JPH0622798A - 塩基配列決定法 - Google Patents
塩基配列決定法Info
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- JPH0622798A JPH0622798A JP4180095A JP18009592A JPH0622798A JP H0622798 A JPH0622798 A JP H0622798A JP 4180095 A JP4180095 A JP 4180095A JP 18009592 A JP18009592 A JP 18009592A JP H0622798 A JPH0622798 A JP H0622798A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 長いＤＮＡの塩基配列を効率良く行う。
【構成】 種々の配列を持ったＤＮＡオリゴマーを区分
けして保持したＤＮＡプローブ素子と、それらオリゴマ
ーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標識した蛍光体標
識オリゴマーセットを用い、長いＤＮＡの複数個所ある
いは複数のＤＮＡの塩基配列を同時に決定する。続いて
決定された配列に相補的なプライマーを再度選んで決定
塩基長を伸ばす。 【効果】 従来法での問題点である部分的な配列決定と
これに基づく新たなプライマーの合成のくり開始を回避
できるので、手間をかけずに効率良く配列決定ができ
る。
けして保持したＤＮＡプローブ素子と、それらオリゴマ
ーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標識した蛍光体標
識オリゴマーセットを用い、長いＤＮＡの複数個所ある
いは複数のＤＮＡの塩基配列を同時に決定する。続いて
決定された配列に相補的なプライマーを再度選んで決定
塩基長を伸ばす。 【効果】 従来法での問題点である部分的な配列決定と
これに基づく新たなプライマーの合成のくり開始を回避
できるので、手間をかけずに効率良く配列決定ができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡあるいはＲＮＡの
塩基配列決定法に関するものである。
塩基配列決定法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、ＤＮＡ塩基配列決定法は、ＤＮＡ
断片試料調製プロセス、ゲル電気泳動法による分離、分
離したＤＮＡバンドパターンの読み取りと配列決定の順
序で行われている。このＤＮＡ塩基配列決定法をジデオ
キシ法について説明すると、まず目的とするＤＮＡ断片
をＭ13ファージに挿入して感受性菌を形質転換し、この
形質転換菌を培養して１本鎖ＤＮＡを調製し、これにＤ
ＮＡ鎖の特定位置に結合するプライマーを結合させＤＮ
ＡポリメラーゼでＤＮＡを合成する。この時、基質とな
る４種のデオキシリボ核酸の他，放射性同位元素で標識
したデオキシリボ核酸を混合しておく。さらに、ジデオ
キシリボ核酸を添加して反応させる。Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔそ
れぞれの塩基でジデオキシリボ核酸を用い前記操作を行
い、末端塩基がそれぞれＡ，Ｇ，Ｃ，ＴのＤＮＡ断片試
料を作製する。このＤＮＡ断片試料をゲル電気泳動法に
より分離し、分離したＤＮＡバンドパターンを読み取り
ＤＮＡ塩基配列を決定する。
断片試料調製プロセス、ゲル電気泳動法による分離、分
離したＤＮＡバンドパターンの読み取りと配列決定の順
序で行われている。このＤＮＡ塩基配列決定法をジデオ
キシ法について説明すると、まず目的とするＤＮＡ断片
をＭ13ファージに挿入して感受性菌を形質転換し、この
形質転換菌を培養して１本鎖ＤＮＡを調製し、これにＤ
ＮＡ鎖の特定位置に結合するプライマーを結合させＤＮ
ＡポリメラーゼでＤＮＡを合成する。この時、基質とな
る４種のデオキシリボ核酸の他，放射性同位元素で標識
したデオキシリボ核酸を混合しておく。さらに、ジデオ
キシリボ核酸を添加して反応させる。Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔそ
れぞれの塩基でジデオキシリボ核酸を用い前記操作を行
い、末端塩基がそれぞれＡ，Ｇ，Ｃ，ＴのＤＮＡ断片試
料を作製する。このＤＮＡ断片試料をゲル電気泳動法に
より分離し、分離したＤＮＡバンドパターンを読み取り
ＤＮＡ塩基配列を決定する。
【０００３】上記方法において、ＤＮＡ断片試料の検出
には従来放射性同位元素でＤＮＡを標識するオートラジ
オグラフィーが用いられてきた。しかし、その取扱の不
便さから、蛍光体でＤＮＡを標識する方法が用いられて
いる（ネーチャー 第３２１巻、６７４頁〜６７９頁
（Ｎａｔｕｒｅ ３２１，６７４−６７９），サイエン
ス 第２３８巻、３３６頁から３４１頁（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３８，３３６−３４１））。この方法では１つの
ＤＮＡにつき約５００塩基の長さまで解析できる。さら
に長い領域まで解析するには、解析されたＤＮＡ配列の
末端近傍の配列と相補的なオリゴマーを作製し、これを
新たなプライマーとして用いることでより長い配列を順
次決定していく手法（プライマー伸長法）や、目的ＤＮ
Ａの片側あるいは両側を酵素を用いて削り、ベクターに
挿入し解析する方法が用いられている。
には従来放射性同位元素でＤＮＡを標識するオートラジ
オグラフィーが用いられてきた。しかし、その取扱の不
便さから、蛍光体でＤＮＡを標識する方法が用いられて
いる（ネーチャー 第３２１巻、６７４頁〜６７９頁
（Ｎａｔｕｒｅ ３２１，６７４−６７９），サイエン
ス 第２３８巻、３３６頁から３４１頁（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３８，３３６−３４１））。この方法では１つの
ＤＮＡにつき約５００塩基の長さまで解析できる。さら
に長い領域まで解析するには、解析されたＤＮＡ配列の
末端近傍の配列と相補的なオリゴマーを作製し、これを
新たなプライマーとして用いることでより長い配列を順
次決定していく手法（プライマー伸長法）や、目的ＤＮ
Ａの片側あるいは両側を酵素を用いて削り、ベクターに
挿入し解析する方法が用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】長いＤＮＡの配列を確
実に決定するにはプライマー伸長法が優れているが、デ
−タ解析の都度新しいプライマーを合成する必要がある
