JPH0622798A - 塩基配列決定法 - Google Patents
塩基配列決定法Info
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Abstract
けして保持したDNAプローブ素子と、それらオリゴマ
ーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標識した蛍光体標
識オリゴマーセットを用い、長いDNAの複数個所ある
いは複数のDNAの塩基配列を同時に決定する。続いて
決定された配列に相補的なプライマーを再度選んで決定
塩基長を伸ばす。 【効果】 従来法での問題点である部分的な配列決定と
これに基づく新たなプライマーの合成のくり開始を回避
できるので、手間をかけずに効率良く配列決定ができ
る。
Description
塩基配列決定法に関するものである。
断片試料調製プロセス、ゲル電気泳動法による分離、分
離したDNAバンドパターンの読み取りと配列決定の順
序で行われている。このDNA塩基配列決定法をジデオ
キシ法について説明すると、まず目的とするDNA断片
をM13ファージに挿入して感受性菌を形質転換し、この
形質転換菌を培養して1本鎖DNAを調製し、これにD
NA鎖の特定位置に結合するプライマーを結合させDN
AポリメラーゼでDNAを合成する。この時、基質とな
る4種のデオキシリボ核酸の他,放射性同位元素で標識
したデオキシリボ核酸を混合しておく。さらに、ジデオ
キシリボ核酸を添加して反応させる。A,G,C,Tそ
れぞれの塩基でジデオキシリボ核酸を用い前記操作を行
い、末端塩基がそれぞれA,G,C,TのDNA断片試
料を作製する。このDNA断片試料をゲル電気泳動法に
より分離し、分離したDNAバンドパターンを読み取り
DNA塩基配列を決定する。
には従来放射性同位元素でDNAを標識するオートラジ
オグラフィーが用いられてきた。しかし、その取扱の不
便さから、蛍光体でDNAを標識する方法が用いられて
いる(ネーチャー 第321巻、674頁〜679頁
(Nature 321,674−679),サイエン
ス 第238巻、336頁から341頁(Scienc
e 238,336−341))。この方法では1つの
DNAにつき約500塩基の長さまで解析できる。さら
に長い領域まで解析するには、解析されたDNA配列の
末端近傍の配列と相補的なオリゴマーを作製し、これを
新たなプライマーとして用いることでより長い配列を順
次決定していく手法(プライマー伸長法)や、目的DN
Aの片側あるいは両側を酵素を用いて削り、ベクターに
挿入し解析する方法が用いられている。
実に決定するにはプライマー伸長法が優れているが、デ
−タ解析の都度新しいプライマーを合成する必要がある
難点があった。そこで、塩基配列の異なる8ないし10
塩基長の全ての組合せのプライマーを用意し、標的とな
るDNAとハイブリダイズするか否かを検定し、ハイブ
リダイズしたプライマーの配列を重ね合う様に配列させ
る試みがなされている。(プロシーディング オブ ナ
チュラル アカデミー オブ サイエンシズ ユーエス
エー 第88巻、10089頁〜10093頁(199
1年)(Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 88,10089−10093(1991))。こ
の方方は、電気泳動を必要としないので、理論的には長
いDNA断片の配列を決定できるはずであるが、変性温
度の異なる多数のプライマーを用いる必要があり全ての
配列を満たすハイブイダイゼーション条件が得られない
ので、全ての配列を確実に決定することは難しい難点が
ある。また、繰返しのある配列の決定が不確実になりや
すいので、結局標的DNAをあらかじめ短い断片にして
長いDNAを少しずつ解析していくので手間が大変かか
る難点があった。
するためになされたもので、ジデオキシ法によるDNA
塩基配列決定法において部分的な配列決定とこれに基づ
く新たなプライマーの合成の繰り返しを回避するため
に、プライマーになりうる可能性のあるものをセットと
してあらかじめ用意し、その中から標的となるDNAに
相補的なプライマーを選ぶこととした。
リゴマーを区分けして保持したDNAプローブ素子と、
それらオリゴマーのセットのそれぞれを種々蛍光体で標
識した蛍光体標識オリゴマーセットを用い、長いDNA
の複数個所あるいは複数のDNAの塩基配列を同時に決
定する。続いてプライマー伸長法を蛍光標識オリゴマー
セットを用いて行うことで解析の手間を数分の一に減じ
ることができる。
て、ゲノム中に繰り返し現れる配列に相補的な配列を含
み、かつその3, 末端側に前記配列と異なるオリゴヌク
レオチド配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライ
