JPH06253825A - New yeast and new gene and use thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a new autolytic yeast capable of developing mutation at sites different from those in PKCI or BCKI gene, to identify a gene capable of suppressing such autolysis, to identify a protein coded by the gene, and to provide a method for producing an yeast extract and proteins with the new yeast as raw material. CONSTITUTION:The objective yeast, a thermosensitive autolytic yeast capable of developing mutation, consisting of Saccharomyces cerevisiae FERM P-13410.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【技術分野】本発明は、新規な温度感受性自己溶解性酵
母及びそれに関する新規遺伝子ＮＬＴ２、その遺伝子が
コードする蛋白質およびこの新規酵母を用いた酵母エキ
スと蛋白質類との製法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel temperature-sensitive autolytic yeast, a novel gene NLT2 related thereto, a protein encoded by the gene, and a method for producing a yeast extract and proteins using this novel yeast.

【０００２】[0002]

【従来技術】遺伝子組換え技術を用いた異種蛋白の生産
において、糖鎖の付与あるいは正確な折り畳みが困難で
本来の活性を示さない場合が多いことは良く知られてい
る。特に生産する宿主として原核生物である大腸菌を用
いた場合には、糖鎖付与の機能がなくまた折り畳みも本
来のものと異なり発現した異種蛋白、特に真核生物由来
の蛋白の場合生物活性がないことが多い。この問題を解
決する一つの方法として真核生物である酵母を用いるこ
とが試みられ、Ｂ型肝炎ワクチン製造においては成功し
ている〔パクセ（Ｍ．Ｐａｓｅｋ）ら、ネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ），ｖｏｌ．２８２，ｐ５７５〜，１９７
９〕。また、ダニアレルゲンの一つＤｅｒｆ Ｉの場合
も大腸菌を宿主として生産させた場合は活性型が得られ
なかったが、酵母を宿主とした場合では活性型が得られ
ている〔チュア（Ｋ．Ｙ．Ｃｈｕａ）ら、ジャーナル・
オブ・アラジー・アンド・クリニカル・イムノロジー
（Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ），ｖｏｌ．８９，ｐ９５〜，１９９２〕。前記のよ
うに、酵母を宿主とする有効性が示されたが、酵母を用
いた場合菌体を破砕して目的物質を回収することは容易
でなく種々の工夫が必要であった。その一つの方法は目
的蛋白を菌体外に分泌させるようにジグナルペプチドを
付与する方法が考えられているが、あらゆる蛋白に有効
な方法として確立してはいない。そこで、ある条件下で
溶解する酵母が得られればこの問題が解決すると考えら
れる。細胞周期に関連した研究の結果、レビン（Ｄ．
Ｅ．Ｌｅｖｉｎ）らはプロテインキナーゼ（ＰＫＣ１あ
るいはＢＣＫ１）の変異によって酵母の膨圧に対する耐
性が低下し溶菌することを報告している〔ザ・ジャーナ
ル・オブ・セルビオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．，ｖｏｌ．１１６，ｐ１２２１〜，１９９２）及び
モレキュラ・アンド・セルラー・ビオロジー（Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐ１７２〜，１
９９２）〕。パラビシーニ（Ｇ．Ｐａｒａｖｉｃｉｎ
ｉ）らも同様の報告をしている（モレキュラ・アンド・
セルラー・ビオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，ｖｏｌ．１２，ｐ４８９６〜，１９９２）〕。し
たがって、酵母の自己溶解性を高める一つの方法として
プロテインキナーゼに対する変異あるいは遺伝子破壊が
考えられる。しかしながら、この方法によると、当該酵
素は多くの生体内反応の鍵となる酵素の一つでありここ
へ変異を導入することは多くの酵母内反応に影響する可
能性が高い。さらに、これらのプロテインキナーゼに対
する変異あるいは遺伝子破壊された酵母は、膨圧に対す
る耐性が低下した結果、生育において浸透圧を必要とす
ることが知られており、このような浸透圧を必要とする
ような酵母は培養上不便が多く、好ましい酵母とはいえ
ない。2. Description of the Related Art It is well known that, in the production of heterologous proteins using gene recombination techniques, it is difficult to give sugar chains or fold them correctly, and the original activity is often not exhibited. Especially when Escherichia coli, which is a prokaryote, is used as a host for production, there is no biological activity in the case of a heterologous protein that has no sugar chain-conferring function and is also folded differently from the original one, especially a protein derived from eukaryote Often. As one method for solving this problem, it has been attempted to use yeast, which is a eukaryote, and has been successful in producing a hepatitis B vaccine [M. Pasek et al., Nature (N.
ature), vol. 282, p575-197
9]. Also, in the case of one of the mite allergens, Derf I, an active form was not obtained when E. coli was produced as a host, but an active form was obtained when yeast was used as a host [Chure (KY .Chua) et al., Journal
Of Allergy and Clinical Immunology (J. Allergy Clin. Immuno
l), vol. 89, p95-, 1992]. As described above, the effectiveness of using yeast as a host was shown, but when yeast was used, it was not easy to crush the cells and recover the target substance, and various measures were required. As one of the methods, a method in which a signal peptide is added so that the target protein is secreted outside the bacterium has been considered, but it has not been established as an effective method for all proteins. Therefore, it is considered that this problem will be solved if yeast that can be dissolved under a certain condition is obtained. As a result of studies relating to the cell cycle, Levin (D.
E. Levin et al. Have reported that mutations in protein kinases (PKC1 or BCK1) reduce yeast resistance to turgor pressure and cause lysis [The Journal of Cell Biology (J. Cell Bio
l. , Vol. 116, p1221 to 1992) and Molecular and Cellular Biology (Mol.
Cell. Biol. , Vol. 12, p172-2, 1
992)]. G. Paravicin
i) et al. (Molecular and.
Cellular Biology (Mol. Cell. Bio
l. , Vol. 12, p4896-, 1992)]. Therefore, mutation or gene disruption to protein kinases can be considered as one method for increasing the autolysis of yeast. However, according to this method, the enzyme is one of the key enzymes for many in-vivo reactions, and the introduction of a mutation into this enzyme is likely to affect many yeast reactions. Furthermore, it is known that yeasts mutated or gene-disrupted with respect to these protein kinases require osmotic pressure for growth as a result of reduced resistance to turgor pressure, and it seems that such osmotic pressure is required. Since many yeasts are inconvenient in culture, they cannot be said to be preferable yeasts.

【０００３】[0003]

【目的】そこで、本発明の第一の目的は前記ＰＫＣ１，
ＢＣＫ１遺伝子とは異なる部位に変異をおこさせ、自己
溶解性を示す新規な酵母を提供する点にある。本発明の
第二の目的は、自己溶解性を抑える働きをする遺伝子を
解明する点にある。本発明の第三の目的は、前記遺伝子
がコードする蛋白質を解明する点にある。本発明の第四
の目的は、前記新規酵母を原料とする酵母エキスの製法
を提供する点にある。本発明の第五の目的は、前記新規
酵母を原料とする蛋白質類の製法を提供する点にある。[Object] Therefore, a first object of the present invention is to provide the PKC1,
The point is to mutate at a site different from the BCK1 gene to provide a novel yeast showing autolytic property. The second object of the present invention is to elucidate genes that act to suppress autolysis. The third object of the present invention is to elucidate the protein encoded by the gene. A fourth object of the present invention is to provide a method for producing a yeast extract using the novel yeast as a raw material. A fifth object of the present invention is to provide a method for producing proteins using the novel yeast as a raw material.

