JPH06205699A - α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 - Google Patents
α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬Info
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- JPH06205699A JPH06205699A JP1962793A JP1962793A JPH06205699A JP H06205699 A JPH06205699 A JP H06205699A JP 1962793 A JP1962793 A JP 1962793A JP 1962793 A JP1962793 A JP 1962793A JP H06205699 A JPH06205699 A JP H06205699A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 α−アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自
動分析機を使用して測定することができるα−アミラー
ゼ活性測定法及びこの測定法に使用するための試薬を提
供する。 【構成】 還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ
糖からなる基質に、α−アミラーゼを含む検体をカルシ
ウムイオンの共存下に、該α−アミラーゼの活性至適p
Hで作用させて基質を分解する第一工程、第一工程で得
られた生成物にα−グルコシダーゼ及びカルシウムイオ
ン捕捉剤を、α−グルコシダーゼの活性至適pHで作用
させる第二工程、及び第二工程で生成した色素を比色定
量する第三工程からなるα−アミラーゼ活性測定法。色
素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カ
ルシウム塩化合物及びα−アミラーゼの活性至適pHを
有する緩衝液を含む第一液、及びα−グルコシダーゼ、
カルシウムイオン捕捉剤及び緩衝液を含む第二液からな
るα−アミラーゼ活性測定用試薬
動分析機を使用して測定することができるα−アミラー
ゼ活性測定法及びこの測定法に使用するための試薬を提
供する。 【構成】 還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ
糖からなる基質に、α−アミラーゼを含む検体をカルシ
ウムイオンの共存下に、該α−アミラーゼの活性至適p
Hで作用させて基質を分解する第一工程、第一工程で得
られた生成物にα−グルコシダーゼ及びカルシウムイオ
ン捕捉剤を、α−グルコシダーゼの活性至適pHで作用
させる第二工程、及び第二工程で生成した色素を比色定
量する第三工程からなるα−アミラーゼ活性測定法。色
素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カ
ルシウム塩化合物及びα−アミラーゼの活性至適pHを
有する緩衝液を含む第一液、及びα−グルコシダーゼ、
カルシウムイオン捕捉剤及び緩衝液を含む第二液からな
るα−アミラーゼ活性測定用試薬
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、新しいα−アミラーゼ
活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬に関す
る。
活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬に関す
る。
【0002】
【従来の技術】急性膵炎の高アミラーゼ血症、耳下腺
炎、肺ガン等の異所性アミラーゼ産生腫瘍等の診断のた
めに、血清、膵液、尿などのα−アミラーゼ活性を測定
することが重要であり、古くから行われている。
炎、肺ガン等の異所性アミラーゼ産生腫瘍等の診断のた
めに、血清、膵液、尿などのα−アミラーゼ活性を測定
することが重要であり、古くから行われている。
【0003】α−アミラーゼ活性測定法として、旧くは
粘稠なデンプン溶液の粘度の減少を測定する粘度法、混
濁したデンプン溶液の濁度の減少を測定する比濁法等が
あるが、感度及び精度の問題から現在殆ど使用されてい
ない。また、α−アミラーゼの作用により生成した還元
糖による銅の還元を利用したソモジー法や、デンプンに
色素チバクロン(Cibachron )を結合させた青色デンプ
ン(ブルースターチ)を発色基質とするブルースターチ
法が広く使用されているが、操作が煩雑で、基質の品質
が不安定であると言う問題がある。
粘稠なデンプン溶液の粘度の減少を測定する粘度法、混
濁したデンプン溶液の濁度の減少を測定する比濁法等が
あるが、感度及び精度の問題から現在殆ど使用されてい
ない。また、α−アミラーゼの作用により生成した還元
糖による銅の還元を利用したソモジー法や、デンプンに
色素チバクロン(Cibachron )を結合させた青色デンプ
ン(ブルースターチ)を発色基質とするブルースターチ
法が広く使用されているが、操作が煩雑で、基質の品質
が不安定であると言う問題がある。
【0004】最近、糖鎖の短い均一な組成のオリゴ糖が
比較的容易に調製できるようになり、これらの合成基質
にα−アミラーゼを作用させて生じる成分を更に検出酵
素と共役させて酵素的にα−アミラーゼを測定する酵素
的測定法が、測定の自動化に伴って日常使用されてい
る。
比較的容易に調製できるようになり、これらの合成基質
にα−アミラーゼを作用させて生じる成分を更に検出酵
素と共役させて酵素的にα−アミラーゼを測定する酵素
的測定法が、測定の自動化に伴って日常使用されてい
る。
【0005】酵素的測定法の中に合成発色基質を使用す
る方法がある。その一例は、下記の原理1又は原理2を
測定原理とする方法である。
る方法がある。その一例は、下記の原理1又は原理2を
測定原理とする方法である。
【0006】
【化1】
【0007】即ち、原理1に於ては、p−ニトロフェノ
ールを標識した基質(p−ニトロフェニルマルトヘプタ
オシド:pNP−G7)にα−アミラーゼが作用し、生
成するp−ニトロフェニルマルトトリオシド(pNP−
G3)にα−グルコシダーゼが作用して、遊離するp−
ニトロフェノール(pNP)を比色定量する。また、原
理2に於ては、2,4−ジクロロフェノールを標識した
基質(2,4−ジクロロフェニルマルトヘプタオシド:
DCP−G7)にα−アミラーゼが作用し、生成する
2,4−ジクロロフェニルマルトトリオシド(DCP−
G3)にα−グルコシダーゼが作用して、遊離する2,
4−ジクロフェノール(DCP)を、4−アミノアンチ
ピリンと過ヨウ素酸カリで酸化して生成する赤色キノン
色素を比色定量する。
ールを標識した基質(p−ニトロフェニルマルトヘプタ
オシド:pNP−G7)にα−アミラーゼが作用し、生
成するp−ニトロフェニルマルトトリオシド(pNP−
G3)にα−グルコシダーゼが作用して、遊離するp−
ニトロフェノール(pNP)を比色定量する。また、原
理2に於ては、2,4−ジクロロフェノールを標識した
基質(2,4−ジクロロフェニルマルトヘプタオシド:
DCP−G7)にα−アミラーゼが作用し、生成する
2,4−ジクロロフェニルマルトトリオシド(DCP−
G3)にα−グルコシダーゼが作用して、遊離する2,
