JPH06213888A - Immunological determination method of human 72-kda gelatinase/iv-type collagenase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To determine human pro MMP-2 within a sample to be tested rapidly with high sensitivity and accuracy by using two types of monoclonal antibodies which specifically combines with human 72-kDa gelatinase/IV-type collagenase (human pro MMP-2). CONSTITUTION:Two types of monoclonal antibodies which specifically combine with human pro-MMP-2 are used as carriers which combine with solid phase carriers or antibodies which give labeled substances, thus performing measurement immunologically by the sandwich method. Balls, microplates, sticks, fine particles, or test tubes made of for example polystyrene and polycarbonate for well adsorbing protein such as antibodies can be selected arbitrarily and used as the solid phase carriers. On the other hand, after an object containing antibodies is fractionated with ammonium sulfate as antibodies giving the labeled substance, anion exchange gel and IgG fraction are performed and further specifically combined part Fab' which is obtained by reduction after pepsin digestion can be used.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【技術分野】本発明は、医学的生理学的分野に用いられ
るヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ
（ヒトプロＭＭＰ−２）の免疫学的定量法に関する。さ
らに詳しく言えば、本発明はヒト７２−ｋＤａゼラチナ
ーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼ（以下ヒトプロＭＭＰ−２と
記す）の特定のアミノ酸配列に対し、あるいは精製ヒト
プロＭＭＰ−２に対し特異的に結合するモノクローナル
抗体を用いてヒトプロＭＭＰ−２を免疫学的に定量する
方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunological quantification method of human 72-kDa gelatinase / type IV collagenase (human proMMP-2) used in the field of medicine and physiology. More specifically, the present invention provides a monoclonal antibody that specifically binds to a specific amino acid sequence of human 72-kDa gelatinase / type IV collagenase (hereinafter referred to as human pro-MMP-2) or purified human pro-MMP-2. The present invention relates to a method for immunologically quantifying human proMMP-2.

【０００２】[0002]

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラ
ミニンなどの接着性糖蛋白質から構成されている（下岡
ら，臨床検査，３４，１７１９−１７２４）。これらマ
トリックス成分の分解には、マトリックスメタロプロテ
アーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果たしている。そ
の中でプロＭＭＰ−２と称される７２−ｋＤａ（キロダ
ルトン）ゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼは、ヒトリ
ウマチ滑膜細胞（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９４：７２１−７３０，１９９０）や中島
ら（実験医学，７，３２−４０（５４２−５５０），１
９８９）によって報告されているように、ヒトＡ２０５
８メラノーマ細胞、ラット乳癌細胞、ヒト大腸癌細胞、
Ｈ−ｒａｓでトランスフォームされたヒト気管支上皮細
胞などにより産生され、酵素的限定分解または、４−ア
ミノフェニル酢酸水銀（ＡＰＭＡ）などのチオール基反
応性有機水銀化合物により活性化され、ゼラチン、ＩＶ
型コラーゲンおよびＶ型コラーゲン、更にプロデオクリ
カンコアたん白質やフィブロネクチン、不溶性エラスチ
ンを分解する活性を有していることが認められている
（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９
４：７２１−７３０，１９９０）。BACKGROUND ART The extracellular matrix is composed of adhesive glycoproteins such as collagen, proteoglycan, elastin, fibronectin, and laminin (Shimooka et al., 34, 1719-1724). Matrix metalloproteases (MMPs) play an important role in the decomposition of these matrix components. A 72-kDa (kilodalton) gelatinase / type IV collagenase, called pro-MMP-2, is used in human rheumatoid synovial cells (Okada et al., Eur. J. Bioc).
hem. , 194: 721-730, 1990) and Nakajima et al. (Experimental Medicine, 7, 32-40 (542-550), 1).
989) and human A205.
8 melanoma cells, rat breast cancer cells, human colon cancer cells,
Produced by human bronchial epithelial cells transformed with H-ras, activated by limited enzymatic decomposition or thiol group-reactive organomercury compounds such as 4-aminophenylmercuric acetate (APMA), gelatin, IV
It is recognized that it has an activity of degrading type I collagen and type V collagen, as well as prodeoglycan core protein, fibronectin, and insoluble elastin (Okada et al., Eur. J. Biochem., 19).
4: 721-730, 1990).

【０００３】このように、ヒトプロＭＭＰ−２は、ゼラ
チンやＩＶ型コラーゲンを分解する酵素（ＩＶ型コラゲ
ナーゼ）として知られているが、Ｗａｃｈｅｒら（Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．， １２６：２３９−２４
５，１９９０）は、ヒトＭＭＰ−２のＮ末端の合成ペプ
チドに対するウサギポリクローナル抗体を用いて、サブ
ストレイトキャプチャーイムノアッセイ法により、ヒト
ＭＭＰ−２を定量している。この方法では、ＩＶ型コラ
ゲナーゼの基質（ゼラチン）を固相に吸着させ、検体中
の抗原と反応させ、さらにその抗原に２種類のポリクロ
ーナル抗体を用いて反応を行わせる方法が用いられてい
る。またＺｕｃｋｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，１４８：１８９−１９８，１９９２）は、ヒトＭ
ＭＰ−２に対するウサギポリクローナル抗体と、ヒトＭ
ＭＰ−２に対するマウスモノクローナル抗体を用いて、
サンドイッチタイプＥＩＡ法によりヒトＭＭＰ−２量を
定量している。この方法では、ウサギポリクローナル抗
体を固相抗体とし、その抗体に検体を加え、検体中の抗
原と反応させ、次にマウスモノクローナル抗体を加えた
後、ビオチン化やぎ抗マウスイムノグロブリンと、アル
カリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを用いて反
応を完了させている。しかしながら、これら、従来報告
されている方法ではポリクローナル抗体を使用している
ため精度の点で極めて劣り、反応時間が長く（例えば７
時間あるいは５時間を要する）、また、いずれも２種類
のポリクローナル抗体を使うため定量操作は繁雑とな
り、得られる感度も低い。As described above, human pro-MMP-2 is known as an enzyme that decomposes gelatin and type IV collagen (type IV collagenase).
Immunol. Meth. , 126: 239-24.
5, 1990) quantifies human MMP-2 by a substrate capture immunoassay method using a rabbit polyclonal antibody against a synthetic peptide at the N-terminal of human MMP-2. In this method, a method is used in which a substrate (gelatin) of type IV collagenase is adsorbed on a solid phase, reacted with an antigen in a sample, and then the antigen is reacted with two types of polyclonal antibodies. See also Zucker et al. (J. Immunol. Met
h. , 148: 189-198, 1992) is a human M
Rabbit polyclonal antibody against MP-2 and human M
Using a mouse monoclonal antibody against MP-2,
The amount of human MMP-2 is quantified by the sandwich type EIA method. In this method, a rabbit polyclonal antibody is used as a solid phase antibody, a sample is added to the antibody, reacted with an antigen in the sample, and then a mouse monoclonal antibody is added, followed by biotinylated goat anti-mouse immunoglobulin and alkaline phosphatase labeling. The reaction is completed with streptavidin. However, in these previously reported methods, polyclonal antibodies are used, so that the accuracy is extremely poor and the reaction time is long (for example, 7
(It takes 5 hours or 5 hours), and both of them use two kinds of polyclonal antibodies, which makes the quantitative operation complicated and the obtained sensitivity is low.

【０００４】本発明者らは、先にヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドに対するモノクローナル抗体を提供することに成
功した（特開平４−１８３３９７）。しかしながら、得
られたこのモノクローナル抗体は、免疫原がペプチドで
あるがために、ＭＭＰ−２に対する親和性が低く、ＭＭ
Ｐ−２以外のＭＭＰｓと交差反応を示すものが多く、ま
た、これらモノクローナル抗体を使用して行ったサンド
イッチアッセイ系の定量法は、いずれも測定感度の低い
ものであった。The present inventors have previously succeeded in providing a monoclonal antibody against human MMP-2 polypeptide (JP-A-4-183397). However, the obtained monoclonal antibody has a low affinity for MMP-2, because the immunogen is a peptide,
Many of them showed cross-reactivity with MMPs other than P-2, and the quantification method of sandwich assay system using these monoclonal antibodies had low measurement sensitivity.

【０００５】本発明の目的は、ヒトプロＭＭＰ−２に対
し、特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を用
いて、被検試料中のヒトプロＭＭＰ−２を感度ならびに
精度において優れ、また迅速に定量し得る方法を提供す
ることにある。更に、上記定量法を用い、関節症、甲状
腺機能亢進症、各種癌および転移性癌等の疾患を診断し
得る診断剤を提供することにある。The object of the present invention is to detect human proMMP-2 in a test sample with excellent sensitivity and accuracy and to rapidly quantify it by using two kinds of monoclonal antibodies that specifically bind to human proMMP-2. To provide a possible method. Another object of the present invention is to provide a diagnostic agent capable of diagnosing diseases such as arthrosis, hyperthyroidism, various cancers and metastatic cancers using the above-mentioned quantitative method.

【０００６】[0006]

【発明の開示】本発明は、ヒトプロＭＭＰ−２に対し、
特異的に結合する２種類のモノクローナル抗体を、サン
ドイッチ法における固相担体に結合させる抗体、あるい
は標識物を付与する抗体として用いて、同方法により、
免疫学的にヒトプロＭＭＰ−２の測定を行うことを特徴
とするヒトプロＭＭＰ−２の定量法を提供するものであ
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to human proMMP-2,
By using two types of monoclonal antibodies that specifically bind as an antibody that binds to a solid phase carrier in the sandwich method or an antibody that imparts a labeled substance,
The present invention provides a method for quantifying human proMMP-2, which comprises immunologically measuring human proMMP-2.

【０００７】本発明の方法は、固相担体に結合させる抗
体あるいは標識物を付与する抗体として、それぞれ、ヒ
トＭＭＰ−２の異なる抗原決定基に対し特異的に結合す
るモノクローナル抗体を、使用することを特徴とするも
のである。In the method of the present invention, a monoclonal antibody that specifically binds to different antigenic determinants of human MMP-2 is used as an antibody that binds to a solid phase carrier or an antibody that imparts a labeled substance. It is characterized by.

【０００８】本発明の定量方法においては、免疫学的測
定法が用いられるが、その際の固相担体としては、抗体
等タンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカー
ボネイト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニル製の
ボール、マイクロプレート、スティック、微粒子あるい
は試験管等の種々の材料および形態を任意に選択し、使
用することができる。一方、標識物を付与する抗体とし
ては、抗体含有物を硫安分画した後、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｃｅｌの如き、陰イオン交換ゲルおよびＩｇＧ画
分、さらにはペプシン消化後還元して得られる特異的結
合部Ｆａｂ′を用いることができる。これらの場合の標
識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリ
ホスファターゼあるいはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
等）、化学物質、蛍光物質あるいは放射性同位元素等が
ある。以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明す
る。In the quantification method of the present invention, an immunological measurement method is used, and the solid phase carrier in that case is a ball made of polystyrene, polycarbonate, polypropylene, or polyvinyl that well adsorbs proteins such as antibodies. Various materials and forms such as microplates, sticks, microparticles or test tubes can be arbitrarily selected and used. On the other hand, as the antibody to which the labeled substance is added, DEAE-Sep is used after the antibody-containing substance is fractionated with ammonium sulfate.
Anion exchange gels such as hacel and IgG fractions as well as specific binding Fab 'obtained by digestion with pepsin followed by reduction can be used. Examples of labeled substances in these cases include enzymes (peroxidase, alkaline phosphatase, β-D-galactosidase, etc.), chemical substances, fluorescent substances, radioisotopes and the like. Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples.

【０００９】実施例１ 抗原の調製 １） ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドの調製 ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６３，６５７９−６５８７，１９８８に記載の
Ｗｉｌｈｅｌｍらのアミノ酸配列を用いた。表１に示し
たヒトＭＭＰ−２ポリペプチド（Ｐ−１〜Ｐ−５）を各
々ペプチドシンセサイザー９６００（ミリジエン／バイ
オサーチ）で合成した。なお、各ペプチドＣ末端にシス
テインを導入した。合成ペプチドの純度が約７０％以下
のものは、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ（５μ、Ｃ１８−
１００Å，ウォーターズ）カラムを用いて高速液体クロ
マトグラフィーにより精製した。Example 1 Preparation of Antigen 1) Preparation of Human MMP-2 Polypeptide Human MMP-2 polypeptide is described in J. Biol. Che
m. , 263, 6579-6587, 1988, using the amino acid sequence of Wilhelm et al. The human MMP-2 polypeptides (P-1 to P-5) shown in Table 1 were each synthesized with a peptide synthesizer 9600 (Millidiene / Biosearch). In addition, cysteine was introduced into the C-terminal of each peptide. Synthetic peptides with a purity of about 70% or less can be synthesized by μBondasphere (5μ, C18-
Purification by high performance liquid chromatography using a 100Å, Waters) column.