マーセットを用いる核酸塩基配列決定法にある。上記ゲ
ノム中に繰り返し現われる配列としては、制限酵素の切
断部の配列、Aluの配列等が用いられる。
の少なくとも一部が、RNAポリメラーゼが認識するプ
ロモーター領域に相補的に結合する配列を含むオリゴヌ
クレオチドからなる核酸塩基配列決定法にある。さら
に、本発明は、上記プライマーセットの少なくても一部
が、ATGあるいはCATの配列を持つオリゴヌクレオ
チドに相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドであ
ることを特徴とする核酸塩基配列決定法にある。
光体で標識されていることを特徴とする上記核酸塩基配
列決定法にある。ここでは蛍光体としては、スルホロー
ダミン101等のローダミン系の蛍光体、B−フィコエ
リスリンやR−フィコエリスリン等のフィコビリプロテ
イン、フルオレッセイン、4−ニトロベンゾ−2−オキ
サ−1、3−ジアゾール、フタロシアニン、ナイルブル
ー等とこれらの誘導体、ならびにこれら蛍光体を含むポ
リマーを用いることができる。ただし、フィコビリプロ
テインは熱安定性や変性剤に対する安定性の観点から、
あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合したプローブに
ビオチン−アビヂンあるいは、ハプテン−抗−ハプテン
抗体等を用いて標識する必要がある。
にあるのと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドプローブ
を固定したチップを用いて、プライマーの選別を行うこ
とを特徴とする上記核酸塩基配列決定法にある。
標識されたプライマーをまず見つける必要がある。この
ために測定しようとするDNAをDNAプローブ素子と
接触させハイブリダイズ(結合)するか否かを調べる。
DNAプローブ素子上にはオリゴマーセットと同じ配列
を持つDNAがセル状に区分けされて並んでおり、検体
DNA中に相補的な配列があればそこに付着する。DN
Aプローブ素子上に捕獲されたDNAを検出(検体のD
NAをあらかじめ蛍光体で標識しておけば、蛍光検出で
きる)し、検体DNAと相補的な配列を持つ複数のオリ
ゴマーを特定する。これらオリゴマーと同じ配列を持
ち、異なる蛍光体で標識されたものを選び最初のプライ
マーとする。このプライマーを起点に複数個所の塩基配
列決定を同時に行い、決定された各配列の3’末端近傍
に相補的なプライマーでそれぞれ異なる蛍光体で標識さ
れたセットを用いて次の塩基配列を決定する。この操作
を繰り返すことにより高効率で長いDNAの塩基配列決
定を行うことができる。
限酵素切断部位あるいはヒトDNA等に現われる繰返し
配列を含みその末端に種々の配列を持った4〜6塩基の
オリゴマーを連結したものを用いるとつごうが良い。あ
るいは、RNAポリメラーゼが認識するプロモーター領
域、例えばTATAボックスやCAATボックス等に相
補的に結合する種々のオリゴヌクレオチド配列を含むセ
ットを用いることで、標的となる長いDNA中のRNA
転写部位を効率良く配列決定できる。あるいは、ペプチ
ド合成の開始点である配列ATGあるいはこれに相補的
な配列CATを一部に持つオリゴヌクレオチドをセット
に用いれば遺伝子のオープンリーディングフレームを認
識する確率が上がるのでタンパク質コード領域の配列を
決定するときにつごうが良い。
る。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的範囲
を限定するものではない。 実施例1 本実施例を図1ないし3を用いて説明する。この実施例
は制限酵素EcoRIの切断個所を利用する例である。
EcoRIは図2記載のように配列GAATTCを認識
し、G−A間を切断する。そこで配列番号1記載の相補
鎖5’GAATTCNNN3’(Nは任意の核酸)を作
りシリコンチップ表面の各セルに固定し、プローブとし
て用いる。NNN中の4種の塩基の並び方は64通りあ
るがこれらを作製し、図1に示すDNAプローブチップ
にマトリックス状に固定する。ここでのオリゴマーの長
さはもっと長くても良い。図1のDNAプローブチップ
は、シリコンウエハー上に形成された64通りのプロー
ブが固定された反応セル1と標識プローブの非特異吸着
量を測定する部位兼マニピュレーションのための他の領
域2からなる。DNAプローブチップの反応部のマトリ
ックスの各セルサイズは1mm×1mmで反応部は8m
m×8mmのサイズである。DNAプローブチップの作
製法は本実施例の最後に示す。これとは別に配列番号2
及び3の蛍光標識付き8あるいは10塩基長からなるプ
ライマー512種のセットを用意する。プライマーセッ
トには、本実施例では配列番号2及び3の512種を用
いたが200〜1000あるいはそれ以上の種類のプラ