4−ジクロフェノール(DCP)を、4−アミノアンチ
ピリンと過ヨウ素酸カリで酸化して生成する赤色キノン
色素を比色定量する。
【0008】これらの酵素的測定法は、一般に、反応時
間0での酵素反応速度を測定する(実際には、単位時間
当りの酵素反応速度が直線的である部分を測定する)レ
ート法(rate法:初速度分析法とも呼ばれる)により行
われており、α−アミラーゼを含有する検体と基質及び
α−グルコシダーゼとを一緒に作用させて反応させてい
る。従って、上記の反応は一般にα−グルコシダーゼの
活性至適pH域である7.0〜7.2のpHを有する緩
衝液中で行われている。
間0での酵素反応速度を測定する(実際には、単位時間
当りの酵素反応速度が直線的である部分を測定する)レ
ート法(rate法:初速度分析法とも呼ばれる)により行
われており、α−アミラーゼを含有する検体と基質及び
α−グルコシダーゼとを一緒に作用させて反応させてい
る。従って、上記の反応は一般にα−グルコシダーゼの
活性至適pH域である7.0〜7.2のpHを有する緩
衝液中で行われている。
【0009】ヒト血清中のα−アミラーゼの活性至適p
H域は7.0〜7.2であり、α−グルコシダーゼの活
性至適pH域と同じであり、ヒト血清中のα−アミラー
ゼとα−グルコシダーゼとを同じpHの環境下で反応さ
せても、両酵素がそれぞれ最大活性を示すので特に問題
は無い。
H域は7.0〜7.2であり、α−グルコシダーゼの活
性至適pH域と同じであり、ヒト血清中のα−アミラー
ゼとα−グルコシダーゼとを同じpHの環境下で反応さ
せても、両酵素がそれぞれ最大活性を示すので特に問題
は無い。
【0010】しかしながら、α−アミラーゼはその起源
が異なるとその活性至適pH域が異なることが考えられ
る。例えば、動物由来のα−アミラーゼとヒト由来のα
−アミラーゼとでは、またヒト由来でも血清中のα−ア
ミラーゼと膵液中のα−アミラーゼとでは、その活性至
適pH域が異なると考えられる。若し、測定しようとす
るα−アミラーゼの活性至適pH域が、α−グルコシダ
ーゼの活性至適pH域とは異なっていると、レート法に
よりα−アミラーゼ活性を測定する際に、反応液のpH
をα−グルコシダーゼの活性至適pHに合わせた場合に
はα−アミラーゼはその最大活性を示さず、逆に反応液
のpHを測定対象のα−アミラーゼの活性至適pH域に
合わせた場合にはα−グルコシダーゼはその最大活性を
示さないことになる。このような場合、レート法による
酵素的測定法によっては、α−アミラーゼの真の活性を
正しく測定することはできなくなる。
が異なるとその活性至適pH域が異なることが考えられ
る。例えば、動物由来のα−アミラーゼとヒト由来のα
−アミラーゼとでは、またヒト由来でも血清中のα−ア
ミラーゼと膵液中のα−アミラーゼとでは、その活性至
適pH域が異なると考えられる。若し、測定しようとす
るα−アミラーゼの活性至適pH域が、α−グルコシダ
ーゼの活性至適pH域とは異なっていると、レート法に
よりα−アミラーゼ活性を測定する際に、反応液のpH
をα−グルコシダーゼの活性至適pHに合わせた場合に
はα−アミラーゼはその最大活性を示さず、逆に反応液
のpHを測定対象のα−アミラーゼの活性至適pH域に
合わせた場合にはα−グルコシダーゼはその最大活性を
示さないことになる。このような場合、レート法による
酵素的測定法によっては、α−アミラーゼの真の活性を
正しく測定することはできなくなる。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、α−
アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を使用
して測定することができるα−アミラーゼ活性測定法及
びこの測定法に使用するための試薬を提供することにあ
る。
アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を使用
して測定することができるα−アミラーゼ活性測定法及
びこの測定法に使用するための試薬を提供することにあ
る。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明は、還元性末端が
色素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質に、α−
アミラーゼを含む検体をカルシウムイオンの共存下に、
該α−アミラーゼの活性至適pHで作用させて基質を分
解する第一工程、第一工程で得られた生成物にα−グル
コシダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコ
シダーゼの活性至適pHで作用させる第二工程、及び第
二工程で生成した色素を比色定量する第三工程からなる
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法である。
色素で修飾されたマルトオリゴ糖からなる基質に、α−
アミラーゼを含む検体をカルシウムイオンの共存下に、
該α−アミラーゼの活性至適pHで作用させて基質を分
解する第一工程、第一工程で得られた生成物にα−グル
コシダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコ
シダーゼの活性至適pHで作用させる第二工程、及び第
二工程で生成した色素を比色定量する第三工程からなる
ことを特徴とするα−アミラーゼ活性測定法である。
【0013】他の本発明は、還元性末端が色素で修飾さ
れたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カルシウム塩
化合物及び測定対象のα−アミラーゼの活性至適pHを
有する緩衝液を含む第一液、及び、α−グルコシダー
ゼ、カルシウムイオン捕捉剤及びα−グルコシダーゼの
活性至適pHを有する緩衝液を含む第二液からなるα−
アミラーゼ活性測定用試薬である。
れたマルトオリゴ糖からなる基質、水溶性カルシウム塩
化合物及び測定対象のα−アミラーゼの活性至適pHを
有する緩衝液を含む第一液、及び、α−グルコシダー
ゼ、カルシウムイオン捕捉剤及びα−グルコシダーゼの
活性至適pHを有する緩衝液を含む第二液からなるα−
アミラーゼ活性測定用試薬である。
【0014】本発明の好適な態様は下記の通りである。
【0015】(1)上記マルトオリゴ糖が、p−ニトロ
フェノール、2−クロロ−4−ニトロフェノール、2,
4−ジクロロフェノール等の色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖である、上記のα−アミラーゼ活性測定法又はα
−アミラーゼ活性測定用試薬。
フェノール、2−クロロ−4−ニトロフェノール、2,
4−ジクロロフェノール等の色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖である、上記のα−アミラーゼ活性測定法又はα
−アミラーゼ活性測定用試薬。
【0016】(2)上記マルトオリゴ糖が、その非還元
末端が未置換(無修飾)グルコース又は4位及び/又は
6位で置換(修飾)されたマルトオリゴ糖である、上記
のα−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測
定用試薬。
末端が未置換(無修飾)グルコース又は4位及び/又は