【００１０】２） 免疫原の調製 ２ｍｇ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｌの０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものと１．８５
ｍｇＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシコハク酸イ
ミドを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解したも
のとを混合し、３０℃、３０分間インキュベーションし
た。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（セファデック
スＧ−２５Ｍ、ファルマシア）に供し、マレイミドが結
合されたＢＳＡを分取し、１．５ｍｌ以下に濃縮した。
マレイミドが結合されたＢＳＡに対し５０倍モル量の前
記（ａ）で合成した各ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドを１
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した
ものと混合した。４℃、２０時間インキュベーション
し、ＭＭＰ−２ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を調製し
た。2) Preparation of immunogen 2 mg bovine serum albumin (BSA) in 1 ml 0.1 M
1.85 dissolved in phosphate buffer (pH 7.0)
mg N- (ε-maleimidocaproyloxysuccinimide dissolved in 200 μl of dimethylformamide was mixed and incubated for 30 minutes at 30 ° C. Next, the above mixture was mixed with 0.1 M phosphate buffer (pH).
It was applied to a PD-10 column (Sephadex G-25M, Pharmacia) equilibrated with 7.0), and the maleimide-bound BSA was fractionated and concentrated to 1.5 ml or less.
A 50-fold molar amount of each human MMP-2 polypeptide synthesized in (a) above with respect to BSA to which maleimide was bound was used.
It was mixed with that dissolved in ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). After incubation at 4 ° C. for 20 hours, an MMP-2 polypeptide-BSA complex was prepared.

【００１１】３） ヒト皮膚線維芽細胞由来プロＭＭＰ
−２の調製 （ａ） 細胞培養 ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地：Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎ
ｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ）ｗｉｔｈ Ｅａｒｌｅ’ｓ ｓａｌｔｓ（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）を加え、
１Ｎ水酸化ナトリウムあるいは１Ｎ塩酸でｐＨを７．２
にし、０．２μｍ東洋メンブレンフィルターで除菌濾過
した。使用時に、さらに、非必須アミノ酸を添加し、Ｍ
ＥＭ Ｅａｇｌｅ培地とした。3) Human skin fibroblast-derived pro-MMP
-2 (a) Cell culture MEM Eagle medium: Minimum Essen
tial Medium Eagle (modify
d) with Earle's salts (Flow
Lab. Sodium bicarbonate (24 mM) is added to
Adjust the pH to 7.2 with 1N sodium hydroxide or 1N hydrochloric acid.
And 0.2 μm Toyo Membrane Filter was used to remove bacteria. When using, add non-essential amino acid,
This was used as EM Eagle medium.

【００１２】ヒト皮膚線維芽細胞ＣＣＤ−４１ＳＫ（ア
メリカンタイプカルチャーコレクション）を、１０％仔
牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地で３
７℃、５％炭酸ガス存在下、３〜４日間培養した。培養
上清を捨て、０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ．４）（ＰＢＳ）を適量加え緩やかに振
とう洗浄した。次に、０．１２５％トリプシンおよび
０．０１％エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）を含むＰＢＳを加え、軽くゆすって細胞を培養フラ
スコから剥した後、１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ Ｅａｇｌ
ｅ培地を適量加えた。遠心後、上清を捨て、１０％ＦＣ
Ｓ含有ＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地を適量加え、細胞を懸濁
した。次に、新しい培養フラスコに約２×１０^５個／ｍ
ｌの細胞を添加し、３７℃、５％炭酸ガス存在下、３〜
４日間培養した。Human dermal fibroblasts CCD-41SK (American Type Culture Collection) was mixed with MEM Eagle medium containing 10% fetal calf serum (FCS).
The cells were cultured at 7 ° C in the presence of 5% carbon dioxide for 3 to 4 days. The culture supernatant was discarded, and an appropriate amount of 0.1 mM sodium chloride-containing 10 mM phosphate buffer solution (pH.4) (PBS) was added and gently washed with shaking. Next, 0.125% trypsin and 0.01% sodium ethylenediamine tetraacetate (EDT
PBS containing A) was added, and the cells were gently shaken to remove the cells from the culture flask, and then 10% FCS-containing MEM Eagle was added.
e medium was added in an appropriate amount. After centrifugation, discard the supernatant and 10% FC
An appropriate amount of S-containing MEM Eagle medium was added to suspend the cells. Then, add about 2 × 10 ⁵ cells / m to a new culture flask.
l cells were added, and the cells were added at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide gas,
Cultured for 4 days.

【００１３】（ｂ） 細胞刺激 （ａ）で得られた培養細胞にインターロイキン１α（Ｉ
Ｌ−１α）を作用させることにより細胞刺激を行う。前
項（ａ）で培養した培養液をデカントし、次に約１００
ｍｌのＭＥＭ Ｅａｇｌｅ培地を加え、ラクトアルブミ
ン水解物（ＧＩＢＣＯ）およびＩＬ−１α（Ｇｅｎｚｙ
ｍｅ）を、各々終濃度０．２％および１０Ｕ／ｍｌにな
るように加えた。３７℃、５％炭酸ガス存在下、７〜１
０日間静置したのち、その培養上清を回収し、ヒトプロ
ＭＭＰ−２調製用材料とした。(B) Cell Stimulation The cultured cells obtained in (a) are treated with interleukin 1α (I
Cell stimulation is carried out by acting L-1α). Decant the culture solution cultivated in (a) above, and then decant about 100
ml MEM Eagle medium was added and lactalbumin hydrolyzate (GIBCO) and IL-1α (Genzy) were added.
me) was added to a final concentration of 0.2% and 10 U / ml, respectively. 7-1 at 37 ° C in the presence of 5% carbon dioxide gas
After leaving still for 0 days, the culture supernatant was collected and used as a material for preparing human pro MMP-2.

【００１４】（ｃ） ヒトプロＭＭＰ−２の精製 前項（ｂ）で調製した培養上清に、終濃度８０％飽和に
なるように硫酸アンモニウムを加え、撹拌、遠心し、そ
の沈殿に適量の０．５Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化
カルシウム、０．０５％ポリオキシエチレンラウリルア
ルコールエーテル（ブリッジ−３５）含有５０ｍＭトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０，Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆ
ｆｅｒ）を添加、溶解し、Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅ
ｒに対し透析した。透析後の溶液を、Ｇｅｌａｔｉｎ−
ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）に供し、その吸着たん白
質を５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有Ｔｒｉ
ｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒで溶出した。溶出画分はＴｒｉ
ｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒに対し透析した。次に、混在す
るＴＩＭＰ−２を除去するため、抗ヒトＴＩＭＰ−２モ
ノクローナル抗体（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４，微工
研寄託番号ＦＥＲＭＰ−１２６９１）結合Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂカラムに供し、その素通り画分を採取し
た。ここで用いた抗ＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体
は、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチド（ＤＳＧＮＤＩＹＧ
ＮＰＩＫＲＩＱ）に対する抗体で、免疫原のキャリヤー
たん白質としてキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）を用いた以外は、後述する抗ヒトＭＭＰ−２ポリ
ペプチドモノクローナル抗体の調製法に従って調製し
た。得られたモノクローナル抗体のうち、クローンＮ
ｏ．６８−６Ｈ４からの抗体を抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂカラムに使用した。(C) Purification of human pro-MMP-2 Ammonium sulfate was added to the culture supernatant prepared in the above (b) so that the final concentration would be 80% saturation, the mixture was stirred and centrifuged, and an appropriate amount of 0.5 M was added to the precipitate. 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.0, Tris-Ca Buf) containing sodium chloride, 10 mM calcium chloride and 0.05% polyoxyethylene lauryl alcohol ether (bridge-35).
fer) is added and dissolved, and Tris-Ca Buffer is added.
It was dialyzed against r. The solution after dialysis is treated with Gelatin-
agarose (Sigma), and the adsorbed protein was treated with 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) -containing Tri.
Elution was performed with s-Ca Buffer. Elution fraction is Tri
It dialyzed with respect to s-Ca Buffer. Next, in order to remove the contaminated TIMP-2, an anti-human TIMP-2 monoclonal antibody (clone No. 68-6H4, Microindustrial Research Deposit No. FERMP-12691) bound Sephar
It was applied to the ose 4B column and the flow-through fraction was collected. The anti-TIMP-2 monoclonal antibody used here is a human TIMP-2 polypeptide (DSGNDIYG
An antibody against NPIKRIQ, which is keyhole limpet hemocyanin (K) as a carrier protein of an immunogen.
It was prepared according to the method for preparing an anti-human MMP-2 polypeptide monoclonal antibody described below except that LH) was used. Among the obtained monoclonal antibodies, clone N
o. The antibody from 68-6H4 is bound to the antibody Sepharo.
Used on a se 4B column.

【００１５】更に、フィブロネクチンを除去するため、
抗フィブロネクチン抗体（ＣａｐｐｅＩ Ｌａｂ．）結
合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムに供し、その素通り
画分を採取した。この画分にはプロＭＭＰ−２が含まれ
ており、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上、ほぼ単一に精
製されていることが認められた。一方、抗ヒトＴＩＭＰ
−２抗体（クローンＮｏ．６８−６Ｈ４）結合Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの０．１５Ｍ塩化ナトリウムお
よび１０ｍＭ塩化カルシウム含有０．２Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（ｐＨ２．５）による溶出画分には、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ上、プロＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２が存在して
おり、プロＭＭＰ−２とＴＩＭＰ−２の複合体が含まれ
ていたと考察される。モノクローナル抗体作製用ヒトプ
ロＭＭＰ−２は、ｇｅｌａｔｉｎ−ａｇａｒｏｓｅの溶
出画分を使用し、後述の実施例６（ｂ）項記載の１ステ
ップサンドイッチ酵素免疫学的定量（ＥＩＡ）には、抗
ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体結合Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂカラムおよび抗フィブロネクチン抗体結合
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの素通り画分のプロＭ
ＭＰ−２を標準抗原として使用した。Furthermore, in order to remove fibronectin,
An anti-fibronectin antibody (Cappe I Lab.)-Bonded Sepharose 4B column was applied, and its flow-through fraction was collected. It was confirmed that this fraction contained pro-MMP-2 and was purified to be almost single on polyacrylamide gel electrophoresis containing sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE). On the other hand, anti-human TIMP
-2 antibody (clone No. 68-6H4) binding Seph
The elution fraction of 0.25 glycine-hydrochloric acid buffer solution (pH 2.5) containing 0.15 M sodium chloride and 10 mM calcium chloride on the arose 4B column contained SDS-
It is considered that PAGE contained pro-MMP-2 and TIMP-2 and contained a complex of pro-MMP-2 and TIMP-2. Human pro-MMP-2 for producing a monoclonal antibody uses an elution fraction of gelatin-agarose, and anti-human TIMP-for the one-step sandwich enzyme immunoassay (EIA) described in Example 6 (b) below. 2 Monoclonal antibody binding Sephar
ose 4B column and anti-fibronectin antibody-bound Sepharose 4B column pro-M of the flow-through fraction
MP-2 was used as a standard antigen.

【００１６】実施例２ 抗ヒトＭＭＰ−２ポリペプチド
モノクローナル抗体の作製 （ａ） 免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１，２）に記載の方法により調製したポリペプチ
ド−ＢＳＡ複合体２５０μｇを、完全フロイントアジュ
バンドと共に、８週令Ｂａ１ｂ／ｃ雌マウスの腹腔内に
投与し、初回免疫とした。１５日後に、０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したポリペプチド−ＢＳＡ
複合体２００μｇ、初回免疫したマウスに腹腔内投与
し、追加免疫した。更に３８日後に追加免疫時と同様に
ポリペプチド−ＢＳＡ複合体７０μｇを静脈内および１
３０μｇを腹腔内投与し、最終免疫とした。その３日後
に、脾臓を摘出し、脾臓胞懸濁液を調製した。Example 2 Preparation of Anti-Human MMP-2 Polypeptide Monoclonal Antibody (a) Immunization Method and Spleen Cell Preparation Method 250 μg of the polypeptide-BSA complex prepared by the method described in Examples 1 and 2 was The complete Freund's adjuvant was intraperitoneally administered to 8-week-old Ba1b / c female mice to give the first immunization. After 15 days, Polypeptide-BSA dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 6.0)
200 μg of the complex was intraperitoneally administered to a mouse that had been immunized for the first time, and a booster was performed. After another 38 days, 70 μg of the polypeptide-BSA complex was intravenously and
30 μg was intraperitoneally administered to give the final immunization. Three days later, the spleen was removed and a splenic vesicle suspension was prepared.

