JPH06165670A - 線虫の天敵微生物の増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】線虫の抽出物を添加し，微生物増殖用の培地を
改良することによって、線虫の天敵微生物を人工培養す
るために好適な増殖用の培地を提供する。 【構成】線虫の抽出物および／または線虫の抽出物中に
含まれる栄養分または化学成分を微生物増殖用の培地に
加えて、線虫の天敵微生物の増殖に好適な培地を作成し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は作物に被害をもたらす植
物寄生性線虫の防除手段として有用な、線虫の天敵微生
物の生産に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】土壌中に棲息する線虫を防除するため
に、従来は薫蒸剤などの化学的防除剤が使用されてき
た。しかし環境汚染への懸念から、化学薬剤を用いず線
虫の天敵微生物を用いて線虫害を防除する方法が求めら
れている。

【０００３】線虫の天敵微生物の中で絶対寄生菌に分類
されているパストリア属細菌は、寄主線虫のみを宿主と
して増殖するために、土壌の生物環境を攪乱しない好適
な微生物として実用化が望まれている。

【０００４】本微生物の増殖方法としては、植物の土壌
に微生物を寄生させた線虫を接種して、植物の根で増殖
した微生物を回収する方法がおこなわれている。しかし
この方法による微生物の増殖効率は、農業への適用には
不十分な水準である。

【０００５】このため微生物培養の手段によってこの微
生物を直接的に培養しようとする試みが過去におこなわ
れたが、現在まで成功に至っていない。

【０００６】ウィリアムズらは、人工培地を用いた本微
生物の培養について検討し、人工培養に成功しなかった
と報告している(Journal of Applied Bacteriology (19
89) 67,145-156)。

【０００７】ビショップらは、特定の微生物（サ−モア
クチノマイセス・バルガリス）の破砕液を添加した培地
で本微生物の増殖が認められたと報告しているが（Bioc
ontrol Science & Technology (1991) 1.101-104) 、増
殖後に本微生物の溶菌が起こり胞子は得られなかったと
報告している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、難培養性で
あるために絶対寄生菌とみなされているパストリア属細
菌を人工培養するために、好適な培地を提供することに
ある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者はパストリア属
細菌の人工培養に使用する培地の組成について鋭意検討
した結果線虫の抽出物を微生物の培養培地に添加するこ
とにより、パストリア属細菌が良好に増殖して多数の胞
子を形成することを発見し、本発明を完成した。

【００１０】本発明は（Ａ）線虫の抽出物を（Ｂ）微生
物の培養培地に添加することにより得られる、パストリ
ア属細菌の人工培養用の培地を用いた線虫の天敵微生物
の増殖方法である。

【００１１】本発明で使用される線虫の抽出物は自活性
線虫、食菌性線虫、植物寄生性線虫より調整できる。例
えば、メロイドギネ、ヘテロデラ、プラチレンカス等の
天然の寄主、ターバトリックス、セノラデティス等の人
工培養が容易な線虫類の抽出物が用いられる。

【００１２】本発明では、一般の培地に不足している栄
養素の供給のための実際的な方法として線虫の抽出物を
添加している。従って、線虫の抽出物中に含まれる糖
質、蛋白質、糖蛋白、アミノ酸や脂肪酸、グリセリド、
糖脂質、ステロイド等の化学成分の添加によって同様の
効果を得ることができる。

【００１３】本発明で使用される微生物の培養培地は、
既知の培地組成を参考にして調整できる。例えば、マイ
コプラズマ、スピロプラズマ等の培養に適した人工培養
培地が用いられる。

【００１４】これらの培地成分を混合し、糖などの栄養
素量や培地の浸透圧を調整して人工培養培地を調整す
る。好適な浸透圧とは天然の寄生環境と同一な条件であ
る。

【００１５】このようにして得られる本発明の培地は、
線虫の体内に存在する天敵微生物の発育に必要な栄養素
を含有し、天敵微生物の人工培養用培地として好適であ
る。

【００１６】

【実施例】以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。

【００１７】線虫の破砕液の調製 線虫の破砕液として、セノラデティス・エレガンスの破
砕液を以下のような方法により作製した。

【００１８】大豆ペプトン（ディフコ社）３０ｇ、酵母
抽出液（ディフコ社）３０ｇ、ブドウ糖（和光純薬社）
１０ｇ、ＭＥＳ（和光純薬社）４．３ｇを蒸留水９５０
ｍｌに溶解し、酢酸でｐＨ５．２に調製した後オ−トク
レ−ブ滅菌をおこなった。豚由来ヘモグロビン（東京化
成社）１．０ｇを２０ｍｌの蒸留水に溶解し、滅菌濾過
をおこなってオ−トクレ−ブ後の培地に添加して線虫培
養用の培地を調製した。