難点があった。そこで、塩基配列の異なる８ないし１０
塩基長の全ての組合せのプライマーを用意し、標的とな
るＤＮＡとハイブリダイズするか否かを検定し、ハイブ
リダイズしたプライマーの配列を重ね合う様に配列させ
る試みがなされている。（プロシーディング オブ ナ
チュラル アカデミー オブ サイエンシズ ユーエス
エー 第８８巻、１００８９頁〜１００９３頁（１９９
１年）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８８，１００８９−１００９３（１９９１））。こ
の方方は、電気泳動を必要としないので、理論的には長
いＤＮＡ断片の配列を決定できるはずであるが、変性温
度の異なる多数のプライマーを用いる必要があり全ての
配列を満たすハイブイダイゼーション条件が得られない
ので、全ての配列を確実に決定することは難しい難点が
ある。また、繰返しのある配列の決定が不確実になりや
すいので、結局標的ＤＮＡをあらかじめ短い断片にして
長いＤＮＡを少しずつ解析していくので手間が大変かか
る難点があった。
実に決定するにはプライマー伸長法が優れているが、デ
−タ解析の都度新しいプライマーを合成する必要がある
難点があった。そこで、塩基配列の異なる８ないし１０
塩基長の全ての組合せのプライマーを用意し、標的とな
るＤＮＡとハイブリダイズするか否かを検定し、ハイブ
リダイズしたプライマーの配列を重ね合う様に配列させ
る試みがなされている。（プロシーディング オブ ナ
チュラル アカデミー オブ サイエンシズ ユーエス
エー 第８８巻、１００８９頁〜１００９３頁（１９９
１年）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８８，１００８９−１００９３（１９９１））。こ
の方方は、電気泳動を必要としないので、理論的には長
いＤＮＡ断片の配列を決定できるはずであるが、変性温
度の異なる多数のプライマーを用いる必要があり全ての
配列を満たすハイブイダイゼーション条件が得られない
ので、全ての配列を確実に決定することは難しい難点が
ある。また、繰返しのある配列の決定が不確実になりや
すいので、結局標的ＤＮＡをあらかじめ短い断片にして
長いＤＮＡを少しずつ解析していくので手間が大変かか
る難点があった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明はこの問題を解決
するためになされたもので、ジデオキシ法によるＤＮＡ
塩基配列決定法において部分的な配列決定とこれに基づ
く新たなプライマーの合成の繰り返しを回避するため
に、プライマーになりうる可能性のあるものをセットと
してあらかじめ用意し、その中から標的となるＤＮＡに
相補的なプライマーを選ぶこととした。
するためになされたもので、ジデオキシ法によるＤＮＡ
塩基配列決定法において部分的な配列決定とこれに基づ
く新たなプライマーの合成の繰り返しを回避するため
に、プライマーになりうる可能性のあるものをセットと
してあらかじめ用意し、その中から標的となるＤＮＡに
相補的なプライマーを選ぶこととした。
【０００６】本発明では、種々の配列を持ったＤＮＡオ
リゴマーを区分けして保持したＤＮＡプローブ素子と、
それらオリゴマーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標
識した蛍光体標識オリゴマーセットを用い、長いＤＮＡ
の複数個所あるいは複数のＤＮＡの塩基配列を同時に決
定する。続いてプライマー伸長法を蛍光標識オリゴマー
セットを用いて行うことで解析の手間を数分の一に減じ
ることができる。
リゴマーを区分けして保持したＤＮＡプローブ素子と、
それらオリゴマーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標
識した蛍光体標識オリゴマーセットを用い、長いＤＮＡ
の複数個所あるいは複数のＤＮＡの塩基配列を同時に決
定する。続いてプライマー伸長法を蛍光標識オリゴマー
セットを用いて行うことで解析の手間を数分の一に減じ
ることができる。
【０００７】即ち、本発明は、核酸塩基配列決定におい
て、ゲノム中に繰り返し現れる配列に相補的な配列を含
み、かつその３, 末端側に前記配列と異なるオリゴヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーセットを用いる核酸塩基配列決定法にある。上記ゲ
ノム中に繰り返し現われる配列としては、制限酵素の切
断部の配列、Ａｌｕの配列等が用いられる。
て、ゲノム中に繰り返し現れる配列に相補的な配列を含
み、かつその３, 末端側に前記配列と異なるオリゴヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーセットを用いる核酸塩基配列決定法にある。上記ゲ
ノム中に繰り返し現われる配列としては、制限酵素の切
断部の配列、Ａｌｕの配列等が用いられる。
【０００８】さらに、本発明は、上記プライマーセット
の少なくとも一部が、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプ
ロモーター領域に相補的に結合する配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなる核酸塩基配列決定法にある。さら
に、本発明は、上記プライマーセットの少なくても一部
が、ＡＴＧあるいはＣＡＴの配列を持つオリゴヌクレオ
チドに相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドであ
ることを特徴とする核酸塩基配列決定法にある。
の少なくとも一部が、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプ
ロモーター領域に相補的に結合する配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなる核酸塩基配列決定法にある。さら
に、本発明は、上記プライマーセットの少なくても一部
が、ＡＴＧあるいはＣＡＴの配列を持つオリゴヌクレオ
チドに相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドであ
ることを特徴とする核酸塩基配列決定法にある。
【０００９】さらに、本発明は、上記プライマーが、蛍
光体で標識されていることを特徴とする上記核酸塩基配
列決定法にある。ここでは蛍光体としては、スルホロー
ダミン１０１等のローダミン系の蛍光体、Ｂ−フィコエ
リスリンやＲ−フィコエリスリン等のフィコビリプロテ
