JPH06258321A - キャリブレーターの正確な希釈度を確認するためのタンパク質−色素コンジュゲート体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 試験キット、特に診断試験キットにおけるキ
ャリブレーター溶液の正確な希釈度を測定するための方
法に関する。より詳細には、キャリブレーターの貯蔵溶
液から希釈される溶液中におけるキャリブレーターを定
量又は濃度測定するための簡便な方法に関する。 【構成】 キャリブレーターを含有する貯蔵溶液が正確
に希釈されていることを決定するための組成物であっ
て、(a)使用濃度範囲内にて目的分析物の検定の較正に
使用するキャリブレーター、及び(b)該貯蔵溶液の希釈
レベルを同定するための同定有効量のマーカーであって
該検定において反応体又は反応体の標識物として関与し
ないものが溶解された貯蔵溶液からなる組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、試験キット、特に診断試験キッ
トにおけるなどのあらゆるキャリブレーター溶液の正確
な希釈度を測定するための方法に関する。より詳細に
は、本発明は、キャリブレーターの貯蔵溶液から希釈さ
れる溶液中におけるキャリブレーターを定量又は濃度測
定するための簡便な方法に関する。本発明は、元の貯蔵
溶液（ストック溶液）から調製されるキャリブレーター
溶液の正確な希釈度をキャリブレーター溶液の製造者が
簡便に確認することのできる方法であり、従って有用な
発明である。本発明はキャリブレーター物質が抗原又は
抗体のときに特に有用である。

【０００２】化学又は生化学分析物を分析するための試
験キットでは、較正曲線を作成するために使用される種
々の濃度の分析物を含有する１つ又はそれ以上の溶液、
即ち「キャリブレーター溶液(calibrator solutions)」
が準備されることが多い。これらのキャリブレーター溶
液では、分析物又は時にはそれと化学的に類似している
物質（即ち、同族体）がキャリブレーター物質として使
用される。キャリブレーターを含有する溶液を商業規模
で製造する際には、その製造者は、予め規定した量のキ
ャリブレーターを含有する濃縮溶液（貯蔵溶液、stock
solution）を大体は製造する。この貯蔵溶液中のキャリ
ブレーター物質の濃度は正確に分析される。次いで、要
すれば、製造者は試験キットに使用されるようなキャリ
ブレーターの希釈溶液（即ち、使用液(working solutio
n)）を、貯蔵溶液の正確な量を正確な容量に希釈するこ
とによって製造する。多くの試験キットでは、製造者は
目的とする分析物のための試験キットにおいて使用範囲
を網羅するキャリブレーターの一系列の溶液群を製造す
る必要がある。

【０００３】キャリブレーター溶液の製造者が元の貯蔵
溶液から正確にすべての希釈液を調製したと決め込むの
は適当でない。キャリブレーター溶液は、一系列の使用
キャリブレーター溶液を製造するために貯蔵溶液が正確
に希釈されたことを確実にするための品質管理工程の対
象でなければならない。これは、キャリブレーター溶液
（群）が医療上又は獣医学上の決定を行うための情報を
ユーザーに提供する診断試験キットの一部を構成する場
合には特に当てはまる。

【０００４】多くの診断試験キットでは、分析物は複雑
な抗原性分子である。分析物とキャリブレーター物質と
の対応を保証するため、分析物はキャリブレーター溶液
中のキャリブレーター物質と同じであることが好まし
い。キャリブレーター溶液中のこのような分析物につい
てキット製造者が行う通常の品質管理（ＱＣ）及び品質
確実性（ＱＡ）分析は複雑であり、高価な試薬を必要と
し、時には長時間が必要となる場合がある（即ち、３日
以内）。多くの診断試験キット、特に定量的成績を得る
ためのキットは、ある範囲のキャリブレーター濃度を有
する６つ以内の溶液を包含する。これらの複数キャリブ
レーターキットでは、キット製造者による通常のキャリ
ブレーター溶液の分析は非常に高価であり繁雑な作業と
なる。本発明のさらなる目的は、キャリブレーターの使
用液を製造する際にリガンド又は抗リガンドなどの複雑
なキャリブレーター物質の貯蔵溶液を正確に希釈したこ
とをキット製造者が確認することを可能にする迅速、単
純かつ信頼性のある方法を提供することにある。また、
複雑な抗原抗体反応又は多重反応系をいずれも要しな
い、キット製造者がＱＣ又はＱＡを行うための方法も本
発明の目的である。

【０００５】現在、種々の市販されている試験キットが
ある。各キットは、種々のシグナル産生系のいずれか１
つを使用してその個々の目的分析物を測定するものであ
る。これらのシグナル産生系には、発色、蛍光、リン
光、放射標識、化学ルミネッセンスなどがある。従っ
て、本発明のさらなる目的は、分析物の存在又は濃度の
測定に使用するシグナルを干渉せずに正確である、貯蔵
キャリブレーター液の希釈度を確認するための方法をも
提供することである。キャリブレーター溶液の殆どの製
造者は「コントロール溶液」も製造している。キャリブ
レーター溶液と同様にコントロール溶液も、コントロー
ル物質を含有する既知量の貯蔵溶液を正確に希釈して製
造される。ある溶液がキャリブレーター溶液であるか、
コントロール溶液であるかは、一般には製造者が任意に
決定する事項である。従って、本発明は、コントロール
物質を含有する貯蔵溶液が正確に希釈されていることを
キット又は成分の製造者が確認できる方法をも提供す
る。

【０００６】キャリブレーション(較正)及び／又はコン
トロール溶液を含有する診断試験キットの最終ユーザー
は診断研究所である。このような研究所の医療従事者は
多くの診断試験操作を同時に行わなければならない場面
に直面することが多い。診断試験の操作を構成する重要
部分の１つは正しい検体同定の維持（メンテナンス）で
ある。ピペッティング工程の前には、キャリブレーター
溶液、コントロール溶液及び患者試料を、記録する正確
な順番で並べる。１つのキャリブレーション溶液は別の
ものと類似しているので、多くの作業を行わなければな
らないというストレス下にある従事者は１つ又はそれ以
上のキャリブレーター及び／又はコントロール溶液の順
序を入れ換えかねない可能性が存在する。さらに、溶液
のピペッティングを全く偶然に誤る場合もある。キャリ
ブレーター及び／又はコントロール溶液を個々の試験管
にピペッティングしてしまうと、検定を行う前に誤りを
発見し、時間的に都合良く補正できる機会はとても巡っ
て来そうにない。多くの診断検定は複数の工程を含み、
変更又はピペッティングの誤りを発見できたとしてもそ
れまでには数時間から数日を要する。従って、本発明は
さらに、診断試験キットの技術者又はユーザーが診断検
定を行う前に時間的に都合良く、ピペッティングの誤り
又は変更を発見し補正するための方法をも提供する。

【０００７】本発明は、目的とする分析物の検定に使用
するためのキャリブレーション又はコントロール物質
（キャリブレーター）を含有する貯蔵溶液の１つ又はそ
れ以上の希釈物の精度を確認するための間接的な方法を
目的としている。本発明の方法は、キャリブレーター自
身よりも簡便かつ／又は正確に測定されるマーカーの規
定量をさらに含有するキャリブレーターの貯蔵溶液を中
間物質として使用するので、簡便かつ正確な方法であ
る。本発明によれば、貯蔵溶液中のキャリブレーターの
初期濃度が知れれば、それから希釈される溶液（使用
液）中の以後のすべてのキャリブレーター濃度はキャリ
ブレーターではなくマーカーを測定することによって測
定される。

【０００８】上記のように、本発明は多くの態様を有し
ている。最初の態様では、キャリブレーターが溶解され
ている貯蔵溶液が正確に希釈されていることを容易に決
定するための中間組成物を目的としている。その中間液
には、(a) ある検定に対して測定しようとする濃度範
囲において目的分析物の検定を較正し又はコントロール
するのに使用するためのキャリブレーター、及び(b)
キャリブレーターの使用濃度内において貯蔵溶液の希釈
レベルを同定するための、同定に有効かつ干渉しない量
の溶解されたマーカーであって、該目的分析物の検定に
おいて反応体として又は反応体の標識物として関与する
ことのないマーカーが溶解されて含有されている。

【０００９】別の態様としては、本発明は、較正又はコ
ントロール物質（キャリブレーター）を含有する貯蔵溶
液の正確な希釈度を確認するための方法であって、(a)
同定可能に有効かつ干渉しない量のマーカー及び予め
規定した量のキャリブレーターを混合し、マーカーの第
１濃度とキャリブレーターの第２濃度とを有するマーク
化貯蔵キャリブレーター溶液を調製し、(b) 該マーク
化貯蔵キャリブレーター溶液中のマーカーの第１濃度と
キャリブレーターの第２濃度との比率を計算し、(c)
該マーク化貯蔵キャリブレーター溶液又はその一部を前
もって規定した量で希釈し、該比率が実質的に維持され
ている希釈キャリブレーター溶液であって、第１の予測
物理パラメーターに関係する第１の予測マーカー濃度
と、さらに第２の予測キャリブレーター濃度とを有する
該希釈キャリブレーター溶液を調製し、(d) 存在する
マーカーの実際の濃度と比例する該希釈キャリブレータ
ー溶液の実際の物理パラメーターを測定し、(e) 実際
の物理パラメーター又はその誘導パラメーターを、第１
の予測物理パラメーター又はその誘導パラメーターとそ
れぞれ比較し、当該希釈工程が正確に行われたことを確
認する、各工程からなる方法を提供するものである。実
際の物理パラメーター及び予測物理パラメーターの好ま
しい誘導パラメーターはそれぞれ、それから計算される
実際の濃度及び予測濃度である。

【００１０】貯蔵キャリブレーター溶液中のマーカー濃
度はその中に存在するキャリブレーター濃度と数学的に
相関できるので、希釈キャリブレーター溶液中の実際の
マーカー濃度を測定すれば、希釈キャリブレーター溶液
中の実際のキャリブレーター濃度を測定することができ
る。さらに、それにより、希釈キャリブレーター溶液中
の予測濃度と実際の濃度との差異が許容限界内であるこ
とを確認することもできる。従って、本発明は第３の態
様として、使用液中のキャリブレーター濃度を間接的に
確認するための方法であって、(a) 同定可能に有効か
つ干渉しない量のマーカー及び予め規定した量のキャリ
ブレーターを混合し、マーカーの第１濃度とキャリブレ
ーターの第２濃度とを有するマーク化貯蔵キャリブレー
ター溶液を調製し、(b) 該マーク化貯蔵キャリブレー
ター溶液中のマーカーの第１濃度とキャリブレーターの
第２濃度との比率を計算し、(c) 該マーク化貯蔵キャ
リブレーター溶液又はその一部を前もって規定した量で
希釈し、該比率が実質的に維持されている希釈キャリブ
レーター溶液であって、第１の予測物理パラメーターに
付随する第１の予測マーカー濃度と、さらに第２の予測
キャリブレーター濃度とを有する該希釈キャリブレータ
ー溶液を調製し、(d) 希釈キャリブレーター溶液中の
マーカーの実際の濃度と比例する該希釈キャリブレータ
ー溶液の実際の物理パラメーターを測定し、そして(e)
実際の物理パラメーターと第１の予測物理パラメータ
ーとの差異、又はそれらの誘導パラメーター間の差異を
参照して、希釈キャリブレーター溶液中のキャリブレー
ターの実際の濃度がその予測濃度と実質的に近似してい
ることを確認する、各工程からなる方法をも提供するも
のである。上記のように本明細書では「キャリブレータ
ー溶液」なる用語を使用しているが、この用語は、「コ
ントロール溶液」、即ち目的分析物のための検定の精度
（例えば、実行可能性）を確認するために使用される溶
液をも包含する意味を有している。

