JPH0622792A - 微生物の検出方法 - Google Patents
微生物の検出方法Info
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- JPH0622792A JPH0622792A JP3860893A JP3860893A JPH0622792A JP H0622792 A JPH0622792 A JP H0622792A JP 3860893 A JP3860893 A JP 3860893A JP 3860893 A JP3860893 A JP 3860893A JP H0622792 A JPH0622792 A JP H0622792A
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- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ナイセリア・ゴノレ及びナイセリア・メニン
ギチジスの分別検出法を提供する。 【構成】 存在の疑われる試料に、レクチンを添加し
て、凝集反応の有無により、ナイセリア・ゴノレ及びナ
イセリア・メニンギチジスの存在を確認し、次いで、そ
の試料について、各微生物に存在する酵素に対して特異
的に反応する基質と接触させて、その反応の有無によ
り、各微生物の存在を確認する。
ギチジスの分別検出法を提供する。 【構成】 存在の疑われる試料に、レクチンを添加し
て、凝集反応の有無により、ナイセリア・ゴノレ及びナ
イセリア・メニンギチジスの存在を確認し、次いで、そ
の試料について、各微生物に存在する酵素に対して特異
的に反応する基質と接触させて、その反応の有無によ
り、各微生物の存在を確認する。
Description
【０００１】本発明は微生物、特にナイセリア・ゴノレ
（Neisseria gonorrhoeae)（N. g.)及び（又は）ナイセ
リア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis) （N.
m.)の検出法に関する。
（Neisseria gonorrhoeae)（N. g.)及び（又は）ナイセ
リア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis) （N.
m.)の検出法に関する。
【０００２】
【従来の技術】N.g.感染の有無の検出のための公知の一
方法は被検試料をレクチン（lectin)（抗体様活性物
質）又は小麦胚芽のアグルチニン（wheat germ aggluti
nin)（ＷＧＡ）と接触させて微生物を凝集させる方法で
ある。ドイル（Doyle)等の米国特許第4298689 号明細書
開示の方法においてＷＧＡと試料との凝集反応の存在は
N.g.菌の存在の推定的表示であると記載されている。こ
の試験法に関するひとつの問題がカーチス等の報文（Cu
rtis, G. D. W., et al., Br. J. Vener. Dis., １９８
１；５７：２５３−５）中に報告されている。該報文
は、N.g.以外の微生物例えばナイセリア・メニンギチジ
ス（N.m.) もレクチン凝集菌株であるので上記の試験方
法はN.g.の同定用として信頼し得ないと述べている。こ
の試験法に関する他の問題は試料の自動的凝集が起るこ
とがあることである。この事実はN.g.の同定可能性の確
率を増大させるために新鮮な単離物を使用する必要があ
ることを示す。さもないと、N.g.感染の診断を或程度誤
る怖れがあり得る。
方法は被検試料をレクチン（lectin)（抗体様活性物
質）又は小麦胚芽のアグルチニン（wheat germ aggluti
nin)（ＷＧＡ）と接触させて微生物を凝集させる方法で
ある。ドイル（Doyle)等の米国特許第4298689 号明細書
開示の方法においてＷＧＡと試料との凝集反応の存在は
N.g.菌の存在の推定的表示であると記載されている。こ
の試験法に関するひとつの問題がカーチス等の報文（Cu
rtis, G. D. W., et al., Br. J. Vener. Dis., １９８
１；５７：２５３−５）中に報告されている。該報文
は、N.g.以外の微生物例えばナイセリア・メニンギチジ
ス（N.m.) もレクチン凝集菌株であるので上記の試験方
法はN.g.の同定用として信頼し得ないと述べている。こ
の試験法に関する他の問題は試料の自動的凝集が起るこ
とがあることである。この事実はN.g.の同定可能性の確
率を増大させるために新鮮な単離物を使用する必要があ
ることを示す。さもないと、N.g.感染の診断を或程度誤
る怖れがあり得る。
【０００３】N.g.及びN.m.のアミノペプチダーゼに関す
る性質は既に研究されており、クロモゲン（色原体）含
有基質の使用によりN.g.とN.m.とを区別し得ること及び
その測定が再現可能であることが報告されている〔Perr
ine, S., and Watson, R. R., Abstracts of the Annua
l Meeting of the American Society for Microbiolgy,
p. ３９（１９７５）〕。即ち、ガンマ−グルタミル−
アミノペプチダーゼ（ＧＧＡ）はN.g.には存在しないか
ら、該ＧＧＡを含む基質の反応生成物の存在はN.m.を含
むけれども、N.g.を含まない試料の陽性表示であること
が該報文に開示されている。もしこの試験結果が陽性で
あればそれは試料がN.m.を含みN.g.を含まないことを示
す。けれどもその試験結果が陰性であればN.g.が試験中
に存在するか否かは確定されない。この試験法に関する
他の問題はガンマ−グルタミル−アミノペプチダーゼ活
性の検出のための公知の基質はその反応に当り長時間、
例えば３７℃で２時間の恒温保持を要するので比較的遅
い試験であることである。
る性質は既に研究されており、クロモゲン（色原体）含
有基質の使用によりN.g.とN.m.とを区別し得ること及び
