JPH06157592A - Peptide or its derivative, combination thereof with protein and production of antiendothelin-1 antibody using the same as immunogen - Google Patents
Peptide or its derivative, combination thereof with protein and production of antiendothelin-1 antibody using the same as immunogenInfo
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- JPH06157592A JPH06157592A JP31326992A JP31326992A JPH06157592A JP H06157592 A JPH06157592 A JP H06157592A JP 31326992 A JP31326992 A JP 31326992A JP 31326992 A JP31326992 A JP 31326992A JP H06157592 A JPH06157592 A JP H06157592A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、エンドセリン−１のア
ミノ酸配列の部分配列を有するが、エンドセリン特有の
生理活性は有せず、動物に抗エンドセリン−１抗体を産
生させる免疫原性を備えたペプチドもしくはその誘導
体、それらとタンパク質との結合体、並びにこれらを用
いた抗エンドセリン−１抗体の製造方法に関する。本発
明のペプチド及びその誘導体は抗エンドセリン−１抗体
産生の免疫原となるほか、抗エンドセリン−１抗体の精
製用リガンドもしくは検出試薬として有用である。INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention has a partial sequence of the amino acid sequence of endothelin-1, but does not have the physiological activity specific to endothelin, and has immunogenicity for producing anti-endothelin-1 antibody in animals. The present invention relates to a peptide or derivative thereof, a conjugate thereof with a protein, and a method for producing an anti-endothelin-1 antibody using these. The peptide and its derivative of the present invention serve as an immunogen for producing anti-endothelin-1 antibody, and are also useful as a ligand for the purification of anti-endothelin-1 antibody or a detection reagent.
【０００２】[0002]
【従来の技術】エンドセリン−１は、図１に示すよう
に、２１箇のアミノ酸残基からなるペプチドで、これま
でに発見された生理活性物質の中で最も強い血管平滑筋
収縮作用をもつペプチドである（Yanagisawa, M. et a
l.:Nature, 1988, 332, 373）。BACKGROUND OF THE INVENTION Endothelin-1 is a peptide consisting of 21 amino acid residues, as shown in FIG. 1, which has the strongest vascular smooth muscle contracting activity among the physiologically active substances discovered so far. (Yanagisawa, M. et a
l.:Nature, 1988, 332 , 373).
【０００３】また、エンドセリン−１の血中濃度は、高
血圧症、腎不全又は呼吸器系疾患等の病態・疾患と強い
相関関係のあることが知られている（Shichiri, M. et
al.:Hypertension, 1990, 15, 493; Kohno, M. et al.:
Am. J. Med., 1990, 88, 614）。It is known that the blood level of endothelin-1 has a strong correlation with pathological conditions / diseases such as hypertension, renal failure and respiratory diseases (Shichiri, M. et.
al.:Hypertension, 1990, 15 , 493; Kohno, M. et al .:
Am. J. Med., 1990, 88 , 614).
【０００４】血中のエンドセリン−１の測定法は、従
来、ラジオイムノアッセイ法やエンザイムイムノアッセ
イ法等があり、これらはいずれも特異検出試薬として抗
エンドセリン−１抗体が用いられている。後者のエンザ
イムイムノアッセイ法のうち、酵素標識した抗体を使う
ものはサンドイッチ法と呼ばれる方式を用いることが多
い。この方法は、検体中のエンドセリン−１をイムノプ
レート等の固相に固定化した抗エンドセリン−１抗体
（１次抗体）で捕捉したのち、酵素で標識した別の抗エ
ンドセリン−１抗体（２次抗体）を加えて挟み込み、発
色性又は発光性基質を加え、生じた発色又は発光量を測
定するものである。Conventionally, there have been known methods for measuring endothelin-1 in blood, such as a radioimmunoassay method and an enzyme immunoassay method, all of which use an anti-endothelin-1 antibody as a specific detection reagent. Of the latter enzyme immunoassay methods, those using an enzyme-labeled antibody often use a method called a sandwich method. In this method, endothelin-1 in a sample is captured by an anti-endothelin-1 antibody (primary antibody) immobilized on a solid phase such as an immunoplate, and then another enzyme-labeled anti-endothelin-1 antibody (secondary antibody) is used. (Antibody) is added and sandwiched, a color-forming or luminescent substrate is added, and the generated color or luminescence amount is measured.
【０００５】抗エンドセリン−１抗体を調製するために
は、従来、図１に示したような完全なアミノ酸配列をも
つエンドセリン−１そのもの、又はこれをアルブミン等
のタンパク質に結合させ、これを抗原として動物に免疫
する方法が採られていた（特開平２−１５０６１７号公
報、特開平２−２３８８９４号公報）。In order to prepare an anti-endothelin-1 antibody, conventionally, endothelin-1 itself having a complete amino acid sequence as shown in FIG. 1 or its binding to a protein such as albumin is used as an antigen. A method of immunizing animals has been adopted (JP-A-2-150617, JP-A-2-238894).
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】しかし、図１に示した
ような完全なアミノ酸配列をもつエンドセリン−１その
もの、又はこれをタンパク質に結合させ、これを抗原と
して動物に免疫する方法では、エンドセリン−１分子中
の複数の抗原決定基と反応する抗体が得られ、特定の抗
原決定基とのみ反応する抗体を得ることができなかっ
た。そのため、エンドセリン−１の特定の部位とのみ反
応する抗体を得るには、これを更に抗体産生以降の段階
で目的の抗体だけを抽出する煩雑な分離精製が必要であ
った。また別の問題は、エンドセリン−１そのもの、又
はこれをタンパク質に結合させ抗原として用いると、エ
ンドセリン−１の強力な昇圧作用のために、免疫動物を
しばしば致死させることであった。However, endothelin-1 itself having the complete amino acid sequence as shown in FIG. 1, or a method of binding this to a protein and immunizing an animal with this as an antigen, endothelin- An antibody reactive with a plurality of antigenic determinants in one molecule was obtained, and an antibody reactive only with a specific antigenic determinant could not be obtained. Therefore, in order to obtain an antibody that reacts only with a specific site of endothelin-1, it is necessary to perform complicated separation and purification in which only the desired antibody is extracted in the stage after antibody production. Another problem was that endothelin-1 itself or, when bound to a protein and used as an antigen, often killed an immunized animal due to the strong pressor action of endothelin-1.