【０００４】[0004]

【構成】本発明の第一は、サッカロミセス セレビシエ
のＦＥＲＭ Ｐ−１３４１０よりなる温度感受性自己溶
解変異酵母に関する。この酵母は野生のサッカロミセス
セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）のＹＮＮ２７株を突然変異させ、３７℃で
自己溶解性を示す変異株を選別分離したものであり、こ
のＦＥＲＭ Ｐ−１３４１０酵母は以下ＹＴＳ−１株と
称する。この変異株の取得は以下のようにして行った。
すなわち、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＮ２７株
をエチルメタンスルフォン酸で処理した後、ＹＰＤ寒天
培地（イーストエクストラクト１０ｇ、ペプトン２０
ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リットル）に適宜希釈
して塗布し２５℃で培養した。コロニーが形成された後
にレプリカによって新たなＹＰＤ培地に転写した。コロ
ニーを転写した寒天培地を３７℃で培養し生育してこな
いコロニーを元の寒天培地プレートから選択した。選択
された株を、２５℃で培養した。そして「３７℃で培養
すると生菌数が低下するとともに、培地中へ菌体内酵素
であるアルカリホスファターゼを漏出する」性質を有す
る温度感受性自己溶解酵母ＹＴＳ−１を分離した。親株
であるサッカロミセス・セレビシエＹＮＮ２７及び取得
した変異株ＹＴＳ−１をＹＰＤ培地中で２５℃、２日間
培養した後培養温度を３７℃に上げてさらに２日間培養
を継続した。培養中毎日生菌数を測定したところ、ＹＮ
Ｎ２７では３７℃培養でも菌の増殖が見られるのに対し
ＹＴＳ−１では培養と共に生菌数が減少し３７℃２日間
の培養で元の約１００分の１まで菌数が減少することが
観察された。溶菌しているかどうか判断するために、両
菌株培養液中のアルカリフォスファターゼ活性を測定し
たところ、親株では同酵素の漏出は認められなかったが
変異株ＹＴＳ−１では同酵素活性が認められ溶菌してい
ることが確認された。[Structure] The first aspect of the present invention relates to a temperature-sensitive autolytic mutant yeast comprising FERM P-13410 of Saccharomyces cerevisiae. This yeast is a wild strain of Saccharomyces cerevisiae.
siae) YNN27 strain was mutated and a mutant strain showing autolytic property at 37 ° C. was selected and separated. This FERM P-13410 yeast is hereinafter referred to as YTS-1 strain. The mutant strain was obtained as follows.
That is, Saccharomyces cerevisiae (Saccha
romyces cerevisiae) YNN27 strain was treated with ethyl methane sulfonic acid, and then subjected to YPD agar medium (yeast extract 10 g, peptone 20).
g, glucose 20 g, distilled water 1 liter) was appropriately diluted and applied, followed by culturing at 25 ° C. After colonies were formed, they were transferred to a new YPD medium by replica. The agar medium to which the colonies were transferred was cultured at 37 ° C., and colonies that did not grow were selected from the original agar plate. Selected strains were cultivated at 25 ° C. Then, temperature-sensitive autolytic yeast YTS-1 having the property of "when cultured at 37 ° C, the number of viable cells decreased and alkaline phosphatase which is an intracellular enzyme leaks into the medium" was isolated. The parent strain Saccharomyces cerevisiae YNN27 and the obtained mutant strain YTS-1 were cultivated in YPD medium at 25 ° C for 2 days, then the culturing temperature was raised to 37 ° C, and the culturing was continued for another 2 days. When the viable cell count was measured every day during culture, YN
In N27, bacterial growth was observed even at 37 ° C culture, whereas in YTS-1, it was observed that the viable cell number decreased with culture, and the number of bacterial cells decreased to about one-hundredth of the original level at 37 ° C for 2 days. Was done. In order to determine whether or not the cells were lysed, the alkaline phosphatase activity in both strain cultures was measured, and no leakage of the same enzyme was observed in the parent strain, but in the mutant strain YTS-1, the same enzyme activity was observed and lysis was performed. Was confirmed.

【０００５】本発明の第二は、図１で示される塩基配列
を有する酵母の温度感受性自己溶解変異を抑圧する遺伝
子（以下遺伝子ＮＬＴ２と称する）に関する。この遺伝
子ＮＬＴ２は酵母の温度感受性自己溶解を抑制する性質
を有する遺伝子であって、前記ＹＴＳ−１株（温度感受
性自己溶解変異株）をつぎのような処理をすることによ
り得られたものである。すなわち、先ず任意の温度感受
性自己溶解変異のないサッカロミセス セレビシエの株
の染色体ＤＮＡを遺伝的検出マーカー、例えばウラシル
非要求性とするＵＲＡ遺伝子を有するプラスミドＹＥｐ
２４に組み込むことで構築されたジーンライブラリーを
ＹＴＳ−１株に導入した。導入によって形質転換された
株を遺伝的マーカーによって検出し、ＹＰＤ培地に植え
３７℃で培養し生育してきたコロニーからプラスミドを
抽出した。このプラスミドには、温度感受性自己溶解変
異のない酵母に由来するＤＮＡ断片が挿入されていた。
サブクローニングを行い、制限酵素Ｂｇｌ IIとＢａｍ
Ｈ Ｉで切断されるプラスミドの断片に温度感受性自己
溶解変異を抑圧する活性が見いだされた。この温度感受
性自己溶解を抑圧する遺伝子をＮＬＴ２と命名し、その
塩基配列を調べたところ図１に示す塩基配列を有してい
た。他の遺伝子との相同性、特に溶解性変異に関連して
いることが報告されているプロテインキナーゼとの相同
性を調べた。その結果、ＮＬＴ２はこれまで報告されて
いるどの遺伝子とも相同性が認められず新規な遺伝子で
あった。The second aspect of the present invention relates to a gene (hereinafter referred to as gene NLT2) which suppresses a temperature-sensitive autolytic mutation in yeast having the nucleotide sequence shown in FIG. This gene NLT2 is a gene having a property of suppressing temperature-sensitive autolysis of yeast, and is obtained by treating the YTS-1 strain (temperature-sensitive autolysis mutant) as follows. . That is, first, a plasmid YEp having a URA gene whose chromosomal DNA of a strain of Saccharomyces cerevisiae without any temperature-sensitive autolytic mutation is a genetic detection marker, for example, uracil non-auxotrophic.
The gene library constructed by being incorporated into 24 was introduced into the YTS-1 strain. The strain transformed by the introduction was detected by a genetic marker, and a plasmid was extracted from a colony that had been grown in a YPD medium and cultured at 37 ° C. A DNA fragment derived from yeast having no temperature-sensitive autolytic mutation was inserted into this plasmid.
Subcloning was performed using restriction enzymes Bgl II and Bam.
The activity of suppressing the temperature-sensitive autolytic mutation was found in a fragment of the plasmid that is cleaved with H1. The gene that suppresses this temperature-sensitive autolysis was named NLT2, and its base sequence was examined. As a result, it had the base sequence shown in FIG. We investigated homology with other genes, especially with protein kinases reported to be associated with lytic mutations. As a result, NLT2 was a novel gene with no homology with any of the previously reported genes.

【０００６】本発明の第三は、前記遺伝子ＮＬＴ２がコ
ードする図２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に
関する。決定された塩基配列より予想されるＮＬＴ２遺
伝子がコードするこの蛋白質は、２３０アミノ酸、分子
量２６０００からなるものである。この蛋白質は、酵母
の自己溶解に対して抑制的に働く物質としての利用可能
性がある。The third aspect of the present invention relates to a protein having the amino acid sequence shown in FIG. 2 which is encoded by the gene NLT2. This protein encoded by the NLT2 gene predicted from the determined nucleotide sequence has 230 amino acids and a molecular weight of 26000. This protein may be used as a substance that suppressively acts on yeast autolysis.

【０００７】本発明の第四は、温度感受性自己溶解変異
を抑圧する遺伝子ＮＬＴ２を遺伝子工学的に破壊するこ
とを目的として作成したプラスミドをサッカロミセス
セレビシエ種の酵母に導入することによって遺伝子を改
変した酵母に関する。特に導入する酵母が、前記温度感
受性自己溶解酵母ＹＴＳ−１株である場合、自己溶解性
がさらに高まったＦＥＲＭ Ｐ−１３４１１が得られ
る。遺伝子を改変した温度感受性自己溶解酵母は、以下
のようにして得られる。すなわち、前記の温度感受性自
己溶解変異を抑圧する遺伝子ＮＬＴ２を、制限酵素等の
処理により、その蛋白質をコードする大部分を遺伝的マ
ーカー、たとえば、ウラシル非要求性とする遺伝子ＵＲ
Ａ３を挿入したプラスミドを作成した。このプラスミド
を、前記の温度感受性自己溶解酵母ＹＴＳ−１株に導入
し、遺伝子を改変した温度感受性自己溶解酵母ＦＥＲＭ
Ｐ−１３４１１（以下ＤＬＴ２１株と称す）を造成し
た。このようにして得られた遺伝子を改変した温度感受
性自己溶解酵母は、自己溶解に対し抑制的に作用する遺
伝子ＮＬＴ２が破壊されたので、さらに、自己溶解性が
高まった。A fourth aspect of the present invention is to use a plasmid prepared for the purpose of disrupting the gene NLT2, which suppresses a temperature-sensitive autolytic mutation, by genetic engineering, Saccharomyces.
The present invention relates to a yeast whose gene has been modified by introducing it into yeast of S. cerevisiae. In particular, when the yeast to be introduced is the temperature-sensitive autolytic yeast YTS-1 strain, FERM P-13411 with further enhanced autolytic property is obtained. The gene-modified temperature-sensitive autolytic yeast is obtained as follows. That is, the gene NLT2, which suppresses the temperature-sensitive autolytic mutation, is treated with a restriction enzyme or the like, and most of the protein-encoding gene is a genetic marker, for example, the gene UR that does not require uracil.
A plasmid having A3 inserted was prepared. This plasmid was introduced into the temperature-sensitive autolytic yeast YTS-1 strain, and the gene was modified to produce the temperature-sensitive autolytic yeast FERM.
P-13411 (hereinafter referred to as DLT21 strain) was constructed. In the temperature-sensitive autolytic yeast obtained by modifying the gene thus obtained, the gene NLT2, which acts suppressively against autolysis, was destroyed, so that the autolytic property was further enhanced.