【００１１】本発明はさらに、含有されるマーカーが可
視性色素である場合、本発明の中間組成物（即ち、貯蔵
溶液）から調製される希釈（即ち、使用）キャリブレー
ター溶液をも目的としている。この希釈キャリブレータ
ー溶液は以下の事項によって特徴付けられる： 一系列
のキャリブレーター溶液群の１構成部分であり、各希釈
キャリブレーター溶液は前もって規定された濃度のキャ
リブレーターと、含有されるキャリブレーター濃度にも
比例する可視性量の発色マーカーとを含有しており、該
一系列のキャリブレーター溶液群がキャリブレーター濃
度の範囲とそれに相当するマーカー濃度の範囲に系列と
してまたがっている個々のキャリブレーター溶液群の多
数のものから構成され、その一系列のキャリブレーター
溶液群における各溶液がそこに含有されるキャリブレー
ターの濃度に比例する発色強度を有している点である。

【００１２】本発明は多くの態様を有しており、含有さ
れるキャリブレーターの量に比例してマーク化(marked)
される希釈キャリブレーター溶液を調製するための中間
組成物（即ち、マーク化貯蔵キャリブレーター溶液）を
包含している［希釈（即ち、使用）キャリブレーター溶
液はそれから調製され、一系列の希釈キャリブレーター
溶液群は存在するキャリブレーターの濃度に比例して発
色が視覚化される；一系列のマーク化キャリブレーター
溶液群を使用する診断検定を行うための方法；キャリブ
レーターの貯蔵溶液が正確に希釈されていることを確認
するための方法；及び使用キャリブレーター溶液中のキ
ャリブレーター濃度を間接的に確認する方法］。

【００１３】本発明はその第１の態様として、溶解され
ている較正又はコントロール物質（キャリブレーター）
を含有する貯蔵溶液、あらゆる貯蔵溶液が正確に希釈さ
れていることを決定することのできる中間組成物を目的
としている。好ましい態様では、本発明はヒト、獣医学
及び農芸分野における診断検定、特に免疫検定のための
キャリブレーターを含有する貯蔵溶液が正確に希釈され
ていることを決定するための組成物を目的とする。この
中間組成物は、(a) 使用濃度範囲、即ち検定によって
測定しようとする濃度範囲において目的分析物の検定を
較正し又はコントロールするのに使用するためのキャリ
ブレーター、及び(b) キャリブレーターの使用濃度範
囲内において貯蔵溶液の希釈レベルを同定するための、
同定可能に有効かつ干渉しない量の溶解されたマーカー
であって、該目的分析物の検定において反応体として又
は反応体の標識物として関与することのないマーカーが
溶解されている貯蔵溶液を包含している。この要素(a)
にて使用している「コントロールする」なる用語は、検
定結果を有効にするための１つ又はそれ以上のコントロ
ール物質（即ち、既知濃度の分析物を有する物質）を提
供するために利用することを意味する。

【００１４】本発明の目的では、「貯蔵溶液」とは、目
的とする溶質を含有する、より希釈された溶液（即ち、
使用キャリブレーター溶液）を調製するための供給源と
して使用する目的を持った既知量の目的溶質を含有する
あらゆる溶液を意味する。この貯蔵溶液は有機性又は水
性溶液又はそれらの混液のいずれであってもよい。好ま
しくは、貯蔵溶液は水性溶液である。本明細書にて使用
している「水性溶液」とは、５０％以上の溶媒が水であ
る溶液を意味し、好ましくは７５％以上、より好ましく
は９０％以上、最も好ましくは９５％以上の水を含有す
る溶液である。水性溶液中での溶媒の平衡は非干渉性の
水混和性有機溶媒である。通常の水混和性有機溶媒とし
ては、１−３個の炭素原子を有するアルコール、エチレ
ンもしくはポリエチレングリコールなどのポリオール、
又はグリセリン、分子量(ＭＷ)２００−６００を有する
ポリエチレングリコール、アセトン、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＳＯ）など
が挙げられる。他の水混和性有機溶媒は当業者に周知で
ある。

【００１５】本明細書にて使用している「キャリブレー
ター」なる用語は、溶液中に侵入することができ、目的
分析物の検定を較正するために使用できる有機、無機又
は有機金属化合物を包含している意味を有する。好まし
い「キャリブレーター」は目的分析物と同じもの、又は
その同族体である。本明細書にて使用している「目的分
析物」なる用語は、測定しようとしている化学化合物又
は生化学組成物を意味している。目的分析物は免疫学的
な対の一員であるのが好ましい。「免疫学的な対の一
員」とは、一方の分子がその表面に、他方の分子に特定
の空間及び極性を有する組織体と特異的に結合する領域
又は穴を有している２つの異なる分子の片方を意味す
る。この「免疫学的な対の一員」は本明細書では「リガ
ンド」及び「抗リガンド」と表示している。「リガン
ド」とは抗リガンドが天然に存在し、又は製造できるた
めの有機化合物、例えばｈＣＧである。「抗リガンド」
とは、ある分子の空間及び極性を有する個々の組織体を
認識できる（それに対する結合親和性の増大によって示
されるような）巨大分子化合物、組成物又はそれらのフ
ラグメント、例えばエピトープ又は抗原決定部位であ
る。例えば、抗リガンドには内因子、チロキシン結合グ
ロブリン、抗体、酵素、レクチンなどの天然に存在する
化合物、及びモノクローナル抗体、Ｆab又はＦab'断
片、ＤＮＡプローブ、ＤＮＡのアンチセンス鎖などのヒ
ト介入によって調製される化合物などが例示される。

【００１６】「目的分析物の同族体」とは、個々の検定
の目的に沿って目的分析物と実質的に同じ挙動を有する
化合物である。目的分析物の同族体は、分析物が生化学
物質である場合に最も普通に使用される。例えば、目的
分析物が多くのエピトープを有する抗原性物質である場
合、目的エピトープ（群）を含有する分析物の断片のみ
を使用しなければならない場合がある。ビタミンＢ₁₂の
場合、ビタミンＢ₁₂の同族体もまた内因子、ビタミンＢ
₁₂の抗リガンドとも結合することが当業者に周知であ
る。同様に、葉酸の同族体もβ−ラクトグロブリンと結
合することが当業者に知られている。較正物質として同
族体を置き換えることは当業者に周知である。

【００１７】本発明の特に好ましい態様では、キャリブ
レーターは目的分析物と同じ化合物又は組成物ばかりで
なく、免疫学的な対の一員であってもよい。米国特許第
４，３６６，２４１号（Ｔomら）には、タンパク質、血
液凝固因子、ホルモン、微生物、薬物及びビタミンなど
の免疫学的な対の一員である種々の分析物がその１９−
２６欄に列記されている［これを引用によって本明細書
に包含させる］。これらの分析物はいずれも本発明の組
成物におけるキャリブレーターとして使用するのに適し
ている。しかし、免疫学的な対の一員である好ましいキ
ャリブレーターは以下のものである：ヒト骨アルカリホ
スファターゼ抗原(ＨＢＡＰＡｇ)、ヒト絨毛ゴナドトロ
ピン(ｈＣＧ)、ヒト黄体形成ホルモン(ｈＬＨ)、ヒト卵
胞刺激ホルモン(ｈＦＳＨ)、クレアチンホスホキナーゼ
ＭＢアイソザイム(ＣＫＭＢ)、フェリチン、癌胎児性抗
原(ＣＥＡ)、前立腺特異抗原(ＰＳＡ)、ＣＡ−５４９
(乳癌抗原)、Ｂ型肝炎表面抗原(ＨＢｓＡｇ)、Ｂ型肝炎
表面抗体(ＨＢｓＡｂ)、Ｂ型肝炎核抗原(ＨＢｃＡｇ)、
Ｂ型肝炎核抗体(ＨＢｃＡｂ)、Ａ型肝炎ウイルス抗原、
ｇｐ１２０、ｐ６６、ｐ４１、ｐ３１、ｐ２４又はｐ１
７などのヒト免疫不全症ウイルスＨＩＶ IIの抗原、Ｈ
ＩＶ IIのｐ４１抗原、及び上記リガンドキャリブレー
ターのいずれかに対する個々の抗リガンド（好ましくは
モノクローナル抗体）。ＨＩＶ抗原は米国特許第５，１
２０，６６２号、及びGelderbloodら,Virology 156:171
-176 1987に、より詳細に記載されている。

【００１８】較正物質が免疫学的な対の一員である場
合、キャリブレーター溶液は哺乳動物血清（例えば、ヒ
ト、ブタ、ウシ、ネズミ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサ
ギ、ラット、モルモット、又はそれらの混和物）又はそ
の規定マトリックス又はその混和物又はその希釈物であ
るのが好ましい。「規定マトリックス」とは、キャリブ
レーターを安定化するか、又は１つもしくはそれ以上の
哺乳動物血清の望ましい比率を模擬している規定組成物
のタンパク質溶液である。

【００１９】本明細書にて使用している「使用濃度範
囲」なる用語は、具体的な検定において利用されるよう
なキャリブレーターの濃度範囲を意味する。従って、使
用濃度範囲は検定に応じて変動する。通常、使用濃度範
囲は、正常な試験サンプル及び不正常な試験サンプルの
両者、即ち目的濃度を有しその検定によって信頼性をも
って測定される試料に見いだされるような目的分析物の
濃度範囲である。例えば、インスリン分析物のための診
断試験キットでは、絶食した患者から得た血清試料の使
用濃度範囲は目的の不正常濃度範囲及び正常濃度範囲の
両者が包含される。第１の不正常濃度範囲は、種々の型
の糖尿病に付随するような低いインスリン濃度に反映さ
れる準正常な範囲である。第２の不正常濃度範囲は、イ
ンスリノーマに付随するようなインスリン濃度の上昇に
反映される正常以上の範囲である。

【００２０】酵素プロスタン酸ホスファターゼについて
の検定などの別の検定では、使用濃度範囲は正常及び上
昇濃度のみから構成させることができる。準正常な酵素
濃度は臨床的に興味あるものでない。ある特定の検定で
は、ユーザー又は臨床医がどの程度高い「高さ」である
かを知りたいと欲する場合がある。他の検定では、分析
物の濃度が上昇していることが知れれば十分である。後
者の例は、上昇ヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が妊
娠に伴うｈＣＧの診断検定である。このように目的分析
物とは無関係に、キャリブレーター溶液（群）の「使用
濃度範囲」は、最終的ユーザーが目的とする分析物の濃
度範囲に応じて製造者が作成している濃度範囲である。

【００２１】本明細書にて使用している「マーカー」な
る用語は、較正物質とは反応しないが、溶液中のマーカ
ーの量と直接相関する量又はレベルにおいて検出可能な
シグナルを発することのできる化学又は医療物質を意味
する。好ましい「マーカー」は色素又は可溶性金属イオ
ン又はその錯体である。特に好ましい「マーカー」は、
タンパク質担体に結合している色素である。例えば、医
療物質である同定可能なマーカーは、リポソーム嚢、赤
血球ゴースト、及び米国特許第４，７０３，０１７号
（Campbell）に教示されている色素被覆ポリマーなどの
粒子標識物である。小球の形態にある色素被覆ポリマー
は例えばBangs Laboratories, Inc., IN 46032, カーメ
ルなどから、種々の色彩、サイズ、ポリマー及び表面群
にて市販されている。粒子サイズは適用に応じて変動で
きるが、通常の粒子サイズは５−５００nmである。