6位で置換(修飾)されたマルトオリゴ糖である、上記
のα−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測
定用試薬。
【0017】(3)上記カルシウムイオン捕捉剤が、エ
チレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩である、上記の
α−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測定
用試薬。
チレンジアミン四酢酸のアルカリ金属塩である、上記の
α−アミラーゼ活性測定法又はα−アミラーゼ活性測定
用試薬。
【0018】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の測定
原理は、基質として還元末端がp−ニトロフェノールで
修飾され、非還元末端がβ−ガラクトースで修飾された
マルトオリゴ糖である、p−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシドを使用する場合を例
にすると、下記の原理3に示す通りである。
原理は、基質として還元末端がp−ニトロフェノールで
修飾され、非還元末端がβ−ガラクトースで修飾された
マルトオリゴ糖である、p−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシドを使用する場合を例
にすると、下記の原理3に示す通りである。
【0019】
【化2】
【0020】即ち、第一反応に於て、p−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(pN
P−G5−Ga)にα−アミラーゼが作用し、p−ニト
ロフェニルマルトトリオシド(pNP−G3)及びp−
ニトロフェニルマルトジオシド(pNP−G2)が生成
し、第二反応に於て、これら両者にα−グルコシダーゼ
が作用して、p−ニトロフェノール(pNP)を生成す
る。
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(pN
P−G5−Ga)にα−アミラーゼが作用し、p−ニト
ロフェニルマルトトリオシド(pNP−G3)及びp−
ニトロフェニルマルトジオシド(pNP−G2)が生成
し、第二反応に於て、これら両者にα−グルコシダーゼ
が作用して、p−ニトロフェノール(pNP)を生成す
る。
【0021】本発明のα−アミラーゼ活性測定法に於て
は、第一工程で上記第一反応を行い、第二工程で上記第
二反応を行い、第三工程で上記第二反応で生成したp−
ニトロフェノールを比色定量する。上記の原理3から明
らかなように、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、
従来のα−アミラーゼの酵素的測定法で採用されている
レート法とは異なり、終点法(end point 法)による測
定法である。
は、第一工程で上記第一反応を行い、第二工程で上記第
二反応を行い、第三工程で上記第二反応で生成したp−
ニトロフェノールを比色定量する。上記の原理3から明
らかなように、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、
従来のα−アミラーゼの酵素的測定法で採用されている
レート法とは異なり、終点法(end point 法)による測
定法である。
【0022】本発明のα−アミラーゼ活性測定法に於け
る第一工程で使用する基質は、還元性末端が色素で修飾
されたマルトオリゴ糖である。上記原理で例示したpN
P−G5−Gaは、p−ニトロフェノールの色素で還元
末端が修飾されたグルコース単位が5個のマルトオリゴ
糖である。上記色素としては、上記第二反応で遊離され
比色法により定量できるものであれば特に限定されな
い。p−ニトロフェノール以外の好ましい色素として、
2−クロロ−4−ニトロフェノール、2,4−ジクロロ
フェノール等を挙げることができる。上記マルトオリゴ
糖のグルコース単位の数は、4〜7個であるものが好ま
しい。
る第一工程で使用する基質は、還元性末端が色素で修飾
されたマルトオリゴ糖である。上記原理で例示したpN
P−G5−Gaは、p−ニトロフェノールの色素で還元
末端が修飾されたグルコース単位が5個のマルトオリゴ
糖である。上記色素としては、上記第二反応で遊離され
比色法により定量できるものであれば特に限定されな
い。p−ニトロフェノール以外の好ましい色素として、
2−クロロ−4−ニトロフェノール、2,4−ジクロロ
フェノール等を挙げることができる。上記マルトオリゴ
糖のグルコース単位の数は、4〜7個であるものが好ま
しい。
【0023】本発明のα−アミラーゼ活性測定法で使用
する基質として好ましいものは、p−ニトロフェニル−
α−マルトペンタオシド(pNP−G5)、p−ニトロ
フェニル−α−マルトヘキサオシド(pNP−G6)、
p−ニトロフェニル−α−マルトヘプタオシド(pNP
−G7)、2−クロロ−4−ニトロフェニル−α−マル
トペンタオシド(CNP−G5)、2−クロロ−4−ニ
トロフェニル−α−マルトヘキサオシド(CNP−G
6)、2−クロロ−4−ニトロフェニル−α−マルトヘ
プタオシド(CNP−G7)等を挙げることができる。
する基質として好ましいものは、p−ニトロフェニル−
α−マルトペンタオシド(pNP−G5)、p−ニトロ
フェニル−α−マルトヘキサオシド(pNP−G6)、
p−ニトロフェニル−α−マルトヘプタオシド(pNP
−G7)、2−クロロ−4−ニトロフェニル−α−マル
トペンタオシド(CNP−G5)、2−クロロ−4−ニ
トロフェニル−α−マルトヘキサオシド(CNP−G
6)、2−クロロ−4−ニトロフェニル−α−マルトヘ
プタオシド(CNP−G7)等を挙げることができる。
【0024】本発明のα−アミラーゼ活性測定法で使用
する基質は、上記のようにその非還元末端が未置換(無
修飾)のものであってもよいが、非還元末端が4位及び
/又は6位が、例えば、ガラクトース、エチリデン、ベ
ンジリデン、3−ケトブチリデン、アジド等で置換(修
飾)されたものであってもよい。非還元末端が修飾され
たマルトオリゴ糖を基質として使用すると、共役酵素と
してグルコアミラーゼが使えるため、反応のラグタイム
がなくなるという効果があるので好ましい。
する基質は、上記のようにその非還元末端が未置換(無
修飾)のものであってもよいが、非還元末端が4位及び
/又は6位が、例えば、ガラクトース、エチリデン、ベ
ンジリデン、3−ケトブチリデン、アジド等で置換(修
飾)されたものであってもよい。非還元末端が修飾され
たマルトオリゴ糖を基質として使用すると、共役酵素と
してグルコアミラーゼが使えるため、反応のラグタイム
がなくなるという効果があるので好ましい。
【0025】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第一
工程の反応液中の上記の基質の濃度は、0.5〜50ミ
リモル/Lであることが好ましい。
工程の反応液中の上記の基質の濃度は、0.5〜50ミ
リモル/Lであることが好ましい。
【0026】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第一
工程は、カルシウムイオンの共存下に行う。上記第一工
程でカルシウムイオンを存在させるために、第一工程に
酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、クエン酸カルシ
ウム等の水溶性の有機酸カルシウム、塩化カルシウム、
水酸化カルシウム等のカルシウム含有水溶性化合物を添
加することが好ましい。上記第一工程の反応液中のカル
シウム含有化合物の濃度は、0.01〜50ミリモル/
Lであることが好ましい。
工程は、カルシウムイオンの共存下に行う。上記第一工
程でカルシウムイオンを存在させるために、第一工程に
酢酸カルシウム、安息香酸カルシウム、クエン酸カルシ
ウム等の水溶性の有機酸カルシウム、塩化カルシウム、
水酸化カルシウム等のカルシウム含有水溶性化合物を添
加することが好ましい。上記第一工程の反応液中のカル
シウム含有化合物の濃度は、0.01〜50ミリモル/
Lであることが好ましい。
【0027】上記第一工程の反応液中には、更に、従来
のα−アミラーゼ活性測定法に於けると同様にNaC
l、CaCl2 、MgCl2 等の塩が含まれていてもよ
い。
のα−アミラーゼ活性測定法に於けると同様にNaC
l、CaCl2 、MgCl2 等の塩が含まれていてもよ
い。
【0028】上記第一工程は、反応液のpHが、測定対
象のα−アミラーゼの活性至適pH域(α−アミラーゼ
が最大活性を示すpH域)内のpHになるように調整さ
れた緩衝液中で行う。測定対象のα−アミラーゼの活性
至適pH域は、本明細書に記載した参考例の方法に従っ
て測定することができる。本発明者らの測定によれば、
α−アミラーゼの活性至適pH域は、例えば、ヒト血清
中のもの:7.0〜7.2、ヒト膵液中のもの:7.5
〜7.6、イヌ血清中のもの:7.6〜7.8、ラット
血清中のもの:7.0である。
象のα−アミラーゼの活性至適pH域(α−アミラーゼ
が最大活性を示すpH域)内のpHになるように調整さ
れた緩衝液中で行う。測定対象のα−アミラーゼの活性
至適pH域は、本明細書に記載した参考例の方法に従っ
て測定することができる。本発明者らの測定によれば、
α−アミラーゼの活性至適pH域は、例えば、ヒト血清
中のもの:7.0〜7.2、ヒト膵液中のもの:7.5
〜7.6、イヌ血清中のもの:7.6〜7.8、ラット
血清中のもの:7.0である。
【0029】上記第一工程で反応液に添加する測定対象
のα−アミラーゼが含まれていると考えられる検体は、
ヒト又は動物の血清、膵液、尿等の何れであってもよ
い。更に、植物、細菌、カビ等の資源からのα−アミラ
ーゼを含む検体を使用することもできる。第一工程の反
応液中のα−アミラーゼの濃度が5000U(国際単
位)/L以下の濃度になるように上記検体を添加するこ
とが好ましい。
のα−アミラーゼが含まれていると考えられる検体は、
ヒト又は動物の血清、膵液、尿等の何れであってもよ
い。更に、植物、細菌、カビ等の資源からのα−アミラ
ーゼを含む検体を使用することもできる。第一工程の反
応液中のα−アミラーゼの濃度が5000U(国際単
位)/L以下の濃度になるように上記検体を添加するこ
とが好ましい。
【0030】上記第一工程の反応温度は一般の酵素反応
に於けると同様に約37℃であることが好ましく、上記
第一工程の反応時間は1〜5分間であることが好まし
い。
に於けると同様に約37℃であることが好ましく、上記
第一工程の反応時間は1〜5分間であることが好まし
い。
【0031】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第二
工程に於ては、第一工程で得られた生成物にα−グルコ
シダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコシ
ダーゼの活性至適pHで作用させる。
工程に於ては、第一工程で得られた生成物にα−グルコ
シダーゼ及びカルシウムイオン捕捉剤を、α−グルコシ
ダーゼの活性至適pHで作用させる。
【0032】上記第二工程で反応液に添加するα−グル
コシダーゼの量は、第一工程で生成した色素で修飾され
たマルトオリゴ糖を分解するに十分な量以上であり、一
般に1〜200U/mLであることが好ましい。
コシダーゼの量は、第一工程で生成した色素で修飾され
たマルトオリゴ糖を分解するに十分な量以上であり、一
般に1〜200U/mLであることが好ましい。
【0033】上記第二工程の反応液に添加するカルシウ
ムイオン捕捉剤は、水溶性であり且つカルシウムイオン
を捕捉して、反応液中にカルシウムイオンが実質的に存
在しないようにするものであれば特に限定されない。こ
のカルシウムイオン捕捉剤として特に好ましい化合物と
しては、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)
のアルカリ金属(ナトリウム、カリウム等)塩、トラン
ス−1,2−シクロヘキサンジアミン−N,N,N’,
N’−四酢酸(CyDTA)、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸(GEDTA)等を挙げることができる。
ムイオン捕捉剤は、水溶性であり且つカルシウムイオン
を捕捉して、反応液中にカルシウムイオンが実質的に存
在しないようにするものであれば特に限定されない。こ
のカルシウムイオン捕捉剤として特に好ましい化合物と
しては、例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)
のアルカリ金属(ナトリウム、カリウム等)塩、トラン
ス−1,2−シクロヘキサンジアミン−N,N,N’,
N’−四酢酸(CyDTA)、グリコールエーテルジア
ミン四酢酸(GEDTA)等を挙げることができる。
【0034】上記第二工程に於ては、カルシウムイオン
捕捉剤を存在させることにより第一工程で得られた反応
生成液中のカルシウムイオンを消去する。α−アミラー
ゼ活性が発現するためにはカルシウムイオンが必要であ
り、カルシウムイオンを消去することによってα−アミ
ラーゼの活性発現が停止し、上記第二工程での反応への
α−アミラーゼの影響を無くすることができる。
捕捉剤を存在させることにより第一工程で得られた反応
生成液中のカルシウムイオンを消去する。α−アミラー
ゼ活性が発現するためにはカルシウムイオンが必要であ
り、カルシウムイオンを消去することによってα−アミ
ラーゼの活性発現が停止し、上記第二工程での反応への
α−アミラーゼの影響を無くすることができる。
【0035】上記第二工程は、反応液のpHを、α−グ
ルコシダーゼの活性至適pH域である7.0〜7.2の
範囲内に維持する緩衝液中で反応を行う。
ルコシダーゼの活性至適pH域である7.0〜7.2の
範囲内に維持する緩衝液中で反応を行う。
【0036】上記第二工程の反応温度は一般の酵素反応
に於けると同様に約37℃であることが好ましく、上記
第二工程の反応時間は3〜10分間であることが好まし
い。
に於けると同様に約37℃であることが好ましく、上記
第二工程の反応時間は3〜10分間であることが好まし
い。
【0037】本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第三
工程に於ては、第二工程で得られた生成液中の色素を、
従来の酵素的測定法に於けると同様にして比色定量す
る。例えば、色素としてp−ニトロフェノールを使用し
た場合には405nm付近での吸光度を測定することに