【０００８】本発明の第五は、前記ＹＴＳ−１株又は遺
伝子を改変した温度感受性自己溶解酵母を自己溶解させ
て酵母エキスを製造する方法に関する。前記酵母エキス
は、ＹＴＳ−１株又は遺伝子を改変した温度感受性自己
溶解酵母を培養、集菌、洗浄後、蒸留水に懸濁させ３７
℃以上の温度で１０時間以上放置し、必要に応じて菌体
残渣を除去することにより得られる。A fifth aspect of the present invention relates to a method for producing a yeast extract by autolyzing the YTS-1 strain or a temperature-sensitive autolyzed yeast with a modified gene. The yeast extract is prepared by culturing, collecting and washing a YTS-1 strain or a temperature-sensitive autolytic yeast in which a gene is modified, and suspending it in distilled water.
It can be obtained by leaving it at a temperature of ℃ or more for 10 hours or more, and removing the bacterial cell residue if necessary.

【０００９】本発明の第六は、前記ＹＴＳ−１株又は遺
伝子を改変した温度感受性自己溶解酵母をその菌体内の
蛋白質類が培地中に分泌されるのに適した温度条件で培
養することにより蛋白質類を製造する方法に関する。The sixth aspect of the present invention is to culture the YTS-1 strain or the temperature-sensitive autolysed yeast modified with a gene under a temperature condition suitable for secreting proteins in the cells into the medium. The present invention relates to a method for producing proteins.

【００１０】[0010]

【実施例】【Example】

実施例１（温度感受性自己溶解変異酵母ＹＴＳ−１の取
得） ＹＰＤ培地（イーストエキス１％、ペプトン２％、グル
コース２％）に、サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＮ
２７株を、３０℃で２０時間培養した。１０ｍｌ分の培
養液からの洗浄菌体を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
７．１）で２ｍｌに懸濁し、ＥＭＳ（エチルメタンスル
フォン酸）７０μｌ加え、３０℃で、４５分変異処理し
た。集菌後、５％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、更に減
菌水で２回洗浄した。洗浄菌体をＹＰＤ寒天培地に撤
き、２５℃で３−５日培養し、コロニーが形成された後
に、レプリカによって新たなＹＰＤ培地に転写した。コ
ロニーを転写した寒天培地を３７℃で２−３日培養し、
生育してこないコロニーを温度感受性株として元の寒天
培地より選択した。さらに、選択された温度感受性株の
温度感受性の自己溶解を調べるため、酵母の液胞に局在
しているアルカリホスファターゼの３７℃での培地への
漏出を寒天培地上で調べた。選択された菌株をＹＰＤ寒
天培地に植え、２５℃２日培養した後、３７℃で１日培
養した。この寒天培地を、ｐ−ニトロフェニルリン酸を
含む軟寒天〔１０ｍＭｐ−ニトロフェニルリン酸、０．
０５Ｍグリシンバッファー（ｐＨ９．７）、０．５％寒
天〕を重層し、３７℃１時間保温した。保温後、黄色の
ハローをつくるコロニーを元の寒天培地より選択し、温
度感受性自己溶解酵母ＹＴＳ−１を分離した。親株であ
るサッカロマイセス・セレビシエＹＮＮ２７及び取得し
た変異株ＹＴＳ−１をＹＰＤ培地で２５℃、２日間培養
した後、培養温度を３７℃に上げた。ＹＮＮ２７では正
常に増殖を続けたのに対し、ＹＴＳ−１は温度シフト
後、直ちに増殖を停止し、次第に生菌数の低下を認め
た。温度シフト後２日後に、ＹＴＳ−１の生菌数は約１
／１００まで低下した。この対比データは、図３に示す
とおりである。Example 1 (Acquisition of temperature-sensitive autolytic mutant yeast YTS-1) YPD medium (1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose) was added to Saccharomyces cerevisiae (Sac).
charomyces cerevisiae) YNN
27 strains were cultured at 30 ° C. for 20 hours. Washed cells from 10 ml of culture solution were washed with 0.1 M phosphate buffer (pH
7.1) was suspended in 2 ml, 70 μl of EMS (ethyl methanesulfonic acid) was added, and mutagenized at 30 ° C. for 45 minutes. After collecting the cells, the cells were washed with 5% sodium thiosulfate, and further washed twice with sterile water. The washed cells were removed from the YPD agar medium, cultured at 25 ° C for 3 to 5 days, and after colonies were formed, they were transferred to a new YPD medium by a replica. The agar medium on which the colonies were transferred was cultured at 37 ° C for 2-3 days,
Colonies that did not grow were selected from the original agar medium as temperature-sensitive strains. Furthermore, in order to investigate the temperature-sensitive autolysis of selected temperature-sensitive strains, the leakage of alkaline phosphatase localized in yeast vacuoles into the medium at 37 ° C was examined on agar medium. The selected strain was planted in a YPD agar medium and cultured at 25 ° C for 2 days and then at 37 ° C for 1 day. This agar medium was mixed with soft agar containing p-nitrophenyl phosphate [10 mM p-nitrophenyl phosphate, 0.
05M glycine buffer (pH 9.7), 0.5% agar] was overlaid and incubated at 37 ° C for 1 hour. After incubation, colonies forming yellow halos were selected from the original agar medium, and temperature-sensitive autolytic yeast YTS-1 was isolated. The parent strain Saccharomyces cerevisiae YNN27 and the obtained mutant strain YTS-1 were cultured in a YPD medium at 25 ° C for 2 days, and then the culture temperature was raised to 37 ° C. While YNN27 continued to grow normally, YTS-1 stopped growing immediately after the temperature shift, and gradually decreased the viable cell count. Two days after the temperature shift, the viable count of YTS-1 was about 1.
It fell to / 100. This comparison data is as shown in FIG.

【００１１】実施例２（自己溶解に関与する遺伝子ＮＴ
Ｌ２のクローニング） 得られた温度感受性自己溶解変異株ＹＴＳ−１を用い
て、自己溶解に関与する遺伝子のクローニングをおこな
った。サッカロマイセス・セレビシエＸ−２１８０の染
色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ−１で部分分解した断片を、ウ
ラシル非要求性とする遺伝子ＵＲＡ３を含むプラスミド
ＹＥｐ２４のＢａｍＨ Ｉ部位に挿入することで作成さ
れた遺伝子ライブラリーをＹＴＳ−１に挿入した。ウラ
シル非要求性で選択された形質転換株を、ＹＰＤ培地に
植え換え、３７℃で培養し生育してきたコロニーよりプ
ラスミドｐＳＬＹ−１２を抽出した。このプラスミドｐ
ＳＬＹ−１２のサブクローニングの結果は図４及び図５
に示した。制限酵素Ｂｇｌ IIとＢａｍＨ Ｉで切断され
る２．１ｋｂｐの断片にＹＴＳ−１の温度感受性を抑圧
する遺伝子が存在することが分かった。この遺伝子をＮ
ＬＴ２と命名し、そのＤＮＡ塩基配列を決定した。決定
した塩基配列は図１に示した。この遺伝子は、報告され
ている他の遺伝子あるいは、その変異が自己溶解性を示
す酵母のＰＫＣ１，ＢＣＫ１との相同性は全くなかっ
た。以上の結果より、今回クローニングされたＮＴＬ２
遺伝子は、これまで報告されているどの遺伝子とも異な
る全く新規な遺伝子であった。Example 2 (NT, a gene involved in autolysis)
Cloning of L2) A gene involved in autolysis was cloned using the obtained temperature-sensitive autolysis mutant strain YTS-1. A gene library prepared by inserting a fragment obtained by partially digesting the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae X-2180 with Sau3A-1 into the BamHI site of the plasmid YEp24 containing the gene URA3 that does not require uracil, YTS-. Inserted in 1. The transformant selected without uracil requirement was replaced with YPD medium, and plasmid pSLY-12 was extracted from the colonies grown by culturing at 37 ° C. This plasmid p
The results of the subcloning of SLY-12 are shown in FIG. 4 and FIG.
It was shown to. It was found that a 2.1 kbp fragment cleaved by the restriction enzymes BglII and BamHI contains a gene that suppresses YTS-1 temperature sensitivity. This gene is N
It was named LT2 and its DNA base sequence was determined. The determined nucleotide sequence is shown in FIG. This gene had no homology with any of the other reported genes or yeast PKC1 and BCK1 whose mutation shows autolysis. From the above results, NTL2 cloned this time
The gene was a completely novel gene that was different from any of the genes reported so far.