その測定が再現可能であることが報告されている〔Perr
ine, S., and Watson, R. R., Abstracts of the Annua
l Meeting of the American Society for Microbiolgy,
p. ３９（１９７５）〕。即ち、ガンマ−グルタミル−
アミノペプチダーゼ（ＧＧＡ）はN.g.には存在しないか
ら、該ＧＧＡを含む基質の反応生成物の存在はN.m.を含
むけれども、N.g.を含まない試料の陽性表示であること
が該報文に開示されている。もしこの試験結果が陽性で
あればそれは試料がN.m.を含みN.g.を含まないことを示
す。けれどもその試験結果が陰性であればN.g.が試験中
に存在するか否かは確定されない。この試験法に関する
他の問題はガンマ−グルタミル−アミノペプチダーゼ活
性の検出のための公知の基質はその反応に当り長時間、
例えば３７℃で２時間の恒温保持を要するので比較的遅
い試験であることである。
【０００４】ホリス等の報文〔Hollis, D. G., et al.,
Appl. Microbiol.,１７：７１−７７（１９６９）〕は
ラクトース資化性のナイセリア菌（N.l.) を記載し；コ
ルベット等の報文〔Corbett, P. 及び Ulivelli, A.,
J. Bacteriol., ９５：５２−５７（１９６８）〕は、
ラクトース−陽性ナイセリアのガラクトシダーゼ活性を
記載している。ベーターガラクトシダーゼ活性の検出に
用いられる基質のひとつはＯ−ニトロフェニル−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）である〔LeMinor,L., an
d Ben Hamida, F., Ann. Inst. Pasteur,１０２：２６
７（１９６２）〕。
Appl. Microbiol.,１７：７１−７７（１９６９）〕は
ラクトース資化性のナイセリア菌（N.l.) を記載し；コ
ルベット等の報文〔Corbett, P. 及び Ulivelli, A.,
J. Bacteriol., ９５：５２−５７（１９６８）〕は、
ラクトース−陽性ナイセリアのガラクトシダーゼ活性を
記載している。ベーターガラクトシダーゼ活性の検出に
用いられる基質のひとつはＯ−ニトロフェニル−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）である〔LeMinor,L., an
d Ben Hamida, F., Ann. Inst. Pasteur,１０２：２６
７（１９６２）〕。
【０００５】組織化学的細胞染色のためにロイシン−４
−メトキシ−ベータ−ナフチルアミドを用いるロイシン
−アミノペプチダーゼの検出も又公知である〔Nachlas,
M.M., et al., J. Biophys. Biochem. Cytol.,７：２
６１（１９６９）〕。
−メトキシ−ベータ−ナフチルアミドを用いるロイシン
−アミノペプチダーゼの検出も又公知である〔Nachlas,
M.M., et al., J. Biophys. Biochem. Cytol.,７：２
６１（１９６９）〕。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、N.g.
及びN.m.の存在が疑われている微生物の分別検出のため
の迅速で正確な試験方法の提供にある。更に、本発明の
別の目的は試料中の微生物の自動的凝集のメカニズムを
逆転させる方法を提供し、それによって凝集試験法にお
ける偽陽性表示を減ずることにある。本発明のそれ以外
の目的及び態様は本発明の好適な以下の具体化によって
明かとなろう。
及びN.m.の存在が疑われている微生物の分別検出のため
の迅速で正確な試験方法の提供にある。更に、本発明の
別の目的は試料中の微生物の自動的凝集のメカニズムを
逆転させる方法を提供し、それによって凝集試験法にお
ける偽陽性表示を減ずることにある。本発明のそれ以外
の目的及び態様は本発明の好適な以下の具体化によって
明かとなろう。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の上記の諸目的に
そって試料中のN.g.菌及びN.m.菌の分別検出の一方法が
提供される。第１工程においてＮ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースと反応して凝
集生成物を与える型のレクチンと被検試料の一部とを反
応させる。これとは別のレクチン試験法を好適に使用す
るが、これはN.g.に対するＷＧＡ試験法並びに病原性ナ
イセリアに関するレクチン確認試験法〔この方法におい
ては大豆アグルチニン（ＳＢＡ）、バレイショのソラニ
ウムツベロソムアグルチニン（Solanium Tuberosom agg
lutinin)（ＳＴＡ）及びバレイショのレクチンのいずれ
か単独又は組合せを使用する〕を含む。N.g.とN.m.との
分別のために試料を別個の部分（複数）に分け、これら
の部分と“N.g.及びN.m.中に存在する互いに異る夫々の
酵素に対して特異的な基質”とを反応させ、反応生成物
をジアゾ染料とカップリングさせて呈色させる。迅速に
反応するN.m.及びN.g.用の好適基質は夫々ガンマ−グル
タミル−ナフチルアミド及びプロリン−ナフチルアミド
であって、双方共に電子供与基によりその４位及び（又
は）６位を置換されているものである。
そって試料中のN.g.菌及びN.m.菌の分別検出の一方法が
提供される。第１工程においてＮ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースと反応して凝
集生成物を与える型のレクチンと被検試料の一部とを反
応させる。これとは別のレクチン試験法を好適に使用す
るが、これはN.g.に対するＷＧＡ試験法並びに病原性ナ
イセリアに関するレクチン確認試験法〔この方法におい