【００２２】マーカーが可溶性金属イオン又はその錯体
である場合、マーカーの量は、溶液中のイオン又は錯体
の量に比例するイオン又はその錯体の物理パラメーター
を定量できるあらゆる検出方法によって測定することが
できる。例えば、適当な検出方法には分光測光法、原子
吸収、火炎測光、又はプラズマ放出又は火炎放出分光測
定などがある。これらの手法は市販されている装置を使
用しており、当業者に周知なものである。本明細書で使
用している「色素」なる用語は、紫外、可視、又は赤外
スペクトルの光りを吸収するか、又はリン光、蛍光、化
学ルミネッセンス(化学発光)である化合物又は複合体、
又は色を改変（即ち、その吸収ピークを変化）させるか
又はpＨの変化に対応して発色する化合物を意味する。

【００２３】電磁スペクトルの可視領域の光りを吸収す
る色素は、キャリブレーター溶液に色彩を与える。発色
溶液が所望でない場合は、無色のマーカーを使用するこ
とができる。無色の色素は紫外部又は赤外部の光りを吸
収し、pＨの変化に対応して発色色素に変化する。後者
の色素の例としては、溶液が酸性又は中性からアルカリ
性（即ち、pＨ範囲８．３から１０．０）に移行するに
連れて無色からピンク色に変化するフェノールフタレイ
ンがある。それと関連する色素は、溶液が酸性又は中性
からアルカリ性（即ち、pＨ範囲９．３から１０．５）
に移行するに連れて無色から青色に変化するチモールフ
タレインである。フェノールフタレイン及びチモールフ
タレイン両者の化学構造は、Tietz N.編, W.B.Saunders
Co., フィラデルフィア, 1970, 「Fundamentals of Cli
nical Chemistry,」の923及び924頁に記されている。

【００２４】他の種々のpＨ指示薬色素は当業者に周知
であり、pＨの変化に応じて第２の色彩に変化する発色p
Ｈ指示薬などがある。後者のpＨ指示薬、それらの個々
のpＨ範囲及び色調変化の例としては以下のものがあ
る： ブロモクレゾール・グリーン、pＨ３．８−５．
４、黄色から緑色；ブロモフェノール・ブルー、pＨ
３．０−４．６、黄色から青色；ブロモチモール・ブル
ー、pＨ６．０−７．６、黄色から青色；コンゴー・レ
ッド、pＨ３．０−５．０、青色−紫色から赤色；クレ
ゾール・レッド、pＨ７．２−８．８、黄色から赤色；
メチルオレンジ、pＨ３．０−４．４、赤色から黄色；
メチルレッド、pＨ４．２−６．３、赤色から黄色；フ
ェノールレッド、pＨ６．８−８．４、黄色から赤色；
チモールブルー、pＨ８．０−９．６、黄色から赤色
(０．００１Ｎ ＮaＯＨ中、酸形態)；及びＴoepfer's試
薬、pＨ２．９−４．０、赤色から黄色。これらの指示
薬個々の化学構造式は、Tietz N.編, W.B.Saunders C
o., フィラデルフィア, 1970, 「Fundamentals of Clini
cal Chemistry,」の920-924頁に記されている。さらなる
pＨ指示薬色素及びそれらの個々の化学構造式は1989 Mo
lecular Probes カラログの92-94頁に記されている(Mol
ecular Probes, オレゴン, ユージーン)。pＨ変化が存
在しないでマーカーとして発色pＨ指示薬色素を使用す
ること、例えば緩衝液中において色素を使用すること
も、本発明の範囲内である。

【００２５】感度を上げるためには、高い吸光係数を有
するマーカーを選択する。あるいは、蛍光又は化学ルミ
ネッセンス分子を利用する。希釈試験法が可能か否かを
決定するためには、初期の試験に発色色素を利用すれば
よい。溶液中の遊離の色素はその相対的濃度及び／又は
外観が経時的に変化する場合がある。この原因として
は、光漂白、熱分解及び／又は溶液（即ち、マトリック
ス）中、他の物質（例えばタンパク質）への物理的吸収
などの種々の因子が考えられる。しかし、担体タンパク
質への色素の共有的カップリングにより、これらの問題
の作用が回避又は軽減される。共有的カップリングによ
りさらに、酵素分解を受け易い色素の安定性が増大され
る。色素の担体タンパク質への結合はまた、血清又は規
定マトリックス中の他の成分が色素と無作為会合するの
を大幅に減少させ、検定の変動性を減少させるものであ
る。好ましくは、担体タンパク質は結合前に血清及び／
又は規定マトリックス中に存在させ、検定に関与しない
ようにさせる。

【００２６】色素を担体タンパク質にコンジュゲートさ
せる別の手法として、本発明のマーカーとして発色性タ
ンパク質を利用することができる。適当な発色性タンパ
ク質にはフィコビリプロテイン(phycobiliprotein)があ
り、これは発色に加えて蛍光を発するものである。フィ
コビリプロテインとしては、フィコシアニン、アロフィ
コシアニン、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリス
リン及びＣ−フィコエリスリンなどがある。フィコビリ
プロテインは純粋な形態で、又は種々のコンジュゲート
体として、例えばMolecular Probes,Inc., オレゴン,
ユージーンから市販されている。

【００２７】本発明にて使用されるマーカーはその型と
は無関係に、同定可能に有効であるが干渉しない量のマ
ーカーを使用するべきである。試験サンプルとして希釈
キャリブレーター溶液中のマーカー量を測定した場合、
その量が目的分析物の検定に利用される波長において有
意な作用を示さなければ、貯蔵キャリブレーター溶液中
のマーカー量は「非干渉」又は「干渉しない」ものであ
る。通常、マーカーは、そのマーカーの吸収及び／又は
放出スペクトルが検定に利用されるシグナル放出系のそ
れと重複しなければ、非干渉又は干渉しないものであ
る。

【００２８】貯蔵キャリブレーター溶液中のマーカーの
量が「同定可能に有効である」か否かは、吸光係数、担
体タンパク質の存在もしくは不存在、吸収バンドの幅、
目的分析物の検定に関連するバンドに対する吸収バンド
の位置、熱及び光安定性、非特異的結合性、溶媒、なら
びに溶液の組成及びpＨなどの種々の因子に応じて決定
される。当業者であれば、貯蔵キャリブレーター溶液か
ら調製され、正確な測定が求められている希釈（即ち、
使用）キャリブレーター溶液中のマーカーの量を信頼性
高く測定できるその測定能に基づき、貯蔵キャリブレー
ターのためのマーカー溶液の同定可能に有効である量を
容易に決定でき、またそれを利用できるであろう。それ
を行うに当たっては、当業者はまず、比較的少ない貯蔵
溶液中マーカー量を使用し、次いでそのマーカー量が同
定可能に有効であるが干渉しない量になるまで増大させ
るであろう。有効であっても有効でなくても干渉すると
決定されたマーカーは拒絶する。そして、別のマーカー
を試験する。同定可能であり干渉しないマーカーのみを
選択する。

【００２９】本発明では、１つ又はそれ以上のマーカー
をタンパク質（即ち、担体タンパク質）に結合させるの
が好ましい。担体タンパク質に結合させたマーカーも本
明細書ではマーカーと称している。本発明にて使用でき
る適当な担体タンパク質は１つ又はそれ以上のマーカー
と結合することのできる非干渉性のタンパク質である。
担体タンパク質と結合する典型的なマーカーは色素、金
属イオン錯体、及びフィコビリプロテインなどである。
担体タンパク質と結合する好ましいマーカーは色素であ
る。

【００３０】担体タンパク質と結合する多くの色素分子
は以下の種々の因子によって決定される：タンパク質に
存在する多くの利用可能な結合部位、貯蔵駅中のタンパ
ク質濃度、及び色素の吸光係数。マーカーがタンパク質
に結合することは、官能基を介して直接的に、又はリン
カーアームを介して間接的に行われる。マーカーに結合
するのに適している最も普通のタンパク質上官能基はシ
ステインのスルフヒドリル基（−ＳＨ）、リジンのε−
アミノ基（−ＮＨ₂）、アスパラギン酸、グルタミン酸
又はＣ−末端アミノ酸のカルボキシ（−ＣＯＯＨ）基、
メチオニンのチオエーテル（−Ｓ−ＣＨ₃）、ヒスチジ
ンのイミダゾリル基、アルギニンのグアニジニル基、チ
ロシンのフェノール性基、及びトリプトファンのインド
リル基である。１つ又はそれ以上の官能基を有すると考
えられるタンパク質は、米国特許第４，３６６，２４１
号（Ｔomら）の１９−２０欄に列記されている［これら
を引用によって本明細書に包含させる］。これらの官能
基を介する化学物質のタンパク質への会合は例えば、Wo
ng,Shen, CRCプレス, ボストン, 1991「Chemistry of Pr
otein Conjugation and Cross-Linking,」に記載されて
いる［これを引用によって本明細書に包含させる］。こ
れらの官能基のうち、アミノ基及びスルフヒドリル基が
好ましい。

【００３１】すべてのタンパク質が遊離のスルフヒドリ
ル基を有しているわけでない。しかし、殆どのタンパク
質はリジンの遊離アミノ基を介して遊離のアミノ基を有
している。従って、一般には、マーカーのタンパク質へ
の会合はその遊離アミノ基を介するものが好ましい。タ
ンパク質のスルフヒドリル基に色素を直接結合させるた
めの好ましい方法は、それに結合するマレイミド部分を
有する色素を利用するものである。マレイミド部分はス
ルフヒドリル基に特異的であり、タンパク質分子に色素
を共有結合させることができる。結合する反応性マレイ
ミドを有する種々の色素は例えばMolecular Probes, In
c., オレゴン, ユージーンから市販されている［例え
ば、フルオレセイン−５−マレイミド、カタログ番号Ｆ
１５０；エオシン−５−マレイミド、カタログ番号Ｅ−
１１８］。

【００３２】色素をタンパク質のε−アミノ基に直接結
合させるための好ましい方法は、イソチオシアネート官
能基を有する色素を利用する。イソチオシアネートとア
ミノ基の間の反応はpＨ依存性であり、アルカリpＨ、好
ましくはpＨ＞８.５で起こり、非プロトン化アミノ基が
反応に利用可能である。イソチオシアネート官能基を有
する色素は市販品から、例えば、Molecular Probes, In
c.から入手可能である[例えば、テトラメチルローダミ
ン−５−(および−６)−イソチオシアネート、Cat. No.
T-490；エオシン−５−イソチオシアネート、Cat. No.
E-18；エリトロシン−５−イソチオシアネート、Cat.
No. E-332；およびマラカイトグリーンイソチオシアネ
ート、Cat. No. M-689]。当業者なら、本発明の組成物
または方法において使用するに適した他の色素をどこか
ら購入するかまたはどのように修飾するかについて認識
しているであろう。例えば、「色の化学」[Zollinger,
Heinrich, VCH出版, New York and Weinheim (1987)]を
参照。Zollingerは、有機色素および顔料の合成、性質
および応用を教示している。