【０００７】本発明は、エンドセリン−１分子中の特定
の抗原決定基とのみ反応する抗エンドセリン−１抗体を
得るための免疫原ペプチド、それを免疫原とする（煩雑
な分離精製の不要な）抗エンドセリン−１抗体の製造方
法を提供することを目的とする。The present invention uses an immunogenic peptide for obtaining an anti-endothelin-1 antibody which reacts only with a specific antigenic determinant in an endothelin-1 molecule, and uses it as an immunogen (no need for complicated separation and purification). It is an object to provide a method for producing an anti-endothelin-1 antibody.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、先ず、本発明者らはエンドセリン−１分子中の抗原
性の高い領域を見つけるべく、６アミノ酸残基からなる
エンドセリン−１部分配列ペプチドを、ポリエチレン製
のロッド上にアミノ末端側から一残基ずつずらしながら
合成し、合成したペプチドを既知の抗エンドセリン−１
ポリクローン抗体と反応させ、そのポリクローン抗体と
親和性の高いペプチドを調べた結果、Ser-Leu-Met-Asp-
Lys-Glu及びSer-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Gluの配列を持つ
ペプチドが抗体と最も高い親和性を持つことを見出し
た。本発明は、この知見に基づいて完成したものであ
る。In order to achieve the above object, first of all, the inventors of the present invention, in order to find a highly antigenic region in an endothelin-1 molecule, an endothelin-1 partial sequence peptide consisting of 6 amino acid residues. Was synthesized on a polyethylene rod while shifting each residue from the amino terminal side, and the synthesized peptide was synthesized as a known anti-endothelin-1.
Ser-Leu-Met-Asp- was detected by reacting with a polyclonal antibody and examining peptides with high affinity for the polyclonal antibody.
It was found that peptides having the sequences Lys-Glu and Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu have the highest affinity for the antibody. The present invention has been completed based on this finding.
【０００９】すなわち、本発明は下記の（１）〜（６）
に関する （１）Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu（Ｉ）で表される
ペプチド。 （２）Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys（II）で表されるペプ
チド。 （３）Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu（III）で表されるペプ
チド。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかのペプチドの末端
のアミノ基もしくはカルボキシル基、又は側鎖のアミノ
基、カルボキシル基もしくは水酸基の、一部もしくは全
部が随意に遮断もしくは保護されたペプチド誘導体。 （５）タンパク質に上記（１）〜（３）のいずれかのペ
プチド又は上記（４）のペプチド誘導体を結合させてな
る、抗エンドセリン−１抗体誘導性タンパク質。 （６）上記（１）〜（３）のいずれかのペプチド、上記
（４）のペプチド誘導体又は上記（５）の抗エンドセリ
ン−１抗体誘導性タンパク質で動物を免疫することを含
む、抗エンドセリン−１抗体の製造方法。 なお本明細書中、アミノ酸は特に断らない限り慣用の３
文字で表し、それぞれのアミノ酸はＬ体で、ペプチドは
慣用の表し方に従いＮ末端を左側に、Ｃ末端を右側に示
している。That is, the present invention provides the following (1) to (6):
(1) A peptide represented by Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (I). (2) A peptide represented by Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys (II). (3) A peptide represented by Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (III). (4) A part or all of the amino group or carboxyl group at the terminal of the peptide of any one of (1) to (3) above, or the amino group, the carboxyl group or the hydroxyl group of the side chain is optionally blocked or protected. Peptide derivative. (5) An anti-endothelin-1 antibody-inducible protein obtained by binding the peptide according to any one of (1) to (3) above or the peptide derivative according to (4) above to the protein. (6) An anti-endothelin-containing method comprising immunizing an animal with the peptide according to any one of (1) to (3) above, the peptide derivative according to (4) above or the anti-endothelin-1 antibody-inducible protein according to (5) above. 1 Method for producing antibody. In addition, in the present specification, unless otherwise specified, an amino acid is a conventional 3
Each amino acid is represented by a letter, each amino acid is in the L-form, and the peptide is shown with the N-terminal on the left side and the C-terminal on the right side according to the conventional notation.
【００１０】本発明のSer-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu
（Ｉ）で表されるペプチドはエンドセリン−１（図１）
の４番目のセリンから１０番目のグルタミン酸までの部
分配列をもつペプチドである。同様に、本発明のSer-Se
r-Leu-Met-Asp-Lys（II）で表されるペプチドはエンド
セリン−１の４番目のセリンから９番目のリジンまでの
部分配列をもつペプチドであり、本発明のSer-Leu-Met-
Asp-Lys-Glu（III）で表されるペプチドは、エンドセリ
ン−１の５番目のセリンから１０番目のグルタミン酸ま
での部分配列をもつペプチドである。Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu of the present invention
The peptide represented by (I) is endothelin-1 (Fig. 1).
Is a peptide having a partial sequence from the 4th serine to the 10th glutamic acid. Similarly, the Ser-Se of the present invention
The peptide represented by r-Leu-Met-Asp-Lys (II) is a peptide having a partial sequence from the 4th serine to the 9th lysine of endothelin-1 and is the Ser-Leu-Met- of the present invention.
The peptide represented by Asp-Lys-Glu (III) is a peptide having a partial sequence from the 5th serine of endothelin-1 to the 10th glutamic acid.
【００１１】図１からも明らかなように３番目のシステ
インと１１番目のシステインはＳＳ結合で架橋されてい
るので、上記３種のペプチドは、３番目と１１番目の２
つのシステインより造られるループ構造の部分配列に一
致するものである。したがって、本発明のペプチド
（Ｉ）〜（III）を免疫原として作製される抗体はエン
ドセリン−１のループ構造に対して特異的な親和性をも
つ抗体であることが期待される。As is clear from FIG. 1, the 3rd cysteine and the 11th cysteine are cross-linked by an SS bond.
It corresponds to the partial sequence of the loop structure made from one cysteine. Therefore, it is expected that the antibody prepared by using the peptides (I) to (III) of the present invention as an immunogen is an antibody having a specific affinity for the loop structure of endothelin-1.
【００１２】本発明のペプチドは、固相法あるいは液相
法等、慣用のペプチド化学合成法によって合成できる。
これらペプチドは、末端のアミノ基もしくはカルボキシ
ル基、又は側鎖のアミノ基、カルボキシル基もしくは水
酸基の、一部もしくは全部が随意に固相により遮断、又
はアセチル基等の保護基により保護されていてもよい。The peptide of the present invention can be synthesized by a conventional peptide chemical synthesis method such as a solid phase method or a liquid phase method.
In these peptides, a part or all of the terminal amino group or carboxyl group, or side chain amino group, carboxyl group or hydroxyl group is optionally blocked by a solid phase or protected by a protective group such as an acetyl group. Good.
