NL8902406A - Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit. - Google Patents

Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit. Download PDF

Info

Publication number
NL8902406A
NL8902406A NL8902406A NL8902406A NL8902406A NL 8902406 A NL8902406 A NL 8902406A NL 8902406 A NL8902406 A NL 8902406A NL 8902406 A NL8902406 A NL 8902406A NL 8902406 A NL8902406 A NL 8902406A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
thrombin
substrate
plasma
process according
amount
Prior art date
Application number
NL8902406A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Hendrik Coenraad Hemker Prof D
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hendrik Coenraad Hemker Prof D filed Critical Hendrik Coenraad Hemker Prof D
Priority to NL8902406A priority Critical patent/NL8902406A/nl
Priority to EP90202509A priority patent/EP0420332B1/en
Priority to DK90202509.7T priority patent/DK0420332T3/da
Priority to ES90202509T priority patent/ES2072970T3/es
Priority to DE69018910T priority patent/DE69018910T2/de
Priority to AT90202509T priority patent/ATE121792T1/de
Priority to US07/588,924 priority patent/US5192689A/en
Priority to JP02260273A priority patent/JP3137261B2/ja
Publication of NL8902406A publication Critical patent/NL8902406A/nl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8121—Serpins
    • G01N2333/8128—Antithrombin III
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit.
Beschrijving
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid trombine, die in een monster van plasma, hetzij bloed aanwezig is geweest, alsmede op een bij deze werkwijze te gebruiken kit.
Afwijkingen in het stollingssysteem kunnen trombose en hemofilie tot gevolg hebben. Trombose leidt tot ziekten zoals hartinfarcten en attaques en is een veelvuldig voorkomende complicatie bij chirurgie en inwendige ziekten. De vorming van trombine neemt een centrale rol in bij hemostase en trombose. De meest efficiënte geneesmiddelen ter voorkoming van trombose en voor de behandeling ervan zijn die middelen die teweegbrengen dat minder trombine verschijnt in stollend bloed. Zonder in veel detail te treden is het nodig eerst de hoofdlijnen van vorming en inactivatie van trombine te vermelden. Wanneer stolling plaatsvindt in bloed, in plasma dat rijk is aan bloedplaatjes (PRP) of in plasma dat weinig bloedplaatjes bezit (ppp), ontstaat daarin het enzym protrombinase. Dit kan op verschillende manieren ontstaan, te weten volgens de intrinsieke reactieweg via activering van de contactfactoren en factor IX of volgens de extrinsieke reactieweg via de activering van factor VII door weefseltromboplastine. Factoren VIII en V, die geactiveerd worden door de eerste sporen van trombine die verschijnen, zijn noodzakelijke cofactoren. Factor IXa met factor Villa en prostollingsfosfolipiden vormen een complex dat factor X activeert. Deze factor Xa vormt met factor Va en fosfolipiden het protrombinase, het complex dat protrombine (factor II) omzet naar trombine (factor Ha).
Pathologie leert dat de inactivering van trombine uitermate belangrijk is bij het voorkomen van trombose. Er zijn geen levende individuen bekend met minder dan de helft van de normale hoeveelheid atiii waarschijnlijk omdat afwezigheid ervan letaal is. Mensen met een erfelijke toestand die tot gevolg heeft dat zij ongeveer de helft van de normale hoeveelheid ATIII bezitten, lijden aan ernstige trombotische ziekte. Men kan ter vermindering van de trombine zorgen dat deze in mindere mate of langzamer wordt aangemaakt door remming van de protrombinase of door vermindering van de protrombineconcentratie in het bloed of plasma. Deze methode past men toe bij orale antistolling, waarbij de synthese in de lever van plasmaproteïnen die vereist zijn voor het stollingsproces (de stollingsfactoren) geremd wordt door het geven van vitamine K-antagonisten. Zowel protrombine als protrombinase vormende factoren zijn gevoelig voor vitamine K. Enzym- en substraathoeveelheden worden verminderd en de vormingssnelheid van trombine verlaagd. Een tweede wijze ter vermindering van de hoeveelheid trombine in het bloed of plasma is de snellere inactivatie van trombine.
Zodra trombine in het plasma verschijnt treden een aantal processen op ter inactivering ervan, waarbij trombine met de natuurlijke inhibitoren ervan zoals antitrombine III (ATIII), heparine-cofactor II (HCII), a-2macroglobuline (a-2M) en andere, combineert tot inerte complexen. Diverse farmaca zoals o.a. de verschillende soorten heparine of dermatansulfaat, heparansulfaat, pentosanpolysulfaat, lactobionzuur of zure mucopolysacchariden uit bijvoorbeeld Stichopus Japonicus (SJAMP) en vergroten de invloed van ATIII en/of HCII waardoor sneller inactivering van trombine plaatsvindt. Ook kan men stoffen toedienen die direkt op trombine werken zonder dat er een remmend plasma-eiwit bij nodig is: zoals hirudine (Stone en Hofsteenge; Biochemistry, 25 4622 (1986) en synthetische direkte trombineremmers zoals MD850 (Kumada en Abiko, Throb.Res. 4 285 1981)).
De snelheid van inactivering is evenredig met de hoeveelheid van de aanwezige trombine. Zolang de snelheid van trombinevorming die van de inactivering overtreft, stijgt de concentratie van trombine in het plasma. Wanneer de protrombine uitgeput raakt neemt de snelheid van trombinevorming af, krijgt de inactivering weldra de overhand en blijft uiteindelijk geen actieve trombine over (fig. 1, curve A). Het oppervlak onder de curve geeft aan gedurende welke tijd en hoeveel trombine actief geweest is in het stollende bloed of plasma. Deze integraal van trombineconcentratie-tijd wordt trombinepotentiaal genoemd. Het potentiaal kan afnemen (fig. 1, curve B) wanneer minder trombine aanwezig is tijdens coagulatie en/of trombine gedurende een kortere tijd aanwezig is. Bij behandeling met de bovenbeschreven antitrombotica verandert de curve van trombinevorming in één of meer van de volgende aspecten (Fig. 1, curven A en B). Het begint later, d.w.z. de latentietijd voor explosieve vorming van trombine optreedt is langer, de piek is lager en de afname is sneller zodat de aanwezige trombine eerder geïnactiveerd wordt. Het is aangetoond dat zowel een verlaagde vorming (bij orale antistolling) als een snellere afname (bij behandeling met heparine) effektieve antitrombotische behandelingen zijn. Beide resulteren in een kleiner oppervlak onder de curve van trombinevorming. Dit oppervlak, de tijd-concentratie-integraal, de endogene trombinepotentiaal ETP kan derhalve een goede maat zijn bij de bepaling van de effektiviteit van behandeling met antitrombotica. De onderhavige werkwijze dient voor het bepalen van een getal (hierna te noemen de endogene trombinepotentiaal ETP) dat weergeeft hoeveel trombine er gedurende welke tijd in het stollende bloed(-plasma) aktief geweest is.
