JPH04128300A - Human nerve growth factor protein and its production - Google Patents
Human nerve growth factor protein and its productionInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
童束上災机歴分駄
本発明は、特定のジスルフィド結合をしている活性なヒ
ト神経成長因子（以下、ヒトＮＧＦと略称することもあ
る。）蛋白質、およびヒト神経成長因子製造のための組
み換えＤＮＡ技術に関する。[Detailed Description of the Invention] The present invention relates to active human nerve growth factor (hereinafter sometimes abbreviated as human NGF) protein having a specific disulfide bond, and human nerve growth factor. Concerning recombinant DNA technology for growth factor production.
該ＤＮＡ技術については、ヒト神経成長因子遺伝子を含
むベクターで形質転換され、クローン化されている動物
細胞及び該動物細胞を培地に培養するヒト神経成長因子
の製造法に関する。The DNA technology relates to animal cells that have been transformed and cloned with a vector containing the human nerve growth factor gene, and a method for producing human nerve growth factor by culturing the animal cells in a medium.
の び
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔａ
ｒ、 Ｎ Ｇ Ｆ ）はレヴイ モンタルチ一二（Ｌｅ
ｖｉ−Ｍｏｎｎｔａｌｃｉｎｉ）【アンニュアルニュー
ヨークアカデミーオブサイエンス（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、 ）５５，３３０（１９５２））およ
びコーエン（Ｃｏｈｅ口）ら〔プロシージングスオブザ
ナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエ−（Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）４０．
１０１４（１９５４））によって発見され、末梢神経系
の分化、成長および生存に必須な栄養因子である。最近
、ＮＧＦは中枢神経系において、コリン作動性ニューロ
ンの生存を維持する作用を有することが明らかにされて
おり（ヘフティー（Ｈｅｆｔｉ）ジャーナルオブニュー
ロサイエンス（Ｊｏｕｒｎａ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ
ｅｎｃｅ）６，２１５５（１９８６）：畑中（Ｈａｔａ
ｎａｋａ）等、ディベロプメントオブブレインリサーチ
（Ｄｅｖ、ＢｒａｉｎＲａａ、）３９．８５（１９８
８））、アルツハイマー病と何らかの関連がある因子と
して注目されている。また、老齢ラットの脳内にＮＧＦ
を投与すると、記憶障害の改善が認められる〔ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ）＃３２９．６５（１９８９））こと
から、老人性痴はうの治療薬としても期待されている。nerve growth factor
r, NGF) is Levy Montalci 12 (Le
vi-Monntalcini) [Annual New York Academy of Sciences (Ann, N, Y, A
CAD, Sci.) 55, 330 (1952)) and Cohe et al. [Proceedings of the National Academy of Sciences USA (P.
roc, Natl, Acad, Sci, USA) 40.
1014 (1954)) and is an essential nutritional factor for the differentiation, growth, and survival of the peripheral nervous system. Recently, it has been revealed that NGF has the effect of maintaining the survival of cholinergic neurons in the central nervous system (Hefti Journal of Neuroscience).
ence) 6, 2155 (1986): Hata
naka) et al., Development of Brain Research (Dev, BrainRaa,) 39.85 (198
8)), is attracting attention as a factor that has some relation to Alzheimer's disease. In addition, NGF was found in the brains of old rats.
When administered, an improvement in memory impairment was observed (Nature #329.65 (1989)), so it is expected to be used as a therapeutic agent for senile dementia.
雄マウス顎下腺より単離されたＮＧＦ （７８ＮＧＦ）
は、α、β、γの３種のサブユニットからなる複合体（
α２βγ２）であり、そのうちのβサブユニットにのみ
ＮＧＦ活性が認められている。NGF isolated from male mouse submandibular gland (78NGF)
is a complex consisting of three subunits α, β, and γ (
α2βγ2), of which only the β subunit has been found to have NGF activity.
βサブユニット（βＮＧＦ、２．５８ ＮＧＦ）は１
１８個のアミノ酸からなる同一のポリペプチドの２量体
であり、そのアミノ酸配列はアルゲレッティ（Ａｒｇｅ
ｌｅｔｔｉ）とブラッドショウ（Ｂｒａｄｓｈａｗ）〔
プロシージングスオブザナショナルアカデミーオブサイ
エンスユーエスーエー（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ） 、６８，２４１７（１９７１））
によって決定されている。β subunit (βNGF, 2.58 NGF) is 1
It is a dimer of the same polypeptide consisting of 18 amino acids, and its amino acid sequence was
letti) and Bradshaw [
Proceedings of the National Academy of Sciences USA (Proc, Natl, Acad)
, sci, UsA), 68, 2417 (1971))
determined by.
スコツト（Ｓｃｏｔｔ）らはマウスβＮＧＦのアミノ酸
配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブ
として用いて、マウス顎下腺ｃＤＮＡライブラリーから
、マウスβＮＧＦ遺伝子のクローニングに成功した〔ネ
イチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 、里、５３８（１９８３）
）。さらにアルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）らはマウスβ
ＮＧＦ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ヒトゲノ
ムＤＮＡのライブラリーからＮＧＦ遺伝子をクローニン
グし、その塩基配列から推定したヒトＮＧＦのアミノ酸
配列がマウスＮＧＦのそれと９０％の相同性を有するこ
とを示した〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ） 、 ３０３
．８２１（１９８３）］。Scott et al. succeeded in cloning the mouse βNGF gene from a mouse submandibular gland cDNA library using an oligonucleotide synthesized based on the amino acid sequence of mouse βNGF as a probe [Nature, Sato, 538 (1983)
). Furthermore, Ullrich et al.
Using NGF cDNA as a probe, the NGF gene was cloned from a human genomic DNA library, and the amino acid sequence of human NGF deduced from the nucleotide sequence was shown to have 90% homology with that of mouse NGF [Nature ( Nature), 303
．． 821 (1983)].
上記のヒトＮＧＦ遺伝子のクローニング、ヒトの脳にお
けるＮＧＦ ｍＲＮＡの検出（ゲーデルト（Ｇａｅｄｅ
ｒｔ）ら、モレキュラープレイン リサーチ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｂｒａｉｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１．８
５（１９８６））、抗マウスＮＧＦ抗体を用いたヒト胎
盤及び***中のＮＧＦの検出〔ハインリッヒおよびマイ
ヤー（Ｈａｉｎｒｉｃｈ ＆ Ｍｅｙｅｒ）、バイオケ
ミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミユニケージ
目ン（Ｂｉｏｃｈｅｉｇ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒ
ａｓ、 Ｃｏｍ５Ｉｕｎ、１５５．４８２（１９８８
）〕などよってヒトＮＧＦの存在が間接的に証明されて
いるが、ヒトＮＧＦが単離され、その蛋白化学的性質が
詳細に調べられた報告はない、ガルトシュタイン（Ｇａ
ｌｄｓｔａｉｎ）らはヒト胎盤から、ＮＧＦを単離し、
その分子量１等電点、生物活性がマウスβＮＯＦのそれ
らと類似していることを報告しているが〔ニューロケミ
カルリサーチ（Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）（３）１７５（１９７８））、その結果には
再現性が認められていない。Cloning of the human NGF gene described above, detection of NGF mRNA in the human brain (Gaedert
rt) et al., Molecular Plain Research (Mole
cural Brain Research), 1.8
5 (1986)), Detection of NGF in human placenta and semen using anti-mouse NGF antibodies [Hainrich & Meyer, Biochemical and Biophysical Research Community (Biocheig, Biophys, R.
as, Com5Iun, 155.482 (1988
Although the existence of human NGF has been indirectly proven by methods such as Galtstein (Galtstein, Ga.
isolated NGF from human placenta,
It has been reported that its molecular weight 1 isoelectric point and biological activity are similar to those of mouse βNOF [Neurochemical Research (Neurochemical Re5e)].
(3) 175 (1978)), and the results are not reproducible.
このように単離、精製が困難なヒトＮＧＦｔｔ調製する
ためには遺伝子組み換え技術を用いることが望ましいと
思われる。現在までに、大腸菌の発現等を用いてヒトＮ
ＧＦ蛋白が生産されたことが報告されている［Ｓｈｉｇ
ｅｎｏｒｉ Ｉｗａｉら、ケミストリーアンドファーマ
シューティ力ルブレチン（Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕ
ｌｌ、）３４４７２４（１９８６）：伊藤ら、日本薬学
全昭和６３年度大会講演要旨集、ｐ４０６）、 Ｌかし
、この場合生産された組み換え型ヒトＮＧＦ蛋白は。It seems desirable to use genetic recombination technology to prepare human NGFtt, which is difficult to isolate and purify. To date, human N
It has been reported that GF protein was produced [Shig
Enori Iwai et al., Chemistry and Pharmacy Rubretin (Chem, Pharm, Bu
ll, ) 344724 (1986): Ito et al., Proceedings of the 1986 Annual Conference of the Japanese Pharmaceutical Sciences, p. 406). In this case, the recombinant human NGF protein produced was.
マウスＮＧＦのそ九に比べて極めて活性が低い。It has extremely low activity compared to mouse NGF.
一方、全容らは、酵母を用いてヒトＮＧＦ蛋白を分泌さ
せることを報告した〔イーストジェネティックスアンド
モレキュラーバイオロジ−（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ ａｎｄ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｎｅｗｓ ＪＡＰＡＮ、Ｎｏ ２１，１９８８．ｐ３５
）が、その生産性は低く （１０μｇ／４２程度）、ま
た分泌された該蛋白のごく一部のみが活性型であると予
想される。On the other hand, Zenyo et al. reported that human NGF protein was secreted using yeast [Yeast Genetics and Molecular Biology]
cs and Molecular Biology
News JAPAN, No. 21, 1988. p35
), but its productivity is low (about 10 μg/42), and only a small portion of the secreted protein is expected to be in the active form.
最近、ＢｒｕｃｅとＨｅ１ｎｒｉｃｈはＣＯＳ細胞でヒ
トＮＧＦ遺伝子を発現させ、その培地中に１５ｎｇ／ｍ
Ｑの活性型ヒトＮＧＦが生産されていることを報告した
〔ニューロバイオロジーオブエージング（Ｎｅｕｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ）、 １０．８９（１
９８９））。しかし該方法においてはＣＯ８細胞はクロ
ーン化されていないため、外来遺伝子は一時的にしか発
現しない。そのため、ＣＯ８細胞を用いて外来遺伝子産
物を大量に製造することはできない。Recently, Bruce and Helnrich expressed the human NGF gene in COS cells and added 15 ng/m
reported that active human NGF of Q was produced [Neurobiology of Aging (Neurob.
iology of Aging), 10.89 (1
989)). However, in this method, since the CO8 cells are not cloned, the foreign gene is only expressed temporarily. Therefore, foreign gene products cannot be produced in large quantities using CO8 cells.
を するための
本発明者らは、上記ＣＯ８細胞系と異なり、外来遺伝子
を安定に発現できる動物細胞の系、例えばＣＨＯ細胞系
を用いてヒトＮＧＦ遺伝子の発現を試みたところ、ヒト
ＮＧＦをコードする遺伝子を含むベクターで形質転換さ
れ、クローン化されている動物細胞を培地に培養すると
、著量のヒトＮＧＦを生産することができることを見出
し、さらにこの著量に生産されたヒトＮＧＦを精製する
ことにより、特定のジスルフィド結合をしている活性な
ヒトＮＧＦを得ることができることを見出し、これに基
づいてさらに研究した結果、本発明を完成した。In order to achieve this, the present inventors attempted to express the human NGF gene using an animal cell system that can stably express a foreign gene, such as a CHO cell line, unlike the above-mentioned CO8 cell line, and found that it encodes human NGF. We discovered that a significant amount of human NGF can be produced when animal cells that have been transformed and cloned with a vector containing a gene for this purpose are cultured in a culture medium, and we further purified this large amount of human NGF. The inventors have discovered that active human NGF having a specific disulfide bond can be obtained by this method, and as a result of further research based on this finding, the present invention has been completed.
すなわち１本発明は、（１）分子中に６個のシスティン
残基を有し、Ｎ末端から数えて第１番目のシスティン残
基と第４番目のシスティン残基とが、第２番目のシステ
ィン残基と第５番目のシスティン残基とが、第３番目の
システィン残基と第６番目のシスティン残基とが、それ
ぞれジスルフィド結合している活性なヒト神経成長因子
（ＮＧＦ）蛋白質、（２）ヒトＮＧＦ蛋白質をコードす
る遺伝子を含むベクターで形質転換され、クローン化さ
れている動物細胞、（３）宿主がチャイニーズハムスタ
ーＣＨＯ細胞である上記（２）記載の動物細胞、および
（４）上記（２）または（３）記載のベクターで形質転
換された動物細胞を培養することを特徴とするヒトＮＧ
Ｆ蛋白質の製造法である。That is, 1 the present invention has (1) six cysteine residues in the molecule, and the first cysteine residue and the fourth cysteine residue counting from the N-terminus are equal to the second cysteine residue. active human nerve growth factor (NGF) protein, in which the residue and the fifth cysteine residue are disulfide bonded to the third cysteine residue and the sixth cysteine residue, respectively. ) An animal cell that has been transformed and cloned with a vector containing a gene encoding human NGF protein, (3) the animal cell described in (2) above, wherein the host is a Chinese hamster CHO cell, and (4) the animal cell described in (4) above ( Human NG characterized by culturing animal cells transformed with the vector described in 2) or (3)
This is a method for producing F protein.
本発明におけるヒトＮＧＦ蛋白質としては、ヒトＮＧＦ
およびそのムティンが挙げられる。ヒトＮＧＦとしては
胎盤由来の天然物由来のものや合成のもの、遺伝子工学
的手法により製造されたものが挙げられる。ヒトＮＧＦ
としては、後述の実施例で得られた１２０個のアミノ酸
を有するものが好ましい。The human NGF protein in the present invention includes human NGF
and its mutin. Examples of human NGF include those derived from natural products derived from the placenta, synthetic ones, and those produced by genetic engineering techniques. human NGF
As such, those having 120 amino acids obtained in the Examples described later are preferable.
ヒトＮＧＦのムティンとしては、ジスルフィド結合して
いる分子中の６個のシスティン残基以外の、元のポリペ
プチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したものが
挙げられる。該変異としては、アミノ酸の付加、構成ア
ミノ酸の欠損、他のアミノ酸への置換が挙げられる。し
たがって、該ムティンは上記した分子中に６個のシステ
ィン残基を有するものである。Human NGF mutins include those in which the amino acid sequence of the original polypeptide or protein other than the six cysteine residues in the disulfide-bonded molecule is mutated. Such mutations include addition of amino acids, deletion of constituent amino acids, and substitution with other amino acids. Therefore, the mutin has six cysteine residues in the above-mentioned molecule.
該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。Examples of the amino acid addition include those in which at least one amino acid is added.
該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のヒト
ＮＧＦ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。Examples of the deletion of the constituent amino acids include deletion of at least one human NGF constituent amino acid.