【００１３】本発明のペプチド又はペプチド誘導体を結
合させるタンパク質としては、これらペプチドの抗原性
を高めるタンパク質を選ぶ。そのようなタンパク質とし
ては例えば、アルブミン、キーホール リンペット ヘモ
シアニン（Keyhole limpethemocyanin；以後、ＫＬＨと
略す。）、卵白リゾチーム、あるいはサイログロブリン
等のタンパク質が挙げられる。As a protein to which the peptide or peptide derivative of the present invention is bound, a protein which enhances the antigenicity of these peptides is selected. Examples of such proteins include proteins such as albumin, keyhole limpet hemocyanin (hereinafter abbreviated as KLH), egg white lysozyme, and thyroglobulin.
【００１４】本発明のペプチド又はペプチド誘導体をタ
ンパク質に結合させ方法としては、カルボジイミド法
（ Lewis, J. E. et al.： Antimicrob. Agents Chemot
her.,1975, 7, 42.; Broughton, A. et al.: Antimicro
b. Agents Chemother.,1976,10, 652 ）、Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミド法（ Kitagawa, T. et al.: Chem.Parm.
Bull.,1972, 20, 2176.; Hoshida, H. et al.: Chem.
Parm. Bull., 1983, 31, 4001 ）等の公知の方法があ
る。As a method for binding the peptide or peptide derivative of the present invention to a protein, a carbodiimide method (Lewis, JE et al .: Antimicrob. Agents Chemot
her., 1975, 7 , 42 .; Broughton, A. et al .: Antimicro
b. Agents Chemother., 1976, 10 , 652), N-hydroxysuccinimide method (Kitagawa, T. et al .: Chem.Parm.
Bull., 1972, 20 , 2176 .; Hoshida, H. et al .: Chem.
There are known methods such as Parm. Bull., 1983, 31 , 4001).
【００１５】抗エンドセリン−１抗体（ポリクローナル
抗体）を取得するには、マウス、ラット、ウサギ、ヤ
ギ、ヒツジ等の動物に、本発明のペプチド、ペプチド誘
導体又はこれらとタンパク質の結合体を複数回投与して
免疫し、その免疫した動物の血清から採取すればよい。
このとき、免疫原としては、ペプチド又はそのペプチド
誘導体よりも、これらとタンパク質の結合体を投与する
ほうが抗体の産生量が高まり好ましい。マウス等の動物
を上記と同様にして免疫し、公知の細胞融合法、すなわ
ちその脾臓細胞と骨髄腫細胞を細胞融合し、クローニン
グし、抗体産生性のハイブリドーマを採り、これを培養
して抗体（モノクローナル抗体）を取得してもよい。To obtain the anti-endothelin-1 antibody (polyclonal antibody), the peptide, peptide derivative of the present invention or a conjugate of these and a protein is administered to an animal such as mouse, rat, rabbit, goat, or sheep multiple times. Immunization is performed and the serum of the immunized animal is collected.
At this time, as the immunogen, it is preferable to administer a conjugate of the protein and the peptide, as compared with the peptide or the peptide derivative thereof, because the production amount of the antibody is increased. Animals such as mice are immunized in the same manner as described above, and a known cell fusion method, that is, cell fusion of the spleen cells and myeloma cells, cloning, collection of antibody-producing hybridomas, and culturing of these antibodies ( Monoclonal antibody) may be obtained.
【００１６】本発明のペプチド又はペプチド誘導体をア
ルブミン等のタンパク質に結合させ、これをイムノプレ
ート等の固相に結合させたものは、抗エンドセリン−１
抗体の検出用材料として用いることができる。イムノプ
レート等の固相へのペプチドの結合法は物理吸着を用い
てもよいし、表面に官能基が露出したプレートを用い共
有結合によって結合してもよい。The peptide or peptide derivative of the present invention bound to a protein such as albumin and bound to a solid phase such as an immunoplate is the anti-endothelin-1.
It can be used as a material for detecting antibodies. Physical adsorption may be used for binding the peptide to a solid phase such as an immunoplate, or a plate having a functional group exposed on the surface may be used for covalent binding.
【００１７】次に、実験例を説明する。なお、以後の実
験例又は実施例で使用した「洗浄液１」は０．１％ツイ
ーン２０を含むダルベッコ変法リン酸緩衝生理食塩水で
あり、「緩衝液１」は０．１％脱脂粉乳及び０．１％ツ
イーン２０を含むダルベッコ変法リン酸生理食塩水であ
る。Next, an experimental example will be described. The "washing solution 1" used in the following experimental examples or examples is Dulbecco's modified phosphate buffered saline containing 0.1% Tween 20, and "buffer solution 1" is 0.1% skim milk powder and Dulbecco's modified phosphate saline containing 0.1% Tween 20.
【００１８】実験例１ エンドセリン−１の抗原決定基
のスクリーニング エンドセリン−１の抗原決定基のスクリーニングは、Ge
ysen らの報告（Geysen, H. M. et al.: Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 1984, 81, 3998）に準じて行った。Experimental Example 1 Screening for antigenic determinant of endothelin-1 Screening for antigenic determinant of endothelin-1
Report by ysen et al. (Geysen, HM et al .: Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 1984, 81 , 3998).
【００１９】（ａ）スクリーニング用ペプチドの合成 ミモトープデザインキット〔ケンブリッジリサーチバイ
オケミカル社（Cambridge Research Biochemicals In
c.)製〕を用いて、そのピンブロック上にエンドセリン
−１の部分アミノ酸配列を持つペプチドを合成した。合
成したペプチドは以下に示す１０種類である。 （１）Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu （２） Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met （３） Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp （４） Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys （５） Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu （６） Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys （７） Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val （８） Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr （９） Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe （１０） Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys(A) Synthesis of peptide for screening Mimotope Design Kit [Cambridge Research Biochemicals In
c.)] was used to synthesize a peptide having a partial amino acid sequence of endothelin-1 on the pin block. There are 10 kinds of peptides synthesized below. (1) Cys-Ser-Cys-Ser-Ser-Leu (2) Ser-Cys-Ser-Ser-Leu-Met (3) Cys-Ser-Ser-Leu-Met-Asp (4) Ser-Ser-Leu -Met-Asp-Lys (5) Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (6) Leu-Met-Asp-Lys-Glu-Cys (7) Met-Asp-Lys-Glu-Cys-Val (8) ) Asp-Lys-Glu-Cys-Val-Tyr (9) Lys-Glu-Cys-Val-Tyr-Phe (10) Glu-Cys-Val-Tyr-Phe-Cys
【００２０】ペプチドの合成方法はキットに付属するマ
ニュアルに従い、キットに含まれるピンブロックおよび
9-fluorenylmethyloxycarbonyl(以下、Fmocと略す）-L-
アミノ酸を用いて行った。用いたアミノ酸の活性エステ
ルは、セリンのほかはすべてアミノ基をFmocで保護した
pentafluorophenyl エステル（以下、-Opfpと略す）で
あり、セリンのみはアミノ基をFmocで保護したdihydrox
y-benzotriazine エステル（以下、-ODhbtと略す）であ
る。またアスパラギン酸及びグルタミン酸の側鎖の保護
基はt-butyl エステル（以後、-OtBuと略す）、システ
インの側鎖の保護基はtrityl-（以下、Trtと略す）、リ
ジンの側鎖の保護基はt-butyloxycarbonyl（以下、Boc
と略す）、セリンおよびチロシンの側鎖の保護基はt-bu
tyl ether（以下、-tBuと略す）である。合成に用いた
ポリエチレン製のピンの先端表面はグラフト重合したア
クリル酸ポリマーで、それにはFmoc-β-アラニンがヘキ
サメチレンジアミンのスペーサを介して結合している。The peptide synthesis method is according to the manual attached to the kit.
