ〔サイエンス(Science),２０９，１４２２（１
９８０）〕を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨindIIIで切断し、
ＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb ＥcoＲＩ−ＨindI
IIＤＮＡ断片を単離した。次にプラスミドpＭＴＶdhfr
〔ネイ チャー(Nature),２９４，２２８(1981)〕より p
olyＡ付加領域を含む１.６kbＢglII−ＥcoＲＩ断片を単
離した。上記のＳＶ４０プロモーターを含む２.６kb
ＥcoＲＩ−ＨindIIIＤＮＡ断片、ヒトＮＧＦ遺伝子を含
む０.８kb ＨindIII−ＢglIIＤＮＡ断片およびpolyＡ付
加領域を含む１.６kb ＢglII−ＥcoＲＩ断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結した。この反応液を用いてエシェリヒ
ア コリ(Escherichia coli)ＤＨ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体〔エシェリヒア コリ
(Escherichia coli) ＤＨ１／pＭＮＧＦ２０１〕から単
離したプラスミドをpＭＮＧＦ２０１と命名した。Reference Example 2 Construction of Human NGF Expression Vector (2) The plasmid pNGF107G obtained in Reference Example 1 was cleaved with restriction enzymes BclI and ApaI, and a DNA fragment (0.8 kb) containing the human NGF gene was isolated. . This 0.8 kb Bc
lI-ApaI fragment and chemically synthesized SN1 (sequence
Table: SEQ ID NO: 2) , SN2 (SEQ ID NO: 3) and SN3 (SEQ ID NO: 4) [ see FIG. 5 ] and [ FIG. 6 ] ), ligated with T4 DNA ligase, and then BglII By cutting with 0.8 kb HindI
A II-BglII DNA fragment was obtained. Plasmid pSV2
-Gpt [Science, 209 , 1422 (1
980)] with the restriction enzymes EcoRI and HindIII,
2.6 kb EcoRI-HindI containing SV40 promoter
The II DNA fragment was isolated. Then the plasmid pMTVdhfr
From [Nature, 294 , 228 (1981)] p
A 1.6 kb BglII-EcoRI fragment containing the olyA addition region was isolated. 2.6 kb containing the above SV40 promoter
The EcoRI-HindIII DNA fragment, the 0.8 kb HindIII-BglII DNA fragment containing the human NGF gene and the 1.6 kb BglII-EcoRI fragment containing the polyA addition region were added to T4DN.
It was ligated with A ligase. Using this reaction mixture, Escherichia coli DH1 was transformed,
Transformants resistant to ampicillin [Escherichia coli
The plasmid isolated from (Escherichia coli) DH1 / pMNGF201] was named pMNGF201.
【００２８】 参考例３ ヒトＮＧＦ発現ベクターの構築(3) 参考例２で得られたプラスミドpＭＮＧＦ２０１をＨind
IIIで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ Ｋlenowフラグメン
ト反応により平滑化したのち、ＢglIIで切断して約０.
８kb ＤＮＡ断片を分離した。一方プラスミドpＴＢ３９
９(特開昭６１−６３２８２に記載)をＥcoＲＩで切断
後、Ｋlenowフラグメント反応により平滑化したのち、
ＢglIIで切断して約３.９kb ＤＮＡ断片を得た。これら
２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環状
化し、プラスミドpＴＢ１０５４を得た。次に、ハムス
ターＤＨＦＲcＤＮＡを有するプラスミドpＴＢ３４８
(特開昭６１−６３２８２に記載)をＣlaＩで切断後アル
カリ性フォスファターゼで処理し、ＣlaＩで切断したp
ＴＢ１０５４より分離精製された２.４kb ＤＮＡ断片
(ＭnＬ ＶＬＴＲ、ヒトＮＧＦ(hＮＧＦ)遺伝子、および
ＳＶ４０ＤＮＡ由来スプライス 領域、ポリ〔Ａ〕付加
領域を含む)と混合して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応によ
り ヒトＮＧＦ発現ベクターpＴＢ１０５８を構築した
(図７および８参照)。Reference Example 3 Construction of human NGF expression vector (3) Hind the plasmid pMNGF201 obtained in Reference Example 2
Cleavage with III and blunting with the DNA polymerase Klenow fragment reaction, followed by digestion with BglII to about 0.
An 8 kb DNA fragment was isolated. On the other hand, plasmid pTB39
9 (described in JP-A-61-13282) was cleaved with EcoRI and then blunted by Klenow fragment reaction.
Cleavage with BglII gave an approximately 3.9 kb DNA fragment. These two DNA fragments were circularized by T4 DNA ligase reaction to obtain plasmid pTB1054. Then the plasmid pTB348 containing the hamster DHFR cDNA.
(Described in JP-A-61-63282) was digested with ClaI, treated with alkaline phosphatase, and digested with ClaI.
2.4 kb DNA fragment separated and purified from TB1054
(MnL VLTR, human NGF (hNGF) gene, and SV40 DNA-derived splice region, poly [A] addition region) were mixed to construct human NGF expression vector pTB1058 by T4 DNA ligase reaction.
(See Figures 7 and 8).
【００２９】参考例４ ＣＨＯ細胞の形質転換 ファルコンシャーレ(直径６cm)に５％牛胎児血清を含む
ハム１２培地を入れ、ハムスターＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞
を３７℃で一晩培養した。培養後、この細胞(７×１０5
個／ディッシュ)を、実施例１で得られたヒトＮＧＦ発
現ベクターpＴＢ１０５８(１０μg)を用いてグラハムら
の方法〔ヴィロロジー(Virology)５２：４５６−４６７
(1973)〕に従って形質転換した。４時間３７℃で培養
後、新たな培地に代えて培養を続けた。２日後に、５％
透析牛胎児血清および３５μg／mlのプロリンを含むダ
ルベッコ改変ＭＥＭ培地で液替えを行って、以後この選
択培地で培養を続けると約２〜３週間後に、ＤＨＦＲ+
となって増殖した細胞がコロニーを形成した。Reference Example 4 Transformation of CHO Cells Hamster 12 medium containing 5% fetal bovine serum was placed in a Falcon dish (diameter 6 cm), and hamster DHFR - CHO cells were cultured at 37 ° C. overnight. After culturing, the cells (7 × 10 5
Cells / dish) using the human NGF expression vector pTB1058 (10 μg) obtained in Example 1 by the method of Graham et al. [Virology 52 : 456-467].
(1973)]. After culturing at 37 ° C. for 4 hours, the culture was continued by replacing with a new medium. 2 days later, 5%
When the solution was changed in Dulbecco's modified MEM medium containing dialyzed fetal bovine serum and 35 μg / ml proline, and the culture was continued in this selective medium thereafter, about 2-3 weeks later, DHFR +
The cells that grew to form colonies.