該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のヒ
トＮＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている
ものが挙げられる。Examples of substitutions with other amino acids include those in which at least one amino acid constituting human NGF is replaced with another amino acid.
ヒトＮＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加している
ムティンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、
ペプチドを発現する際に用いられる開始コドンに基因す
るメチオニンや、シグナルペプチドは含まれないもので
ある。At least one amino acid in a mutin in which at least one amino acid is added to human NGF is:
It does not include methionine derived from the start codon used to express the peptide or a signal peptide.
付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ヒトＮＧＦの特徴を失なわない限り何個でも
よい、さらに好ましくは、ヒトＮＧＦと相同性（ホモロ
ジー）が認められており、同様の活性を示すタンパクの
アミノ酸配列の一部あるいはすべてが挙げられる。The number of added amino acids is at least one, but any number may be added as long as the characteristics of human NGF are not lost.More preferably, the number of amino acids added is recognized to be homology to human NGF, and the same amino acid is added. This includes part or all of the amino acid sequence of a protein that exhibits this activity.
ヒトＮＧＦの少なくとも１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸
が欠損しているムティンにおける欠損している構成アミ
ノ酸の数としては、ヒトＮＧＦの特徴を失なわない限り
何個でもよい、該欠損型ムティンにおけるアミノ酸の数
は４１個以上であることが好ましい。The number of deficient constitutive amino acids in a mutin in which at least one human NGF constitutive amino acid of human NGF is deficient may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. The number is preferably 41 or more.
ヒトＮＧＦの少なくとも１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸
が別のアミノ酸で置換されているムティンにおける置換
される前の少なくとも１個のヒトＮＧＦ構成アミノ酸の
数としては、ヒトＮＧＦの特徴を失なわない限り何個で
もよい。In a mutin in which at least one human NGF-constituent amino acid of human NGF is substituted with another amino acid, the number of at least one human NGF-constituent amino acid before substitution may be any number as long as the characteristics of human NGF are not lost. It may be one piece.
置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
以外のものが挙げられる。Ｉｉ換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン。Examples of the constituent amino acids before substitution include amino acids other than cysteine. Constituent amino acids other than cysteine before being converted to Ii include aspartic acid, arginine, and glycine.
セリン、バリンなどが挙げられる。Examples include serine and valine.
置換された別のアミノ酸としては、たとえば。Other substituted amino acids include, for example.
アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、置換さ
れる前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。Choose an amino acid that has different properties from the amino acid before being replaced in terms of hydrophilicity, hydrophobicity, or electric charge.
具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン酸の
場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパラギ
ン、スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニ
ンなどが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニン
が好ましい。Specifically, when the amino acid before substitution is aspartic acid, examples of the amino acid after substitution include asparagine, threonine, valine, phenylalanine, and arginine, with asparagine and arginine being particularly preferred.
置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には、置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン、スレオニン、
ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。If the amino acid before substitution is arginine, the amino acids after substitution are glutamine, threonine,
Examples include leucine, phenylalanine, and aspartic acid, with glutamine being particularly preferred.
置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、Ｈ換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is glycine, examples of the amino acid after H substitution include threonine, leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid, and arginine, with threonine being particularly preferred.
置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。If the constituent amino acid before substitution is serine,
Examples of the amino acid after substitution include methionine, alanine, leucine, cysteine, glutamine, arginine, and aspartic acid, with methionine being particularly preferred.
置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン、アスパラギン酸などが
挙げられ、特にセリンが好ましい。If the constituent amino acid before substitution is valine,
Examples of the amino acid after substitution include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred.
置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。Preferred amino acids after substitution are asparagine, glutamine, arginine, threonine, methionine, serine, and leucine.
上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。In the above substitutions, two or more substitutions may be performed simultaneously.
該ムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つまたは
３つが組み合わさったものでもよい。The mutin may be a combination of two or three of the above additions, deletions, and substitutions.
該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アール
・エフ・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ、Ｒ，Ｆ、）及びジェ
イ・ビー・レコック（ＬｅｃｏｑｙＪ、Ｐ−）ｔジェネ
ティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社（１９８３
年）第３１〜５０頁、に示されている。To produce the mutin, site-directed mutagenesis technology is used.
esis) will be adopted. The technology is well known and has been developed by Lather, R,F, and LecoqyJ, Genetic Eng.
ineering), Academic Breath Co., Ltd. (1983
2013), pages 31-50.
オリゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミ
ス（Ｓｍｉｔｂ、Ｍ、）及びニス・ギラム（Ｇｘｌｌａ
ｍ＊Ｓ−）、ジェネティック・エンジニアリング：原理
と方法、ブレナムプレス社（１９８１年）３巻、１〜３
２頁、に示されている。Oligonucleotide-directed mutagenesis was performed by M. Smitb, M. and Gxlla.
m*S-), Genetic Engineering: Principles and Methods, Blenheim Press (1981), vol. 3, 1-3.
It is shown on page 2.
該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、
（ａ）ヒトＮＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖
ＤＮＡを突然変異株オリゴヌクレオチドプライマーと維
種形成させる（この１本鎖で代替すべきアミノ酸に対す
るコドン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるア
ンチセンス・トリブレットを包含する領域に対して上記
プライマーは相補的なものである。但し、当該コドンの
他のアミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセ
ンス・トリプレットとの不一致はこの限りでない。）、
（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長させ
、突然変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ
）を形成させ、この突然変異性へテロニ量体を二本鎖フ
ァージＤＮＡ中に挿入し、このファージＤＮＡをＥ、ｃ
ｏｌｉ中に形質移入する、及び（ｃ）この突然変異性へ
テロニ量体をＥ、ｃｏｌｉ中で複製する。In order to produce the structural gene encoding the mutin, for example, (a) a single-stranded DNA consisting of a single strand of the structural gene of human NGF is allowed to form fibers with a mutant strain oligonucleotide primer (this one The primers are complementary to the region containing the codon for the amino acid to be replaced in the chain, or optionally an antisense triplet that pairs with this codon, provided that no other amino acid code for the codon is present. This does not apply to mismatches with conversion codons or antisense triplets, as the case may be).
(b) Extend the primer with DNA polymerase to generate a mutant heteroduplex.
), insert this mutant heterodimer into double-stranded phage DNA, and convert this phage DNA into E, c
(c) this mutant heterodimer is replicated in E. coli.
次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。Next, a phage DN carrying the mutated gene
A is isolated and incorporated into a plasmid.
このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。A mutin can be produced by transforming a suitable host with the plasmid thus obtained and culturing the obtained transformant in a medium.
本発明のヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子としては
、例えばヒトゲノムライブラリーからりローニジグによ
って得られたもの、または化学合成によって得られたも
のなどが挙げられる。ヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺
伝子のクローニングは、例えばネイチａｒ−（Ｎａｔｕ
ｒｅ） 、 ３０３．８２１ （１９８３）に記載され
ている方法で行なうことが出来る。Examples of the gene encoding the human NGF protein of the present invention include those obtained from a human genome library by Ronisig, or those obtained by chemical synthesis. Cloning of the gene encoding the human NGF protein can be carried out using, for example, Nature ar-(Natu
re), 303.821 (1983).
上記のようにして得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコードす
る遺伝子は目的によりそのまま、あるいは制限酵素で切
断して使用することができる。The gene encoding the human NGF protein obtained as described above can be used as it is or after being cut with a restriction enzyme depending on the purpose.
上記で得られるヒトＮＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を
プロモーターの下流に連結するが、この場合ヒトＮＧＦ
蛋白質をコードするＤＮＡの５′末端にシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ、またはシグナルペプチドをコー
ドするＤＮＡとプロペプチドをコードするＤＮＡを連結
させることが望ましい。シグナルペプチドとしては、ヒ
トＮＧＦ蛋白質を分泌させることが可能なものであれば
何でも良く、具体例としては、ヒト、マウス、ラット、
ウシ、およびニワトリのＮＧＦのシグナルペプチド、卵
白リゾチームのシグナルペプチドおよびその変異体、ヒ
トインターロイキシン−２のシグナルペプチドなどが挙
げられる。また、プロペプチドとしては、ヒト、ラット
、マウス、ウシ、およびニワトリのＮＧＦのプロペプチ
ドなどが挙げられる。The gene encoding human NGF protein obtained above is linked downstream of the promoter, but in this case human NGF
It is desirable to link DNA encoding a signal peptide, or DNA encoding a signal peptide and DNA encoding a propeptide, to the 5' end of DNA encoding a protein. Any signal peptide may be used as long as it can secrete human NGF protein, and specific examples include human, mouse, rat,
Examples include signal peptides of bovine and chicken NGF, signal peptides of egg white lysozyme and variants thereof, and signal peptides of human interleuxin-2. Examples of the propeptide include human, rat, mouse, bovine, and chicken NGF propeptides.
上記の方法の他に、他の蛋白とヒトＮＧＦ蛋白質との融
合蛋白として分泌生産−きせたのち、適当なプロテアー
ゼで切断することによってヒトＮＧＦ蛋白質を得ること
もできる。In addition to the above method, human NGF protein can also be obtained by secreting and producing a fusion protein between another protein and human NGF protein, and then cleaving it with an appropriate protease.
上記のヒトＮＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡなどを用い
て動物細胞用のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターを構築す
る。A human NGF protein expression vector for animal cells is constructed using the DNA encoding the human NGF protein described above.
ヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターの構築に用いるベクター
としては、例えばｐＢＲ３２２およびその誘導体、ＳＶ
４０系ベクター、ウシパピローマウィルスベクター、レ
トロウィルスベクター、ＢＫウィルスベクターなどが挙
げられる。そのほかにＥＢウィルス、単純ヘルペスウィ
ルスなどの動物ウィルスをベクターとして用いることも
できる。Vectors used for constructing human NGF protein expression vectors include, for example, pBR322 and its derivatives, SV
Examples include 40 series vectors, bovine papilloma virus vectors, retrovirus vectors, and BK virus vectors. In addition, animal viruses such as EB virus and herpes simplex virus can also be used as vectors.
発現ベクターに用いるプロモーターとしては。As a promoter used in expression vectors.
動物細胞で機能するものであればいずれでもよく、例え
ば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタ
ロチオネインプロモーターなどが挙げられる。Any promoter may be used as long as it functions in animal cells, and examples thereof include the SV40 promoter, LTR promoter, and metallothionein promoter.
発現ベクターには、以上のほかに、エンハンサ−１ＲＮ
Ａスプライシングのシグナル、ポリＡ付加のシグナル、
選択マーカーなどを用いる。In addition to the above, the expression vector contains enhancer-1RN
A splicing signal, poly A addition signal,
Use selection markers etc.
発現ベクターを構築する方法自体は公知であり、例えば
、モレキュラークローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ）、アラポラトリーマニュアル、コールドス
プリングハーバ−ラボラトリ−（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｎｕｌ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）に記載さ
れている・。Methods for constructing expression vectors are known, for example, molecular cloning (MolecularCl
oning), A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (A Laboratory
ry Mannul, Co1d Spring Har
bor Laboratory) (1982).
このようにして作製したヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクター
を用いて動物細胞を形質転換する。Animal cells are transformed using the human NGF protein expression vector thus prepared.
動物細胞としては、例えばサルＶｅｒｏ細胞、チャイニ
ーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＣ１
２７細胞、マウスＢＡＬＢ３Ｔ３細胞などおよびリンパ
球系細胞、例えばマウス５ｐ２１０などが挙げられる。Examples of animal cells include monkey Vero cells, Chinese hamster CHO cells, mouse L cells, and mouse C1 cells.
27 cells, mouse BALB3T3 cells, and lymphoid cells such as mouse 5p210.
動物細胞を形質転換する方法は公知であり、例えば、グ
ラハム（Ｇｒａｈａ鵬）の方法〔ウィロロジー（Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）、５２，４５６（１９７３））などが挙げ
られる。Methods for transforming animal cells are known, for example, the method of Graham [Virology].
52, 456 (1973)).
以上のようにしてヒトＮＧＦ発現ベクターで形質転換さ
れた動物細胞が得られる。Animal cells transformed with the human NGF expression vector are obtained in the manner described above.
上記のヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターで形質転換された
動物細胞を用いてヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子を安定に発現
させる方法としては、ヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターが
導入細胞の染色体に組み込まれる方法と、導入細胞にお
いてヒトＮＧＦ蛋白質発現ベクターが染色体に組み込ま
れることなく安定に存在させる方法がある。前者の場合
には、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子
などの増幅系〔ジャーナルオブモレキュラーバイオロジ
−（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）１５９，６０１（１９８
２））を利用してヒトＮＧＦ蛋白質の生産量を増大させ
ることができる。Methods for stably expressing the human NGF protein gene using animal cells transformed with the human NGF protein expression vector described above include a method in which the human NGF protein expression vector is integrated into the chromosome of the introduced cell, and a method in which the human NGF protein expression vector is integrated into the chromosome of the introduced cell. There is a method for allowing the NGF protein expression vector to exist stably without being integrated into the chromosome. In the former case, for example, an amplification system such as the dihydrofolate reductase (DHFR) gene [Journal of Molecular Biology (J, Mo1. Biol.) 159, 601 (198
2)) can be used to increase the amount of human NGF protein produced.
形質転換された動物細胞（クローン）を選択する方法自
体は公知であり、例えば実験医学、臨時増刊号、Ｖｏｌ
、 ５ 、 Ｎｏ、１１，１９８７ （羊上社）に記載
されている。具体的には、ヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子と共
に選択マーカー遺伝子を指標にして形質転換株を選択す
る。この場合、選択マーカーをヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子
と同一ベクターに乗せて細胞に導入しても良く、また選
択マーカーをこれよりも多量のヒトＮＧＦ蛋白質遺伝子
とともに同一のベクターに導入せずに細胞に導入（ｃｏ
−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ） Ｌ／ても良い。こ
れらの選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）（メンドレキセート（ＭＴＸ）耐性〕
、チミジンキナーゼ、Ｅ ｃｏｇｐｔ遺伝子（ミコフェ
ノール酸耐性）、ｎｅＯ遺伝子（０４１８耐性）などが
挙げられる。さらに、このようにして選択マーカーを用
いて得られた形質転換株に対し、くり返しクローン選択
を行うことにより、遺伝子産物の高産生能を有する安定
な細胞株を得ることができるに
のようにして得られた動物細胞を培養する際、培地とし
ては、たとえば０．５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１２２，５０
１（１９５２））、ＤＭＥＭ培地〔ウィロロジー（Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ）、８，３９６（１９５９））、ＲＰＭ１
１６４０培地〔ジャーナルオブアメリカンメディカルア
ソシエーション（Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）、
１９９，５１９（１９６７）、１９９培地〔プロシージ
ングスオブソサイエティ オブエクスペリメントバイオ
ロジカルメディシン（Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｍｅｄ、７３．１ （１９５０））などが挙げら
れる。ＰＨは約６〜８であるのが望ましい。培養は通常
約３０”Ｃ〜４０℃約１５〜６０時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。The method of selecting transformed animal cells (clones) is known, for example, as described in Experimental Medicine, Special Issue, Vol.