より、色素として2−クロロ−4−ニトロフェノールを
使用した場合には400nm付近での吸光度を測定する
ことにより、2,4−ジクロロフェノールを使用した場
合には前記原理2に示すように生成する赤色キノン色素
を500nm付近での吸光度を測定することにより定量
できる。特定濃度の色素の水溶液の吸光度とα−アミラ
ーゼ活性との規定された関係から、第三工程で得られた
吸光度から検体中のα−アミラーゼ活性を求めることが
できる。
工程に於ては、第二工程で得られた生成液中の色素を、
従来の酵素的測定法に於けると同様にして比色定量す
る。例えば、色素としてp−ニトロフェノールを使用し
た場合には405nm付近での吸光度を測定することに
より、色素として2−クロロ−4−ニトロフェノールを
使用した場合には400nm付近での吸光度を測定する
ことにより、2,4−ジクロロフェノールを使用した場
合には前記原理2に示すように生成する赤色キノン色素
を500nm付近での吸光度を測定することにより定量
できる。特定濃度の色素の水溶液の吸光度とα−アミラ
ーゼ活性との規定された関係から、第三工程で得られた
吸光度から検体中のα−アミラーゼ活性を求めることが
できる。
【0038】本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、従
来の酵素活性測定法で使用されているような自動分析装
置を使用して行うことができる。
来の酵素活性測定法で使用されているような自動分析装
置を使用して行うことができる。
【0039】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ糖から
なる基質0.5〜50ミリモル/L、水溶性カルシウム
塩化合物0.01〜50ミリモル/L及び測定対象のα
−アミラーゼの活性至適pHを有する緩衝液を含む第一
液、及びα−グルコシダーゼ1〜200U/mL、カル
シウムイオン捕捉剤1〜15ミリモル/L及びα−グル
コシダーゼの活性至適pHを有する緩衝液を含む第二液
からなる。
は、還元性末端が色素で修飾されたマルトオリゴ糖から
なる基質0.5〜50ミリモル/L、水溶性カルシウム
塩化合物0.01〜50ミリモル/L及び測定対象のα
−アミラーゼの活性至適pHを有する緩衝液を含む第一
液、及びα−グルコシダーゼ1〜200U/mL、カル
シウムイオン捕捉剤1〜15ミリモル/L及びα−グル
コシダーゼの活性至適pHを有する緩衝液を含む第二液
からなる。
【0040】上記第一液は本発明のα−アミラーゼ活性
測定法の第一工程で使用するためのものであり、上記第
二液は本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第二工程で
使用するためのものである。従って、本発明のα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬中の各成分の内容及び作用効果
は、前記の本発明のα−アミラーゼ活性測定法について
説明したことと同様である。上記第一液中には、更に、
NaCl、CaCl2 、MgCl2 等の塩が含まれてい
てもよい。
測定法の第一工程で使用するためのものであり、上記第
二液は本発明のα−アミラーゼ活性測定法の第二工程で
使用するためのものである。従って、本発明のα−アミ
ラーゼ活性測定用試薬中の各成分の内容及び作用効果
は、前記の本発明のα−アミラーゼ活性測定法について
説明したことと同様である。上記第一液中には、更に、
NaCl、CaCl2 、MgCl2 等の塩が含まれてい
てもよい。
【0041】本発明のα−アミラーゼ活性測定用試薬
は、第一液及び第二液のそれぞれについて、必要な全て
の成分を含有させた溶液を製造しておき、使用に際して
必要に応じて適宜希釈して使用してもよく、また、それ
ぞれ二個以上に分割して調製し貯蔵し(必要に応じて凍
結乾燥品として)、使用に際して必要に応じて適宜希釈
し混合して使用するようにしてもよい。
は、第一液及び第二液のそれぞれについて、必要な全て
の成分を含有させた溶液を製造しておき、使用に際して
必要に応じて適宜希釈して使用してもよく、また、それ
ぞれ二個以上に分割して調製し貯蔵し(必要に応じて凍
結乾燥品として)、使用に際して必要に応じて適宜希釈
し混合して使用するようにしてもよい。
【0042】
【実施例】次に、参考例、実施例及び比較例により本発
明を更に詳細に説明する。
明を更に詳細に説明する。
【0043】[参考例]この参考例に於て、由来の異な
るα−アミラーゼが、それぞれ異なる活性至適pH域を
有することを示す。
るα−アミラーゼが、それぞれ異なる活性至適pH域を
有することを示す。
【0044】測定試料として下記の6種の試料を用意し
た。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト血清(Moni-Trol-II、デイド社製、管理血
清) (3)ヒト膵液 (4)イヌ血清 (5)ラット血清 (6)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液(反応
液中のpHにより、p−ニトロフェノールの解離度が異
なるため、pH補正用として含める)
た。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト血清(Moni-Trol-II、デイド社製、管理血
清) (3)ヒト膵液 (4)イヌ血清 (5)ラット血清 (6)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液(反応
液中のpHにより、p−ニトロフェノールの解離度が異
なるため、pH補正用として含める)
【0045】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。 (第一液)6.5、7.0、7.5、8.0又は8.5
のpH値に調整した5種類の30mMリン酸塩緩衝液の
各々に、24mMの塩化ナトリウム、0.4mMの酢酸
カルシウム及び5mMのp−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシド(LG−5P)が含
有されている、5種類の第一液。
を調製した。 (第一液)6.5、7.0、7.5、8.0又は8.5
のpH値に調整した5種類の30mMリン酸塩緩衝液の
各々に、24mMの塩化ナトリウム、0.4mMの酢酸
カルシウム及び5mMのp−ニトロフェニル−β−ガラ
クトシル−α−マルトペンタオシド(LG−5P)が含
有されている、5種類の第一液。
【0046】(第二液)7.2のpH値に調整した10
0mMリン酸塩緩衝液に、75U/mLのα−グルコシ
ダーゼ(活性至適pH=7.0〜7.2)及び3mMの
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩が含有されてい
る。
0mMリン酸塩緩衝液に、75U/mLのα−グルコシ
ダーゼ(活性至適pH=7.0〜7.2)及び3mMの
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩が含有されてい
る。
【0047】日立7050型自動分析機(株式会社日立
製作所製)を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。