Voor zover bekend bestaat er geen werkwijze om de ETP of een variabele grootheid van vergelijkbaar belang te meten. Er bestaat een werkwijze om de ETP te berekenen uit een curve van trombinevorming, hetgeen ingewikkeld en tijdrovend is en er bestaan meer testen om het effekt van verschillende soorten behandeling met antitrombotica met meer of mindere specificiteit te volgen. Deze testen zijn duidelijk anders en/of omslachtiger dan de onderhavige werkwijze en worden hieronder in het kort beschreven.
a) Bepaling van de stollingstijd met behulp van weefseltrombo-plastine (protrombinetijd PT) Deze methode is gevoelig voor orale anti-stolling maar ongevoelig voor heparine.
b) Bepaling van de stollingstijd met behulp van contactactivatoren en fosfolipiden (geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT) Teien, Abilgaard, Hook en Lindahl, Thromb.Res. 11 107 (1977) Bain, Forster en Sleigh Am. Soc. Clin. Pathol. 35 668 (1980)). Deze methode is gevoelig voor heparine en orale antistolling maar niet of nauwelijks voor heparines met laag-moleculair gewicht of voor dermatansulfaat. De Hep-test is een aPTT-test die door toevoeging van geïsoleerde factor Xa wel gevoeliger wordt voor heparinen met een laag molecuulgewicht echter een lage gevoeligheid vertoont voor andere trombotica.
c) Meting van de verdwijningssnelheid van toegevoegd trombine (anti-IIa). (Handeland en Abilgaard Thromb. Res. 35 627 (1984), Bartl. Dorsch, Lill en Ziegenhorn, Thromb. Hemostas. 42 1446 (1980)). Deze methode meet een niet-fysiologische parameter en is ongevoelig voor heparines met laag moleculair gewicht. Het is bekend dat er fundamentele verschillen bestaan tussen het gedrag van trombine die toegevoegd wordt aan bloed (-plasma) en trombine die in bloed (-plasma) gevormd wordt. Endogene trombine is minder gevoelig voor ATIII (-heparine) werking. (Thrombosis and Hemostasis F.K. Schattauer Verlagsgesellschaft GmbH (Stuttgart) 56 9-17 1986 en 61, 30-34 (1989).
d) Meting van verdwijning van toegevoegde factor X (anti-Xa) (Teien, Lie en Abilgaard, Thromb. Res. 8 413 (1976)). Hierin wordt iets gemeten dat slecht korreleert met antitrombotische eigenschappen. Deze methode is alleen geschikt voor heparines en geeft essentieel verschillende uitslagen met in vivo gelijk werkzame doses van resp. ongefrac-tioneerde heparine, laagmoleculairgewicht heparine en ultralaagmole- culairgewicht (P-type) heparine. Daarnaast kunnen effekten van dermatansulfaat en andere trombotica enkel of in samenhang met heparine cofactor II niet bepaald worden met deze anti-Xa werkwijze.
e) Titratie van het heparine-effeet met polybreen (Hoffmann en Meulendijk, Clin. Chim. Acta 87 417 (1978)). Deze werkwijze is zeer arbeidsintensief en alleen geschikt voor heparines.
f) Een gemodificeerde verblijftijd van trombine die afhankelijk wordt van heparine door de toevoeging van factor Xa. (Denson en Bonnar, Thromb. Diathes. Haemorrh. 30 471 (1973), Yin, Wessler en Butler, J.
Lab. Clin. Ned. 81 298 (1973), Yin Thromb. Diathes. Haemorrh. 33 393 (1975)).Deze werkwijze is alleen geschikt voor heparines met een laag molecuulgewicht. Het belangrijkste is dat geen van de methoden de hoeveelheid trombine meet die in het plasma ontstaat en weer verdwijnt. Er worden secundaire effecten gemeten, voornamelijk het effect van de farmaca op activering van het stollingsmechanisme die veroorzaakt worden door kleine hoeveelheden trombine die tijdens de latentietijd van een stollingstijd bepaling ontstaan (a, b en f).
g) Hemker, Béguin et al. hebben twee werkwijzen bedacht om het effect van antitrombotica op protrombinase-vorming en inactivering in stollend plasma te onderzoeken. Een indirecte werkwijze waarbij de activiteit van protrombinase berekend werd uit de vorming van trombine-achtige amidolytische activiteit en een directe meting van overblijvende protrombineniveaus. De indirecte werkwijze is preciezer en sneller. (Hemker, H.C., Willems, G. en Béguin, S Thrombosis and Haemostatis 56 9-17 (1986)). Deze methode werd o.a. toegepast om het effect van het antitromboticum heparine in plasma te onderzoeken (Béguin, S. Lindhout, T. Hemker, H.C. Thrombosis and Haemostatis 56 9-17 (1989)). De afbraak van trombine in aanwezigheid van heparine kan bij goede benadering beschreven worden als de som van twee pseudo eerste ordereacties, één die trombine compleet inactiveert (complexvorming door ATIII en trom-bine-inhibitoren van minder belang) en de andere die een produkt levert met een amidolytische activiteit (a2-macroglobuline-trombinecomplex).
Het verloop van protrombinase-activiteit in de tijd kon berekend worden in aan- of afwezigheid van heparine. Deze resultaten werden vergeleken met snelheden van verbruik van protrombine zoals die direct gemeten werden met behulp van stafylocoagulase. Deze werkwijze omvat berekeningen van verschillen tussen grote waarden waarbij de standaarddeviatie van de resulterende snelheid waarmee protrombine verdwijnt, berekend werd tussen de 9 en 15%. De waarden berekend volgens de indirecte wijze komen goed overeen met die bepaald via de directe wijze zodat de mathe matische benadering een acceptabel beeld geeft van de snelheid waarmee protrombine geactiveerd wordt in aanwezigheid en afwezigheid van hepari-ne. Data-analyse leverde een eerste orde snelheidsconstante van inacti-vering van trombine door alpha 2-macroglobuline van 0,232 +/- 0,004 min-1 die onafhankelijk was van de heparineconcentraties. De antitrombine III afhankelijke snelheidsconstante van inhibitie van trombine gevormd in plasma kon eveneens als functie van de heparine-concentratie uitgezet worden.