, 5, No. 11, 1987 (Hijikamisha). Specifically, transformed strains are selected using the human NGF protein gene and the selection marker gene as indicators. In this case, the selection marker may be placed on the same vector as the human NGF protein gene and introduced into the cell, or the selection marker and a larger amount of the human NGF protein gene may be introduced into the cell without being placed on the same vector ( co
-transformation) L/ may be used. These selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase (DHFR) (mendrexate (MTX) resistance).
, thymidine kinase, E cogpt gene (mycophenolic acid resistance), neO gene (0418 resistance), and the like. Furthermore, by repeatedly performing clonal selection on the transformed strains obtained using the selection marker in this way, it is possible to obtain stable cell lines with high production ability of the gene product. When culturing the obtained animal cells, the medium may be ME containing, for example, 0.5 to 20% fetal bovine serum.
M medium [Science, 122, 50
1 (1952)), DMEM medium [Virology (Vi
logy), 8,396 (1959)), RPM1
1640 medium [Journal of American Medical Association (J, Am, Med, As5oc,),
199, 519 (1967), 199 Medium [Procedures of Society of Experimental Biological Medicine (Proc, Soc, Exp, Bi
ol, Med, 73.1 (1950)). Desirably, the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30"C to 40C for about 15 to 60 hours, with aeration and stirring added as necessary.
本発明のヒトＮＧＦ蛋白質は細胞内または細胞外に生成
、蓄積する。細胞内ヒトＮＧＦ蛋白質を培養物から抽出
するに際しては、培養後公知の方法で細胞を集め、塩酸
グアニジンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やトラ
イトンＸ−１００などの界面活性剤を含む緩衝液中に細
胞を懸濁させたのち、遠心分離によりヒトＮＧＦ蛋白質
を含む上澄液を得る方法、あるいは超音波処理や凍結融
解法によって細胞を破壊したのち、遠心分離によりヒト
ＮＧＦ蛋白質を含む上澄液を得る方法などを適宜用い得
る。The human NGF protein of the present invention is produced and accumulated intracellularly or extracellularly. To extract intracellular human NGF protein from a culture, collect the cells by a known method after culturing, and use a buffer containing a protein denaturant such as guanidine hydrochloride or urea or a buffer containing a surfactant such as Triton X-100. After suspending cells in a liquid, a supernatant containing human NGF protein can be obtained by centrifugation, or after cells have been disrupted by ultrasonication or freeze-thawing, a supernatant containing human NGF protein can be obtained by centrifugation. Any method for obtaining a clear liquid may be used as appropriate.
これらの上澄液や細胞外に生成、蓄積したヒトＮＧＦ蛋
白質を分離、精製するには自体公知の分離、精製法を適
切に組み合わせて実施すればよい。In order to separate and purify the human NGF protein produced and accumulated in these supernatants and extracellular cells, separation and purification methods known per se may be appropriately combined.
これらの公知の分離、精製法としては、塩析、硫安沈殿
および溶媒沈殿法などの溶解度の差を利用する法、透析
法、限外ろ過払、および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法
、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用
する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特
異的親和性を利用する方法、例えば抗体カラムおよびＣ
ｕ”＊ラムなどのメタルキレートカラム、逆相高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの疎水性の差を利
用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用
する方法などが挙げられる。These known separation and purification methods mainly include methods that utilize differences in solubility such as salting out, ammonium sulfate precipitation and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, and 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis. Methods that utilize differences in molecular weight, methods that utilize differences in charge such as ion exchange chromatography, and methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography, such as antibody columns and C
Examples include methods that utilize differences in hydrophobicity such as metal chelate columns such as u''*lam, reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC), and methods that utilize differences in isoelectric points such as isoelectric focusing. It will be done.
このようにして、活性体として、９０％（Ｗ ／ Ｗ
）以上の純度のもの、さらに好ましくは、９４％（Ｗ／
Ｗ ）以上の純度のものが得られる。該純度は、ＨＰ
ＬＣ，５ＤＳ−ＰＡＧＥ、生物活性から測定される。こ
のように、ヒトＮＧＦ蛋白質の純度９４％以上のものが
好ましい。In this way, as active form, 90% (W/W
) or higher purity, more preferably 94% (W/
W) or higher purity can be obtained. The purity is HP
Measured from LC, 5DS-PAGE, and biological activity. Thus, it is preferable that the human NGF protein has a purity of 94% or higher.
このようにして得られた本発明のヒトＮＧＦ蛋白質は活
性体であり、分子中に６個のシスティン残基を有し、Ｎ
末端から数えて第１番目のシスティン残基と第４番目の
システィン残基とが、第２番目のシスティン残基と第５
番目のシスティン残基とが、第３番目のシスティン残基
と第６番目のシスティン残基とが、それぞれジスルフィ
ド結合しているものである。The human NGF protein of the present invention thus obtained is an active form, has 6 cysteine residues in the molecule, and has NGF protein of the present invention.
The first cysteine residue and the fourth cysteine residue counting from the end are the second cysteine residue and the fifth cysteine residue.
The No. 3 cysteine residue, the No. 3 cysteine residue, and the No. 6 cysteine residue are each disulfide bonded.
上記のようにして得られるヒトＮＧＦ蛋白質は免疫学的
方法または生物活性に基づく方法で定量する。The human NGF protein obtained as described above is quantified by an immunological method or a method based on biological activity.
前者の例としては、バイオケミカルアンドバイオフィジ
カルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、
Ｂｉｏｐｈｙｓ 、 Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍｕｎ 、
）、 １５５，４８２（１９８８）に記載されているエ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる。後者
の例としては、ニワトリ胚を椎後根神経節（細胞成長因
子、日本組織培養学会編、朝食書店、１９８４年）、ラ
ット副腎髄質由来ＰＣ１２細胞〔プレインリサーチ（Ｂ
ｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１３３，３５０（１９
７７））などにおける神経線維の伸長、ラット中隔野コ
リン作動性ニューロンにおけるコリンアセチルトランス
フェラーゼ活性の誘導などを指標とした生物活性測定法
が挙げられる。An example of the former is Biochemical and Biophysical Research Communication (Biochem).
Biophys, Res, Commun,
), 155, 482 (1988). As an example of the latter, chicken embryos were used to produce dorsal root ganglia (Cell Growth Factors, edited by the Japanese Society of Tissue Culture, Shokuba Shoten, 1984), rat adrenal medulla-derived PC12 cells [Plain Research (B
rain Research), 133,350 (19
Examples of biological activity measurement methods include the elongation of nerve fibers in 77)) and the induction of choline acetyltransferase activity in rat septal cortex cholinergic neurons.
以上のようにして得られるヒトＮＧＦ蛋白質は、脳、神
経系の研究に用いる試薬として有用であり、また老人性
部はうの治療薬としても期待できる。The human NGF protein obtained as described above is useful as a reagent for research on the brain and nervous system, and is also expected to be used as a therapeutic agent for senile cysts.
ヒトＮＧＦ蛋白質をこれらの研究のために用いるには、
たとえばヒトＮＧＦ蛋白質を動物細胞培養用培地１ｍｆ
ｌあたり約０．１〜１ 、 ＯＯＯｎｇ ／ ｍ Ｑ、
さらに好ましくは約１〜１１００ｎとなる量を加えるこ
とが好ましい。To use human NGF protein for these studies,
For example, human NGF protein is added to 1 ml of animal cell culture medium.
Approximately 0.1-1 per l, OOOng/m Q,
More preferably, it is added in an amount of about 1 to 1100 n.
なお、本願発明明細書および図面において、塩基やアミ
ノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡ Ｃ−Ｉ Ｕ
Ｂ Ｃｏｍａ＋１ｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅ
ａ＋１ｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次にあげる。In addition, in the specification and drawings of the present invention, when bases, amino acids, etc. are indicated by abbreviations, IUPA C-I U
B Coma+1ission on Bioche
It is based on the a+1cal Nomenclature abbreviation or the common abbreviation in the field,
An example of this is given below.
またアミノ酸に関して光学異性体がありうる場合は、特
に明示しなければＬ体を示すものとする。Furthermore, if an amino acid has optical isomers, the L-isomer is indicated unless otherwise specified.
ＮＡ ＡまたはＡｌａ ＲまたはＡｒｇ ＮまたはＡｓｎ ＤまたはＡｓｐ ＣまたはＣｙｓ ＱまたはＧｌｎ ＥまたはＧｌｕ ＧまたはＧｌｙ ＨまたはＨｉｓ 工またはｌ１ｅ ＬまたはＬｅｕ ＫまたはＬｙｓ ＭまたはＭｅｔ ＦまたはＰｈｅ ＰまたはＰｒ。NA A or Ala R or Arg N or Asn D or Asp C or Cys Q or Gln E or Glu G or Gly H or His engineering or l1e L or Leu K or Lys M or Met F or Phe P or Pr.
デオキシリボ核酸
アデニン
シトニジ
グアニン
チミン
：アラニン
：アルギニン
：アスパラギン
：アスパラギン酸
ニジスティン
：グルタミン
：グルタミン酸
ニゲリシン
：ヒスチジン
：イソロイシン
：ロイシン
：リジン
：メチオニン
：フェニールアラニン
：プロリン
ＳまたはＳｅｒ ：セリン
ＴまたはＴｈｒ ：スレオニン
ＷまたはＴｒｐ ニトリブトファン
ＹまたはＴｙｒ ：チロシン
■またはＶａｌ：バリン
以下に、参考例、実施例を挙げて、本発明をさらに具体
的に説明するが、本発明はこれらに限定されることはな
い。Deoxyribonucleic acid adenine cytoni diguanine thymine: alanine: arginine: asparagine: nidistine aspartate: glutamine: nigericine glutamate: histidine: isoleucine: leucine: lysine: methionine: phenylalanine: proline S or Ser: serine T or Thr: threonine W or Trp Nitributophan Y or Tyr: Tyrosine ■ or Val: Valine The present invention will be explained in more detail with reference examples and examples below, but the present invention is not limited thereto.
また、参考例１で得られたエシェリヒア コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄ Ｈ１／ ｐ Ｍ Ｎ
Ｇ Ｆ １０１は、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に
平成１年４月６日から受託番号Ｉ Ｆ Ｏ１４８６９と
して寄託されており、またこのものは平成１年４月１５
日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲ
Ｉ）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２３８５として寄託さ
れている。参考例２で得られたエシェリヒア コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄ Ｈ１／ ｐ Ｍ
ＮＧ Ｆ ２０１は、工ＦＯに平成１年４月６日から
受託番号ＩＦ０１４８７０として寄託されており、また
このものは平成１年４月１５日からＦＲＩに受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２３８６として寄託されている。In addition, Escherichia coli (Esc
herichia coli) D H1/p M N
GF 101 has been deposited with the Institute for Fermentation Research (IFO) since April 6, 1999 under the accession number I F O14869,
Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Microbial Technology Research Institute (FR)
I) under accession number FERM BP-2385. Escherichia coli (E
scherichia coli) D H1/ p M
NG F 201 has been deposited with the FRI since April 6, 1999 under the accession number IF014870, and has been deposited with the FRI under the accession number F since April 15, 1999.
It has been deposited as ERM BP-2386.
また、実施例３で得られた形質転換動物細胞（クローン
化されたもの）ＣＨＯ−Ｄ５はＩＦＯに平成１年７月１
７日から受託番号Ｉ Ｆ Ｏ５０１９５として寄託され
ており、またこのものは平成１年８月４日からＦＲＩに
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４４として寄託されてい
る。実施例４で得られた形質転換動物細胞（クローン化
されたもの）ＣＨＯ−Ｄ ３１−１０はＩＦｏに平成１
年１１月１５日力ら受託番号Ｉ Ｆ Ｏ５０２１７とし
て寄託されており、またこのものは平成１年１２月７日
からＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７４として
寄託されている。In addition, the transformed animal cell (cloned) CHO-D5 obtained in Example 3 was sent to IFO on July 1, 1999.
It has been deposited with the FRI since August 4, 1999 under the accession number IF O50195. The transformed animal cell (cloned) CHO-D 31-10 obtained in Example 4 was transferred to IFo in Heisei 1.
It was deposited with the FRI on November 15, 1999 under the accession number IF O50217, and since December 7, 1999, it has been deposited with the FRI under the accession number FERM BP-2674.
実施例７で得られた形質転換動物細胞（クローン化され
たもの）ＣＨＯ−Ｄ３１−１０−２はＩＦＯに平成２年
３月２１日から受託番号ＩＦ０５０２３６として寄託さ
れており、またこのものは平成２年４月６日からＦＲＩ
に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−２８５１として寄託されて
いる。The transformed animal cell (cloned) CHO-D31-10-2 obtained in Example 7 has been deposited with IFO since March 21, 1990 under accession number IF050236, and this cell has been deposited with IFO since March 21, 1990. FRI from April 6, 2017
It has been deposited with the accession number FERM BP-2851.
なお、上記ＦＥＲＭ ＢＰで示される寄託はブダペス
ト条約に基づく寄託の受託番号を示す。The deposit indicated by FERM BP above indicates the deposit number based on the Budapest Treaty.
参考例１ ヒトＮＧＦ ベクターの構築（１）（第
２図）
ヒト白血球ＤＮＡより作製されたλＥＭＢＬ３ゲノムラ
イブラリー〔クロンチック（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）社〕を
大腸菌ＮＭ５３８に感染させたのち、軟寒天プレート上
に約３Ｘ１０’クローンずつ撒いた。プラークをナイロ
ンメンブラン（アマジャム社、ハイボンド−Ｎ）上に移
した後、０．５Ｎ Ｎ ａ ＯＨ−１，５ＭＮａＣ１溶
液に６分間浸し、ファージＤＮＡを変性させた後、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ Ｈ８，０）−１，５Ｍ
ＮａＣ１溶液に６分間浸した０本メンプランを２ＸＳＳ
Ｃ溶液に浸し、風乾後８０℃、２時間処理することによ
りＤＮＡをメンプランに固定した。Reference Example 1 Construction of Human NGF Vector (1) (Figure 2) After infecting Escherichia coli NM538 with a λEMBL3 genomic library (Clontech) prepared from human leukocyte DNA, approximately 3 x 10' clones were plated. The plaques were transferred onto a nylon membrane (Amarjam, Hybond-N) and immersed in a 0.5N NaOH-1, 5M NaCl solution for 6 minutes to denature the phage DNA.
5M Tris-HCl (pH 8,0)-1,5M
2XSS of 0-piece plank soaked in NaCl solution for 6 minutes
DNA was immobilized on the membrane plan by immersing it in C solution, air drying, and treating it at 80°C for 2 hours.