【００３０】参考例５ 形質転換体のクローニングおよ
びヒトＮＧＦ遺伝子 の発現 参考例４で得た形質転換細胞のクローニングを、公知の
方法(例えばリミテッド ダイリューション法)に従って
行ない、形質転換体(クローン化されたもの)ＣＨＯ−Ｄ
５，ＣＨＯ−Ｄ４２およびＣＨＯ−Ｍ３６を得た。クロ
ーニング終了後は、各クローン細胞を、５％牛胎児血
清，３５μg／mlのプロリン，５０IU／mlペニシリンお
よび５０μg／mlストレプトマイシンを含むダルベッコ
改変ＭＥＭ培地にて培養した。分離された各クローンの
細胞はリンブロディッシュにまき、細胞が約８０％コン
フルエントになった時、新しい培地と交換して、７２時
間培養後、培養上清中のＮＧＦをＥＩＡ〔ベーリンガー
社；バイオケミカル バイオフィジカル リサーチ コ
ミュニケーション(Biochem. Biophys. Res. Commun.,１
５５，４８２(1988))〕で定量した。ヒトＮＧＦ生産量
の高いクローンを表１に示す。なお、形質転換されてい
ないＣＨＯ細胞の培養上清にはＮＧＦは検出されなかっ
た。 以上の結果から、ヒトＮＧＦ遺伝子を恒久的に発現する
ＣＨＯ細胞は該遺伝子を一時的に発現するＣＯＳ細胞よ
りも多量のヒトＮＧＦを生産することができることが明
らかになった。Reference Example 5 Cloning and transformation of transformants
Expression of human and human NGF gene Cloning of the transformed cells obtained in Reference Example 4 was performed according to a known method (for example, limited dilution method) to obtain transformants (cloned) CHO-D.
5, CHO-D42 and CHO-M36 were obtained. After the completion of cloning, each clone cell was cultured in Dulbecco's modified MEM medium containing 5% fetal bovine serum, 35 μg / ml proline, 50 IU / ml penicillin and 50 μg / ml streptomycin. The cells of each isolated clone were spread on Lymbrodishes, and when the cells were about 80% confluent, the medium was replaced with a new medium, and after culturing for 72 hours, NGF in the culture supernatant was transferred to EIA [Boehringer; Chemical Biophysical Research Communication (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1
55 , 482 (1988))]. Table 1 shows clones with high human NGF production. NGF was not detected in the culture supernatant of untransformed CHO cells. From the above results, it was revealed that CHO cells that permanently express the human NGF gene can produce a larger amount of human NGF than COS cells that transiently express the gene.
【００３１】 参考例６ ヒトＮＧＦ高産生ＣＨＯ細胞株 実施例３と同様の方法で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｄ
３１を１０nＭメントレキセート(ＭＴＸ)を含むダルベ
ッコ改変ＭＥＭ(５％牛胎児血清３５μg/mlプロリンを
含む)にて培養した。このクローンは、この濃度のＭＴ
Ｘでは正常な増殖を示したので、ＭＴＸ濃度を１００n
Ｍに上げて継代し培養をつづけた。更に、ＭＴＸ濃度を
１μＭとすると大半の細胞が死滅したが、３〜４日に液
替を行って培養を続けると１０5個の細胞当り数個の細
胞がコロニー状に増殖をはじめた。 これらの細胞が十
分増殖したのち、１０μＭ ＭＴＸの培養液にて継代す
ると再び大半の細胞が死滅し、数個の細胞が、コロニー
状に増殖をはじめた。このようにして得られた細胞は１
０μＭ ＭＴＸ存在下に、安定した正常な増殖を示し、
又ＭＴＸを含まない培養液に戻して増殖させ数代継代し
たのち、１０μＭＭＴＸ存在下に培養しても正常に増殖
した。この１０μＭ ＭＴＸに耐性のＣＨＯ−Ｄ３１−
１０細胞(ＩＦＯ ５０２１７，ＦＥＲＭ ＢＰ−２６
７４)を参考例５と同じ条件で培養したところ、４mg／l
のヒトＮＧＦが培地中に生産されている ことがＥＩＡ
で分かった。Reference Example 6 Human NGF Highly Producing CHO Cell Line Transformant CHO-D obtained by the same method as in Example 3
31 was cultured in Dulbecco's modified MEM (containing 35 μg / ml proline of 5% fetal bovine serum) containing 10 nM mentholxate (MTX). This clone has this concentration of MT
X showed normal growth, so the MTX concentration was 100n.
It was raised to M and subcultured to continue culture. Furthermore, when the MTX concentration was 1 μM, most of the cells died, but when the liquid was changed on 3 to 4 days and the culture was continued, several cells started growing in colony form per 10 5 cells. After these cells proliferated sufficiently, when subcultured in a culture medium of 10 μM MTX, most of the cells died again, and a few cells began to grow in a colony. The cells thus obtained are 1
Shows stable normal growth in the presence of 0 μM MTX,
Further, after returning to a culture solution containing no MTX and proliferating it for several passages, it was proliferated normally even when cultured in the presence of 10 μM MTX. CHO-D31- resistant to this 10 μM MTX
10 cells (IFO 50217, FERM BP-26
No. 74) was cultured under the same conditions as in Reference Example 4 to give 4 mg / l.
Of human NGF in EIA
I understand.
【００３２】参考例７ ヒトＮＧＦの単離 参考例６で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を５％
牛胎児血清，３５μg／mlプロリン，５０IU／mlペニシ
リン，５０μg／mlストレプトマイシンおよび１０μＭ
メソトレキセートを含むダルベッコ改変培地で５％炭酸
ガス中で、３０℃、７日間大量に培養したところ、培地
中に２.４mg／lのヒトＮＧＦが生産されていることがＥ
ＩＡで分かった。培養液を遠心分離し、その培養上清
２.２lにＡＰＭＳＦを最終濃度０.１mＭになるように添
加し、０.２Ｎ酢酸でpＨ６.０に補正したのち遠心分離
した。得られた上清を０．１Ｍリン酸緩衝液 pＨ６.０
−１mＭ ＥＤＴＡで平衡化させたＳ− Sepharose カラ
ム(２.６cm×１４cm)に吸着させ、０.１Ｍリン酸緩衝液
pＨ６.０−０.１５Ｍ ＮaＣl−１mＭ ＥＤＴＡ−１０
％グリセロールで洗浄したのち、５０mＭ Ｔris−ＨＣ
l pＨ７.５−０.７Ｍ ＮaＣl−１mＭ ＥＤＴＡ−１
０％グリセロールで溶出した。ヒトＮＧＦを含むフラク
ションを集め、ダイアフローセル(タイプＹＭ１０，ア
ミコン社)で約３０倍に濃縮した。得られた濃縮液を２
０mＭ Ｔris−ＨＣl pＨ７.４−０.５Ｍ ＮaＣl−１
mＭ ＥＤＴＡ−１０％グリセロールで平衡化させたSep
hacryl Ｓ−１００ＨＲ(２００ml，１.６cm×１００c
m)でゲルろ過した。ヒトＮＧＦを含むフラクションを集
めセントリプレップ１０(アミコン社)で約１０倍に濃縮
した。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、ヒトＮＧ
Ｆを精製した。すなわち、該濃縮液を Asahipak ＯＤＰ
−５０(１０.０mmID×２５０mmL)カラムにかけ、０.１
％トリフルオロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリルの
濃度勾配にかけ、ヒトＮＧＦの精製標品１.２mg(アミノ
酸分析より)を得た。本精製の要約を表２に示す。ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および逆相ＨＰＬ
Ｃの結果、得られた組換え型ヒトＮＧＦの純度は９４％
であった。Reference Example 7 Isolation of human NGF 5% of the cell line CHO-D31-10 obtained in Reference Example 6 was used.