イマーが含まれていれば有効である。プライマーは必要
に応じて種々蛍光体で標識されている。この中には種々
制限酵素断片部位を含むプライマーや、繰返し配列の末
端を含むプライマーも含まれる。
断し、切断部に蛍光体を導入する。蛍光体導入法には蛍
光標識ヌクレオチドモノマーをDNAポリメラーゼで導
入する方法、蛍光標識付きオリゴヌクレオチドをライゲ
ーション反応でつける方法、あるいは全DNA鎖にビオ
チンを導入し蛍光標識アビジン等を結合させる方法やエ
テノ化によりDNAを蛍光性に変換する方法があるが、
ここではライゲーションによる蛍光標識オリゴマーの導
入を行う。
プローブチップにハイブリダイズさせ、洗浄後、試料が
ハイブリダイズした部分を蛍光計測により認識する。こ
こで用いた反応等の細略はProc.Natl.Aca
d.Sci.USA Vol88,10089−100
93(1991)の記載と同じである。ハイブリダイズ
シタ部分のDNAプローブと同じ配列を含む蛍光標識プ
ライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例では異
なる蛍光体で標識された2種のプライマーを用いて、目
的DNAを2ヵ所から配列決定を500塩基まで行う。
配列の400塩基長〜500塩基長の範囲の中で手持ち
の512種プライマーセットと一致するものを選び出
し、第2回目以後のシーケンシングを行う。10塩基長
のプライマーの中には10塩基完全に一致するものがな
い場合もあったが、3’末端の8塩基が一致すれば使用
できることが多い。ここで、異なる蛍光波長を持つ蛍光
体で標識したプライマーを用意し、同時に数個所のシー
ケンシングを行い効率を上げることができる。
い、長いDNAの配列を決定する。このように、本発明
では、長いDNAに相補的な複数のプライマーをあらか
じめ用意したプライマーセットの中から選ぶので、効率
良くDNA配列を決定できる。上記実施例に使用するD
NAプローブチップの調製法を示す。まず、シリコンウ
エハー表面を水蒸気酸化する。ここで、水蒸気酸化は次
の工程で表面をアミノシラン化する上で必須であるが、
通常の半導体製造プロセスでの絶縁膜形成のような厚い
酸化層を形成させる必要はない。次に、3−(2−アミ
ノエチルアミノプロピル)トリメトキシシランを用いて
酸化膜表面をアミノシラン化しシリコンウエハー表面に
アミノ基を導入する。アミノ基をトリフルオロアセチル
化して保護する。次に、キノンジアジドを付加したフェ
ノールノボラック系のポジ型レジストを塗布し95℃で
ベークする。このレジストは露光した部分をアルカリ洗
浄で除去できるので、露光、アルカリ洗浄、トリフルオ
ロアセチル基の除去、ポリヌクレオチドプローブの固定
の工程を繰り返すことで異なるプローブをシリコンウエ
ハー上の異なる位置に順次固定することができる。ま
ず、シリコンウエハー表面の第1のセルを350nm〜
400nmの光で露光し、第1のセルのレジストを除去
する。次に、トリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、
分解したレジストを除去する。アミノ基を保護している
トリフルオロアセチル基も同時に除去される。次に、エ
ス.アール.ラスムッセンらの方法(Sφren Ri
chard Rasmussen et al、Ana
litical Biochemistry 198、
128〜142(1991))に従い5’末端にリン酸
基を持つ第1のプローブを固定する。即ち、pH7の1
−メチルイミダゾール緩衝液と0.2Mの1−エチル−
3−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド
の存在下、第1のプローブを5時間50℃で反応させ
る。同様にして第2以降のセルで同様の工程を繰返し第
2〜第64のプローブを固定する。最後に、全てのセル
をトリメチルアンモニウム水溶液で洗浄し、カルボジイ
ミドの副反応物を除去する。以上の工程で、表面に異な
るプローブを固定した複数の独立したセルを有する反応
チップを得る。 実施例2 本実施例はポリペプチドのオープンリーディングフレー
ムの開始コドンあるいはそのアンチコドンに対応するA
TGあるいはCATの配列を含むオリゴヌクレオチドに
相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチドを用いる例
である。
番号4記載の5’末端がATGで他がTTX,TCX,
TAX,TGX,CTX,CCX,CAX,CGX,A
TX,ACX,AAX,AGX,GUX,GCX,GA
X,GGXの3塩基ずつのランダムな組合せで構成され
ている塩基長12のオリゴヌクレオチドを含み、5’末
端にはスペーサーを介してアミノ基が結合している。よ
って本実施例で使用するポリヌクレオチドプローブは4
096種類である。ここで、Xはスペーサーで各塩基と