De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze van het in de aanhef beschreven type. Deze werkwijze wordt gekenmerkt doordat men de potentiaal bepaalt van endogene trombine. Verder heeft de uitvinding betrekking op een kit ter uitvoering van de hiervoor genoemde bepaling. Toepassing van de onderhavige werkwijze vergemakkelijkt en versnelt de bepaling van de ETP zodat deze voor het bepalen van het effect van antitrombotische behandeling in de kliniek en bij proefdieren gebruikt kan worden. De onderhavige werkwijze is in niets te vergelijken met de bestaande werkwijzen. Er is tot dusver geen enkele methode bekend die universeel toepasbaar is voor alle antitrombotica en die een maat geeft van de hoeveelheid actieve trombine die er gedurende het stollingsproces in het plasma aanwezig is.
De uitvinding levert een zeer gevoelige, reproduceerbare en gemakkelijke test voor de bepaling van de tijdintegraal van de trombineconcentratie in stollend bloed, d.w.z. van het oppervlak onder de curve van trombinevorming, hier gedefinieerd als endogene trombinepotentiaal of ETP. De onderhavige werkwijze berust op toevoeging van het te testen reactiemengsel aan een oplossing omvattende een activator van het stollingsproces, een bron van Ca** ionen, een preparaat van een natuurlijk antitromboticum en een substraat van trombine. Het reactiemengsel is hetzij een monster bloed, plaatjesrijk plasma, plaatjesarm plasma of gedefibrineerd plasma van een patiënt (of proefdier) die (dat) antitrombotische behandeling ondergaat met een farmacon (eventueel meerdere farmaca) hetzij normaal bloed of plasma waaraan een bekende hoeveelheid van het betreffende farmacon toegevoegd is. Het preparaat van natuurlijk antitromboticum kan hetzij ATIII (antitrombine III), hetzij HCII (heparine cofactor II) hetzij beide omvatten. De aanwezigheid van additioneel ATIII en/of HCII dient meerdere doeleinden. Trombine heeft een voorkeur voor deze inhibitoren boven andere antitrombotica zoals bijvoorbeeld a-2-M(a-2-macroglobuline) (Thrombosis and Hasemostatis 1987, uitgegeven door M. Verstraten, J. Vermeylen, H.r. Lynen en J. Arnout, International Society on Thrombosis and Haemostasis, Leuven University Press, Leuven 1987, hoofdstuk 2 biz. 23), zodat de nevenreakties geminimaliseerd worden. Tevens wordt de werkwijze hierdoor vrijwel onafhankelijk van het gehalte aan ATIII en/of HCII van het monster. Hiernaast kan de test door de keuze van een van beide inhibitoren specifiek gevoelig gemaakt worden voor een bepaald type geneesmiddel. Heparine bijvoorbeeld katalyseert de reaktie van trombine met ATIII, dermatansulfaat die van trombine met HCII. Deze specificiteit kan nog verder toenemen door (immuno)vermindering van de andere inhibitor. Het mengsel met het te testen monster wordt gedurende een bepaalde tijd onder bepaalde omstandigheden geïncubeerd. Vervolgens wordt de hoeveelheid trombinesubstraat direkt gemeten of wordt in het geval van ondoorzichtige oplossingen de reaktie stopgezet door toevoeging van een trombineremmer en wordt het mengsel behandeld bijvoorbeeld gecentrifugeerd om hetzij bepaling van de heid van het gevormde produkt mogelijk te maken, hetzij bepaling van de hoeveelheid substraat die verdwenen is. Mogelijke trombineremmers omvatten benzamidine (deze stof wordt in het voorbeeld gebruikt), hirudine of N-(2-naftylsulfonylglycyl) D,L-amidinefenylalanine-piperidine HCl (a-NAPAP). In optisch heldere oplossingen is het eveneens mogelijk de hoeveelheid gevormd produkt spectrofotometrisch te volgen. Deze laatste mogelijkheid is van bijzonder belang omdat de eerste afgeleide van de verkregen curve het verloop van de trombinevorming in het monster voorstelt.
In het verderop beschreven voorbeeld, experiment 1 wordt het verloop van de amidolytische activiteit in plasma spectrofotometrisch gemeten bij 405 nm aan de hand van de ontwikkeling van paranitroaniline. In experiment 2 wordt gemeten nadat een bepaalde reactietijd verlopen is. In experiment 3 wordt de reactie na een bepaalde tijd stilgelegd door het toevoegen van een trombineremmer, waarna het reactiemengsel wordt behandeld(gecentrifugeerd) om het reactieprodukt te kunnen meten.
De onderstaande reacties illustreren de onderhavige werkwijze verder: 1) stollingsfactoren (V-XII) actiYater protrombinase 2) protrombine **«*««» trombine 3) trombine + antitrombotica - inactieve complexen 4) substraat ttombln‘ signaal molecuul
Reacties 2 en 3 zijn aflopend zodat trombine slechts tijdelijk aanwezig is in het reactiemengsel. Gedurende de aanwezigheid van trombine neemt het deel aan reactie 4, zodat de mate van omzetting van het substraat de tijd weergeeft gedurende welke en de hoeveelheid waarmee trombine deze reactie gekatalyseerd heeft. Het is essentieel dat de hoeveelheid substraat niet uitgeput raakt voordat de trombine verdwijnt. In het ideale geval dient de reactiesnelheid evenredig te zijn met de concentratie aan trombine op elk tijdstip. Dit kan voor alle praktische begrippen bereikt worden wanneer bij aanvang van de reactie de concentratie van substraat verscheidene malen groter is dan de Km van dat substraat voor trombine en wanneer een bescheiden deel van het substraat verbruikt wordt zodat de eindconcentratie aanzienlijk hoger blijft dan de Km. Het substraat moet door trombine worden omgezet, maar niet zo snel dat er onmogelijk hoge concentraties van het substraat aan de proef zouden moeten worden toegevoegd om te verhinderen dat het substraat opraakt. Om deze reden is het zeer specifieke substraat S2238 (HD-phe-pip-arg-pNa) veel minder geschikt dan de in de voorbeelden gebruikte substraten.