【００１２】実施例３（ＮＬＴ２遺伝子破壊株ＤＬＴ２
１の造成） 酵母自己溶解に関与する遺伝子ＮＬＴ２の遺伝子破壊用
プラスミドｐＤＮＬＴ２は、図６に示すように作成し
た。プラスミドｐＵＣ１１９（図６のｂ）の制限酵素Ｂ
ａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ切断断片に、プラスミドｐＳＬＹ
−１２（図６のｃ）のＢｇｌ II、Ｓａｌ Ｉで切断され
たＮＬＴ２遺伝子を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメ
ントを挿入したプラスミドｐＳＬ１２−ＢＳｌ（図６の
ｅ）を作成した。作成されたｐＳＬ１２−ＢＳｌより、
ＮＬＴ２遺伝子を含むＥｃｏＲＰＩ、Ｈｉｎｄ III Ｄ
ＮＡフラグメント８００ｂｐを切り出し、プラスミドｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ III 切断断片に
挿入し、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴ２（図６のｄ）を作
成した。ｐＢＲ−ＮＬＴ２に挿入されたＮＬＴ２遺伝子
は、図１０でＣからＤまでを含む部分で蛋白質をコード
しない部分である。プラスミドｐＢＳΔ３５(図６のｆ)
は、ｐＳＬ１２−ＢＳｌ(図６のｅ)を制限酵素Ｓａｃ
Ｉ、Ｓｍａ Ｉで切断した後、核酸分解酵素Ｅｘｏ III
で消化し、核酸分解酵素Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅ
ａｓｅで処理、核酸合成酵素Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍ
ｅｎｔで平滑化した後、ライゲーションし、作成された
ものである。ｐＢＳΔ３５(図６のｆ)に挿入されたＮＬ
Ｔ２遺伝子は、図１０でＥからＦまで含む部分である。
プラスミドｐＢＳΔ３５(図６のｆ)のＥｃｏＲ Ｉ部位
を、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる処理の後、核酸合成酵
素Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑化し、オリゴヌクレ
オチド断片Ｈｉｎｄ IIIリンカーを付着させ、プラスミ
ドｐＢＳΔ３５−Ｈｌ(図６のｈ)を作成した。作成した
プラスミドｐＢＳΔ３５−Ｈｌ(図６のｈ)より、制限酵
素Ｈｉｎｄ III、ＢａｍＨ Ｉで処理し、ＮＬＴ２遺伝
子の一部を含むＨｉｎｄ III−ＢａｍＨ Ｉ ＤＮＡフ
ラグメント５００ｂｐを、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴ２
(図６のｄ)のＨｉｎｄ III、ＢａｍＨ Ｉ切断断片に挿
入し、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴＤ２(図６のｇ)を作成
した。さらに、ｐＢＲ−ＮＬＴＤ２(図６のｇ)のＨｉｎ
ｄ III部位に、プラスミドＹＥｐ２４(図６のｇ)を制限
酵素Ｈｉｎｄ IIIで処理して得た酵母サッカロミセス・
セレビシエのＵＲＡ３遺伝子を含む１．１ｋｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを挿入し、プラスミドｐＤＮＬＴ２(図
６のｉ)を作成した。作成されたプラスミドｐＤＮＬＴ
２(図６のｉ)は、プラスミドｐＢＲ３２２(図６のａ)を
基礎とし、ＮＬＴ２遺伝子の図１０に示すＥからＦまで
の部分とＣからＤまでの部分を含み、ＦからＣまでの間
にサッカロミセス・セレビシエのＵＲＡ３遺伝子が挿入
されたものである。このプラスミドｐＤＮＬＴ２(図６
のｉ)のＮＬＴ２遺伝子を含むＸｈｏＩ、Ｐｖｕ II Ｄ
ＮＡフラグメント約２．４ｋｂｐを、温度感受性自己溶
解変異酵母であるＹＴＳ−１に導入し、ＤＬＴ２１株を
造成した。造成された酵母ＤＬＴ２１は、図５で示すよ
うに、ＮＬＴ２遺伝子が破壊され、ＮＬＴ２遺伝子がコ
ードする蛋白質が産生できなくなったことが予想される
ものである。ＤＬＴ２１株のＮＬＴ２遺伝子破壊は、図
７に示すサザンハイブリダイゼーションの結果より明ら
かである。サザンハイブリダイゼーションは、ＮＬＴ２
遺伝子内のＸｈｏ Ｉ、Ｐｖｕ II部位をプローブとし、
各酵母より抽出された染色体ＤＮＡをＸｈｏ Ｉ、Ｐｖ
ｕIIで処理し行った。造成されたＮＬＴ２遺伝子破壊酵
母ＤＬＴ２１及び親株であり温度感受性自己溶解変異酵
母であるＹＴＳ−１の３７℃に温度シフト後の生菌数の
変化を図８に示した。ＤＬＴ２１は、ＹＴＳ−１に較べ
て３７℃に温度シフト後の生菌数の低下がより著しかっ
た。Example 3 (NLT2 gene disrupted strain DLT2
Construction of 1) A plasmid pDNLT2 for gene disruption of the gene NLT2 involved in yeast autolysis was prepared as shown in FIG. Restriction enzyme B of plasmid pUC119 (FIG. 6b)
The plasmid pSLY was digested with the amHI and Sal I fragments.
A plasmid pSL12-BS1 (e in FIG. 6) was prepared by inserting a 2.2 kbp DNA fragment containing the NLT2 gene cleaved with -12 (FIG. 6c) BglII and SalI. From the created pSL12-BSl,
EcoRPI, Hind III D containing NLT2 gene
The NA fragment 800 bp was cut out to obtain plasmid p
The plasmid pBR-NLT2 (d in FIG. 6) was prepared by inserting it into the EcoR I and Hind III digestion fragments of BR322. The NLT2 gene inserted into pBR-NLT2 is a portion that includes C to D in FIG. 10 and does not encode a protein. Plasmid pBSΔ35 (f in FIG. 6)
Is the restriction enzyme Sac for the pSL12-BS1 (e in FIG. 6).
Nucleolytic enzyme Exo III after cleavage with I and Sma I
Digested with Nucleolytic enzyme Mung Bean Nucle
Nuclease synthase Klenow Fragm
It is created by smoothing with ent and then ligating. NL inserted in pBSΔ35 (f in FIG. 6)
The T2 gene is a portion including E to F in FIG.
The EcoR I site of the plasmid pBSΔ35 (f in FIG. 6) was treated with a restriction enzyme EcoR I, blunted with a nucleic acid synthesizing enzyme T4 DNA polymerase, and an oligonucleotide fragment HindIII linker was attached to the plasmid pBSΔ35-Hl (FIG. 6). H) was created. The prepared plasmid pBSΔ35-Hl (h in FIG. 6) was treated with restriction enzymes HindIII and BamHI, and a HindIII-BamHI DNA fragment 500 bp containing a part of the NLT2 gene was added to the plasmid pBR-NLT2.
(FIG. 6d) was inserted into the HindIII and BamHI cleavage fragments to construct plasmid pBR-NLTD2 (FIG. 6g). Furthermore, Hin of pBR-NLTD2 (g in FIG. 6) was used.
The yeast Saccharomyces obtained by treating the plasmid YEp24 (g in FIG. 6) with the restriction enzyme HindIII at the dIII site.
1.1 kbp DN containing URA3 gene of S. cerevisiae
The A fragment was inserted to create the plasmid pDNLT2 (i in FIG. 6). Constructed plasmid pDNLT
2 (i in FIG. 6) is based on the plasmid pBR322 (a in FIG. 6) and contains the portion from E to F and the portion from C to D of the NLT2 gene shown in FIG. The URA3 gene of Saccharomyces cerevisiae has been inserted into. This plasmid pDNLT2 (Fig. 6)
I) XhoI, Pvu II D containing the NLT2 gene
About 2.4 kbp of NA fragment was introduced into YTS-1 which is a temperature-sensitive autolytic mutant yeast to construct DLT21 strain. In the constructed yeast DLT21, as shown in FIG. 5, it is expected that the NLT2 gene was disrupted and the protein encoded by the NLT2 gene could not be produced. The NLT2 gene disruption in the DLT21 strain is clear from the results of Southern hybridization shown in FIG. Southern hybridization is NLT2
Using the Xho I and Pvu II sites in the gene as probes,
The chromosomal DNA extracted from each yeast was Xho I, Pv
Treated with uII. Changes in the viable cell count of the constructed NLT2 gene-disrupted yeast DLT21 and the parent strain and temperature-sensitive autolytic mutant yeast YTS-1 after the temperature shift to 37 ° C. are shown in FIG. Compared to YTS-1, DLT21 showed a more remarkable decrease in the viable cell count after the temperature shift to 37 ° C.