9-fluorenylmethyloxycarbonyl (hereinafter abbreviated as Fmoc) -L-
Performed with amino acids. The amino acid active esters used were all protected by Fmoc except for serine.
It is a pentafluorophenyl ester (hereinafter abbreviated as -Opfp), and only serine is dihydrox with the amino group protected by Fmoc.
It is a y-benzotriazine ester (hereinafter abbreviated as -ODhbt). The side chain protecting group of aspartic acid and glutamic acid is t-butyl ester (hereinafter abbreviated as -OtBu), the side chain protecting group of cysteine is trityl- (hereinafter abbreviated as Trt), and the side chain protecting group of lysine. Is t-butyloxycarbonyl (hereinafter Boc
Abbreviated), and the side chain protecting groups of serine and tyrosine are t-bu
It is tyl ether (hereinafter abbreviated as -tBu). The surface of the tip of the polyethylene pin used for the synthesis is a graft-polymerized acrylic acid polymer, to which Fmoc-β-alanine is bonded via a hexamethylenediamine spacer.
【００２１】Fmoc-β-アラニンが共有結合したピンブロ
ックをピペリジン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以
下、ＤＭＦと略す）混合液 １：４（容量比）に３０分
間浸漬してFmoc基をはずした後、ＤＭＦで５分間（２
回）、メタノールで２分間（１回）、メタノールで５分
間（２回）洗浄し、更に風乾してメタノールを完全に蒸
散させた。ピンブロックをＤＭＦに５分間浸漬後、各ピ
ンの先端をFmocーアミノ酸溶液に３０℃で１８時間浸漬
してアミノ酸を付加させた。このときのアミノ酸溶液
は、各ピン上に合成予定しているペプチドのカルボキシ
ル末端のFmocーアミノ酸をそれぞれ２０ｍＭずつ、２
２．５ｍＭの１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（以
後、ＨＯＢＴと略）を含むＤＭＦ溶液に溶かしたもので
ある。アミノ酸を付加した後、ＤＭＦで２分間、メタノ
ールで２分間（３回）洗浄した。以上のアミノ酸の付加
反応をカルボキシル末端のアミノ酸からアミノ末端側に
順番に一つずつ行い、それぞれのピンブロック上に６ア
ミノ酸残基からなるペプチドを合成した。The pin block to which Fmoc-β-alanine was covalently bonded was immersed in a piperidine: N, N-dimethylformamide (hereinafter abbreviated as DMF) mixed solution 1: 4 (volume ratio) for 30 minutes to remove the Fmoc group. Then, with DMF for 5 minutes (2
(2 times), washed with methanol for 2 minutes (1 time), washed with methanol for 5 minutes (2 times), and further air-dried to completely evaporate methanol. After the pin block was immersed in DMF for 5 minutes, the tip of each pin was immersed in an Fmoc-amino acid solution at 30 ° C. for 18 hours to add an amino acid. At this time, the amino acid solution contains 20 mM each of the carboxyl-terminal Fmoc-amino acids of the peptide to be synthesized on each pin.
It was dissolved in a DMF solution containing 2.5 mM 1-hydroxy-benzotriazole (hereinafter abbreviated as HOBT). After the amino acid was added, it was washed with DMF for 2 minutes and with methanol for 2 minutes (three times). The above-mentioned addition reaction of amino acids was carried out one by one from the amino acid at the carboxyl terminal to the amino terminal side in order to synthesize a peptide consisting of 6 amino acid residues on each pin block.
【００２２】最後のアミノ酸を結合した後、ピンブロッ
クをＤＭＦ：無水酢酸：トリエチルアミン ５：２：１
（容量比）混合液に３０℃で９０分間浸漬し、アミノ基
をアセチル化した。反応後、ＤＭＦで２分間、メタノー
ルで２分間（３回）洗浄し、風乾した。側鎖の保護基を
はずすために、ピンブロックをトリフルオロ酢酸：アニ
ソール：エタンジチオール ９５：２．５：２．５（容
量比）混合液に室温で４時間浸漬したのち、更に０．１
％（Ｗ／Ｖ）塩酸、５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール溶液に
浸漬し、超音波処理洗浄後、これを以下の実験に用い
た。After coupling the last amino acid, the pin block was added to DMF: acetic anhydride: triethylamine 5: 2: 1.
(Volume ratio) The mixture was immersed in the mixed solution at 30 ° C. for 90 minutes to acetylate the amino groups. After the reaction, it was washed with DMF for 2 minutes and with methanol for 2 minutes (three times), and dried in air. In order to remove the side chain protecting group, the pin block was immersed in a mixed solution of trifluoroacetic acid: anisole: ethanedithiol 95: 2.5: 2.5 (volume ratio) for 4 hours at room temperature, and then 0.1
% (W / V) hydrochloric acid, 50% (V / V) methanol solution was immersed in the solution, and after ultrasonic treatment, this was used for the following experiments.
【００２３】（ｂ）高親和性領域のスクリーニング 既知の抗エンドセリン−１ポリクローン抗体に対して高
い親和性を持つアミノ酸配列を以下のようにして調べ
た。ピンブロック及びイムノプレートへの抗エンドセリ
ン−１抗体の非特異的な吸着を防ぐために、９６穴のイ
ムノプレートに０．２％脱脂粉乳（Kirkegaard andPerr
y Laboratories. Inc. 製）を一ウェル当り４００μlと
り、ピンブロックの各ピンが各ウェルに入るようにセッ
トし、４℃で一晩浸漬した。(B) Screening of high affinity region An amino acid sequence having high affinity for a known anti-endothelin-1 polyclonal antibody was examined as follows. To prevent non-specific adsorption of anti-endothelin-1 antibody to pin blocks and immunoplates, 96% immunoplates were supplemented with 0.2% skim milk powder (Kirkegaard and Perr).