特異的に結合しない物質が用いられる。各プローブを実
施例1の手法に従い反応チップの各セルに固定する。D
NAプローブチップの反応部のマトリックスの各セルサ
イズは0.5mm×0.5mmで反応部は32mm×3
2mmのサイズである。目的とするDNAを実施例1と
同様にNotIで切断し、切断部を蛍光体を導入する。
本実施例では以下の方法により蛍光体標識して用いる。
まずアナリティカル バイオケミストリー記載のラリー
イー.モリソン等の方法(Larry E. Mor
rison et al.、AnalyticalBi
ochemistry 183、231−244(19
89))に従い、T4ポリメラーゼ キナーゼを用いて
上試料ポリヌクレオチドの5’末端にリン酸基を導入す
る。
チルアミノプロピル)カルボジイミドと0.5M エチ
レンジアミンを含むpH6の溶液中で18時間反応させ
5’末端にアミノ基を導入する。エタノール沈殿を繰返
し未反応のエチレンヂアミン等を除いた後、20%のア
セトニトリルを含むpH9の0.1M 炭酸緩衝液中
で、終濃度20mM の蛍光体、スルホローダミン10
1酸クロライド(標的オリゴヌクレオチドの60ないし
100倍モル量)を反応させる。エタノール沈殿等で未
反応のスルホローダミン101等を除いて5’末端がス
ルホローダミン101標識されたポリヌクレオチド試料
を得る。
種類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップ
に実施例1に従いハイブリダイゼーション条件下で反応
させる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄
して除く。本実施例では、プローブの12塩基長(5’
末端のスペーサーをいれなければ11塩基長)の配列の
うち標的となるDNAと相補的に結合するのは9塩基の
みであるが、問題なくハイブリダイゼーションできる。
結合部を、He/Neレーザー(594nm)(あるい
はNaランプなど)と光電子増倍管(あるいは高感度ラ
インセンサーやエリアセンサー)を用いて反応チップか
ら発する蛍光を測定し、その蛍光強度より標識DNAが
ハイブリダイズしたセルを確認する。もちろん他の光源
と蛍光体の組みあわせを用いてもよい。
のDNAプローブと同じ配列を持つ蛍光標識プライマー
を用いてシーケンス反応を行う。実施例では異なる蛍光
体で標識された2種のプライマーを用いて、目的DNA
を2ヵ所から配列決定を500塩基まで行った。ここ
で、標識プライマーの12塩基長(5’末端のスペーサ
ーをいれなければ11塩基長)の配列のうち標的となる
DNAと相補的に結合するのは9塩基のみであるが、
3’末端側の5塩基は確実に標的DNAと相補鎖を形成
するのでポリメラーゼ反応を用いたシーケンシングは十
分可能である。
00塩基長の範囲の中で手持ちの512種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例1と同様
にして順次2回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的ポリヌクレオチドのATGで
始まる塩基長11の領域の可能な全ての配列を網羅して
いるため、配列が未知のDNAに用いることのできる標
識プライマーを検索することができる利点がある。さら
に標的ポリヌクレオチドのATGで始まる領域はDNA
中のオープンリーディングフレームの開始コドンの可能
性があるので、ランダムの配列決定を行ってもDNA中
のポリペプチドをコードしている領域の配列をシーケン
シングする確率を高めることができる。 実施例3 本実施例で用いるプライマーセットはRNAポリメラー
ゼが認識するプロモーター領域の相補鎖に相補的に結合
するオリゴヌクレオチドで、その配列は配列番号5に示
すようにTATANANNからなる。Nは任意の核酸で
あるので、このオリゴヌクレオチドの塩基の並び方は6
4通りあリ、実施例1と同様にシリコンウエハー製のD
NAプローブチップ表面にマトリックス状に固定し、プ
ローブとして用いるとともに、5’末端に蛍光標識を導
入してプライマーとして用いる。
tIで切断し、切断部を蛍光体を導入する。本実施例で
は以下の方法によりスルホローダミン101酸クロライ
ドで蛍光標識して用いる。標識したDNAを上記64種
類のプローブを各セルに固定した上記プローブチップに
実施例1に従いハイブリダイゼーション条件下で反応さ
せる。非特異吸着した該ポリヌクレオチド試料を洗浄し
て除く。
蛍光を測定し、その蛍光強度より標識DNAがハイブリ
ダイズしたセルを確認する。実施例1と同様にハイブリ
ダイズした部分のDNAプローブと同じ配列を持つ蛍光
標識プライマーを用いてシーケンス反応を行う。実施例
では異なる蛍光体で標識された2種のプライマーを用い