一方、既知〔アルリッチ（Ｕｌｌｒｉｃｈ、Ａ、）ら、
ネイチ’ｒ （Ｎａｔｕｒｅ） ３０３，８２１（１
９８３））のヒトＮＧＦ遺伝子を参考にしてヒトβＮＧ
ＦをコードするＤＮＡ （０，３８ｋｂ）を化学合成し
、これをＤＮＡラベリングキットにツポンジーン社）を
用いて３２Ｐで標識したものをプローブとした。On the other hand, it is known [Ullrich, A. et al.
Nature'r (Nature) 303,821 (1
Based on the human NGF gene of 983)), human βNG
DNA (0.38 kb) encoding F was chemically synthesized, and this was labeled with 32P using a DNA labeling kit (Tsupon Gene) and used as a probe.
ＤＮＡを固定したフィルターを、標識プローブを含む、
６ＸＳＳＣ（ＩＸＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣ１，０，
０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、 ５ Ｘ Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ’ｓ。A filter with immobilized DNA containing a labeled probe,
6XSSC (IXSSC=0.15M NaC1,0,
015M Sodium Citrate), 5X Denha
rdt's.
０．５％Ｓ Ｄ Ｓ 、２０Ｐｇ／ ｍ Ｑ変性サケ精
子ＤＮＡ溶液中１０ｍＱ中で６５℃、１６時間、保温し
た。反応後、フィルターを２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ
溶液中で室温で５分ずつ３回、ｌＸ５ＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳ溶液中で、６０℃で６０分洗浄した。洗浄したフィ
ルターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プ
ローブと反応するクローンを検索した。この方法により
得られたクローンλβＬＮ２１１３よりデイヴイス（Ｄ
ａｖｉｓ）らの方法（Ｄａｖｉｓら、〔アドバンスト・
バクチリアル・ジエネテイクス（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ、Ｃｏ１ｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
１９８０）によりファージＤＮＡを抽出した。The cells were incubated at 65° C. for 16 hours in 10 mQ of a 0.5% SDS, 20 Pg/m Q denatured salmon sperm DNA solution. After reaction, filter with 2XSSC, 0.1% SDS
1×5SC, 0.1% S, 3 times for 5 min each in solution at room temperature.
Washed in DS solution at 60°C for 60 minutes. After drying the washed filter, a radioautogram was taken to search for clones that reacted with the probe. Davies (D) from clone λβLN2113 obtained by this method.
avis) et al. (Davis et al., [Advanced
Bacterial Genetics (Advanced B
Acterial Genetics) J, Co1d
Spring Harbor Laboratory
Phage DNA was extracted by (1980).
次にλβＬＮ２１１３をＳｍａ １とＡｐａｌで切断し
、ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ （約１ ｋｂ）を切
り出し、プラスミドｐ Ｂ １ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ
Ｋ （トーヨーボーより購入）のＳｍａ Ｉｓ Ａｐ
ａ １部位に挿入し、プラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを
得た。Next, λβLN2113 was cut with Sma 1 and Apal, and the DNA (approximately 1 kb) containing the human NGF gene was excised, and the plasmid pB 1uescript II was cut out.
Sma Is Ap by K (purchased from Toyobo)
a1 site to obtain plasmid pNGFP107G.
挿入された部分の塩基配列をシークナーゼ（ｌｌｎｉｔ
ｅｄ ５ｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｓｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐｏｒａｒｉｏｎ）を用いて決定した（第１図）。決定
された塩基配列はネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３０３
，８２１（１９８３）に記載されている配列と、蛋白コ
ード領域では完全に一致した。The nucleotide sequence of the inserted portion was extracted using sequencenase (llnit).
ed 5tates Biochemical Cor
polarion) (Fig. 1). The determined base sequence is published in Nature, 303
, 821 (1983) in the protein coding region.
上記のファージλβＬＮ２１１３ＤＮＡを制限酵素Ｂｇ
ＱＩＩで切断し、ヒトＮＧＦを含むＤＮＡ断片（１，８
ｋｂ）を単離した。一方、動物細胞用の発現ベクターｐ
Ｋ Ｓ Ｖ−１０（ファルマシア）を制限酵素Ｂｔｒ
、Ｑｎで切断し、上記のヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ
断片（１，８ｋｂ）とＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。The above phage λβLN2113 DNA was digested with restriction enzyme Bg.
A DNA fragment containing human NGF (1,8
kb) was isolated. On the other hand, expression vector p for animal cells
KSV-10 (Pharmacia) and restriction enzyme Btr
, DNA containing the above human NGF gene cut with Qn
The fragment (1.8 kb) was ligated with T4 DNA ligase.
この反応液を用いてエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体の１つ〔エシェリヒアコ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ１／ ｐ
ＭＮＧ ＦＩＯＩ（ＩＦｏ １４８６９． ＦＥＲＭ
ＢＰ−２３８５）から単離したプラスミドをｐＭＮＧ
Ｆｌｏｌと命名した（第２図）。Using this reaction solution, Escherichia coli (Escher
ichia coli) D H1 was transformed,
One of the ampicillin-resistant transformants [Escherichia coli DH1/p
MNG FIOI (IFo 14869. FERM
The plasmid isolated from BP-2385) was transformed into pMNG
It was named Flol (Figure 2).
参考例２ ヒトＮＧＦ ベクターの ２（第３
図）
参考例１で得られたプラスミドｐＮＧＦＰ１０７Ｇを制
限酵素ＢａＱＩおよびＡｐａｌで切断し。Reference example 2 Human NGF vector 2 (3rd
Figure) Plasmid pNGFP107G obtained in Reference Example 1 was cut with restriction enzymes BaQI and Apal.
ヒトＮＧＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片（０，８ｋｂ）を単
離した。この０．８ｋｂ ＢＣＱ Ｉ−Ａｐａ Ｉ断片
と化学合成アダプターＳＮＩ、ＳＮ２および５Ｎ３（第
３図参照）とを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した
のち、ＢｇＱｎで切断することによって０．８ｋｂ Ｈ
ｉｎｄｌ［Ｉ−ＢｇＱＴＩ ＤＮＡ断片が得られた。A DNA fragment (0.8 kb) containing the human NGF gene was isolated. This 0.8 kb BCQ I-Apa I fragment was mixed with chemically synthesized adapters SNI, SN2, and 5N3 (see Figure 3), ligated with T4 DNA ligase, and then cut with BgQn to obtain 0.8 kb H
An indl[I-BgQTI DNA fragment was obtained.
プラスミドｐＳＶ２−ｇｐｔ（サイエ：／ Ｘ （Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ）、２０９．１４２２（１９８０））を制限
酵素Ｅ ｃ ｏ ＲｌとＨｉｎｄＩ［［で切断し、ＳＶ
４０プロモーターを含む２．６ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｈｉ
ｎｄｍ ＤＮＡ断片を単離した１次にプラスミドｐＭ
ＴＶｄｈｆｒ（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、 ２９４
，２２８（１９８１））よりｐｏｌｙＡ付加領域を含む
１．６ｋｂ ＢｇＱＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を単離した。Plasmid pSV2-gpt (Sc)
209.1422 (1980)) was cut with the restriction enzymes E co Rl and HindI [[, and SV
2.6kb EcoRI-Hi containing 40 promoters
Primary plasmid pM from which the ndm DNA fragment was isolated
TVdhfr (Nature), 294
, 228 (1981)), a 1.6 kb BgQII-EcoRI fragment containing the polyA addition region was isolated.
上記（７）ＳＶ４０プｏモーターを含む２．６ｋｂ Ｅ
ｃ 。2.6kb E including the above (7) SV40 motor
c.
Ｒ１−Ｈｌｎｄｎｌ ＤＮＡ断片、ヒトＮＧＦ遺伝子を
含む０．８ｋｂ Ｈｉｎｄｌ［Ｉ−ＢｇＱＴＩ ＤＮ
Ａ断片およびｐｏｌｙＡ付加領域を含む１．６ｋｂ Ｂ
ｇ Ｑ ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結した。R1-Hlndnl DNA fragment, 0.8kb Hindl[I-BgQTI DN containing human NGF gene
1.6kb B containing A fragment and polyA addition region
g The Q II-EcoRI fragments were ligated with T4 DNA ligase.
この反応液を用いてエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｄ Ｈ１の形質転換を行い、
アンピシリン耐性の形質転換体〔エシェリヒア コリ（
Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｄ Ｈ１／ ｐ
Ｍ Ｎ Ｇ Ｆ ２０１（ＩＦｏ １４８７０゜ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−２３８６））から単離したプラスミドをｐＭ
ＮＧＦ２０１と命名した（第３図）。Using this reaction solution, Escherichia coli (Escher
ichia coli) D H1 was transformed,
Ampicillin-resistant transformant [Escherichia coli (
Eseherichia coli)D H1/p
M N G F 201 (IFo 14870°FER
The plasmid isolated from M BP-2386)) was transformed into pM
It was named NGF201 (Figure 3).
参考例３
ヒトＮＧＦのＮ末ペプチドの合成は自動ペプチド合成機
４３０Ａ （アプライド・バイオシステムズ社製）を用
いた固相合成法にて行なった。プログラムは「スタンダ
ード」を用いた。基本的な合成過程等は、メリーフィー
ルドアールビー（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、 Ｒ，Ｂ、）
（１９６９）アドバンスオブエンザイモロジー（Ａｄｖ
、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、） ３２．２２１−２９６の方法
に準じている。レジンにはＢｏＣ−Ｃｙｓ （ＭｅＢｚ
ｌ） ・ＰＡＭ−Ｐ（０，５ｍｍｏｌ／ｇ）を用い、
力Ｊレボキシル末端から順次合成した。Ｂｏｃ−アミノ
酸としてＢｏｃ−Ｖａｌ、ＢｏＣ−８ｅｒ （Ｂｚｌ）
、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＢｏＣ−Ｇｌｕ （ＯＢｚｌ）、
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ （Ｔｏｓ）、Ｂｏ
ｃ−Ｈｉｓ （Ｔｏｓ）、ＢｏＣ−１１ｅ。Reference Example 3 The N-terminal peptide of human NGF was synthesized by solid phase synthesis using an automatic peptide synthesizer 430A (manufactured by Applied Biosystems). The "Standard" program was used. The basic synthesis process is described by Merrifield, R.B.
(1969) Advance of Enzymology (Adv
, Enzymol, ) 32.221-296. The resin is BoC-Cys (MeBz
l) Using PAM-P (0.5 mmol/g),
Synthesis was carried out sequentially starting from the J levoxyl terminus. Boc-Val as Boc-amino acid, BoC-8er (Bzl)
, Boc-Phe, BoC-Glu (OBzl),
Boc-Gly, Boc-Arg (Tos), Bo
c-His (Tos), BoC-11e.
ＢｏＣ−Ｐｒｏを用いた。アミノ末端Ｓｅｒまで合成し
たのち、ペプチドレジンを合成機から取り出し、乾燥し
た。BoC-Pro was used. After synthesis up to the amino terminal Ser, the peptide resin was taken out from the synthesizer and dried.
ペプチドレジン１ｇに１．５ｍ Ｑのｐ−クレゾールお
よび０．５ｍ Ｑの１，２−エタンジチオールを加え、
さらに約８ｍＱの液体フッ化水素を加えて、０℃で２時
間反応させた。反応終了後、デシケータ−中でフッ化水
素を減圧除去し、０．１％の２−メルカプトエタノール
を含むジエチルエーテルで、続いてジエチルエーテルで
洗い、大部分の混在試薬を除去した。ペプチドを１０ｍ
Ｑの３％酢酸で抽出し、ろ過により抽出液中に混入し
ているレジンを除いた。ろ液をセファデックス（Ｓｅｐ
ｈａｄｅｘ） Ｇ −２５を用いるゲルろ過により精製
した。ゲルろ過条件は、カラムサイズ２，８Ｘ６０ａｎ
＊検出波長２３０ｎｍ：溶媒３％酢酸；流速４０ｍ党
／ｈｒであった。Add 1.5 m Q of p-cresol and 0.5 m Q of 1,2-ethanedithiol to 1 g of peptide resin,
Further, about 8 mQ of liquid hydrogen fluoride was added, and the mixture was reacted at 0°C for 2 hours. After the reaction was completed, hydrogen fluoride was removed under reduced pressure in a desiccator, and most of the mixed reagents were removed by washing with diethyl ether containing 0.1% 2-mercaptoethanol and then with diethyl ether. 10m of peptide
The mixture was extracted with 3% acetic acid (Q), and the resin mixed in the extract was removed by filtration. The filtrate was treated with Sephadex (Sep.
purified by gel filtration using G-25 (Hadex) G-25. Gel filtration conditions are column size 2.8 x 60an
*Detection wavelength: 230 nm: Solvent: 3% acetic acid; Flow rate: 40 m/hr.
ペプチドを含むフラクションを集めて凍結乾燥し、得ら
れた粉末標品について逆相高速液体クロマトグラフィー
によりさらに精製した。カラムＭＭＣパック、Ａ −３
２４０Ｄ Ｓ １０ Ｘ ２５０ａｎ ；カラム温度２
５℃；溶出溶媒ＡＯ０１％−トリフルオロ酢酸水−９９
，９％蒸留水；溶出溶媒ＢＯ０１％−トリフルオロ酢酸
水−９９，９％アセトニトリル；溶出プログラム ０分
（９０％Ａ＋１０％Ｂ）、３０分（６０％Ａ＋４０％Ｂ
）；溶出速度１．６ｍ Ｑ ／分、検出波長２３０ ｎ
ｍ ｓ本条件下で保持時間２９．１４分に溶出された
主ピーク画分を集めて、バイオラッドＡＧＩＸ８ （Ａ
ｃＯＨ型、１，８Ｘ５３）のカラムに通し、洗液も集め
、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥した。白色粉
末７６■を得た。薄層クロマトグラフィー：Ｒｆ＝０．
７１（アビセルゲルプレート；展開溶媒；ｎ−ブタノー
ル：ＡｃＯＨ：ピリジン：水＝３０：２０：６：４）、
エルマンジーエル（Ｅｌｍａｎ、Ｇ、Ｌ、）（１９５９
）アーキテクチュアルバイオケミストリーアンドバイオ
フイジクス（Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、）８２．７０−７７法による遊離のＳＨ基の定
量：９７％。Fractions containing the peptide were collected and lyophilized, and the resulting powder preparation was further purified by reversed-phase high performance liquid chromatography. Column MMC pack, A-3
240D S 10 x 250an; Column temperature 2
5℃; Elution solvent AO01%-trifluoroacetic acid water-99
,9% distilled water; Elution solvent BO01%-trifluoroacetic acid water-99,9% acetonitrile; Elution program 0 minutes (90% A + 10% B), 30 minutes (60% A + 40% B)
); Elution rate 1.6 mQ/min, detection wavelength 230 n
m s Under these conditions, the main peak fraction eluted at a retention time of 29.14 minutes was collected, and BioRad AGIX8 (A
It was passed through a cOH type, 1,8×53) column, the washing solution was collected, the acetonitrile was distilled off, and then freeze-dried. 76 square meters of white powder was obtained. Thin layer chromatography: Rf=0.