ては大豆アグルチニン（ＳＢＡ）、バレイショのソラニ
ウムツベロソムアグルチニン（Solanium Tuberosom agg
lutinin)（ＳＴＡ）及びバレイショのレクチンのいずれ
か単独又は組合せを使用する〕を含む。N.g.とN.m.との
分別のために試料を別個の部分（複数）に分け、これら
の部分と“N.g.及びN.m.中に存在する互いに異る夫々の
酵素に対して特異的な基質”とを反応させ、反応生成物
をジアゾ染料とカップリングさせて呈色させる。迅速に
反応するN.m.及びN.g.用の好適基質は夫々ガンマ−グル
タミル−ナフチルアミド及びプロリン−ナフチルアミド
であって、双方共に電子供与基によりその４位及び（又
は）６位を置換されているものである。
【０００８】上記試験法はN.l.菌に対する試験法と組合
せて使用され得る。N.l.菌は試料の一部と“ベーターガ
ラクトシダーゼ（ＢＧ）酵素と反応する基質”とを接触
させることにより検出され、次にこの酵素（基質に対し
て反応する酵素）により生成する反応生成物の存在を検
出し、かようにして試料がN.l.を含有することの陽性表
示とするのである。好適基質はＯＮＰＧである。更に４
−及び（又は）６−位に置換基をもつグリシル−プロリ
ル−ナフチルアミドを使用してブランハメラ・カタラリ
ス（Branhamella catarrhalis)（Ｂ．ｃ．）に対する試
験も遂行され得る。
せて使用され得る。N.l.菌は試料の一部と“ベーターガ
ラクトシダーゼ（ＢＧ）酵素と反応する基質”とを接触
させることにより検出され、次にこの酵素（基質に対し
て反応する酵素）により生成する反応生成物の存在を検
出し、かようにして試料がN.l.を含有することの陽性表
示とするのである。好適基質はＯＮＰＧである。更に４
−及び（又は）６−位に置換基をもつグリシル−プロリ
ル−ナフチルアミドを使用してブランハメラ・カタラリ
ス（Branhamella catarrhalis)（Ｂ．ｃ．）に対する試
験も遂行され得る。
【０００９】本発明に従い各種ナイセリア菌、即ち、N.
g., N.m., N.l.及びB.c.に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素試験法
による確認試験と組合せたレクチン凝集試験法を用い
る。選択された培地、例えばタイア−マアチン（Thayer
-Martin)培地、の上で微生物を生育させた後にグラム染
色とオキシダーゼテストとを行って該微生物がグラム陰
性双球菌であること、オキシダーゼテスト陽性であるこ
とを決定する。これはN.g., N.m., N.l.及び（又は）B.
c.存在可能性の推定表示である。試料の一部を用いて適
宜の型のレクチンを用いる凝集によりN.g.又はN.m.菌の
存在を試験する。この目的のためにＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースに対して
反応する型の１種又は複数種のレクチンを選ぶ。該菌の
凝集反応の存在は試料がN.g.か又はN.m.か又はそれら両
者を含むことの陽性表示である。
g., N.m., N.l.及びB.c.に対する迅速で正確な試験方法
が提供される。好ましい態様においては迅速酵素試験法
による確認試験と組合せたレクチン凝集試験法を用い
る。選択された培地、例えばタイア−マアチン（Thayer
-Martin)培地、の上で微生物を生育させた後にグラム染
色とオキシダーゼテストとを行って該微生物がグラム陰
性双球菌であること、オキシダーゼテスト陽性であるこ
とを決定する。これはN.g., N.m., N.l.及び（又は）B.
c.存在可能性の推定表示である。試料の一部を用いて適
宜の型のレクチンを用いる凝集によりN.g.又はN.m.菌の
存在を試験する。この目的のためにＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオースに対して
反応する型の１種又は複数種のレクチンを選ぶ。該菌の
凝集反応の存在は試料がN.g.か又はN.m.か又はそれら両
者を含むことの陽性表示である。
【００１０】上記のナイセリア菌の或る菌株は自動的凝
集の傾向を有する。試料の一部分についてこれがレクチ
ン不在下に自動的凝集を起すか否かを測定してみるべき
である。もし自動的凝集が起れば、本発明に従い、自動
的凝集のメカニズムを逆転させる目的で、レクチン凝集
以前に試料を前処理するための処理法が提供される。該
処理法のひとつにおいては試料と粗又は純粋なＤＮＡ′
アーゼ又はＤＮＡ′アーゼ含有品とを有効濃度（例えば
１mg／ml）において反応させる。他の処理方法において
は試料中の微生物に対し陰性電荷を与える物質を反応さ
せて凝集体の中の個々の微生物を相互に反撥させる。適
当な陰性電荷付与剤には適宜濃度（例えば0.２５mg／m
l）の無水コハク酸が含まれる。
集の傾向を有する。試料の一部分についてこれがレクチ
ン不在下に自動的凝集を起すか否かを測定してみるべき
である。もし自動的凝集が起れば、本発明に従い、自動
的凝集のメカニズムを逆転させる目的で、レクチン凝集
以前に試料を前処理するための処理法が提供される。該
処理法のひとつにおいては試料と粗又は純粋なＤＮＡ′
アーゼ又はＤＮＡ′アーゼ含有品とを有効濃度（例えば
１mg／ml）において反応させる。他の処理方法において
は試料中の微生物に対し陰性電荷を与える物質を反応さ
せて凝集体の中の個々の微生物を相互に反撥させる。適
当な陰性電荷付与剤には適宜濃度（例えば0.２５mg／m
l）の無水コハク酸が含まれる。
【００１１】従前技術においてN.g.存在下の凝集の目的
の達成のために想定されたレクチンはＷＧＡである。け
れどもＷＧＡ存在下ですべてのN.g.菌が凝集するわけで
はないことが見出された。偽陰性の凝集結果の問題を解
決するためには異る諸試験において異るレクチン（複
数）を用いることが好ましい。適切な補助的なレクチン
試験法においては試料の一部と病源性ナイセリア（N.
