JPH06199673A - リン脂質依存性プロトロンビン活性剤、その製造方法、凝血試験法および凝血試験キット - Google Patents
リン脂質依存性プロトロンビン活性剤、その製造方法、凝血試験法および凝血試験キットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ループス抗凝血物質の測定試験において有用
なリン脂質依存性プロトロンビン活性剤の提供。 【構成】 エラピダエ科、特にオキシウラヌスおよびプ
ソイドナジャ類の部類に属するヘビの毒から得られるリ
ン脂質依存性プロトロンビン活性剤において、リン脂質
およびカルシウムイオンの存在で血漿凝固活性が増大
し、ループス抗凝血物質の存在で減少し、それぞれ第
Ｖ、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩまたは第Ｘ因子に依存せず、
４００００〜６００００ダルトンの分子量に相当する移
動度での主要バンドを示すことを特徴とするリン脂質依
存性プロトロンビン活性剤。
なリン脂質依存性プロトロンビン活性剤の提供。 【構成】 エラピダエ科、特にオキシウラヌスおよびプ
ソイドナジャ類の部類に属するヘビの毒から得られるリ
ン脂質依存性プロトロンビン活性剤において、リン脂質
およびカルシウムイオンの存在で血漿凝固活性が増大
し、ループス抗凝血物質の存在で減少し、それぞれ第
Ｖ、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩまたは第Ｘ因子に依存せず、
４００００〜６００００ダルトンの分子量に相当する移
動度での主要バンドを示すことを特徴とするリン脂質依
存性プロトロンビン活性剤。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リン脂質依存性プロト
ロンビン活性剤、その精製方法および前記活性剤を用い
たループス抗凝血物質の検出試験に関する。
ロンビン活性剤、その精製方法および前記活性剤を用い
たループス抗凝血物質の検出試験に関する。
【０００２】
【従来の技術】ループス抗凝血物質（ＬＡ）はイムノグ
ロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、または両方の混合物）であ
り、これは１種以上の試験管内でのリン脂質依存性の凝
固試験（活性化部分トロンボプラスチン時間［ＡＰＴ
Ｔ］；プロトロンビン時間［ＰＴ］；希釈ラッセルマム
シ毒時間［ｄＲＶＶＴ］）を妨害する。凝固タンパク質
の特異的阻害剤と比較して、ＬＡは個々の凝固因子の全
てに反応性を有していない。この名称は、大多数の患者
が潜在的全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）を伴わないために
誤りである。さらに一般的に、ＬＡは第２に伝染病、薬
品（たとえばクロロプロマジン、キニジン、プロカイン
アミド）に該当し、またはこれは自己免疫疾患において
見受けられ、これは最近では一次抗リン脂質抗体症候群
と表わされる。
ロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、または両方の混合物）であ
り、これは１種以上の試験管内でのリン脂質依存性の凝
固試験（活性化部分トロンボプラスチン時間［ＡＰＴ
Ｔ］；プロトロンビン時間［ＰＴ］；希釈ラッセルマム
シ毒時間［ｄＲＶＶＴ］）を妨害する。凝固タンパク質
の特異的阻害剤と比較して、ＬＡは個々の凝固因子の全
てに反応性を有していない。この名称は、大多数の患者
が潜在的全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）を伴わないために
誤りである。さらに一般的に、ＬＡは第２に伝染病、薬
品（たとえばクロロプロマジン、キニジン、プロカイン
アミド）に該当し、またはこれは自己免疫疾患において
見受けられ、これは最近では一次抗リン脂質抗体症候群
と表わされる。
【０００３】逆説的に、ＬＡは、関連性の止血性欠陥
（たとえば血小板減少症）でない限り、臨床的出血と結
び付かない。ＬＡを伴う患者の約３０〜４０％は、静脈
および動脈の血栓塞栓性現象の前歴を有する。数年の
間、ＬＡは、原因であるか、結果であるかまたは血栓症
と同時発生かどうかについて多くの議論がなされた。動
物モデルでのより最近の研究は、ＬＡが実際に血栓症体
質の原因であることが暗示されている。ＬＡの他の臨床
的な表現は、胎児損失、子宮内胎児成長遅延および早熟
が含まれる。同様に、ＬＡは血小板減少症または自己免
疫溶血性貧血と関連付けることもできる。２つの最近の
優れた文献はＬＡを議論しており、これは抗体：抗カル
ジオリピン抗体と密接に関係している［Triplett D.
A., Brandt J.T., Lupus Anticoagulants: Misnomer, P
aradox, Riddle Epiphenomenon. Hematol. Pathol. 2,
121-143, 1988; Love P. E., Santoro S. A., Antiphos
pholipid Antibodies: Anticardiolipin and the Lupus
Anticoagulant in Systemic Lupus Erythematosus (SL
E) and in Non-SLE Disorders. Ann. Int. Med. 112, 6
82-698, 1990］。
（たとえば血小板減少症）でない限り、臨床的出血と結
び付かない。ＬＡを伴う患者の約３０〜４０％は、静脈
および動脈の血栓塞栓性現象の前歴を有する。数年の
間、ＬＡは、原因であるか、結果であるかまたは血栓症
と同時発生かどうかについて多くの議論がなされた。動
物モデルでのより最近の研究は、ＬＡが実際に血栓症体
質の原因であることが暗示されている。ＬＡの他の臨床
的な表現は、胎児損失、子宮内胎児成長遅延および早熟
が含まれる。同様に、ＬＡは血小板減少症または自己免
疫溶血性貧血と関連付けることもできる。２つの最近の
優れた文献はＬＡを議論しており、これは抗体：抗カル
ジオリピン抗体と密接に関係している［Triplett D.