て、目的DNAを2ヵ所から配列決定を500塩基まで
行う。
00塩基長の範囲の中で手持ちの512種プライマーセ
ットと一致するものを選び出し、以後は実施例1と同様
にして順次2回目以後のシーケンシングを行う。このよ
うに本発明では異なるポリヌクレオチド試料はチップ上
の異なるセルに結合することになる。本実施例で用いる
プローブ固定チップは標的DNAの通常TATAボック
スあるいはホネス(Hogness)ボックスとよばれ
るプロモーター配列のほぼ半分を網羅しているため、未
知のDNAのプロモーター領域及びその下流に位置する
転写領域、即ちRNAの配列をシーケンシングする確率
を高めることができる利点がある。本実施例ではプロモ
ーターとしてTATAボックスに相補的な配列を認識す
るオリゴマーセットを用いたが、他のプロモーター領域
に相補的な配列を認識するオリゴマーセットでももちろ
ん良い結果が得られる。
配列を決定する際、蛍光標識プライマーセットを用いて
複数個所の配列決定を同時に行い、決定された中から次
のプライマーを選んで決定塩基長を伸ばすことにより効
率良く長いDNAの塩基配列を決定できる。
の都度合成する必要もなく、迅速にシーケンシングを行
える。さらに酵素切断部位からの配列決定あるいはヒト
遺伝子中に現われる繰返し配列に接続する塩基配列など
をクローニング等の手間をかけずに決定することができ
る。あるいは未知のDNA試料に体してRNA転写のプ
ロモーター部位やポリペプチド翻訳開始部位の配列を認
識するセットを用いることでRNA転写部位やポリペプ
チドコーディング領域を優先的に解析する確率を高める
ことができる。
CX,TAX,TGX,CTX,CCX,CAX,CG
X,ATX,ACX,AAX,AGX,GUX,GC
X,GAX,GGX (Xはスペーサー) 配列 ATGOPQ 配列番号 5 配列の長さ 8 配列の型 核酸 鎖の数 1 トポロジー 直鎖 配列の種類 合成DNAプライマー 配列の特徴 配列中のNは任意のACGT 配列 TATANANN
す図。
す図。
Claims (7)
- 【請求項1】 核酸塩基配列決定において、ゲノム中に
繰り返し現れる配列に相補的な配列を含み、かつその3
, 末端側に前記配列と異なるオリゴヌクレオチド配列を
含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーセットを用
いる核酸塩基配列決定法。 - 【請求項2】 ゲノム中に繰り返し現われる配列が、制
限酵素の切断部の配列である請求項1記載の核酸塩基配
列決定法。 - 【請求項3】 ゲノム中に繰り返し現われる配列が、A
luの配列である請求項1記載の核酸塩基配列決定法。 - 【請求項4】 請求項1のプライマーセットの少なくと
も一部が、RNAポリメラーゼが認識するプロモーター
領域に相補的に結合する配列を含むオリゴヌクレオチド
からなることを特徴とする核酸塩基配列決定法。 - 【請求項5】 請求項1のプライマーセットの少なくて
も一部が、ATGあるいはCATの配列を持つオリゴヌ
クレオチドに相補的に結合する配列のオリゴヌクレオチ
ドであることを特徴とする核酸塩基配列決定法。 - 【請求項6】 プライマーセットに含まれるプライマー
が、蛍光体で標識されていることを特徴とする上記請求
項1、2、3、4または5の核酸塩基配列決定法。 - 【請求項7】 プライマーセットにあるのと同じ配列を
持つオリゴヌクレオチドプローブを固定したチップを用
いて、プライマーの選別を行うことを特徴とする上記請
求項1、2、3、4、5または6の核酸塩基配列決定
法。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4180095A JPH0622798A (ja) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | 塩基配列決定法 |
US08/465,181 US5741644A (en) | 1992-07-07 | 1995-06-05 | DNA sequencing by extension of probe chip immobilized oligonucleotides |
US08/969,163 US5935794A (en) | 1992-07-07 | 1997-11-12 | Method of DNA base sequence determination |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4180095A JPH0622798A (ja) | 1992-07-07 | 1992-07-07 | 塩基配列決定法 |
Publications (1)
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