【００３３】本発明の貯蔵溶液において可溶性であり、
目的の検定に非干渉性であり、そしてそれ自体が目的の
検定における分析物ではない任意のタンパク質が、本発
明における担体タンパク質として使用するのに適してい
る。好ましい担体タンパク質は、特に検定がリガンドま
たは抗リガンドに対するものであるときには、哺乳動物
血清タンパク質である。担体タンパク質として使用する
に適した多数の哺乳動物タンパク質が米国特許4,366,24
1(Tom)に教示されている。

【００３４】色素のための適切な担体タンパク質を選択
する際には、色素(例えば、吸光係数、疎水性および大
きさ)および対応する担体タンパク質(例えば、結合部位
の数および種類、生物学的機能および／または拡散性を
維持することの望ましさ)の両方に関係する種々の因子
を考慮しなければならない。溶液中の担体タンパク質の
ある種の所望の機能を維持するために、最大数よりも実
質的に少ない色素分子を利用可能な結合部位に結合させ
ることが必要になることがある。例えば、哺乳動物血清
アルブミンは、天然の担体タンパク質(例えば、非コン
ジュゲート化ビリルビン、薬学物質など)として、およ
び通常のコロイド浸透圧の維持物質として機能すること
ができる。多数の色素のアルブミンへのコンジュゲート
化は、その立体配座を変化させ、従ってどちらかの能力
で天然に機能するその可能性が変化するであろう。

【００３５】同定可能な有効量のマーカーを生成するコ
ンジュゲート中の色素とタンパク質の任意の比を本発明
において使用することができる。タンパク質分子に結合
(即ち、コンジュゲート化)させるための色素分子の数を
選択する際には、１タンパク質分子あたり少なくとも１
色素分子をコンジュゲート化させることによって初めは
ゆっくりと始め、次いで、同定可能に有効かつ非干渉性
でありうるマーカー(コンジュゲート化されたマーカー)
が得られるまでその数を徐々に増加させる。従って、一
部の状況下では、特に色素が高い吸光係数を有し、タン
パク質分子が小さい(例えば、分子量≦１０,０００ダル
トン)ときには、色素とタンパク質分子の比は１：１の
ように低いものであってよい。タンパク質分子が大きい
(例えば、分子量＞６９,０００ダルトン)ものである他
の状況下では、タンパク質分子に対して大きい数の色素
分子(例えば、１〜１５＋)をコンジュゲート化させるこ
とができる。中間の大きさの担体タンパク質は、タンパ
ク質分子に対して中間の数の色素分子をコンジュゲート
化させることができると予測される。本発明の目的のた
めの色素分子とタンパク質分子の使用比率は、約１：１
〜約１５：１の範囲である。

【００３６】好ましい担体タンパク質は哺乳動物血清ア
ルブミン、例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、ヒト血
清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ヒツジ血清アルブ
ミン、ヤギ血清アルブミン、モルモット血清アルブミン
などであり、これらの全てがリジン残基に富む。例え
ば、ＢＳＡは５９のリジン残基を有しており、その３０
〜３５が化学結合(例えば、イソチオシアネート基を介
する結合)に利用可能なアミノ基を有している。本発明
において使用するに適切な担体タンパク質−色素コンジ
ュゲート(即ち、マーカー)の例を挙げると、それは血清
アルブミン−マラカイトグリーン コンジュゲートのい
ずれか、好ましくはウシ血清アルブミン−マラカイトグ
リーン コンジュゲート(即ち、「ＢＳＡ−マラカイトグ
リーン コンジュゲート」)である。マラカイトグリーン
はトリフェニルメタン型の色素であり、６２９nmと４２
７nmに比較的鋭い２つの吸収バンドを有している。マラ
カイトグリーンとＢＳＡの好ましい比率は、約２.８：
１〜約７.０：１の範囲内である。ＢＳＡ−マラカイト
グリーン コンジュゲートの安定性は、上記の色素とタ
ンパク質の比(２.８〜７.０)に影響されないことがわか
った。

【００３７】貯蔵および希釈キャリブレーター溶液の両
溶液中のマーカーの同じ物理パラメーター(例えば、吸
収、放射、リン光、蛍光など)の測定によって、任意の
希釈キャリブレーター溶液中に含まれる抗原(即ち、キ
ャリブレーター)量の間接的な精密かつ正確な測定値を
得ることができる(本明細書中の実施例を参照)。物理パ
ラメーターの測定は迅速(約３０分)であり、診断キット
の製造元などにこの製造元の希釈工程の間接的ではある
が正確な分析法を供することができる。例示を目的とし
て、本明細書中の実施例ではマーカー ＢＳＡ−マラカ
イトグリーンの合成を教示する。

【００３８】本発明のマーク化貯蔵溶液がマーカーとし
て可視性色素(遊離またはタンパク質にコンジュゲート
化されていることを問わない)を使用するときには、こ
の溶液を一系列の希釈(即ち、使用)キャリブレーター溶
液に変換することができる(溶液中のキャリブレーター
の濃度範囲およびキャリブレーター濃度に比例した色調
範囲の両方にまたがる)。従って第２の態様において、
本発明は希釈(即ち、使用)キャリブレーター溶液に関す
るものであるが、この溶液は一系列のキャリブレーター
溶液の１つであり、かつ溶液中のキャリブレーター濃度
に比例した可視性マーカーをその中に含有する溶液であ
る(本明細書中に既に定義したように、「キャリブレー
ター」なる語句はキャリブレーション物質とコントロー
ル物質の両方を包含する)。

【００３９】別の態様において、本発明は一系列のキャ
リブレーター溶液に関するものであるが、これら溶液は
複数の個々のキャリブレーター溶液(好ましくは、２〜
１０のキャリブレーター溶液)からなり、予め決定した
キャリブレーター濃度範囲にまたがっている(該系列中
のそれぞれの溶液はその中の色の濃度に比例した色の濃
さを有する)。本明細書中に記載したように、任意の系
列におけるキャリブレーター濃度の範囲は、この検定に
より信頼して測定することができる所望の濃度範囲およ
び所望の分析物を含む多くの因子に依存している。

【００４０】これらキャリブレーション溶液を導入した
診断検定を行なう医療技術者は、キャリブレーター濃度
の関数として、それぞれのキャリブレーター溶液の色の
濃さが異なるのが有用であることを見い出すであろう。
例えば、ある検定においてキャリブレーターをピペッテ
ィングする前に、通常、技術者はキャリブレーター溶液
を濃度の上昇または下降する順に並べるであろう(通常
は上昇する順)。このように並べられたキャリブレータ
ー溶液系列の対応する色の濃さの上昇または下降は、キ
ャリブレーター溶液がピペッティング工程用に適切に並
べられていることを迅速に視覚により保証することを可
能にする。色の濃さの上昇または下降順序のいずれかの
遮断は間違って置かれたキャリブレーター溶液を示すで
あろう。また、ピペッティング工程の後に、それぞれの
キャリブレーター溶液の増加しつつ変化する色は、正し
いキャリブレーター溶液が適切な試験管または試験溶液
中に少なくともピペッティングされたことの第２の視覚
による保証を与えることができる。

【００４１】即ち、別の態様において、本発明は一系列
のキャリブレーター溶液を用いて診断検定を行なうため
の方法を包含するものであるが、この方法は次の工程： (a)それぞれのキャリブレーター溶液がその中に含まれ
ているキャリブレーター物質の濃度に比例して可視性マ
ーカーを含有する一系列のキャリブレーター溶液を、そ
の中に含まれているキャリブレーター物質の濃度に基づ
いて上昇または下降の順に並べる工程；および(b)この
並べたキャリブレーター溶液系列の色の上昇または下降
の逆転がないことを検視して、該キャリブレーター溶液
がピペッティングおよび／またはサンプリング用に適切
に並んでいることを保証する工程；からなり、これによ
り、並べたキャリブレーター溶液系列の色の上昇または
下降の逆転が間違った並び方を示すようにすることから
なる。時には、１またはそれ以上のキャリブレーター溶
液を重複して調製してもよい。このような重複キャリブ
レーター溶液は同一のキャリブレーター濃度を有し、従
って同一の色を有するであろう。この重複キャリブレー
ター溶液を直列組(即ち、並べて)で配置すると、キャリ
ブレーター系列の色の上昇または下降が逆転する結果に
はならず、上昇または下降の均一な箇所と遮断の結果に
なるのみであろう。

【００４２】第３の態様においては、本発明は、本発明
の中間体組成物(即ち、貯蔵溶液)を利用する方法に関す
る。本発明のこの方法は、キャリブレーションまたはコ
ントロール物質(「キャリブレーター」)を含有する貯蔵
溶液の正しい希釈が通常は診断キットまたは診断成分の
製造者によって行われたことを確認するためのものであ
る。この方法は、次の工程からなる： (a)同定可能に有効かつ非干渉性の量のマーカーと予め
決定した量のキャリブレーターを混合して、第１濃度の
マーカーと第２濃度のキャリブレーターを有するマーク
化貯蔵キャリブレーター溶液を得； (b)該マーク化貯蔵キャリブレーター溶液中のマーカー
濃度とキャリブレーター濃度の間の比率を計算し； (c)該マーク化貯蔵キャリブレーター溶液またはその一
部を予め決定した量で希釈して、該比率が実質的に維持
された希釈キャリブレーター溶液を得(該希釈キャリブ
レーターは、第１の予測物理パラメーターに関係した第
１の予測マーカー濃度、さらに第２の予測キャリブレー
ター濃度を有する)； （d)該希釈キャリブレーター溶液の実際の物理パラメー
ターを測定し(該実際の物理パラメーターはマーカー濃
度に比例する)；そして (e)該実際の物理パラメーターまたはその誘導パラメー
ターを第１の予測物理パラメーターまたはその誘導パラ
メーターのそれぞれと比較して、希釈工程が正しく行わ
れたことを確認する。

【００４３】上記の方法において、予め決定した量のキ
ャリブレーターおよび第２の予め決定した量のマーカー
は、任意の順序で混合する。マーカーは「同定可能な」
と言及されるが、貯蔵溶液中に入れるときには無色であ
ってよい。このマーカーは、後の段階で同定可能である
か、または同定可能にされることが必要であるにすぎな
い。同定は視覚によるか、または装置によるものであっ
てよい。マーカーとキャリブレーターの両方がマーク化
貯蔵キャリブレーター溶液中にそれらそれぞれの濃度を
有している。これらの濃度は同一または異なっていてよ
い。

【００４４】また、上記の方法は、マーク化貯蔵溶液中
のマーカー濃度とキャリブレーター濃度の間の「比率」
を計算する工程を包含している。本明細書中で用いる
「比率」または「比例する」なる語句は、正または逆、
直線または対数を問わず、数学的に表現することができ
る比または任意の関係を意味する。工程(b)の「計算」
工程は、上記工程(e)の「比較」工程の前の任意の時間
または同時に行なってよい。