【００１３】実施例４（温度感受性変異酵母ＹＴＳ−１
を用いた酵母エキス製造法） 得られた温度感受性自己溶解性変異株の実用上の利点を
実証するために、親株とＹＴＳ−１株を用いて酵母エキ
ス製造を行った。現行の酵母エキス製造法に準拠して実
施し両株での抽出率を評価した。親株であるＹＮＮ２７
あるいは、変異株であるＹＴＳ−１を２５℃で２日間培
養した後、集菌洗浄後、蒸留水に懸濁、５２℃で１８時
間放置した。その後、遠心分離を行い菌体残渣を除去
し、酵母エキスとした。エキス抽出率は、中西らの方法
（特願平１−２４９５０２）に従った。親株であるＹＮ
Ｎ２７の抽出率が２５．７％であったの対し変異株ＹＴ
Ｓ−１では３３．３％の抽出率であった。ＹＴＳ−１株
では約３０％弱の抽出率の向上が認められ本菌が酵母エ
キス製造に有用であることが明かとなった。Example 4 (temperature-sensitive mutant yeast YTS-1
In order to demonstrate the practical advantage of the obtained temperature-sensitive autolytic mutant strain, yeast extract was produced using the parent strain and YTS-1 strain. The extraction rate of both strains was evaluated according to the current yeast extract production method. YNN27, the parent strain
Alternatively, YTS-1, which is a mutant strain, was cultured at 25 ° C. for 2 days, washed with bacteria, suspended in distilled water, and allowed to stand at 52 ° C. for 18 hours. Then, centrifugation was performed to remove the bacterial cell residue to obtain a yeast extract. The extract extraction rate was in accordance with the method of Nakanishi et al. (Japanese Patent Application No. 1-249502). YN, the parent stock
Mutant strain YT for which the extraction rate of N27 was 25.7%
The extraction rate of S-1 was 33.3%. With the YTS-1 strain, an improvement in the extraction rate of about 30% was recognized, which revealed that the bacterium is useful for yeast extract production.

【００１４】実施例５（温度感受性変異酵母ＹＴＳ−１
のＮＬＴ２遺伝子破壊酵母であるＤＬＴ２１を用いた酵
母エキス製造法） 温度感受性自己溶解変異株であるＹＴＳ−１のＮＬＴ２
遺伝子破壊株であるＤＬＴ２１を２５℃で２日間培養し
た後、集菌洗浄し、蒸留水に懸濁、５２℃で１８時間放
置した。その後、遠心分離を行い菌体残渣を除去し、酵
母エキスとした。対照としては、変異株ＹＴＳ−１の親
株であるＹＮＮ２７株とＹＴＳ−１株を用いた。エキス
抽出率は、中西らの方法（特願平１−２４９５０２号）
にしたがって求めた。対照であるＹＮＮ２７の抽出率は
２５．７％であったのに対し、変異株ＹＴＳ−１の抽出
率は３３．３％、ＮＬＴ２遺伝子破壊株ＤＬＴ２１の抽
出率は３２．３％であり、ＤＬＴ２１はＹＮＮ２７に対
し約３０％弱の抽出率の向上が認められ、また、ＹＴＳ
−１に対しては、ほぼ同等の抽出率であった。Example 5 (Temperature-sensitive mutant yeast YTS-1
Yeast extract production method using DLT21 which is the NLT2 gene disrupted yeast of YTS-1 NLT2 which is a temperature-sensitive autolytic mutant
After culturing the gene-disrupted strain DLT21 at 25 ° C. for 2 days, the bacteria were collected and washed, suspended in distilled water and left at 52 ° C. for 18 hours. Then, centrifugation was performed to remove the bacterial cell residue to obtain a yeast extract. As a control, YNN27 strain and YTS-1 strain, which are parent strains of mutant strain YTS-1, were used. Extract extraction rate is the method of Nakanishi et al. (Japanese Patent Application No. 1-249502).
Sought according to. The extraction rate of the control YNN27 was 25.7%, whereas the extraction rate of the mutant strain YTS-1 was 33.3% and the extraction rate of the NLT2 gene disrupted strain DLT21 was 32.3%. Has been found to have an improvement in extraction rate of approximately 30% over YNN27.
With respect to -1, the extraction rate was almost the same.

【００１５】実施例６（変異株ＹＴＳ−１を用いた菌体
内蛋白質の分泌生産） 親株であるＹＮＮ２７あるいは、温度感受性自己溶解変
異株であるＹＴＳ−１を２５℃で２日間培養した後、３
７℃へ温度を上昇させ、２日間培養し、各時間で培地を
採取、遠心分離した後、菌体内、培養上清のアルカリホ
スファターゼの活性を測定した。酵母懸濁液中の酵素活
性はシャー（Ａ．Ｓｃｈｕｒｒ）及びヤジル（Ｅ．Ｙａ
ｇｉｌ）の方法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミク
ロビオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉ−ｃｒｏｂｉｏ
ｌ．），６５，２９１，１９７１〕で測定した。その結
果は、図９に示した。ＹＴＳ−１株の場合は、培養上清
のアルカリホスファターゼ活性は徐々に上昇するのに対
し、菌体内の活性は徐々に低下した。３７℃に温度シフ
ト後、４８時間後にアルカリホスファターゼの全活性の
９０％は培地中に漏出され、約２８ｕ／ｍｌの活性が認
められた。一方、親株では同酵素の活性を検出できなか
った。以上より、変異株ＹＴＳ−１は、温度シフトさせ
ることにより菌体内蛋白質を培地中に分泌することが可
能であることがわかった。Example 6 Secretory Production of Intracellular Protein Using Mutant YTS-1 Parent strain YNN27 or temperature-sensitive autolytic mutant YTS-1 was cultured at 25 ° C. for 2 days, and then 3
The temperature was raised to 7 ° C., the cells were cultured for 2 days, the medium was collected at each time and centrifuged, and then the activity of alkaline phosphatase in the cells and the culture supernatant was measured. The enzyme activity in the yeast suspension was determined by A. Schurr and Y.
Gil [Method of Journal of General Microbiology (J. Gen. Mi-crobio
l. ), 65, 291, 1971]. The results are shown in Fig. 9. In the case of the YTS-1 strain, the alkaline phosphatase activity in the culture supernatant gradually increased, while the intracellular activity gradually decreased. After 48 hours after the temperature shift to 37 ° C., 90% of the total activity of alkaline phosphatase was leaked into the medium, and an activity of about 28 u / ml was observed. On the other hand, the activity of the same enzyme could not be detected in the parent strain. From the above, it was found that the mutant strain YTS-1 can secrete intracellular protein into the medium by shifting the temperature.

【００１６】[0016]

【効果】本発明により、調味料などとして有用な酵母エ
キスや蛋白質類の生産に有利な性質である自己溶解性の
高い新規酵母を提供することができた。また、この研究
のさい、自己溶解性を抑制する性質を与える遺伝子およ
びそれがコードする蛋白質を確認することができたの
で、自己溶解性をもつと不都合なケースにおいて、この
遺伝子を組み込む手法が可能となった。[Effect] According to the present invention, it is possible to provide a novel yeast having a high self-solubility, which is a property advantageous for the production of yeast extracts and proteins useful as seasonings and the like. In addition, during this study, we were able to confirm the gene that gives the property of suppressing autolysis and the protein that it encodes.Therefore, in cases where autolysis is inconvenient, a method for incorporating this gene is possible. Became.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明の遺伝子ＮＬＴ２の塩基配列を示す。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the gene NLT2 of the present invention.

【図２】本発明の遺伝子ＮＬＴ２がコードする蛋白質の
アミノ酸配列を示す。FIG. 2 shows the amino acid sequence of the protein encoded by the gene NLT2 of the present invention.

【図３】本発明の温度感受性自己溶解変異酵母ＹＴＳ−
１株とその親株ＹＮＮ２７株の２５℃における生菌数の
変化と、３７℃に温度シフトしたときの生菌数の変化と
の対比を示すグラフである。横軸は時間、縦軸は生菌数
の対数表示である。FIG. 3: Temperature-sensitive autolytic mutant yeast YTS- of the present invention
It is a graph which shows the change of the viable cell count in 25 degreeC of 1 strain and its parent strain YNN27 strain, and the change of the viable cell number when a temperature shift is carried out at 37 degreeC. The horizontal axis is time, and the vertical axis is the logarithmic display of the viable cell count.

【図４】クローニングされた本発明の遺伝子ＮＬＴ２の
サブクローニング過程でのプラスミドの作成過程を示
す。FIG. 4 shows a process of constructing a plasmid in the subcloning process of the cloned gene NLT2 of the present invention.