A., Brandt J.T., Lupus Anticoagulants: Misnomer, P
aradox, Riddle Epiphenomenon. Hematol. Pathol. 2,
121-143, 1988; Love P. E., Santoro S. A., Antiphos
pholipid Antibodies: Anticardiolipin and the Lupus
Anticoagulant in Systemic Lupus Erythematosus (SL
E) and in Non-SLE Disorders. Ann. Int. Med. 112, 6
82-698, 1990］。
【０００４】たいていは、ＬＡは明らかでない延長され
たＡＰＴＴおよび／またはＰＴの結果として検出され
る。一般に、異常なＡＰＴＴは、第ＸＩＩ、第ＸＩ、第
ＩＸ、第ＶＩＩＩ、第Ｖ、または第Ｘ因子において量的
または質的欠乏と関連しており、ＰＴの延長は一般に第
ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｘ因子またはフィブリノーゲ
ンの欠乏を表わしている。患者の血漿と通常の血小板欠
乏血漿の供給源との混合は、延長されたＡＰＴＴおよび
／またはＰＴの補償の欠如が生じる。補償の欠如は、阻
害物質（循環する抗凝血物質と同義語）の診断のための
必須条件である。
たＡＰＴＴおよび／またはＰＴの結果として検出され
る。一般に、異常なＡＰＴＴは、第ＸＩＩ、第ＸＩ、第
ＩＸ、第ＶＩＩＩ、第Ｖ、または第Ｘ因子において量的
または質的欠乏と関連しており、ＰＴの延長は一般に第
ＩＩ、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｘ因子またはフィブリノーゲ
ンの欠乏を表わしている。患者の血漿と通常の血小板欠
乏血漿の供給源との混合は、延長されたＡＰＴＴおよび
／またはＰＴの補償の欠如が生じる。補償の欠如は、阻
害物質（循環する抗凝血物質と同義語）の診断のための
必須条件である。
【０００５】ＬＡの診断はしばしば困難である。市販さ
れているＡＰＴＴ試薬はＬＡに対して広い範囲の感受性
を示し、ＩｇＧおよびＩｇＭ ＬＡの間で異なっている
ことを示す。ＡＰＴＴの他に、他の試験は、希釈ラッセ
ルマムシ毒時間（dilute Russell Viper Venom Time）
（ｄＲＶＶＴ）、カオリン凝固時間および希釈ＡＰＴＴ
を含めて、ＬＡをスクリーニングするために使用され
る。これらの試験の性能は、カオリン凝固時間および希
釈ＡＰＴＴの場合に、患者の血漿および通常の血漿を混
合する必要があることが困難である。従って、これらの
試験は常用の凝固器機を用いて容易に自動化されない。
さらに、市販の凍結乾燥血漿を通常の混合試験のための
血漿として使用する場合に、これらは凍結乾燥した市販
の調製剤中のリン脂質の高い含量のために誤ったマイナ
スの結果を生じることがある。
れているＡＰＴＴ試薬はＬＡに対して広い範囲の感受性
を示し、ＩｇＧおよびＩｇＭ ＬＡの間で異なっている
ことを示す。ＡＰＴＴの他に、他の試験は、希釈ラッセ
ルマムシ毒時間（dilute Russell Viper Venom Time）
（ｄＲＶＶＴ）、カオリン凝固時間および希釈ＡＰＴＴ
を含めて、ＬＡをスクリーニングするために使用され
る。これらの試験の性能は、カオリン凝固時間および希
釈ＡＰＴＴの場合に、患者の血漿および通常の血漿を混
合する必要があることが困難である。従って、これらの
試験は常用の凝固器機を用いて容易に自動化されない。
さらに、市販の凍結乾燥血漿を通常の混合試験のための
血漿として使用する場合に、これらは凍結乾燥した市販
の調製剤中のリン脂質の高い含量のために誤ったマイナ
スの結果を生じることがある。
【０００６】患者の血漿は、通常の血小板欠乏血漿と混
合することによる補正の欠如を伴う延長されたスクリー
ニング調査を示すことで確立された場合、阻害剤のリン
脂質特異性を確かめる必要がある。２つの対比されるア
プローチが利用される。これらのアプローチの第１のも
のは、阻害剤効果を強調するための希釈リン脂質試験系
（たとえば組織トロンボプラスチン阻害［ＴＴＩ］）を
用いる。第２のアプローチは、ＬＡをバイパスまたは中
和するための過剰リン脂質の供給源（たとえば血小板中
和方法［ＰＮＰ］）を用いる。これらの２つの異なるア
プローチの比較分析は、ＰＮＰがＴＴＩよりもより感受
性であることを示す。
合することによる補正の欠如を伴う延長されたスクリー
ニング調査を示すことで確立された場合、阻害剤のリン
脂質特異性を確かめる必要がある。２つの対比されるア
プローチが利用される。これらのアプローチの第１のも
のは、阻害剤効果を強調するための希釈リン脂質試験系
（たとえば組織トロンボプラスチン阻害［ＴＴＩ］）を
用いる。第２のアプローチは、ＬＡをバイパスまたは中
和するための過剰リン脂質の供給源（たとえば血小板中
和方法［ＰＮＰ］）を用いる。これらの２つの異なるア
プローチの比較分析は、ＰＮＰがＴＴＩよりもより感受
性であることを示す。
【０００７】市販の試薬の異質性に加えて、患者の血漿
は、ＬＡ活性を有する抗体の類であることを示している
異常な異質性を示す。ＬＡの診断の問題は、ループス抗
凝血物質の標準化のためのＳＳＣ小委員会の審議により
強調される（Exner, T. et al., SSC Subcommittee for
the standardization of Lupus Anticoagulants, Guid
elines for Testing and Revised Criteria for Lupus
Anticoagrants. Thromb. Haemost. 65, 320-322, 199
1）。
は、ＬＡ活性を有する抗体の類であることを示している
異常な異質性を示す。ＬＡの診断の問題は、ループス抗
凝血物質の標準化のためのＳＳＣ小委員会の審議により
強調される（Exner, T. et al., SSC Subcommittee for
the standardization of Lupus Anticoagulants, Guid
elines for Testing and Revised Criteria for Lupus
Anticoagrants. Thromb. Haemost. 65, 320-322, 199
1）。
【０００８】多様なヘビの種類の毒は、酵素原のプロト
ロンビンを酵素トロンビンおよび／またはその触媒活性
前駆体のメイゾトロンビン（meizothrombin）に変える
酵素を含んでいる。両方の活性生成物はフィブリノーゲ
ンをフィブリンに変え、それにより血漿の凝固が生じ
る。同様に、両方のトロンビンおよびメイゾトロンビン
は合成発色トロンビン感受性基質からの発色団の加水分
解的な放出を触媒する。これらのヘビ毒プロトロンビン
活性剤の幾つかは補因子を必要とせず、一方第２のグル
ープはカルシウムイオンおよびリン脂質の存在に依存す
る。第３のグループはカルシウムおよびリン脂質の添加
において第Ｖ因子を必要とする。ヘビ毒プロトロンビン
活性剤に関する詳細は、Rosing J., Tans G., Thromb.
Haemost. 65, 627-630, 1991に記載されている。
ロンビンを酵素トロンビンおよび／またはその触媒活性
前駆体のメイゾトロンビン（meizothrombin）に変える
酵素を含んでいる。両方の活性生成物はフィブリノーゲ
ンをフィブリンに変え、それにより血漿の凝固が生じ
る。同様に、両方のトロンビンおよびメイゾトロンビン
は合成発色トロンビン感受性基質からの発色団の加水分
解的な放出を触媒する。これらのヘビ毒プロトロンビン
活性剤の幾つかは補因子を必要とせず、一方第２のグル
ープはカルシウムイオンおよびリン脂質の存在に依存す
る。第３のグループはカルシウムおよびリン脂質の添加
において第Ｖ因子を必要とする。ヘビ毒プロトロンビン
活性剤に関する詳細は、Rosing J., Tans G., Thromb.
Haemost. 65, 627-630, 1991に記載されている。
【０００９】リン脂質により効力が高められるが第Ｖ因
子によっては高められないリン脂質依存性プロトロンビ
ン活性剤は、エラピダエ科（Elapidae family）、特に
オキシウラヌス（Oxyuranus）およびプソイドナジャ類
（Pseudonaja genera）の部類に属するヘビの毒におい
て見出される。プソイドナジャ テクスティリス（Pseu
donaja textilis）のヘビ毒からカンカナバリンＡ−セ
ファロースのクロマトグラフィーおよびゲル濾過を用い
てプロトロンビン活性剤を精製する方法は、Masci P.P.
et al., Biochemistry International 17, 825, 1988
により記載されている。この方法に従って製造された活
性剤の市販の調製物は Venom Supplies, Tanunda, Aust
raliaから入手することができる。Ｐ．テクスチリスの
ヘビ毒からMasci et al.に従って単離されたプロトロン
ビン活性剤は、ナトリウムドデシルスルフェートの存在
でポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により
示されるように、サブユニットと結合した幾つかの非共
有原子価を含有する２０００００ダルトンより大きい分
子量を有するタンパク質である。Masci et al. (1988)
に従った活性剤は、カルシウムイオンの不在でクエン酸
塩処理した血漿を凝固させることができる。しかし、こ
の血漿の凝固活性は、カルシウムの存在で２．５倍刺激
されるが、リン脂質の添加によって付加的な刺激は観察
されなかった。
子によっては高められないリン脂質依存性プロトロンビ
ン活性剤は、エラピダエ科（Elapidae family）、特に
オキシウラヌス（Oxyuranus）およびプソイドナジャ類
（Pseudonaja genera）の部類に属するヘビの毒におい
て見出される。プソイドナジャ テクスティリス（Pseu
donaja textilis）のヘビ毒からカンカナバリンＡ−セ
ファロースのクロマトグラフィーおよびゲル濾過を用い
てプロトロンビン活性剤を精製する方法は、Masci P.P.