(manufactured by y Laboratories. Inc.) was taken in an amount of 400 μl per well, and each pin of the pin block was set so as to enter each well, and immersed at 4 ° C. overnight.
【００２４】ピンブロック及びプレートを洗浄液１で充
分に洗った後、１／１０００希釈した抗エンドセリン−
１ポリクローン抗体（ペプチド研究所（株）製）を含む
緩衝液１を一ウェル当り１７５μlとり、ピンをウェル
中、３７℃で２．５時間浸漬した。このとき緩衝液１の
みを入れたウェルも同時に用意した。プレート及びピン
ブロックを洗浄液１で充分に洗った後、１／２０００に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識化抗ウサギ抗体
ヤギ抗体（Kirkegaard andPerry Laboratories. Inc.
製）（２次抗体）を含む緩衝液１を一ウエル当り１７５
μl加えた。ピンブロックのピンをウェルに浸し、３７
℃で一時間インキュベーションした。一時間後ピンブロ
ックとプレートを洗浄液で充分洗ったあと、ｐ−ニトロ
フェニルリン酸（以下、ＰＮＰＰと略す。アルカリフォ
スファターゼ基質で、Kirkegaard and Perry Laborator
ies. Inc.製 ）溶液を一ウェル当り１７５μl加え、ピ
ンをウェル中に浸して３７℃で１時間反応させた。After thoroughly washing the pin block and plate with Washing Solution 1, anti-endothelin-diluted 1/1000.
175 μl of buffer solution 1 containing 1 polyclonal antibody (manufactured by Peptide Institute Co., Ltd.) was taken per well, and pins were immersed in the wells at 37 ° C. for 2.5 hours. At this time, wells containing only buffer solution 1 were also prepared at the same time. The plate and the pin block were thoroughly washed with the washing solution 1, and then diluted to 1/2000 with an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit antibody goat antibody (Kirkegaard and Perry Laboratories. Inc.
Buffer solution 1) containing (secondary antibody) 175 per well
μl was added. Dip the pins of the pin block into the wells and
Incubated at 0 ° C for 1 hour. After 1 hour, the pin block and plate were thoroughly washed with a washing solution, and then p-nitrophenyl phosphate (hereinafter abbreviated as PNPP. Alkaline phosphatase substrate, Kirkegaard and Perry Laborator
ies. Inc.) solution was added in an amount of 175 μl per well, and pins were immersed in the wells and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
【００２５】ピンブロックを取り除いて反応を停止し、
各ウェルから１００μlずつをとり、別のプレートの各
ウェルに回収し、マイクロプレートリーダー〔ＭＴＰ−
２２形マイクロプレート光度計、コロナ電気（株）〕を
用いて各ウェルの溶液の吸光度Ａ405/492（４０５ｎｍ
と４９２ｎｍの吸光度の差）を求めた。抗エンドセリン
−１ポリクローナル抗体を加えたウェルの吸光度と加え
ないウェルの吸光度（対照）の差を求め、抗体の結合能
とした。Stop the reaction by removing the pin block,
Take 100 μl from each well and collect in each well of another plate. Microplate reader [MTP-
22 type microplate photometer, Corona Denki Co., Ltd.] absorbance of solution in each well A 405/492 (405 nm
And the difference in absorbance at 492 nm). The difference between the absorbance of the well to which the anti-endothelin-1 polyclonal antibody was added and the absorbance of the well to which the anti-endothelin-1 polyclonal antibody was not added (control) was determined and defined as the antibody binding ability.
【００２６】表１にその結果を示した。表１の結果か
ら、Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys及びSer-Leu-Met-Asp-Lys
-Gluのアミノ酸配列を持つペプチドが抗エンドセリン−
１ポリクローナル抗体に対し、高い結合能を有すること
がわかる。The results are shown in Table 1. From the results in Table 1, Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys and Ser-Leu-Met-Asp-Lys
-A peptide having the amino acid sequence of Glu is anti-endothelin-
It can be seen that it has a high binding ability to one polyclonal antibody.
【表１】 表１ エンドセリン−１の部分アミノ酸配列をもつペプチドと抗エンドセリン −１ポリクローナル抗体の結合能 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ No. ペプチド(アミノ酸配列) 結合能（吸光度：Ａ405/492） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 1 ＣＳＣＳＳＬ ０．０１３ 2 ＳＣＳＳＬＭ ０．５２０ 3 ＣＳＳＬＭＤ ０．４７４ 4 ＳＳＬＭＤＫ ０．７７２ 5 ＳＬＭＤＫＥ ０．７９４ 6 ＬＭＤＫＥＣ ０．１８９ 7 ＭＤＫＥＣＶ ０．１３３ 8 ＤＫＥＣＶＹ ０．０１２ 9 ＫＥＣＶＹＦ ０．０１０ 10 ＥＣＶＹＦＣ ０．０１０ 11 対照（ピンブロックのみ） ０．０００ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ なお表１中、ペプチドのアミノ酸は一文字で表したもの
で、ＣはＣｙｓ、ＤはＡｓｐ、ＥはＧｌｕ、ＦはＰｈ
ｅ、ＫはＬｙｓ、ＬはＬｅｕ、ＭはＭｅｔ、ＳはＳｅ
ｒ、ＶはＶａｌ及びＹはＴｙｒを表す。[Table 1] Table 1 Binding ability of a peptide having a partial amino acid sequence of endothelin-1 and an anti-endothelin-1 polyclonal antibody ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━ No. Peptide (amino acid sequence) Binding capacity (Absorbance: A 405/492 ) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━ 1 CSCSSL 0.013 2 SCSSLM 0.520 3 CSSLMD 0.474 4 SSLMDK 0.772 5 SLMDKE 0.794 6 LMDKEC 0.189 7 MDKECV 0.133 8 DKECVY 0. 012 9 KECVYF 0.010 10 ECVYFC 0.010 11 Control (pin block only) 0.000 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━ In Table 1, Pep The amino acid of tide is represented by a single letter, C for Cys, D for Asp, E for Glu, F for Ph.
e, K are Lys, L is Leu, M is Met, S is Se
r and V represent Val and Y represents Tyr.