イン、フルオレッセイン、４−ニトロベンゾ−２−オキ
サ−１、３−ジアゾール、フタロシアニン、ナイルブル
ー等とこれらの誘導体、ならびにこれら蛍光体を含むポ
リマーを用いることができる。ただし、フィコビリプロ
テインは熱安定性や変性剤に対する安定性の観点から、
あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合したプローブに
ビオチン−アビヂンあるいは、ハプテン−抗−ハプテン
抗体等を用いて標識する必要がある。
光体で標識されていることを特徴とする上記核酸塩基配
列決定法にある。ここでは蛍光体としては、スルホロー
ダミン１０１等のローダミン系の蛍光体、Ｂ−フィコエ
リスリンやＲ−フィコエリスリン等のフィコビリプロテ
イン、フルオレッセイン、４−ニトロベンゾ−２−オキ
サ−１、３−ジアゾール、フタロシアニン、ナイルブル
ー等とこれらの誘導体、ならびにこれら蛍光体を含むポ
リマーを用いることができる。ただし、フィコビリプロ
テインは熱安定性や変性剤に対する安定性の観点から、
あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合したプローブに
ビオチン−アビヂンあるいは、ハプテン−抗−ハプテン
抗体等を用いて標識する必要がある。
【００１０】さらに、本発明は、上記プライマーセット
にあるのと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドプローブ
を固定したチップを用いて、プライマーの選別を行うこ
とを特徴とする上記核酸塩基配列決定法にある。
にあるのと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドプローブ
を固定したチップを用いて、プライマーの選別を行うこ
とを特徴とする上記核酸塩基配列決定法にある。
【００１１】
【作用】長いＤＮＡの一部と相補的で、異なる蛍光体で
標識されたプライマーをまず見つける必要がある。この
ために測定しようとするＤＮＡをＤＮＡプローブ素子と
接触させハイブリダイズ（結合）するか否かを調べる。
ＤＮＡプローブ素子上にはオリゴマーセットと同じ配列
を持つＤＮＡがセル状に区分けされて並んでおり、検体
ＤＮＡ中に相補的な配列があればそこに付着する。ＤＮ
Ａプローブ素子上に捕獲されたＤＮＡを検出（検体のＤ
ＮＡをあらかじめ蛍光体で標識しておけば、蛍光検出で
きる）し、検体ＤＮＡと相補的な配列を持つ複数のオリ
ゴマーを特定する。これらオリゴマーと同じ配列を持
ち、異なる蛍光体で標識されたものを選び最初のプライ
マーとする。このプライマーを起点に複数個所の塩基配
列決定を同時に行い、決定された各配列の３’末端近傍
に相補的なプライマーでそれぞれ異なる蛍光体で標識さ
れたセットを用いて次の塩基配列を決定する。この操作
を繰り返すことにより高効率で長いＤＮＡの塩基配列決
定を行うことができる。
標識されたプライマーをまず見つける必要がある。この
ために測定しようとするＤＮＡをＤＮＡプローブ素子と
接触させハイブリダイズ（結合）するか否かを調べる。
ＤＮＡプローブ素子上にはオリゴマーセットと同じ配列
を持つＤＮＡがセル状に区分けされて並んでおり、検体
ＤＮＡ中に相補的な配列があればそこに付着する。ＤＮ
Ａプローブ素子上に捕獲されたＤＮＡを検出（検体のＤ
ＮＡをあらかじめ蛍光体で標識しておけば、蛍光検出で
きる）し、検体ＤＮＡと相補的な配列を持つ複数のオリ
ゴマーを特定する。これらオリゴマーと同じ配列を持
ち、異なる蛍光体で標識されたものを選び最初のプライ
マーとする。このプライマーを起点に複数個所の塩基配
列決定を同時に行い、決定された各配列の３’末端近傍
に相補的なプライマーでそれぞれ異なる蛍光体で標識さ
れたセットを用いて次の塩基配列を決定する。この操作
を繰り返すことにより高効率で長いＤＮＡの塩基配列決
定を行うことができる。
【００１２】ここで用いるオリゴマーセットとして、制
限酵素切断部位あるいはヒトＤＮＡ等に現われる繰返し
配列を含みその末端に種々の配列を持った４〜６塩基の
オリゴマーを連結したものを用いるとつごうが良い。あ
るいは、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター領
域、例えばＴＡＴＡボックスやＣＡＡＴボックス等に相
補的に結合する種々のオリゴヌクレオチド配列を含むセ
ットを用いることで、標的となる長いＤＮＡ中のＲＮＡ
転写部位を効率良く配列決定できる。あるいは、ペプチ
ド合成の開始点である配列ＡＴＧあるいはこれに相補的
な配列ＣＡＴを一部に持つオリゴヌクレオチドをセット
に用いれば遺伝子のオープンリーディングフレームを認
識する確率が上がるのでタンパク質コード領域の配列を
決定するときにつごうが良い。
限酵素切断部位あるいはヒトＤＮＡ等に現われる繰返し
配列を含みその末端に種々の配列を持った４〜６塩基の
オリゴマーを連結したものを用いるとつごうが良い。あ
るいは、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター領
域、例えばＴＡＴＡボックスやＣＡＡＴボックス等に相
補的に結合する種々のオリゴヌクレオチド配列を含むセ
ットを用いることで、標的となる長いＤＮＡ中のＲＮＡ
転写部位を効率良く配列決定できる。あるいは、ペプチ
ド合成の開始点である配列ＡＴＧあるいはこれに相補的
な配列ＣＡＴを一部に持つオリゴヌクレオチドをセット
に用いれば遺伝子のオープンリーディングフレームを認
識する確率が上がるのでタンパク質コード領域の配列を
決定するときにつごうが良い。
【００１３】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲
を限定するものではない。 実施例１ 本実施例を図１ないし３を用いて説明する。この実施例
は制限酵素ＥｃｏＲＩの切断個所を利用する例である。
ＥｃｏＲＩは図２記載のように配列ＧＡＡＴＴＣを認識
し、Ｇ−Ａ間を切断する。そこで配列番号１記載の相補
鎖５’ＧＡＡＴＴＣＮＮＮ３’（Ｎは任意の核酸）を作
りシリコンチップ表面の各セルに固定し、プローブとし
て用いる。ＮＮＮ中の４種の塩基の並び方は６４通りあ
るがこれらを作製し、図１に示すＤＮＡプローブチップ
にマトリックス状に固定する。ここでのオリゴマーの長
さはもっと長くても良い。図１のＤＮＡプローブチップ
は、シリコンウエハー上に形成された６４通りのプロー
ブが固定された反応セル１と標識プローブの非特異吸着
量を測定する部位兼マニピュレーションのための他の領
域２からなる。ＤＮＡプローブチップの反応部のマトリ
ックスの各セルサイズは１ｍｍ×１ｍｍで反応部は８ｍ