et al., Biochemistry International 17, 825, 1988
により記載されている。この方法に従って製造された活
性剤の市販の調製物は Venom Supplies, Tanunda, Aust
raliaから入手することができる。Ｐ．テクスチリスの
ヘビ毒からMasci et al.に従って単離されたプロトロン
ビン活性剤は、ナトリウムドデシルスルフェートの存在
でポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により
示されるように、サブユニットと結合した幾つかの非共
有原子価を含有する２０００００ダルトンより大きい分
子量を有するタンパク質である。Masci et al. (1988)
に従った活性剤は、カルシウムイオンの不在でクエン酸
塩処理した血漿を凝固させることができる。しかし、こ
の血漿の凝固活性は、カルシウムの存在で２．５倍刺激
されるが、リン脂質の添加によって付加的な刺激は観察
されなかった。
【００１０】リン脂質に不感受性のプロトロンビン活性
剤は、ビペリダエ科（family Viperdiae）に所属するヘ
ビ毒、特にエヒス（Echis）、トリメレスルス（Trimere
surus）およびボスロプス（Bothrops）の類に所属する
ヘビ毒から、R. K. Scopes, Protein Purification, Sp
ringer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, 2nded
ition, (1987)に記載されたような通常のタンパク質分
離技術を用いて単離することができる。ボスロプス ア
トロックス（Bothrops atrox）のヘビ毒からプロトロン
ビン活性剤を単離するための特別な方法は、Hofmann H.
and Bon C., Biochemistry 26,772 (1987)に記載され
ており、エヒス カリナトゥス（Echis carinatus）の
ヘビ毒からエカリン（Ecarin）を製造するための方法
は、Morita T. and Iwanaga S., J. Biochem. 83, 559
(1978) により提供されている。エカリンは Pentapharm
Ltd., Basel, CH から市販されている。１エカリン単
位は、合成発色トロンビン基質のＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いて測定されるように、規定さ
れた条件下でプロトロンビンから１国際単位（Ｕ）の酵
素活性を生じるエカリンの量である（１Ｕは標準条件下
で１分あたり１μＭの基質を加水分解する酵素の量であ
る）。
剤は、ビペリダエ科（family Viperdiae）に所属するヘ
ビ毒、特にエヒス（Echis）、トリメレスルス（Trimere
surus）およびボスロプス（Bothrops）の類に所属する
ヘビ毒から、R. K. Scopes, Protein Purification, Sp
ringer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, 2nded
ition, (1987)に記載されたような通常のタンパク質分
離技術を用いて単離することができる。ボスロプス ア
トロックス（Bothrops atrox）のヘビ毒からプロトロン
ビン活性剤を単離するための特別な方法は、Hofmann H.
and Bon C., Biochemistry 26,772 (1987)に記載され
ており、エヒス カリナトゥス（Echis carinatus）の
ヘビ毒からエカリン（Ecarin）を製造するための方法
は、Morita T. and Iwanaga S., J. Biochem. 83, 559
(1978) により提供されている。エカリンは Pentapharm
Ltd., Basel, CH から市販されている。１エカリン単
位は、合成発色トロンビン基質のＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いて測定されるように、規定さ
れた条件下でプロトロンビンから１国際単位（Ｕ）の酵
素活性を生じるエカリンの量である（１Ｕは標準条件下
で１分あたり１μＭの基質を加水分解する酵素の量であ
る）。
【００１１】
【課題を解決するための手段】オーストラリアの褐色ヘ
ビのプソイドナジャ テクスティリス（Pseudonaja tex
tilis）からの粗製ヘビ毒または市販されているこれら
のヘビ毒からのプロトロンビン活性剤を添加した結果、
ヒトのクエン酸塩処理した血漿の凝固時間がリン脂質お
よびカルシウムイオンの存在により僅かに短縮されたこ
とが見出された。さらに、リン脂質およびカルシウムの
存在で、Ｐ．テクスティリスのヘビ毒または市販のその
活性剤（Masci et al.により製造される）により誘導さ
れた凝固は、通常の血漿と比較してＬＡ含有血漿中に明
らかに遅延しなかった。従って、Ｐ．テクスティリスの
ヘビ毒は２つの異なるプロトロンビン活性剤を含有して
おり、この一方はその作動のためにリン脂質およびカル
シウムイオンが必要であり、かつＬＡに対して感受性で
あり、他方はリン脂質およびカルシウムとは無関係に作
動し、かつＬＡに対して不感受性であることが意想外に
見出された。さらに、Ｐ．テクスティリスのヘビ毒から
のリン脂質依存性プロトロンビン活性剤（ＰＬＤＰＡ）
は硫酸バリウムに吸着され、一方、リン脂質に依存しな
いプロトロンビン活性剤（ＰＬＩＰＡ）は溶液の形で残
留し、およびリン脂質依存性活性剤の簡単な精製方法は
この挙動を基礎にすることができることが見出された。
ビのプソイドナジャ テクスティリス（Pseudonaja tex
tilis）からの粗製ヘビ毒または市販されているこれら
のヘビ毒からのプロトロンビン活性剤を添加した結果、
ヒトのクエン酸塩処理した血漿の凝固時間がリン脂質お
よびカルシウムイオンの存在により僅かに短縮されたこ
とが見出された。さらに、リン脂質およびカルシウムの
存在で、Ｐ．テクスティリスのヘビ毒または市販のその
活性剤（Masci et al.により製造される）により誘導さ
れた凝固は、通常の血漿と比較してＬＡ含有血漿中に明
らかに遅延しなかった。従って、Ｐ．テクスティリスの
ヘビ毒は２つの異なるプロトロンビン活性剤を含有して
おり、この一方はその作動のためにリン脂質およびカル
シウムイオンが必要であり、かつＬＡに対して感受性で
あり、他方はリン脂質およびカルシウムとは無関係に作
動し、かつＬＡに対して不感受性であることが意想外に
見出された。さらに、Ｐ．テクスティリスのヘビ毒から
のリン脂質依存性プロトロンビン活性剤（ＰＬＤＰＡ）
は硫酸バリウムに吸着され、一方、リン脂質に依存しな
いプロトロンビン活性剤（ＰＬＩＰＡ）は溶液の形で残
留し、およびリン脂質依存性活性剤の簡単な精製方法は
この挙動を基礎にすることができることが見出された。
【００１２】さらに、硫酸バリウム吸着により精製され
たＰＬＤＰＡはカルシウムの不在で著しく低い血漿凝固
活性を示し、リン脂質およびカルシウムの存在でＰＬＤ
ＰＡの添加により測定した血漿凝固時間は、ＬＡの存在
により著しく延長されたことが見出された。さらに付加
的に、毒ヘビ（saw-scaled viper）の Echis carinatus
の毒液からのＰＬＩＰＡのエカリンを添加することに
より測定された凝固時間は、通常の血漿およびＬＡ含有