【００２７】[0027]
【実施例】実施例１ Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu
で表されるペプチドの合成 上記実験例１でSer-Ser-Leu-Met-Asp-Lys（II）及びSer
-Leu-Met-Asp-Lys-Glu(III）のペプチドが抗エンドセリ
ンポリクローナル抗体と高い親和性をもつことがわかっ
たので、上記のペプチドのアミノ酸配列を共通に含むヘ
プタペプチドAc-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu（ただ
し、Ac-はＮ末端セリンのアミノ基がアセチル化されて
いることを示す。）をペプチド合成装置（ミリジェン／
バイオサーチ社製、全自動ペプチドシンセサイザー９０
５０型、固相樹脂はFmoc-Glu-ペプシンKAを使用）によ
り合成した。EXAMPLES Example 1 Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu
Synthesis of peptide represented by Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys (II) and Ser in Experimental Example 1
-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (III) peptide was found to have high affinity with anti-endothelin polyclonal antibody, so the heptapeptide Ac-Ser-Ser- containing the amino acid sequence of the above peptide in common. Leu-Met-Asp-Lys-Glu (wherein Ac-indicates that the amino group of the N-terminal serine is acetylated) was used as a peptide synthesizer (Milligen /
Biosearch, fully automatic peptide synthesizer 90
Type 50, solid phase resin was synthesized by Fmoc-Glu-pepsin KA).
【００２８】カルボキシル末端側から順にFmoc-Lys(Bo
c)-OPfp、Fmoc-Asp(OtBu)-OPfp、Fmoc-Met-OPfp、Fmoc-
Leu-OPfp、Fmoc-Ser(tBu)-ODhbt、Fmoc-Ser(tBu)-ODhbt
をカップリングしてペプチド鎖を伸長した後、アミノ末
端に残っているFmoc基をピペリジン処理によって外し、
０．５Ｍ無水酢酸を含むＤＭＦ溶液によりアミノ末端を
アセチル化した。合成ペプチドの結合した固相樹脂をカ
ラムから取り出し、これをトリフルオロ酢酸：チオアニ
ソール：エタンジチオール：m-クレゾールの混合溶液
（容量比で４０：６：３：１）に浸して樹脂からペプチ
ドを離すとともに、側鎖の保護基を外した。Fmoc-Lys (Bo
c) -OPfp, Fmoc-Asp (OtBu) -OPfp, Fmoc-Met-OPfp, Fmoc-
Leu-OPfp, Fmoc-Ser (tBu) -ODhbt, Fmoc-Ser (tBu) -ODhbt
After the reaction, the peptide chain was extended to remove the Fmoc group remaining at the amino terminus by piperidine treatment,
The amino terminus was acetylated with a DMF solution containing 0.5 M acetic anhydride. The solid phase resin to which the synthetic peptide was bound was taken out from the column and immersed in a mixed solution of trifluoroacetic acid: thioanisole: ethanedithiol: m-cresol (volume ratio 40: 6: 3: 1) to remove the peptide from the resin. Upon release, the side chain protecting group was removed.
【００２９】得られたペプチドを高速液体クロマトグラ
フィー（６５５液体クロマトグラフィー、日立製作所
社）を用いて、逆相カラム（D-ODS-5、YMC社製）によっ
て分離精製した。The obtained peptide was separated and purified by high performance liquid chromatography (655 Liquid Chromatography, Hitachi Ltd.) using a reverse phase column (D-ODS-5, manufactured by YMC).
【００３０】実施例２ タンパク質へのAc-Ser-Ser-Leu
-Met-Asp-Lys-Gluの結合 カルボジイミド法によってAc-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys
-GluをＫＬＨ及びウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと
略す）に化学結合させた。実施例１で得たAc-Ser-Ser-L
eu-Met-Asp-Lys-Glu ２４０nmol、Ｎ−ヒドロキシスル
ホスクシンイミド（以下、Sulfo-NHSと略す）８００nmo
l及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド（以下、EDCと略す）８００nmol
を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）６４μ
ｌに溶かし、０℃で３０分間放置した。ＫＬＨ４nmolを
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）２．２ｍ
ｌに溶かし、これを前記の溶液に加え、室温で１時間、
次いで４℃で一晩放置した。その後、この反応液を５０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析
し、未反応のAc-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu、Sulfo-
NHS及びEDCを除去した。Example 2 Ac-Ser-Ser-Leu to protein
-Met-Asp-Lys-Glu bond Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys by carbodiimide method
-Glu was chemically bonded to KLH and bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA). Ac-Ser-Ser-L obtained in Example 1
eu-Met-Asp-Lys-Glu 240 nmol, N-hydroxysulfosuccinimide (hereinafter abbreviated as Sulfo-NHS) 800 nmo
l and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide (hereinafter abbreviated as EDC) 800 nmol
64 mM of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0)
It was dissolved in 1 and left at 0 ° C. for 30 minutes. KLH 4 nmol is added to 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) 2.2 m
1 l, add this to the above solution and at room temperature for 1 hour,
It was then left overnight at 4 ° C. Then, this reaction solution is mixed with 50
Dialyzed against mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), unreacted Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu, Sulfo-
NHS and EDC were removed.
【００３１】Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-GluをＢＳＡ
に結合させる場合は、Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu
量を４．１μｍｏｌ、Sulfo-NHSの量を１２．３μｍｏ
ｌ、EDC量を１２．３μｍｏｌ及びＢＳＡ量を０．４１
μｍｏｌとしたほかはＫＬＨに結合させる場合と同様に
行った。Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu was added to BSA.
Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu
Amount 4.1 μmol, Sulfo-NHS amount 12.3 μmo
1, EDC amount of 12.3 μmol and BSA amount of 0.41
The procedure was the same as in the case of binding to KLH except that the concentration was μmol.
【００３２】タンパク質を定量した結果、いずれのタン
パク質（ＫＬＨ又はＢＳＡ）もほぼ１００％が回収され
ていた。以下、ペプチド Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-
GluをＫＬＨに化学結合させたものを Ac-Ser-Ser-Leu-M
et-Asp-Lys-Glu結合ＫＬＨ、ＢＳＡに化学結合させたも
のを Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合ＢＳＡとい
う。As a result of protein quantification, almost 100% of any protein (KLH or BSA) was recovered. Below, the peptide Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-
Ac-Ser-Ser-Leu-M is obtained by chemically binding Glu to KLH.
Those chemically bound to et-Asp-Lys-Glu-bound KLH and BSA are referred to as Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-bound BSA.