Fetal bovine serum, 35 μg / ml proline, 50 IU / ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin and 10 μM
When cultured in Dulbecco's modified medium containing methotrexate in 5% carbon dioxide at 30 ° C. for 7 days in a large amount, 2.4 mg / l of human NGF was produced in the medium.
I found it in IA. The culture solution was centrifuged, and to 2.2 l of the culture supernatant, APMSF was added to a final concentration of 0.1 mM, pH was adjusted to 6.0 with 0.2N acetic acid, and then centrifuged. The obtained supernatant is used as 0.1M phosphate buffer pH 6.0.
Adsorb on S- Sepharose column (2.6 cm x 14 cm) equilibrated with -1 mM EDTA, and use 0.1 M phosphate buffer.
pH 6.0-0.15M NaCl-1 mM EDTA-10
After washing with 50% glycerol, 50 mM Tris-HC
pH 7.5-0.7M NaCl-1 mM EDTA-1
Eluted with 0% glycerol. Fractions containing human NGF were collected and concentrated about 30 times with a diaflow cell (type YM10, Amicon). 2 of the concentrate obtained
0 mM Tris-HCl pH 7.4-0.5M NaCl-1
Sep equilibrated with mM EDTA-10% glycerol
hacryl S-100HR (200ml, 1.6cm × 100c
Gel filtered through m). Fractions containing human NGF were collected and concentrated about 10 times with Centriprep 10 (Amicon). The obtained concentrated solution was subjected to reverse phase HPLC to obtain human NG.
F was purified. That is, the concentrated solution is added to Asahipak ODP.
-50 (10.0mm ID x 250mmL) column, 0.1
By subjecting to a concentration gradient of 0-90% acetonitrile containing% trifluoroacetic acid, 1.2 mg (from amino acid analysis) of a purified preparation of human NGF was obtained. A summary of this purification is shown in Table 2. SD
S-polyacrylamide gel electrophoresis and reverse phase HPL
As a result of C, the purity of the recombinant human NGF obtained was 94%.
Met.
【００３３】 表２ 組換え型ヒトＮＧＦの精製の要約 ──────────────────────────── 液量 全蛋白 全ヒトＮＧＦ 収率 (ml) (mg) (mg) (％) ──────────────────────────── 培養上清 2,200 11,000 5.3 100 S-Sepharose 4.5 24 5.0 94 Sephacryl S-100 2.5 3.7 4.7 89 逆相ＨＰＬＣ 1.3 1.6 30 ──────────────────────────── こうして得られた精製標品を１６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけ、銀染色を行ったところ、１３キロ
ダルトン(kDa)の単一なバンドが認められた。得られた
精製ヒトＮＧＦをガラス製加水分解用試験管にとり減圧
下で乾燥後、４％チオグチコール酸を含む５.７Ｎ塩酸
を加えて減圧下に封管したのち、１１０℃，２４時間加
水分解した。加水分解後、塩酸を除去し、残渣を０.０
２Ｎ塩酸に溶解してアミノ酸分析を実施した。その結果
を表３に示す。Table 2 Summary of purification of recombinant human NGF ──────────────────────────── Liquid volume Total protein Total human NGF yield Rate (ml) (mg) (mg) (%) ──────────────────────────── Culture supernatant 2,200 11,000 5.3 100 S- Sepharose 4.5 24 5.0 94 Sephacryl S-100 2.5 3.7 4.7 89 Reversed phase HPLC 1.3 1.6 30 ──────────────────────────── When the purified sample was subjected to 16% polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining was performed, a single band of 13 kilodalton (kDa) was observed. The obtained purified human NGF was placed in a glass hydrolysis test tube, dried under reduced pressure, added with 5.7 N hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid, sealed under reduced pressure, and then hydrolyzed at 110 ° C. for 24 hours. . After hydrolysis, hydrochloric acid was removed and the residue was adjusted to 0.0
Amino acid analysis was carried out by dissolving in 2N hydrochloric acid. The results are shown in Table 3.
【００３４】 表３ アミノ酸組成 ───────────────────────── アミノ酸 実験値 1) 理論値 2) ───────────────────────── Ａsp＋Ａsn １３.０ １３ Ｔhr ９.７ １０ Ｓer ９.２ １１ Ｇlu＋Ｇln ６.６ ６ Ｐro ２.９ ３ Ｇly ７.３ ７ Ａla ６.９ ７ Ｖal １２.８ １３ Ｍet ２.１ ２ Ｉle ６.１ ６ Ｌeu ３.２ ３ Ｔyr ２.３ ２ Ｐhe ７.３ ７ Ｌys ９.１ ９ Ｈis ３.９ ４ Ａrg ７.３ ８ Ｔrp ３.０ ３ 合 計 １２０ ───────────────────────── 1) Ａsp＋Ａsnを１３として計算した。 2) ヒトＮＧＦ遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸
配列から計算した。 なお、Ullrich らはマウスβＮＧＦとの比較から、ヒト
ＮＧＦが１１８個のアミノ酸からなると推定している
〔ネイチャー(Nature),３０３巻，８２１頁(1983
年)〕。精製ヒトＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列を気相プ
ロテインシーケンサー(アプライドバイオシステム社モ
デル４７０Ａ)を用いて決定した。その結果を表４に示
す。Table 3 Amino acid composition ───────────────────────── Amino acid experimental value 1) Theoretical value 2) ────────── ───────────────── Asp + Asn 13.0 13 Thr 9.7 10 Ser 9.2 11 Glu + Gln 6.6 6 Pro Pro 2.9 3 Gly 7.3 7 Ala 6.9 7 Val 12.8 13 Met 2.1 2 Ile 6.1 6 Leu 3.2 3 Tyr 2.3 2 Phe 7.3 7 Lys 9.1 9 His 3.9 4 Arg 7.3 8 Trp 3.0 3 Total 120 ───────────────────────── 1) Asp + Asn was calculated as 13. 2) Calculated from the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence of human NGF gene. In comparison with mouse βNGF, Ullrich et al. Estimate that human NGF is composed of 118 amino acids [Nature, vol. 303, p. 821 (1983).
Year)〕. The N-terminal amino acid sequence of purified human NGF was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems model 470A). The results are shown in Table 4.