【００１７】（ｂ） 細胞融合 （１） 材料 ＲＰＭＩ １６４０培地：ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｌｏ
ｗ Ｌａｂ．）に重炭酸ナトリウム（２４ｍＭ）、ピル
ビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリンＧカリウム
（５０Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（５０μｇ
／ｍｌ）および硫酸アカシン（１０μｇ／ｍｌ）を加
え、ドライアイスでｐＨを７．２にし、０．２μｍ東洋
メンブレンイルターで除菌濾過した。 ＮＳ−１培地：上記ＲＰＭＩ １６４０培地に除菌濾過
したＦＣＳを１５％ｖ／ｖ）の濃度になるように加え
た。(B) Cell fusion (1) Material RPMI 1640 medium: RPMI 1640 (Flo
w Lab. ) To sodium bicarbonate (24 mM), sodium pyruvate (1 mM), potassium penicillin G (50 U / ml), streptomycin sulfate (50 μg)
/ Ml) and acacin sulfate (10 μg / ml) were added, the pH was adjusted to 7.2 with dry ice, and sterilization filtration was performed with a 0.2 μm Toyo Membrane filter. NS-1 medium: FCS that had been sterilized and filtered was added to the RPMI 1640 medium to a concentration of 15% v / v).

【００１８】ＰＥＧ ４，０００溶液：ＲＰＭＩ １６
４０培地にポリエチレングリコール４，０００（ＰＥＧ
４，０００、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）を５０％（ｗ／
ｗ）になるように加え、無血清溶液を調製した。PEG 4,000 solution: RPMI 16
Polyethylene glycol 4,000 (PEG
4,000, Merck & Co. ) 50% (w /
w) to prepare a serum-free solution.

【００１９】８−アザグアニン耐性ミエローマ細胞ＳＰ
２（ＳＰ２／０−Ａｇ１４）との融合は、Ｓｅｌｅｃｔ
ｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｂ．Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ ａ
ｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｓｈｉｉｇｉ）、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍ
ａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０）、３５１−
３７２に記載の０ｉらの方法を若干改変して行った。8-azaguanine resistant myeloma cell SP
2 (SP2 / 0-Ag14) fusion is Select
ed Method in Cellular Imm
unology (eds. BB Misshella
nd S. M. Shiigi), W.W. H. Freem
an and Company (1980), 351-
The method of Oi et al. Described in 372 was slightly modified.

【００２０】（２） 細胞融合法 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）とミエローマ細胞（生細胞率１００％）とを５：１
の割合で融合した。脾臓細胞とミエローマ細胞とを別に
前記のＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄し、次に同じ培地
に懸濁し、融合させるため上記の割合で混合した。容量
２５０ｍｌのポリプロピレン製遠沈管（岩城硝子）を用
い、４０ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地中４００×ｇ、
１０分間遠心分離し、上清を完全に吸出した。沈殿細胞
に３７℃加温ＰＥＧ ４，０００溶液６．０ｍｌを穏や
かに撹拌しながら１分間で滴下し、さらに１分間撹拌し
細胞を再懸濁、分散させた。次に３７℃加温ＲＰＭＩ
１６４０培地６．０ｍｌを１分間で滴下した。この操作
をさらに１回繰り返した後、同培地４２．０ｍｌを２〜
３分間で常に撹拌しながら滴下し細胞を分散させた。こ
れを４００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を完全に吸
引除去した。次にこの沈殿細胞に３７℃加温ＮＳ−１培
地６０ｍｌを速やかに加え、細胞の大きい塊を１０ｍｌ
のピペットを用いて注意深くピペッティングして分散し
た。さらに同培地１２０ｍｌを加えて希釈し、ポリスチ
レン製９６穴マイクロウエル（岩城硝子）にウエル当り
６．０×１０^５個／０．１ｍｌＮＣ細胞を加えた。細胞
を加えた上記のマイクロウエルを７％炭酸ガス／９３％
空気中で温度３７℃、湿度１００％下に培養に付した。(2) Cell fusion method Nucleated spleen cells (viable cell ratio 100) prepared in the above (a)
%) And myeloma cells (live cell ratio 100%) 5: 1
Fused at a rate of. Spleen cells and myeloma cells were washed separately in RPMI 1640 medium as described above, then suspended in the same medium and mixed at the above ratio for fusion. Using a polypropylene centrifuge tube (Iwaki Glass) with a capacity of 250 ml, 400 xg in 40 ml of RPMI 1640 medium,
After centrifugation for 10 minutes, the supernatant was completely aspirated. To the precipitated cells, 6.0 ml of a PEG 4,000 solution heated at 37 ° C. was added dropwise over 1 minute with gentle stirring, and further stirred for 1 minute to resuspend and disperse the cells. Next, RPMI heated at 37 ℃
6.0 ml of 1640 medium was added dropwise for 1 minute. After repeating this operation once more, 42.0 ml of the same medium was added to
The cells were dispersed by dropwise addition for 3 minutes with constant stirring. This was centrifuged at 400 × g for 10 minutes, and the supernatant was completely removed by suction. Next, 60 ml of 37 ° C. warmed NS-1 medium was rapidly added to the precipitated cells, and 10 ml of a large lump of cells was added.
Using a pipette, carefully pipette to disperse. Further, 120 ml of the same medium was added to dilute, and 6.0 × 10 ⁵ cells / 0.1 ml NC cells were added per well to polystyrene 96-well microwells (Iwaki Glass). Add the above microwells containing cells to 7% carbon dioxide / 93%
The cells were cultured in air at a temperature of 37 ° C and a humidity of 100%.

【００２１】（ｃ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 （１） 使用培地 ＨＡＴ培地：前記（ｂ）で述べたＮＳ−１培地にさらに
ヒポキサンチン（１００μＭ）、アミノプテリン（０．
４μＭ）およびチミジン（１６μＭ）を加えた。 ＨＴ培地：アミノプテリンを除去した以外は上記ＨＡＴ
培地と同一組成のものである。(C) Selective growth of hybridoma by selective medium (1) Medium used HAT medium: The NS-1 medium described in (b) above was further supplemented with hypoxanthine (100 μM) and aminopterin (0.
4 μM) and thymidine (16 μM) were added. HT medium: HAT described above except that aminopterin was removed
It has the same composition as the medium.

【００２２】（２） ハイブリドーマの選択 前記（ｂ）の培養開始後翌日（１日目）、細胞にパスツ
ールピペットでＨＡＴ培地２滴（約０．１ｍｌ）を加え
た。２、３、５、８、１１日目に培地の半分（０．１ｍ
Ｉ）を新しいＨＡＴ培地で置き換え、１４日目に培地の
半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。以降３〜４日毎に
培地の半分を新しいＨＴ培地で置き換えた。通常約２週
間で充分なハイブリドーマの生育が観察される。ハイブ
リドーマ生育全ウエルについて次項（ｄ）記載の固相−
抗体結合テスト法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ウエルをチ
ェックした。次にフィーダーとして１０^７個のマウス胸
腺細胞を含むＨＴ培地１ｍｌをポリスチレン製２４穴セ
ルウエル（岩城硝子）に加えたものを用い、上記で検出
された各陽性ハイブリドーマの全内容物を移した。これ
を前記（ｂ）におけると同様に７％炭酸ガス存在下、３
７℃で約１週間培養に付した。その間１〜２回各ウエル
の上清０．５ｍｌを新しいＨＴ培地０．５ｍｌと交換し
た。ハイブリドーマの充分生育した時点でＥＬＩＳＡ法
により陽性を再確認し、それぞれについて次項（ｅ）記
載の限界希釈法によるクローニングを行った。なお、ク
ローニングに使用後の残液をポリスチレン製２５ｃｍ^２
組織培養フラスコ（岩城硝子）に移し、凍結保存用試料
を調製した。(2) Selection of hybridoma On the next day (1st day) after the start of culture in (b) above, 2 drops (about 0.1 ml) of HAT medium was added to the cells with a Pasteur pipette. Half of the medium (0.1 m
I) was replaced with fresh HAT medium and on day 14 half of the medium was replaced with fresh HT medium. Every 3-4 days thereafter, half of the medium was replaced with fresh HT medium. In about 2 weeks, sufficient growth of hybridoma is usually observed. Solid phase described in the following item (d) for all wells in which hybridomas grow
Positive wells were checked by antibody binding test (ELISA). Next, 1 ml of HT medium containing 10 ⁷ mouse thymocytes was added to a polystyrene 24-well cell well (Iwashiro Glass) as a feeder, and the whole contents of each positive hybridoma detected above were transferred. In the same manner as in (b) above, in the presence of 7% carbon dioxide gas, 3
The cells were cultured at 7 ° C for about 1 week. In the meantime, 0.5 ml of the supernatant in each well was replaced with 0.5 ml of fresh HT medium once or twice. When the hybridomas were sufficiently grown, the positiveness was reconfirmed by the ELISA method, and each of them was cloned by the limiting dilution method described in the following item (e). The residual liquid after use for cloning was 25 cm ² made of polystyrene.
The sample was transferred to a tissue culture flask (Iwaki Glass) to prepare a sample for cryopreservation.

【００２３】（ｄ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ
−２ポリペプチド抗体産生ハイブリドーマの検索 Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２０５〜２１４
（１９８０）に記載のＲｅｎｎａｒｄらの方法を若干改
変した方法を用いた。この方法は、ハイブリドーマ抗体
の検出に適している。９６穴ミクロタイトレーションプ
レート（ＦｌｏｗＬａｂ．）を１００ｎｇの各ヒトＭＭ
Ｐ−２ポリペプチドでコートし、次に、未コート部分を
１％ＢＳＡでブロックした。これに前記（ｃ）で得られ
たハイブリドーマ生育ウエルの上清の一部を加えて室温
で約１時間インキュベートした。２次抗体として西洋わ
さびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｃａｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を加え、さらに室温で約１
時間インキュベートした。次に基質である過酸化水素と
ｏ−フェニレンジアミンを加え生成した褐色の程度をマ
イクロプレートリーダー（ＭＰＲ−Ａ４、東洋ソーダ）
を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し判定した。(D) Anti-human MMP by ELISA method
-2 Polypeptide Antibody-Producing Hybridomas Anal. Biochem. 104, 205-214
The method of Rennard et al. Described in (1980) was slightly modified. This method is suitable for detecting hybridoma antibodies. 96-well microtitration plate (FlowLab.) With 100 ng of each human MM
Coated with P-2 polypeptide, then the uncoated portion was blocked with 1% BSA. A portion of the supernatant of the hybridoma growth well obtained in (c) above was added to this and incubated at room temperature for about 1 hour. Horseradish peroxidase-labeled goat anti-mouse immunoglobulin (Cappel Lab.) Was added as a secondary antibody, and further added at room temperature to about 1
Incubated for hours. Next, add the substrate hydrogen peroxide and o-phenylenediamine, and measure the degree of brown produced by the microplate reader (MPR-A4, Toyo Soda).
Was used to measure and determine the absorbance at 492 nm.

【００２４】（ｅ） クローニング 前記（ｃ）の操作後、各ウエル中には、２種以上のハイ
ブリドーマが生育している可能性があるので、限界希釈
法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生
ハイブリドーマを取得する。ＮＳ−１培地１ｍｌ当りフ
ィーダーとして１０^７個のマウス胸腺細胞を含むクロー
ニング培地を調製し、９６穴マイクロウエルの３６ウエ
ル、３６ウエルおよび２４ウエル当り５個、１個および
０．５個のハイブリドーマを加えた。５日目、１２日目
に全ウエルに各約０．１ｍｌのＮＳ−１培地を追加し
た。クローニング開始後１４〜１５日で充分なハイブリ
ドーマの生育が認められ、コロニー形成陰性ウエルが５
０％以上である群についてＥＬＩＳＡ法を行った。テス
トした全ウエルが陽性でない場合、抗体陽性ウエル中の
コロニー数を確認し、ウエル中に１コロニーが確認され
たウエルを４〜６個選び再クローニングする。最終的に
表２に示したようにヒトＭＭＰ−２ポリペプチドに対す
るモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得た。(E) Cloning Since two or more hybridomas may grow in each well after the operation of (c), cloning is performed by the limiting dilution method to obtain a monoclonal antibody-producing hybridoma. get. A cloning medium containing 10 ⁷ mouse thymocytes as a feeder per ml of NS-1 medium was prepared, and 5, 1, and 0.5 hybridomas were added to 36 wells, 36 wells, and 24 wells of 96-well microwells. added. On the 5th and 12th days, about 0.1 ml of NS-1 medium was added to each well. Sufficient hybridoma growth was observed 14 to 15 days after the start of cloning, and 5 colony formation negative wells were observed.
The ELISA method was performed on the group of 0% or more. When all the tested wells are not positive, the number of colonies in the antibody-positive wells is confirmed, and 4 to 6 wells in which one colony is confirmed are selected and recloned. Finally, as shown in Table 2, hybridomas producing a monoclonal antibody against human MMP-2 polypeptide were obtained.