【００３３】Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合タン
パク質の抗エンドセリン−１抗体に対する親和性試験 （１）Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合ＫＬＨ ＫＬＨ、Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合ＫＬＨ、
及びエンドセリン−１を結合させたＫＬＨ（以下、エン
ドセリン−１結合ＫＬＨという）を、それぞれ最終濃度
が１０μg／ｍｌになるように５０ｍＭ炭酸ナトリウ
ム：５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム １：２４（容量比）
溶液に溶かし、その１００μlをそれぞれイムノプレー
ト（MaxiSorpF96、Nunc社製）のウェルにとり、４℃で
一晩放置し、それぞれのタンパク質をイムノプレートに
固定化した。プレートを蒸留水で洗浄し、０．２％脱脂
粉乳を４００μlずつ加え、３７℃で２．５時間インキ
ュベーションした。各ウェルを洗浄液１で洗浄したの
ち、エンドセリン−１のＮ末端を認識すると説明されて
いる抗エンドセリン−１マウスモノクローン抗体（Cat.
No.ET-01、ヤマサ醤油製、緩衝液１で１／１０００希
釈）、正常マウス血清（１／１０００希釈液）、抗エン
ドセリン−１ウサギポリクローン抗体（ペプチド研究所
（株）製、１／１０００希釈液）及び正常ウサギ血清
（１／１０００希釈液）をウェル当り２００μl加え、
３７℃で２時間インキュベーションした。 Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu conjugated tan
Affinity test of anti-endothelin-1 antibody in protein (1) Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu binding KLH KLH, Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu binding KLH,
And KLH bound with endothelin-1 (hereinafter referred to as endothelin-1-binding KLH) are adjusted to a final concentration of 10 μg / ml with 50 mM sodium carbonate: 50 mM sodium hydrogen carbonate 1:24 (volume ratio).
After being dissolved in a solution, 100 μl of each was placed in a well of an immunoplate (MaxiSorpF96, manufactured by Nunc) and left at 4 ° C. overnight to immobilize each protein on the immunoplate. The plate was washed with distilled water, 400 µl of 0.2% skim milk powder was added, and the plate was incubated at 37 ° C for 2.5 hours. After washing each well with washing solution 1, anti-endothelin-1 mouse monoclonal antibody (Cat.
No.ET-01, made by Yamasa Shoyu, diluted 1/1000 with buffer 1), normal mouse serum (diluted 1/1000), anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody (Peptide Research Institute, 1 / 1000 diluted solution) and normal rabbit serum (1/1000 diluted solution) were added in an amount of 200 μl per well,
Incubated at 37 ° C for 2 hours.
【００３４】洗浄液１でウェルを洗浄後、マウス抗体を
加えたウェルに対してはペルオキシダーゼ標識化抗マウ
ス抗体ヤギ抗体（Kirkegaard and Perry Laboratories.
Inc.製）、ウサギ抗体を加えたウェルに対してはアルカ
リホスファターゼ標識化抗ウサギ抗体ヤギ抗体を、各々
緩衝液１で１／１０００希釈してその２００μlを加
え、３７℃で１時間インキュベーションした。各ウェル
を洗浄液１で洗浄し、前者には３，３’，５，５’−テ
トラメチルベンジジン（以下、ＴＭＢと略す、ペルオキ
シダーゼ基質、Kirkegaard and Perry Laboratories. I
nc.製）１００μl、後者にはＰＮＰＰを２００μl加
え、３７℃で３０分間反応させた。ＭＴＢを加えたウェ
ルに１Ｍリン酸１００μlを加えた後、マイクロプレー
トリーダーを用いて各ウェルの吸光度を求めた。このと
きＴＭＢを加えたウェルは４９２ｎｍから６１０ｎｍの
吸光度を引いた値を、ＰＮＰＰを加えたウェルは４０５
ｎｍから４９２ｎｍの吸光度を引いた値を求めた。After washing the wells with washing solution 1, peroxidase-labeled anti-mouse antibody goat antibody (Kirkegaard and Perry Laboratories.
(Manufactured by Inc.) and a rabbit antibody-added well, an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit antibody goat antibody was diluted 1/1000 with buffer 1 and 200 μl thereof was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. Each well was washed with washing solution 1, and the former was 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (hereinafter abbreviated as TMB, a peroxidase substrate, Kirkegaard and Perry Laboratories.
(manufactured by nc.), and 200 μl of PNPP was added to the latter and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After adding 100 μl of 1M phosphoric acid to the wells containing MTB, the absorbance of each well was determined using a microplate reader. At this time, the value obtained by subtracting the absorbance at 610 nm from 492 nm was calculated for the well to which TMB was added, and 405 for the well to which PNPP was added.
The value obtained by subtracting the absorbance at 492 nm from nm was determined.
【００３５】表２はその結果（吸光度は上記の吸光度の
差として表示）を示したものである。Table 2 shows the results (absorbance is expressed as the above difference in absorbance).
【表２】 表２ ペプチド結合タンパク質（ＫＬＨ）に対する結合能 （単位：吸光度） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 血清 又は 抗体 ペプチド結合タンパク マウス血清 マウス抗体 ウサギ血清 ウサギ抗体 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＫＬＨ(陰性対照） 0.009 0.005 0.003 0.023 エンドセリン-1結合KLH 0.009 0.649 0.007 １．６１
３ ヘプタペプチド結合ＫＬＨ 0.008 0.004 0.007 0.907 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━[Table 2] Table 2 Binding ability to peptide-binding protein (KLH) (unit: absorbance) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━ Serum or antibody Peptide-binding protein Mouse serum Mouse antibody Rabbit serum Rabbit antibody ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━ KLH (negative control) 0.009 0.005 0.003 0.023 Endothelin-1 binding KLH 0.009 0.649 0.007 1.61
3 Heptapeptide bond KLH 0.008 0.004 0.007 0.907 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００３６】なお表２中、マウス血清は正常マウスの血
清、マウス抗体は抗エンドセリン−１マウスモノクロー
ン抗体、ウサギ血清は正常ウサギの血清、ウサギ抗体は
抗エンドセリン−１ウサギポリクローン抗体、ヘプタペ
プチド結合KLHはAc-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合
ＫＬＨをそれぞれ示す。In Table 2, mouse serum is normal mouse serum, mouse antibody is anti-endothelin-1 mouse monoclonal antibody, rabbit serum is normal rabbit serum, rabbit antibody is anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody, heptapeptide. The bound KLH represents Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-bound KLH, respectively.