Een substraat bestaat in de regel uit een oligopeptide waaraan een "leaving-group" is gekoppeld. (De leaving group is de groep die afsplitst na reactie van het substraat met trombine). Het oligopeptide bepaalt meestal de specificiteit en de "leaving" groep krijgt bij afsplitsing meetbare eigenschappen. Een voorbeeld van een ander substraat is tosylargininemethylester. De arginine bepaalt dat trombine-affiniteit heeft voor dit substraat. Het vrijkomen van H--ionen bij de splitsing kan als signaal dienen. Ook bestaan er substraten die niet een chromofore groep zoals p-nitroaniline afscheiden maar een fluorescerende groep. Voor ieder substraat is dit een kwestie van behendig zoeken. Bij rechtlijnige evenredigheid tussen de omzettingssnelheid van het substraat en de hoeveelheid aanwezige trombine zal eveneens rechtlijnige evenredigheid heersen tussen de hoeveelheid gesplitst substraat en het oppervlak onder de curves in fig. 1, te weten de trombinepotentiaal. Indien geen rechtlijnige evenredigheid heerst tussen omzettingssnelheid van het substraat en de hoeveelheid aanwezige trombine, zal de evenredigheid tussen hoeveelheid gesplitst substraat en trombinepotentiaal ingewikkelder van aard zijn. De hoeveelheid trombine die gedurende de proef in het plasma aanwezig is geweest is onbekend maar is te berekenen uit de hoeveelheid gevormde produkt (p-nitroaniline in de voorbeelden) omdat de kinetische parameters kcat en Km van de werking van trombine op het substraat bekend zijn. De trombine-tijdcurve kan worden verkregen zoals beschreven in Hemker, Béguin, Willems (Thrombosis, Heamostasis 56 9 (1986)). Het wezen van de onderhavige methode is echter dat deze curve helemaal niet bepaald wordt. fig. 1 is alleen gegeven voor de theoretische onderbouwing. De onderhavige werk wijze gebruikt men ter bepaling van het oppervlak onder de trombine-tijdcurve, (waarvan overigens geen mathematisch analytische uitdrukking gegeven kan worden). De experimentele curven uit fig. 2 zijn de integraal van die in fig. 1, want de snelheid van produktvorming is evenredig met de hoeveelheid trombine. Daarom is het eindniveau van de experimentele curven gelijk aan het oppervlak onder de trombine-tijd-curve, dus aan de trombinepotentiaal. In de praktijk, voor gebruik bij patiënten en in farmacologisch onderzoek, zal dit eindniveau meestal het enige zijn dat bepaald wordt. Vanwege de persisterende, zij het geringe, activiteit van het complex van trombine met α-2-macroglobuline kan het noodzakelijk zijn het eindniveau na een vaste reactietijd te meten.
Bij de onderhavige methode wordt de trombinepotentiaal direkt bepaald.
In ieder geval zal er een verband bestaan tussen de hoeveelheid gesplitste substraat en de hoeveelheid aanwezige farmacon (bijv. heparine of een ander geneesmiddel). Dit is juist het verband dat experimenteel met deze werkwijze bepaald kan worden.
De keuze van activator bepaalt of het effect op het intrinsieke of extrinsieke stollingssysteem gemeten wordt, Bij gebruik van tromboplas-tine wordt het gecombineerde effect gemeten van de aanwezigheid van het geneesmiddel op het vormen van protrombinase (indien deze plaatsvindt) en het verdwijnen van trombine. Wanneer de intrinsieke route geactiveerd wordt door een contactactivator bijvoorbeeld kaoline, met of zonder fosfolipiden wordt nogmaals het gecombineerde effect gemeten, echter nu zal de protrombinase-vorming afhankelijk zijn van de terugkoppelingsactivering van trombine op bloedstollingsfactor VIII die alleen in de intrinsieke weg voorkomt. Door gerichte keuze van het activerende middel kan het effect van het geneesmiddel op verschillende delen van het stollingsmechanisme getest worden. Activering door kleine heden tromboplastine uit weefsel geniet bijzondere interesse omdat dit waarschijnlijk de beste benadering geeft van de physiologische situatie. Bij gebruik van een slangegif (b.v. Oxyuranus Scutellatusgif), een kunstmatige protrombineactivator die ongevoelig is voor de remmende werking van ATIII en HCII en andere giffen die ongevoelig zijn voor de werking van heparinen kan men onderzoeken of de vermindering van de trombinepotentiaal alleen veroorzaakt wordt door versnelde afbraak van trombine of ook door remming van het fysiologische protrombinase. Fysiologische protrombine-activator is soms wel en soms niet gevoelig. Indien remming van het fysiologische protrombinase optreedt zal met slangegif een grotere trombinepotentiaal worden gemeten dan onder fysiologische omstandigheden.
De onderhavige uitvinding heeft eveneens betrekking op zowel een uitrusting voor de routinematige uitvoer van de bepaling van de trombinepotentiaal volgens de hieraan voorafgaande werkwijze als het leveren van een bron van testbestanddelen in bulkheid ter vergemakkelijking van de werking van geautomatiseerde inrichtingen die grote heden testmonsters kunnen verwerken. De testuitrusting omvat een houder omvattende de volgende reactanten (en desgewenst een voorschrift):
een of meerdere stoffen die de trombinevorming op gang brengen, waaronder ten minste Ca++ionen (met daarnaast b.v. een tromboplastine, een contactactivator of een slangegif) een preparaat van een trombineremmeer, die gevoelig is voor het te testen farmacon. (antitrombine III en/of Heparine Co factor II
een geschikt substraat van trombine (b.v. S2222 of CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA.AcOH eventuele conserveringsmiddelen.
Ter verhoging van de houdbaarheid kan de oplossing eventueel worden gevriesdroogd en kort voor gebruik in een aangegeven hoeveelheid water worden opgelost. Men kan houders maken die geschikt zijn voor een bepaald aantal bepalingen maar men kan ook de gewenste hoeveelheid oplossing vriesdrogen in individuele buisjes of cuvetten waaraan alleen water en/of een monster hoeft worden toegevoegd.
Na een voorgeschreven incubatietijd bij een voorgeschreven temperatuur wordt de meting verricht of wordt een remmer van trombine (b.v. benzamidine, hirudine of alfa NAPAP) toegevoegd om de reactie te stoppen. Eventueel moet het reactiemengsel dan een behandeling ondergaan (centrifugatie, precipitatie of iets dergelijks) die het meten van de hoeveelheid gevormd produkt mogelijk maakt. De remmende vloeistof wordt in een aparte houder aan de kit toegevoegd en wordt gebruikt. Wanneer het te testen monster ondoorschijnend is en de hoeveelheid trombinesubstraat daardoor niet direkt afleesbaar is.
Voorbeelden
Reactiemiddelen:
Buffer: 0,05 M Tris-HCl, pH 7,35 0,1 M NaCl, 0,5% ei-albumine Bloed:
Bloed verkregen door venapunctie van normale of antigecoaguleerde proefpersonen/dieren. 9 delen bloed werden verzameld op 1 deel trinatriumcitraat van 0,13 M Plaatjesrijk plasma:
Kleurloze supernatans van bloed na centrifugatie bij kamertemperatuur en 3000 g.