血漿の両方において等しく、最終的に両方のＰＬＩＰＡ
およびＰＬＤＰＡ凝固試験が第Ｖ、第ＶＩＩＩまたは第
Ｘ因子おいて欠乏した血漿を用いて通常の結果を示した
ことが見出された。
たＰＬＤＰＡはカルシウムの不在で著しく低い血漿凝固
活性を示し、リン脂質およびカルシウムの存在でＰＬＤ
ＰＡの添加により測定した血漿凝固時間は、ＬＡの存在
により著しく延長されたことが見出された。さらに付加
的に、毒ヘビ（saw-scaled viper）の Echis carinatus
の毒液からのＰＬＩＰＡのエカリンを添加することに
より測定された凝固時間は、通常の血漿およびＬＡ含有
血漿の両方において等しく、最終的に両方のＰＬＩＰＡ
およびＰＬＤＰＡ凝固試験が第Ｖ、第ＶＩＩＩまたは第
Ｘ因子おいて欠乏した血漿を用いて通常の結果を示した
ことが見出された。
【００１３】本発明の対象は、ＬＡの測定のために使用
することができるヘビ毒からのＰＬＤＰＡを提供するこ
とであった。
することができるヘビ毒からのＰＬＤＰＡを提供するこ
とであった。
【００１４】本発明のもう一つの対象はヘビ毒の精製方
法を提供することであった。
法を提供することであった。
【００１５】本発明のさらにもう一つの対象は、ＬＡの
測定のための異なる試験法ならびにそのために使用する
ことができる試験キットを提供することであった。
測定のための異なる試験法ならびにそのために使用する
ことができる試験キットを提供することであった。
【００１６】ＰＬＩＰＡにより汚染されていないＰＬＤ
ＰＡは、プソイドナジャ テクスティリス、Ｐ．アフィ
ニス、Ｐ．ヌカリス、オキシウラヌス スクテラツスま
たはＯ．ミクロレピドツスの粗製の毒液の水溶液から、 １） 主に水に不溶性のバリウム塩、たとえば硫酸バリ
ウム、クエン酸バリウム、リン酸バリウムに吸着させる
か、または水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウムま
たはリン酸三カルシウムに吸着させ、 ２） 吸着物を水または食塩水で非吸着タンパク質が除
去されるまで洗浄し、 ３） ＰＬＤＰＡを、アルカリ土類金属イオンおよびア
ルミニウムイオンと共に主に不溶性の塩を形成する酸の
アルカリ金属−、アンモニウム−または有機アミンの
塩、たとえばクエン酸塩、モルホリノエタンスルホン酸
塩、リン酸塩またはエチレンジアミンテトラ酢酸塩の水
溶液を用いて溶離させ、および ４） 溶離剤を限外濾過、透析またはゲル濾過により除
去することにより得ることができる。生じたＰＬＤＰＡ
は、ポリアクリルアミドの８〜２５％へのゲル勾配でＳ
ＤＳの存在での電気泳動により、４００００〜６０００
０ダルトンの分子量に相当する移動度を有する１つの主
要バンドおよび１つまたは２つの１０００００〜１５０
０００ダルトンとの間の分子量を有する非主要バンドと
して移行する。本発明によるＰＬＤＰＡの血小板欠乏性
のヒト血漿に関して測定した血漿凝固活性は、カルシウ
ムイオンの添加により約２０倍刺激され、カルシウムイ
オンおよびリン脂質の両方の添加により約５０倍刺激さ
れた。
ＰＡは、プソイドナジャ テクスティリス、Ｐ．アフィ
ニス、Ｐ．ヌカリス、オキシウラヌス スクテラツスま
たはＯ．ミクロレピドツスの粗製の毒液の水溶液から、 １） 主に水に不溶性のバリウム塩、たとえば硫酸バリ
ウム、クエン酸バリウム、リン酸バリウムに吸着させる
か、または水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウムま
たはリン酸三カルシウムに吸着させ、 ２） 吸着物を水または食塩水で非吸着タンパク質が除
去されるまで洗浄し、 ３） ＰＬＤＰＡを、アルカリ土類金属イオンおよびア
ルミニウムイオンと共に主に不溶性の塩を形成する酸の
アルカリ金属−、アンモニウム−または有機アミンの
塩、たとえばクエン酸塩、モルホリノエタンスルホン酸
塩、リン酸塩またはエチレンジアミンテトラ酢酸塩の水
溶液を用いて溶離させ、および ４） 溶離剤を限外濾過、透析またはゲル濾過により除
去することにより得ることができる。生じたＰＬＤＰＡ
は、ポリアクリルアミドの８〜２５％へのゲル勾配でＳ
ＤＳの存在での電気泳動により、４００００〜６０００
０ダルトンの分子量に相当する移動度を有する１つの主
要バンドおよび１つまたは２つの１０００００〜１５０
０００ダルトンとの間の分子量を有する非主要バンドと
して移行する。本発明によるＰＬＤＰＡの血小板欠乏性
のヒト血漿に関して測定した血漿凝固活性は、カルシウ
ムイオンの添加により約２０倍刺激され、カルシウムイ
オンおよびリン脂質の両方の添加により約５０倍刺激さ
れた。
【００１７】ＬＡに対して感受性の凝固試験は、血漿試
料を適当な量のリン脂質懸濁液およびＰＬＤＰＡの溶液
と混合し、十分な量の塩化カルシウム溶液の添加による
凝固時間の測定により行うことができる。このＰＬＤＰ
Ａ凝固時間は、ＬＡ含有血漿の場合、通常の血漿と比較
して延長され；これは同様にトロンビンの量的または質
的な異常の場合に延長されるが、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｖ
ＩＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ因子の欠乏により影響されな
いままである。
料を適当な量のリン脂質懸濁液およびＰＬＤＰＡの溶液
と混合し、十分な量の塩化カルシウム溶液の添加による
凝固時間の測定により行うことができる。このＰＬＤＰ
Ａ凝固時間は、ＬＡ含有血漿の場合、通常の血漿と比較
して延長され；これは同様にトロンビンの量的または質
的な異常の場合に延長されるが、第Ｖ、第ＶＩＩ、第Ｖ
ＩＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ因子の欠乏により影響されな
いままである。
【００１８】この凝固試験はＰＬＤＰＡおよびリン脂質
を混合凍結乾燥させた安定した形で含有する復元試薬の
製造により簡略化することができる。所望の場合に、こ
の試験のために必要であるカルシウムイオンの量はＰＬ
ＤＰＡおよびリン脂質と一緒に混合凍結乾燥することも
でき、低い凍結点を有する非吸湿性カルシウム塩が活性
を抑制する場合、たとえばグルコン酸カルシウムまたは
ラクトビオン酸カルシウムが使用される。
を混合凍結乾燥させた安定した形で含有する復元試薬の
製造により簡略化することができる。所望の場合に、こ
の試験のために必要であるカルシウムイオンの量はＰＬ
ＤＰＡおよびリン脂質と一緒に混合凍結乾燥することも
でき、低い凍結点を有する非吸湿性カルシウム塩が活性
を抑制する場合、たとえばグルコン酸カルシウムまたは
ラクトビオン酸カルシウムが使用される。
【００１９】ＬＡについての発色試験は、血漿試料をＰ
ＬＤＰＡおよびリン脂質と混合し、塩化カルシウムを添
加し、この混合物を規定の活性化時間インキュベート
し、キレート剤、たとえばエチレンジアミンテトラ酢酸
塩を含有する緩衝液の添加によりプロトロンビン活性工
程を停止させ、発色性基質、たとえばＴｏｓ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いて生じたトロンビンの量
を測定する。ＬＡ含有血漿中に生じたトロンビンの量
は、通常の血漿中に生じた量と比較して明らかに少な
い；これはプロトロンビンの質的または量的異常の場合
にも同様に少ない。
ＬＤＰＡおよびリン脂質と混合し、塩化カルシウムを添
加し、この混合物を規定の活性化時間インキュベート
し、キレート剤、たとえばエチレンジアミンテトラ酢酸