【００４５】さらに、上記の方法は、記述した「希釈」
工程を包含している。この希釈工程はマーカーとキャリ
ブレーターの両方を含有するマーク化貯蔵溶液を希釈す
るので、マーカーとキャリブレーター両方の濃度を等し
く希釈する。従って、工程(a)におけるあらゆる比率が
工程(c)においてそのまま維持される。あらゆる希釈溶
液中のマーカーとキャリブレーター両方の予測濃度は、
次の式を用いて決定することができる： Ｃonc_i（Ｖolume_i）＝ Ｃonc_e（Ｖolume_e） 上記式中、「Ｃonc_i」はマーク化貯蔵キャリブレーター
溶液中のマーカーの初期濃度であり；「Ｖolume_i」はマ
ーク化貯蔵キャリブレーター溶液または希釈されたその
一部の初期容量であり；「Ｃonc_e」および「Ｖolume_e」
は希釈後のそれぞれ予測濃度および予測容量である。
「Ｃonc_i」、「Ｖolume_i」および「Ｖolume_e」は既知で
あるので、この式から予測濃度「Ｃonc_e」を求めること
ができる。

【００４６】「測定」工程は、マーカーの実際濃度に関
係した希釈溶液の物理パラメーターを測定することに本
発明の方法を限定する。この物理パラメーターはマーカ
ーおよびその物理性質に基づいて選択した。色素の場合
には、このような濃度関連の物理パラメーターには、吸
収、透過、蛍光、リン光、化学発光などが含まれる。金
属イオンまたはその錯体の場合には、濃度関連の物理パ
ラメーターには、特定波長における光の吸収または放射
が含まれる。測定工程において用いられる「比例する」
なる語句は、既に上で定義した。

【００４７】マーカーがエオシンであるときには、好ま
しい濃度関連の物理パラメーターはリン光または蛍光で
ある。このエオシンはコンジュゲート化されていなくて
もよいが、好ましくはエオシン−５−マレイミドなどに
よって担体タンパク質にコンジュゲート化される。エオ
シン−５−マレイミドは、Molecular Probes, Eugene,
Oregon Cat.No.E-118などから市販品として入手するこ
とができる。

【００４８】マーカーがフルオレセインまたはローダミ
ンであるときには、好ましい濃度関連パラメーターは蛍
光である。このフルオレセインまたはローダミンはコン
ジュゲート化されていなくてもよいが、好ましくは担体
タンパク質にコンジュゲート化される。コンジュゲート
可能なフルオレセイン誘導体には、フルオレセイン−ｒ
−マレイミドおよび５−(および−６)−カルボキシフル
オレセイン スクシンイミジルエステルが含まれるが、
これらはMolecular Probes, Eugene, OregonからCat.N
o.F-150およびC-1311としてそれぞれ入手することがで
きる。コンジュゲート可能なローダミン誘導体は、５−
(および−６−)−カルボキシテトラメチルローダミン
スクシンイミジルエステル(Cat.No.C-1171)および５−
(および６−)−カルボキシ−Ｘ−ローダミン スクシン
イミジルエステル(Cat.No.C-1309)としてMolecular Pro
bes, Eugene, ORなどから市販品として入手することが
できる。

【００４９】マーカーがフィコビリプロテイン、例えば
Ｂ−フィコエリトリンなどの着色タンパク質であるとき
には、濃度関連パラメーターは吸収または蛍光であって
よい。このタンパク質は着色しているので、色素にコン
ジュゲート化させる必要はない。ここに記載したフィコ
ビリプロテインはMolecular Probes, Eugene, Oregonな
どから市販品として入手することができる。

【００５０】マーカーがＢＳＡ−マラカイトグリーン
コンジュゲートであるときには、好ましい濃度関連の物
理パラメーターは吸収である。このコンジュゲートに対
して、Hewlett Packard 8451 A Diode Array 分光光度
計を用いて６２８nmの吸収を測定した(このＨＰ ８４５
１は等波長の吸収だけを測定することができる)。濃度
に対してプロットしたときに、０〜１.５吸収単位の範
囲にわたって吸収が直線的であることを観察した。

【００５１】比較工程において、工程(d)からの「実際
の物理パラメーターまたはその誘導パラメーター」を、
工程(c)からの対応する「予測の物理パラメーターまた
はその誘導パラメーター」と比較する。本発明におい
て、実際の物理パラメーターを第１の予測物理パラメー
ターと比較する工程は、実際および予測の物理パラメー
ターから誘導される数(即ち、これらの誘導パラメータ
ー)のあらゆる利用を包含することが意図されている。
例えば、希釈キャリブレーター溶液の実際および予測の
両吸収をある因数(例えば、１０００)で割るかまたは掛
けることが、「実際の物理パラメーター」の誘導パラメ
ーターを「予測の物理パラメーター」の誘導パラメータ
ーと比較することになるであろう。「実際の物理パラメ
ーター」の好ましい誘導パラメーターは、「実際の濃
度」である。「第１の予測物理パラメーター」の好まし
い誘導パラメーターは、「予測濃度」である。

【００５２】また、マーク化貯蔵キャリブレーター溶液
と希釈キャリブレーター溶液の両溶液中のマーカーとキ
ャリブレーターの濃度の間の関係の故に、本発明は、貯
蔵物から希釈された溶液中のキャリブレーションまたは
コントロール物質(「キャリブレーター」)の濃度を確認
するための方法に関する。この方法は上記の工程(a)〜
(d)を利用する。しかし、その最後の工程である工程(e)
は、以下からなる：(e)希釈キャリブレーター溶液中の
キャリブレーターの実際の濃度が、実際の物理パラメー
ターと第１の予測物理パラメーターの間の相違を参照し
て、またはそれらの誘導パラメーターの間の相違を参照
して、その予測濃度に実質的に近似していることを確認
する。

【００５３】この確認工程を行なう際には、希釈キャリ
ブレーター溶液の実際の(測定した)物理パラメーターと
予測物理パラメーターの間の許容しうる相違(即ち、許
容性)を設定する。上に記載したように、例えば１また
はそれ以上の因数によって割るかまたは掛けることによ
り、これらパラメーターを数学的に操作してそれらの誘
導パラメーターを得ることは本発明の範囲内にあるとみ
なす。工程(d)において測定される実際の物理パラメー
ターの特に好ましい誘導パラメーターは、マーカーの実
際の濃度である。第１の予測物理パラメーターの対応し
て好ましい誘導パラメーターは「予測濃度」である。即
ち、本発明は、診断キットまたは成分の製造者ならびに
該キットまたは成分の末端使用者に有用な組成物および
方法を提供するものである。

【００５４】

【実施例】実施例１．ＢＳＡ-マラカイトグリーン複合体の製造 ＢＳＡ粉末(牛フラクションＶ，シグマ・ケミカル・カ
ンパニー，ミズーリ州セントルイス，カタログ番号３２
９４)を０.０５Ｍホウ酸緩衝液(ｐＨ９.５)中に１ｍｌ
あたり１０ｍｇの濃度で可溶化した。マラカイトグリー
ン・イソチオシアネート(モレキュラー・プローブス，
オレゴン州ユージン，カタログ番号Ｍ-６８９)をＤＭＳ
Ｏ１ｍｌ中に別途可溶化した。８等量の色素を上記ＢＳ
Ａ溶液に加え、２時間反応させた。ピペットを用いて、
複合体反応液の少量を反応の完結についてチェックし
た。ピペットの底にガラスウールを入れ、次いで８ｃｍ
のＧ-２５セファデックス・ブランド・マイクロビーズ
(分子量カットオフ５０００)(ファルマシア，ニュージ
ャージー州ピスカタウェイ)を充填した。次いでそのカ
ラムを０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)で平衡化した。
その後、タンパク質色素複合体１００μｌを上記カラム
にのせ、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)で溶出させ
た。第１のピークを集め、下記１ないし５の等式を用い
てそのカップリング効率を決定した。 １）モル濃度マラカイトグリーン＝(吸光度６２９ｎｍ)
×(Σ_629nmマラカイトグリーン)×(１ｃｍ) ２）吸光度２８０ｎｍマラカイトグリーン＝(吸光度６
２９ｎｍ)×(Σ_280nmマラカイトグリーン) ３）吸光度ＢＳＡ＝(吸光度２８０ｎｍ−吸光度２８０
ｎｍマラカイトグリーン) ４）ＢＳＡ濃度＝(吸光度２８０ｎｍＢＳＡ／１.２ｍｇ
／ｍｌ)／６６０００ＭＷ ５）色素／タンパク質＝モル濃度マラカイトグリーン／
モル濃度ＢＳＡ

【００５５】タンパク質１分子あたり色素５分子の比率
が得られるまで反応を続けた。トリス［ヒドロキシメチ
ル］アミノメタン・塩酸塩、即ち「Trizma HCl」(例え
ばシグマ・ケミカル・カンパニー，ミズーリ州セントル
イス，カタログ番号Ｔ３２５３)の飽和溶液を用いて上
記溶液を中和することによりカップリング反応をクエン
チした。

【００５６】平均してＢＳＡ１分子あたり５分子のマラ
カイトグリーンを結合させた。ＢＳＡは５９個のリジン
残基を有しており、そのうちの３０〜３５残基は化学的
カップリングに利用できるアミノ基を有している。ｐＨ
７では、ＢＳＡなどのある部分中のリジンのε-アミノ
基は約９９％プロトン化されており、非反応性である。
しかしｐＨ８.５以上では限られた数のアミンが脱プロ
トン化され、反応性になる。上記反応で用いたｐＨ９.
５では、色素分子のイソチオシアネート基がアミノ酸リ
ジンの側鎖上のε-アミノ基と反応した。これら条件下
におけるこのタイプのカップリング反応は２時間後にほ
ぼ６０％完結する。したがって、ＢＳＡに対する色素の
比率が５対１になるように、８等量のマラカイトグリー
ン色素をタンパク質溶液に加えた。ＢＳＡに対する色素
のカップリングは色素の波長シフトとして観測すること
ができる。比率５：１の色素分子／ＢＳＡ分子を用いる
ことにより、ＢＳＡ-マラカイトグリーン複合体が約４.
４×１０^-7Ｍであるマーク化貯蔵キャリブレーター系の
１：２５００希釈液で、ＢＳＡ-マラカイトグリーン複
合体の吸光度を検出することが可能であった。

【００５７】実施例２．ＢＳＡ-マラカイトグリーン複
合体の精製 Ｇ-２５セファデックスを０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.
０)で平衡化した。１.５ｃｍ×３０ｃｍのカラムにその
Ｇ-２５ゲルを１ｍｌ／分の流速で充填し、２８０ｎｍ
で監視した。そのカラムを０.１Ｍリン酸塩(ｐＨ７.０)
でベースラインが安定するまで平衡化した。１ｍｇ／ｍ
ｌのＢＳＡ溶液を０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)中に
調製した。非特異的結合を低下させるために、１空隙容
量のＢＳＡ溶液をこのカラムに適用し、２８０ｎｍで監
視した。元のベースラインに再び戻るまで、このカラム
を０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)で洗浄した。ＢＳＡ
-マラカイトグリーン複合体溶液３ｍｌをこのカラムに
適用した。複合体を遊離の色素から分離し、０.１Ｍリ
ン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を用いて溶出させ、２８０ｎｍ
で監視した。空隙タンパク質-色素ピークを集め、上述
の等式を用いてタンパク質(ＢＳＡ)に対する色素(マラ
カイトグリーン)の比率を決定した。このＢＳＡ-マラカ
イトグリーン複合体ピークを４℃で終夜水に対して透析
(ＭＷ１２０００カットオフ)した後、凍結乾燥した。 空隙容量＝(２πｒ×カラムの高さ)×(０.２５)^a) ａ) この０.２５という数値はＧ-２５球体が最も緊密な
充填配置を取って、充填された球体が全容量の７５％
(０.７５)を占めるという仮定に基づいている。この等
式においてｒはカラムの半径を表す。