ｍ×８ｍｍのサイズである。ＤＮＡプローブチップの作
製法は本実施例の最後に示す。これとは別に配列番号２
及び３の蛍光標識付き８あるいは１０塩基長からなるプ
ライマー５１２種のセットを用意する。プライマーセッ
トには、本実施例では配列番号２及び３の５１２種を用
いたが２００〜１０００あるいはそれ以上の種類のプラ
イマーが含まれていれば有効である。プライマーは必要
に応じて種々蛍光体で標識されている。この中には種々
制限酵素断片部位を含むプライマーや、繰返し配列の末
端を含むプライマーも含まれる。
る。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲
を限定するものではない。 実施例１ 本実施例を図１ないし３を用いて説明する。この実施例
は制限酵素ＥｃｏＲＩの切断個所を利用する例である。
ＥｃｏＲＩは図２記載のように配列ＧＡＡＴＴＣを認識
し、Ｇ−Ａ間を切断する。そこで配列番号１記載の相補
鎖５’ＧＡＡＴＴＣＮＮＮ３’（Ｎは任意の核酸）を作
りシリコンチップ表面の各セルに固定し、プローブとし
て用いる。ＮＮＮ中の４種の塩基の並び方は６４通りあ
るがこれらを作製し、図１に示すＤＮＡプローブチップ
にマトリックス状に固定する。ここでのオリゴマーの長
さはもっと長くても良い。図１のＤＮＡプローブチップ
は、シリコンウエハー上に形成された６４通りのプロー
ブが固定された反応セル１と標識プローブの非特異吸着
量を測定する部位兼マニピュレーションのための他の領
域２からなる。ＤＮＡプローブチップの反応部のマトリ
ックスの各セルサイズは１ｍｍ×１ｍｍで反応部は８ｍ
ｍ×８ｍｍのサイズである。ＤＮＡプローブチップの作
製法は本実施例の最後に示す。これとは別に配列番号２
及び３の蛍光標識付き８あるいは１０塩基長からなるプ
ライマー５１２種のセットを用意する。プライマーセッ
トには、本実施例では配列番号２及び３の５１２種を用
いたが２００〜１０００あるいはそれ以上の種類のプラ
イマーが含まれていれば有効である。プライマーは必要
に応じて種々蛍光体で標識されている。この中には種々
制限酵素断片部位を含むプライマーや、繰返し配列の末
端を含むプライマーも含まれる。
【００１４】目的とするＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで切
断し、切断部に蛍光体を導入する。蛍光体導入法には蛍
光標識ヌクレオチドモノマーをＤＮＡポリメラーゼで導
入する方法、蛍光標識付きオリゴヌクレオチドをライゲ
ーション反応でつける方法、あるいは全ＤＮＡ鎖にビオ
チンを導入し蛍光標識アビジン等を結合させる方法やエ
テノ化によりＤＮＡを蛍光性に変換する方法があるが、
ここではライゲーションによる蛍光標識オリゴマーの導
入を行う。
断し、切断部に蛍光体を導入する。蛍光体導入法には蛍
光標識ヌクレオチドモノマーをＤＮＡポリメラーゼで導
入する方法、蛍光標識付きオリゴヌクレオチドをライゲ
ーション反応でつける方法、あるいは全ＤＮＡ鎖にビオ
チンを導入し蛍光標識アビジン等を結合させる方法やエ
テノ化によりＤＮＡを蛍光性に変換する方法があるが、
ここではライゲーションによる蛍光標識オリゴマーの導
入を行う。
【００１５】蛍光標識ＤＮＡ変性させ１本鎖とした後、
プローブチップにハイブリダイズさせ、洗浄後、試料が
ハイブリダイズした部分を蛍光計測により認識する。こ
こで用いた反応等の細略はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ８８，１００８９−１００
９３（１９９１）の記載と同じである。ハイブリダイズ
シタ部分のＤＮＡプローブと同じ配列を含む蛍光標識プ
ライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例では異
なる蛍光体で標識された２種のプライマーを用いて、目
的ＤＮＡを２ヵ所から配列決定を５００塩基まで行う。
プローブチップにハイブリダイズさせ、洗浄後、試料が
ハイブリダイズした部分を蛍光計測により認識する。こ
こで用いた反応等の細略はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ８８，１００８９−１００
９３（１９９１）の記載と同じである。ハイブリダイズ
シタ部分のＤＮＡプローブと同じ配列を含む蛍光標識プ
ライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例では異
なる蛍光体で標識された２種のプライマーを用いて、目
的ＤＮＡを２ヵ所から配列決定を５００塩基まで行う。
【００１６】次に図３記載のように、決定されたＤＮＡ
配列の４００塩基長〜５００塩基長の範囲の中で手持ち
の５１２種プライマーセットと一致するものを選び出
し、第２回目以後のシーケンシングを行う。１０塩基長
のプライマーの中には１０塩基完全に一致するものがな
い場合もあったが、３’末端の８塩基が一致すれば使用
できることが多い。ここで、異なる蛍光波長を持つ蛍光
体で標識したプライマーを用意し、同時に数個所のシー
ケンシングを行い効率を上げることができる。
配列の４００塩基長〜５００塩基長の範囲の中で手持ち
の５１２種プライマーセットと一致するものを選び出
し、第２回目以後のシーケンシングを行う。１０塩基長
のプライマーの中には１０塩基完全に一致するものがな
い場合もあったが、３’末端の８塩基が一致すれば使用
できることが多い。ここで、異なる蛍光波長を持つ蛍光
体で標識したプライマーを用意し、同時に数個所のシー
ケンシングを行い効率を上げることができる。
【００１７】同様にして第３回目以後の配列決定を行な
い、長いＤＮＡの配列を決定する。このように、本発明
では、長いＤＮＡに相補的な複数のプライマーをあらか
じめ用意したプライマーセットの中から選ぶので、効率
良くＤＮＡ配列を決定できる。上記実施例に使用するＤ
ＮＡプローブチップの調製法を示す。まず、シリコンウ
エハー表面を水蒸気酸化する。ここで、水蒸気酸化は次
の工程で表面をアミノシラン化する上で必須であるが、
通常の半導体製造プロセスでの絶縁膜形成のような厚い
酸化層を形成させる必要はない。次に、３−（２−アミ
ノエチルアミノプロピル）トリメトキシシランを用いて
酸化膜表面をアミノシラン化しシリコンウエハー表面に
アミノ基を導入する。アミノ基をトリフルオロアセチル
化して保護する。次に、キノンジアジドを付加したフェ
ノールノボラック系のポジ型レジストを塗布し９５℃で
ベークする。このレジストは露光した部分をアルカリ洗
浄で除去できるので、露光、アルカリ洗浄、トリフルオ