【図５】図４で作成された各プラスミドを本発明のＹＴ
Ｓ−１株に導入した際の３７℃に温度シフトした後の時
間に対する生菌数の変化を示す。FIG. 5 shows YT of the present invention in which each plasmid prepared in FIG.
The change of the viable cell number with respect to time after temperature-shifting to 37 degreeC when introduce | transducing into S-1 strain is shown.

【図６】実施例３における本発明酵母の製造工程例を示
す。FIG. 6 shows an example of steps for producing the yeast of the present invention in Example 3.

【図７】ＮＬＴ２遺伝子が破壊されているＤＬＴ２１株
の対応遺伝子とＮＬＴ２遺伝子のそれぞれの構造を証明
するためのサザンハイブリダイゼーションの結果を示
す。FIG. 7 shows the results of Southern hybridization to prove the respective structures of the corresponding gene of the DLT21 strain in which the NLT2 gene is disrupted and the NLT2 gene.

【図８】酵母ＹＴＳ−１と酵母ＤＬＴ２１の３７℃にお
ける生菌数の変化を示す。横軸は時間、縦軸は生菌数の
対数表示である。FIG. 8 shows changes in the viable cell count of yeast YTS-1 and yeast DLT21 at 37 ° C. The horizontal axis is time, and the vertical axis is logarithmic display of viable cell count.

【図９】本発明の自己溶解性酵母ＹＴＳ−１株の３７℃
温度シフト後の細胞内および培地中のアルカリホスファ
ターゼの活性を培地１ｍｌ当りで示したものである。FIG. 9: 37 ° C. of the autolytic yeast YTS-1 strain of the present invention
The activity of alkaline phosphatase in cells and in the medium after temperature shift is shown per 1 ml of the medium.

【図１０】図１の遺伝子ＮＬＴ２の塩基配列に実施例３
の説明のための符号を付加した図である。FIG. 10 shows the nucleotide sequence of the gene NLT2 of FIG.
It is the figure which added the code | symbol for description.

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成６年４月４日[Submission date] April 4, 1994

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】請求項５[Name of item to be corrected] Claim 5

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０００４[Correction target item name] 0004

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【０００４】[0004]

【構成】本発明の第一は、サッカロミセス セレビシエ
のＦＥＲＭ Ｐ−１３４１０よりなる温度感受性自己溶
解変異酵母に関する。この酵母は野生型のサッカロミセ
ス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）のＹＮＮ２７株を突然変異させ、３７
℃で自己溶解性を示す変異株を選別分離したものであ
り、このＦＥＲＭ Ｐ−１３４１０酵母は以下ＹＴＳ−
１株と称する。この変異株の取得は以下のようにして行
った。すなわち、サッカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＮ
２７株をエチルメタンスルフォン酸で処理した後、ＹＰ
Ｄ寒天培地（イーストエクストラクト１０ｇ、ペプトン
２０ｇ、グルコース２０ｇ、蒸留水１リットル）に適宜
希釈して塗布し２５℃で培養した。コロニーが形成され
た後にレプリカによって新たなＹＰＤ培地に転写した。
コロニーを転写した寒天培地を３７℃で培養し生育して
こないコロニーを元の寒天培地プレートから選択した。
選択された株を、２５℃で培養した。そして「３７℃で
培養すると生菌数が低下するとともに、培地中へ菌体内
酵素であるアルカリホスファターゼを漏出する」性質を
有する温度感受性自己溶解酵母ＹＴＳ−１を分離した。
親株であるサッカロミセス・セレビシエＹＮＮ２７及び
取得した変異株ＹＴＳ−１をＹＰＤ培地中で２５℃、２
日間培養した後培養温度を３７℃に上げてさらに２日間
培養を継続した。培養中毎日生菌数を測定したところ、
ＹＮＮ２７では３７℃培養でも菌の増殖が見られるのに
対しＹＴＳ−１では培養と共に生菌数が減少し３７℃２
日間の培養で元の約１００分の１まで菌数が減少するこ
とが観察された。溶菌しているかどうか判断するため
に、両菌株培養液中のアルカリフォスファターゼ活性を
測定したところ、親株では同酵素の漏出は認められなか
ったが変異株ＹＴＳ−１では同酵素活性が認められ溶菌
していることが確認された。[Structure] The first aspect of the present invention relates to a temperature-sensitive autolytic mutant yeast comprising FERM P-13410 of Saccharomyces cerevisiae. This yeast is a wild-type Saccharomyces cerevisiae.
Evisiae) YNN27 strain was mutated to 37
The mutant strain exhibiting autolytic property at ℃ was selected and separated. This FERM P-13410 yeast is referred to as YTS-
Called 1 share. The mutant strain was obtained as follows. That is, Saccharomyces cerevisiae (Sac
charomyces cerevisiae) YNN
After treating 27 strains with ethyl methane sulfonic acid, YP
D agar medium (10 g of yeast extract, 20 g of peptone, 20 g of glucose, 1 liter of distilled water) was appropriately diluted and applied, and cultured at 25 ° C. After colonies were formed, they were transferred to a new YPD medium by replica.
The agar medium to which the colonies were transferred was cultured at 37 ° C., and colonies that did not grow were selected from the original agar plate.
Selected strains were cultivated at 25 ° C. Then, temperature-sensitive autolytic yeast YTS-1 having the property of "when cultured at 37 ° C, the number of viable cells decreased and alkaline phosphatase which is an intracellular enzyme leaks into the medium" was isolated.
The parent strain Saccharomyces cerevisiae YNN27 and the obtained mutant strain YTS-1 were treated in a YPD medium at 25 ° C. for 2
After culturing for one day, the culturing temperature was raised to 37 ° C. and the culturing was continued for another two days. When the number of viable bacteria was measured every day during the culture,
In YNN27, bacterial growth was observed even at 37 ° C., whereas in YTS-1, the viable cell count decreased with cultivation and 37 ° C.
It was observed that the number of bacteria was reduced to about 1/100 of the original amount by culturing for one day. In order to determine whether or not the cells were lysed, the alkaline phosphatase activity in both strain cultures was measured, and no leakage of the same enzyme was observed in the parent strain, but in the mutant strain YTS-1, the same enzyme activity was observed and lysis was performed. Was confirmed.

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０００５[Name of item to be corrected] 0005

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【０００５】本発明の第二は、図１で示される塩基配列
を有する酵母の温度感受性自己溶解変異を抑圧する遺伝
子（以下遺伝子ＮＬＴ２と称する）に関する。この遺伝
子ＮＬＴ２は酵母の温度感受性自己溶解を抑制する性質
を有する遺伝子であって、前記ＹＴＳ−１株（温度感受
性自己溶解変異株）をつぎのような処理をすることによ
り得られたものである。すなわち、先ず任意の温度感受
性自己溶解変異のないサッカロミセス セレビシエの株
の染色体ＤＮＡを遺伝的検出マーカー、例えばウラシル
非要求性とするＵＲＡ３遺伝子を有するプラスミドＹＥ
ｐ２４に組み込むことで構築されたジーンライブラリー
をＹＴＳ−１株に導入した。導入によって形質転換され
た株を遺伝的マーカーによって検出し、ＹＰＤ培地に植
え３７℃で培養し生育してきたコロニーからプラスミド
を抽出した。このプラスミドには、温度感受性自己溶解
変異のない酵母に由来するＤＮＡ断片が挿入されてい
た。サブクローニングを行い、制限酵素Ｂｇｌ IIとＢ
ａｍＨ Ｉで切断されるプラスミドの断片に温度感受性
自己溶解変異を抑圧する活性が見いだされた。この温度
感受性自己溶解を抑圧する遺伝子をＮＬＴ２と命名し、
その塩基配列を調べたところ図１に示す塩基配列を有し
ていた。他の遺伝子との相同性、特に溶解性変異に関連
していることが報告されているプロテインキナーゼとの
相同性を調べた。その結果、ＮＬＴ２はこれまで報告さ
れているどの遺伝子とも相同性が認められず新規な遺伝
子であった。The second aspect of the present invention relates to a gene (hereinafter referred to as gene NLT2) which suppresses a temperature-sensitive autolytic mutation in yeast having the nucleotide sequence shown in FIG. This gene NLT2 is a gene having a property of suppressing temperature-sensitive autolysis of yeast, and is obtained by treating the YTS-1 strain (temperature-sensitive autolysis mutant) as follows. . That is, first, a plasmid YE having a URA3 gene that makes chromosomal DNA of a strain of Saccharomyces cerevisiae without any temperature-sensitive autolytic mutation a genetic detection marker, for example, uracil non-auxotrophic
The gene library constructed by incorporating it into p24 was introduced into the YTS-1 strain. The strain transformed by the introduction was detected by a genetic marker, and a plasmid was extracted from a colony that had been grown in a YPD medium and cultured at 37 ° C. A DNA fragment derived from yeast having no temperature-sensitive autolytic mutation was inserted into this plasmid. Subcloning is performed and the restriction enzymes Bgl II and B are added.
The activity of suppressing the temperature-sensitive autolytic mutation was found in a fragment of the plasmid cleaved with amHI. The gene that suppresses this temperature-sensitive autolysis is named NLT2,
When its base sequence was examined, it had the base sequence shown in FIG. We investigated homology with other genes, especially with protein kinases reported to be associated with lytic mutations. As a result, NLT2 was a novel gene with no homology with any of the previously reported genes.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１１[Correction target item name] 0011