塩を含有する緩衝液の添加によりプロトロンビン活性工
程を停止させ、発色性基質、たとえばＴｏｓ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを用いて生じたトロンビンの量
を測定する。ＬＡ含有血漿中に生じたトロンビンの量
は、通常の血漿中に生じた量と比較して明らかに少な
い；これはプロトロンビンの質的または量的異常の場合
にも同様に少ない。
【００２０】プロトロンビンの不足によりその結果に影
響を及ぼさないＬＡについての凝固試験は、ＰＬＩＰ
Ａ、たとえばエカリンの添加の後に血漿凝固時間を測定
し、リン脂質およびＰＬＤＰＡの添加の後にその凝固時
間を測定し、ＰＬＩＰＡ／ＰＬＤＰＡ凝固時間比および
／またはＰＬＤＰＡ／ＰＬＩＰＡ凝固時間比を算定する
ことからなる。ＰＬＩＰＡおよびＰＬＤＰＡの両方の凝
固時間は、血漿試料のプロトロンビン含量に対して反比
例している。しかし、試料中にＬＡが存在する場合、添
加されたリン脂質との相互作用によりＰＬＤＰＡ凝固時
間の延長が生じ、エカリン凝固時間は影響されないまま
である。従って、１より下のＰＬＩＰＡ／ＰＬＤＰＡ凝
固時間比はまたは１より上のＰＬＤＰＡ／ＰＬＩＰＡ凝
固時間（参照時間内で）は、ＬＡまたは分子的異常を有
するプロトロンビンの存在を示す。本発明によるＰＬＩ
ＰＡおよびＰＬＤＰＡ試薬の効力は、有利に、両方の試
薬が一定の条件下で、若干の時間、たとえば２０秒間に
通常のヒトの血漿を凝固させるように調節する。ＰＬＩ
ＰＡ−およびＰＬＤＰＡ試験のための試薬は、限定され
た時間内に使用するための限定された安定性を有する液
体の形で製造することができるか、またはすぐに使用で
きる溶液を得るために水または緩衝液を用いて復元され
る安定な凍結乾燥調製剤として製造することができる。
響を及ぼさないＬＡについての凝固試験は、ＰＬＩＰ
Ａ、たとえばエカリンの添加の後に血漿凝固時間を測定
し、リン脂質およびＰＬＤＰＡの添加の後にその凝固時
間を測定し、ＰＬＩＰＡ／ＰＬＤＰＡ凝固時間比および
／またはＰＬＤＰＡ／ＰＬＩＰＡ凝固時間比を算定する
ことからなる。ＰＬＩＰＡおよびＰＬＤＰＡの両方の凝
固時間は、血漿試料のプロトロンビン含量に対して反比
例している。しかし、試料中にＬＡが存在する場合、添
加されたリン脂質との相互作用によりＰＬＤＰＡ凝固時
間の延長が生じ、エカリン凝固時間は影響されないまま
である。従って、１より下のＰＬＩＰＡ／ＰＬＤＰＡ凝
固時間比はまたは１より上のＰＬＤＰＡ／ＰＬＩＰＡ凝
固時間（参照時間内で）は、ＬＡまたは分子的異常を有
するプロトロンビンの存在を示す。本発明によるＰＬＩ
ＰＡおよびＰＬＤＰＡ試薬の効力は、有利に、両方の試
薬が一定の条件下で、若干の時間、たとえば２０秒間に
通常のヒトの血漿を凝固させるように調節する。ＰＬＩ
ＰＡ−およびＰＬＤＰＡ試験のための試薬は、限定され
た時間内に使用するための限定された安定性を有する液
体の形で製造することができるか、またはすぐに使用で
きる溶液を得るために水または緩衝液を用いて復元され
る安定な凍結乾燥調製剤として製造することができる。
【００２１】ＬＡ試験のための免疫発色原則は、微量滴
定プレートをリン脂質で被覆し、一連の通常の血漿試料
および患者の血漿試料をその凹所中に添加し（ＬＡをリ
ン脂質層に結合させ）、すすぐことにより血漿を除去
し、ＰＬＤＰＡおよびカルシウム含有プロトロンビン溶
液をそれぞれの凹所に添加し、キレート化剤の添加によ
り活性を停止させ、合成発色トロンビン基質を添加し、
一定のインキュベート時間の後に酢酸を用いて反応を停
止させ、放出された発色団を微量滴定プレート読み取り
光度計を用いて測定することにより行うことができる。
この試験の原則はプロトロンビン異常により影響されな
い。
定プレートをリン脂質で被覆し、一連の通常の血漿試料
および患者の血漿試料をその凹所中に添加し（ＬＡをリ
ン脂質層に結合させ）、すすぐことにより血漿を除去
し、ＰＬＤＰＡおよびカルシウム含有プロトロンビン溶
液をそれぞれの凹所に添加し、キレート化剤の添加によ
り活性を停止させ、合成発色トロンビン基質を添加し、
一定のインキュベート時間の後に酢酸を用いて反応を停
止させ、放出された発色団を微量滴定プレート読み取り
光度計を用いて測定することにより行うことができる。
この試験の原則はプロトロンビン異常により影響されな
い。
【００２２】全ての前記試験法においてＰＬＤＰＡのた
めの基質としてプロトロンビンを混入することにより、
質的および／または量的プロトロンビン異常による干渉
を回避することができる。
めの基質としてプロトロンビンを混入することにより、
質的および／または量的プロトロンビン異常による干渉
を回避することができる。
【００２３】ＰＬＤＰＡ試験の実施のために適したリン
脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（コラミンケ
ファリンと同義）およびホスファチジルセリン（セリン
ケファリンと同義）を含有する調製剤であり、これらは
動物、植物または微生物バイオマスから有機溶剤抽出に
より得ることができる。たとえばウシの脳、卵黄または
大豆からの適当なリン脂質調製剤は、Sigma Chemical C
ompany, St. Louis, Mo, USA から市販されている。
脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（コラミンケ
ファリンと同義）およびホスファチジルセリン（セリン
ケファリンと同義）を含有する調製剤であり、これらは
動物、植物または微生物バイオマスから有機溶剤抽出に
より得ることができる。たとえばウシの脳、卵黄または
大豆からの適当なリン脂質調製剤は、Sigma Chemical C
ompany, St. Louis, Mo, USA から市販されている。
【００２４】復元のために適したＰＬＤＰＡ試薬は、本
発明に従って生成したＰＬＤＰＡおよびタンパク質安定
化ポリマー、たとえばコラーゲン誘導ポリペプチドおよ
び／またはウシ血清アルブミンおよび／またはデキスト
ランを、水または懸濁液に溶かし、リン脂質懸濁液を添
加し、この混合物を、復元のために適したバイアル中に
小分けした後、凍結乾燥させた。所望の場合に、凍結乾
燥カルシウム塩、たとえばグルコン酸カルシウムまたは
ラクトビオン酸カルシウムを添加することができる。
発明に従って生成したＰＬＤＰＡおよびタンパク質安定
化ポリマー、たとえばコラーゲン誘導ポリペプチドおよ
び／またはウシ血清アルブミンおよび／またはデキスト
ランを、水または懸濁液に溶かし、リン脂質懸濁液を添
加し、この混合物を、復元のために適したバイアル中に
小分けした後、凍結乾燥させた。所望の場合に、凍結乾
燥カルシウム塩、たとえばグルコン酸カルシウムまたは
ラクトビオン酸カルシウムを添加することができる。
【００２５】本発明によるＰＬＴＰＡ試験のための適当
なＰＬＩＰＡ試薬は、エカリンおよび安定化ポリマー、
たとえば血清アルブミンおよび／またはコラーゲン誘導
ポリペプチドおよび／またはデキストランを水または緩
衝溶液中に溶かし、復元のために適したバイアル中に小
分けしたこの溶液を凍結乾燥させる。
なＰＬＩＰＡ試薬は、エカリンおよび安定化ポリマー、
たとえば血清アルブミンおよび／またはコラーゲン誘導
ポリペプチドおよび／またはデキストランを水または緩
衝溶液中に溶かし、復元のために適したバイアル中に小
分けしたこの溶液を凍結乾燥させる。
【００２６】試験試薬のｐＨは７〜８、有利に７．４に