【００１９】この培地に８万匹の線虫を添加して２０℃
で１６日間エアレ−ションした。２千万匹に増殖した線
虫を３５００回転の遠心分離で沈下させて集め、蒸留水
に懸濁して線虫を洗った。再度遠心して１３ｇの新鮮な
線虫を得た。

【００２０】この線虫を凍結融解し、蒸留水１０ｍｌを
加えて１分間細胞破砕機（ブランソン社、ソニファイア
−）にかけた。破砕液をさらにホモジナイザ−（井内盛
栄堂社）で１５００回転で５分間ホモジナイズした。ホ
モジナイズ液を１６０００回転で２０分間遠心して沈下
物を除き、滅菌濾過をおこなって１６．８ｍｌの線虫破
砕液を調製した。

【００２１】人工培養培地の作製 基礎培地として、スピロプラズマ培養用のＳＰ−４培地
をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション・メ
ディウム・ハンドブック（ATCC Medium handbook,pp49,
1st Ed.,1984）に従い調製した。ＳＰ−４培地は、ＰＰ
ＬＯブロス（ディフコ社）３．５ｇ、トリプトン（ディ
フコ社）１０．０ｇ、ペプトン（ディフコ社）５．３
ｇ、グルコース（和光純薬社）５．０ｇを蒸留水６１５
ｍｌに溶かしてｐＨを６．２に合わせた後、オートクレ
ーブ滅菌を行い、その後ＣＭＲＬ１０６６培地（ギブコ
社）５０ｍｌ、イースト抽出液（ギブコ社）３５ｍｌ、
イーストレート（ディフコ社）１００ｍｌ、ウシ胎児血
清（シグマ社）１７０ｍｌ、フェノールレッド（シグマ
社）２０ｍｌを添加して調製した。

【００２２】ＳＰ−４培地７５ｍｌと線虫破砕液２５ｍ
ｌを混合し、苛性ソ−ダでｐＨを６．２に合わせ、滅菌
濾過をおこなって人工培養培地を作製した。

【００２３】実施例１ 培養器に人工培養培地５００μｌを入れ、６７匹のメロ
イドギネ・インコグニ−タの雌成虫より取得した増殖期
のパストリア・ペネトランスを加え、炭酸ガスインキュ
ベ−タ−中で２８℃に保った。培養開始８日後に遠心分
離機を用いてパストリア・ペネトランスを回収し、増殖
相の増加について観察した。

【００２４】培養開始時と８日後のパストリア・ペネト
ランスの各相の観察数を表１に示した。

【００２５】表１ 雌成虫１匹当たりのパストリア属細菌の発生期の形態の
数 増殖期 初期 後期 四葉期 培養開始時 ３４００ ０ ０ ８日後 １４５００ ３７００ ４８００

【００２６】実施例２ 実施例１と同様の人工培養培地８００μl を培養器に入
れ、７０匹のメロイドギネ・インコグニ−タの雌成虫よ
り取得した増殖期のパストリア・ペネトランスを加え、
炭酸ガスインキュベ−タ−中で２８℃に保った。培養開
始１０日後に遠心分離機を用いてパストリア属細菌を回
収し、胞子形成について観察した。この実験における培
養開始時と１０日後のパストリア・ペネトランスの各相
の観察数を表２に示した。

【００２７】 表２ 雌成虫１匹当たりのパストリア属細菌の発生期の形態の数 増殖期 初期 後期 四葉期 二葉期 胞子形成期 培養開始時 ２６１０ １４６０ ７４０ １６０ ５０ １０日後 １４８０ ２００ １００ ３０ ４４９０

【００２８】比較例１ 線虫混合液を添加せずに調製した人工培養培地を用いて
実施例１と同様の実験をおこなった。培養開始時と７日
後のパストリア・ペネトランスの各相の観察数を表３に
示した。

【００２９】表３ 雌成虫１匹当たりのパストリア属細菌の発生期の形態の
数 増殖期 初期 後期 四葉期 培養開始時 ４６４０ ０ １４ ７日後 ３２２０ １４ ０

【００３０】

【発明の効果】線虫の抽出物を加えることを特徴とする
本発明で用いる人工培養培地は、従来の微生物培養用の
培地に不足している栄養成分を付与することにより、線
虫の天敵微生物、とくにパストリア属細菌の増殖用の培
地として好適である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）線虫の抽出物を（Ｂ）微生物増殖
   用の培地に加えることを特徴とする人工培養用の培地を
   用いた線虫の天敵微生物の増殖方法。
2. 【請求項２】 線虫の天敵微生物がパストリア属細菌で
   ある請求項１に記載の線虫の天敵微生物の増殖方法。
3. 【請求項３】 （Ａ）の代替として、線虫の抽出物中に
   含まれる栄養分および／または、化学成分を用いる請求
   項１に記載の線虫の天敵微生物の増殖方法。