ロアセチル基の除去、ポリヌクレオチドプローブの固定
の工程を繰り返すことで異なるプローブをシリコンウエ
ハー上の異なる位置に順次固定することができる。ま
ず、シリコンウエハー表面の第１のセルを３５０ｎｍ〜
４００ｎｍの光で露光し、第１のセルのレジストを除去
する。次に、トリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、
分解したレジストを除去する。アミノ基を保護している
トリフルオロアセチル基も同時に除去される。次に、エ
ス．アール．ラスムッセンらの方法（Ｓφｒｅｎ Ｒｉ
ｃｈａｒｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎａ
ｌｉｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８、
１２８〜１４２（１９９１））に従い５’末端にリン酸
基を持つ第１のプローブを固定する。即ち、ｐＨ７の１
−メチルイミダゾール緩衝液と０．２Ｍの１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
の存在下、第１のプローブを５時間５０℃で反応させ
る。同様にして第２以降のセルで同様の工程を繰返し第
２〜第６４のプローブを固定する。最後に、全てのセル
をトリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、カルボジイ
ミドの副反応物を除去する。以上の工程で、表面に異な
るプローブを固定した複数の独立したセルを有する反応
チップを得る。 実施例２ 本実施例はポリペプチドのオープンリーディングフレー
ムの開始コドンあるいはそのアンチコドンに対応するＡ
ＴＧあるいはＣＡＴの配列を含むオリゴヌクレオチドに
相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドを用いる例
である。
い、長いＤＮＡの配列を決定する。このように、本発明
では、長いＤＮＡに相補的な複数のプライマーをあらか
じめ用意したプライマーセットの中から選ぶので、効率
良くＤＮＡ配列を決定できる。上記実施例に使用するＤ
ＮＡプローブチップの調製法を示す。まず、シリコンウ
エハー表面を水蒸気酸化する。ここで、水蒸気酸化は次
の工程で表面をアミノシラン化する上で必須であるが、
通常の半導体製造プロセスでの絶縁膜形成のような厚い
酸化層を形成させる必要はない。次に、３−（２−アミ
ノエチルアミノプロピル）トリメトキシシランを用いて
酸化膜表面をアミノシラン化しシリコンウエハー表面に
アミノ基を導入する。アミノ基をトリフルオロアセチル
化して保護する。次に、キノンジアジドを付加したフェ
ノールノボラック系のポジ型レジストを塗布し９５℃で
ベークする。このレジストは露光した部分をアルカリ洗
浄で除去できるので、露光、アルカリ洗浄、トリフルオ
ロアセチル基の除去、ポリヌクレオチドプローブの固定
の工程を繰り返すことで異なるプローブをシリコンウエ
ハー上の異なる位置に順次固定することができる。ま
ず、シリコンウエハー表面の第１のセルを３５０ｎｍ〜
４００ｎｍの光で露光し、第１のセルのレジストを除去
する。次に、トリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、
分解したレジストを除去する。アミノ基を保護している
トリフルオロアセチル基も同時に除去される。次に、エ
ス．アール．ラスムッセンらの方法（Ｓφｒｅｎ Ｒｉ
ｃｈａｒｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ、Ａｎａ
ｌｉｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８、
１２８〜１４２（１９９１））に従い５’末端にリン酸
基を持つ第１のプローブを固定する。即ち、ｐＨ７の１
−メチルイミダゾール緩衝液と０．２Ｍの１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
の存在下、第１のプローブを５時間５０℃で反応させ
る。同様にして第２以降のセルで同様の工程を繰返し第
２〜第６４のプローブを固定する。最後に、全てのセル
をトリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、カルボジイ
ミドの副反応物を除去する。以上の工程で、表面に異な
るプローブを固定した複数の独立したセルを有する反応
チップを得る。 実施例２ 本実施例はポリペプチドのオープンリーディングフレー
ムの開始コドンあるいはそのアンチコドンに対応するＡ
ＴＧあるいはＣＡＴの配列を含むオリゴヌクレオチドに
相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドを用いる例
である。
【００１８】本実施例で用いるポリヌクレオチドは配列
番号４記載の５’末端がＡＴＧで他がＴＴＸ，ＴＣＸ，
ＴＡＸ，ＴＧＸ，ＣＴＸ，ＣＣＸ，ＣＡＸ，ＣＧＸ，Ａ
ＴＸ，ＡＣＸ，ＡＡＸ，ＡＧＸ，ＧＵＸ，ＧＣＸ，ＧＡ
Ｘ，ＧＧＸの３塩基ずつのランダムな組合せで構成され
ている塩基長１２のオリゴヌクレオチドを含み、５’末
端にはスペーサーを介してアミノ基が結合している。よ
って本実施例で使用するポリヌクレオチドプローブは４
０９６種類である。ここで、Ｘはスペーサーで各塩基と
特異的に結合しない物質が用いられる。各プローブを実
施例１の手法に従い反応チップの各セルに固定する。Ｄ
ＮＡプローブチップの反応部のマトリックスの各セルサ
イズは０．５ｍｍ×０．５ｍｍで反応部は３２ｍｍ×３
２ｍｍのサイズである。目的とするＤＮＡを実施例１と
同様にＮｏｔＩで切断し、切断部を蛍光体を導入する。
本実施例では以下の方法により蛍光体標識して用いる。
まずアナリティカル バイオケミストリー記載のラリー
イー．モリソン等の方法（Ｌａｒｒｙ Ｅ． Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８３、２３１−２４４（１９
８９））に従い、Ｔ４ポリメラーゼ キナーゼを用いて
上試料ポリヌクレオチドの５’末端にリン酸基を導入す
る。
番号４記載の５’末端がＡＴＧで他がＴＴＸ，ＴＣＸ，
ＴＡＸ，ＴＧＸ，ＣＴＸ，ＣＣＸ，ＣＡＸ，ＣＧＸ，Ａ
ＴＸ，ＡＣＸ，ＡＡＸ，ＡＧＸ，ＧＵＸ，ＧＣＸ，ＧＡ
Ｘ，ＧＧＸの３塩基ずつのランダムな組合せで構成され
ている塩基長１２のオリゴヌクレオチドを含み、５’末
端にはスペーサーを介してアミノ基が結合している。よ
って本実施例で使用するポリヌクレオチドプローブは４
０９６種類である。ここで、Ｘはスペーサーで各塩基と