【００３５】 表４ Ｎ末端アミノ酸配列 ─────────────────────────── ＰＴＨ−アミノ酸 ＤＮＡより推定さ サイクル Residue p mole れるアミノ酸配列 ─────────────────────────── １ Ｓer ６０５ Ｓer ２ Ｓer ４９５ Ｓer ３ Ｓer ３８４ Ｓer ４ Ｈis ７８５ Ｈis ５ Ｐro ７０５ Ｐro ６ Ｉle ７６７ Ｉle ７ Ｐhe ８２９ Ｐhe ８ Ｈis ３４１ Ｈis ９ Ａrg ７００ Ａrg １０ Ｇly ４２５ Ｇly １１ Ｇlu ４７８ Ｇlu １２ Ｐhe ５１７ Ｐhe １３ Ｓer ９７ Ｓer １４ Ｖal ４６７ Ｖal 15 − Ｃys １６ Ａsp ２９７ Ａsp １７ Ｓer ５８ Ｓer １８ Ｖal ３９２ Ｖal １９ Ｓer ７３ Ｓer ２０ Ｖal ４７６ Ｖal ２１ Ｔrp ９５ Ｔrp ２２ − Ｖal ２３ Ｇly １６６ Ｇly ２４ Ａsp １７９ Ａsp ２５ Ｌys ２４５ Ｌys ２６ Ｔhr ７４ Ｔhr ２７ Ｔhr １０２ Ｔhr ２８ Ａla １７９ Ａla ─────────────────────────── 精製ヒトＮＧＦ２.９n moleを分析に用いた。Table 4 N-terminal amino acid sequence ─────────────────────────── PTH-amino acid Sequence deduced from DNA Residue pmoled amino acid sequence ─────────────────────────── 1 Ser 605 Ser 2 Ser 495 Ser 3 Ser 384 Ser 4 His 785 His 5 Pro 705 Pro 6 Ile 767 Ile 7 Phe 829 Phe 8 His 341 His 9 Arg 700 Arg 10 Gly 425 Gly 11 Glu 478 Glu 12 Phe 517 Phe 13 Ser 97 Ser 19 Ser 18 Ser 18 Ser 18 Sr 17 Sr 17 Sr 17 Sr 17 Sr 18 Sr 17 Asp 2 Ser 16 Asp 17 Sr 18 Asp 2 73 Ser 20 Val 476 Val 21 Trp 95 Trp 22-Val 23 Gly 166 Gly 24 Asp 179 Asp 25 Lys 245 Lys 26 Thr 74 Thr 27 Thr 102 Thr 28 Ala 179 Ala ─────────────────────────── Purified human NGF 2.9 nmole was used for the analysis.
【００３６】ヒドラジン分解〔Natita ら、ジャーナル
オブ バイオケミストリー(J. Biochem.),５９，１７
０(1966)〕で調べた精製ヒトＮＧＦのＣ末端アミノ酸は
アラニンであった。ＰＡＧ等電点電気泳動法(新版電気
泳動実験法、電気泳動学会編、文光堂、1989年)で調べ
た結果、得られたヒトＮＧＦの等電点はpＨ９−１０で
あり、マウスＮＧＦ( Collaborative Research Incor
porated )のそれとほぼ同じであった。ブレイン リサ
ーチ(Brain Research),１３３，３５０(1977)，エクス
ペリメンタル セル リサーチ(Experimental Cell Res
earch),１４ ５，１７９(1983)およびジャーナル オブ
ニューロサイエンス リサーチ(Journal of Neurosci
ence Research),１７，２５(1987)に記載されている方
法に従い、ＰＣ１２細胞の神経突起の伸長 (neurite ou
tgrowth)を指標にして、精製ヒトＮＧＦの活性を測定し
たところ、精製ヒトＮＧＦはマウス２.５Ｓ−ＮＧＦの
標準品(和光純薬)と同程度の活性を示した。ディベロプ
メンタル バイオロジー (Developmental Biology),１
１１，６２(1985)に記載されている方法に従い、ニワト
リ胚の脊髄後根神経節(dorsal rootganglia；ＤＲＧ)に
対する精製ヒトＮＧＦの作用を調べた。その結果、精製
ヒトＮＧＦは脊髄後根神経節(ＤＲＧ)由来の神経細胞の
神経突起の伸長および生存を促進した。Degradation of hydrazine [Natita et al., Journal of Biochemistry (J. Biochem.), 59 , 17]
0 (1966)], the C-terminal amino acid of purified human NGF was alanine. As a result of examination by PAG isoelectric focusing method (new edition electrophoretic experiment method, edited by Electrophoretic Society, Bunkodo, 1989), the isoelectric point of human NGF obtained was pH 9-10, and mouse NGF ( Collaborative Research Incor
It was almost the same as that of porated). Brain Research, 133 , 350 (1977), Experimental Cell Res
earch), 14 5, 179 ( 1983) and the Journal of Neuroscience Research (Journal of Neurosci
ence Research), 17 , 25 (1987) according to the method described in neurite outgrowth of PC12 cells (neurite ou).
When the activity of purified human NGF was measured using tgrowth) as an index, the purified human NGF showed an activity similar to that of the standard mouse 2.5S-NGF product (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Developmental Biology, 1
11 , 62 (1985), the effect of purified human NGF on the dorsal root ganglia (DRG) of chicken embryos was investigated. As a result, purified human NGF promoted neurite outgrowth and survival of nerve cells derived from dorsal root ganglion (DRG).
【００３７】 参考例８ 分子内ジスルフィド結合の解析 参考例７で得られた精製ヒトＮＧＦを用いて、その分子
内ジスルフィド結合の位置を決定した。凍結乾燥した精
製ヒトＮＧＦ(５３０μg)に０.２mlの０.９％ＮaＣl溶
液と０.８mlの０.０１Ｍ ＨＣlとを加えて溶解した。
この溶液のpＨは２.２であった。これに重量比で１/50
になるように、１mg／mlのペプシン(Sigma社)溶液を１
０.６μl加えて、３７℃で２２時間反応させた。反応後
９５０μlを採取し、５０μlの２５０mＭリン酸緩衝液
(pＨ６.０)を加えて反応を停止したものをペプシン消化
物とした。ペプシン消化物をＨＰＬＣに付し、ペプチド
マッピングを行った。ＴＳＫ−ゲルＯＤＳ−１２０Ｔカ
ラム(東ソー社、０.４６×２５cm)を用いて、０.０５％
ＴＦＡ(Ａ)および９９.９５％アセトニトリル０.０５％
ＴＦＣ(Ｂ)の混合物を以下の溶出プログラムに従って流
した。流速は１ml／min，検出波長は２２０nmおよび２
８０nm。 一方、ペプシン消化物５０μlに１００mＭ ＤＴＴ溶液
を１０μl加え、室温で３時間放置してジスルフィド結
合を還元したサンプルを同じようにＨＰＬＣに付し、ペ
プチドマッピングを行った。これら２つのペプチドマッ
ピングを比較することにより、ジスルフィド結合を有す
るペプチドを固定した後、このペプチドを単離し、気相
プロテインシークエンサー末端(ＡＢＩ社)アミノ酸配列
を分析した。Reference Example 8 Analysis of Intramolecular Disulfide Bond Using the purified human NGF obtained in Reference Example 7, the position of the intramolecular disulfide bond was determined. Lyophilized purified human NGF (530 μg) was dissolved by adding 0.2 ml of 0.9% NaCl solution and 0.8 ml of 0.01M HCl.
The pH of this solution was 2.2. 1/50 by weight ratio
1 mg / ml pepsin (Sigma) solution
0.6 μl was added and the mixture was reacted at 37 ° C. for 22 hours. After the reaction, collect 950 μl and collect 50 μl of 250 mM phosphate buffer.
(pH 6.0) was added to stop the reaction, which was used as a pepsin digest. The pepsin digest was submitted to HPLC for peptide mapping. Using a TSK-gel ODS-120T column (Tosoh Corp., 0.46 × 25 cm), 0.05%
TFA (A) and 99.95% acetonitrile 0.05%
The mixture of TFC (B) was run according to the following elution program. Flow rate is 1 ml / min, detection wavelength is 220 nm and 2
80 nm. On the other hand, 10 μl of 100 mM DTT solution was added to 50 μl of digested pepsin, and the mixture was left at room temperature for 3 hours to reduce disulfide bonds. After immobilizing the peptide having a disulfide bond by comparing these two peptide mappings, the peptide was isolated and the amino acid sequence of the gas phase protein sequencer end (ABI) was analyzed.