【００２５】（ｆ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 モノクローナル抗体の増殖は常法による。すなわち、得
られた各ハイブリドーマをＮＳ−１培地などの適当な培
養液で培養（生体外増殖）し、その培養上清から１０〜
１００μｇ／ｍｌの濃度のモノクローナル抗体を得るこ
とができた。一方、大量に抗体を得るためには脾細胞と
ミエローマ細胞の由来動物と同系の動物（Ｂａｌｂ／ｃ
マウス）にマウス１匹当り０．５ｍｌの腫瘍形成促進剤
プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ．）を腹腔内投与し
た。１〜３週間後に、各ハイブリドーマ１×１０^７個を
同じく腹腔内投与し、さらにその１〜２週間後に生体内
で産生された４〜７ｍｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を
含む腹水を得ることができた。(F) Proliferation of Monoclonal Antibody In Vitro and Proliferation In Vitro Proliferation of the monoclonal antibody is carried out by a conventional method. That is, each of the obtained hybridomas was cultured (in vitro growth) in an appropriate culture medium such as NS-1 medium, and 10 to 10
It was possible to obtain a monoclonal antibody at a concentration of 100 μg / ml. On the other hand, in order to obtain a large amount of antibody, an animal syngeneic with the origin of splenocytes and myeloma cells (Balb / c
To each mouse, 0.5 ml of a tumor formation promoter pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane, Aldrich Chem.) Was intraperitoneally administered to each mouse. After 1 to 3 weeks, 1 × 10 ^{7 of} each hybridoma was similarly intraperitoneally administered, and 1 to 2 weeks after that, ascites containing 4 to 7 mg / ml of the monoclonal antibody produced in vivo could be obtained. .

【００２６】（ｇ） モノクローナル抗体の重鎖および
軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドをコートしたミクロタイトレーションプレート
に、前記（ｅ）で得られた各モノクローンの培養上清を
加えた。次にＰＢＳにより洗浄した後、アイソタイプ特
異的ウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．）
を加えた。ＰＢＳによる洗浄後、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を加え、
基質として過酸化水素および２，２′−アジノ−ジ（３
−エチルベンゾチアゾリン硫酸）を用いてそれぞれの重
鎖および軽鎖を判定した。その結果をまとめて表２に示
す。(G) Heavy chain and light chain of monoclonal antibody According to the above-mentioned ELISA method, the culture supernatant of each of the monoclones obtained in (e) above was added to a microtitration plate coated with human MMP-2 polypeptide. Was added. Then, after washing with PBS, an isotype-specific rabbit anti-mouse Ig antibody (Zymed Lab.)
Was added. After washing with PBS, horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit IgG (H + L) antibody was added,
Hydrogen peroxide and 2,2'-azinodi (3
-Ethylbenzothiazoline sulfate) was used to determine each heavy and light chain. The results are summarized in Table 2.

【００２７】（ｈ） モノクローナル抗体の精製 前記（ｆ）で得られた各腹水を４０％飽和硫酸アンモニ
ウムで分画した後、ＩｇＧ１クラスの抗体について０．
５Ｍ塩化ナトリウム含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したプロテインＡアフィゲ
ル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムに吸着させ、上記洗浄液で
洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で溶出
することにより精製した。(H) Purification of Monoclonal Antibodies Each ascites fluid obtained in the above (f) was fractionated with 40% saturated ammonium sulfate, and then the IgG1 class antibody was diluted with 0.
The protein A Affigel (Bio-Rad) column equilibrated with 1.5 M glycine-NaOH buffer (pH 8.9) containing 5 M sodium chloride was adsorbed, washed with the above washing solution, and then 0.1 M citrate buffer (pH 5. Purified by eluting with 0).

【００２８】実施例３ 抗ヒトプロＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体の作製 （ａ） 免疫方法および脾臓細胞の調製法 実施例１，３）に記載の方法により精製したＣＣＤ−４
１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭＭＰ−２，３１μｇを用いて
実施例２，（ａ）の方法に従い調製した。なお、この方
法においては、初回免疫後、１５日後に０．１５Ｍ塩化
ナトリウム含有２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に
溶解したヒトプロＭＭＰ−２，３５μｇを腹腔内投与
し、追加免疫した。また、最終免疫として、ヒトプロＭ
ＭＰ−２，４０μｇを静脈内投与した。Example 3 Preparation of anti-human pro-MMP-2 monoclonal antibody (a) Immunization method and spleen cell preparation method CCD-4 purified by the method described in Examples 1 and 3).
It was prepared according to the method of Example 2, (a) using 31 μg of human pro-MMP-2 derived from 1SK cells. In this method, 15 days after the first immunization, human proMMP-2 (35 μg) dissolved in 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.15 M sodium chloride was intraperitoneally administered to booster immunization. In addition, as the final immunization, human proM
MP-2, 40 μg was administered intravenously.

【００２９】（ｂ） 細胞融合 前記（ａ）で調製した有核脾臓細胞（生細胞率１００
％）を用いて、前記実施例２，（ｂ）と同様に行った。(B) Cell fusion Nucleated spleen cells (live cell ratio 100) prepared in the above (a)
%) In the same manner as in Example 2, (b) above.

【００３０】（ｃ） 選択培地によるハイブリドーマの
選択的増殖 前記（ｂ）の培養開始翌日（１日目）、細胞に対し、前
記実施例２，（ｃ）に記載した方法で行った。(C) Selective Propagation of Hybridomas by Selection Medium On the day after the start of the culture in (b) above (the first day), the cells were subjected to the method described in Example 2 (c) above.

【００３１】（ｄ） ＥＬＩＳＡ法による抗ヒトＭＭＰ
−２抗体産生ハイブリドーマの検索 前記実施例２，（ｄ）に記載した方法と同様に行った。
この方法においては、９６穴ミクロタイトレーションプ
レートを５０ｎｇのヒトプロＭＭＰ−２でコートした。(D) Anti-human MMP by ELISA method
-2 Search for antibody-producing hybridoma The same procedure as described in Example 2, (d) above was performed.
In this method, 96-well microtitration plates were coated with 50 ng human pro-MMP-2.

【００３２】（ｅ） クローニング 前記実施例２，（ｅ）に記載した方法と同様に行った。
最終的に表３に示したＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプ
ロＭＭＰ−２に対するモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマを得た。(E) Cloning The same procedure as described in Example 2, (e) above was performed.
Finally, the CCD-41SK cell-derived human proMMP-2-derived monoclonal antibody-producing hybridomas shown in Table 3 were obtained.

【００３３】（ｆ） モノクローナル抗体の生体外増殖
および生体内増殖 前記実施例２，（ｆ）に記載した方法と同様に行った。 （ｇ） モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖 前述したＥＬＩＳＡ法に従って、ヒトプロＭＭＰ−２を
コートしたミクロタイトレーションプレートに前記
（ｅ）で得られた各モノクローンの培養上清を加え、前
記実施例２，（ｇ）に記載した方法と同様に行った。結
果は表３に示されている。 （ｈ） モノクローナル抗体の精製 前記実施例２，（ｈ）に記載した方法と同様に行った。(F) In vitro growth and in vivo growth of monoclonal antibody The same procedure as in Example 2, (f) above was carried out. (G) Monoclonal Antibody Heavy and Light Chains According to the above-mentioned ELISA method, the culture supernatant of each of the monoclones obtained in (e) above was added to a microtitration plate coated with human proMMP-2, and the above-mentioned Example was carried out. It carried out similarly to the method described in 2, (g). The results are shown in Table 3. (H) Purification of Monoclonal Antibody The same procedure as described in Example 2, (h) above was performed.

【００３４】実施例４ 抗ヒトＭＭＰ−２ポリペプチド
モノクローナル抗体および抗ヒトプロＭＭＰ−２モノク
ローナル抗体の選択 （ａ） 材料の調製 ＤＭＥＭ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅ
ｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ“Ｎｉｓｓｕｉ”（日水
製薬）に重炭酸ナトリウム（３１ｍＭ）およびＬ−グル
タミン（５ｍＭ）を加え、ドライアイスでｐＨ７．２に
調整し、０．２μｍ東洋メンブレンで除菌濾過した。Example 4 Selection of Anti-Human MMP-2 Polypeptide Monoclonal Antibody and Anti-Human Pro-MMP-2 Monoclonal Antibody (a) Preparation of Material DMEM Medium: Dulbecco's Modify
d Sodium bicarbonate (31 mM) and L-glutamine (5 mM) were added to Eagle Medium “Nissui” (Nissui Pharmaceutical), pH was adjusted to 7.2 with dry ice, and 0.2 μm Toyo membrane was used for sterilization filtration.

【００３５】ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドに対するモノ
クローナル抗体を選択するため、ヒト慢性関節リウマチ
（ＲＡ）滑膜細胞を、１５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地で
５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃、６〜７日間培
養し、遠心後の細胞を０．２％ラクトアルブミン水解物
および２０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏ
ｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦα．Ｇｅｎｚｙｍｅ）を
含むＤＭＥＭ培地で懸濁し、同様に６〜８日間培養し
た。遠心後上清を限外濾過あるいは３％トリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）により濃縮し、イムノブロッティング用試料
とした。To select monoclonal antibodies against human MMP-2 polypeptides, human rheumatoid arthritis (RA) synovial cells were cultured in DMEM medium containing 15% FCS in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. for 6 to 7 days. The cells after culturing and centrifugation were treated with 0.2% lactalbumin hydrolyzate and 20 units / ml Tumor Necro.
The cells were suspended in DMEM medium containing sis Factor (TNFα.Genzyme), and similarly cultured for 6 to 8 days. After centrifugation, the supernatant was concentrated by ultrafiltration or 3% trichloroacetic acid (TCA) to obtain a sample for immunoblotting.

【００３６】また、前述の実施例１，３）に記載した方
法により調製したＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭ
ＭＰ−２をヒトプロＭＭＰ−２に対するモノクローナル
抗体を選択するためのイムノブロッティング用試料とし
た。Further, CCD-41SK cell-derived human pro-M prepared by the method described in Examples 1 and 3) above.
MP-2 was used as a sample for immunoblotting to select a monoclonal antibody against human proMMP-2.

【００３７】また、他のＭＭＰｓあるいは他のたん白質
との交差反応を調べるために、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ−
１０８０（アメリカンタイプカルチャーコレクション）
を前記ＮＳ−１培地で５％ＣＯ_２インキュベーター中、
３７℃、２〜３日間培養し、遠心後の細胞を２％ラクト
アルブミン水解物および１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ＴＮ
Ｆαを含むＲＰＭＩ １６４０培地で懸濁し、同様に７
〜１０日間培養した。７００〜８００ｒｐｍ、３分間の
遠心上清を集め、限外濾過あるいは３％ＴＣＡにより濃
縮し、イムノブロッティング用試料とした。In order to examine the cross-reactivity with other MMPs or other proteins, human fibrosarcoma cells HT-
1080 (American Type Culture Collection)
In a 5% CO ₂ incubator with the NS-1 medium,
After culturing at 37 ° C. for 2 to 3 days and centrifuging the cells, 2% lactalbumin hydrolyzate and 100 units / ml TN
Suspend in RPMI 1640 medium containing Fα, and
Cultured for 10 days. The supernatant obtained by centrifugation at 700 to 800 rpm for 3 minutes was collected and concentrated by ultrafiltration or 3% TCA to obtain a sample for immunoblotting.

【００３８】（ｂ） イムノブロッティング 実施例４，（ａ）で調製した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供した後、細胞工学１＆２，１０６１−１０６８（１９
８３）に記載の田部の方法に従ってウエスタンブロッテ
ィングを行い、各モノクローンの培養上清と反応後、ペ
ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｃａ
ｐｐｅｌ Ｌａｂ．）を用い、間接法によりイムノブロ
ッティングを行った。(B) Immunoblotting After subjecting the sample prepared in Example 4, (a) to SDS-PAGE, Cell Engineering 1 & 2, 1061-1068 (19)
83), Western blotting was performed according to the method of Tabe, and after reacting with the culture supernatant of each monoclone, peroxidase-labeled goat anti-mouse immunoglobulin (Ca
ppel Lab. ) Was used for immunoblotting by the indirect method.