特異的に結合しない物質が用いられる。各プローブを実
施例１の手法に従い反応チップの各セルに固定する。Ｄ
ＮＡプローブチップの反応部のマトリックスの各セルサ
イズは０．５ｍｍ×０．５ｍｍで反応部は３２ｍｍ×３
２ｍｍのサイズである。目的とするＤＮＡを実施例１と
同様にＮｏｔＩで切断し、切断部を蛍光体を導入する。
本実施例では以下の方法により蛍光体標識して用いる。
まずアナリティカル バイオケミストリー記載のラリー
イー．モリソン等の方法（Ｌａｒｒｙ Ｅ． Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８３、２３１−２４４（１９
８９））に従い、Ｔ４ポリメラーゼ キナーゼを用いて
上試料ポリヌクレオチドの５’末端にリン酸基を導入す
る。
【００１９】次に、０．２Ｍ １−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミドと０．５Ｍ エチ
レンジアミンを含むｐＨ６の溶液中で１８時間反応させ
５’末端にアミノ基を導入する。エタノール沈殿を繰返
し未反応のエチレンヂアミン等を除いた後、２０％のア
セトニトリルを含むｐＨ９の０．１Ｍ 炭酸緩衝液中
で、終濃度２０ｍＭ の蛍光体、スルホローダミン１０
１酸クロライド（標的オリゴヌクレオチドの６０ないし
１００倍モル量）を反応させる。エタノール沈殿等で未
反応のスルホローダミン１０１等を除いて５’末端がス
ルホローダミン１０１標識されたポリヌクレオチド試料
を得る。
チルアミノプロピル）カルボジイミドと０．５Ｍ エチ
レンジアミンを含むｐＨ６の溶液中で１８時間反応させ
５’末端にアミノ基を導入する。エタノール沈殿を繰返
し未反応のエチレンヂアミン等を除いた後、２０％のア
セトニトリルを含むｐＨ９の０．１Ｍ 炭酸緩衝液中
で、終濃度２０ｍＭ の蛍光体、スルホローダミン１０
１酸クロライド（標的オリゴヌクレオチドの６０ないし
１００倍モル量）を反応させる。エタノール沈殿等で未
反応のスルホローダミン１０１等を除いて５’末端がス
ルホローダミン１０１標識されたポリヌクレオチド試料
を得る。
【００２０】標識したポリヌクレオチド試料を４０９６
種類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップ
に実施例１に従いハイブリダイゼーション条件下で反応
させる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄
して除く。本実施例では、プローブの１２塩基長（５’
末端のスペーサーをいれなければ１１塩基長）の配列の
うち標的となるＤＮＡと相補的に結合するのは９塩基の
みであるが、問題なくハイブリダイゼーションできる。
種類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップ
に実施例１に従いハイブリダイゼーション条件下で反応
させる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄
して除く。本実施例では、プローブの１２塩基長（５’
末端のスペーサーをいれなければ１１塩基長）の配列の
うち標的となるＤＮＡと相補的に結合するのは９塩基の
みであるが、問題なくハイブリダイゼーションできる。
【００２１】反応の終了したプローブチップ上の蛍光体
結合部を、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ）（あるい
はＮａランプなど）と光電子増倍管（あるいは高感度ラ
インセンサーやエリアセンサー）を用いて反応チップか
ら発する蛍光を測定し、その蛍光強度より標識ＤＮＡが
ハイブリダイズしたセルを確認する。もちろん他の光源
と蛍光体の組みあわせを用いてもよい。
結合部を、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ）（あるい
はＮａランプなど）と光電子増倍管（あるいは高感度ラ
インセンサーやエリアセンサー）を用いて反応チップか
ら発する蛍光を測定し、その蛍光強度より標識ＤＮＡが
ハイブリダイズしたセルを確認する。もちろん他の光源
と蛍光体の組みあわせを用いてもよい。
【００２２】実施例１と同様にハイブリダイズした部分
のＤＮＡプローブと同じ配列を持つ蛍光標識プライマー
を用いてシーケンス反応を行う。実施例では異なる蛍光
体で標識された２種のプライマーを用いて、目的ＤＮＡ
を２ヵ所から配列決定を５００塩基まで行った。ここ
で、標識プライマーの１２塩基長（５’末端のスペーサ
ーをいれなければ１１塩基長）の配列のうち標的となる
ＤＮＡと相補的に結合するのは９塩基のみであるが、
３’末端側の５塩基は確実に標的ＤＮＡと相補鎖を形成
するのでポリメラーゼ反応を用いたシーケンシングは十
分可能である。
のＤＮＡプローブと同じ配列を持つ蛍光標識プライマー
を用いてシーケンス反応を行う。実施例では異なる蛍光
体で標識された２種のプライマーを用いて、目的ＤＮＡ
を２ヵ所から配列決定を５００塩基まで行った。ここ
で、標識プライマーの１２塩基長（５’末端のスペーサ
ーをいれなければ１１塩基長）の配列のうち標的となる
ＤＮＡと相補的に結合するのは９塩基のみであるが、
３’末端側の５塩基は確実に標的ＤＮＡと相補鎖を形成
するのでポリメラーゼ反応を用いたシーケンシングは十
分可能である。
【００２３】決定されたＤＮＡ配列の４００塩基長〜５
００塩基長の範囲の中で手持ちの５１２種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例１と同様
にして順次２回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的ポリヌクレオチドのＡＴＧで
始まる塩基長１１の領域の可能な全ての配列を網羅して
いるため、配列が未知のＤＮＡに用いることのできる標
識プライマーを検索することができる利点がある。さら
に標的ポリヌクレオチドのＡＴＧで始まる領域はＤＮＡ
中のオープンリーディングフレームの開始コドンの可能
性があるので、ランダムの配列決定を行ってもＤＮＡ中
のポリペプチドをコードしている領域の配列をシーケン
シングする確率を高めることができる。 実施例３ 本実施例で用いるプライマーセットはＲＮＡポリメラー
ゼが認識するプロモーター領域の相補鎖に相補的に結合
するオリゴヌクレオチドで、その配列は配列番号５に示
すようにＴＡＴＡＮＡＮＮからなる。Ｎは任意の核酸で
あるので、このオリゴヌクレオチドの塩基の並び方は６
４通りあリ、実施例１と同様にシリコンウエハー製のＤ
ＮＡプローブチップ表面にマトリックス状に固定し、プ