【００３８】その結果、本ペプチドは以下に示す配列−
１、配列−２、および配列−３を含み、かつ３個のジス
ルフィド結合を持つ大きなペプチドであることがわかっ
た。 配列−１ 13 15 20 Ｓ−Ｖ−Ｃ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｖ （配列表：配列番号５） 配列−２ 54 58 60 65 Ｆ−Ｅ−Ｔ−Ｋ−Ｃ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−Ｓ−Ｇ−Ｃ−Ｒ− 70 73 Ｇ−Ｉ−Ｄ−Ｓ− （配列表：配列番号６） 配列−３ 102 105 110 115 Ｉ−Ｒ−Ｉ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−Ｌ−Ｓ−Ｒ−Ｋ−Ａ−Ｖ− 120 Ｒ−Ｒ−Ａ （配列表：配列番号７） 次に、このペプチド(２０６０pmol)を減圧下に濃縮乾固
した後０.３mlの５０mＭ酢酸ナトリウム(pＨ６.０)に溶
解した。この溶液に０.４８μg(１４pmol)のサーモライ
シン(和光純薬工業(株))を加えて、３７℃で２０時間反
応させた後、上記と同一の条件下で、ＨＰＬＣに付し、
ペプチドマッピングを行った。ただし、以下の溶出プロ
グラムを使用した。 さらに、ジスルフィド結合の位置を決定するために、上
記ペプチドをＤＴＴで還元処理したサンプルを同じよう
にＨＰＬＣに付し、ペプチドマッピングを行った。ペプ
チドマッピングの比較から、ジスルフィド結合を含む３
個のフラグメント(フラグメント−１、フラグメント−
２、フラグメント−３)を固定し、それぞれ取得した。
フラグメント−１、フラグメント−２、およびフラグメ
ント−３のアミノ末端アミノ酸配列を分析した。その結
果を表５に示す。一方、これらのフラグメントを過ギ酸
で酸化し、システイン残基をシステイン酸に変換した
後、アミノ酸分析を行った結果、いずれのフラグメント
にも２残基ずつのシステイン酸が検出された。As a result, this peptide has the sequence shown below.
It was found to be a large peptide containing 1, sequence-2, and sequence-3 and having three disulfide bonds. Sequence-1 13 15 20 S-V-C-D-S-V-S-V (Sequence Listing: SEQ ID NO: 5) Sequence-2 54 58 60 65 F-E-T-K-C-R-D- P-N-P-V-D-S-G-C-R- 7073 G-I-D-S- (Sequence listing: SEQ ID NO: 6) Sequence-3 102 105 110 115 I-R-I-D -T-A-C-V-C-V-L-S-R-K-A-V-120R-R-A (Sequence listing: SEQ ID NO: 7) Then, this peptide (2060 pmol) was depressurized. The solution was concentrated to dryness and dissolved in 0.3 ml of 50 mM sodium acetate (pH 6.0). 0.48 μg (14 pmol) of thermolysin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to this solution, reacted at 37 ° C. for 20 hours, and then subjected to HPLC under the same conditions as above,
Peptide mapping was performed. However, the following elution program was used. Furthermore, in order to determine the position of the disulfide bond, a sample obtained by subjecting the above peptide to reduction treatment with DTT was similarly subjected to HPLC to perform peptide mapping. Comparison of peptide mapping revealed that 3 including disulfide bond
Fragments (fragment-1, fragment-
2. Fragment-3) was immobilized and obtained respectively.
The amino terminal amino acid sequences of Fragment-1, Fragment-2, and Fragment-3 were analyzed. The results are shown in Table 5. On the other hand, these fragments were oxidized with performic acid to convert cysteine residues into cysteic acid and amino acid analysis was performed. As a result, two cysteic acids were detected in each fragment.
【００３９】[0039]
【表５】 これらの結果から、精製ヒトＮＧＦのジスルフィド結合
の位置は、Ｃys15−Ｃys80，Ｃys58−Ｃys108およびＣy
s68−Ｃys110であると結論された。このジスルフィド結
合様式を〔図９〕に示す。また、ヒトＮＧＦのアミノ酸
を、配列表：配列番号９に示す。[Table 5] From these results, the position of the disulfide bonds of purified human NGF is, Cys 15 -Cys 80, Cys 58 -Cys 108 and Cy
It was concluded that this was s 68 -Cys 110 . Shows this disulfide bond fashion [Figure 9]. Also, the amino acid of human NGF
Is shown in the sequence listing: SEQ ID NO: 9.
【００４０】 実施例１ 抗ヒトＮＧＦポリクローナル抗体の作製 参考例７で得られたヒトＮＧＦをRibi Adjuvand (RIBI
Immunochem. Res. Inc.)とよく混合し、その混合物を
ウサギ(ニュージーランドホワイト，体重約１.５kg,
雌)の背部皮下に注射した。一匹当りのヒトＮＧＦ接種
量は１００μgであった。以後１０日毎に同量のヒトＮ
ＧＦとRibi Adjuvand(RIBI Immunochem. Res. Inc.)と
の混合物を同じウサギに５〜７回注射した。上記のよう
にして免疫したウサギから採取して得られた血液を遠心
分離し、抗血清を得た。得られた抗血清の抗体価をヒト
ＮＧＦを抗原とするＥＬＩＳＡで測定した結果、高い抗
体価(８回；１６,０００倍)が認められた。上記の抗血
清をプロテインＡ−Sepharose カラム（Pharmacia Fine
ChemicalsCo.,Ltd.,Sweden ０.２Ｍ ＮaＣlを含む０.
１Ｍリン酸緩衝液 (pＨ７.０)で平衡化したカラム(１m
l)に血清を加え、同緩衝液で十分洗浄後、０.２Ｍを含
む１％酢酸で溶出した。）により精製し、抗ヒトＮＧＦ
抗体ＩgＧ画分を得た。Example 1 Preparation of Anti-Human NGF Polyclonal Antibody The human NGF obtained in Reference Example 7 was converted into Ribi Adjuvand (RIBI
Immunochem. Res. Inc.), and the mixture was mixed with rabbit (New Zealand White, body weight about 1.5 kg,
Female) was subcutaneously injected into the back. The amount of human NGF inoculated per animal was 100 μg. The same amount of human N every 10 days thereafter
The same rabbit was injected with a mixture of GF and Ribi Adjuvand (RIBI Immunochem. Res. Inc.) 5-7 times. The blood obtained from the rabbit immunized as described above was centrifuged to obtain antiserum. As a result of measuring the antibody titer of the obtained antiserum by ELISA using human NGF as an antigen, a high antibody titer (8 times; 16,000 times) was observed. The above antiserum was applied to a Protein A-Sepharose column (Pharmacia Fine
Chemicals Co., Ltd., Sweden 0.2M including 0.2M NaCl.
Column (1 m) equilibrated with 1M phosphate buffer (pH 7.0)
Serum was added to l), washed thoroughly with the same buffer, and then eluted with 1% acetic acid containing 0.2M. ), Anti-human NGF
An antibody IgG fraction was obtained.