【００５８】ＢＳＡ-マラカイトグリーン複合体はＧ-２
５ゲルの分子量カットオフ(５０００ダルトン)よりかな
り大きい分子量(即ち＞６６０００ダルトン)を有する。
したがって、この複合体は空隙容量中に溶出される。溶
出による分離に先立って、ゲルに対する複合体の非特異
的吸収を低下させるべく、カラムをＢＳＡで遮断するこ
とが重要であった。強い色ゆえに、もし非特異的相互作
用が起これば、遊離の色素と複合体色素の分離を決定す
ることは極めて困難になるであろう。カラムはかすかな
青色になり、望ましくない相互作用が完全には排除され
なかったことを示した。２つの青色バンドを２８０ｎｍ
で監視した。その色の大半は空隙ピーク内に特定され
た。リン酸緩衝剤と上記タンパク質に非特異的に結合し
た色素を除去するために複合体を透析した。

【００５９】実施例３．ＢＳＡ-マラカイトグリーンと
仮定的に５０００ｎｇ／ｍｌの課題のキャリブレーター
を含有するマーク化貯蔵キャリブレーター溶液の調製 貯蔵キャリブレーター溶液からの希釈の正確さを確認す
るために貯蔵キャリブレーター溶液中でマーカーを使用
することの成否を決定するために、そのマーカーとして
のＢＳＡ-マラカイトグリーン複合体と５０００ｎｇ／
ｍｌのキャリブレーターを仮定的に含有するマーク化貯
蔵溶液を以下のように調製した。５.０ｍｌのメスフラ
スコに脱イオン水約２.５ｍｌを加えた。その後、次の
試薬類を順次加えた：クエン酸(一水和物)１２.４ｍ
ｇ、リン酸水素二ナトリウム(無水物)７７.７ｍｇ、Ｄ-
マンニトール６.７ｍｇ、アジ化ナトリウム６.７ｍｇ、
非イオン性界面活性剤「Nonidet-P40」(シグマ・ケミカ
ル・カンパニー，ミズーリ州セントルイス，カタログ番
号Ｎ６５０７)６.７μｌ、３０％牛血清アルブミン(イ
ンタージェン・カンパニー，ニューヨーク州パーチェイ
ス)０.８３６ｍｌ、およびＢＳＡ-マラカイトグリーン
複合体４１０ｍｇ(上記実施例２で得たものなど)。各試
薬の添加の間には、すべての固体が溶解するまで溶液を
充分に混合した。ＢＳＡとNonidetの添加後には、それ
ぞれ５分間溶液を混合した。この混合は渦が生じるに足
るほど激しくなくてはならないが、発泡が起こるほど激
しくてはいけない。次にｐＨ＜６.９の場合には０.１Ｎ
ＮａＯＨを用い、ｐＨ＞７.１の場合には０.１Ｎ ＨＣ
ｌを用いて、６.９〜７.１の範囲内になるようにｐＨを
調節した。ｐＨが指定した範囲に入ったら、５.０ｍｌ
に希釈した時に０.０２％濃度を与えるに足る量のアジ
化ナトリウムを加えた。次にその溶液をすべての固体が
溶解するまで混合した。この溶液に充分量の脱イオン水
を加えてその体積を５.０ｍｌのマークまで増量させ
た。得られたマーク化溶液を５０００ｎｇ／ｍｌの目的
のキャリブレーター(例えば抗原など)を仮定的に含有す
るマーク化貯蔵キャリブレーター溶液とした。このマー
ク化貯蔵溶液を暗所に４℃で保存した。

【００６０】実施例４．使用液の調製：吸光度の測定 ４.Ａ．規定マトリックスの調製 マーク化貯蔵溶液を希釈する際に使用する規定マトリッ
クスを下記の手法に合わせて調製した。５００ｍｌの脱
イオン水が入った１０００ｍｌメスフラスコに無水リン
酸水素二ナトリウム１１.６ｇを加える。次に、その内
容物をすべての固体が溶解するまで混合する。その後、
クエン酸一水和物１.８６ｇをその溶液に加え、その内
容物をすべての固体が溶解するまで混合する。次に３０
％牛血清アルブミン(ＢＳＡ)３３３.３ｍｌを上記フラ
スコに加え、その内容物を少なくとも５分間撹拌する。
この撹拌は渦が形成するに足るほどでなければならない
が、発泡が起こるほど激しくてはならない。次いで、そ
の溶液に炭水化物(例えばマンニトール)１.０ｇを加
え、その溶液をすべての固体が溶解するまで撹拌する。
その後、非イオン性界面活性剤(例えばNonidet P-40)１
ｍｌをその溶液に加える。上述のように５分間撹拌を続
ける。次に、６.９未満のｐＨについては１０Ｎ水酸化
ナトリウムを用い、７.１より高いｐＨについては６Ｎ
塩酸を用いてｐＨが６.９から７.１までの範囲内になる
ように調節する。ｐＨが指定の範囲に入ったら、その溶
液にアジ化ナトリウム１.０ｇを加え、それをすべての
固体が溶解するまで混合する。最後に、このフラスコに
充分量の脱イオン水を加えてその溶液を１０００ｍｌの
マークまで増量させる。０.２ミクロンフィルターを通
して濾過した後、得られた溶液は使用準備のできた規定
マトリックスである。

【００６１】４.Ｂ．規定マトリックスによるマーク化
貯蔵キャリブレーター溶液の希釈 実施例３のマーク化貯蔵溶液(これは５０００ｎｇ／ｍ
ｌの抗原性キャリブレーターに対応する)を規定マトリ
ックス(上記実施例４.Ａ.)で希釈して、一系列の希釈さ
れたキャリブレーター溶液(即ち「使用キャリブレータ
ー溶液」)を調製した。希釈されたキャリブレーター溶
液は２.０、５.０、１０.０、２５、および５０ｎｇ／
ｍｌの抗原に等価である。これらのレベルを達成するた
めに、マーク化貯蔵溶液をそれぞれ１：２５００、１：
２０００、１：１０００、１：５００、および１：１０
０に希釈した。これらの希釈されたキャリブレーター溶
液のそれぞれについて吸光度を決定した。次に、各レベ
ルの試料を２セットの３つに分割した。１セットを暗所
に置いた。他のセットを室内の光のなかに置いた。両方
の試料セットを室温で保存した。各試料の吸光度をヒュ
ーレット・パッカード８４５１Ａダイオード・アレイ分
光測定器で調製の１日、２日、および６日後に読み取っ
た。下記１〜３の等式を用いて、各試料について変動の
係数百分率(％ＣＶ)を計算した。 １）誤差百分率＝示数相違(吸光度)平均 ２）標準偏差＝［(平均−値)²の和／Ｎ］^1/2(ここにＮ
＝値の数) ３）％ＣＶ＝標準偏差×１００

【００６２】明所試料と暗所試料の間の吸光度、誤差百
分率、および変動の係数(「ＣＶ」)の相違を決定した。
ＣＶ百分率は測定を行った範囲で良好であった。しかし
低い濃度(高い希釈率)では信号対雑音比が増大した。示
数の変動は±０.０１６吸光度単位の精度を有する分光
測定器によるものであった。１日、２日、および６日の
それぞれにおいて、ＣＶは５％より低かった。

【００６３】個々の日(第１日、第２日、および第６日)
のそれぞれについての較正曲線はすべて相関係数１を伴
う直線であった。データ点について計算した線に関する
切片と傾きはわずかに変化する。これは分光測定器の日
々の変動に原因を帰することができ、３日すべてを同じ
グラフにプロットした場合に観測することができる。第
２日に関する棒グラフと検定内ＣＶは明所試料セットと
暗所試料セットの間に有意な相違がない(即ち、＜０.０
３吸光度単位)ことを示す。吸光度示数の偏差は分光測
定器の変動によるものであり、０.０ｎｇ／ｍｌ試料で
の示数で観測することができる。０.０ｎｇ／ｍｌ値に
等しいか、それ以下の吸光度の相違はいずれも分光測定
器によるものである。しかし検定内ＣＶは第６日にわず
かに増大したが、それでも５％未満であった。検定内Ｃ
Ｖは低濃度であるほど大きくなったが、それでも５％未
満であった。

【００６４】実施例５．フロースルーセルを用いる希釈
測定 本明細書実施例３のマーク化貯蔵溶液を１：４０００、
１：２０００、および１：１０００に希釈してそれぞれ
１.２５、２.５０、および５.００ｎｇ／ｍｌ抗原の希
釈されたキャリブレーター溶液に対応させた。各濃度
(０.０、１.２５、２.５０、および５.００ｎｇ／ｍｌ)
の５つの試料をバイオラッド・モデルＡＳ-１００ＨＲ
ＬＣ自動サンプリングシステムを用いてＡＢＩ，アナリ
ティカル・クラトス・ディヴィジョン，スペクトロフロ
ー７８３分光測定器に毎分１ｍｌの流速で注入し、それ
ぞれの６２９ｎｍでの吸光度で監視した。

【００６５】このフロースルーセルはヒュレット・パッ
カード(「ＨＰ」)８４５１Ａ分光測定器で行った測定と
比較して貯蔵標準の希釈液についての吸光度測定におい
てより正確であった。検定内ＣＶはすべて０.４％未満
であった。これはＨＰ装置で得られた結果より精度が１
０倍増であることに等しい。ＨＰ系の場合と同様に再度
プロットすると、データは相関係数１の直線であった。
本測定では希釈率の関数としてプロットしたのに対し
て、ＨＰから得たデータでは吸光度をキャリブレーター
(抗原)濃度の関数としてプロットした。

【００６６】実施例６．ｐＨ対ＢＳＡ-マラカイトグリ
ーン複合体に関する吸光度 ＢＳＡ-マラカイトグリーン複合体の吸光度スペクトル
に対するｐＨの効果を６２９ｎｍで監視した。一系列の
ＢＳＡマラカイトグリーン複合体溶液(５.５×１０
^-7Ｍ)をｐＨ３.２、５.２、６.２、７.２、および９.２
に調節した炭酸緩衝液中に調製した。ベックマンＤＵ７
０分光測定器を用いて、各複合体溶液について吸光度ス
ペクトル(２５０ｎｍ〜７００ｎｍ)を監視した。

【００６７】タンパク質複合体に関するスペクトルは３
つの吸光度バンド(２８０、５００、および６２９ｎｍ)
を示した。５００ｎｍと６２９ｎｍのバンドはマラカイ
トグリーンによるものであり、２８０ｎｍのバンドはタ
ンパク質中の芳香族アミノ酸の結果である。この色素は
塩基性条件下(ｐＨ９.２)と比較して酸性条件下(ｐＨ
３.２)で６２９ｎｍでより強く吸収する。ｐＨの効果は
より酸性な溶液でより著しくなる。