【００３９】その結果、第２表に掲げた抗ヒトＭＭＰ−
２ポリペプチドモノクローナル抗体のうち、３４−２Ｈ
１１，３４−２７Ａ５，３５−３Ｆ２，３９−１Ｈ９，
３９−４Ｅ４，３９−１１Ｄ１１，３９−１２Ｂ７，３
９−１８Ｆ３，４２−２Ｈ２，４２−５Ｄ１１，４２−
１４Ｈ５，４３−３Ｆ９，４５−２Ｈ８，４５−６Ｆ１
２，４５−１４Ａ８，４５−１５Ｆ９および４５−１７
Ｄ８の１７個のモノクローナル抗体がヒトＲＡ滑膜細胞
由来プロＭＭＰ−２と反応した。また第３表に掲げた抗
ヒトプロＭＭＰ−２モノクローナル抗体のうち、７５−
７Ｆ７のみがＣＣＤ−４１ＳＫ細胞由来ヒトプロＭＭＰ
−２と反応した。As a result, the anti-human MMPs listed in Table 2 were
34-2H out of 2 polypeptide monoclonal antibodies
11, 34-27A5, 35-3F2, 39-1H9,
39-4E4, 39-11D11, 39-12B7, 3
9-18F3, 42-2H2, 42-5D11, 42-
14H5, 43-3F9, 45-2H8, 45-6F1
2,45-14A8,45-15F9 and 45-17
17 D8 monoclonal antibodies reacted with human RA synovial cell-derived pro-MMP-2. Of the anti-human pro MMP-2 monoclonal antibodies listed in Table 3, 75-
Only 7F7 is human pro-MMP derived from CCD-41SK cells
-Reacted with -2.

【００４０】ヒトプロＭＭＰ−２の分子量は、ＴＮＦα
で刺激されたヒトＲＡ滑膜細胞培養液から調製した試料
を用いたイムノブロッティングの結果から、プロＭＭＰ
−２が７２ｋＤａ、ＡＰＭＡにより活性化された活性型
ＭＭＰ−２が６７ｋＤａであった。The molecular weight of human proMMP-2 is TNFα.
From the results of immunoblotting using samples prepared from human RA synovial cell culture medium stimulated with
-2 was 72 kDa, and active MMP-2 activated by APMA was 67 kDa.

【００４１】（ｃ） 特異性 各陽性の前記（ｂ）の免疫染色で陽性となった抗ヒトＭ
ＭＰ−２ポリペプチドモノクローナル抗体および抗ヒト
プロＭＭＰ−２モノクローナル抗体が各々他のＭＭＰｓ
または他のたん白質と交差反応するかどうかをみるため
に、ＴＮＦαで刺激したヒトＲＡ滑膜細胞およびＨＴ１
０８０細胞のそれぞれの培養液から調製した試料を用い
てイムノブロッティングにより各モノクローナル抗体の
特異性を調べた（表４）。(C) Specificity Anti-human M positive for each positive immunostaining in the above (b)
The MP-2 polypeptide monoclonal antibody and the anti-human pro MMP-2 monoclonal antibody are different from each other.
Or human RA synovial cells stimulated with TNFα and HT1 to see if they cross-react with other proteins
The specificity of each monoclonal antibody was examined by immunoblotting using a sample prepared from each culture solution of 080 cells (Table 4).

【００４２】前記（ｂ）の陽性モノクローナル抗体のう
ち、３４−２Ｈ１１，３９−１Ｈ９および４２−１４Ｈ
５の各モノクローナル抗体は９２ｋＤａゼラチナーゼ
（ヒトプロＭＭＰ−９）と交差反応を示し、４２−２Ｈ
２および４２−１４Ｈ５の各モノクローナル抗体は、ヒ
トプロ間質型コラゲナーゼ（ヒトプロＭＭＰ−１）およ
びヒトプロストロムライシン（ヒトプロＭＭＰ−３）と
交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗体につ
いては、他のヒトプロＭＭＰｓまたは細胞培養液中の他
のたん白質と反応せず、ヒトプロＭＭＰ−２に対して特
異的に反応することが示された。Among the positive monoclonal antibodies of (b) above, 34-2H11, 39-1H9 and 42-14H
Each of the 5 monoclonal antibodies cross-reacted with 92 kDa gelatinase (human pro-MMP-9), 42-2H
The 2 and 42-14H5 monoclonal antibodies cross-reacted with human pro-stroma collagenase (human pro-MMP-1) and human prostromelysin (human pro-MMP-3). The other monoclonal antibodies were shown to react specifically with human proMMP-2 without reacting with other human proMMPs or other proteins in the cell culture medium.

【００４３】更に、特異的に反応することが確認された
もののうち、ＩｇＧ１抗体で、ヒトプロＭＭＰ−２との
反応性の高いものは、４３−３Ｆ９，４２−５Ｄ１１お
よび７５−７Ｆ７の３クローンの抗体であることが認め
られた。Furthermore, among those which were confirmed to react specifically, IgG1 antibodies having high reactivity with human proMMP-2 were three clones of 43-3F9, 42-5D11 and 75-7F7. It was confirmed to be an antibody.

【００４４】実施例５ 酵素標識抗体（ＩｇＧ−ＰＯＤ
複合体）の調製 １） ＳＨ基標識ＩｇＧの調製 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７，１
９８３に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、マ
ウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体を調製
した。ヒトプロＭＭＰ−２に対し、反応性が認められた
モノクローナル抗体（ＩｇＧ：クローンＮｏｓ．４３−
３Ｆ９，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３４，４
２−５Ｄ１１，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３１４
６）を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し透析
し、その溶液に含有するＩｇＧに対して１００倍モルの
Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸をジメチルホルム
アミド溶液として加え、３０℃、３０分間インキュベー
ションした。次に、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）１００μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
６．０）１０μｌ、１Ｍヒドロキシルアミン溶液（ｐＨ
７．０）１００μｌを加え、３０℃、５分間静置後、５
ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５でゲル濾
過し、ＳＨ基標識マウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ＩｇＧを
得た。Example 5 Enzyme-labeled antibody (IgG-POD
Preparation of complex) 1) Preparation of SH group labeled IgG Immunoassay 4,209-327,1
A mouse anti-human pro MMP-2 IgG-POD complex was prepared according to the method of Ishikawa et al. A monoclonal antibody (IgG: clone Nos. 43-, which was recognized to have reactivity with human pro-MMP-2)
3F9, Micro Engineering Research Deposit No. FERM P-13334,4
2-5D11, NIKEN deposit number FERM P-1314
6) was dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), 100 times mol of S-acetylmercaptosuccinic anhydride was added as a dimethylformamide solution to IgG contained in the solution, and the mixture was added at 30 ° C. Incubated for 30 minutes. Next, 0.1 M Tris-HCl buffer (pH
7.0) 100 μl, 0.1 M EDTA solution (pH
6.0) 10 μl, 1M hydroxylamine solution (pH
7.0) 100 μl was added, and the mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 5 minutes, then 5
0.1 M phosphate buffer containing mM EDTA (pH 6.
Gel filtration was performed using Sephadex G-25 equilibrated in 0) to obtain SH group-labeled mouse anti-human pro MMP-2 IgG.

【００４５】２） マレイミド標識ペルオキシダーゼ
（ＰＯＤ）の調製 ＰＯＤを１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ．７．０）に溶解し、そのＰＯＤ量に
対して２５倍モル量のＮ−（ε−マレイミドカプロイル
オキシ）コハク酸イミド（ＥＭＣＳ）をジメチルホルム
アミド溶液として加え、３０℃、３０分間反応させた。
この反応液を０．１Ｍリ酸緩衝液（ｐＨ．６．０）で平
衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムでゲル濾過
し、マレイミド標識ＰＯＤ画分を分取した。2) Preparation of maleimide-labeled peroxidase (POD) POD was dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) to a concentration of 10 mg / ml, and the amount was 25 times the POD amount. A molar amount of N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS) was added as a dimethylformamide solution and reacted at 30 ° C for 30 minutes.
This reaction solution was subjected to gel filtration using a Sephadex G-25 column equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) to collect a maleimide-labeled POD fraction.

【００４６】３） ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体の調整 上記１）で調製したＳＨ基標識ＩｇＧ １モル、上記
２）で得られたマイミド標識ＰＯＤ約５モルを加え、４
℃、２０時間静置した。この混合液を０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＵ１ｔｒｏｇｅｌ Ａ
ｃＡ ４４カラムでゲル濾過し、マウス抗ヒトプロＭＭ
Ｐ−２ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体画分を分取した。ＢＳＡ
およびクロルヘキシジンを各々０．１％および０．００
１％になるように添加し、４℃で保存した。3) Preparation of IgG-POD complex 1 mol of the SH group-labeled IgG prepared in 1) above and about 5 mol of the mimide-labeled POD obtained in 2) above were added and 4
It was left still at 20 ° C. for 20 hours. This mixed solution was equilibrated with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.5), and U1trogel A was equilibrated.
Gel filtration on cA 44 column, mouse anti-human proMM
The P-2 IgG-POD complex fraction was collected. BSA
And chlorhexidine at 0.1% and 0.00, respectively.
It was added to be 1% and stored at 4 ° C.

【００４７】実施例６ ヒトプロＭＭＰ−２の定量法 （ａ） モノクローナル抗体結合担体の調製法 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ４，２０９〜３２７（１
９８３）に記載のＩｓｈｉｋａｗａらの方法に従って、
マウス抗ヒトプロＭＭＰ−２ ＩｇＧ（クローンＮｏ．
７５−７Ｆ７，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３３３
５）を各々０．１％アジ化ナトリウム含有０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１００μｇ／ｍｌ
（Ａ_２８０＝０．１５）の濃度に調整した。そのモノク
ローナル抗体溶液を９６穴マイクロプレートにウエル当
り１００μｌずつ加え、４℃、２４時間静置した。次に
モノクローナル抗体溶液を除去し、各々生理食塩液で２
回洗浄後、１％ＢＳＡ−０．１Ｍ塩化ナトリウム含有１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に浸漬し、４℃で保
存した。Example 6 Method for Quantifying Human ProMMP-2 (a) Method for Preparing Monoclonal Antibody Binding Carrier J. Immunoassay 4,209-327 (1
983) according to the method of Ishikawa et al.
Mouse anti-human pro MMP-2 IgG (clone no.
75-7F7, National Institute of Microscopy Deposit No. FERM P-1333
5) were each dissolved in 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.1% sodium azide to obtain 100 μg / ml.
The concentration was adjusted to (A ₂₈₀ = 0.15). The monoclonal antibody solution was added to a 96-well microplate in an amount of 100 μl per well, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 24 hours. Next, remove the monoclonal antibody solution, and add 2 parts each with physiological saline.
After washing twice, containing 1% BSA-0.1M sodium chloride 1
It was immersed in 0 mM phosphate buffer (pH 7.0) and stored at 4 ° C.

【００４８】（ｂ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法 １％ＢＳＡ ０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ
ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝
液Ａ）で希釈した精製ヒトプロＭＭＰ−２あるいはヒト
ＭＭＰ−２を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ）に各々１０μｌ加えた。次に実施例５で調製し
た酵素標識抗体を１０００ｎｇ／ｍｌとなるように、緩
衝液Ａで希釈し、上記ビニルプレートに各々１１０μｌ
ずつ加え混和した。この混合液を前項（ａ）で調製した
抗体結合プレートに１００μｌ加え、室温で１時間反応
させ、生理食塩液で４回洗浄した。次に０．０２％過酸
化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．
９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン
をウエル当たり１００μｌ加え、室温で３０分間反応
後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し、反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ_４９２をマイクロプレートリーダー（Ｍ
ＰＲ−Ａ４ 東洋ソーダ）を用いて測定し、検量線より
検体中のヒトＭＭＰ−２量を求めた。(B) One-step sandwich EIA method 1% BSA 0.1 M sodium chloride and 10 mM
A sample containing purified human pro-MMP-2 or human MMP-2 diluted with 30 mM phosphate buffer (pH 7.0, buffer A) containing EDTA was added to a 96-well vinyl plate (Fal.
10 μl of each of these). Next, the enzyme-labeled antibody prepared in Example 5 was diluted with buffer solution A to a concentration of 1000 ng / ml, and 110 μl each was added to the vinyl plate.
Add each and mix. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate prepared in the above (a), reacted at room temperature for 1 hour, and washed 4 times with physiological saline. Next, 0.1M citric acid-phosphate buffer solution containing 0.02% hydrogen peroxide (pH 4.
100 μl of 2 mg / ml o-phenylenediamine dissolved in 9) was added to each well and reacted at room temperature for 30 minutes, and then 100 μl of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction. A _{492 of} this reaction mixture was _added to a microplate reader (M
(PR-A4 Toyo Soda), and the amount of human MMP-2 in the sample was determined from the calibration curve.