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１１】実施例２（自己溶解に関与する遺伝子ＮＬ
Ｔ２のクローニング） 得られた温度感受性自己溶解変異株ＹＴＳ−１を用い
て、自己溶解に関与する遺伝子のクローニングをおこな
った。サッカロマイセス・セレビシエＸ−２１８０の染
色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ−１で部分分解した断片を、ウ
ラシル非要求性とする遺伝子ＵＲＡ３を含むプラスミド
ＹＥｐ２４のＢａｍＨ Ｉ部位に挿入することで作成さ
れた遺伝子ライブラリーをＹＴＳ−１に挿入した。ウラ
シル非要求性で選択された形質転換株を、ＹＰＤ培地に
植え換え、３７℃で培養し生育してきたコロニーよりプ
ラスミドｐＳＬＹ−１２を抽出した。このプラスミドｐ
ＳＬＹ−１２のサブクローニングの結果は図４及び図５
に示した。制限酵素Ｂｇｌ IIとＢａｍＨ Ｉで切断され
る２．１ｋｂｐの断片にＹＴＳ−１の温度感受性を抑圧
する遺伝子が存在することが分かった。この遺伝子をＮ
ＬＴ２と命名し、そのＤＮＡ塩基配列を決定した。決定
した塩基配列は図１に示した。この遺伝子は、報告され
ている他の遺伝子あるいは、その変異が自己溶解性を示
す酵母のＰＫＣ１，ＢＣＫ１との相同性は全くなかっ
た。以上の結果より、今回クローニングされたＮＬＴ２
遺伝子は、これまで報告されているどの遺伝子とも異な
る全く新規な遺伝子であった。Example 2 (gene NL involved in autolysis)
Cloning of T2) A gene involved in autolysis was cloned using the obtained temperature-sensitive autolysis mutant strain YTS-1. A gene library prepared by inserting a fragment obtained by partially digesting the chromosomal DNA of Saccharomyces cerevisiae X-2180 with Sau3A-1 into the BamHI site of the plasmid YEp24 containing the gene URA3 that does not require uracil, YTS-. Inserted in 1. The transformant selected without uracil requirement was replaced with YPD medium, and plasmid pSLY-12 was extracted from the colonies grown by culturing at 37 ° C. This plasmid p
The results of the subcloning of SLY-12 are shown in FIG. 4 and FIG.
It was shown to. It was found that a 2.1 kbp fragment cleaved by the restriction enzymes BglII and BamHI contains a gene that suppresses YTS-1 temperature sensitivity. This gene is N
It was named LT2 and its DNA base sequence was determined. The determined nucleotide sequence is shown in FIG. This gene had no homology with any of the other reported genes or yeast PKC1 and BCK1 whose mutation shows autolysis. From the above results, NLT2 cloned this time
The gene was a completely novel gene that was different from any of the genes reported so far.

【手続補正５】[Procedure Amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１２[Correction target item name] 0012

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１２】実施例３（ＮＬＴ２遺伝子破壊株ＤＬＴ２
１の造成） 酵母自己溶解に関与する遺伝子ＮＬＴ２の遺伝子破壊用
プラスミドｐＤＮＬＴ２は、図６に示すように作成し
た。プラスミドｐＵＣ１１９（図６のｂ）の制限酵素Ｂ
ａｍＨ Ｉ、Ｓａｌ Ｉ切断断片に、プラスミドｐＳＬＹ
−１２（図６のｃ）のＢｇｌ II、Ｓａｌ Ｉで切断され
たＮＬＴ２遺伝子を含む２．２ｋｂｐのＤＮＡフラグメ
ントを挿入したプラスミドｐＳＬ１２−ＢＳｌ（図６の
ｅ）を作成した。作成されたｐＳＬ１２−ＢＳｌより、
ＮＬＴ２遺伝子を含むＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ III Ｄ
ＮＡフラグメント８００ｂｐを切り出し、プラスミドｐ
ＢＲ３２２のＥｃｏＲ Ｉ、Ｈｉｎｄ III 切断断片に
挿入し、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴ２（図６のｄ）を作
成した。ｐＢＲ−ＮＬＴ２に挿入されたＮＬＴ２遺伝子
は、図１０でＣからＤまでを含む部分で蛋白質をコード
しない部分である。プラスミドｐＢＳΔ３５(図６のｆ)
は、ｐＳＬ１２−ＢＳｌ(図６のｅ)を制限酵素Ｓａｃ
Ｉ、Ｓｍａ Ｉで切断した後、核酸分解酵素Ｅｘｏ III
で消化し、核酸分解酵素Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｎｕｃｌｅ
ａｓｅで処理、核酸合成酵素ＫｌｅｎｏｗＦｒａｇｍｅ
ｎｔで平滑化した後、ライゲーションし、作成されたも
のである。ｐＢＳΔ３５(図６のｆ)に挿入されたＮＬＴ
２遺伝子は、図１０でＥからＦまで含む部分である。プ
ラスミドｐＢＳΔ３５(図６のｆ)のＥｃｏＲ Ｉ部位
を、制限酵素ＥｃｏＲ Ｉによる処理の後、核酸合成酵
素Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑化し、オリゴヌクレ
オチド断片Ｈｉｎｄ IIIリンカーを付着させ、プラスミ
ドｐＢＳΔ３５−Ｈｌ(図６のｈ)を作成した。作成した
プラスミドｐＢＳΔ３５−Ｈｌ(図６のｈ)より、制限酵
素Ｈｉｎｄ III、ＢａｍＨ Ｉで処理し、ＮＬＴ２遺伝
子の一部を含むＨｉｎｄ III−ＢａｍＨ Ｉ ＤＮＡフ
ラグメント ５００ｂｐを、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴ
２(図６のｄ)のＨｉｎｄ III、ＢａｍＨＩ切断断片に挿
入し、プラスミドｐＢＲ−ＮＬＴＤ２(図６のｇ)を作成
した。さらに、ｐＢＲ−ＮＬＴＤ２(図６のｇ)のＨｉｎ
ｄ III部位に、プラスミドＹＥｐ２４(図６のｇ)を制限
酵素Ｈｉｎｄ IIIで処理して得た酵母サッカロミセス・
セレビシエのＵＲＡ３遺伝子を含む１．１ｋｂｐのＤＮ
Ａフラグメントを挿入し、プラスミドｐＤＮＬＴ２(図
６のｉ)を作成した。作成されたプラスミドｐＤＮＬＴ
２(図６のｉ)は、プラスミドｐＢＲ３２２(図６のａ)を
基礎とし、ＮＬＴ２遺伝子の図１０に示すＥからＦまで
の部分とＣからＤまでの部分を含み、ＦからＣまでの間
にサッカロミセス・セレビシエのＵＲＡ３遺伝子が挿入
されたものである。このプラスミドｐＤＮＬＴ２(図６
のｉ)のＮＬＴ２遺伝子を含むＸｈｏＩ、Ｐｖｕ II Ｄ
ＮＡフラグメント約２．４ｋｂｐを、温度感受性自己溶
解変異酵母であるＹＴＳ−１に導入し、ＤＬＴ２１株を
造成した。造成された酵母ＤＬＴ２１は、図７で示すよ
うに、ＮＬＴ２遺伝子が破壊され、ＮＬＴ２遺伝子がコ
ードする蛋白質が産生できなくなったことが予想される
ものである。ＤＬＴ２１株のＮＬＴ２遺伝子破壊は、図
７に示すサザンハイブリダイゼーションの結果より明ら
かである。サザンハイブリダイゼーションは、ＮＬＴ２
遺伝子内のＸｈｏ Ｉ、Ｐｖｕ II部位をプローブとし、
各酵母より抽出された染色体ＤＮＡをＸｈｏ Ｉ、Ｐｖ
ｕIIで処理し行った。造成されたＮＬＴ２遺伝子破壊酵
母ＤＬＴ２１及び親株であり温度感受性自己溶解変異酵
母であるＹＴＳ−１の３７℃に温度シフト後の生菌数の
変化を図８に示した。ＤＬＴ２１は、ＹＴＳ−１に較べ
て３７℃に温度シフト後の生菌数の低下がより著しかっ
た。Example 3 (NLT2 gene disrupted strain DLT2
Construction of 1) A plasmid pDNLT2 for gene disruption of the gene NLT2 involved in yeast autolysis was prepared as shown in FIG. Restriction enzyme B of plasmid pUC119 (FIG. 6b)
The plasmid pSLY was digested with the amHI and Sal I fragments.
A plasmid pSL12-BS1 (e in FIG. 6) was prepared by inserting a 2.2 kbp DNA fragment containing the NLT2 gene cleaved with -12 (FIG. 6c) BglII and SalI. From the created pSL12-BSl,
EcoR I, Hind III D containing NLT2 gene
The NA fragment 800 bp was cut out to obtain plasmid p
The plasmid pBR-NLT2 (d in FIG. 6) was prepared by inserting it into the EcoR I and Hind III digestion fragments of BR322. The NLT2 gene inserted into pBR-NLT2 is a portion that includes C to D in FIG. 10 and does not encode a protein. Plasmid pBSΔ35 (f in FIG. 6)
Is the restriction enzyme Sac for the pSL12-BS1 (e in FIG. 6).
Nucleolytic enzyme Exo III after cleavage with I and Sma I
Digested with Nucleolytic enzyme Mung Bean Nucle
treated with asase, nucleic acid synthase KlenowFragme
It was created by ligating after smoothing with nt. NLT inserted in pBSΔ35 (f in FIG. 6)
The two genes are portions including E to F in FIG. The EcoR I site of the plasmid pBSΔ35 (f in FIG. 6) was treated with a restriction enzyme EcoR I, blunted with a nucleic acid synthesizing enzyme T4 DNA polymerase, and an oligonucleotide fragment HindIII linker was attached to the plasmid pBSΔ35-Hl (FIG. 6). H) was created. The prepared plasmid pBSΔ35-H1 (h in FIG. 6) was treated with restriction enzymes HindIII and BamHI, and HindIII-BamHI DNA fragment 500bp containing a part of NLT2 gene was added to plasmid pBR-NLT.
2 (d in FIG. 6) was inserted into the HindIII and BamHI cleavage fragment to prepare plasmid pBR-NLTD2 (g in FIG. 6). Furthermore, Hin of pBR-NLTD2 (g in FIG. 6) was used.
The yeast Saccharomyces obtained by treating the plasmid YEp24 (g in FIG. 6) with the restriction enzyme HindIII at the dIII site.
1.1 kbp DN containing URA3 gene of S. cerevisiae
The A fragment was inserted to create the plasmid pDNLT2 (i in FIG. 6). Constructed plasmid pDNLT
2 (i in FIG. 6) is based on the plasmid pBR322 (a in FIG. 6) and contains the portion from E to F and the portion from C to D of the NLT2 gene shown in FIG. The URA3 gene of Saccharomyces cerevisiae has been inserted into. This plasmid pDNLT2 (Fig. 6)
I) XhoI, Pvu II D containing the NLT2 gene
About 2.4 kbp of NA fragment was introduced into YTS-1 which is a temperature-sensitive autolytic mutant yeast to construct DLT21 strain. In the constructed yeast DLT21, as shown in FIG. 7, it is expected that the NLT2 gene was disrupted and the protein encoded by the NLT2 gene could not be produced. The NLT2 gene disruption in the DLT21 strain is clear from the results of Southern hybridization shown in FIG. Southern hybridization is NLT2
Using the Xho I and Pvu II sites in the gene as probes,
The chromosomal DNA extracted from each yeast was Xho I, Pv
Treated with uII. Changes in the viable cell count of the constructed NLT2 gene-disrupted yeast DLT21 and the parent strain and temperature-sensitive autolytic mutant yeast YTS-1 after the temperature shift to 37 ° C. are shown in FIG. Compared to YTS-1, DLT21 showed a more remarkable decrease in the viable cell count after the temperature shift to 37 ° C.