製作所製)を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。
【0048】測定試料4μLと第一液150μLとを混
合して37℃で5分間維持し、次いでこの混合物に第二
液300μLを添加混合して(α−グルコシダーゼの濃
度:50U/mL)37℃で5分間維持した後、生成し
たp−ニトロフェノールに基づく415nm(主波長)
での吸光度を測定した。
合して37℃で5分間維持し、次いでこの混合物に第二
液300μLを添加混合して(α−グルコシダーゼの濃
度:50U/mL)37℃で5分間維持した後、生成し
たp−ニトロフェノールに基づく415nm(主波長)
での吸光度を測定した。
【0049】第一液に比較して第二液の量が多いので、
第二液を添加した後の反応液のpHはα−グルコシダー
ゼの活性至適pH域内である7.2前後に保持されてい
た。
第二液を添加した後の反応液のpHはα−グルコシダー
ゼの活性至適pH域内である7.2前後に保持されてい
た。
【0050】この測定操作を、上記6種類の測定試料の
それぞれに対して、5種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。第一液の各pH値での2.5mM p−ニト
ロフェノール水溶液からの吸光度から、各pH値での補
正係数を求め、各pH値に於いて、上記(2)〜(5)
の測定試料について自動分析機から打ち出された吸光度
から、(1)のブランク試料について自動分析機から打
ち出された吸光度を差し引き、上記の補正係数を乗じる
ことによって、上記(2)〜(5)の測定試料について
の吸光度を得た。
それぞれに対して、5種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。第一液の各pH値での2.5mM p−ニト
ロフェノール水溶液からの吸光度から、各pH値での補
正係数を求め、各pH値に於いて、上記(2)〜(5)
の測定試料について自動分析機から打ち出された吸光度
から、(1)のブランク試料について自動分析機から打
ち出された吸光度を差し引き、上記の補正係数を乗じる
ことによって、上記(2)〜(5)の測定試料について
の吸光度を得た。
【0051】このようにして得た上記(2)〜(5)の
測定試料についての吸光度と、使用した第一液のpH値
との関係をプロットしたグラフを、図1[測定試料
(2)ヒト血清及び測定試料(3)ヒト膵液]及び図2
[測定試料(4)イヌ血清及び測定試料(5)ラット血
清]に実線で示す。
測定試料についての吸光度と、使用した第一液のpH値
との関係をプロットしたグラフを、図1[測定試料
(2)ヒト血清及び測定試料(3)ヒト膵液]及び図2
[測定試料(4)イヌ血清及び測定試料(5)ラット血
清]に実線で示す。
【0052】図1から、ヒト血清中のα−アミラーゼの
活性至適pHは7.0〜7.2であり、ヒト膵液中のα
−アミラーゼの活性至適pHは7.5〜7.6であるこ
とが分かり、図2から、イヌ血清中のα−アミラーゼの
活性至適pHは7.6〜7.8であり、ラット血清中の
α−アミラーゼの活性至適pHは7.0であることが分
かる。図1及び図2から、由来が異なるα−アミラーゼ
はそれぞれ異なった独自の活性至適pH域を有すること
が明らかである。
活性至適pHは7.0〜7.2であり、ヒト膵液中のα
−アミラーゼの活性至適pHは7.5〜7.6であるこ
とが分かり、図2から、イヌ血清中のα−アミラーゼの
活性至適pHは7.6〜7.8であり、ラット血清中の
α−アミラーゼの活性至適pHは7.0であることが分
かる。図1及び図2から、由来が異なるα−アミラーゼ
はそれぞれ異なった独自の活性至適pH域を有すること
が明らかである。
【0053】[比較参考例]この比較参考例に於ては、
従来のレート法により、参考例で使用したものと同じ基
質及びα−グルコシダーゼを使用して、参考例に於ける
のと同じ測定試料についてα−アミラーゼ活性を測定し
た。
従来のレート法により、参考例で使用したものと同じ基
質及びα−グルコシダーゼを使用して、参考例に於ける
のと同じ測定試料についてα−アミラーゼ活性を測定し
た。
【0054】測定試料として参考例で使用したものと同
じ試料を用意した。
じ試料を用意した。
【0055】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。 (第一液)6.5、7.0、7.5、8.0又は8.5
のpH値に調整した5種類の30mMリン酸塩緩衝液の
各々に、72mMの塩化ナトリウム、1.2mMの酢酸
カルシウム及び150U/mLのα−グルコシダーゼ
(活性至適pH=7.0〜7.2)が含有されている、
5種類の第一液。
を調製した。 (第一液)6.5、7.0、7.5、8.0又は8.5
のpH値に調整した5種類の30mMリン酸塩緩衝液の
各々に、72mMの塩化ナトリウム、1.2mMの酢酸
カルシウム及び150U/mLのα−グルコシダーゼ
(活性至適pH=7.0〜7.2)が含有されている、
5種類の第一液。
【0056】(第二液)7.5mMのp−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG
−5P)の水溶液。
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG
−5P)の水溶液。
【0057】日立7050型自動分析機(株式会社日立
製作所製)を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。
製作所製)を使用して、下記の方法により上記の各測定
試料についてα−アミラーゼ活性を測定した。
【0058】測定試料4μLと第一液150μLとを混
合して37℃で5分間維持し、次いでこの混合物に第二
液300μLを添加混合して(α−グルコシダーゼの濃
度:50U/mL、LG−5Pの濃度:5mM)37℃
で5分間維持し、第二液を添加して4分後と5分後の間
の1分間の、生成したp−ニトロフェノールに基づく4
15nm(主波長)での吸光度差を測定した。
合して37℃で5分間維持し、次いでこの混合物に第二
液300μLを添加混合して(α−グルコシダーゼの濃
度:50U/mL、LG−5Pの濃度:5mM)37℃
で5分間維持し、第二液を添加して4分後と5分後の間
の1分間の、生成したp−ニトロフェノールに基づく4
15nm(主波長)での吸光度差を測定した。
【0059】全反応時間を通して、反応液のpHは各々
6.5、7.0、7.5、8.0、及び8.5に保持さ
れていた。
6.5、7.0、7.5、8.0、及び8.5に保持さ
れていた。
【0060】この測定操作を、上記6種類の測定試料の
それぞれに対して、5種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。参考例と同様にして上記(2)〜(5)の測
定試料についての1分間当りの吸光度差を算出した。
それぞれに対して、5種類の第一液のそれぞれを使用し
て行った。参考例と同様にして上記(2)〜(5)の測
定試料についての1分間当りの吸光度差を算出した。
【0061】このようにして得た上記(2)〜(5)の
測定試料についての1分間当りの吸光度差を5倍(第二
液を添加した後に維持した5分間に対応)して得られた
吸光度と、使用した第一液のpH値との関係をプロット
したグラフを、図1[測定試料(2)ヒト血清及び測定