【００６８】実施例７．希釈法の確認 上記実施例３で得たマーク化貯蔵キャリブレーター溶液
の一部を上記実施例４.Ａ.で得た規定マトリックスで
１，５０００、１：２０００、１：１０００、および
１：４０００に希釈した。これらの希釈液はそれぞれ
１.０、２.５、５.０、および１２.５ｎｇ／ｍｌのキャ
リブレーターを有する使用液に対応する。各濃度で使用
液を３つに分割した。その１／３を１.５ｍｌ試料に入
れ、後に一系列の対照として使用するために−２０℃で
凍結した。第２の１／３を５℃で暗所に置いた。最後の
１／３を５℃で室内の光のなかに置いた。５℃で保存し
た試料の吸光度を１週間間隔で６２９ｎｍで読み取っ
た。標準曲線(即ち較正曲線)を各週について構築した。
凍結した試料を融解し、１週間間隔で対照として読み取
った。５℃の試料から得た較正曲線を用いて凍結試料中
の仮定的な抗原の濃度を計算した。

【００６９】これらの実験を行った４０日間にわたっ
て、すべての試料(明所および暗所)についての較正曲線
は直線(相関係数１)であった。明所および暗所示数間の
％ＣＶについての変動(０.０１０−１.９００)は週ごと
に変動した。ブランク試料(色素を含まない)で最も高い
％ＣＶ(即ち１.９００)が観測された。これは恐らくＵ
Ｖランプの雑音の結果であろう。データをプロットした
ところ、明所試料と暗所試料が互いから移動していると
いうことを示唆する傾向はグラフには認められない。し
かし変動が一週間内で首尾一貫していることが示唆され
る。

【００７０】較正曲線はその週の実験誤差内で凍結試料
の正しい濃度を一貫して決定することができた。計算し
た値を検定日の関数としてプロットすると、３つのまっ
すぐな水平線が得られた。この３つの線は希釈率を決定
するという色素複合体の能力をグラフ的に確認するもの
である。これらの線が水平であるという事実は５℃の溶
液中で保存された色素が凍結保存された色素と同じであ
ることを示唆している。それぞれの日における示数につ
いての検定内ＣＶはすべて１.２％未満であった。

【００７１】実施例８．一系列の使用キャリブレーター
溶液について希釈率を決定するための方法の提案 上記実施例１の手法を用いて、ＢＳＡ(タンパク質)１分
子あたり５分子のマラカイトグリーン(色素)をカップリ
ングさせる。得られたＢＳＡ-マラカイトグリーン複合
体をＧ-２５セファデックスで実施例２に記述したよう
に精製する。次に、精製したＢＳＡ-マラカイトグリー
ン複合体を既知濃度のキャリブレーターの貯蔵溶液に、
最も高い希釈率で希釈されたキャリブレーター溶液につ
いて０.１吸光度単位の吸光度示数を与えることができ
るマーク化貯蔵溶液を作成するに足る量で加える。ま
た、上に定義した規定マトリックスに複合体化していな
いＢＳＡを上記実施例３に従って加える。次に、製造に
進む前に標準曲線を構築するべく、マーク化貯蔵キャリ
ブレーター溶液の充分量を取り出す。次に、キット・キ
ャリブレーターを規定マトリックス(色素を含まない)で
所望の抗原濃度を得るための製造と同様に希釈する(即
ちＰＳＡに関して２、１０、２５、５０、および１００
ｎｇ／ｍｌ)。次に、希釈したキャリブレーター溶液を
保存(−２０℃)用のバイアルに分注(２ｍｌ)する。これ
らを融解し、必要に応じて読み取ることにより、以降に
製造されるロットを試験するための所望の標準曲線を構
築する。

【００７２】実施例９．不規則なキャリブレーター溶液
の同定と調節 ９.Ａ．５０００ｎｇ／ｍｌのヒト骨アルカリ性ホスフ
ァターゼ抗原を含有するプレ貯蔵溶液の調製 抗原細胞系ＳＡＯＳ-２骨肉腫一次ヒト型(ＡＴＴＣカタ
ログ番号ＨＴＢ８５)を、５ｍｇ／Ｌヒト組換えインス
リン(Nucellin-Na)を添加したＨＰ Ｐｒｏ培地(イルヴ
ィン，カリフォルニア)中で１１日間培養した。１１日
目にその細胞から膜画分を調製し、収集した膜画分のア
ルカリ性ホスファターゼ活性を決定した。アルカリ性ホ
スファターゼ抗原を膜画分から酵素的に、例えばホスホ
リパーゼＣ(Ｂ．セリュウス・カンパニー)の溶液(この
抽出溶液は膜画分のアルカリ性ホスファターゼ活性１０
単位ごとに１単位のホスホリパーゼＣ活性を含む)を用
いてｐＨ７.５で抽出した。抽出物中のヒトアルカリ性
ホスファターゼ抗原の濃度は約１０００００ｎｇ／ｍｌ
であった。定量し精製した抽出物の充分量(即ち体積)
を、その抽出物体積をマークまで希釈したときに５００
０ｎｇ／ｍｌのアルカリ性ホスファターゼ抗原を含有す
る溶液が得られるように、適当な大きさのフラスコに入
れた。未希釈の体積の精製した抽出物を含有するこのフ
ラスコを本明細書ではヒト骨アルカリ性ホスファターゼ
の「プレ貯蔵」溶液と呼ぶ。

【００７３】９.Ｂ．５０００ｎｇ／ｍｌのヒト骨アル
カリ性ホスファターゼ抗原を含有するマーク化貯蔵溶液
の調製 上記実施例９.Ａ.で得たプレ貯蔵溶液に充分量のＢＳＡ
-マラカイトグリーン(実施例２で精製したもの(即ち色
素対タンパク質の比が５：１)など)を加えて、メスフラ
スコ中で実施例４.Ａ.の規定マトリックスでマークまで
希釈した時に６２９ｎｍでほぼ５０吸光度単位の吸光度
を有するマーク化貯蔵キャリブレーター溶液を得た。最
も希釈されたキャリブレーター溶液(１５ｎｇ／ｍｌ)
(即ち１：３３３希釈)が約０.１５吸光度単位の吸光度
を有するように、マーク化貯蔵キャリブレーター溶液の
吸光度を意図的に約５０吸光度単位に設定した。

【００７４】次に、マーク化貯蔵キャリブレーター溶液
を規定マトリックスで希釈して、それぞれ０、１５、３
０、４５、６０および１２０ｎｇ／ｍｌの濃度を有する
一系列の希釈されたキャリブレーター溶液を作成した。
しかし上記系列において、４５ｎｇ／ｍｌキャリブレー
ターを故意に不正に(即ち約１０％高く)作成した。次
に、希釈されたキャリブレーター溶液の吸光度を６２９
ｎｍで測定し、濃度に対してプロットした。正しく調製
されたキャリブレーターは６２９ｎｍでの吸光度対濃度
としてプロットした時に直線的に希釈された。予期され
る吸光度と測定された吸光度の間の相違に基づいて、４
５ｎｇ／ｍｌ較正溶液の一部を規定マトリックスを加え
ることによって調節し、分光測定器で再度読み取った。
すべての希釈されたキャリブレーター溶液を、不正であ
って調節された４５ｎｇ／ｍｌキャリブレーターを含め
て、ハイブリテックのタンデム・オスターゼ(Tandem^ROs
tase^TM)アッセイ(ハイブリテック、カリフォルニア州サ
ンディエゴ)を用いて、骨アルカリ性ホスファターゼ抗
原について分析した。

【００７５】正しく調製されたキャリブレーターは直線
的に希釈された(６２９ｎｍでの吸光度対ヒト骨アルカ
リ性ホスファターゼ・オスターゼ抗原濃度)。対応する
タンデム・オスターゼ検定も直線的に希釈された(毎分
の計数値対オスターゼ抗原濃度)。タンデム・オスター
ゼ検定に関するＣＶは平均して２％〜３％の範囲にわた
り、オスターゼ検定に関してセットされた仕様書内であ
った。不正に調製された４５ｎｇ／ｍｌキャリブレータ
ーに対する規定マトリックスの添加は６２９ｎｍでのキ
ャリブレーターの吸光度を正しい値に調節することがで
きた。タンデム・オスターゼ検定も不正に調製されたキ
ャリブレーターを検出することができた。タンデム・オ
スターゼ検定は不正に調製された４５ｎｇ／ｍｌに対し
てなされた調節をも反映した。タンデム・オスターゼ検
定から得られたキャリブレーター中の抗原の濃度は色素
吸収実験から得られた結果と強く相関した(相関係数＝
０.９９６)。しかし色素データに対してわずかな一定の
偏りがあった。これは恐らく、複合体の添加後に５００
０ｎｇ／ｍｌマ−ク化貯蔵キャリブレーター溶液に割り
当てられた正しくない値の結果であろう。

【００７６】希釈されたキャリブレーター溶液中のマー
カーに伴う物理的変数(例えば吸光度)の測定は正しくお
よび不正に希釈されたキャリブレーター溶液を検出する
ことができた。マーカーは４５ｎｇ／ｍｌキャリブレー
ターの正しい濃度への適切な調節をも検出した。調節に
要する時間はタンデム・オスターゼ検定が必要とするほ
ぼ３日間と比較して極わずかであった。本発明の方法と
タンデム検定から得られた結果の間の強い相関は色素が
オスターゼ検定の実行に対して効果を持たなかったこと
を示唆している。

【００７７】実施例１０．５０００ｎｇ／ｍｌヒトアル
カリ性ホスファターゼ抗原をキャリブレーターとし、Ｂ
-フィコエリトリンをマーカーとして含有するマーク化
貯蔵溶液の調製 １０００ｍｌのメスフラスコに、５０００ｎｇのヒト骨
アルカリ性ホスファターゼ抗原を与えるに足る体積の実
施例９.Ａ.で得た精製した抽出物を加えた。実施例４.
Ａ.で得た規定マトリックスをこのフラスコに加えてそ
の体積をほぼ９００ｍｌマークまで増量した。その内容
物を渦を生じさせることなく撹拌することによって混合
した。次に、このフラスコにＢ-フィコエリトリン(分子
量２４００００ダルトン)(モレキュラー・プローブス，
インコーポレイテッド，オレゴン州ユージン，カタログ
番号Ｐ-８００)２.４ｍｇを加えた。その内容物を泡立
てずに最低１５分間撹拌することによって再度混合し
た。その後、そのフラスコを規定マトリックスで１００
０ｍｌマークまで希釈し、渦を生じさせることなく約１
０分間撹拌した。得られたマーク化貯蔵キャリブレータ
ー溶液は５０００ｎｇ／ｍｌのヒト骨アルカリ性ホスフ
ァターゼ抗原を含有し、Ｂ-フィコエリトリンについて
は１×１０^-8Ｍである。Ｂ-フィコエリトリンは５４５
ｎｍで吸収し、５７５ｎｍで発光する蛍光色素である。

【００７８】実施例１１．Ｂ-フィコエリスリンでマー
クされたヒト骨アルカリ性ホスファターゼ抗原の使用キ
ャリブレーター溶液の調製 実施例１０で得たマーク化貯蔵溶液(５０００ｎｇ／ｍ
ｌのヒト骨アルカリ性ホスファターゼ抗原「ＨＢＡＰＡ
ｇ」に対応する)を実施例４.Ａ.で得た規定マトリック
スで希釈して一系列の希釈されたキャリブレーター溶液
(即ち「使用キャリブレーター溶液」)を調製する。希釈
されたキャリブレーター溶液は１５、３０、４５、６０
および１２０ｎｇ／ｍｌのキャリブレーターＨＢＡＰＡ
ｇを含有する。これらのキャリブレーター濃度を得るた
めに、マーク化貯蔵キャリブレーター溶液を規定マトリ
ックスでそれぞれ１：３３３、１：１６７、１：１１
１、１：８３および１：４１．７に希釈した。規定マト
リックスの一部を０ｎｇ／ｍｌキャリブレーターとして
使用する。