71 (Avicel gel plate; developing solvent; n-butanol: AcOH: pyridine: water = 30:20:6:4),
Elman, G. L. (1959)
) Architectural Biochemistry and Biophysics (Arch, Biochem, Biop
hys,) 82. Determination of free SH groups by method 70-77: 97%.
アミノ酸分析値 Ｓｅｔ ３．９９（４）； Ｇｌｕ
１．００（１）：Ｐｒｏ ０．９８（１）； Ｇｌｙ
１．１９（１）； １／２Ｃｙｓ Ｏ，８４（１）
：Ｖａｌ １．０３（１）： Ｉｌｅ １．０１（
１）； Ｐｈｅ ２．１２（２）；）１ｉｓ １．８４
（２）、 Ａｒｇ ０．９４（１）。回収率 ７１．１
％。Amino acid analysis value Set 3.99 (4); Glu
1.00(1): Pro 0.98(1); Gly
1.19(1); 1/2Cys O, 84(1)
:Val 1.03(1): Ile 1.01(
1); Phe 2.12(2);)1is 1.84
(2), Arg 0.94(1). Recovery rate 71.1
%.
１ ／ ２ Ｃｙ ｓは過ギ酸酸化法により定量した。1/2Cys was determined by performic acid oxidation method.
カッコ内は理論値を示す。Values in parentheses indicate theoretical values.
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（１３２■）を３ｍ１ｌ
の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解した。3ml of bovine serum albumin (BSA) (132■)
was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.5).
この溶液に１１．２■のＮ−（γ−マレイミドブチルオ
キシ）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）を含有するジメチル
アミド溶液（２００μΩ）をスタージーで撹拌しながら
滴下し、３０℃で３０分間反応を行った。A dimethylamide solution (200 .mu..OMEGA.) containing 11.2 .mu. of N-(.gamma.-maleimidobutyloxy)succinimide (GMBS) was added dropwise to this solution while stirring with a Stargie, and the reaction was carried out at 30.degree. C. for 30 minutes.
反応液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１６．５）−０，
１Ｍ Ｎ ａＣＱで溶出液とした５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
２５（１，５Ｘ ３０ｅｍ ）で精製し、マレイミド基
が導入されたＢ、ＳＡ（マレイミド化ＢＳＡ）を得た。The reaction solution was diluted with 0.1M phosphate buffer (p) 16.5)-0,
5ephadexG- eluted with 1M NaCQ
25 (1,5× 30<em>) to obtain B and SA (maleimide BSA) into which a maleimide group was introduced.
上記のマレイミド化ＢＳＡ（２０■）を０．１Ｍすン酸
緩衝液（ｐＨ６，５）−０，ＩＭ Ｎ ａ ＣＱに溶解
した。The above maleimidated BSA (20 µ) was dissolved in 0.1 M sulfate buffer (pH 6.5)-0, IM Na CQ.
一方、上記（１）で得られたヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド
（５■）を０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）−５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに溶解した。両溶液を混合しく全容量５ｍ
Ｑ以下）、３０℃で６０分間反応を行い、ＰＢＳを加え
てヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドとＢＳＡとの複合体を含
む溶液１２ｍ Ｑを得た。本溶液を１．５ｍＱづつ分注
し、ウサギの免疫に使用した。On the other hand, human NGF N-terminal peptide (5■) obtained in (1) above was added to 0.1M phosphate buffer (pH 6.0) - 5m
Dissolved in MEDTA. Mix both solutions in a total volume of 5 m.
Q), the reaction was carried out at 30°C for 60 minutes, and PBS was added to obtain a solution 12mQ containing a complex of human NGF N-terminal peptide and BSA. This solution was dispensed into 1.5 mQ portions and used for rabbit immunization.
ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド の 製上記で得られた
ヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチドとＢＳＡとの複合体をＦｒｅ
ｕｎｄのｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔとよく混
合し、その混合物をウサギの皮下に注射した。以後、２
週問おきに上記複合体とＦｒｅｕｎｄのｉｎｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔとの混合物を同じウサギに注
射した。Preparation of human NGF N-terminal peptide The complex of the human NGF N-terminal peptide obtained above and BSA was
und complete adjuvant and the mixture was subcutaneously injected into rabbits. From now on, 2
The above complex and Freund's incompl every other week
A mixture with ete adjuvant was injected into the same rabbit.
上記のようにして免疫したウサギから採取して得られた
血液を遠心分離し、抗血清を得た。得られた抗血清の抗
体価をヒトＮＧＦ Ｎ末ペプチド（前出）とヒト血清ア
ルブミンとの複合体を抗原とするＥＬＩＳＡで測定した
結果、高い抗体価が認められた。Blood collected from rabbits immunized as described above was centrifuged to obtain antiserum. The antibody titer of the obtained antiserum was measured by ELISA using a complex of human NGF N-terminal peptide (described above) and human serum albumin as an antigen, and a high antibody titer was observed.
上記の抗血清を硫安塩析、ＤＥＡＥセルロースカラムク
ロマトグラフィーによって精製し、抗ヒトＮＧＦ Ｎ末
ペプチド抗体を得た。The above antiserum was purified by ammonium sulfate salting out and DEAE cellulose column chromatography to obtain an anti-human NGF N-terminal peptide antibody.
実施例１ ヒトＮＧＦ ベクターの構築参考例２で
得られたプラスミドＰＭＮＧＦ２０１をＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメン
ト反応により平滑化したのち、ＢｇＱＵで切断して約０
，８ｋｂＤＮＡ断片を分離した。Example 1 Construction of human NGF vector Plasmid PMNGF201 obtained in Reference Example 2 was transformed into HindIII
After cutting with DNA polymerase Klenow fragment reaction and blunting with
, an 8 kb DNA fragment was isolated.
一方プラスミドｐＴＢ３９９（特開昭６１−６３２８２
に記載）をＥｃｏＲＩで切断後、 Ｋ ｌｅｎｏｗフラ
グメント反応により平滑化したのち、ＢｇＱＵで切断し
て約３．９ｋｂ ＤＮＡ断片を得た。これら２つのＤＮ
Ａ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ反応により環状化し、プラ
スミドｐ Ｔ Ｂ １０５４を得た。On the other hand, plasmid pTB399 (JP-A-61-63282
) was cut with EcoRI, blunted by Klenow fragment reaction, and then cut with BgQU to obtain a DNA fragment of approximately 3.9 kb. These two DNs
The A fragment was circularized by T4 DNA ligase reaction to obtain plasmid pTB1054.
次に、ハムスターＤＨＦＲｃＤＮＡを有するプラスミド
ｐＴＢ３４８ （特開昭６１−６３２８２に記載）をＣ
１ａｌで切断後アルカリ性フォスファターゼで処理し、
Ｃ１ａｌで切断したｐＴＢ１０５４より分離精製された
２、４ｋｂＤＮＡ断片（ＭｎＬＶＬＴＲ、ヒトＮＧＦ
（ｈＮＧＦ）遺伝子、および５Ｖ４０ＤＮＡ由来スプラ
イス領域、ポリ（Ａ）付加領域を含む）と混合して、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ反応によりヒトＮＧＦ発現ベクターｐ
ＴＢ１０５８を構築した（第４図）。Next, plasmid pTB348 (described in JP-A-61-63282) containing hamster DHFR cDNA was
After cleavage with 1al, treatment with alkaline phosphatase,
A 2.4 kb DNA fragment (MnLVLTR, human NGF) isolated and purified from pTB1054 cut with C1al.
(hNGF) gene, 5V40 DNA-derived splice region, and poly(A) addition region).
Human NGF expression vector p was generated by DNA ligase reaction.
TB1058 was constructed (Figure 4).
実施例２ ＣＨＯの７ 転
ファルコンシャーレ（直径６ ａａ ）に５％牛脂児血
清を含むハム１２培地を入れ、ハムスターＤＨＦＲ−Ｃ
ＨＯ細胞を３７℃で一晩培養した。培養後、この細胞（
７Ｘ１０’個／デイツシュ）を、実施例１で得らたヒト
ＮＧＦ発現ベクターｐＴＢ１０５８（１０μｇ）を用い
てグラハムらの方法〔ウィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
） ５２：４５６−４６７（１９７３））に従って形質
転換した。４時間３７℃で培養後、新たな培地に代えて
培養を続けた。２日後に、５％透析牛脂児血清および３
５μｇｌ論Ｑのプロリンを含むダルベツコ改変ＭＥＭ培
地で液替えを行って、以後この選択培地で培養を続ける
と約２〜３週間後に、ＤＭＦＲ＋どなって増殖した細胞
がコロニーを形成した。Example 2 Hamster DHFR-C culture medium containing 5% beef tallow serum was placed in a CHO seven-sided falcon Petri dish (diameter 6 aa).
HO cells were cultured overnight at 37°C. After culturing, this cell (
Using the human NGF expression vector pTB1058 (10 μg) obtained in Example 1, the method of Graham et al.
) 52:456-467 (1973)). After culturing at 37°C for 4 hours, the culture medium was replaced with a new medium and culture was continued. After 2 days, 5% dialyzed tallow serum and 3
The medium was replaced with Dulbecco's modified MEM medium containing 5 μgl of proline, and the culture was continued in this selective medium. After about 2 to 3 weeks, DMFR+ rapidly proliferating cells formed colonies.
実施例３ 形 転 体のクローニングおよびヒト実施例
２で得た形質転換細胞のクローニングを、公知の方法（
例えばリミテッドダイリューション法）に従って行ない
、形質転換体（クローン化されたもの）ＣＨＯ−Ｄ５
（ＩＦＯ５０１９５゜ＦＥＲＭ ＢＰ−２５４４）、
ＣＨＯ−Ｄ４２およびＣＨＯ−Ｍ２Ｓを得た。Example 3 Cloning of transformants and humans Cloning of the transformed cells obtained in Example 2 was carried out using known methods (
For example, the transformant (cloned one) CHO-D5
(IFO50195°FERM BP-2544),
CHO-D42 and CHO-M2S were obtained.
クローニング終了後は、各クローン細胞を、５％牛脂児
血清、３５μｇ／ｍ Ｑのプロリン、 ５０ＩＵ／ｍＱ
ペニシリンおよび５０μｇ／閣Ｑストレプトマイシンを
含むダルベツコ改変ＭＥＭ培地にて培養した。After cloning, each cloned cell was treated with 5% tallow serum, 35 μg/mQ proline, and 50 IU/mQ.
The cells were cultured in Dulbecco's modified MEM medium containing penicillin and 50 μg/Kaku Q streptomycin.
分離された各クローンの細胞はリンプロデイツシュにま
き、細胞が約８０％コンフルエントになった時、新しい
培地と交換して、７２時間培養後、培養上清中のＮＧＦ
をＥＩＡ（ベーリンガー社；バイオケミカル バイオフ
ィジカル リサーチ コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｗ鵬ｕｎ＊
＠Ｌ壜、４８２（１９８８））で定量した。The cells of each isolated clone were sown on a lymphoid tissue, and when the cells became approximately 80% confluent, the medium was replaced with fresh medium, and after culturing for 72 hours, NGF in the culture supernatant was added.
EIA (Boehringer; Biochemical Biophysical Research Communication (Bioch)
em, Biophys, Res, Cowpeng*
@L Bottle, 482 (1988)).
ヒトＮＧＦ生産量の高いクローンを第１表に示す。なお
、形質転換されていないＣＨＯ細胞の培養上清にはＮＧ
Ｆは検出されなかった。Table 1 shows clones with high human NGF production. In addition, NG is added to the culture supernatant of untransformed CHO cells.
F was not detected.
第１表
形質転換体（クローン） ＮＧＦ（ｎｇ／ｍＱ）ＣＨ
Ｏ−Ｄ５ １１０ＣＨＯ−Ｄ４
２ ３９ＣＨＯ−Ｍ２Ｓ
２４以上の結果から、ヒトＮＧＦ遺伝
子を恒久的に発現するＣＨＯ細胞は該遺伝子を一時的に
発現するＣＯ８細胞よりも多量のヒトＮＧＦを生産する
ことができることが明らかになった。Table 1 Transformants (clones) NGF (ng/mQ) CH
O-D5 110CHO-D4
2 39CHO-M2S
24 These results revealed that CHO cells that permanently express the human NGF gene can produce a larger amount of human NGF than CO8 cells that temporarily express the gene.
実施例４ ヒトＮＧＦ高産生ＣＨｏ ａ！実施例３と
同様の方法で得られた形質転換体ＣＨＯ−Ｄ３１を１０
ｎＭメソトレキセート（ＭＴＸ）を含むダルベツコ改変
ＭＥＭ（５％牛脂児血清３５μｇ ／ ｍ Ｑプロリン
を含む）にて培養した。このクローンは、この濃度のＭ
ＴＸでは正常な増殖を示したので、ＭＴＸ濃度を１１０
０ｎに上げて継代し培養をつづけた。更に、ＭＴＸ濃度
を１μＭとすると大半の細胞が死滅したが、３〜４日後
に液替を行って培養を続けると１０５個の細胞当り数個
の細胞がコロニー状に増殖をはじめた。これらの細胞が
十分増殖したのち、１０ＭＭ ＭＴＸの培養液にて継代
すると再び大半の細胞が死滅し、数個の細胞が、コロニ
ー状に増殖をはじめた。このようにして得られた細胞は
１０ＭＭ ＭＴＸ存在下に、安定した正常な増殖を示し
、又ＭＴＸを含まない培養液に戻して増殖させ数代継代
したのち、ｌＯμＭ ＭＴＸ存在下に培養しても正常に
増殖した。Example 4 Human NGF high production CHo a! The transformant CHO-D31 obtained by the same method as in Example 3 was
Cultured in Dulbecco's modified MEM (containing 5% tallow serum 35 μg/m Q-proline) containing nM methotrexate (MTX). This clone has this concentration of M
Since TX showed normal proliferation, the MTX concentration was increased to 110
The culture was continued by subculturing the cells to 0n. Furthermore, when the MTX concentration was set to 1 μM, most of the cells died, but when the solution was changed after 3 to 4 days and the culture was continued, several cells per 10 5 cells began to proliferate in the form of colonies. After these cells had sufficiently proliferated, when they were subcultured in a 10 MM MTX culture solution, most of the cells died again, and a few cells began to proliferate in the form of colonies. The cells thus obtained showed stable and normal growth in the presence of 10 MM MTX, and were grown again in MTX-free culture medium and passaged for several generations, and then cultured in the presence of 10 μM MTX. also grew normally.
この１０ＭＭ ＭＴＸに耐性のＣＨＯ−Ｄ３１−１０細
胞（ＩＦＯ５０２１７，ＦＥＲＭ ＢＰ−２６７４）を
実施例３と同じ条件で培養したところ、４ ｍ ｇ ／
ＱのヒトＮＧＦが培地中に生産されていることがＥＩ
Ａで分かった。When CHO-D31-10 cells (IFO50217, FERM BP-2674) resistant to 10 MM MTX were cultured under the same conditions as in Example 3, 4 mg /
EI indicates that Q human NGF is produced in the medium.