調節され、緩衝液系を用いて安定化される。適当な緩衝
液系は、たとえばトリス−（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタンヒドロクロリド（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタン−スルホン酸（ＭＥＳ）およ
びＮ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）からなる。
調節され、緩衝液系を用いて安定化される。適当な緩衝
液系は、たとえばトリス−（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタンヒドロクロリド（ＴＲＩＳ−ＨＣｌ）、２−
（Ｎ−モルホリノ）エタン−スルホン酸（ＭＥＳ）およ
びＮ−２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−エタ
ンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）からなる。
【００２７】血漿中のＬＡのためのＰＬＩＰＡおよびＰ
ＬＤＰＡ試験は、反応混合物中でフィブリン形成が開始
されるまでの時間を、ゲル形成の手作業による検出また
は機械的検出によりまたは分光的濁度測定により測定す
ることにより行われる。
ＬＤＰＡ試験は、反応混合物中でフィブリン形成が開始
されるまでの時間を、ゲル形成の手作業による検出また
は機械的検出によりまたは分光的濁度測定により測定す
ることにより行われる。
【００２８】
例１ Ｐ．テクスティリスのヘビ毒からのＰＬＤＰＡの製造 粗製Ｐ．テクスティリスのヘビ毒５０ｍｇを、クエン酸
三ナトリウム水溶液１００ｍｌに溶かした。塩化バリウ
ム溶液（１Ｍ）８ｍｌを添加し、この混合物を３０分間
攪拌し、形成された沈殿物を遠心分離により分離し、ク
エン酸塩処理した食塩水の水溶液（塩化ナトリウム０．
１５Ｍおよびクエン酸三ナトリウム０．０２Ｍ）３３ｍ
ｌ中に溶かした。塩化バリウム（１Ｍ）２．６４ｍｌを
この溶液に添加し、３０分間攪拌した後、形成された沈
殿物を遠心分離により分離し、堆積物をクエン酸塩処理
した食塩水３３ｍｌで洗浄した。この洗浄した堆積物を
ＥＤＴＡ０．２Ｍ中に溶かし、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ−
バリウムキレートを、１００００ダルトンを遮断する膜
を通す限外濾過により除去し、十分に食塩水で洗浄し
た。この保持物を凍結乾燥するとＰＬＤＰＡが得られ、
これは、５３０００ダルトンの分子量に相応する移動度
での１つの主要バンドおよびそれぞれ１１００００〜１
３００００ダルトンの分子量を示す２つの非主要バンド
として、８〜２５％のポリアクリルアミドの勾配を用い
るＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で移行した。ＰＬＤＰＡ溶液を、
通常のヒトのクエン酸塩処理した血漿を塩化カルシウム
１２．５ｍＭおよびウサギの脳のリン脂質１７μｇ／ｍ
ｌの存在で、２０秒の内で凝固するように調節し、カル
シウムイオンおよびリン脂質の不在で９００秒より長い
血漿凝固時間を示した。
三ナトリウム水溶液１００ｍｌに溶かした。塩化バリウ
ム溶液（１Ｍ）８ｍｌを添加し、この混合物を３０分間
攪拌し、形成された沈殿物を遠心分離により分離し、ク
エン酸塩処理した食塩水の水溶液（塩化ナトリウム０．
１５Ｍおよびクエン酸三ナトリウム０．０２Ｍ）３３ｍ
ｌ中に溶かした。塩化バリウム（１Ｍ）２．６４ｍｌを
この溶液に添加し、３０分間攪拌した後、形成された沈
殿物を遠心分離により分離し、堆積物をクエン酸塩処理
した食塩水３３ｍｌで洗浄した。この洗浄した堆積物を
ＥＤＴＡ０．２Ｍ中に溶かし、ｐＨ７．４、ＥＤＴＡ−
バリウムキレートを、１００００ダルトンを遮断する膜
を通す限外濾過により除去し、十分に食塩水で洗浄し
た。この保持物を凍結乾燥するとＰＬＤＰＡが得られ、
これは、５３０００ダルトンの分子量に相応する移動度
での１つの主要バンドおよびそれぞれ１１００００〜１
３００００ダルトンの分子量を示す２つの非主要バンド
として、８〜２５％のポリアクリルアミドの勾配を用い
るＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で移行した。ＰＬＤＰＡ溶液を、
通常のヒトのクエン酸塩処理した血漿を塩化カルシウム
１２．５ｍＭおよびウサギの脳のリン脂質１７μｇ／ｍ
ｌの存在で、２０秒の内で凝固するように調節し、カル
シウムイオンおよびリン脂質の不在で９００秒より長い
血漿凝固時間を示した。
【００２９】例２ リン脂質依存性プロトロンビン活性試験のためのテクス
タリン試薬の製造 例１により製造されたテクスタリンを、０．０５モルの
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のコラーゲン誘導ポ
リペプチド（Prionex(登録商標), Pentapharm）１％か
らなる溶剤混合物中に溶かし、原液Ｉ ５０ｍｌを製造
した。
タリン試薬の製造 例１により製造されたテクスタリンを、０．０５モルの
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中のコラーゲン誘導ポ
リペプチド（Prionex(登録商標), Pentapharm）１％か
らなる溶剤混合物中に溶かし、原液Ｉ ５０ｍｌを製造
した。
【００３０】ウサギの脳のケファリン５００ｍｇを溶剤
混合物５０００ｍｌ中に均質混合させ、原液ＩＩが得ら
れた。
混合物５０００ｍｌ中に均質混合させ、原液ＩＩが得ら
れた。
【００３１】原液Ｉの連続的希釈液は、原液ＩＩと混合
することにより製造された。次に、クエン酸塩処理した
ヒト血漿の凝固時間を、次の手段を用いてそれぞれ希釈
することにより測定した：希釈液０．１ｍｌおよび塩化
カルシウム溶液０．１ｍｌ（０．０２５Ｍ）を３７℃で
３分間インキュベートし、次に、通常のヒト血漿０．１
ｍｌを添加し、凝固時間を手作業で測定した。原液Ｉ
１容量と原液ＩＩ ６４容量との混合物は、通常の血漿
を２０秒間で凝固させた。ＰＬＤＰＡ原液の総量を希釈
し、それに応じてケファリンと混合し、１．０ｍｌの部
分に小分けし、シリコーン処理したバイアルに充填し、
凍結乾燥した。凍結乾燥生成物は、蒸留水（１バイアル
あたり１ｍｌ）で復元した後、血漿０．１ｍｌ、テクス
タリン試薬０．１ｍｌおよびＣａＣｌ2０．１ｍｌから
なる試験化合物中で、クエン酸塩処理した通常のヒト血
漿を、２０±２秒間で凝固させる試薬であった。
することにより製造された。次に、クエン酸塩処理した
ヒト血漿の凝固時間を、次の手段を用いてそれぞれ希釈
することにより測定した：希釈液０．１ｍｌおよび塩化
カルシウム溶液０．１ｍｌ（０．０２５Ｍ）を３７℃で
３分間インキュベートし、次に、通常のヒト血漿０．１
ｍｌを添加し、凝固時間を手作業で測定した。原液Ｉ
１容量と原液ＩＩ ６４容量との混合物は、通常の血漿
を２０秒間で凝固させた。ＰＬＤＰＡ原液の総量を希釈
し、それに応じてケファリンと混合し、１．０ｍｌの部
分に小分けし、シリコーン処理したバイアルに充填し、
凍結乾燥した。凍結乾燥生成物は、蒸留水（１バイアル
あたり１ｍｌ）で復元した後、血漿０．１ｍｌ、テクス
タリン試薬０．１ｍｌおよびＣａＣｌ2０．１ｍｌから
なる試験化合物中で、クエン酸塩処理した通常のヒト血
漿を、２０±２秒間で凝固させる試薬であった。