【００４９】以上の操作法を表５に示す。表５に記載し
たプレート法により、クローンＮｏｓ． ４３−３Ｆ
９，４２−５Ｄ１１からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体および
前記（ａ）項で調製した抗体結合担体を用い、１ステッ
プサンドイッチＥＩＡを行った（表６および図１参
照）。どちらの場合も、標準抗原の濃度に依存した吸光
度が得られたが、固相抗体として７５−７Ｆ７からのＩ
ｇＧ、４３−３Ｆ９からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体（−・
−）の系の方が、固相抗体として７５−７Ｆ７からのＩ
ｇＧ、４２−５Ｄ１１からのＩｇＧ−ＰＯＤ複合体（−
×−）の系より高い吸光度を示すことが認められた。こ
の時、前者のＩｇＧ−ＰＯＤ複合体にクローンＮｏ．４
３−３Ｆ９からの抗体を用いた系では、標準抗原１−５
００ｎｇ／ｍｌ（１０−５，０００ｐｇ／ｗｅｌｌ）の
濃度まで直線が認められた。その結果、固相および酵素
標識抗体用モノクローナル抗体として、クローンＮｏ
ｓ．７５−７Ｆ７および４３−３ Ｆ９からの抗体を以
下の免疫学的定量法に使用することとした。クローンＮ
ｏ．４３−３Ｆ９からの抗体は、ヒトＭＭＰ−２ポリペ
プチドのＮ末端側のペプチドに対するモノクローナル抗
体であるため、ここでは、プロＭＭＰ−２の測定系とい
うことができる。Table 5 shows the above operation method. By the plate method described in Table 5, clone Nos. 43-3F
A one-step sandwich EIA was performed using the IgG-POD complex from 9,42-5D11 and the antibody-bound carrier prepared in (a) above (see Table 6 and FIG. 1). In both cases, a concentration-dependent absorbance of the standard antigen was obtained, but I from 75-7F7 as a solid-phase antibody was obtained.
IgG-POD complex from gG, 43-3F9 (-
The system of −) is the solid phase antibody I from 75-7F7.
IgG-POD complex from gG, 42-5D11 (-
It was confirmed that the system exhibited a higher absorbance than the system (x-). At this time, clone No. was added to the former IgG-POD complex. Four
In the system using the antibody from 3-3F9, the standard antigen 1-5
A straight line was observed up to a concentration of 00 ng / ml (10-5,000 pg / well). As a result, clone No. was obtained as a monoclonal antibody for solid phase and enzyme-labeled antibody.
s. It was decided to use the antibodies from 75-7F7 and 43-3F9 in the following immunoassays. Clone N
o. Since the antibody from 43-3F9 is a monoclonal antibody against the peptide at the N-terminal side of human MMP-2 polypeptide, it can be referred to as a proMMP-2 measurement system here.

【００５０】（ｃ） 緩衝液の選択 １ステップサンドイッチＥＩＡ法で用いる緩衝液の検討
を行った。緩衝液として、緩衝液Ａと、１％ＢＳＡ、
０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡ
含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝液
Ｂ）を用いた。(C) Selection of Buffer Solution The buffer solution used in the one-step sandwich EIA method was examined. As the buffer solution, buffer solution A and 1% BSA,
0.15 M sodium chloride and 10 mM EDTA
A 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.0, buffer solution B) containing was used.

【００５１】実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで希釈した標準抗原を９６穴ビ
ニルプレートに２０μｌ加えた。次に実施例５で調製し
た酵素標識抗体、ＩｇＧ（クローンＮｏ．４３−３Ｆ
９）−ＰＯＤ複合体を１０００ｎｇ／ｍｌになるように
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂで希釈し、上記ビニルプレート
に１００μｌずつ加え、混合した。この混合液を実施例
６，（ａ）で調整した抗体結合プレートに１００μｌ加
え、室温で１時間反応させた。以下の操作は実施例６，
（ｂ）に記載した操作と同様に行った。検量線の結果を
表７および図２に示す。緩衝液Ａ（−・−），Ｂ（−×
−）どちらの場合も標準抗原の濃度に依存した吸光度が
得られたが、緩衝液Ａの方がより高い吸光度を示した。
その結果、以下において緩衝液Ａを用いることにした。According to the method described in Example 6, (b),
20 μl of standard antigen diluted with buffer A and buffer B was added to a 96-well vinyl plate. Next, the enzyme-labeled antibody prepared in Example 5, IgG (clone No. 43-3F
9) -POD complex was diluted with buffer solution A and buffer solution B to 1000 ng / ml, and 100 μl of each was added to the vinyl plate and mixed. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate prepared in Example 6, (a), and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour. The following operations are performed in Example 6,
The same operation as described in (b) was performed. The results of the calibration curve are shown in Table 7 and FIG. Buffer solution A (-・-), B (-x
-) In both cases, the absorbance depending on the concentration of the standard antigen was obtained, but the buffer A showed a higher absorbance.
As a result, it was decided to use the buffer solution A in the following.

【００５２】（ｄ） 希釈試験 実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、希釈試験を行
った。緩衝液Ａで希釈した標準抗原あるいは１／１〜１
／２５６倍に倍数希釈した３種類の検体（健常人血清）
を９６穴ビニルプレートに１０μｌ加えた。以下の操作
は実施例６，（ｂ）に記載した操作と同様に行い、各々
希釈血清を測定した（表８Ａおよび図３参照）。希釈試
験に用いたいずれの血清も充分な直線を示し（γ＞０．
９９９３）、回帰直線もほぼ０点を通った（表８Ｂおよ
び図３参照）。(D) Dilution Test A dilution test was conducted according to the method described in Example 6, (b). Standard antigen diluted with buffer A or 1/1 to 1
/ 3 types of specimens diluted 256-fold (normal human serum)
10 μl was added to a 96-well vinyl plate. The following operation was performed in the same manner as the operation described in Example 6, (b), and the diluted serum was measured (see Table 8A and FIG. 3). All the sera used in the dilution test showed a sufficient straight line (γ> 0.
9993), and the regression line also passed almost 0 point (see Table 8B and FIG. 3).

【００５３】（ｅ） 同時再現性試験および感度 実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、標準抗原液お
よび検体（健常人血清）について同時再現性試験を行っ
た（表９参照）。標準抗原液の吸光度、血清測定値いず
れのＣＶ値も１０％以下であることが認められた。(E) Simultaneous reproducibility test and sensitivity In accordance with the method described in Example 6, (b), the simultaneous reproducibility test was carried out on the standard antigen solution and the sample (serum of healthy person) (see Table 9). It was confirmed that the CV value of both the absorbance and the serum measurement value of the standard antigen solution was 10% or less.

【００５４】標準抗原０ｎｇ／ｍｌの吸光度を８回測定
したときの平均（Ｍ）と標準偏差（ＳＤ）を算出し、Ｍ
＋２ＳＤに相当する標準抗原濃度を感度とするとき、そ
の感度は約０．２４ｎｇ／ｍｌ（２．４ｐｇ／ｗｅｌ
ｌ）であった。Standard antigen The average (M) and standard deviation (SD) of the absorbance at 0 ng / ml measured 8 times were calculated, and M was calculated.
When the standard antigen concentration corresponding to + 2SD is defined as the sensitivity, the sensitivity is about 0.24 ng / ml (2.4 pg / wel
l).

【００５５】（ｆ） 添加回収試験 健常人血清１０μｌに標準抗原液（０、６３、２５０、
５００、１０００、２０００ｎｇ／ｍｌ）各１０μｌを
添加したものを検体とし、１００μｌの酵素標識抗体液
（１１００ｎｇ／ｍｌ）を加えた。ｏ−フェニレンジア
ミン濃度を０．２ｍｇ／ｍｌとした他は実施例６，
（ｂ）に記載した操作法と同様にしてプロＭＭＰ−２量
を測定し、回収された標準抗原量を算出した（表１０参
照）。標準抗原量の平均回収率は９９．５％であり、充
分な回収率が得られ、１０μｌ中の抗原量を正確な値と
して読みとり得ることが認められた。(F) Addition and recovery test 10 μl of serum of a healthy person was mixed with standard antigen solution (0, 63, 250,
(500, 1000, 2000 ng / ml) 10 μl each was used as a sample, and 100 μl of enzyme-labeled antibody solution (1100 ng / ml) was added. Example 6, except that the o-phenylenediamine concentration was 0.2 mg / ml.
The amount of proMMP-2 was measured in the same manner as in the operation method described in (b), and the amount of recovered standard antigen was calculated (see Table 10). It was confirmed that the average recovery rate of the standard antigen amount was 99.5%, sufficient recovery rate was obtained, and the antigen amount in 10 μl could be read as an accurate value.

【００５６】（ｇ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法
による血清中ヒトプロＭＭＰ−２量の測定 前記（ｂ）に記載した１ステップサンドイッチＥＩＡ法
により、検体として各種疾患の血清プロＭＭＰ−２を測
定した（表１１および図４参照）。健常人血清（ｎ＝２
１３）のプロＭＭＰ−２値は、５７０ｎｇ／ｍｌ±１１
８ｎｇ／ｍｌ（Ｍ±ＳＤ）であった。甲状腺機能先進
症、原発性肝癌および胆汁性肝硬変患者血清プロＭＭＰ
−２濃度は各々７４９±１６６ｎｇ／ｍｌ、６８６±２
３６ｎｇ／ｍｌおよび７１６±１３５ｎｇ／ｍｌであ
り、健常人血清プロＭＭＰ−２濃度に比べ有意に高い値
を示した。一方、ＲＡ、変形性関節症、胃癌および膵癌
患者血清プロＭＭＰ−２濃度は、各々４０８±１３９ｎ
ｇ／ｍｌ、４４９±７２ｎｇ／ｍｌ、４２７±１０３ｎ
ｇ／ｍｌおよび４２２±１３０ｎｇ／ｍｌであり、健常
人血清プロＭＭＰ−２濃度に比べ有意に低い値を示し
た。なお、慢性膵炎患者血清プロＭＭＰ−２濃度は、健
常人のそれと比べて有意差は認められなかった。(G) Measurement of human proMMP-2 content in serum by one-step sandwich EIA method Serum proMMP-2 of various diseases was measured as a sample by the one-step sandwich EIA method described in (b) above (Table 11 and FIG. 4). Healthy human serum (n = 2
13) ProMMP-2 value is 570 ng / ml ± 11
It was 8 ng / ml (M ± SD). Serum pro-MMP for patients with advanced thyroidism, primary liver cancer and biliary cirrhosis
-2 concentrations are 749 ± 166 ng / ml and 686 ± 2 respectively
The values were 36 ng / ml and 716 ± 135 ng / ml, which were significantly higher than the serum proMMP-2 concentration in healthy subjects. On the other hand, serum pro-MMP-2 concentrations in RA, osteoarthritis, gastric cancer and pancreatic cancer patients were respectively 408 ± 139n.
g / ml, 449 ± 72 ng / ml, 427 ± 103n
g / ml and 422 ± 130 ng / ml, which were significantly lower than the serum pro-MMP-2 concentration in healthy subjects. The serum proMMP-2 concentration in patients with chronic pancreatitis was not significantly different from that in healthy subjects.

【００５７】実施例７ 血清中抗原の解析 イムノブロッティングにより、検体（血清）中の抗原の
解析を行った。 （ａ） 材料の調製 検体（健常人血清）を、抗ヒトプロＭＭＰ−２モノクロ
ーナル抗体（クローンＮｏ．７５−７Ｆ７）結合カラム
に供し、Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒで充分洗浄後、
その吸着たん白質を８Ｍ尿素含有Ｔｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕ
ｆｆｅｒで溶出した。溶出画分は、ＰＤ−１０カラムに
よりＴｒｉｓ−Ｃａ Ｂｕｆｆｅｒに交換したのち、セ
ントリコン１０（アミコン）により濃縮し、イムノブロ
ッティング用試料とした。Example 7 Analysis of Antigen in Serum Antigen in a sample (serum) was analyzed by immunoblotting. (A) Preparation of material A sample (serum of a healthy person) was subjected to an anti-human pro-MMP-2 monoclonal antibody (clone No. 75-7F7) binding column, washed thoroughly with Tris-Ca Buffer,
The adsorbed protein was used as Tris-Ca Bu containing 8M urea.
Elute with fffer. The elution fraction was exchanged with Tris-Ca Buffer using a PD-10 column, and then concentrated with Centricon 10 (Amicon) to prepare a sample for immunoblotting.