Plaatjesarm plasma:
Het bloed werd tweemaal gecentrifugeerd gedurende 15 min., bij 3000 g en 15°C. Een derde centrifugering werd gedurende 60 min., bij 4°C, bij 2300 g uitgevoerd.
Gedefibrineerd plasma:
Plaatjesarm plasma werd met 0,1 deel reptilase oplossing geïncubeerd gedurende 10 min. bij 37°C en werd vervolgens 10 minuten op ijs gezet.
De gevormde fibrine werd door middel van centrifugering gedurende 10 min. bij 5000 g en 0°C verwijderd of door het om een spatel te winden.
Tromboplastine:
Dit werd bereid volgens Owren en Aas; Scand. J. Clin. Lab. Invest. 3, 201, 1951. Het werd voor gebruik 40x verdund.
Antitrombine III:
Dit werd geïsoleerd volgens Thaler en Schmer; Br. J. Haemat, 31, 233, 1975.
Andere reactiemiddelen:
Deze werden in de handel verkregen.
Uitrusting:
Pipetten, buizen etc. Een waterbad bij 37°C. Een spectrometer, die de optische dichtheid bij 405 nM kan opnemen en die een cuvettehouder bezit waarvan de temperatuur geregeld kan worden.
Voorbeeld 1:
Alle reactiemiddelen worden voorzover nodig opgelost in de reeds beschreven buffer.
Er wordt 400 microliter oplossing gemaakt omvattende:
- 40 μΐ S2222 (N-benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamylglycyl-L-arginine-p-nitroanilide HCL) conc: 0,4mM
- tromboplastine: 1,25 %
- CaCl2 : 7,5 mM
- ATIII: 2,5 micromol/liter
De oplossing wordt gedurende ten minste 2 minuten voorverwarmd in het waterbad. De reactie wordt aangevangen met 200 μΐ gedefibrineerd plasma met verschillende heden heparine. Het verloop van de toename in optische dichtheid bij 405 nm wordt gevolgd. De spectrofotometrische resultaten worden gegeven in fig. 2. Men kan zien dat het eindniveau van de hoeveelheid geproduceerde p-nitroaniline evenredig afneemt met de hoeveelheid heparine die in het plasma aanwezig was.
De curves van Fig. 2 zijn van bijzonder belang omdat de eerste afgeleiden ervan het analoog voorstellen van de klassieke trombinevormingstest. Dit impliceert dat zij gebruikt kunnen worden ter bepaling van de curve van trombinevorming en ter meting van zowel de ETP als het tijdstip waarop een bepaald laag niveau (bijvoorbeeld 10 mM) trombine gevormd is. Op deze wijze kan de latentietijd van het systeem, overeenkomstig met de klassieke stollingstijd bepaald worden. In Fig. 3 wordt getoond dat er een lineair verband bestaat tussen de procentuele remming van het eindniveau van paranitroaniline en de hoeveelheid heparine die aanwezig was in het monster.
In het onderhavige voorbeeld was het plasma gedefibrineerd door toevoeging van reptilase ter verkrijging van onverstoorde spectrofotometrische gegevens. In de praktijk is dit niet noodzakelijk. Plasma arm aan plaatjes (PPP), plasma rijk aan plaatjes (PRP) of volbloed kunnen gebruikt worden, maar het mengsel dient dan voor het meten gecentrifugeerd te worden.
In het onderhavige experiment werd normaal plasma gebruikt waaraan heparine toegevoegd was. In de praktijk kunnen zulke concentratie reeksen van heparine gebruikt worden ter verkrijging van standaardcurves. Wanneer bloed of plasma getest wordt van patiënten, die behandeld zijn met heparine, kan de figuur verkregen uit het monster van de patiënt, vergeleken worden met de standaardcurve. Op deze wijze kan de hoeveelheid heparine gevonden worden die equivalent is met die aanwezig in het monster van de patiënt. Een vergelijkbare werkwijze kan gevolgd worden onder toepassing van andere farmaca.
Het dient opgemerkt te worden dat S2222, hoewel het bekend staat als zijnde een specifiek substraat voor factor Xa, gebruikt wordt als trombinesubstraat in dit experiment. Dit kan omdat de concentratie van trombine zoveel hoger is dan die van factor Xa zodat de activiteit van laatstgenoemde nauwelijks bijdraagt aan de gemeten totale omzetting van substraat.
Voorbeeld 2:
Aan de bovenbeschreven buffer worden toegevoegd: - 0,75 mM AcGPRpNA (CH3OCO-Gly-Pro-Arg-paranitroanilide.HCl) - 2% tromboplastine - 7,5 mM CaCl2
- 3 micromolair antitrombine III
Op tijdstip o wordt aan 400 microliter van dit mengsel 400 microliter gedefibrineerd plasma toegevoegd. Het toegevoegde plasma omvat verschillende concentraties van een heparine met een laag molecuulgewicht (Fraxiparine). Na 6 minuten wordt de optische dichtheid gemeten bij 405 nm.
De 60D per minuut op dit tijdstip wordt eveneens bepaald en de 6-voudige waarde ervan wordt afgetrokken van de OD op t=6 min. Op deze wijze wordt de sprong in OD gemeten, onafhankelijk van de persisterende amidolytische activiteit nadat het proces van trombinevorming afgelopen is. De procentuele remming van de aldus verkregen waarde en de hoeveelheid toegevoegde Fraxiparine wordt in Fig. 4 gegeven. In dezelfde figuur wordt de remming door dezelfde concentraties van Fraxiparine geleverd van het oppervlak onder de trombine-tijdcurve, aantonend dat de figuur verkregen volgens de uitvinding inderdaad direkt evenredig is met de trombinepotentiaal. In Fig. 5 worden de waarden verkregen volgens de oude en de onderhavige werkwijze direkt vergeleken.
Voorbeeld 3:
Dezelfde oplossing wordt gebruikt als in experiment 2. Aan 400 microliter van deze oplossing wordt 400 microliter bloed toegevoegd, dat verkregen is door venapunctie van vier gezonde vrijwilligers en 24 patiënten, die onder langdurige antistollingsbehandeling staan. Na 6 minuten wordt de reactie stopgezet door toevoeging van 400 microliter van een oplossing van benzamidine (10 mM) in 0,15 M NaCl. De monsters worden gecentrifugeerd en de toename van de optische dichtheid (OD) bij 405 nm wordt bepaald. Deze toename wordt bepaald door vergelijking van de waarde verkregen met een controleproef uitgevoerd met hetzelfde plasma dat een identieke behandeling heeft ondergaan met als uitzondering toevoeging op tijdstip t=o van een oplossing zonder chromogeen substraat. Het aldus afgelezen getal wordt gebruikt als een direkte maat voor de trombinepotentiaal. In figuur 6 worden de verkregen resultaten vergeleken met het protrombine-gehalte van dezelfde monsters. Daar het protrombine-gehalte van deze patiënten beschouwd kan worden als een maat voor het effect van de antistollingsbehandeling toont deze proef aan dat de trombinepotentiaal, gemeten volgens de onderhavige werkwijze, een maat is voor de diepte van de antistollingsbehandeling.