I got it from A.
実施例５ 旦ΣＮ見凡魚見鼠（１）
実施例４で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を５％
牛脂児血清、 ３５μｇ／ｎｆｉプロリン、 ５０ＩＵ
／ｍＱペニシリン、５０Ｍｇ／ａρストレプトマイシン
および１０μ阿メソトレキセートを含むダルベツコ改変
培地で５％炭酸ガス中で、３７℃、７日間大量に培養し
たところ、培地中に２．４ｍ ｇ ／ ＱのヒトＮＧＦ
が生産されていることがＥＩＡで分かった。Example 5 DanΣN Mibon Uomi Nezumi (1) 5% of the cell line CHO-D31-10 obtained in Example 4
Tallow baby serum, 35μg/nfi proline, 50IU
When cultured in large quantities at 37°C for 7 days in Dulbecco's modified medium containing /mQ penicillin, 50 Mg/aρ streptomycin, and 10 μ amethotrexate in 5% carbon dioxide gas, 2.4 mg/Q human NGF was found in the medium.
The EIA revealed that it is being produced.
培養液を遠心分離し、その培養上清２．２ＱにＡＰＭＳ
Ｆを最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、０．２Ｎ
酢酸でｐＨ６，０に補正したのち遠心分離した。Centrifuge the culture solution and add APMS to 2.2Q of the culture supernatant.
Add F to a final concentration of 0.1mM, and add 0.2N
After correcting the pH to 6.0 with acetic acid, the mixture was centrifuged.
得られた上清を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡで平衡化させたＳ −Ｓ ｅｐｈａｒｏｓ
ｅカラム（２，６ｃ ｍ Ｘ１４ｃ ｍ）に吸着させ、
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ Ｈ６，０−０，１５Ｍ Ｎ
ａ ＣＱ −１ｍＭ Ｅ ＤＴ Ａ−１０％グリセロー
ルで洗浄したのち、５０ｍＭＴｒｉ ５−ＨＣＱ ｐ
Ｈ７，５−０，７Ｍ ＮａＣＱ−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１
０％グリセロールで溶出した。The obtained supernatant was added to 0.1M phosphate buffer pH 6,0-1m
S-S epharos equilibrated with MEDTA
Adsorb onto e-column (2.6cm x 14cm),
0.1M phosphate buffer pH6,0-0,15M N
a After washing with CQ-1mM EDT A-10% glycerol, 50mM Tri 5-HCQ p
H7,5-0,7M NaCQ-1mM EDTA-1
Elution was performed with 0% glycerol.
ヒトＮＧＦを含むフラクションを集め、ダイアフローセ
ル（タイプＹＭＩＯ，アミコン社）で約３０倍に濃縮し
た。得られた濃縮液を２０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ５−ＨＣ
Ｑ ｐＨ７，４−０，５Ｍ ＮａＣＱ−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ−１０％グリセロールで平衡化させた５ｅｐｈａｃ
ｒｙｌ Ｓ−１００ＨＲ（２００ｍ Ｑ 、 １．６ｃ
ｍ Ｘ１００ｃ ｍ）でゲルろ過した。ヒトＮＧＦを
含むフラクションを集めセントリプレツブ１０（アミコ
ン社）で約１０倍に濃縮した。得られた濃縮液を逆相Ｈ
ＰＬＣにかけ、ヒトＮＧＦを精製した。即ち、該濃縮液
をＡｓａｈｉｐａｋ ＯＤ Ｐ −５０（１０，０ｍｍ
Ｉ Ｄ Ｘ２５０ｍｍＬ）カラムにかけ、０．１％ト
リフルオロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリルの濃度
勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ １．２ｍｇ （アミノ
酸分析より）を得た。本精製の要約を第２表に示す。５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（第５図）およ
び逆相ＨＰＬＣの結果、得られた組換え型ヒトＮＧＦの
純度は９４％であった。Fractions containing human NGF were collected and concentrated approximately 30 times using a Diaflow cell (type YMIO, Amicon). The obtained concentrate was diluted with 20mM Tri 5-HC.
Q pH7,4-0,5M NaCQ-1mM ED
5ephac equilibrated with TA-10% glycerol
ryl S-100HR (200m Q, 1.6c
Gel filtration was performed using 100 cm x 100 cm). Fractions containing human NGF were collected and concentrated approximately 10 times using Centriprep 10 (Amicon). The obtained concentrate was subjected to reverse phase H
Human NGF was purified by PLC. That is, the concentrate was purified by Asahipak OD P-50 (10.0 mm
The mixture was applied to a 0-90% acetonitrile concentration gradient containing 0.1% trifluoroacetic acid to obtain 1.2 mg of purified human NGF (from amino acid analysis). A summary of this purification is shown in Table 2. 5
As a result of DS-polyacrylamide gel electrophoresis (Fig. 5) and reverse phase HPLC, the purity of the obtained recombinant human NGF was 94%.
第２表 組換え型ヒトＮＧＦの精製の要約培養上清
２，２００ １１，０００ ５．３
１０Ｏ５−５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ 、
５ ２４ ５ 、０ ９４Ｓｅｐ
ｈａｃｒｙｌ Ｓ−１００２，５３，７４，７８９逆相
ＨＰＬＣ１，３１，６３０
こうして得られた精製ヒトＮＧＦを１６％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけ、銀染色を行ったところ、分
子量１３，０００の位置に単一なバンドが認められた（
第５図）。また、ヒトＮＧＦのアミノ末端１５アミノ酸
残基からなる合成ペプチドを免疫原としてウサギ血清か
ら得られたウサギ抗ヒトＮＧＦＮ末ペプチド抗体（参考
例３参照）とアフィニティー精製ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサ
ギＩ ｇＧ（バイオラッド社、米国）を２次抗体として
用いたＷｅｓｔｅｒｎプロッティングによって、上記と
同じ位置にバンドが認められた。Table 2 Summary of purification of recombinant human NGF culture supernatant
2,200 11,000 5.3
10O5-5epharose 4,
5 24 5, 0 94Sep
hacryl S-1002,53,74,789 Reversed phase HPLC1,31,630 The thus obtained purified human NGF was subjected to 16% polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining revealed that a single protein was detected at the molecular weight position of 13,000. A band was recognized (
Figure 5). In addition, a rabbit anti-human NGF N-terminal peptide antibody obtained from rabbit serum (see Reference Example 3) using a synthetic peptide consisting of the amino-terminal 15 amino acid residues of human NGF as an immunogen and an affinity-purified HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (biological A band was observed at the same position as above by Western plotting using a secondary antibody (Rudd, USA) as a secondary antibody.
得られた精製ヒトＮＧＦをガラス製加水分解用試験管に
とり減圧下で乾燥後、４％チオグチコール酸を含む５．
７Ｎ塩酸を加えて減圧下に封管したのち、１１０℃、２
４時間加水分解した。加水分解後、塩酸を除去し、残渣
を０．０２Ｎ塩酸に溶解してアミノ酸分析を実施した。The obtained purified human NGF was placed in a glass hydrolysis test tube and dried under reduced pressure.5.
After adding 7N hydrochloric acid and sealing the tube under reduced pressure, the tube was heated at 110℃ for 2
Hydrolyzed for 4 hours. After hydrolysis, hydrochloric acid was removed, the residue was dissolved in 0.02N hydrochloric acid, and amino acid analysis was performed.
その結果を第３表に示す。The results are shown in Table 3.
第３表 アミノ酸組成
アミノ酸 実験値 １−） 理論値 ２）Ａ
ｓｐ＋Ａｓｎ １３．０ １３Ｔｈｒ
９．７ １０Ｓｅｔ
９．２ １１Ｇｌｕ＋Ｇｌｎ
６．６ ６Ｐｒｏ
２． ９ ３Ｇｌｙ
７．３ ７Ａｌａ
６．９ ７Ｖａｌ
１２．８ １３Ｍｅｔ
２．１ ２１１ｅ
６．１ ６Ｌｅｕ
３． ２ ３Ｔｙｒ
２．３ ２Ｐｈｅ
７． ３ ７Ｌｙｓ
９． １ ９Ｈｉｓ
３．９ ４Ａｒｇ
７． ３ ８Ｔｒｐ −
３，０３
合計 １２０
１）Ａｓｐ＋Ａｓｎを１３として計算した。Table 3 Amino acid composition Amino acid Experimental value 1-) Theoretical value 2) A
sp+Asn 13.0 13Thr
9.7 10Set
9.2 11Glu+Gln
6.6 6Pro
2. 9 3Gly
7.3 7Ala
6.9 7Val
12.8 13Met
2.1 211e
6.1 6 Leu
3. 2 3 Tyr
2.3 2Phe
7. 3 7Lys
9. 1 9His
3.9 4Arg
7. 3 8Trp −
3,03 Total 120 1) Calculated assuming Asp+Asn is 13.
２）ヒトＮＧＦ遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸
配列から計算した。2) Calculated from the amino acid sequence deduced from the base sequence of the human NGF gene.
なお、ＵｌｌｒｉｃｈらはマウスβＮＧＦとの比較から
、ヒトＮＧＦが１１８個のアミノ酸からなると推定して
いる〔ネイチャー （Ｎａｔｕｒｅ）、 ３０３巻、８
２１頁（１９８３年）〕 。Furthermore, Ullrich et al. estimated that human NGF consists of 118 amino acids based on a comparison with mouse βNGF [Nature, vol. 303, 8
21 pages (1983)].
精製ヒトＮＧＦのＮ末端アミノ酸配列を気相プロティン
シーケンサ−（アプライドバイオシステム社モデル４７
０Ａ）を用いて決定した。その結果を第４表に示す。The N-terminal amino acid sequence of purified human NGF was analyzed using a gas-phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 47).
0A). The results are shown in Table 4.
第４表 Ｎ末端アミノ酸配列
サイクル ＰＴＨ−アミノ酸 ＤＮＡより推定さＲｅ５
ｉｄｕｅ ｐ ｍｏｌｅ れるアミノ酸配列ｌ
Ｓｅｒ ６０５ ５ｅｒ２ Ｓｅｒ
４９５ ５ｅｒ３ Ｓｅｒ ３８
４ ５ｅｒ４ Ｈｉｓ ７８５
Ｈｉｓ５ Ｐｒｏ ７０５ Ｐｒ。Table 4 N-terminal amino acid sequence cycle PTH-amino acid Re5 estimated from DNA
Amino acid sequence l due to p mole
Ser 605 5er2 Ser
495 5er3 Ser 38
4 5er4 His 785
His5 Pro 705 Pr.
６ １１ｅ ７６７ １１ｅ７ Ｐｂ
ｅ ８２９ Ｐｂｅ８ Ｈｉｓ
３４１ Ｈｉｓ９ Ａｒｇ ７００
Ａｒｇｌｏ Ｇｌｙ ４２５
Ｇｌｙｌｕ
Ｐｂｅ
Ｓｅｒ
ａｌ
ｓｐ
Ｓｅｒ
ａｌ
Ｓｅｒ
ａｌ
ｒｐ
Ｇｌｙ
ｓｐ
ｙｓ
ｈｒ
ｈｒ
ｌｕ
Ｐｂｅ
Ｓｅｒ
ａｌ
ｙｓ
ｓｐ
Ｓｅｒ
ａｌ
Ｓｅｒ
ａｌ
ｒ ｐ
ａｌ
Ｇｌｙ
ｓｐ
ｙｓ
ｈｒ
ｈｒ
ヒドラジン分解
［Ｎａｔｉｔａ
ら、
ジャーナル
オブ
バイオケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、） 、５
９，１７０（１９６６）〕で調べた精製ヒトＮＧＦのＣ
末端アミノ酸はアラニンであった。し−たがって、該精
製ヒトＮＧＦは、１２０個のアミノ酸からなるものであ
ることが判明した。6 11e 767 11e7 Pb
e 829 Pbe8 His
341 His9 Arg 700
Arglo Gly 425
Hydrazinolysis [Natita et al. Journal of Biochemistry (J, Biochem), 5
9,170 (1966)] of purified human NGF.
The terminal amino acid was alanine. Therefore, it was found that the purified human NGF consists of 120 amino acids.
ＰＡＧ等電点電気泳動法（新版電気泳動実験法、電気泳
動学会編、文光堂、１９８９年）で調べた結果、得られ
たヒトＮＧＦの等電点はｐＨ９−１０であり、マウスＮ
Ｇ Ｆ （Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ Ｉｎｃｏｒｐ。As a result of investigation using the PAG isoelectric focusing method (New Edition Electrophoresis Experimental Method, edited by the Electrophoresis Society, Bunkodo, 1989), the isoelectric point of human NGF was pH 9-10, and mouse NGF
GF (Collaborative Re5ea)
rch Incorp.
ｒａｔｅｄ）のそれとほぼ同じであった。It was almost the same as that of rated).
プレイン リサーチ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、１３３．３５０（１９７７） 、エクスペリメンタ
ルセルリサーチ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅ１
ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、 １４５． １７９（１
９８３）およびジャーナルオブニューロサイエンスリサ
ーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、 １７゜２５（１９８７）に
記載されている方法に従い、ＰＣ１２細胞の神経突起の
伸長（ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を指標に
して、精製ヒトＮＧＦの活性を測定したところ、精製ヒ
トＮＧＦはマウス２．５８−ＮＧＦの標準品（和光純薬
）と同程度の活性を示した（第６図）。Brain Research
, 133.350 (1977), Experimental Cell Research (Experimental Ce1
l Research), 145. 179 (1
983) and Journal of Neuroscience Research
The activity of purified human NGF was measured using the neurite outgrowth of PC12 cells as an indicator according to the method described in J. E. Research), 17°25 (1987). .58-NGF showed the same level of activity as the standard product (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Figure 6).
ディベロプメンタルバイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏρ膳ｅ
ｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、 １１１．６２（１９８
５）に記載されている方法に従い、ニワトリ胚のを髄後
根神経節（ｄｏｒｓａｌ ｒｏｏｔ ｇａｎｇｌｉａ：
ＤＲＧ）に対する精製ヒトＮＧＦの作用を調べた。そ
の結果、精製ヒトＮＧＦはＤＲＧ由来の神経細胞の神経
突起の伸長および生存を促進した。Developmental Biology
ntal Biology), 111.62 (198
According to the method described in 5), the dorsal root ganglia of chicken embryos was isolated.
The effect of purified human NGF on DRG was investigated. As a result, purified human NGF promoted neurite outgrowth and survival of DRG-derived neurons.
実施例６ （Σ凡見ｌムｌ！！ＪＬ （２＞実施例４
で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を実施例３と同
様の方法で培養したところ、４．２ｍｇＩＱのヒトＮＧ
Ｆが生産されていることがＥＩＡで分かった。Example 6 (ΣGeneral view l!! JL (2>Example 4
When the cell line CHO-D31-10 obtained in Example 3 was cultured in the same manner as in Example 3, 4.2 mgIQ of human NG
EIA revealed that F is being produced.