m., N.g., N.l.及びB.c.）を凝集させるレクチンとを混
合する。この試験法は非特異的であるけれどもＷＧＡ試
験法は偽陰性結果を与えることを技術者に警告する働き
をする。この補助試験のために適切なレクチンはＳＢＡ
又はＳＴＡの夫々単独又はそれらの組合せである。
の達成のために想定されたレクチンはＷＧＡである。け
れどもＷＧＡ存在下ですべてのN.g.菌が凝集するわけで
はないことが見出された。偽陰性の凝集結果の問題を解
決するためには異る諸試験において異るレクチン（複
数）を用いることが好ましい。適切な補助的なレクチン
試験法においては試料の一部と病源性ナイセリア（N.
m., N.g., N.l.及びB.c.）を凝集させるレクチンとを混
合する。この試験法は非特異的であるけれどもＷＧＡ試
験法は偽陰性結果を与えることを技術者に警告する働き
をする。この補助試験のために適切なレクチンはＳＢＡ
又はＳＴＡの夫々単独又はそれらの組合せである。
【００１２】最高の正確度の達成のために各種の病原性
ナイセリアを区別する場合に上記のレクチン試験とひと
つ又は複数の確認試験との組合せが重要であることが見
出された。本発明に従えば確認試験のひとつはN.m.がＧ
ＧＡ酵素活性を持つけれどもプロリン−アミノペプチダ
ーゼ（ＰＡ）活性を持たないという知識からみちびかれ
た。逆にN.g.はＰＡ活性をもつがＧＧＡ活性をもたな
い。従ってＧＧＡと反応するがＰＡと反応しない基質は
被検試料がN.m.を含むけれどもN.g.を含まないことの陽
性表示として利用され得る。詳言すればかような基質を
試料の一部に添加したとき基質と試料との反応生成物の
存在は該試料がN.m.を含みN.g.を含まないということの
陽性表示である。アミノ酸ベータ−ナフチルアミドは酵
素存在の表示としてベータ−ナフチルアミンクロモーゲ
ンを放出する基質であることが公知である。けれどもこ
の類の公知の基質例えばガンマ−グルタミル−ベータ−
ナフチルアミドはジアゾ染料とのカップリングによる呈
色定量のために３７℃で２時間もの長時間の恒温保持を
必要とする。該基質はジアゾ染料の添加により変色を起
す。基質−酵素反応の検出のための他の一方法において
は放出されたナフチルアミンを蛍光検出する方法を採用
し得る。
ナイセリアを区別する場合に上記のレクチン試験とひと
つ又は複数の確認試験との組合せが重要であることが見
出された。本発明に従えば確認試験のひとつはN.m.がＧ
ＧＡ酵素活性を持つけれどもプロリン−アミノペプチダ
ーゼ（ＰＡ）活性を持たないという知識からみちびかれ
た。逆にN.g.はＰＡ活性をもつがＧＧＡ活性をもたな
い。従ってＧＧＡと反応するがＰＡと反応しない基質は
被検試料がN.m.を含むけれどもN.g.を含まないことの陽
性表示として利用され得る。詳言すればかような基質を
試料の一部に添加したとき基質と試料との反応生成物の
存在は該試料がN.m.を含みN.g.を含まないということの
陽性表示である。アミノ酸ベータ−ナフチルアミドは酵
素存在の表示としてベータ−ナフチルアミンクロモーゲ
ンを放出する基質であることが公知である。けれどもこ
の類の公知の基質例えばガンマ−グルタミル−ベータ−
ナフチルアミドはジアゾ染料とのカップリングによる呈
色定量のために３７℃で２時間もの長時間の恒温保持を
必要とする。該基質はジアゾ染料の添加により変色を起
す。基質−酵素反応の検出のための他の一方法において
は放出されたナフチルアミンを蛍光検出する方法を採用
し得る。
【００１３】アミノ酸ナフチルアミド基質のカップリン
グ反応の速度は下記構造式：
グ反応の速度は下記構造式：
【００１４】
【化１】
【００１５】で示される通り、その４−位、６−位又は
それら両位置を電子供与基Ｒ（例えば、メトキシのよう
なアルコキシ基、ヒドロキシル基又はハロゲン）で置換
することにより大きく増加することが見出された。従っ
て、N.m.のガンマ−グルタミルアミノペプチダーゼ酵素
に対する有効基質はガンマ−グルタミル−４−アルコキ
シ−ベータ−ナフチルアミド、特にそのアルコキシ基が
メトキシ基であるものである。該基質と適切なジアゾカ
ップリング物質とを使用すれば同濃度の反応体について
温度３７℃で１０分間以下の恒温保持で変色が起る。N.
m.に対する酵素−基質反応試験と類似の該反応試験がN.
g.についても使用され得る。この試験の遂行のためにN.