【００４１】 実施例２ ＥＩＡ法を用いたヒトＮＧＦの定量 ９６ウエルのポリスチレンマイクロタイタープレート(F
alcon Co.,Ltd.,USA)に実施例１で得た１００μg／mlの
抗ヒトＮＧＦ ＩgＧ画分を１０μlずつ分注し室温で２
時間置き、ＩgＧ画分をマイクロタイタープレートに付
着させた。このプレートを０.４Ｍ ＮaＣl，０.１％Ｂ
ＳＡ，０.１％ＮaＮ3および１mＭ ＭgＣl2を含む０.１
Ｍ Ｔris−ＨＣl buffer(pＨ７.６)で、２回洗った
後、同じbufferを加え(１３０μl／ウエル)室温で２時
間置いた。次にスタンダードヒトＮＧＦを含む液２０μ
lを加え、室温で４時間ゆっくり振盪した後上記buffer
で２回洗浄した。洗浄後、ビオチンラベルした抗ヒトＮ
ＧＦ ＩgＧ液(３５ng／ml)を３０μl／ウエル加え、一
晩４℃で振盪し、上記bufferで２回洗浄した。抗ヒトＮ
ＧＦ ＩgＧ画分のビオチンラベルは HSU, S.-M., Rain
e, L. and Faugen,H. Use of avidin-biotin peroxid
ase complex(ABC) in immunoperoxidase techniques: A
comparison between ABC and unlabelled antibody(P
AP) procedures. J. Histochem.Cytochem., 29(4), 577
-580(1981)の方法を用いた。次に３０μlのストレプト
アビシン−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ complex を加え
１時間室温で振盪した後、上記buffer で３回洗浄し
た。このプレートに６０mＭの４−methylumbelliferyl
−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを３０μl加え室温で４時
間インキュベートし、１３０μlの０.１Ｍ glycine−Ｎ
aＯＨ buffer(pＨ１０.３)を加えて反応を停止させた
後、Fluorometry により蛍光強度(Excitation ３６０n
m；Emission ４５０nm)を測定した。参考例７で得られ
たヒトＮＧＦを用いてこのＥＩＡを行って得た標準曲線
は図１０に示すようになった。この曲線から本ＥＩＡは
下限１Pg／２０μl／well程度迄のヒトＮＧＦを検出で
きることがわかった。Example 2 Quantification of human NGF using EIA method 96-well polystyrene microtiter plate (F
alcon Co., Ltd., USA), 100 μg / ml of the anti-human NGF IgG fraction obtained in Example 1 was dispensed in 10 μl aliquots, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 2
After a period of time, the IgG fraction was attached to the microtiter plate. This plate was washed with 0.4M NaCl, 0.1% B
SA, 0.1% containing 0.1% NaN 3 and 1 mM MgCl 2
After washing twice with M Tris-HCl buffer (pH 7.6), the same buffer was added (130 μl / well) and the plate was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Next, a solution containing standard human NGF 20μ
l and slowly shaken at room temperature for 4 hours, then add the above buffer
It was washed twice with. After washing, biotin-labeled anti-human N
GF IgG solution (35 ng / ml) was added at 30 μl / well, shaken overnight at 4 ° C., and washed twice with the above buffer. Anti-human N
The biotin label of the GF IgG fraction is HSU, S.-M., Rain
e, L. and Faugen, H. Use of avidin-biotin peroxid
ase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: A
comparison between ABC and unlabelled antibody (P
AP) procedures. J. Histochem. Cytochem., 29 (4), 577
-580 (1981) was used. Next, 30 μl of streptavicin-β-D-galactosidase complex was added, and the mixture was shaken at room temperature for 1 hour, and then washed 3 times with the above buffer. Add 60 mM 4-methylumbelliferyl to this plate.
30 μl of -β-D-galactosidase was added and incubated at room temperature for 4 hours to obtain 130 μl of 0.1M glycine-N.
After adding aOH buffer (pH 10.3) to stop the reaction, fluorescence intensity (Excitation 360n) was measured by Fluorometry.
m; Emission 450 nm) was measured. The standard curve obtained by carrying out this EIA using the human NGF obtained in Reference Example 7 is shown in FIG. From this curve, it was found that this EIA can detect human NGF up to a lower limit of about 1 Pg / 20 μl / well.
【００４２】 実施例３ 種々の動物由来ＮＧＦの抗原性の比較 実施例２に示された抗ヒトＮＧＦＩgＧ画分を用いたＥ
ＩＡ法により、種々の動物由来ＮＧＦの抗原性を比較検
討した。すなわち、実施例２と同一方法を用い、種々の
ＮＧＦの標準曲線を求め、図１１に示した。図１１か
ら、ウシ，モルモット，マウス，ヘビ由来ＮＧＦの順に
免疫交差性が低下することが分かった。図１１は、実施
例２で得られた本発明の抗ヒトＮＧＦポリクローナル抗
体を用いたＥＩＡによる種々のＮＧＦの標準曲線を示
す。図１１において─●─はヒトＮＧＦの，─○─はウ
シＮＧＦの，─△─を黒くぬった印はモルモットＮＧＦ
の，─△─はマウスＮＧＦの，─□─を黒くぬった印は
ヘビ（コブラ）毒ＮＧＦの結果をそれぞれ示す。Example 3 Comparison of antigenicity of NGF derived from various animals E using the anti-human NGFI IgG fraction shown in Example 2
The antigenicity of various animal-derived NGFs was compared and examined by the IA method. That is, using the same method as in Example 2, standard curves of various NGFs were determined and shown in FIG. From FIG. 11, it was found that the immunoreactivity decreases in the order of bovine, guinea pig, mouse, and snake-derived NGF. FIG. 11 shows standard curves of various NGF by EIA using the anti-human NGF polyclonal antibody of the present invention obtained in Example 2. In FIG. 11, ∘∘ indicates human NGF, ∘∘ indicates bovine NGF, and ∑ indicates black guinea pig NGF.
, ∑ indicates the results of mouse NGF and ∘ indicates the results of snake (cobra) venom NGF.
【００４３】[0043]
【発明の効果】本発明ではヒトＮＧＦを抗原として用い
た抗体を得るが、ヒトＮＧＦ全蛋白質であるためこのポ
リクローナル抗体は多くのエピトープを認識する多種の
抗体の混合物として得られる。従って本発明のヒトＮＧ
Ｆの検出・測定法によると、微量のＮＧＦを高感度で測
定することができるので、ヒトの体液や組織中のＮＧＦ
を有利に検出・測定することができ、また疾病の診断法
としても用いることができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, an antibody using human NGF as an antigen is obtained. Since it is a human NGF whole protein, this polyclonal antibody can be obtained as a mixture of various antibodies recognizing many epitopes. Therefore, the human NG of the present invention
According to the method for detecting and measuring F, a very small amount of NGF can be measured with high sensitivity, so NGF in human body fluids and tissues can be measured.
Can be advantageously detected and measured, and can also be used as a diagnostic method for diseases.