得られた培養液を遠心分離し、その培養上清２゜３Ｑに
ＡＰＭＳＦを最終濃度０．１ｍＭになるように添加し、
０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ Ｈ６，０−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−０，１％ＣＨＡＰＳで平衡化させたＳ−８ｅｐｈａｒ
ｏｓｅカラム（２，６ｃ ｍ Ｘ１４ｃ ｍ）に吸着さ
せ、同じ緩衝液で洗浄したのち、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
ＣＱ ｐＨ７，５−０，７Ｍ ＮａＣＱ−１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−０，１％ＣＨＡＰＳで溶出した。ヒトＮＧＦを
含むフラクションを集め、ダイアフローセル（タイプＹ
ＭＩＯ，アミコン社）で約３０倍に濃縮した。得られた
濃縮液を２０ｍＭ Ｔ ｒ ｉ ｓ −ＨＣＱｐ Ｈ７
，４−０，５Ｍ Ｎ ａ ＣＱ −１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ
−１０％グリセロールで平衡化させた５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−１００ＨＲ（２００ｍＱ、１，６ｃｍＸ１００
ｃｍ）でゲルろ過した。ヒトＮＧＦを含むフラクション
を集めセントリプレツブ１０ （アミコン社）で約２０
倍に濃縮した。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬＣにかけ、
ヒトＮＧＦを精製した。即ち、該濃縮液をＡｓａｈｉｐ
ａｋＯＤＳ −５０（１０，０ｍ ｍ Ｉ Ｄ Ｘ ２
５０ｍ ｍ Ｌ ）カラムにかけ、０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリルの濃度勾配にか
け、単一な精製ヒトＮＧＦ５．７ｍ ｇを得た。得られ
た精製ヒトＮＧＦは、逆相ＨＰＬＣで測定して９０％以
上の純度のものであった・
実施例７ ヒトＮＧＦ のクローン実施例４
で得られたヒトＮＧＦ産生細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０
のシングルコロニーアイソレーション（ｓｉｎｇｌｅ
ｃｏｌｏｎｙ １ｓｏｌａｔｉｏｎ）を次のように行つ
た・
細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を１０μＭメソトレキセー
トを含むダルベツコ改変ＭＥＭ （５％牛脂児血清、３
５μｇ ／ ｍ Ｑプロリンを含む）で培養したのち細
胞をトリプシン−ＥＤＴＡ−ＰＢＳで浮揚させ、３ ｃ
ａｌｌｓ／ ｍ Ｑの濃度（ｄｅｎｓｉｔｙ ）になる
ように同じ培地で希釈した。得られた細胞を９６穴ミク
ロプレートに１００μＱ／ｗｅｌｌの割合で播種（５ｅ
ｅｄ ） シ、同じ培地で２週間培養した。このように
して得られた３０個のクローンを５ Ｘ １０’ ／
ｗｅｌｌの濃度（ｄｅｎｓｉｔｙ）でＬｉｍｂｒｏ ２
４ ｗｅｌｌ培養皿に播種し、同じ培地で５日間培養し
た。培養上清中のヒトＮＧＦをエンザイムイムノアッセ
イ（ＥＩＡ）（ベーリンガー社、バイオケミカルバイオ
フィジカルリサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍｕｎ、）
、 １５５．４８２． （１９８８））で定量した。得
られたクローンのうちでＣＨＯ−０３１−１０−２（Ｉ
Ｆ Ｏ５０２３６，Ｆ Ｅ ＲＭ Ｂ Ｐ−２８５１
）は１０〜１５ｍ ｇ ／ ＬのヒトＮＧＦを培地中で
生産した。The obtained culture solution was centrifuged, and APMSF was added to the culture supernatant 2°3Q to a final concentration of 0.1 mM.
0.1M phosphate buffer pH6, 0-1mM EDTA
- S-8ephar equilibrated with 0.1% CHAPS
After adsorbing on an ose column (2.6 cm x 14 cm) and washing with the same buffer, 50 mM Tris-H
CQ pH7,5-0,7M NaCQ-1mM E
Elution was done with DTA-0.1% CHAPS. The fractions containing human NGF were collected and placed in a diaflow cell (type Y
It was concentrated approximately 30 times using MIO (Amicon Inc.). The obtained concentrate was diluted with 20mM Tris-HCQp H7
,4-0,5M N a CQ -1mM E DTA
-5ephacry equilibrated with 10% glycerol
l S-100HR (200mQ, 1.6cmX100
cm) and gel filtration. Collect the fractions containing human NGF and incubate them with Centripret 10 (Amicon) for approximately 20 minutes.
Concentrated twice. The obtained concentrate was subjected to reverse phase HPLC,
Human NGF was purified. That is, the concentrate was
akODS-50 (10,0mm ID x 2
50 mm L) column and a concentration gradient of 0-90% acetonitrile containing 0.1% trifluoroacetic acid to obtain 5.7 mg of single purified human NGF. The purified human NGF obtained had a purity of 90% or more as measured by reverse phase HPLC. Example 7 Human NGF Clone Example 4
Human NGF-producing cell line CHO-D31-10 obtained in
Single colony isolation (single
Cell line CHO-D31-10 was cultured in Dulbecco's modified MEM containing 10 μM methotrexate (5% tallow serum, 3
After culturing with 5 μg/m Q-proline), cells were floated with trypsin-EDTA-PBS and incubated for 3 c.
The cells were diluted with the same medium to a density of alls/mQ. The obtained cells were seeded in a 96-well microplate at a rate of 100 μQ/well (5e
ed) and cultured in the same medium for 2 weeks. The 30 clones thus obtained were divided into 5 x 10'/
Limbro 2 at well density
The cells were seeded in a 4-well culture dish and cultured in the same medium for 5 days. Human NGF in the culture supernatant was analyzed by enzyme immunoassay (EIA) (Boehringer, Biochemical Biophysical Research Communication (Bioche)).
m, Biophys, Res, Commun,)
, 155.482. (1988)). Among the obtained clones, CHO-031-10-2 (I
FO50236, FERMBP-2851
) produced 10-15 mg/L human NGF in the culture medium.
実施例８ ヒトＮＧＦの ３
実施例７で得られたクローンＣＨＯ−Ｄ３１−１０−２
を５％ウシ胎児血清、３５μｇ ／ ｍ Ｑプロリン、
５０ＩＵ／ｍρストレプトマイシン、１０ＭＭメソトレ
キセートを含むダルベツコ改変量ｔＪｚ培地（Ｄｕｌｂ
ｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍ
ｅｄｉｕｍ 、 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ）で５％炭酸ガス中で
、３７℃、７日間培養した。培地中に１３．７ｍ ｇ
／ ＬのヒトＮＧＦが生産されていることがＥＩＡで認
められた。Example 8 Human NGF 3 Clone CHO-D31-10-2 obtained in Example 7
5% fetal bovine serum, 35 μg/m Q-proline,
Dulbecco's modified tJz medium containing 50 IU/mρ streptomycin, 10 MM methotrexate (Dulb
ecco's modified Eagle's m
The cells were cultured at 37° C. for 7 days in 5% carbon dioxide (Edium, DMEM). 13.7 mg in medium
EIA confirmed that human NGF of /L was produced.
培養液を遠心分離し、その培養上清（２，４Ｑ）にＡＰ
ＭＳＦを最終濃度０．１ｍＭになるように添加した。得
られた培養上清を０．２Ｎ酢酸でｐＨ６，０に補正した
後遠心分離した。得られた上清を、０゜１Ｍリン酸緩衝
液ｐ Ｈ６，０−１ｍＭ Ｅ ＤＴＡで平衡化させたＳ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２，６ｃｍＸ１４ｃｍ
）に吸着させ、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，０−０゜
１５Ｍ Ｎ ａ ＣＱ −１ｍＭ Ｅ ＤＴＡ−１０％
グリセロールで洗浄した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｑ ｐＨ７，５−０，７Ｍ Ｎ ａ ＣＩＡ −１ｍ
Ｍ Ｅ ＤＴＡ−１０％グリセロールで溶出した。ヒト
ＮＧＦを含むフラクションを集め、ダイアフローセル（
タイプＹＭ１０、アミコン社）で約３０倍に濃縮した。Centrifuge the culture solution and add AP to the culture supernatant (2,4Q).
MSF was added to a final concentration of 0.1 mM. The obtained culture supernatant was corrected to pH 6.0 with 0.2N acetic acid and then centrifuged. The obtained supernatant was added to S
-5 epharose column (2.6cm x 14cm
) and 0.1M phosphate buffer pH 6,0-0°15M Na CQ-1mM E DTA-10%
After washing with glycerol, 50mM Tris-HC
Q pH7,5-0,7M Na CIA-1m
Eluted with ME DTA-10% glycerol. Collect the fractions containing human NGF and place them in a diaflow cell (
It was concentrated approximately 30 times using a type YM10 (Amicon Corporation).
得られた濃縮液を２０ｍＭ Ｔｒｉ ５−ＨＣｎ ｐ
Ｈ７，４−０，５Ｍ ＮａＣＱ−１ｍＭ ＥＤＴＡ
−１０％グリセロールで平衡化させた５ｅｐｈａｃｒｙ
ｌ Ｓ−１００ＨＲ（２００ｍ ｍ 、 １．６ｃ ｍ
Ｘ１００ｃ ｍ）でゲルろ過した。ヒトＮＧＦを含む
フラクションを集めセントリプレツブ１０（アミコン社
）で約１０倍に濃縮した。得られた濃縮液を逆相ＨＰＬ
Ｃにかけ、ヒトＮＧＦを精製した。即ち、該濃縮液をＡ
ｓａｈｉｐａｋ ＯＤ Ｐ −５０（１０，０ｍ ｍ
Ｉ Ｄ Ｘ ２５０ｒｒ［ｍ Ｌ ）カラムにかけ、０
．１％トリフルオロ酢酸を含む０−９０％アセトニトリ
ルの濃度勾配にかけ、精製ヒトＮＧＦ ５ｍｇ（アミ
ノ酸分析から計算）を得た。得られた精製ヒトＮＧＦの
純度は逆相ＨＰＬＣでは約９０％と計算された。The obtained concentrate was diluted with 20mM Tri 5-HCn p
H7,4-0,5M NaCQ-1mM EDTA
-5ephacry equilibrated with 10% glycerol
l S-100HR (200mm, 1.6cm
Gel filtration was carried out using 100 cm). Fractions containing human NGF were collected and concentrated approximately 10 times using Centriprep 10 (Amicon). The obtained concentrate was subjected to reverse phase HPL.
C to purify human NGF. That is, the concentrate is A
sahipak OD P-50 (10,0mm
Apply to IDX 250rr [mL] column and
．． A concentration gradient of 0-90% acetonitrile containing 1% trifluoroacetic acid was applied to obtain 5 mg of purified human NGF (calculated from amino acid analysis). The purity of the purified human NGF obtained was calculated to be about 90% by reverse phase HPLC.
こうして得られた精製ヒトＮＧＦのアミノ酸組成を第５
表に示す。The amino acid composition of the purified human NGF thus obtained was
Shown in the table.
ヒドラジン分析（前出）で調べた精製ヒトＮＧＦのＣ末
端アミノ酸はアラニンであった。したがって、該精製ヒ
トＮＧＦは、１２０個のアミノ酸からなるものであるこ
とが判明した。また、マイナーなＣ末端アミノ酸として
バリンが検出された。The C-terminal amino acid of purified human NGF examined by hydrazine analysis (described above) was alanine. Therefore, the purified human NGF was found to consist of 120 amino acids. Additionally, valine was detected as a minor C-terminal amino acid.
ジャーナルオブニューロサイエンスリサーチ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ） 、 １７゜２５、 （１９８７）に記載され
ている方法に従い、ＰＣＩ２細胞を用いて生物活性を測
定した。精製ヒトＮＧＦはマウス２．５ｓＮＧＦ （和
光純薬）と同程度の活性を示した。Journal of Neuroscience Research
nal of Neuroscience Re5ea
Biological activity was measured using PCI2 cells according to the method described in (1987). Purified human NGF showed activity comparable to that of mouse 2.5sNGF (Wako Pure Chemical Industries).
第５表 アミノ酸組成 実験値１） １２．７ ９．３ ８．５ ６．４ ２．５ ７．３ ６．５ アミノ酸 Ａｓｐ＋＾ｓｎ ｈｒ ｅｒ Ｇｉｎ ＋ Ｇｌｎ Ｐｒ。Table 5 Amino acid composition Experimental value 1) 12.7 9.3 8.5 6.4 2.5 7.3 6.5 amino acid Asp+＾sn hr er Gin + Gln Pr.
ｌｙ
１ａ
Ｈａｌｆ Ｃｙｓ３）
５．９
理論値２）
ａ１
１２．１
Ｎｅｔ ２．０
２１１ｅ ６．０
６Ｌｅｕ ３ 、３
３Ｔｙｒ ２ 、
１ ２Ｐｈｅ ’
７ 、２ ７Ｌｙｓ
９．０ ９Ｈｉｓ
３ 、９ ４Ａｒｇ
７ 、１ ８Ｔ
ｒｐ ２ 、８
３合計 １２０１ ）
Ｌｙｓを９として計算した。ly 1a Half Cys3) 5.9 Theoretical value 2) a1 12.1 Net 2.0
211e 6.0
6Leu 3,3
3 Tyr 2,
1 2Phe'
7, 2 7Lys
9.0 9His
3, 9 4Arg
7, 1 8T
rp2,8
3 total 1201)
Calculations were made assuming Lys as 9.
２）ヒトＮＧＦの塩基配列から推定したアミノ酸配列か
ら計算した。2) Calculated from the amino acid sequence deduced from the base sequence of human NGF.
３）過ギ酸酸化と加水分解によって生じたシスティン酸
として計算した。3) Calculated as cystic acid produced by performic acid oxidation and hydrolysis.
実施例９ ヒトＮＧＦの ４
実施例４で得られた細胞株ＣＨＯ−Ｄ３１−１０を実施
例３と同様の方法で培養し、得られた培養上清を遠心し
て不溶物を除いた後、氷冷し硫安を加えた。５０％飽和
となるように硫安を加えた時に生ずる沈殿を遠心によっ
て分離し、これを最初の１／１００容量の２０ｍＭ Ｔ
ｒ ｉ ｓ ＨＣｌ （ｐＨ７゜４）に溶解した
。これに含まれるヒトＮＧＦ量をＥＩＡによって測定と
ころ９０％以上のＮＧＦがこの両分に回収された。これ
をＣｕ２＋カラム（ファルマシア社製、キレ−ティング
セファロース４ＢにＣｕ２＋をキレートさせたもの）に
通し、０．５ＭＮａＣ１，０，１Ｍリン酸ナトリウム（
ｐ Ｈ６，５）で洗い、その後０〜３０ｍＭのイミダゾ
ールの直線的濃度勾配をかけることによりヒトＮＧＦが
溶出された。この両分を濃縮し、実施例６に示した逆相
ＨＰＬＣにかけることにより、単一のヒトＮＧＦを得る
ことができた。Example 9 The cell line CHO-D31-10 obtained in Example 4 of human NGF was cultured in the same manner as in Example 3, and the resulting culture supernatant was centrifuged to remove insoluble materials, and then placed on ice. Cooled ammonium sulfate was added. The precipitate formed when ammonium sulfate was added to 50% saturation was separated by centrifugation, and this was added to 20mM T of the initial 1/100 volume.