g.のプロリン−アミノペプチダーゼ酵素に対する基質を
試料の一部に加える。未置換のプロリン−ベータ−ナフ
チルアミドを使用し得るけれども迅速反応の基質は既述
の型の電子供与基で４−位、６−位、又はそれら両位置
を置換した化合物を包含する。特に有効な基質はプロリ
ン−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミド、特にそ
の４−メトキシ化合物、を包含する。
それら両位置を電子供与基Ｒ（例えば、メトキシのよう
なアルコキシ基、ヒドロキシル基又はハロゲン）で置換
することにより大きく増加することが見出された。従っ
て、N.m.のガンマ−グルタミルアミノペプチダーゼ酵素
に対する有効基質はガンマ−グルタミル−４−アルコキ
シ−ベータ−ナフチルアミド、特にそのアルコキシ基が
メトキシ基であるものである。該基質と適切なジアゾカ
ップリング物質とを使用すれば同濃度の反応体について
温度３７℃で１０分間以下の恒温保持で変色が起る。N.
m.に対する酵素−基質反応試験と類似の該反応試験がN.
g.についても使用され得る。この試験の遂行のためにN.
g.のプロリン−アミノペプチダーゼ酵素に対する基質を
試料の一部に加える。未置換のプロリン−ベータ−ナフ
チルアミドを使用し得るけれども迅速反応の基質は既述
の型の電子供与基で４−位、６−位、又はそれら両位置
を置換した化合物を包含する。特に有効な基質はプロリ
ン−４−アルコキシ−ベータ−ナフチルアミド、特にそ
の４−メトキシ化合物、を包含する。
【００１６】B.c.については他の類似の酵素−基質反応
試験を使用し得る。この試験に当りN.g.のグリシル−プ
ロリル−アミノペプチダーゼ酵素部分に対する基質を試
料の一部に加える。迅速検出用の基質は４−位、６−
位、又は両位置を既述の型の電子供与基で置換したグリ
シル−プロリル−ナフチルアミドを包含する。特に有効
な基質はグリシル−プロリル−４−アルコキシ−ベータ
−ナフチルアミド、特にその４−メトキシ化合物であ
る。本発明の他の特徴的態様は上記のレクチン凝集反応
とＧＧＡ酵素試験との組合せの試験方法である。該方法
において試料中のN.l.菌の存在は試料の一部と“ＢＧ酵
素（この酵素はN.l.菌体上に存在する) と反応する基
質”とを接触させることにより検出される。N.l.菌体中
のＢＧ酵素と基質との反応生成物は該試料がN.l.菌を有
することの陽性表示である。この目的にかなう適切な基
質はＯＮＰＧ、そのブロモクロロ−インドキシル誘導体
及びそのベータ−ナフチル誘導体を包含する。特異的基
質はＯ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ
−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェノー
ルフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−
４−クロロ−インドイル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ブ
ロモチモールフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド及び
ナフチル−ガラクトピラノシドを包含する。総括すると
病源性ナイセリア（N.m., N.g., B.c.又はN.l.) に対す
る特異的分別試験の四方法が次表に示される：
試験を使用し得る。この試験に当りN.g.のグリシル−プ
ロリル−アミノペプチダーゼ酵素部分に対する基質を試
料の一部に加える。迅速検出用の基質は４−位、６−
位、又は両位置を既述の型の電子供与基で置換したグリ
シル−プロリル−ナフチルアミドを包含する。特に有効
な基質はグリシル−プロリル−４−アルコキシ−ベータ
−ナフチルアミド、特にその４−メトキシ化合物であ
る。本発明の他の特徴的態様は上記のレクチン凝集反応
とＧＧＡ酵素試験との組合せの試験方法である。該方法
において試料中のN.l.菌の存在は試料の一部と“ＢＧ酵
素（この酵素はN.l.菌体上に存在する) と反応する基
質”とを接触させることにより検出される。N.l.菌体中
のＢＧ酵素と基質との反応生成物は該試料がN.l.菌を有
することの陽性表示である。この目的にかなう適切な基
質はＯＮＰＧ、そのブロモクロロ−インドキシル誘導体
及びそのベータ−ナフチル誘導体を包含する。特異的基
質はＯ−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ
−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシド、フェノー
ルフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−
４−クロロ−インドイル−Ｄ−ガラクトピラノシド、ブ
ロモチモールフタレイン−Ｄ−ガラクトピラノシド及び
ナフチル−ガラクトピラノシドを包含する。総括すると
病源性ナイセリア（N.m., N.g., B.c.又はN.l.) に対す
る特異的分別試験の四方法が次表に示される：
【００１７】
【表１】 表１ ────────────────────────────────── 基 質 N.m. N.g. B.c. N.l. ────────────────────────────────── ＯＮＰＧ − − − ＋ プロリン−ナフチルアミド* − ＋ − − ガンマ−グルタミル−ナフチルアミド* ＋ − − − グリシル−プロリル−ナフチルアミド* − − ＋ − ────────────────────────────────── （注）＊４−位又は６−位を電子供与基で置換されてい
ることを示す。 記号＋は特定のナイセリア菌との陽性反応を示す。 記号−は特定のナイセリア菌との不反応を示す。
ることを示す。 記号＋は特定のナイセリア菌との陽性反応を示す。 記号−は特定のナイセリア菌との不反応を示す。
【００１８】基質−酵素反応生成物を着色型へ転化させ
るための適当なジアゾカップリング染料は下記の諸物質
を包含する：４−アミノ−２，５−ジメトキシ−４′−
ニトロアゾベンゼンジアゾニウム塩；テトラアゾ化され
たＯ−ジアニシジン；ジアゾ化された４′−アミノ−
２′，５′−ジエトキシベンズアニリドの塩化亜鉛塩；
４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジメトキシアニリン塩
化亜鉛塩のジアゾ化物；Ｏ−アミノアゾトルエンのジア
ゾニウム塩〔ファストガーネット（Fast Garnet)という
名称で公知である〕；アントラキノン−１−ジアゾニウ