試料(3)ヒト膵液]及び図2[測定試料(4)イヌ血
清及び測定試料(5)ラット血清]に点線で示す。
測定試料についての1分間当りの吸光度差を5倍(第二
液を添加した後に維持した5分間に対応)して得られた
吸光度と、使用した第一液のpH値との関係をプロット
したグラフを、図1[測定試料(2)ヒト血清及び測定
試料(3)ヒト膵液]及び図2[測定試料(4)イヌ血
清及び測定試料(5)ラット血清]に点線で示す。
【0062】図1及び図2に於いて、参考例(終点法)
で得られた結果(実線)と比較参考例(レート法)で得
られた結果(点線)とを比較すると、α−グルコシダー
ゼの活性至適pH域(7.0〜7.2)近傍では両者の
間に殆ど差がないが、pHが7.5より高くなると比較
参考例に於いては吸光度が著しく低下している。このこ
とから、レート法による測定をα−グルコシダーゼの活
性至適pH域で行った場合には、ヒト膵液及びイヌ血清
ではα−アミラーゼの最大活性を示さず、これらのα−
アミラーゼの活性至適pH域で行った場合にはα−グル
コシダーゼの活性至適pH域から外れるためにα−グル
コシダーゼの活性が大きく低下し、レート法によっては
正確なα−アミラーゼ活性を測定できないことが分か
る。
で得られた結果(実線)と比較参考例(レート法)で得
られた結果(点線)とを比較すると、α−グルコシダー
ゼの活性至適pH域(7.0〜7.2)近傍では両者の
間に殆ど差がないが、pHが7.5より高くなると比較
参考例に於いては吸光度が著しく低下している。このこ
とから、レート法による測定をα−グルコシダーゼの活
性至適pH域で行った場合には、ヒト膵液及びイヌ血清
ではα−アミラーゼの最大活性を示さず、これらのα−
アミラーゼの活性至適pH域で行った場合にはα−グル
コシダーゼの活性至適pH域から外れるためにα−グル
コシダーゼの活性が大きく低下し、レート法によっては
正確なα−アミラーゼ活性を測定できないことが分か
る。
【0063】[実施例1]測定試料として下記の3種の
試料を使用した。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト膵液 (3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液
試料を使用した。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト膵液 (3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液
【0064】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。 (第一液)7.5のpH値に調整した30mMリン酸塩
緩衝液に、24mMの塩化ナトリウム、0.4mMの酢
酸カルシウム及び5mMのp−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG−5P)が
含有されている。
を調製した。 (第一液)7.5のpH値に調整した30mMリン酸塩
緩衝液に、24mMの塩化ナトリウム、0.4mMの酢
酸カルシウム及び5mMのp−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG−5P)が
含有されている。
【0065】(第二液)7.2のpH値に調整した10
0mMリン酸塩緩衝液に、75U/mLのα−グルコシ
ダーゼ及び3mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩が含有されている。
0mMリン酸塩緩衝液に、75U/mLのα−グルコシ
ダーゼ及び3mMのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩が含有されている。
【0066】日立7050型自動分析機(株式会社日立
製作所製)を使用して、参考例に於けると同様の方法に
より上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性測定
操作を行い、生成したp−ニトロフェノールに基づく4
15nm(主波長)での吸光度を測定した。第一液中の
反応時には反応液のpHは、ヒト膵液の活性至適pH域
内の7.5であったが、第二液を添加した後の反応液の
pHはα−グルコシダーゼの活性至適pH域内である
7.2前後に保持されていた。
製作所製)を使用して、参考例に於けると同様の方法に
より上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性測定
操作を行い、生成したp−ニトロフェノールに基づく4
15nm(主波長)での吸光度を測定した。第一液中の
反応時には反応液のpHは、ヒト膵液の活性至適pH域
内の7.5であったが、第二液を添加した後の反応液の
pHはα−グルコシダーゼの活性至適pH域内である
7.2前後に保持されていた。
【0067】測定試料(2)ヒト膵液について自動分析
機から打ち出された吸光度から、測定試料(1)試薬ブ
ランクの吸光度を差し引くと、0.8233Absであ
った。酵素の国際単位(U)は、1分間に1μMの基質
を分解するとき、その酵素活性を1単位と定められてお
り、本例に於ては、2.5mM、即ち2500μMのp
−ニトロフェノールが1分間に全て分解されたとして、
測定試料(3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶
液について得られた吸光度が、α−アミラーゼ2500
U/Lであると仮定して、上記測定試料(3)について
得られた吸光度0.2655Absから、K−ファクタ
ー=1883(=2500/5分/0.2655)が得
られた。このK−ファクターを測定試料(2)について
の吸光度0.8233Absに乗じることにより、測定
試料(2)のα−アミラーゼ活性は1550U/Lであ
ると求められた。
機から打ち出された吸光度から、測定試料(1)試薬ブ
ランクの吸光度を差し引くと、0.8233Absであ
った。酵素の国際単位(U)は、1分間に1μMの基質
を分解するとき、その酵素活性を1単位と定められてお
り、本例に於ては、2.5mM、即ち2500μMのp
−ニトロフェノールが1分間に全て分解されたとして、
測定試料(3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶
液について得られた吸光度が、α−アミラーゼ2500
U/Lであると仮定して、上記測定試料(3)について
得られた吸光度0.2655Absから、K−ファクタ
ー=1883(=2500/5分/0.2655)が得
られた。このK−ファクターを測定試料(2)について
の吸光度0.8233Absに乗じることにより、測定
試料(2)のα−アミラーゼ活性は1550U/Lであ
ると求められた。
【0068】[比較例1]測定試料として下記の3種の
試料を使用した。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト膵液 (3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液
試料を使用した。 (1)試薬ブランク(生理食塩水) (2)ヒト膵液 (3)2.5mM p−ニトロフェノール水溶液
【0069】測定試薬として、下記の第一液及び第二液