Claims (44)

1. Werkwijze voor het bepalen van de hoeveelheid trombine die in een monster van hetzij stollend bloed hetzij plasma aanwezig is geweest, ook trombine-tijd integraal of trombinepotentiaal genoemd, met het kenmerk, dat men de potentiaal bepaalt van endogene trombine.
2. Werkwijze voor het bepalen van de remming van trombinevorming van hetzij bloed, hetzij plasma met behulp van farmacologische middelen, met het kenmerk, dat men de remming bepaalt voor endogene trombine.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men aan het reactiemengsel een substraat van trombine toevoegt samen met - een activator van trombinevorming - een preparaat van een protease-inhibitor, en desgewenst een te testen farmacon.
4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat men de bepaling uitvoert in hetzij bloed, hetzij plaatjesrijk plasma, hetzij in plaatjesarm plasma.
5. Werkwijze volgens conclusie 1, 2, 3, of 4 met het kenmerk, dat het plasma gedefibrineerd is.
6. Werkwijze volgens conclusie 1, 2, 3 of 4 met het kenmerk, dat de fibrinepolymerisatie geremd is.
7. Werkwijze volgens conclusies 1 - 6, met het kenmerk, dat men de hoeveelheid, alsmede de kinetische eigenschappen van substraat van trombine zodanig kiest dat de hoeveelheid trombine, opgewekt in het plasma, het substraat niet volledig kan verbruiken.
8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat men het substraat zodanig kiest dat de snelheid van omzetting ervan evenredig is met de hoeveelheid aanwezige trombine.
9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat men een zodanige keuze maakt dat de hoeveelheid gesplitst substraat recht evenredig is met het trombinepotentiaal.
10. Werkwijze volgens conclusies 8, met het kenmerk, dat men het substraat zodanig kiest dat de snelheid van omzetting ervan niet recht evenredig is met de hoeveelheid aanwezige trombine.
11. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 9, met het kenmerk, dat men als substraat S2222 (N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamylglycyl-L-arginine-p-nitroanilide HCL) toepast.
12. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 9, met het kenmerk, dat men als substraat AcGPRpNA (CH3OCO-Gly-Pro-Arg-paranitroanilide.HCl) toepast.
13. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 12, met het kenmerk, dat men een een substraat toepast, dat bestaat uit een deel met specificiteit voor trombine en een "leaving groep" die vrijkomt na reactie van substraat met trombine.
14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat men een leaving groep met meetbare eigenschappen toepast.
15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men een substraat toepast waarvan de "leaving-groep" amidolytische activiteit vertoont.
16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat men de amidolytische activiteit spectrofotometrisch bepaalt.
17. Werkwijze volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat men dat men aan een ondoorzichtige oplossing een trombineremmer toevoegt.
18. Werkwijze volgens conclusies 17, met het kenmerk, dat als trombineremmers benzamide, hirudine en/of N-(2-naftylsulfonylglycyl) D,L-amidinifenylalanine-piperidine HC1 (alfa NAPAP) toepast.
19. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men als leaving groep een chromofore groep toepast.
20. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men als leaving groep een fluorescerende groep toepast.
21. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men een substraat toepast waarbij H~-ionen vrijkomen als "leaving group".
22. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat men als deel van het substraat met specificiteit voor trombine een oligopeptide gebruikt.
23. Werkwijze volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat men een arginine houdende oligopeptide gebruikt.
24. Werkwijze volgens conclusies 21 en 23, met het kenmerk, dat men tosylarginine methylester gebruikt als substraat.
25. Werkwijze volgens conclusies 3-24, met het kenmerk, dat men ATIII en/of HCII samen als protease-inhibitoren gebruikt.
26. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat men ATIII en/of HCII toepast afkomstig uit dieren.
27. Werkwijze volgens conclusie 25, met het kenmerk, dat men ATIII en/of HCII toepast, verkregen door expressie van recombinant DNA in een gastheercel.
28. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 27, met het kenmerk, dat men door de keuze van het activerende middel bepaalt op welk onderdeel van het stollingsproces het effect van het farmacon wordt bepaald.
29. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat men Ca**ionen toepast als activator van trombinevorming al dan niet in combinatie met een ander activerend middel.
30. Werkwijze volgens conclusie 28 en/of 29, met het kenmerk, dat men een activerend middel kiest dat ongevoelig is voor ATIII.
31. Werkwijze volgens conclusie 28 en/of 29, met het kenmerk, dat men een activerend middel toepast dat ongevoelig is voor HCII.
32. Werkwijze volgens conclusies 30 of 31, met het kenmerk, dat men Oxyuranus-Scutellatisgif gebruikt.
33. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat men als activerend middel een contactactivator toepast.
34. Werkwijze volgens conclusie 28, met het kenmerk, dat men als activerend middel tromboplastine toepast.
35. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 34, met het kenmerk, dat men een antitromboticum als farmacon toepast.
36. Werkwijze volgens conclusie 35, met het kenmerk, dat men als antitromboticum heparine toepast.
37. Werkwijze volgens conclusie 35, met het kenmerk, dat men dermatansulfaat als antitromboticum toepast.
38. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 37, met het kenmerk, dat men als reactiemengsel hetzij plasma, hetzij bloed van een patiënt (of proefdier) die (of dat) een antitrombotische behandeling ondergaat met een bepaald farmacon, toepast.
39. Werkwijze volgens conclusies 1 t/m 29, met het kenmerk, dat men als reactiemengsel hetzij normaal bloed, hetzij normaal plasma toepast waaraan een bekende hoeveelheid van het betreffende farmacon toegevoegd is.
40. Een kit ter uitvoering van de bepaling volgens conclusie 1 t/m 39, gekenmerkt door, een houder met een oplossing omvattende de volgende reactanten: 1. een of meer stoffen die de trombinevorming op gang brengen 2. een preparaat van een trombineremmer 3. een geschikt substraat van trombine. 4. eventuele conserveringsmiddelen.