ムクロリド；５−ニトロ−２−アミノ−メトキシベンゼ
ンジアゾテート；Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−４−メトキシ
メタニルアミドのジアゾニウム塩；２−アミノ−４−メ
トキシベンズアミドのジアゾニウム塩；ジアゾ−２−ア
ミノ−５−クロロアニソール、即ち、ジアゾ−５−クロ
ロ−Ｏ−アニシジン；５−クロロ−２−トルイジンジア
ゾニウムクロリドの半塩化亜鉛塩；５−クロロ−４−ベ
ンズアミド−２−メチルベンゼンジアゾニウムクロリド
の半塩化亜鉛塩；６−ベンズアミド−５−メトキシ−ｍ
−トルイジンジアゾニウムクロリド；及びその他のジア
ゾニウム塩。
るための適当なジアゾカップリング染料は下記の諸物質
を包含する：４−アミノ−２，５−ジメトキシ−４′−
ニトロアゾベンゼンジアゾニウム塩；テトラアゾ化され
たＯ−ジアニシジン；ジアゾ化された４′−アミノ−
２′，５′−ジエトキシベンズアニリドの塩化亜鉛塩；
４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジメトキシアニリン塩
化亜鉛塩のジアゾ化物；Ｏ−アミノアゾトルエンのジア
ゾニウム塩〔ファストガーネット（Fast Garnet)という
名称で公知である〕；アントラキノン−１−ジアゾニウ
ムクロリド；５−ニトロ−２−アミノ−メトキシベンゼ
ンジアゾテート；Ｎ′，Ｎ′−ジエチル−４−メトキシ
メタニルアミドのジアゾニウム塩；２−アミノ−４−メ
トキシベンズアミドのジアゾニウム塩；ジアゾ−２−ア
ミノ−５−クロロアニソール、即ち、ジアゾ−５−クロ
ロ−Ｏ−アニシジン；５−クロロ−２−トルイジンジア
ゾニウムクロリドの半塩化亜鉛塩；５−クロロ−４−ベ
ンズアミド−２−メチルベンゼンジアゾニウムクロリド
の半塩化亜鉛塩；６−ベンズアミド−５−メトキシ−ｍ
−トルイジンジアゾニウムクロリド；及びその他のジア
ゾニウム塩。
【００１９】
【実施例】本発明に従う検出法の一例は下記の通りであ
る。タイア−マアチン平面培地上に生育させた一試料を
被検物とした。この試料微生物をグラム染色し、このタ
イア−マアチン平面培地からグラム陰極双球菌の純粋培
養が得られたことを確認した。オキシダーゼテストを行
ってこの微生物がオキシダーゼ陽性であることを確証し
た。形態学的に類似する多数のコロニーを除去してから
適宜の緩衝物質、例えばリン酸塩でpH7.２で緩衝された
試験管内の食塩溶液の中で乳化させた。
る。タイア−マアチン平面培地上に生育させた一試料を
被検物とした。この試料微生物をグラム染色し、このタ
イア−マアチン平面培地からグラム陰極双球菌の純粋培
養が得られたことを確認した。オキシダーゼテストを行
ってこの微生物がオキシダーゼ陽性であることを確証し
た。形態学的に類似する多数のコロニーを除去してから
適宜の緩衝物質、例えばリン酸塩でpH7.２で緩衝された
試験管内の食塩溶液の中で乳化させた。
【００２０】この細菌懸濁物の最終的な混濁度はマクフ
ァランド（McFarland)No. ３又はNo. ４の硫酸バリウム
標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管又は凝集
板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一滴に対しＷＧＡ
（水溶液又は緩衝溶液１ml当りおよそ１mg）の一滴を加
えた。他の第２の試験管又は凝集板又は凝集皿の中でこ
の細菌懸濁物の他の一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の
一滴を加えた。第３の試験管又は凝集板／皿の中でこの
細菌懸濁物の一滴に対しＳＢＡ又はＳＴＡ（水溶液又は
緩衝溶液１ml当りおよそ１mg）の一滴を加えた。〔すべ
ての該試験管／板／皿を振盪した。〕対照食塩溶液は振
盪後に凝集陰性であるべきである。もし対照食塩溶液が
凝集陽性であるならばこれは自動的凝集を起したもので
あるから試料を処理してこの処理済みの細菌懸濁物につ
いてＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用いて自動的凝集試験
を行うべきである。
ァランド（McFarland)No. ３又はNo. ４の硫酸バリウム
標準液とおよそ等しくあるべきである。試験管又は凝集
板或は凝集皿の中でこの細菌懸濁物の一滴に対しＷＧＡ
（水溶液又は緩衝溶液１ml当りおよそ１mg）の一滴を加
えた。他の第２の試験管又は凝集板又は凝集皿の中でこ
の細菌懸濁物の他の一滴に対しリン酸塩緩衝食塩溶液の
一滴を加えた。第３の試験管又は凝集板／皿の中でこの
細菌懸濁物の一滴に対しＳＢＡ又はＳＴＡ（水溶液又は
緩衝溶液１ml当りおよそ１mg）の一滴を加えた。〔すべ
ての該試験管／板／皿を振盪した。〕対照食塩溶液は振
盪後に凝集陰性であるべきである。もし対照食塩溶液が
凝集陽性であるならばこれは自動的凝集を起したもので
あるから試料を処理してこの処理済みの細菌懸濁物につ
いてＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用いて自動的凝集試験
を行うべきである。
【００２１】自動的凝集を逆転させる適宜の処理として
はＷＧＡ及びＳＢＡを用いる凝集試験の遂行以前に0.２
mlの試料に対し0.００５mlの無水コハク酸溶液を加え
る。ＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用いる凝集反応が陽性
であれば、これはN.g.又は不被嚢（non-encapsulated)
のM.c.の存在を示す。ＷＧＡ使用による凝集が陰性であ
るが、ＳＢＡ／ＳＴＡ使用による凝集が陽性であるなら
ばこれはN.m.又はN.g.（その表面構造は変化している）
の存在の可能性を示す。
はＷＧＡ及びＳＢＡを用いる凝集試験の遂行以前に0.２
mlの試料に対し0.００５mlの無水コハク酸溶液を加え
る。ＷＧＡ及びＳＢＡ／ＳＴＡを用いる凝集反応が陽性
であれば、これはN.g.又は不被嚢（non-encapsulated)
のM.c.の存在を示す。ＷＧＡ使用による凝集が陰性であ
るが、ＳＢＡ／ＳＴＡ使用による凝集が陽性であるなら
ばこれはN.m.又はN.g.（その表面構造は変化している）
の存在の可能性を示す。
【００２２】次に試料の一滴を下記の基質の各溶液の一
滴に対して別々に添加する：ガンマ−グルタミル−４−
メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、プロリル−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミド、ＯＮＰＧ、及びグリ