【００７９】実施例１２．５０００ｎｇ／ｍｌの前立腺
特異的抗原をキャリブレーターとし、フェノールフタレ
イン-ＨＳＡ複合体をマーカーとして含有するマーク化
貯蔵キャリブレーター溶液の調製 １２.Ａ．フェノールフタレイン-Ｎ-ヒドロキシ-２-ス
ルホスクシンイミジルエステルの調製 １等量のＮ-ヒドロキシスルホスクシンイミド(ピアス・
ケミカル・カンパニー，イリノイ州ロックフォード)を
乾燥ＤＭＦ中のわずかに過剰量のジシクロヘキシルカル
ボジイミドと共にフェノールフタレインに添加し、終夜
混合することによって標記のフェノールフタレインエス
テルを調製する。その混合物を４℃で３時間冷却して尿
素副生成物を溶液から沈殿させる。その尿素をワットマ
ン＃２濾紙上での濾過によって除去し、濾液を集める。
この濾液に２０体積の酢酸エチルを添加することによっ
てエステルを沈殿させる。フェノールフタレインエステ
ルを集め、窒素下で保存する。(1)Yip,C；Yeung,C.；Mo
ule,M.,J.Biol.Chem.,1978,253(6),1743-5および(2)And
erson,G.；Callahan,F.；Zimmerman,J.,J.Am.Chem.So
c.,1967,89(1)を参照のこと。

【００８０】１２.Ｂ．ヒト血清アルブミン(「ＨＳ
Ａ」)に対するフェノールフタレインの結合 ヒト血清アルブミンを０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.８)
中に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶化する。上記Ｌ(１)で
得たフェノールフタレインスルホスクシンイミジルエス
テル１５倍モル過剰量を上述したヒト血清アルブミン溶
液に穏やかに撹拌しながら加え、３０分間反応させる。
次に、得られた反応混合物を実施例２に記述したように
Ｇ-２５サイズ排除カラムに通し、０.１Ｍリン酸緩衝液
(ｐＨ７.０)で溶出させる。溶出液を２８０ｎｍで監視
する。複合体を含有する最初のピークを集める。溶出液
の一部を塩基性にし、フェノールフタレインの吸光度を
５５０ｎｍで測定する。複合体のフェノールフタレイン
-ＨＳＡ比は上記実施例１に記載の等式を利用して決定
される。フェノールフタレイン-ＨＳＡ複合体ピークの
残りを水に対して４℃で終夜透析(分子量１２０００カ
ットオフ)し、次いで凍結乾燥する。

【００８１】１２.Ｃ．ヒト前立腺特異的抗原のプレ貯
蔵キャリブレーター溶液の調製 ヒト前立腺特異的抗原は約３４０００ダルトンの分子量
を有する一本鎖の糖タンパク質であり、７重量％の炭水
化物を含有している。Wangら,「ヒト前立腺特異的抗原
の精製(原題：Purification of a Human Prostate Spec
ific Antigen)」,Invest.Urol.17:159(1979)。ヒト前立
腺特異的抗原(「ＰＳＡ」)は米国特許第４４４６１２２
(Chu)に開示された方法に従って精製された形態で得ら
れる。Chuに従って、１００００ｎｇ／ｍｌをわずかに
超えるＰＳＡ濃度を有するプレ貯蔵キャリブレーター溶
液が得られるまで精製された抽出物を濃縮する。精製さ
れた抽出物中のＰＳＡの濃度に基づいて、実施例４.Ａ.
などの規定マトリックスで希釈された時に５０００ｎｇ
／ｍｌのＰＳＡ濃度を有する貯蔵キャリブレーター溶液
を与える、メスフラスコに移すべき抽出物の量を計算す
ることができる。精製されたＰＳＡ抽出物の適量を含有
するこの未希釈のメスフラスコをプレ貯蔵溶液と呼ぶ。

【００８２】１２.Ｄ．ＨＳＡ-フェノールフタレイン複
合体をマーカーとし、ＰＳＡをキャリブレーターとして
含有するマーク化貯蔵キャリブレーター溶液の調製 上記実施例１１.Ｃ.で得たプレ貯蔵ＰＳＡキャリブレー
ター溶液に充分量の凍結乾燥したフェノールフタレイン
-ＨＳＡ複合体(上記実施例１１.Ｄ.で調製したものな
ど)と規定マトリックス(実施例４.Ａ.で調製したものな
ど)を加えることにより、５００００ｎｇ／ｍｌのＰＳ
Ａを有し、１.８８５×１０^-3Ｍ ＨＳＡ-フェノールフ
タレイン複合体を含有するマーク化貯蔵キャリブレータ
ー溶液を得る。(ＢＳＡがＨＳＡに置き換えられた規定
マトリックスを希釈に使用することもできる。）上記５
０００ｎｇ／ｍｌマーク化貯蔵キャリブレーター溶液を
希釈することによって調製される２ｎｇ／ｍｌ使用キャ
リブレーターはｐＨ１０の塩基性媒質中で５５０ｎｍで
約０.１吸光度単位の分光器吸光度を有すると予期され
る。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶解された較正物質又はコントロール物
   質（キャリブレーター）を含有する貯蔵溶液が正確に希
   釈されていることを容易に決定するための組成物であっ
   て、 (a) 使用又はコントロール濃度範囲において目的とす
   る分析物の検定の較正に使用するためのキャリブレータ
   ー、及び (b) 該キャリブレーターの使用濃度範囲内において該
   貯蔵溶液の希釈レベルを同定するための、溶解された同
   定有効量のマーカーであって、該目的とする分析物の検
   定において反応体として又は反応体の標識物として関与
   することのないマーカーが溶解された貯蔵溶液からなる
   組成物。
2. 【請求項２】 マーカーが可視スペクトル内の光りを吸
   収する色素又は化合物である請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 マーカーが、ウシ血清アルブミン、ヒト
   血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ヒツジ血清アル
   ブミン、ネズミ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン、
   及びモルモット血清アルブミンの中から選ばれる担体タ
   ンパク質と共有結合している請求項２に記載の組成物。
4. 【請求項４】 色素がマラカイトグリーンであり、色素
   の担体タンパク質に対する比率が約２．８：１から約
   ７：１である請求項３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 一系列のキャリブレーター溶液群の１構
   成部分である試験キットに使用されるキャリブレーター
   溶液であって、該一系列のキャリブレーター溶液群が予
   め規定された範囲のキャリブレーター濃度とそれに相当
   する範囲のマーカー濃度にまたがる個々のキャリブレー
   ター溶液群の多数のものから構成され、該キャリブレー
   ター溶液が前もって規定された濃度のキャリブレーター
   及び同定に有効かつ干渉しない量であって該キャリブレ
   ーター溶液中、該キャリブレーターの濃度に比例する量
   の可視性色素を含有しており、それによって該一系列の
   キャリブレーター溶液群における各溶液がそこに含有さ
   れるキャリブレーターの濃度に比例する色強度を有して
   いる当該キャリブレーター溶液。
6. 【請求項６】 一系列の溶液群が２から１０個のキャリ
   ブレーター溶液を含有し、該溶液中のキャリブレーター
   が較正物質又はコントロール物質として使用されるもの
   であり、溶液中の可視性色素がウシ血清アルブミン、ヒ
   ト血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、ヒツジ血清ア
   ルブミン、ネズミ血清アルブミン、ヤギ血清アルブミン
   及びモルモット血清アルブミンの中から選ばれる担体タ
   ンパク質と共有結合しているマラカイトグリーンであ
   る、試験キットがリガンド又は抗リガンドの分析用であ
   る請求項５に記載のキャリブレーター溶液。
7. 【請求項７】 一系列のキャリブレーター溶液群を使用
   する診断検定を行うための方法であって、 (a) 各キャリブレーター溶液がそこに含有されている
   キャリブレーター物質の濃度に比例して可視性マーカー
   を含有することを特徴とする該一系列の溶液群を、その
   含有されているキャリブレーター物質の濃度に基づいて
   上昇又は下降の順序に並べ、 (b) 上昇又は下降の順序が逆転していないことを確か
   めるため、並べた一系列のキャリブレーター溶液群の発
   色を調べ、キャリブレーター溶液群がピペッティング及
   び／又はサンプリングにとって正しい並びになっている
   ことを保証する工程からなり、 それにより、並べた一系列のキャリブレーター溶液群に
   おける発色の上昇又は下降の逆転が本検定における並び
   の誤りを反映するようにすることを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 較正物質又はコントロール物質（キャリ
   ブレーター）を含有する貯蔵溶液の正確な希釈度を確認
   するための方法であって、 (a) 同定に有効かつ干渉しない量のマーカー及び予め
   規定した量のキャリブレーターを混合し、マーカーの第
   １濃度とキャリブレーターの第２濃度とを有するマーク
   化貯蔵キャリブレーター溶液を調製し、 (b) 該マーク化貯蔵キャリブレーター溶液中のマーカ
   ー濃度とキャリブレーター濃度との比率を計算し、 (c) 該マーク化貯蔵キャリブレーター溶液又はその一
   部を前もって規定した量で希釈し、該比率が実質的に維
   持されている希釈キャリブレーター溶液であって、第１
   の予測物理パラメーターに関係する第１の予測マーカー
   濃度と、さらに第２の予測キャリブレーター濃度とを有
   する該希釈キャリブレーター溶液を調製し、 (d) 該希釈キャリブレーター溶液中のマーカーの実際
   の濃度と比例する該希釈キャリブレーター溶液の実際の
   物理パラメーターを測定し、 (e) 実際の物理パラメーター又はその誘導パラメータ
   ーを、第１の予測物理パラメーター又はその誘導パラメ
   ーターとそれぞれ比較し、当該希釈工程が正確に行われ
   たことを確認する、ことを特徴とする方法。
9. 【請求項９】 貯蔵溶液から希釈された溶液中の較正物
   質又はコントロール物質（キャリブレーター）の濃度を
   確認するための方法であって、 (a) 同定に有効かつ干渉しない量のマーカー及び予め
   規定した量のキャリブレーターを混合し、マーカーの第
   １濃度とキャリブレーターの第２濃度とを有するマーク
   化された貯蔵キャリブレーター溶液を調製し、 (b) 該マーク化された貯蔵キャリブレーター溶液中の
   マーカー濃度とキャリブレーター濃度との比率を計算
   し、 (c) 該マーク化された貯蔵キャリブレーター溶液又は
   その一部を前もって規定した量で希釈し、該比率が実質
   的に維持されている希釈キャリブレーター溶液であっ
   て、第１の予測物理パラメーターに付随する第１の予測
   マーカー濃度と、さらに第２の予測キャリブレーター濃
   度とを有する該希釈キャリブレーター溶液を調製し、 (d) 希釈キャリブレーター溶液中のマーカーの実際の
   濃度と比例する該希釈キャリブレーター溶液の実際の物
   理パラメーターを測定し、そして (e) 実際の物理パラメーターと第１の予測物理パラメ
   ーターとの差異、又はそれらの誘導パラメーター間の差
   異を参照して、希釈キャリブレーター溶液中のキャリブ
   レーターの実際の濃度がその予測濃度と実質的に近似し
   ていることを確認する、ことを特徴とする方法。