41. Een kit volgens conclusie 40, gekenmerkt doordat deze een daarbij behorend voorschrift bevat.
42. Uitrusting volgens conclusie 40 of 41, gekenmerkt doordat de heden van de reactanten zodanig zijn dat de kit voor een aantal bepalingen kan worden gebruikt.
43. Uitrusting volgens conclusie 40 of 41, gekenmerkt doordat de hoeveelheden van de reactanten zodanig zijn dat de kit voor een bepaling kan worden gebruikt.
44. Uitrusting volgens conclusies 40-43, met het kenmerk, dat deze gevriesdroogde reagentia bevat.
NL8902406A 1989-09-27 1989-09-27 Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit. NL8902406A (nl)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8902406A NL8902406A (nl) 1989-09-27 1989-09-27 Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit.
EP90202509A EP0420332B1 (en) 1989-09-27 1990-09-21 Method for determining the endogenous thrombin potential of plasma and blood, and also a kit for use in said method
DK90202509.7T DK0420332T3 (da) 1989-09-27 1990-09-21 Fremgangsmåde til bestemmelse af det endogene trombinpotentiale af plasma og blod, samt et kit til anvendelse ved fremgangsmåden
ES90202509T ES2072970T3 (es) 1989-09-27 1990-09-21 Metodo para determinar el potencial de trombina endogeno del plasma y de la sangre, y tambien un equipo para su uso en dicho metodo.
DE69018910T DE69018910T2 (de) 1989-09-27 1990-09-21 Verfahren zur Bestimmung des endogenen Thrombinpotentials von Plasma und Blut und Reagenziensatz zur Verwendung in besagtem Verfahren.
AT90202509T ATE121792T1 (de) 1989-09-27 1990-09-21 Verfahren zur bestimmung des endogenen thrombinpotentials von plasma und blut und reagenziensatz zur verwendung in besagtem verfahren.
US07/588,924 US5192689A (en) 1989-09-27 1990-09-27 Method for determining the endogenous thrombin potential of plasma and blood
JP02260273A JP3137261B2 (ja) 1989-09-27 1990-09-27 血しょうおよび血液の内因性トロンビンポテンシャルの測定方法と同方法に使用するキット

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8902406 1989-09-27
NL8902406A NL8902406A (nl) 1989-09-27 1989-09-27 Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8902406A true NL8902406A (nl) 1991-04-16

Family

ID=19855364

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8902406A NL8902406A (nl) 1989-09-27 1989-09-27 Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5192689A (nl)
EP (1) EP0420332B1 (nl)
JP (1) JP3137261B2 (nl)
AT (1) ATE121792T1 (nl)
DE (1) DE69018910T2 (nl)
DK (1) DK0420332T3 (nl)
ES (1) ES2072970T3 (nl)
NL (1) NL8902406A (nl)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE121139T1 (de) * 1990-11-05 1995-04-15 Baxter Diagnostics Inc Verfahren zur bestimmung der konzentration von antikoagulantien.
DE4203980A1 (de) * 1992-02-11 1993-08-12 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur bestimmung von hirudin und synthetischen thrombininhibitoren
AT397391B (de) * 1992-05-15 1994-03-25 Immuno Ag Verwendung von prothrombinfragmenten
EP0585504A1 (en) * 1992-09-04 1994-03-09 Pentapharm A.G. Phospholipid dependant prothrombin activator and its use in lupus anticoagulant testing
AU4634896A (en) * 1995-01-10 1996-07-31 Hendrik Coenraad Hemker Methods of determining endogenous thrombin potential (etp) and thrombin substrates for use in said methods
DE19533817C2 (de) * 1995-09-13 1999-12-09 Max Planck Gesellschaft Komplex-gebundene Hemmstoffe aktivierbarer Stoffwechselenzyme als molekulare Marker zur Diagnostik und Therapieüberwachung
SE9600216D0 (sv) * 1996-01-18 1996-01-18 Hans Arne Hansson Styrning av läkningsprocesser
US6740496B1 (en) 1999-03-04 2004-05-25 Synapse B.V. Determination of biologically active forms of proteolytic enzymes
AUPP971299A0 (en) * 1999-04-12 1999-05-06 South Eastern Sydney Area Health Service Procoagulant assay
US6743596B1 (en) 2000-10-27 2004-06-01 Biomerieux, Inc. Method of determining global coagulability hemostatic potential
US6645768B1 (en) 2000-10-27 2003-11-11 Biomerieux, Inc. Reagent and kit for determining global coagulability and hemostatic potential
EP1367135A1 (en) * 2002-05-29 2003-12-03 Pentapharm AG Improved method for the assessment of thrombin formation in blood or plasma
DE10360628A1 (de) * 2003-12-19 2005-07-21 Dade Behring Marburg Gmbh Kontrollplasma für Thrombinaktivitätstests
GB0402719D0 (en) * 2004-02-07 2004-03-10 Royal College Of Surgeons Ie A method of detecting incomplete inhibition of enzymes in individuals undergoing enzyme inhibitor therapy
CA2566411A1 (en) * 2004-05-11 2005-11-24 Heptest Laboratories, Inc. Compositions, kit and one-step method for monitoring compounds having anti-factor xa and/or anti factor iia activities
US7148067B2 (en) * 2004-08-31 2006-12-12 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Thromboplastin reagents
DE102004059055A1 (de) 2004-12-07 2006-06-08 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren zur automatischen Bestimmung des endogenen Thrombinpotenzials
DE602006018577D1 (de) 2005-01-07 2011-01-13 Stichting Katholieke Univ Blutstillungstest
DE102005003145B4 (de) 2005-01-21 2006-10-19 Dade Behring Marburg Gmbh Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests
WO2006088741A2 (en) * 2005-02-16 2006-08-24 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Procoagulants based on metal-chelating lipids
DE102005008066A1 (de) 2005-02-22 2006-08-24 Haemosys Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Gesamtgerinnungsaktivität einer Blut- oder Plasmaprobe
EP1869082B1 (en) * 2005-03-04 2011-04-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Coagulation and fibrinolytic cascades modulator
JP5212821B2 (ja) 2005-12-27 2013-06-19 マクマスター ユニバーシティー スペーサーを介して高分子へ結合する基質を含む修飾基質を用いた酵素測定アッセイ
US9091700B2 (en) 2005-12-27 2015-07-28 Mcmaster University Modified peptide substrate
DE102006035899A1 (de) 2006-07-31 2008-02-07 Dade Behring Marburg Gmbh Polysacharid-Peptid-Konjugate zur Verwendung als Thrombinsubstrate
CN101221188B (zh) * 2007-01-12 2012-04-18 上海太阳生物技术有限公司 临床检验凝血酶时间(tt)测定体外诊断试剂盒
DE102007017906A1 (de) 2007-04-17 2008-10-23 Dade Behring Marburg Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Reaktions-Lag-Phase in einer analytabhängigen Reaktion
WO2009046194A2 (en) * 2007-10-05 2009-04-09 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Fibrin sealant
WO2009061697A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Anticoagulant antagonist and hemophilia procoagulant