シル−プロリル−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド。但し、濃度はトリス−NCl （Tris-NCl) 緩衝溶液又
はリン酸塩緩衝液中１ml当り１mgである。ＯＮＰＧにつ
いて試験結果が陽性であれば、即ち３７℃で１０分間以
内に無色から黄色に変色すれば、これはN.l.の存在を示
す。ＧＧＡについて試験結果が陽性ならば、即ち細菌懸
濁液を用いガンマ−グルタミル−４−メトキシ−ベータ
−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃に１０分間
恒温保持した後に、及びファスト−ガーネットＧＢＣ塩
（水溶液１ml中及び0.２mgの濃度）添加の後に、赤から
ピンクへの変色が示されるならば、これはN.m.の存在を
示す。
滴に対して別々に添加する：ガンマ−グルタミル−４−
メトキシ−ベータ−ナフチルアミド、プロリル−４−メ
トキシ−ベータ−ナフチルアミド、ＯＮＰＧ、及びグリ
シル−プロリル−４−メトキシ−ベータ−ナフチルアミ
ド。但し、濃度はトリス−NCl （Tris-NCl) 緩衝溶液又
はリン酸塩緩衝液中１ml当り１mgである。ＯＮＰＧにつ
いて試験結果が陽性であれば、即ち３７℃で１０分間以
内に無色から黄色に変色すれば、これはN.l.の存在を示
す。ＧＧＡについて試験結果が陽性ならば、即ち細菌懸
濁液を用いガンマ−グルタミル−４−メトキシ−ベータ
−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃に１０分間
恒温保持した後に、及びファスト−ガーネットＧＢＣ塩
（水溶液１ml中及び0.２mgの濃度）添加の後に、赤から
ピンクへの変色が示されるならば、これはN.m.の存在を
示す。
【００２３】ＰＡについて試験結果が陽性ならば、即
ち、細菌懸濁液を用いプロリル−４−メトキシ−ベータ
−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃に１０分間
恒温保持した後に、及びファスト−ガーネットＧＢＣ塩
溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはN.g.の存在を示す。ＧＰＡについて試験結果
が陽性ならば、即ち、グリシル−プロリル−４−メトキ
シ−ベータ−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃
に２０分間恒温保持した後に、及びファスト−ガーネッ
トＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示
されるならば、これはB.c.の存在を示す。上記の諸試験
はウェルを有する一個の平板の上で行うことができ、こ
れによりり、N.g.、N.m.及びN.l.を迅速（即ち３０分間
以内）に同定することができる。更に、ＳＢＡ又はＳＴ
ＡとＷＧＡとの組合せの使用により、及び自動的凝集が
問題である場合にはＤＮＡ′アーゼ及び（又は）無水コ
ハク酸を用いて試料を処理することにより、同定の正確
度は増大する。
ち、細菌懸濁液を用いプロリル−４−メトキシ−ベータ
−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃に１０分間
恒温保持した後に、及びファスト−ガーネットＧＢＣ塩
溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示されるなら
ば、これはN.g.の存在を示す。ＧＰＡについて試験結果
が陽性ならば、即ち、グリシル−プロリル−４−メトキ
シ−ベータ−ナフチルアミド含有溶液中において３７℃
に２０分間恒温保持した後に、及びファスト−ガーネッ
トＧＢＣ塩溶液添加の後に、赤からピンクへの変色が示
されるならば、これはB.c.の存在を示す。上記の諸試験
はウェルを有する一個の平板の上で行うことができ、こ
れによりり、N.g.、N.m.及びN.l.を迅速（即ち３０分間
以内）に同定することができる。更に、ＳＢＡ又はＳＴ
ＡとＷＧＡとの組合せの使用により、及び自動的凝集が
問題である場合にはＤＮＡ′アーゼ及び（又は）無水コ
ハク酸を用いて試料を処理することにより、同定の正確
度は増大する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター クウォック チ チュン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94080サウス サンフランシスコ アダム ス コート 2566
Claims (1)
- 【請求項１】 試料中に存在の疑ある微生物ナイセリア
・ゴノレ及び微生物ナイセリア・メニンギチジスの分別
検出方法において、下記の工程: （1) ナイセリア・ゴノレ菌及びナイセリア・メニンギ
チジス菌を含有する疑のある試料の一部を、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン又はＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオース
と反応するレクチンと接触させ、この試料がナイセリア
・ゴノレ、ナイセリア・メニンギチジスのいずれか又は
それら両者を含むことの陽性表示として、ナイセリア・
ゴノレ菌又はナイセリア・メニンギチジス菌の表面上に
おいてレクチンと、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ，
Ｎ′−ジアセチルキトビオースとの間で生じる凝集反応
の存在を検出し、そして（2) ナイセリア・ゴノレ菌及
びナイセリア・メニンギチジス菌を含有する疑のある試
料の一部と、ナイセリア・メニンギチジス中に存在する
ガンマ−グルタミル−アミノペプチダーゼに対して特異
的な基質及びナイセリア・ゴノレ中に存在するプロリン
−アミノペプチダーゼに対して特異的な基質から成る群
から選ばれる基質とを接触させ、この試料がナイセリア
・メニンギチジス又はナイセリア・ゴノレを含むことの
陽性表示として、該試料の一部と基質との間で形成する
反応生成物の存在を検出する、工程を含むことを特徴と
する分別検出方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47266383A | 1983-03-07 | 1983-03-07 | |