【手続補正６】[Procedure correction 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１５[Name of item to be corrected] 0015

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１５】実施例６（変異株ＹＴＳ−１を用いた菌体
内蛋白質の分泌生産） 親株であるＹＮＮ２７あるいは、温度感受性自己溶解変
異株であるＹＴＳ−１を２５℃で２日間培養した後、３
７℃へ温度を上昇させ、２日間培養し、各時間で培地を
採取、遠心分離した後、菌体内、培養上清のアルカリホ
スファターゼの活性を測定した。酵母懸濁液中の酵素活
性はシャー（Ａ．Ｓｃｈｕｒｒ）及びヤジル（Ｅ．Ｙａ
ｇｉｌ）の方法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・ミク
ロビオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．），
６５，２９１，１９７１〕で測定した。その結果は、図
９に示した。ＹＴＳ−１株の場合は、培養上清のアルカ
リホスファターゼ活性は徐々に上昇するのに対し、菌体
内の活性は徐々に低下した。３７℃に温度シフト後、４
８時間後にアルカリホスファターゼの全活性の９０％は
培地中に漏出され、約２８ｕ／ｍｌの活性が認められ
た。一方、親株では同酵素の活性を検出できなかった。
以上より、変異株ＹＴＳ−１は、温度シフトさせること
により菌体内蛋白質を培地中に分泌することが可能であ
ることがわかった。Example 6 Secretory Production of Intracellular Protein Using Mutant YTS-1 Parent strain YNN27 or temperature-sensitive autolytic mutant YTS-1 was cultured at 25 ° C. for 2 days, and then 3
The temperature was raised to 7 ° C., the cells were cultured for 2 days, the medium was collected at each time and centrifuged, and then the activity of alkaline phosphatase in the cells and the culture supernatant was measured. The enzyme activity in the yeast suspension was determined by A. Schurr and Y.
Gil) method [Journal of General Microbiology (J. Gen. Microbiol.),
65, 291, 1971]. The results are shown in Fig. 9. In the case of the YTS-1 strain, the alkaline phosphatase activity in the culture supernatant gradually increased, while the intracellular activity gradually decreased. After temperature shift to 37 ° C, 4
After 8 hours, 90% of the total activity of alkaline phosphatase was leaked into the medium, and an activity of about 28 u / ml was observed. On the other hand, the activity of the same enzyme could not be detected in the parent strain.
From the above, it was found that the mutant strain YTS-1 can secrete intracellular protein into the medium by shifting the temperature.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁵ Identification number Office reference number FI Technical display area // (C12N 1/19 C12R 1: 865) (C12N 15/31 C12R 1: 865) (C12P 21/00 C12R 1: 865)

Claims (7)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 サッカロミセス セレビシエ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＥＲＭ
Ｐ−１３４１０よりなる温度感受性自己溶解変異酵
母。1. A Saccharomyces cerevisiae (Sacc)
FERM of Haromyces cerevisiae)
A temperature-sensitive autolytic mutant yeast consisting of P-13410. 【請求項２】 図１で示される塩基配列を有する酵母の
温度感受性自己溶解変異を抑圧する遺伝子。2. A gene for suppressing a temperature-sensitive autolytic mutation in yeast, which has the nucleotide sequence shown in FIG. 【請求項３】 請求項２記載の遺伝子がコードする図２
で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。3. FIG. 2 encoded by the gene according to claim 2.
A protein having the amino acid sequence shown by. 【請求項４】 請求項２記載の遺伝子を破壊することを
目的として作成されたプラスミドをサッカロミセス セ
レビシエ種の酵母に導入して得られた遺伝子を改変した
温度感受性自己溶解酵母。4. A temperature-sensitive autolytic yeast in which a gene obtained by introducing a plasmid prepared for the purpose of destroying the gene according to claim 2 into a yeast of Saccharomyces cerevisiae is modified. 【請求項５】 前記のプラスミドを導入する酵母がサッ
カロミセス セレビシエ ＦＥＲＭ Ｐ−１３４１１よ
りなる請求項４記載の温度感受性自己溶解酵母。5. The temperature-sensitive autolytic yeast according to claim 4, wherein the yeast into which the plasmid is introduced is Saccharomyces cerevisiae FERM P-13411. 【請求項６】 請求項１又は請求項４記載の酵母を自己
溶解させることを特徴とする酵母エキスの製法。6. A method for producing a yeast extract, which comprises autolyzing the yeast according to claim 1 or 4. 【請求項７】 請求項１又は請求項４記載の酵母を、そ
の菌体内の蛋白質類が培地中に分泌されるのに適した温
度条件で培養することを特徴とする蛋白質類の製法。7. A method for producing a protein, which comprises culturing the yeast according to claim 1 or 4 under a temperature condition suitable for secreting the protein in the bacterial cell into a medium.