【００５８】（ｂ） イムノブロッティング 前記（ａ）で調製した血清試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供した後、細胞工学１＆２，１０６１−１０６８（１９
８３）に記載の田部の方法に従ってウエスタンブロッテ
ィングを行った。次に、抗ヒトＭＭＰ−２ ＩｇＧ（ク
ロー）Ｎｏｓ．４３−３Ｆ９および７５−７Ｆ７）−Ｐ
ＯＤ複合体、抗ヒトＴＩＭＰ−２ １ｇＧ（クローンＮ
ｏ．６７−４Ｈ１１，微工研寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
２６９０）−ＰＯＤ複合体の３種を用いて免疫染色を行
った。ここで用いた抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル
抗体（クローンＮｏ．６７−４Ｈ１１）は、ヒトＴＩＭ
Ｐ−２ポリペプチド（ＹＲＧＡＡＰＰＫＱＥＦＬＤＩＥ
Ｄ）に対する抗体で、免疫原のキャリヤーたん白質とし
てＫＬＨを使用した以外は実施例２の記載方法に従い調
製した。こうして得られたモノクローナル抗体のうち、
クローンＮｏ．６７−４Ｈ１１の抗体を酵素標識抗体と
後述する実施例８，（ａ）に記載した抗体結合Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４Ｂカラムに使用した。(B) Immunoblotting After subjecting the serum sample prepared in (a) above to SDS-PAGE, Cell Engineering 1 & 2, 1061-1068 (19)
Western blotting was performed according to the method of Tabe described in 83). Next, anti-human MMP-2 IgG (claw) Nos. 43-3F9 and 75-7F7) -P
OD complex, anti-human TIMP-2 1gG (clone N
o. 67-4H11, MIC deposit number FERM P-1
Immunostaining was performed using 3 types of 2690) -POD complex. The anti-human TIMP-2 monoclonal antibody (clone No. 67-4H11) used here was human TIM.
P-2 polypeptide (YRGAAPPKQEFLDIE
An antibody against D) was prepared according to the method described in Example 2 except that KLH was used as the carrier protein of the immunogen. Of the monoclonal antibodies thus obtained,
Clone No. The antibody of 67-4H11 is an enzyme-labeled antibody and the antibody-bound Seph described in Example 8, (a) below.
Used on an arose 4B column.

【００５９】結果を図５に示す。４３−３Ｆ９および７
５−７Ｆ７ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体で染色した場合（各
々レーン１およびレーン２）、７２ｋＤａ付近に陽性バ
ンドが、また、６７−４Ｈ１１ ＩｇＧ−ＰＯＤ複合体
で染色した場合（レーン３）、２４ｋＤａ付近に陽性バ
ンドが確認された。したがって血清中においては、ＭＭ
Ｐ−２はほとんど潜在（プロ）型として存在し、そのプ
ロＭＭＰ−２は単独あるいは、ＴＩＭＰ−２と複合体を
形成して存在することが示唆された。The results are shown in FIG. 43-3F9 and 7
When stained with 5-7F7 IgG-POD complex (lane 1 and lane 2 respectively), a positive band near 72 kDa, and when stained with 67-4H11 IgG-POD complex (lane 3), around 24 kDa. A positive band was confirmed. Therefore, in serum, MM
It was suggested that P-2 exists almost as a latent (pro) type, and that pro-MMP-2 exists alone or in the form of a complex with TIMP-2.

【００６０】実施例８ ヒトＴＩＭＰ−２添加効果 一定量のプロＭＭＰ−２に種々の濃度のＴＩＭＰ−２を
加えたものを検体とし、１ステップサンドイッチＥＩＡ
系に対する影響を調べた。Example 8 Effect of Human TIMP-2 Addition One-step sandwich EIA was prepared by using a fixed amount of proMMP-2 to which various concentrations of TIMP-2 were added as a sample.
The effect on the system was investigated.

【００６１】（ａ） ヒト胎盤由来ヒトＴＩＭＰ−２の
精製 胎盤を細切し、１ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ塩化ナ
トリウム、０．００５％ブリッジ−３５，１ｍＭ Ｎ−
エチルマレイミド、５ｍＭＥＤＴＡ，５ｍＭ塩酸ベンズ
アミジン含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．
４）を加え撹拌し、３０分間静置した。その後、高速冷
却遠心機（ＨＩＴＡＣＨＩ）により、１０，０００ｒｐ
ｍ、４℃、５０分間遠心分離を行い、上清を得た。同様
の操作をもう一度繰り返し、上清をプールした。次に、
この上清を抗ヒトＴＩＭＰ−２モノクローナル抗体（ク
ローンＮｏ．６７−４Ｈ１１）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
４Ｂカラムに吸着させたのち、１ｍＭ塩化カルシウ
ム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．００５％ブリッジ−
３５含有２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４，緩
衝液Ｃ）により、その抗体結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４
Ｂ樹脂をガラスフィルター上で洗浄した。更に、緩衝液
Ｃと１ｍＭ塩化カルシウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、
０．００５％ブリッジ−３５含有０．１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）で交互に洗浄後、樹脂をカラムに詰め直
し、吸着たん白質を１ｍＭ塩化カルシウム、０．００５
％ブリッジ−３５含有０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液
（ｐＨ２．５）で溶出し、直ちに１ｍＭ塩化カルシウ
ム、０．００５％ブリッジ−３５含有３Ｍトリス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）により中和した。次にこの溶出画
分を限外濾過（東洋濾紙ＵＨＰ−４３）により濃縮し、
Ｕｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ５４（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｃｓ）によりゲル濾過した。各フラクションのＡ
_２８０を測定し、２つ目のピークを集めた。ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上、得られたヒトＴＩＭＰ−２は、単一バンドに
精製された。(A) Purification of human TIMP-2 derived from human placenta The placenta was cut into small pieces, 1 mM calcium chloride, 0.1 M sodium chloride, 0.005% bridge-35, 1 mM N-.
Ethylmaleimide, 5 mM EDTA, 5 mM benzamidine hydrochloride-containing 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
4) was added and stirred, and the mixture was left standing for 30 minutes. Then, 10,000 rpm with a high-speed cooling centrifuge (HITACHI)
The mixture was centrifuged at 4 ° C. for 50 minutes to obtain a supernatant. The same operation was repeated once again, and the supernatants were pooled. next,
This supernatant was used for Sepharose binding to anti-human TIMP-2 monoclonal antibody (clone No. 67-4H11).
After adsorbing on a 4B column, 1 mM calcium chloride, 0.1 M sodium chloride, 0.005% bridge-
The antibody-bound Sepharose 4 with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, buffer C) containing 35.
The B resin was washed on a glass filter. Further, buffer C, 1 mM calcium chloride, 0.1 M sodium chloride,
After alternately washing with 0.1M acetate buffer (pH 5.5) containing 0.005% Bridge-35, the resin was repacked in the column, and the adsorbed protein was diluted with 1 mM calcium chloride, 0.005
0.1 M glycine-hydrochloric acid buffer containing% -bridge-35
It was eluted at (pH 2.5) and immediately neutralized with 3M Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) containing 1 mM calcium chloride and 0.005% Bridge-35. Next, the eluted fraction was concentrated by ultrafiltration (Toyo Filter Paper UHP-43),
Ultrogel AcA54 (IBF Biotec
gel filtration by hnics). A for each fraction
₂₈₀ was measured and the second peak was collected. SDS-P
The resulting human TIMP-2 was purified to a single band on AGE.

【００６２】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２添加効果 プロＭＭＰ−２量を一定とし、ヒトＴＩＭＰ−２をモル
比（ＴＩＭＰ−２／プロＭＭＰ−２）が１２５，２５，
１，０．２，０．０４，０となるように加えた。反応
後、プロＭＭＰ−２量を基準に緩衝液Ａにより希釈し、
実施例６，（ｂ）に記載した１ステップサンドイッチＥ
ＩＡ法によりプロＭＭＰ−２量を測定した（表１２参
照）。その結果、ヒトＴＩＭＰ−２添加量を増やしても
プロＭＭＰ−２各濃度のＡ_４９２値に変化は認められな
かった。従って、このアッセイ系により、 プロＭＭＰ
−２−ＴＩＭＰ−２複合体中のプロＭＭＰ−２もフリー
のプロＭＭＰ−２と同程度の免疫反応性で認識できるこ
とが判明した。(B) Effect of human TIMP-2 addition With the amount of proMMP-2 being constant, the molar ratio of human TIMP-2 (TIMP-2 / proMMP-2) was 125, 25,
1, 0.2, 0.04 and 0 were added. After the reaction, dilute with buffer A based on the amount of pro-MMP-2,
One-step sandwich E described in Example 6, (b)
The amount of pro-MMP-2 was measured by the IA method (see Table 12). As a result, no change was observed in the A ₄₉₂ value of each concentration of pro-MMP-2 even if the amount of human TIMP-2 added was increased. Therefore, this assay system allows proMMP
It was found that proMMP-2 in the 2-TIMP-2 complex can also be recognized with the same degree of immunoreactivity as free proMMP-2.

【００６３】[0063]

【表１】 [Table 1]

【００６４】[0064]

【表２】 [Table 2]

【００６５】[0065]

【表３】 [Table 3]

【００６６】[0066]

【表４】 [Table 4]

【００６７】[0067]

【表５】 [Table 5]

【００６８】[0068]

【表６】 [Table 6]

【００６９】[0069]

【表７】 [Table 7]

【００７０】[0070]

【表８】 [Table 8]

【００７１】[0071]

【表９】 [Table 9]

【００７２】[0072]

【表１０】 [Table 10]

【００７３】[0073]

【表１１】 [Table 11]

【００７４】[0074]

【表１２】 [Table 12]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】ヒトプロＭＭＰ−２の標準曲線を示すグラフで
あり、縦軸は４９２ｎｍにおける吸光度、横軸はプロＭ
ＭＰ−２濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。FIG. 1 is a graph showing a standard curve of human pro-MMP-2, in which the vertical axis represents absorbance at 492 nm and the horizontal axis represents pro-M.
The MP-2 concentration (ng / ml) is shown.

【図２】プロＭＭＰ−２，１ステップサンドイッチＥＩ
Ａ法に使用する緩衝液の影響を示すグラフであり、縦
軸、横軸はいずれも図１と同様である。FIG. 2 Pro MMP-2, 1 step sandwich EI
It is a graph which shows the influence of the buffer solution used for A method, and a vertical axis and a horizontal axis are the same as that of FIG.

【図３】健常人血清の希釈試験の結果を示すグラフであ
り、縦軸はプロＭＭＰ−２量（ｎｇ／ｍｌ）、横軸は希
釈倍率（倍）を示す。FIG. 3 is a graph showing the results of a dilution test of serum of healthy subjects, in which the vertical axis represents the amount of pro-MMP-2 (ng / ml) and the horizontal axis represents the dilution factor (fold).

【図４】各種疾患血清のプロＭＭＰ−２測定結果を示す
グラフであり、縦軸はプロＭＭＰ−２量（ｎｇ／ｍ
ｌ）、横軸は表１１に示した各疾患番号を表わす。FIG. 4 is a graph showing the results of measurement of pro-MMP-2 in serum of various diseases, in which the vertical axis represents the amount of pro-MMP-2 (ng / m 2
l), the horizontal axis represents each disease number shown in Table 11.

【図５】血清中抗原のイムノブロッティングの結果を表
わす図である。FIG. 5 shows the results of immunoblotting of serum antigens.

─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───

【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成６年３月２４日[Submission date] March 24, 1994

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】請求項１[Name of item to be corrected] Claim 1

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０００２[Name of item to be corrected] 0002

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【０００２】[0002]

【背景技術】細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロ
テオグリカン、エラスチン、フィブロネクチンおよびラ
ミニンなとの接着性糖蛋白質から構成されている（下岡
ら，臨床検査，３４，１７１９−１７２４）。これらマ
トリックス成分の分解には、マトリックスメタロプロテ
アーゼ類（ＭＭＰｓ）が重要な役割を果たしている。そ
の中でプロＭＭＰ−２と称される７２−ｋＤａ（キロダ
ルトン）ゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼは、ヒトリ
ウマチ滑膜細胞（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，１９４：７２１−７３０，１９９０）や中島
ら（実験医学，７，３２−４０（５４２−５５０），１
９８９）によって報告されているように、ヒトＡ２０５
８メラノーマ細胞、ラット乳癌細胞、ヒト大腸癌細胞、
Ｈ−ｒａｓでトランスフォームされたヒト気管支上皮細
胞などにより産生され、酵素的限定分解または、４−ア
ミノフェニル酢酸水銀（ＡＰＭＡ）なとのチオール基反
応性有機水銀化合物により活性化され、ゼラチン、ＩＶ
型コラーゲンおよびＶ型コラーゲン、更にプロテオグリ
カンコアたん白質やフィブロネクチン、不溶性エラスチ
ンを分解する活性を有していることが認められている
（Ｏｋａｄａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９
４：７２１−７３０，１９９０）。BACKGROUND ART The extracellular matrix is composed of adhesive glycoproteins such as collagen, proteoglycan, elastin, fibronectin and laminin (Shimooka et al., Clinical examination, 34, 1719-1724). Matrix metalloproteases (MMPs) play an important role in the decomposition of these matrix components. A 72-kDa (kilodalton) gelatinase / type IV collagenase, called pro-MMP-2, is used in human rheumatoid synovial cells (Okada et al., Eur. J. Bioc).
hem. , 194: 721-730, 1990) and Nakajima et al. (Experimental Medicine, 7, 32-40 (542-550), 1).
989) and human A205.
8 melanoma cells, rat breast cancer cells, human colon cancer cells,
Produced by human bronchial epithelial cells transformed with H-ras, activated by limited enzymatic decomposition or thiol group-reactive organomercury compound with 4-aminophenylmercuric acetate (APMA), gelatin, IV
It is recognized that it has an activity of degrading type I collagen and type V collagen, as well as proteoglycan core protein, fibronectin, and insoluble elastin (Okada et al., Eur. J. Biochem., 19).
4: 721-730, 1990).