ローブとして用いるとともに、５’末端に蛍光標識を導
入してプライマーとして用いる。
００塩基長の範囲の中で手持ちの５１２種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例１と同様
にして順次２回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的ポリヌクレオチドのＡＴＧで
始まる塩基長１１の領域の可能な全ての配列を網羅して
いるため、配列が未知のＤＮＡに用いることのできる標
識プライマーを検索することができる利点がある。さら
に標的ポリヌクレオチドのＡＴＧで始まる領域はＤＮＡ
中のオープンリーディングフレームの開始コドンの可能
性があるので、ランダムの配列決定を行ってもＤＮＡ中
のポリペプチドをコードしている領域の配列をシーケン
シングする確率を高めることができる。 実施例３ 本実施例で用いるプライマーセットはＲＮＡポリメラー
ゼが認識するプロモーター領域の相補鎖に相補的に結合
するオリゴヌクレオチドで、その配列は配列番号５に示
すようにＴＡＴＡＮＡＮＮからなる。Ｎは任意の核酸で
あるので、このオリゴヌクレオチドの塩基の並び方は６
４通りあリ、実施例１と同様にシリコンウエハー製のＤ
ＮＡプローブチップ表面にマトリックス状に固定し、プ
ローブとして用いるとともに、５’末端に蛍光標識を導
入してプライマーとして用いる。
【００２４】目的とするＤＮＡを実施例１と同様にＮｏ
ｔＩで切断し、切断部を蛍光体を導入する。本実施例で
は以下の方法によりスルホローダミン１０１酸クロライ
ドで蛍光標識して用いる。標識したＤＮＡを上記６４種
類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップに
実施例１に従いハイブリダイゼーション条件下で反応さ
せる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄し
て除く。
ｔＩで切断し、切断部を蛍光体を導入する。本実施例で
は以下の方法によりスルホローダミン１０１酸クロライ
ドで蛍光標識して用いる。標識したＤＮＡを上記６４種
類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップに
実施例１に従いハイブリダイゼーション条件下で反応さ
せる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄し
て除く。
【００２５】反応の終了したプローブチップから発する
蛍光を測定し、その蛍光強度より標識ＤＮＡがハイブリ
ダイズしたセルを確認する。実施例１と同様にハイブリ
ダイズした部分のＤＮＡプローブと同じ配列を持つ蛍光
標識プライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例
では異なる蛍光体で標識された２種のプライマーを用い
て、目的ＤＮＡを２ヵ所から配列決定を５００塩基まで
行う。
蛍光を測定し、その蛍光強度より標識ＤＮＡがハイブリ
ダイズしたセルを確認する。実施例１と同様にハイブリ
ダイズした部分のＤＮＡプローブと同じ配列を持つ蛍光
標識プライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例
では異なる蛍光体で標識された２種のプライマーを用い
て、目的ＤＮＡを２ヵ所から配列決定を５００塩基まで
行う。
【００２６】決定されたＤＮＡ配列の４００塩基長〜５
００塩基長の範囲の中で手持ちの５１２種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例１と同様
にして順次２回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的ＤＮＡの通常ＴＡＴＡボック
スあるいはホネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）ボックスとよばれ
るプロモーター配列のほぼ半分を網羅しているため、未
知のＤＮＡのプロモーター領域及びその下流に位置する
転写領域、即ちＲＮＡの配列をシーケンシングする確率
を高めることができる利点がある。本実施例ではプロモ
ーターとしてＴＡＴＡボックスに相補的な配列を認識す
るオリゴマーセットを用いたが、他のプロモーター領域
に相補的な配列を認識するオリゴマーセットでももちろ
ん良い結果が得られる。
００塩基長の範囲の中で手持ちの５１２種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例１と同様
にして順次２回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的ＤＮＡの通常ＴＡＴＡボック
スあるいはホネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）ボックスとよばれ
るプロモーター配列のほぼ半分を網羅しているため、未
知のＤＮＡのプロモーター領域及びその下流に位置する
転写領域、即ちＲＮＡの配列をシーケンシングする確率
を高めることができる利点がある。本実施例ではプロモ
ーターとしてＴＡＴＡボックスに相補的な配列を認識す
るオリゴマーセットを用いたが、他のプロモーター領域
に相補的な配列を認識するオリゴマーセットでももちろ
ん良い結果が得られる。
【００２７】
【発明の効果】以上説明したように、長いＤＮＡの塩基
配列を決定する際、蛍光標識プライマーセットを用いて
複数個所の配列決定を同時に行い、決定された中から次
のプライマーを選んで決定塩基長を伸ばすことにより効
率良く長いＤＮＡの塩基配列を決定できる。
配列を決定する際、蛍光標識プライマーセットを用いて
複数個所の配列決定を同時に行い、決定された中から次
のプライマーを選んで決定塩基長を伸ばすことにより効
率良く長いＤＮＡの塩基配列を決定できる。
【００２８】この方法では従来のようにプライマーをそ
の都度合成する必要もなく、迅速にシーケンシングを行
える。さらに酵素切断部位からの配列決定あるいはヒト
遺伝子中に現われる繰返し配列に接続する塩基配列など
をクローニング等の手間をかけずに決定することができ
る。あるいは未知のＤＮＡ試料に体してＲＮＡ転写のプ
ロモーター部位やポリペプチド翻訳開始部位の配列を認
識するセットを用いることでＲＮＡ転写部位やポリペプ
チドコーディング領域を優先的に解析する確率を高める
ことができる。
の都度合成する必要もなく、迅速にシーケンシングを行
える。さらに酵素切断部位からの配列決定あるいはヒト