【００３２】例３ リン脂質に依存しないプロトロンビン活性試験のための
エカリン試薬の製造 ５００ＥＵ／ｍｇの効力を有するエカリン１０ｍｇ（Pe
ntapharm）を、０．０５モルのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．４）中の１％のコラーゲン誘導ポリペプチド（Prio
nex(登録商標), Pentapharm）からなる溶剤混合物５０
ｍｌ中に溶解させ、エカリン原液が得られた。溶剤混合
物を用いて原液の一連の希釈液を製造し、クエン酸塩処
理した通常のヒトの血漿の凝固時間を、血漿０．２ｍｌ
およびエカリン希釈液０．１ｍｌの試験混合物を用い
て、３７℃で手作業で測定した。通常の血漿が２０秒間
で凝固するこの希釈度を測定し、それによりエカリン原
液を凍結乾燥のために１ｍｌあたり約１６ＥＵを有する
溶液が得られるように希釈した。この溶液を１．０ｍｌ
の部分に小分けし、適当なバイアルに充填し、凍結乾燥
させた。この凍結乾燥生成物は、１．０ｍｌの蒸留水で
復元した後、血漿０．２ｍｌおよびエカリン試薬０．１
ｍｌからなる試験混合物中で、クエン酸処理した通常の
ヒトの血漿を２０±２秒で凝固させる試薬であった。
エカリン試薬の製造 ５００ＥＵ／ｍｇの効力を有するエカリン１０ｍｇ（Pe
ntapharm）を、０．０５モルのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．４）中の１％のコラーゲン誘導ポリペプチド（Prio
nex(登録商標), Pentapharm）からなる溶剤混合物５０
ｍｌ中に溶解させ、エカリン原液が得られた。溶剤混合
物を用いて原液の一連の希釈液を製造し、クエン酸塩処
理した通常のヒトの血漿の凝固時間を、血漿０．２ｍｌ
およびエカリン希釈液０．１ｍｌの試験混合物を用い
て、３７℃で手作業で測定した。通常の血漿が２０秒間
で凝固するこの希釈度を測定し、それによりエカリン原
液を凍結乾燥のために１ｍｌあたり約１６ＥＵを有する
溶液が得られるように希釈した。この溶液を１．０ｍｌ
の部分に小分けし、適当なバイアルに充填し、凍結乾燥
させた。この凍結乾燥生成物は、１．０ｍｌの蒸留水で
復元した後、血漿０．２ｍｌおよびエカリン試薬０．１
ｍｌからなる試験混合物中で、クエン酸処理した通常の
ヒトの血漿を２０±２秒で凝固させる試薬であった。
【００３３】例４ ＬＡのためのテクスタリン−およびエカリン凝固試験 例２によるテクスタリン試薬および例３によるエカリン
試薬を、１バイアルあたり１．０ｍｌの蒸留水で復元し
た。
試薬を、１バイアルあたり１．０ｍｌの蒸留水で復元し
た。
【００３４】１０人の手術前の患者から集めた通常の血
液凝固状態を有する血漿試料および１０人のＬＡ含有血
漿試料のテクスタリン−およびエカリン凝固時間を測定
した。この結果は表１および表２に記載した。
液凝固状態を有する血漿試料および１０人のＬＡ含有血
漿試料のテクスタリン−およびエカリン凝固時間を測定
した。この結果は表１および表２に記載した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
【表２】
【００３７】例５ 発色テクスタリン試験 材料：例２によるテクスタリン試薬を、１バイアルあた
り１ｍｌの蒸留水で復元した。発色トロンビン基質：Ｔ
ｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Chromozym TH
(登録商標), Pentapharm Ltd.製造, Boehringer-Mannhe
im販売）を、１ｍｌあたり４μモルの濃度で蒸留水中に
溶解させた。塩化カルシウム／ＧＰＲＰ溶液は、１ｍｌ
あたり、ＣａＣｌ2０．０２５モルおよびＧｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ、Pefabloc FG (登録商
標)、フィブリン重合の阻害剤、Pentapharm）０．５ｍ
ｇを含有していた。ＥＤＴＡ緩衝液は、グリシン−Ｎａ
ＯＨ緩衝液、０．３Ｍ、ｐＨ８．４、ＥＤＴＡ・Ｎａ2
中０．７５ｍＭであった。
り１ｍｌの蒸留水で復元した。発色トロンビン基質：Ｔ
ｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Chromozym TH
(登録商標), Pentapharm Ltd.製造, Boehringer-Mannhe
im販売）を、１ｍｌあたり４μモルの濃度で蒸留水中に
溶解させた。塩化カルシウム／ＧＰＲＰ溶液は、１ｍｌ
あたり、ＣａＣｌ2０．０２５モルおよびＧｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（ＧＰＲＰ、Pefabloc FG (登録商
標)、フィブリン重合の阻害剤、Pentapharm）０．５ｍ
ｇを含有していた。ＥＤＴＡ緩衝液は、グリシン−Ｎａ
ＯＨ緩衝液、０．３Ｍ、ｐＨ８．４、ＥＤＴＡ・Ｎａ2
中０．７５ｍＭであった。
【００３８】試験：テクスタリン試薬０．０２０ｍｌお
よびＣａＣｌ2／ＧＰＲＰ０．０２０ｍｌを、測光キュ
ベットにピペットで入れ、３７℃で２分間前加熱し、
０．０２０ｍｌの血漿試料を添加し、３７℃で正確に３
０秒間インキュベートした。この活性化プロセスをＥＤ
ＴＡ緩衝液１．７４ｍｌの添加により停止させ、Chromo
zym TH ０．２００ｍｌを添加し、トロンビンの生成に
より触媒されたｐ−ニトロアニリン放出を、４０５ｎｍ
の波長で光度計を用いて記録した。トロンビン生成量に
対して正比例する１分あたりの吸光度差（ＤＡ４０５／
分）を、通常の血漿試料およびＬＡ含有血漿試料におい
て測定した。
よびＣａＣｌ2／ＧＰＲＰ０．０２０ｍｌを、測光キュ
ベットにピペットで入れ、３７℃で２分間前加熱し、
０．０２０ｍｌの血漿試料を添加し、３７℃で正確に３
０秒間インキュベートした。この活性化プロセスをＥＤ
ＴＡ緩衝液１．７４ｍｌの添加により停止させ、Chromo
zym TH ０．２００ｍｌを添加し、トロンビンの生成に
より触媒されたｐ−ニトロアニリン放出を、４０５ｎｍ
の波長で光度計を用いて記録した。トロンビン生成量に
対して正比例する１分あたりの吸光度差（ＤＡ４０５／
分）を、通常の血漿試料およびＬＡ含有血漿試料におい
て測定した。
【００３９】結果：通常の血漿のＤＡ４０５／分値は
０．０７〜０．１の間で変化し、ＬＡ含有血漿の場合
は、０．０２〜０．０６の値が生じた。
０．０７〜０．１の間で変化し、ＬＡ含有血漿の場合
は、０．０２〜０．０６の値が生じた。
【００４０】例６ 異なる種類のヘビ毒からのリン脂質依存性プロトロンビ
ン活性剤（ＰＬＤＰＡ）の製造 オキシウラヌス スクテラツス（Oxyuranus scutellatu
s）、Ｏ．ミクロレピドツス（O. microlepidotus）、プ
ソイドナジャ テクスチリス（Pseudonaja textili
s）、Ｐ．インフラマクラタ（P. inframaculata）およ
びＰ．ヌカリス（P.nuchalis）からの乾燥させた粗製の
ヘビ毒それぞれ５ｍｇの試料を、クエン酸三ナトリウム
の水溶液１０ｍｌに溶かした。塩化バリウム溶液０．８
ｍｌ、１Ｍを添加し、この混合物を３０分間攪拌し、生
じた沈殿物を遠心分離により分離し、クエン酸処理した
食塩（塩化ナトリウム０．１５Ｍおよびクエン酸三ナト
リウム０．０２Ｍ）の水溶液３ｍｌに溶かし、塩化バリ
ウム０．２５ｍｌ（１Ｍ）を溶液に添加し、３０分間攪
拌した後、生じた沈殿物を遠心分離により分離し、堆積