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１０[Correction target item name] 0010

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１０】２） 免疫原の調製 ２ｍｇ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｌの０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解したものと１．８５
ｍｇＮ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸
イミドを２００μｌのジメチルホルムアミドに溶解した
ものとを混合し、３０℃、３０分間インキュベーション
した。次に上記の混合液を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（セファデック
スＧ−２５Ｍ、ファルマシア）に供し、マレイミドが結
合されたＢＳＡを分取し、１．５ｍｌ以下に濃縮した。
マレイミドが結合されたＢＳＡに対し５０倍モル量の前
記（ａ）で合成した各ヒトＭＭＰ−２ポリペプチドを１
ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した
ものと混合した。４℃、２０時間インキュベーション
し、ＭＭＰ−２ポリペプチド−ＢＳＡ複合体を調製し
た。2) Preparation of immunogen 2 mg bovine serum albumin (BSA) in 1 ml 0.1 M
1.85 dissolved in phosphate buffer (pH 7.0)
A mixture of mg N- (ε-maleimidocaproyloxy) succinimide dissolved in 200 μl of dimethylformamide was mixed and incubated at 30 ° C. for 30 minutes. Next, the above mixed solution is mixed with 0.1M phosphate buffer (pH
It was applied to a PD-10 column (Sephadex G-25M, Pharmacia) equilibrated with 7.0), and the maleimide-bound BSA was fractionated and concentrated to 1.5 ml or less.
A 50-fold molar amount of each human MMP-2 polypeptide synthesized in (a) above with respect to BSA to which maleimide was bound was used.
It was mixed with that dissolved in ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0). After incubation at 4 ° C. for 20 hours, an MMP-2 polypeptide-BSA complex was prepared.

【手続補正４】[Procedure amendment 4]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００４２[Correction target item name] 0042

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００４２】前記（ｂ）の陽性モノクローナル抗体のう
ち、３４−２Ｈ１１，３９−１Ｈ９および４２−１４Ｈ
５の各モノクローナル抗体は９２ｋＤａゼラチナーゼ
（ヒトプロＭＭＰ−９）と交差反応を示し、４２−２Ｈ
２および４２−１４Ｈ５の各モノクローナル抗体は、ヒ
トプロ間質型コラゲナーゼ（ヒトプロＭＭＰ−１）およ
びヒトプロストロムライシン−１（ヒトプロＭＭＰ−
３）と交差反応を示した。それ以外のモノクローナル抗
体については、他のヒトプロＭＭＰｓまたは細胞培養液
中の他のたん白質と反応せず、ヒトプロＭＭＰ−２に対
して特異的に反応することが示された。Among the positive monoclonal antibodies of (b) above, 34-2H11, 39-1H9 and 42-14H
Each of the 5 monoclonal antibodies cross-reacted with 92 kDa gelatinase (human pro-MMP-9), 42-2H
2 and 42-14H5 monoclonal antibodies are human pro-interstitial collagenase (human proMMP-1) and human prostromelysin-1 (human proMMP-
It showed a cross-reaction with 3). The other monoclonal antibodies were shown to react specifically with human proMMP-2 without reacting with other human proMMPs or other proteins in the cell culture medium.

【手続補正５】[Procedure Amendment 5]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００４８[Correction target item name] 0048

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００４８】（ｂ） １ステップサンドイッチＥＩＡ法 １％ＢＳＡ、０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１０ｍＭ
ＥＤＴＡ含有３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，緩衝
液Ａ）で希釈した精製ヒトプロＭＭＰ−２あるいはヒト
ＭＭＰ−２を含む検体を９６穴ビニルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ）に各々１０μｌ加えた。次に実施例５で調製し
た酵素標識抗体を１０００ｎｇ／ｍｌとなるように、緩
衝液Ａで希釈し、上記ビニルプレートに各々１１０μｌ
ずつ加え混和した。この混合液を前項（ａ）で調製した
抗体結合プレートに１００μｌ加え、室温で１時間反応
させ、生理食塩液で４回洗浄した。次に０．０２％過酸
化水素含有０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．
９）に溶解した２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニレンジアミン
をウエル当たり１００μｌ加え、室温で３０分間反応
後、２Ｎ硫酸１００μｌ添加し、反応を停止させた。こ
の反応混液のＡ_４９２をマイクロプレートリーダー（Ｍ
ＰＲ−Ａ４ 東洋ソーダ）を用いて測定し、検量線より
検体中のヒトＭＭＰ−２量を求めた。(B) One-step sandwich EIA method 1% BSA, 0.1 M sodium chloride and 10 mM
A sample containing purified human pro-MMP-2 or human MMP-2 diluted with 30 mM phosphate buffer (pH 7.0, buffer A) containing EDTA was added to a 96-well vinyl plate (Fal.
10 μl of each of these). Next, the enzyme-labeled antibody prepared in Example 5 was diluted with buffer solution A to a concentration of 1000 ng / ml, and 110 μl each was added to the vinyl plate.
Add each and mix. 100 μl of this mixed solution was added to the antibody-bound plate prepared in the above (a), reacted at room temperature for 1 hour, and washed 4 times with physiological saline. Next, 0.1M citric acid-phosphate buffer solution containing 0.02% hydrogen peroxide (pH 4.
100 μl of 2 mg / ml o-phenylenediamine dissolved in 9) was added to each well and reacted at room temperature for 30 minutes, and then 100 μl of 2N sulfuric acid was added to stop the reaction. A _{492 of} this reaction mixture was _added to a microplate reader (M
(PR-A4 Toyo Soda), and the amount of human MMP-2 in the sample was determined from the calibration curve.

【手続補正６】[Procedure correction 6]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００５２[Correction target item name] 0052

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００５２】（ｄ） 希釈試験 実施例６，（ｂ）に記載した方法に従い、希釈試験を行
った。緩衝液Ａで希釈した標準抗原あるいは１／１〜１
／２５６倍に倍数希釈した３種類の検体（健常人血清）
を９６穴ビニルプレートに１０μｌ加えた。以下の操作
は実施例６，（ｂ）に記載した操作と同様に行い、各々
希釈血清を測定した（表８Ａおよび図３参照）。希釈試
験に用いたいずれの血清も充分な直線を示し、回帰直線
もほぼ０点を通った（表８Ｂおよび図３参照）。(D) Dilution Test A dilution test was conducted according to the method described in Example 6, (b). Standard antigen diluted with buffer A or 1/1 to 1
/ 3 types of specimens diluted 256-fold (normal human serum)
10 μl was added to a 96-well vinyl plate. The following operation was performed in the same manner as the operation described in Example 6, (b), and the diluted serum was measured (see Table 8A and FIG. 3). All the sera used in the dilution test showed a sufficient straight line, and the regression line also passed almost 0 point (see Table 8B and FIG. 3).

【手続補正７】[Procedure Amendment 7]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００６２[Correction target item name] 0062

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００６２】（ｂ） ヒトＴＩＭＰ−２添加効果 プロＭＭＰ−２量を一定とし、ヒトＴＩＭＰ−２をモル
比（ＴＩＭＰ−２／プロＭＭＰ−２）が１２５，２５，
１，０．２，０．０４，０となるように加えた。反応
後、プロＭＭＰ−２量を基準にＥＤＴＡを除いた緩衝液
Ａにより希釈し、実施例６，（ｂ）に記載した１ステッ
プサンドイッチＥＩＡ法によりプロＭＭＰ−２量を測定
した（表１２参照）。その結果、ヒトＴＩＭＰ−２添加
量を増やしてもプロＭＭＰ−２各濃度のＡ_４９２値に変
化は認められなかった。従って、このアッセイ系によ
り、プロＭＭＰ−２−ＴＩＭＰ−２複合体中のプロＭＭ
Ｐ−２もフリーのプロＭＭＰ−２と同程度の免疫反応性
で認識できることが判明した。(B) Effect of human TIMP-2 addition With the amount of proMMP-2 being constant, the molar ratio of human TIMP-2 (TIMP-2 / proMMP-2) was 125, 25,
1, 0.2, 0.04 and 0 were added. After the reaction, the amount of proMMP-2 was measured by the 1-step sandwich EIA method described in Example 6, (b) by diluting with buffer A excluding EDTA based on the amount of proMMP-2 (see Table 12). ). As a result, no change was observed in the A ₄₉₂ value of each concentration of pro-MMP-2 even if the amount of human TIMP-2 added was increased. Therefore, this assay system allows for proMM in proMMP-2-TIMP-2 complex.
It was found that P-2 can also be recognized with the same degree of immunoreactivity as free proMMP-2.

【手続補正８】[Procedure Amendment 8]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００６４[Correction target item name] 0064

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００６４】[0064]

【表２】 [Table 2]

【手続補正９】[Procedure Amendment 9]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００７０[Name of item to be corrected] 0070

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００７０】[0070]

【表８】 [Table 8]

【手続補正１０】[Procedure Amendment 10]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００７４[Correction target item name] 0074

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００７４】[0074]

【表１２】 [Table 12]

【手続補正１１】[Procedure Amendment 11]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】図２[Name of item to be corrected] Figure 2

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【図２】プロＭＭＰ−２の１ステップサンドイッチＥＩ
Ａ法に使用する緩衝液の影響を示すグラフであり、縦
軸、横軸はいずれも図１と同様である。FIG. 2: One-step sandwich EI of pro-MMP-2
It is a graph which shows the influence of the buffer solution used for A method, and a vertical axis and a horizontal axis are the same as that of FIG.

【手続補正１３】[Procedure Amendment 13]

【補正対象書類名】図面[Document name to be corrected] Drawing

【補正対象項目名】図３[Name of item to be corrected] Figure 3

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【図３】 [Figure 3]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 酒井 智恵 富山県射水郡小杉町戸破3799番地６号 (72)発明者 東海 秀明 富山県高岡市横田本町11番１号 (72)発明者 早川 太郎 愛知県名古屋市天白区向が丘３丁目406番 地 (72)発明者 岩田 和士 富山県高岡市五十里東町190番地 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Chie Sakai 3799-6 Tobata, Kosugi-cho, Imizu-gun, Toyama Prefecture (72) Inventor Hideaki Tokai 11-11 Yokotahonmachi, Takaoka-shi, Toyama Prefecture (72) Inventor Taro Hayakawa Aichi 3-406, Mukogaoka, Tenpaku-ku, Nagoya, Japan (72) Inventor, Kazushi Iwata 190, Igarito-cho, Takaoka-shi, Toyama

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型
コラゲナーゼに対し、特異的に結合する２種類のモノク
ローナル抗体を、固相担体に結合させる担体、あるいは
標識物を付与する抗体として用いて、サンドイッチ法に
より免疫学的に測定を行うことを特徴とするヒト７２−
ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コラゲナーゼの定量法。1. A sandwich method in which two types of monoclonal antibodies that specifically bind to human 72-kDa gelatinase / type IV collagenase are used as a carrier for binding to a solid phase carrier or an antibody to which a labeling substance is attached. 72- characterized by immunologically measuring by
Quantitative determination of kDa gelatinase / type IV collagenase. 【請求項２】 血清中のヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ
／ＩＶ型コラゲナーゼを測定することを特徴とする請求
項１に記載のヒト７２−ｋＤａゼラチナーゼ／ＩＶ型コ
ラゲナーゼの定量法。2. The method for quantifying human 72-kDa gelatinase / IV collagenase according to claim 1, which comprises measuring human 72-kDa gelatinase / IV collagenase in serum.