【００４４】[0044]
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：９７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 株名：組織 配列： ＣＣＣＧＧＧＴＴＡＣ ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣ ＣＣＧＧＴＡＴＡＡＣ ＣＡＴ
ＴＧＣＴＡＧＣ ＡＣＡＣＣＣＴＴＴＣ ＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡ ６０ ＧＴＧＣＣＣＣＧＧＴ ＴＴＧＡＡＴＧＡＡＡ ＣＣＴＣＴＴＣＧＴＧ ＡＴＣ
ＣＣＣＴＴＧＧ ＧＡＧＧＴＣＡＡＣＴ ＣＴＧＡＧＧＧＡＣＣ １２０ ＣＡＧＡＡＡＣＴＧＣ ＣＴＴＴＴＧＡＣＴＧ ＣＡＴＴＴＡＧＴＡＣ ＴＣＣ
ＡＴＧＡＡＧＴ ＣＡＣＣＣＴＣＡＴＴ ＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴ １８０ ＴＣＣＡＧＧＴＧＣＡ ＴＡＧＣＧＴＡ ＡＴＧ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＴＧ Ｔ
ＴＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＴＣＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ２３０ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐ
ｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｌａ １
５ １０ ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＡＧ ＧＣＧ ＧＡＡ ＣＣＡ
ＣＡＣ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＧＣ ＡＡＴ ＧＴＣ ＣＣＴ ２７８ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ １５ ２０
２５ ＧＣＡ ＧＧＡ ＣＡＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＣＡＡ ＧＴＣ ＣＡＣ
ＴＧＧ ＡＣＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＡＴ ＴＣＣ ３２６ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｓｅｒ ３０ ３５
４０ ＣＴＴ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＧＣ ＡＧＡ ＧＣＣ ＣＧＣ
ＡＧＣ ＧＣＣ ＣＣＧ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＴＡＴ ３７４ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ ４５ ５０
５５ ＧＣＴ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＧ ＧＣＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ
ＡＡＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＧＧ ４２２ Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｒｇ ６０ ６５
７０ ７５ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＣＧＧ ＣＧＡ ＣＴＣ ＣＧＴ ＴＣＡ
ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＴＴＴ ＡＧＣ ＡＣＣ ４７０ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ８０
８５ ９０ ＣＡＧ ＣＣＴ ＣＣＣ ＣＧＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＡＣ ＡＣＴ
ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＡＣ ＴＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ５１８ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｈｒ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ ９５ １００
１０５ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＣＴ ＧＣＣ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＣＴ
ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＧＧ ＴＣＡ ＴＣＡ ５６６ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ １１０ １１５
１２０ ＴＣＣ ＣＡＴ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＣ ＣＡＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＧＡＡ
ＴＴＣ ＴＣＧ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＴＣ ６１４ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｕ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｖａｌ １２５ １３０
１３５ ＡＧＣ ＧＴＧ ＴＧＧ ＧＴＴ ＧＧＧ ＧＡＴ ＡＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ
ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＡＡＧ ６６２ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｌｙｓ １４０ １４５
１５０ １５５ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＣ
ＡＴＴ ＡＡＣ ＡＡＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＴＴＣ ＡＡＡ ７１０ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｙｓ １６０
１６５ １７０ ＣＡＧ ＴＡＧ ＴＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＣＧＧ
ＧＡＣ ＣＣＡ ＡＡＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＧＡＣ ＡＧＣ ７５８ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ １７５ １８０
１８５ ＧＧＧ ＴＧＣ ＣＧＧ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＣＡ ＡＡＧ ＣＡＣ
ＴＧＧ ＡＡＣ ＴＣＡ ＴＡＴ ＴＧＴ ＡＣＣ ＡＣＧ ８０６ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｈｉｓ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｙ １９０ １９５ ２００ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＡＣＣ
ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＧＣＣ ８５４ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ａｌａ ２０５ ２１０
２１５ ＴＧＧ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＴＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＡＴ ＡＣＧ ＧＣＣ
ＴＧＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ９０２ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｒｇ ２２０ ２２５
２３０ ２３５ ＡＡＧ ＧＣＴ ＧＴＧ ＡＧＡ ＡＧＡ ＧＣＣ ＴＧＡＣＣＴＧＣＣＧ Ａ
ＣＡＣＧＣＴＣＣＣ ＴＣＣＣＣＣＴＧＣＣ ９５０ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｌａ ２４０ ＣＣＴＴＣＴＡＣＡＣ ＴＣＴＣＣＴＧＧＧＣ ＣＣ
９７２[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 972 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded Topology: Linear Sequence type: Genomic DNA Origin organism name: Human strain name: Tissue Sequence: CCCGGGTTAC GCCTGTTGTC CCGGTATAAC CAT
TGCTAGC ACACCCTTTC CCTCTCAGAA 60 GTGCCCCGGT TTGAATGAAA CCTCTTCCGTG ATC
CCCTTGGAGAGTCAACT CTGAGGGACC 120 CAGAAACTGC CTTTTGACTG CATTAGTAG TCC
ATGAAGT CACCCTCATT TCTTTTTTCAT 180 TCCAGGGTGCA TAGCGTA ATG TCC ATG TTG T
TC TAC ACT TCG ATC ACA GCT 230 Met Ser Met Leu P
he Tyr Thr Leu Ile Thr Ala 1
5 10 TTT CTG ATC GGC ATA CAG GCG GAA CCA
CAC TCA GAG AGC AAT GTC CCT 278 Phe Leu Ile Gly Ile Gln Ala Glu Pro
His Ser Glu Ser Asn Val Pro 15 20
25 GCA GGA CAC ACC ATC CCC CAA GTC CAC
TGG ACT AAA CTT CAG CAT TCC 326 Ala Gly His Thr Ile Pro Gln Val His
Trp Thr Lys Leu Gln His Ser 30 35
40 CTT GAC ACT GCC CTT CGC AGA GCC CGC
AGC GCC CCG GCA GCG GCG TAT 374 Leu Asp Thr Ala Leu Arg Arg Ala Arg
Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile 45 50
55 GCT GCA CGC GTG GCG GGG CAG ACC CGC
AAC ATT ACT GTG GAC CCC AGG 422 Ala Ala Arg Val Ala Gly Gln Thr Arg
Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg 60 65
70 75 CTG TTT AAA AAG CGG CGA CTC CGT TCA
CCC CGT GTG CTG TTT AGC ACC 470 Leu Phe Lys Lys Arg Arg Leu Arg Ser
Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr 80
85 90 CAG CCT CCC CGT GAA GCT GCA GAC ACT
CAG GAT CTG GAC TTC GAG GTC 518 Gln Pro Pro Arg Glu Ala Ala Asa Thr Thr
Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val 95 100
105 GGT GGT GCT GCC CCC TTC AAC AGG ACT
CAC AGG AGC AAG CGG TCA TCA 566 Gly Gly Ala Ala Pro Phe Asn Arg Thr
His Arg Ser Lys Arg Ser Ser 110 115
120 TCC CAT CCC ATC TTC CAC AGG GGC GAA
TTC TCG GTG TGT GAC AGT GTC 614 Ser His His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu
Phe Ser Val Cys Asp Ser Val 125 130
135 AGC GTG TGG GTT GGG GAT AAG ACC ACC
GCC ACA GAC ATC AAG GGC AAG 662 Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr
Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys 140 145
150 155 GAG GTG ATG GTG TTG GGA GAG GTG AAC
ATT AAC AAC AGT GTA TTC AAA 710 Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn
Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys 160
165 170 CAG TAG TTT TTT GAG ACC AAG TGC CGG
GAC CCA AAT CCC GTT GAC AGC 758 Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg
Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser 175 180
185 GGG TGC CGG GGC ATT GAC TCA AAG CAC
TGG AAC TCA TAT TGT ACC ACG 806 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His
Trp Asn Ser Ty 190 195 200 ACT CAC ACC TTT GTC AAG GCG CTG ACC
ATG GAT GGC AAG CAG GCT GCC 854 Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr
Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala 205 210
215 TGG CGG TTT ATC CGG ATA GAT ACG GCC
TGT GTG TGT GTG CTC AGC AGG 902 Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala
Cys Val Cys Val Leu Ser Arg 220 225
230 235 AAG GCT GTG AGA AGA GCC TGACCTGCCG A
CACGCTCCC TCCCCCTGCC 950 Lys Ala Val Arg Arg Ala 240 CCTCTACCACTCTCCTGGGC CC
972
【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： ＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣ ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣ ＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴ ＡＣＡ
ＣＴＣＴ ３７SEQ ID NO: 2 Sequence length: 37 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics: Adapter sequence: AGCTTGCCGC CACCATGTCC ATGTTGTTCT ACA
CTCT 37
【００４６】配列番号：３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： GATCAGAGTG TAGAACAACA TGGACATGGT GGCGGGCA 37SEQ ID NO: 3 Sequence length: 37 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics: Adapter sequence: GATCAGAGTG TAGAACAACA TGGACATGGT GGCGGGCA 37
【００４７】配列番号：４ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：アダプター 配列： CAGATCTGGG CC 12SEQ ID NO: 4 Sequence length: 12 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics: Adapter sequence: CAGATCTGGG CC 12
【００４８】配列番号：５ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 5 Sequence length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide
【００４９】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys 5 10 15 Arg Gly Ile Asp Ser 20SEQ ID NO: 6 Sequence length: 20 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys 5 10 15 Arg Gly Ile Asp Ser 20
【００５０】配列番号：７ 配列の長さ：１９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Arg 5 10 15 Val Arg Arg AlaSEQ ID NO: 7 Sequence length: 19 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Arg 5 10 15 Val Arg Arg Ala
【００５１】配列番号：８ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 5 10 15SEQ ID NO: 8 Sequence length: 15 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys 5 10 15
【００５２】配列番号：９ 配列の長さ：１２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120SEQ ID NO: 9 Sequence length: 120 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide Sequence: Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120
【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]
【図１】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。FIG. 1 shows the cloned human N obtained in Reference Example 1.
The nucleotide sequence of the GF gene and the amino acid sequence translated therefrom are shown.
【図２】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。FIG. 2 shows the cloned human N obtained in Reference Example 1.
The nucleotide sequence of the GF gene and the amino acid sequence translated therefrom are shown.
【図３】は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮ
ＧＦ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ
酸配列を示す。FIG. 3 is the cloned human N obtained in Reference Example 1.
The nucleotide sequence of the GF gene and the amino acid sequence translated therefrom are shown.
【図４】は、参考例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ１０１の構築図を示す。FIG. 4 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF101 obtained in Reference Example 1.
【図５】は、参考例２で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ２０１の構築図を示す。FIG. 5 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF201 obtained in Reference Example 2.
【図６】は、参考例２で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＭＮＧＦ２０１の構築図を示す。FIG. 6 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF201 obtained in Reference Example 2.
【図７】は、参考例３で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＴＢ１０５８の構築図を示す。FIG. 7 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pTB1058 obtained in Reference Example 3.
【図８】は、参考例３で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベク
ターpＴＢ１０５８の構築図を示す。FIG. 8 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pTB1058 obtained in Reference Example 3.
【図９】は、参考例８で得られた、精製ヒトＮＧＦのジ
スルフィド結合様式の解析図を示す。FIG. 9 shows an analysis diagram of the disulfide bond mode of purified human NGF obtained in Reference Example 8.
【図１０】は、実施例２で得られた、本発明の抗ヒトＮ
ＧＦポリクローナル抗体を用いたヒトＮＧＦのＥＩＡの
標準曲線を示す。FIG. 10 shows the anti-human N of the present invention obtained in Example 2.
The standard curve of EIA of human NGF using a GF polyclonal antibody is shown.
【図１１】は、実施例３で得られた、種々のＮＧＦの標
準曲線を示す。FIG. 11 shows standard curves of various NGF obtained in Example 3.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＺＮＡ Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Office reference number FI technical display location C12P 21/02 ZNA H 8214-4B (C12P 21/02 C12R 1:91)
Claims (4)
末端から数えて第１番目のシステイン残基と第４番目の
システイン残基とが、第２番目のシステイン残基と第５
番目のシステイン残基とが、第３番目のシステイン残基
と第６番目のシステイン残基とが、それぞれジスルフィ
ド結合している活性なヒト神経成長因子(ＮＧＦ)蛋白質
を免疫原として得られるポリクローナル抗体。1. A molecule having 6 cysteine residues,
The first cysteine residue and the fourth cysteine residue counted from the end are the second cysteine residue and the fifth cysteine residue, respectively.
Polyclonal antibody obtained by using an active human nerve growth factor (NGF) protein in which the third cysteine residue, the third cysteine residue, and the sixth cysteine residue are disulfide-bonded as an immunogen .
コードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、クロ
ーン化されている動物細胞が産生したヒトＮＧＦ蛋白質
である請求項１記載の抗体。2. The antibody according to claim 1, wherein the human NGF protein is a human NGF protein produced by a cloned animal cell transformed with a vector containing a gene encoding the human NGF protein.
するヒトＮＧＦ蛋白質の検出・定量法。3. A method for detecting and quantifying human NGF protein, which comprises using the antibody according to claim 1.
出・定量法。4. The detection / quantification method according to claim 3, wherein an enzyme immunoassay method is performed.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2118191A JPH06317587A (en) | 1990-08-31 | 1991-02-14 | Antibody and its use |
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| JP2-231317 | 1990-08-31 | ||
| JP2118191A JPH06317587A (en) | 1990-08-31 | 1991-02-14 | Antibody and its use |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06317587A true JPH06317587A (en) | 1994-11-15 |
Family
ID=26358218
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2118191A Withdrawn JPH06317587A (en) | 1990-08-31 | 1991-02-14 | Antibody and its use |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06317587A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US9260514B2 (en) | 2003-07-15 | 2016-02-16 | Amgen Inc. | Methods of treating conditions caused by increased expression of nerve growth factor (NGF) or increased sensitivity to NGF using anti-NGF neutralizing antibodies as selective NGF pathway inhibitors |
| US10323086B2 (en) | 2002-12-24 | 2019-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
| US11008386B2 (en) | 2002-12-24 | 2021-05-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
-
1991
- 1991-02-14 JP JP2118191A patent/JPH06317587A/en not_active Withdrawn
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| WO2007051477A3 (en) * | 2005-11-07 | 2007-10-04 | Copenhagen University | Neurotrophin-derived peptide sequences |
| US8008259B2 (en) | 2005-11-07 | 2011-08-30 | Copenhagen University, Techtrans Unit | Neurotrophin-derived peptide sequences |
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980514 |