遺伝子中に現われる繰返し配列に接続する塩基配列など
をクローニング等の手間をかけずに決定することができ
る。あるいは未知のＤＮＡ試料に体してＲＮＡ転写のプ
ロモーター部位やポリペプチド翻訳開始部位の配列を認
識するセットを用いることでＲＮＡ転写部位やポリペプ
チドコーディング領域を優先的に解析する確率を高める
ことができる。
【００２９】
配列番号 １ 配列の長さ ９ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＮは任意のＡＣＧＴ 配列 ＧＡＡＴＴＣＮＮＮ 配列番号 ２ 配列の長さ １０ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＮは任意のＡＣＧＴ 配列 ＧＡＡＴＴＣＮＮＮＮ 配列番号 ３ 配列の長さ ８ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＮは任意のＡＣＧＴ 配列 ＡＧＣＴＮＮＮＮ 配列番号 ４ 配列の長さ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 他の配列を含む合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＯ，Ｐ，ＱはそれぞれＴＴＸ，Ｔ
ＣＸ，ＴＡＸ，ＴＧＸ，ＣＴＸ，ＣＣＸ，ＣＡＸ，ＣＧ
Ｘ，ＡＴＸ，ＡＣＸ，ＡＡＸ，ＡＧＸ，ＧＵＸ，ＧＣ
Ｘ，ＧＡＸ，ＧＧＸ （Ｘはスペーサー） 配列 ＡＴＧＯＰＱ 配列番号 ５ 配列の長さ ８ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＮは任意のＡＣＧＴ 配列 ＴＡＴＡＮＡＮＮ
ＣＸ，ＴＡＸ，ＴＧＸ，ＣＴＸ，ＣＣＸ，ＣＡＸ，ＣＧ
Ｘ，ＡＴＸ，ＡＣＸ，ＡＡＸ，ＡＧＸ，ＧＵＸ，ＧＣ
Ｘ，ＧＡＸ，ＧＧＸ （Ｘはスペーサー） 配列 ＡＴＧＯＰＱ 配列番号 ５ 配列の長さ ８ 配列の型 核酸 鎖の数 １ トポロジー 直鎖 配列の種類 合成ＤＮＡプライマー 配列の特徴 配列中のＮは任意のＡＣＧＴ 配列 ＴＡＴＡＮＡＮＮ
【図１】ＤＮＡプローブチップの模式図。
【図２】本発明の第１回目の配列決定までのフローを示
す図。
す図。
【図３】本発明の第２回目以後の配列決定のフローを示
す図。
す図。
１…反応セル、２…他の領域
Claims (7)
- 【請求項１】 核酸塩基配列決定において、ゲノム中に
繰り返し現れる配列に相補的な配列を含み、かつその３
, 末端側に前記配列と異なるオリゴヌクレオチド配列を
含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用
いる核酸塩基配列決定法。 - 【請求項２】 ゲノム中に繰り返し現われる配列が、制
限酵素の切断部の配列である請求項１記載の核酸塩基配
列決定法。 - 【請求項３】 ゲノム中に繰り返し現われる配列が、Ａ
ｌｕの配列である請求項１記載の核酸塩基配列決定法。 - 【請求項４】 請求項１のプライマーセットの少なくと
も一部が、ＲＮＡポリメラーゼが認識するプロモーター
領域に相補的に結合する配列を含むオリゴヌクレオチド
からなることを特徴とする核酸塩基配列決定法。 - 【請求項５】 請求項１のプライマーセットの少なくて
も一部が、ＡＴＧあるいはＣＡＴの配列を持つオリゴヌ
クレオチドに相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチ
ドであることを特徴とする核酸塩基配列決定法。 - 【請求項６】 プライマーセットに含まれるプライマー
が、蛍光体で標識されていることを特徴とする上記請求
項１、２、３、４または５の核酸塩基配列決定法。 - 【請求項７】 プライマーセットにあるのと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドプローブを固定したチップを用
いて、プライマーの選別を行うことを特徴とする上記請
求項１、２、３、４、５または６の核酸塩基配列決定
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4180095A JPH0622798A (ja) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | 塩基配列決定法 |
| US08/465,181 US5741644A (en) | 1992-07-07 | 1995-06-05 | DNA sequencing by extension of probe chip immobilized oligonucleotides |
| US08/969,163 US5935794A (en) | 1992-07-07 | 1997-11-12 | Method of DNA base sequence determination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4180095A JPH0622798A (ja) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | 塩基配列決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622798A true JPH0622798A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=16077352
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4180095A Pending JPH0622798A (ja) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | 塩基配列決定法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5741644A (ja) |
| JP (1) | JPH0622798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0701001A2 (en) * | 1994-09-07 | 1996-03-13 | Hitachi, Ltd. | DNA separating, fractionating and analyzing method and system therefor |
Families Citing this family (43)
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