It was dissolved in ris HCl (pH 7°4). When the amount of human NGF contained in this was measured by EIA, more than 90% of NGF was recovered in both portions. This was passed through a Cu2+ column (manufactured by Pharmacia, chelating Sepharose 4B with Cu2+ chelated), 0.5M NaCl, 0.1M sodium phosphate (
Human NGF was eluted by washing with pH 6.5) followed by a linear gradient of imidazole from 0 to 30 mM. By concentrating these two fractions and subjecting them to reverse phase HPLC as shown in Example 6, a single human NGF could be obtained.
実施例１０ ヒトＮＧＦの ５
実施例９に示した硫安沈殿物を疎水クロマトカラム（フ
ェニルセファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社）に通
した。カラムを蒸留水で洗浄後、０−５０％アセトニト
リルの勾配をかけることにより、ヒトＮＧＦは溶出され
た。これを実施例６記載の逆相ＨＰＬＣにかけることに
より、同様に高純度のヒトＮＧＦを得ることができた。Example 10 5 of human NGF The ammonium sulfate precipitate shown in Example 9 was passed through a hydrophobic chromatography column (Phenyl Sepharose CL-4B, Pharmacia). After washing the column with distilled water, human NGF was eluted by applying a gradient of 0-50% acetonitrile. By subjecting this to reverse phase HPLC as described in Example 6, highly pure human NGF could be obtained in the same manner.
実施例１１ 分子内ジスルフィド ムの解析実施例５で
得られた精製ヒトＮＧＦを用いて、その分子内ジスルフ
ィド結合の位置を決定した。Example 11 Analysis of intramolecular disulfide bonds Using the purified human NGF obtained in Example 5, the positions of its intramolecular disulfide bonds were determined.
凍結乾燥した精製ヒトＮＧＦ（５３０μｇ）に０．２ｍ
Ｑの０．９％ＮａＣ１溶液と０．８ｍ Ｑの０．０１Ｍ
ＨＣｌとを加えて溶解した。この溶液のｐＨは２．２
であった。これに重量比で１１５０になるように、１ｍ
ｇ ／ ｍ Ｑのペプシン（Ｓｉｇｍａ社）溶液を１
０．６ｐＱ加えて、３７℃で２２時間反応させた。反応
後９５０μＱを採取し、５０μＱの２５０ｍＭ リン
酸緩衝液（ｐＨ６，０）を加えて反応を停止したものを
ペプシン消化物とした。0.2 m in lyophilized purified human NGF (530 μg)
Q with 0.9% NaCl solution and 0.8m Q with 0.01M
HCl was added and dissolved. The pH of this solution is 2.2
Met. Add 1m to this so that the weight ratio is 1150.
1 g/m Q of pepsin (Sigma) solution
0.6 pQ was added and the reaction was carried out at 37°C for 22 hours. After the reaction, 950 μQ was collected, and 50 μQ of 250 mM phosphate buffer (pH 6,0) was added to stop the reaction, which was used as a pepsin digest.
ペプシン消化物をＨＰＬＣに付し、ペプチドマツピング
を行った。ＴＳＫ−ゲル０ＤＳ−１２０Ｔカラム（東ソ
ー社、０，４６Ｘ２５ｃｍ）を用いて、０．０５％ＴＦ
Ａ （Ａ）および９９．９５％アセトニトリル０．０５
％ＴＦＣ（Ｂ）の混合物を以下の溶出プログラムに従っ
て流した。流速は１ｒｎＱ／ｍｉｎ。The pepsin digest was subjected to HPLC and peptide mapping was performed. Using a TSK-gel 0DS-120T column (Tosoh, 0.46 x 25 cm), 0.05% TF
A (A) and 99.95% acetonitrile 0.05
% TFC(B) was run according to the following elution program. The flow rate was 1rnQ/min.
検出波長は２２０ｎｍおよび２８０ｎｍ。Detection wavelengths are 220nm and 280nm.
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
一方、ペプシン消化物５０ｕｆｌに１００ｍＭ ＤＴＴ
溶液を１０μＱ加え、室温で３時間放置してジスルフィ
ド結合を還元したサンプルを同じようにＨＰＬＣとに付
し、ペプチドマツピングを行った。Time (min) %A %B Meanwhile, add 100mM DTT to 50ufl of pepsin digest.
A sample in which 10 μQ of the solution was added and left at room temperature for 3 hours to reduce disulfide bonds was similarly subjected to HPLC and peptide mapping was performed.
これら２つのペプチドマツピングを比較することにより
、ジスルフィド結合を有するペプチドを固定した後、こ
のペプチドを単離し、気相プロテインシークエンサー末
端（ＡＢＩ社）アミノ酸配列を分析した。By comparing these two peptide mappings, a peptide having a disulfide bond was fixed, and then this peptide was isolated and its amino acid sequence was analyzed using a gas phase protein sequencer terminal (ABI).
その結果、本ペプチドは以下に示す配列−１、配列−２
、および配列−３を含み、かつ３個のジスルフィド結合
を持つ大きなペプチドであることがわかった。As a result, this peptide was found to have the following sequences: -1 and -2.
, and sequence-3, and was found to be a large peptide with three disulfide bonds.
配列−１
Ｓ−Ｖ−Ｃ−Ｄ−５−Ｖ−Ｓ−Ｖ
配列−２
Ｆ−Ｅ−Ｔ−に−Ｃ−Ｒ−Ｄ−Ｐ−Ｎ−Ｐ−Ｖ−Ｄ−８
−Ｇ−Ｃ−Ｒ−Ｇ−Ｉ−Ｄ−８−配列−３
Ｉ −Ｒ−Ｉ −Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−吹に、
このペプチド（２０６０ｐ ｍ ｏ Ｑ ）を減圧下に
濃縮乾固した後０．３ｍ Ｑの５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ６，０）に溶解した。この溶液に０．４８μｇ（
１４ｐｍｏＱ）のサーモライシン（和光純薬工業（株）
）を加えて、３７℃で２００時間反応せた後、上記と同
一の条件下で、ＨＰＬＣに付し、ペプチドマツピングを
行った。ただし、以下の溶出プログラムを使用した。Sequence-1 S-V-C-D-5-V-S-V Sequence-2 F-E-T--C-R-D-P-N-P-V-D-8
-G-C-R-G-I-D-8-Sequence-3 I-R-I -D-T-A-C-V-C-V-Skiing,
This peptide (2060 p m o Q) was concentrated to dryness under reduced pressure and then dissolved in 0.3 m Q of 50 mM sodium acetate (pH 6,0). Add 0.48 μg (
14pmoQ) thermolysin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
) and reacted at 37° C. for 200 hours, followed by HPLC and peptide mapping under the same conditions as above. However, the following elution program was used.
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
０ １００′ ０
さらに、ジスルフィド結合の位置を決定するために、上
記ペプチドをＤＴＴで還元処理したサンプルを同じよう
にＨＰＬＣに付し、ペプチドマツピングを行った。ペプ
チドマツピングの比較から、ジスルフィド結合を含む３
個のフラグメント（フラグメント−１、フラグメント−
２、フラグメント−３）を固定し、それぞれ取得した。Time (minutes) %A %B 0 100' 0 Furthermore, in order to determine the position of the disulfide bond, a sample obtained by reducing the above peptide with DTT was similarly subjected to HPLC and peptide mapping was performed. From the comparison of peptide mapping, 3 containing disulfide bonds
fragments (fragment-1, fragment-
2, Fragment-3) was fixed and obtained.
フラグメント−１、フラグメント−２、およびフラグメ
ント−３のアミノ末端アミノ酸配列を分析した。その結
果を第６表に示す。The amino-terminal amino acid sequences of fragment-1, fragment-2, and fragment-3 were analyzed. The results are shown in Table 6.
一方、これらのフラグメントを過ギ酸で酸化し、システ
ィン残基をシスティン酸に変換した後、アミノ酸分析を
行った結果、いずれのフラグメントにも２残基ずつのシ
スティン酸が検出された。On the other hand, after oxidizing these fragments with performic acid to convert cysteine residues to cysteic acid, amino acid analysis was performed, and as a result, two cysteic acid residues were detected in each fragment.
第６表
これらの結果から、
精製ヒトＮＧＦのジスルフ
イド結合の位置は、
Ｃｙ ｓ”−Ｃｙ ｓ”、 （：、ｙ ５％＠ Ｃｙ
ｓ１０８およびＣｙＳ ” Ｑ ｙ ｓ ｘ ｚ ｏ
であると結論された。From these results in Table 6, the position of the disulfide bond in purified human NGF is: Cy s”-Cy s”, (:, y 5%@Cy
s108 and CyS ” Q y s x zo
It was concluded that
このジスルフィド結合様式を第７図に示す。This disulfide bonding mode is shown in FIG.
見匪例熱末
本発明の特定のジスルフィド結合をしているヒトＮＧＦ
蛋白質は、活性体であるので、試薬や治療薬として有利
に用いることができる。Specific disulfide-bonded human NGF of the present invention
Since proteins are in active form, they can be advantageously used as reagents and therapeutic agents.
本発明の動物細胞はクローン化されているので、導入さ
れた遺伝子を安定に発現させることができ、したがって
、本発明のクローン化されている動物細胞を用いると、
ヒトＮＧＦ蛋白質を高純度に工業的大量に生産すること
ができる。Since the animal cells of the present invention are cloned, the introduced gene can be stably expressed, and therefore, using the cloned animal cells of the present invention,
Human NGF protein can be industrially produced in large quantities with high purity.
第１図は、参考例１で得られたクローン化したヒトＮＧ
Ｆ遺伝子の塩基配列およびこれから翻訳されるアミノ酸
配列を示す。
第２図は、参考例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベクタ
ーｐ Ｍ Ｎ Ｇ Ｆ １０１の構築図を示す。
第３図は、参考例２で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベクタ
ーｐＭＮＧＦ２０１の構築図を示す。
第４図は、実施例１で得られた、ヒトＮＧＦ発現ベクタ
ーｐ Ｔ Ｂ １０５８の構築図を示す。
第５図は実施例５で得られた精製ヒトＮＧＦとマウスＮ
ＧＦの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示
す。泳動はＬａｅｍｍｌｉの方法（前出）に従い、還元
条件下で行った。（１）はマウス２．５８ＮＧＦの標準
品を、（２）は精製ヒトＮＧＦを示す。
第６図は実施例５で得られた精製ヒトＮＧＦのＰＣ１２
細胞神経突起伸長活性を示す、ＰＣ１２細胞をヒトＮＧ
Ｆ（・）またはマウス２．５８ＮＧＦ（０）存在下２日
間培養し、神経突起を有する細胞を計算した。
第７図は、実施例１１で得られた、精製ヒトＮＧＦのジ
スルフィド結合様式の解析図を示す。Figure 1 shows the cloned human NG obtained in Reference Example 1.
The base sequence of the F gene and the amino acid sequence translated from this are shown. FIG. 2 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF101 obtained in Reference Example 1. FIG. 3 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pMNGF201 obtained in Reference Example 2. FIG. 4 shows a construction diagram of the human NGF expression vector pT B 1058 obtained in Example 1. Figure 5 shows purified human NGF obtained in Example 5 and mouse NGF.
A 5DS-polyacrylamide gel electropherogram of GF is shown. The electrophoresis was performed under reducing conditions according to the method of Laemmli (supra). (1) shows a standard mouse 2.58NGF, and (2) shows purified human NGF. Figure 6 shows PC12 of purified human NGF obtained in Example 5.
Human NG PC12 cells exhibiting cell neurite outgrowth activity
The cells were cultured for 2 days in the presence of F(·) or mouse 2.58NGF(0), and the number of cells with neurites was counted. FIG. 7 shows an analysis diagram of the disulfide bonding mode of purified human NGF obtained in Example 11.
Claims (8)
ら数えて第１番目のシステイン残基と第４番目のシステ
イン残基とが、第２番目のシステイン残基と第５番目の
システイン残基とが、第３番目のシステイン残基と第６
番目のシステイン残基とが、それぞれジスルフィド結合
している活性なヒト神経成長因子（ＮＧＦ）蛋白質。(1) There are six cysteine residues in the molecule, the first cysteine residue and the fourth cysteine residue counting from the N-terminus, the second cysteine residue, and the fifth cysteine residue counting from the N-terminus. The third cysteine residue and the sixth cysteine residue are
An active human nerve growth factor (NGF) protein in which each cysteine residue has a disulfide bond.
なヒト神経成長因子蛋白質。(2) The active human nerve growth factor protein of claim 1 having 120 amino acids.
活性なヒト神経成長因子蛋白質。(3) The active human nerve growth factor protein according to claim 1 or 2, which has a purity of 94% or more.
スルフィド結合を有する請求項３記載の活性なヒト神経
成長因子蛋白質。(4) The active human nerve growth factor protein according to claim 3, wherein the protein has the amino acid sequence shown in FIG. 7 and a disulfide bond.
１記載の蛋白質。(5) The protein according to claim 1, wherein the active human nerve growth factor is a mutein.
むベクターで形質転換され、クローン化されている動物
細胞。(6) Animal cells that have been transformed and cloned with a vector containing a gene encoding human nerve growth factor protein.
請求項６記載の動物細胞。(7) The animal cell according to claim 6, wherein the host is a Chinese hamster CHO cell.
ることを特徴とするヒト神経成長因子蛋白質の製造法。(8) A method for producing human nerve growth factor protein, which comprises culturing the animal cell according to claim 6 or 7 in a medium.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21298089 | 1989-08-21 | ||
| JP1-212980 | 1989-08-21 | ||
| JP1-328198 | 1989-12-20 | ||
| JP2-96252 | 1990-04-13 | ||
| JP2-147392 | 1990-06-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04128300A true JPH04128300A (en) | 1992-04-28 |
Family
ID=16631480
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2217029A Pending JPH04128300A (en) | 1989-08-21 | 1990-08-20 | Human nerve growth factor protein and its production |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04128300A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009040786A (en) * | 1996-11-15 | 2009-02-26 | Genentech Inc | Purification of neurotrophin |
-
1990
- 1990-08-20 JP JP2217029A patent/JPH04128300A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009040786A (en) * | 1996-11-15 | 2009-02-26 | Genentech Inc | Purification of neurotrophin |
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