物をＥＤＴＡ０．２Ｍ、ｐＨ７．４に溶かし、プロトロ
ンビン活性試験のための原液が得られた。
ン活性剤（ＰＬＤＰＡ）の製造 オキシウラヌス スクテラツス（Oxyuranus scutellatu
s）、Ｏ．ミクロレピドツス（O. microlepidotus）、プ
ソイドナジャ テクスチリス（Pseudonaja textili
s）、Ｐ．インフラマクラタ（P. inframaculata）およ
びＰ．ヌカリス（P.nuchalis）からの乾燥させた粗製の
ヘビ毒それぞれ５ｍｇの試料を、クエン酸三ナトリウム
の水溶液１０ｍｌに溶かした。塩化バリウム溶液０．８
ｍｌ、１Ｍを添加し、この混合物を３０分間攪拌し、生
じた沈殿物を遠心分離により分離し、クエン酸処理した
食塩（塩化ナトリウム０．１５Ｍおよびクエン酸三ナト
リウム０．０２Ｍ）の水溶液３ｍｌに溶かし、塩化バリ
ウム０．２５ｍｌ（１Ｍ）を溶液に添加し、３０分間攪
拌した後、生じた沈殿物を遠心分離により分離し、堆積
物をＥＤＴＡ０．２Ｍ、ｐＨ７．４に溶かし、プロトロ
ンビン活性試験のための原液が得られた。
【００４１】ヒト血漿凝固時間を、リン脂質およびカル
シウムイオンの存在および不在で、それぞれの原液の希
釈液を用いて測定した。この結果を表３に示した。
シウムイオンの存在および不在で、それぞれの原液の希
釈液を用いて測定した。この結果を表３に示した。
【００４２】
【表３】
Claims (18)
- 【請求項１】 エラピダエ科、特にオキシウラヌスおよ
びプソイドナジャ類の部類に属するヘビの毒から得られ
るリン脂質依存性プロトロンビン活性剤において、 ａ） リン脂質およびカルシウムイオンの存在で血漿凝
固活性を増大させ、ループス抗凝血物質の存在で減少さ
せ、 ｂ） それぞれ第Ｖ、第ＶＩＩ、第ＶＩＩＩまたは第Ｘ
因子に依存せず、 ｃ） ４００００〜６００００ダルトンの分子量に相当
する移動度での主要バンドを示すことを特徴とするリン
脂質依存性プロトロンビン活性剤。 - 【請求項２】 １０００００〜１５００００ダルトンの
分子量に相当する移動度での１または２の非主要バンド
を示す請求項１記載の活性剤。 - 【請求項３】 血漿凝固活性が、１０倍以上のカルシウ
ムイオンの存在でおよび４０倍以上のリン脂質およびカ
ルシウムイオンの存在で刺激される請求項１または２記
載の活性剤。 - 【請求項４】 プソイドナジャ アフィニス、プソイド
ナジャ ヌカリス、オキシウラヌス スクテラツスまた
はオキシウラヌス ミクロレピドツス、特にプソイドナ
ジャ テクスチリスのヘビ毒から得られる請求項１から
３までのいずれか１項記載の活性剤。 - 【請求項５】ａ） 前記ヘビ毒を、実際に水に不溶性の
バリウム、マグネシウム、カルシウムまたはアルミニウ
ムの塩に吸着させ、洗浄し、 ｂ） アルカリ土類金属イオンおよびアルミニウムイオ
ンと共に実際に不溶性の塩、錯体またはキレートを形成
するアルカリ−、アンモニウム−または有機アミン塩の
水溶液を用いて活性剤を溶離させ、 ｃ） 塩から溶離剤を除去することを特徴とする請求項
１から４までのいずれか１項記載の活性剤の製造方法。 - 【請求項６】 吸着工程において、クエン酸バリウム、
リン酸バリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシ
ウムまたはリン酸三カルシウム、特に硫酸バリウムを使
用する請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 溶離工程の塩として、クエン酸塩、モル
ホリノエタンスルホン酸塩、リン酸塩またはエチレンジ
アミンテトラ酢酸塩を使用する請求項５または６記載の
製造方法。 - 【請求項８】 溶離剤の除去のために限外濾過、透析ま
たはゲル濾過を行う請求項５から７までのいずれか１項
記載の方法。 - 【請求項９】 ループス抗凝血物質に感受性の凝血試験
法において、血漿試料を適当な量のリン脂質懸濁液およ
び請求項１から４までのいずれか１項記載の活性剤の溶
液と混合し、十分な量のカルシウム塩溶液、特に塩化カ
ルシウム溶液を添加し、凝血時間を測定するループス抗
凝血物質に感受性の凝血試験法。 - 【請求項１０】 ループス抗凝血物質に感受性の発色試
験法において、血漿試料を請求項１から４までのいずれ
か１項記載の活性剤およびリン脂質と混合し、カルシウ
ム塩、特に塩化カルシウムを添加し、この混合物を一定
の活性時間インキュベートし、プロトロンビン活性工程
をキレート剤、特にエチレンジアミンテトラ酢酸塩を含
有する緩衝液の添加により停止させ、生じたトロンビン
の量を色素原基質、特にＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−ｐＮＡの測定により測定することを特徴とするルー
プス抗凝血物質に感受性の発色試験法。 - 【請求項１１】 リン脂質に依存しないプロトロンビン
活性剤および請求項１から４までのいずれか１項記載の
活性剤の血漿凝固時間の比率を測定することを特徴とす
るループス抗凝血物質に感受性の凝血試験法。 - 【請求項１２】 特にエヒス、トリメレスルスおよびボ
スロプス、特にボスロプス アトロックス、特にエヒス
カリナトスの類に所属するビペリダエ科のヘビ毒から
単離したリン脂質に依存しないプロトロンビン活性剤、
たとえばエカリンを使用する請求項１１記載の凝血試験
法。 - 【請求項１３】 ループス抗凝血物質に感受性の免疫発
色試験法において、微量滴定板をリン脂質でコーティン
グし、一連の正常のおよび患者の血漿試料を凹所に添加
し、過剰の血漿を除去するためにすすぎ、請求項１から
４までのいずれか１項記載の活性剤およびカルシウム含
有プロトロンビン溶液をそれぞれの凹所に添加し、活性
をキレート剤の添加により停止させ、有利な合成発色性
トロンビン基質を添加し、酸、有利に酢酸を用いて反応
を停止し、一定のインキュベート時間の後、遊離した発
色団を、有利に微量滴定板読み取り光度計を用いて測定
することを特徴とするループス抗凝血物質に感受性の免
疫発色試験法。 - 【請求項１４】 請求項１から４までのいずれか１項記
載の活性剤に対する基質としてプロトロンビンを使用す
る請求項９から１３までのいずれか１項記載の試験法。 - 【請求項１５】 リン脂質としてホスファチジル−エタ
ノールアミンおよび／またはホスファチジルセリンを使
用する請求項９から１４までのいずれか１項記載の試験
法。 - 【請求項１６】 請求項１から４までのいずれか１項記
載の活性剤およびリン脂質、および所望の場合に、水ま
たは緩衝液中のタンパク質安定化ポリマー、たとえばコ
ラーゲン誘導ポリペプチドおよび／またはウシ血清アル
ブミンおよび／またはデキストラン、および所望の場合
に、混合凍結乾燥した形のカルシウム塩を含有する請求
項９から１５までのいずれか１項記載の凝血試験のため
の試験キット。 - 【請求項１７】 混合凍結乾燥したカルシウム塩として
グルコン酸カルシウムまたはラクトビオン酸カルシウム
を含有する請求項１６記載の試験キット。 - 【請求項１８】 ｐＨを７〜８、有利に７．４に調節
し、および／または緩衝液、有利にトリス−（ヒドロキ
シメチル）−アミノメタン ヒドロクロリド、２−（Ｎ
−モルホリノ）エタン−スルホン酸および／またはＮ−
２−ヒドロキシ−エチルピペラジン−Ｎ′−エタン−ス
ルホン酸を用いてキットを安定化させる請求項９から１
７までのいずれか１項記載の試験キット。
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