を調製した。 (第一液)7.0のpH値に調整した30mMリン酸塩
緩衝液に、72mMの塩化ナトリウム、1.2mMの酢
酸カルシウム及び150U/mLのα−グルコシダーゼ
が含有されている。
を調製した。 (第一液)7.0のpH値に調整した30mMリン酸塩
緩衝液に、72mMの塩化ナトリウム、1.2mMの酢
酸カルシウム及び150U/mLのα−グルコシダーゼ
が含有されている。
【0070】(第二液)7.5mMのp−ニトロフェニ
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG
−5P)の水溶液。
ル−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシド(LG
−5P)の水溶液。
【0071】日立7050型自動分析機(株式会社日立
製作所製)を使用して、比較参考例に於けると同様の方
法により上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性
測定操作を行い、生成したp−ニトロフェノールに基づ
く415nm(主波長)での吸光度を測定した。
製作所製)を使用して、比較参考例に於けると同様の方
法により上記の各測定試料についてα−アミラーゼ活性
測定操作を行い、生成したp−ニトロフェノールに基づ
く415nm(主波長)での吸光度を測定した。
【0072】測定試料(2)ヒト膵液のα−アミラーゼ
活性は、実施例1に於けると同様の算出方法で求めたと
ころ、1180U/Lであった。(測定試料(1)試薬
ブランクの吸光度を差し引いた、測定試料(2)ヒト膵
液についての吸光度は、0.0987であり、K−ファ
クターは11956であった。)
活性は、実施例1に於けると同様の算出方法で求めたと
ころ、1180U/Lであった。(測定試料(1)試薬
ブランクの吸光度を差し引いた、測定試料(2)ヒト膵
液についての吸光度は、0.0987であり、K−ファ
クターは11956であった。)
【0073】実施例1と比較例1との比較から、比較例
1で得られたα−アミラーゼ活性測定値は、実施例1で
得られたα−アミラーゼ活性測定値に対して24%小さ
いことが分かる。
1で得られたα−アミラーゼ活性測定値は、実施例1で
得られたα−アミラーゼ活性測定値に対して24%小さ
いことが分かる。
【0074】
【発明の効果】本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、
α−アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を
使用して測定することができるという顕著な効果を奏す
る。従って、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、広
範な種々の起源に由来するα−アミラーゼ活性の測定に
利用することができる。
α−アミラーゼの真の活性を正しく簡便に自動分析機を
使用して測定することができるという顕著な効果を奏す
る。従って、本発明のα−アミラーゼ活性測定法は、広
範な種々の起源に由来するα−アミラーゼ活性の測定に
利用することができる。
【図1】参考例及び比較参考例で得られたヒト血清及び
ヒト膵液についての吸光度と、使用した第一液のpH値
との関係をプロットしたグラフである。
ヒト膵液についての吸光度と、使用した第一液のpH値
との関係をプロットしたグラフである。
【図2】参考例及び比較参考例で得られたイヌ血清及び
ラット血清についての吸光度と、使用した第一液のpH
値との関係をプロットしたグラフである。
ラット血清についての吸光度と、使用した第一液のpH
値との関係をプロットしたグラフである。
Claims (2)
- 【請求項1】 還元性末端が色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖からなる基質に、α−アミラーゼを含む検体をカ
ルシウムイオンの共存下に、該α−アミラーゼの活性至
適pHで作用させて基質を分解する第一工程、第一工程
で得られた生成物にα−グルコシダーゼ及びカルシウム
イオン捕捉剤を、α−グルコシダーゼの活性至適pHで
作用させる第二工程、及び第二工程で生成した色素を比
色定量する第三工程からなることを特徴とするα−アミ
ラーゼ活性測定法。 - 【請求項2】 還元性末端が色素で修飾されたマルトオ
リゴ糖からなる基質、水溶性カルシウム塩化合物及び測
定対象のα−アミラーゼの活性至適pHを有する緩衝液
を含む第一液、及び、α−グルコシダーゼ、カルシウム
イオン捕捉剤及びα−グルコシダーゼの活性至適pHを
有する緩衝液を含む第二液からなるα−アミラーゼ活性
測定用試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1962793A JPH06205699A (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1962793A JPH06205699A (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06205699A true JPH06205699A (ja) | 1994-07-26 |
Family
ID=12004442
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1962793A Withdrawn JPH06205699A (ja) | 1993-01-11 | 1993-01-11 | α−アミラーゼ活性測定法及びα−アミラーゼ活性測定用試薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06205699A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006136882A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-06-01 | Inst Fr Petrole | 複数の固定床または移動床帯域および内蔵型熱交換器を有する反応装置 |
JP2013068642A (ja) * | 2013-01-23 | 2013-04-18 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 分析装置用の沈殿防止用組成物 |
-
1993
- 1993-01-11 JP JP1962793A patent/JPH06205699A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006136882A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-06-01 | Inst Fr Petrole | 複数の固定床または移動床帯域および内蔵型熱交換器を有する反応装置 |
JP2013068642A (ja) * | 2013-01-23 | 2013-04-18 | Mitsubishi Chemical Medience Corp | 分析装置用の沈殿防止用組成物 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000404 |