| US472663 | 1983-03-07 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4477784A Division JPS59220200A (ja) | 1983-03-07 | 1984-03-07 | 微生物の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622792A true JPH0622792A (ja) | 1994-02-01 |
Family
ID=23876437
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4477784A Granted JPS59220200A (ja) | 1983-03-07 | 1984-03-07 | 微生物の検出方法 |
| JP3860893A Pending JPH0622792A (ja) | 1983-03-07 | 1993-02-26 | 微生物の検出方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4477784A Granted JPS59220200A (ja) | 1983-03-07 | 1984-03-07 | 微生物の検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0122023A1 (ja) |
| JP (2) | JPS59220200A (ja) |
| CA (1) | CA1219201A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047077A1 (en) | 1998-03-18 | 1999-09-23 | Meadox Medicals, Inc. | Improved ptfe vascular prosthesis and method of manufacture |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3345748A1 (de) * | 1983-12-17 | 1985-08-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Phenolsulfonphthaleinyl-ss-d-galactoside, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung zur bestimmung der ss-d-galactosidase |
| CA1298763C (en) * | 1986-06-16 | 1992-04-14 | Mary Lou Gantzer | Rapid detection of n. gonorrhoeae without culture |
| US5554388A (en) * | 1989-02-25 | 1996-09-10 | Danbiosyst Uk Limited | Systemic drug delivery compositions comprising a polycationi substance |
| GB9700624D0 (en) | 1997-01-14 | 1997-03-05 | Danbiosyst Uk | Drug delivery composition |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3862011A (en) * | 1971-08-16 | 1975-01-21 | Robert E Smith | Method for quantitatively determining enzyme concentrations in homogenates |
| US3957584A (en) * | 1974-09-30 | 1976-05-18 | Warner-Lambert Company | Detection of beta-galactosidase producing micro-organisms |
| US4298689A (en) * | 1978-09-25 | 1981-11-03 | Research Corporation | Gonorrhea diagnostic test |
| GB2031949B (en) * | 1978-10-16 | 1983-01-06 | American Home Prod | Identification of microrganisms |
| EP0018825B1 (en) * | 1979-05-02 | 1985-02-13 | National Research Development Corporation | A process for the identification of bacteria and a kit of reagents for use in this process |
-
1984
- 1984-03-06 CA CA000448977A patent/CA1219201A/en not_active Expired
- 1984-03-07 EP EP84301507A patent/EP0122023A1/en not_active Withdrawn
- 1984-03-07 JP JP4477784A patent/JPS59220200A/ja active Granted
-
1993
- 1993-02-26 JP JP3860893A patent/JPH0622792A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ABSTR ANNU MEET AM SOC MICROBIOL=1975 * |
| BR J VENER DIS=1981 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047077A1 (en) | 1998-03-18 | 1999-09-23 | Meadox Medicals, Inc. | Improved ptfe vascular prosthesis and method of manufacture |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0122023A1 (en) | 1984-10-17 |
| JPS59220200A (ja) | 1984-12-11 |
| CA1219201A (en) | 1987-03-17 |
| JPH0563158B2 (ja) | 1993-09-09 |
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