DE102007062323A1 (de) 2007-12-21 2009-06-25 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Langzeitstabiles Thromboplastin-Reagenz
WO2009142744A2 (en) * 2008-05-20 2009-11-26 The University Of Vermont And State Agriculture College Predicting hemostatic risk; dependence on plasma composition
US8293493B2 (en) * 2010-01-27 2012-10-23 Adventist Health System/Sunbelt, Inc. Thrombin generation determination method
EP2395354A1 (de) 2010-06-10 2011-12-14 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Homogener Aktivitätstest zur Bestimmung von enzymatischen Reaktionen
JP6133777B2 (ja) * 2010-09-20 2017-05-24 キュー−セラ プロプライエタリー リミテッド 血清の調製
WO2012096566A1 (en) 2010-12-14 2012-07-19 Stichting Katholieke Universiteit Chemiluminescence-based haemostasis assay
US9561300B2 (en) 2011-09-26 2017-02-07 Yes, Inc. Hemostatic compositions and dressings for bleeding
WO2013056116A1 (en) * 2011-10-12 2013-04-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Hemostatic dressing for arterial bleeding
EP2677037B1 (en) 2012-06-21 2016-04-13 Synapse B.V. Simultaneous measurement of thrombin generation and clot strength in plasma and whole blood
ES2706995T3 (es) 2012-12-18 2019-04-02 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento para medir la generación de trombina
US9989532B2 (en) * 2013-07-26 2018-06-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for detecting coagulation inhibitors
US10794896B2 (en) 2016-01-29 2020-10-06 Sony Corporation Blood coagulation system examination module, blood coagulation system examination system, blood coagulation system examination method, and determination method of parameter for blood coagulation system examination module
JP2020524283A (ja) 2017-06-20 2020-08-13 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 急性非代償性心不全（ａｄｈｆ）患者が凝固亢進状態を示すかどうかを同定するための方法
EP3489692A1 (de) 2017-11-28 2019-05-29 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Prothrombinzeit-reagenz enthaltend einen eisenchelator
WO2021019529A1 (en) * 2019-07-31 2021-02-04 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Methods and kits for identifying thrombus origin and optimizing post-ischemic event treatment
WO2022133109A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Compositions and methods for treating and preventing venom related poisoning
EP4239338A1 (de) 2022-03-03 2023-09-06 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Globaltest zur feststellung des status des blutgerinnungssystems

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4169015A (en) * 1975-07-11 1979-09-25 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
US4061625A (en) * 1975-07-11 1977-12-06 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
US4247454A (en) * 1975-07-11 1981-01-27 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
US4289498A (en) * 1979-01-08 1981-09-15 Ortho Diagnostics, Inc. One-stage prothrombin assay and compositions useful therein
US4496653A (en) * 1980-10-09 1985-01-29 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the determination of antithrombin-BM
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4594326A (en) * 1983-05-09 1986-06-10 Wade Stephen E Time-integrated measurement for determining substances in biological fluids
DE3407280A1 (de) * 1984-02-28 1985-09-19 Gödecke AG, 1000 Berlin Testsatz zur bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit (ptt) mit erhoehter heparinempfindlichkeit
US4851336A (en) * 1985-09-05 1989-07-25 Yin E Thye Composition, kit, and method for assaying heparinano a method for making the composition

Also Published As

Publication number Publication date
JP3137261B2 (ja) 2001-02-19
ATE121792T1 (de) 1995-05-15
EP0420332A2 (en) 1991-04-03
US5192689A (en) 1993-03-09
EP0420332B1 (en) 1995-04-26
DE69018910T2 (de) 1995-08-24
EP0420332A3 (en) 1991-05-08
ES2072970T3 (es) 1995-08-01
DK0420332T3 (da) 1995-07-03
JPH03236798A (ja) 1991-10-22
DE69018910D1 (de) 1995-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL8902406A (nl) Werkwijze voor het bepalen van de endogene trombinepotentiaal van plasma, en bloed alsmede een bij deze werkwijze te gebruiken kit.
Bauer et al. The pathophysiology of the prethrombotic state in humans: insights gained from studies using markers of hemostatic system activation
Hemker et al. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential
Pötzsch et al. Monitoring of recombinant hirudin: assessment of a plasma-based ecarin clotting time assay
Kitchen Problems in laboratory monitoring of heparin dosage.
US5051357A (en) Method and assay using inactivation of factors Va and VIIIa by activated Protein C to diagnose thrombic disease or assay for Protein C and kit therefor
AU776845B2 (en) Hematological assay and reagent
EP0509086B1 (en) A method to determine the concentration of anticoagulants
EP2529221B1 (en) Thrombin generation determination method
Colucci et al. Mild hyperhomocysteinemia is associated with increased TAFI levels and reduced plasma fibrinolytic potential
Wessler et al. On the antithrombotic action of heparin
CA1060324A (en) Method for determination of factor xal in blood
Parsi et al. In vitro effects of detergent sclerosants on antithrombotic mechanisms
Scott et al. Factors influencing the acceleration of human factor XIa inactivation by antithrombin III
Kher et al. Laboratory assessment of antithrombotic therapy: what tests and if so why?
MXPA04005518A (es) Prueba de heparina de bajo peso molecular, sistema y reactivo para el mismo.
Pieters et al. Heparin-stimulated inhibition of factor IXa generation and factor IXa neutralization in plasma
CA2039173C (en) Factor ix chromogenic assay
Triplett Heparin: biochemistry, therapy, and laboratory monitoring
Nieuwenhuys et al. Monitoring hypocoagulant conditions in rat plasma: factors determining the endogenous thrombin potential of tissue factor-activated plasma
Fernández et al. Activated protein C correlates inversely with thrombin levels in resting healthy individuals
Vinazzer Photometric assay of platelet factor 4 with a chromogenic substrate
Kaiser et al. In vitro studies on the effect of activated protein C on platelet activation and thrombin generation
Brack et al. Prothrombin fragment F1+ 2 concentrations for monitoring anticoagulation therapy with heparin
Scully The use of an automated analyzer in the evaluation of antithrombin III and heparin

Legal Events

Date Code Title Description
BV The patent application has lapsed