【００３７】ペプチド結合タンパク質（ＫＬＨ）とウサ
ギポリクローン抗体の結合能をみると、ウサギポリクロ
ーン抗体に対するヘプタペプチド結合KLHの結合能はウ
サギポリクローン抗体に対するエンドセリン−１結合KL
Hの結合能の約６０％であった。これは抗エンドセリン
−１ウサギポリクローン抗体のうち約６０％がエンドセ
リン−１の部分配列 Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Gluに結
合したことを意味している。一方、用いたマウスモノク
ローン抗体はエンドセリン−１に結合したが（おそら
く、エンドセリン−１のＮ末端部位に結合）、意外にも
Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Gluには結合しないことが表
２から分かった。この理由は、用いたマウスモノクロー
ン抗体がエンドセリン−１のSer4-Ser-Leu-Met-Asp-Lys
-Glu10部位とは別のＮ末端部位を認識するからと思われ
る。Looking at the binding ability between the peptide binding protein (KLH) and the rabbit polyclonal antibody, the binding ability of the heptapeptide-bound KLH to the rabbit polyclonal antibody is the endothelin-1 binding KL to the rabbit polyclonal antibody.
It was about 60% of the binding capacity of H 2. This means that about 60% of the anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody bound to the partial sequence Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu of endothelin-1. On the other hand, the mouse monoclonal antibody used bound to endothelin-1 (probably bound to the N-terminal site of endothelin-1), but surprisingly
It was found from Table 2 that it did not bind to Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu. The reason for this is that the mouse monoclonal antibody used was Ser 4 -Ser-Leu-Met-Asp-Lys of endothelin-1.
-This is probably because it recognizes an N-terminal site different from the Glu 10 site.
【００３８】（１）Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結
合ＢＳＡ ＢＳＡ、Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu結合ＢＳＡ、
及びエンドセリン−１を結合させたＢＳＡ（以下、エン
ドセリン−１結合ＢＳＡという）を、それぞれ最終濃度
１０μg／ｍｌとなるように５０ｍＭ炭酸ナトリウム：
５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム １：２４（容量比）溶液
に溶かした後、その１００μlをそれぞれイムノプレー
トのウェルにとり、４℃で一晩放置し、それぞれのタン
パク質をイムノプレートに固定化した。各ウェルを蒸留
水で洗浄後、０．２％脱脂粉乳をウェル当り４００μl
ずつ加え、３７℃で２．５時間インキュベーションし
た。各ウェルを洗浄液１で洗浄した後、緩衝液１で希釈
した抗エンドセリン−１ウサギポリクローン抗体（１／
１０００希釈液）及び正常ウサギ血清（１／１０００希
釈液）をウェル当り２００μl加え、３７℃で２時間イ
ンキュベーションした。(1) Ac-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-conjugated BSA BSA, Ac-Ser-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu-conjugated BSA,
And BSA bound with endothelin-1 (hereinafter referred to as BSA bound with endothelin-1) are each adjusted to a final concentration of 10 μg / ml with 50 mM sodium carbonate:
After being dissolved in a 50 mM sodium hydrogen carbonate 1:24 (volume ratio) solution, 100 μl thereof was placed in each well of the immunoplate and left overnight at 4 ° C. to immobilize each protein on the immunoplate. After washing each well with distilled water, 0.2% non-fat dry milk was added to each well at 400 μl.
Each was added and incubated at 37 ° C. for 2.5 hours. After washing each well with the washing solution 1, the anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody diluted with the buffer solution 1 (1 /
(1000 dilution) and normal rabbit serum (1/1000 dilution) were added at 200 μl per well and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
【００３９】洗浄液１でウェルを洗浄後、緩衝液１で１
／１０００希釈したアルカリホスファターゼ標識化抗ウ
サギ抗体ヤギ抗体をウェル当り２００μlずつ加え、３
７℃で１時間インキュベーションした。各ウェルを洗浄
液１で洗浄後、ＰＮＰＰをウェル当り２００μlずつ加
え、３７℃で３０分間反応させた。その後、マイクロプ
レートリーダーを用いてウェルの反応液の吸光度(４０
５ｎｍと４９２ｎｍの吸光度の差)を測定した。After washing the wells with washing solution 1, the wells are washed with buffer solution 1
Alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit antibody goat antibody diluted at 1000/1000 was added to each well in an amount of 200 μl.
Incubated at 7 ° C for 1 hour. After washing each well with Washing Solution 1, 200 μl of PNPP was added to each well and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Then, using a microplate reader, the absorbance (40
The difference in absorbance between 5 nm and 492 nm was measured.
【００４０】表３はその結果を示したものである。Table 3 shows the results.
【表３】 表３ ペプチド結合タンパク質（ＢＳＡ）に対する結合能 （単位：吸光度） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 血清 又は 抗体 ペプチド結合タンパク ウサギ血清 ウサギ抗体 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ＢＳＡ(陰性対照） ０．００２ ０．０２２ エンドセリン-1結合BSA ０．００７ １．５６３ ヘプタペプチド結合BSA ０．００５ ０．８９５ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ なお表３中、ウサギ血清は正常ウサギの血清、ウサギ抗
体は抗エンドセリン−１ウサギポリクローン抗体、ヘプ
タペプチド結合ＢＳＡはAc-Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-G
lu結合ＢＳＡをそれぞれ示す。[Table 3] Table 3 Binding ability to peptide-binding protein (BSA) (unit: absorbance) ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━ serum or antibody peptide binding protein rabbit serum rabbit antibody ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ BSA ( Negative control) 0.002 0.022 endothelin-1 binding BSA 0.007 1.563 heptapeptide binding BSA 0.005 0.895 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ━━━━━━━━━━━━━━ In Table 3, rabbit serum is normal rabbit serum, rabbit antibody is anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody, and heptapeptide-conjugated BSA is Ac-Ser-Ser-. Leu-Met-Asp-Lys-G
The lu binding BSAs are shown respectively.
【００４１】ウサギポリクローン抗体に対するペプチド
結合ＢＳＡの結合能はウサギポリクローン抗体に対する
エンドセリン−１結合ＢＳＡの約６０％であった。これ
は前記同様に、抗エンドセリン−１ウサギポリクローン
抗体のうち約６０％がエンドセリン−１の部分配列 Ser
-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Gluを認識していることを意味し
ている。The binding ability of the peptide-bound BSA to the rabbit polyclonal antibody was about 60% of that of endothelin-1-bound BSA to the rabbit polyclonal antibody. Similar to the above, about 60% of the anti-endothelin-1 rabbit polyclonal antibody was a partial sequence Ser of endothelin-1.
-It means that it recognizes Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu.
【００４２】[0042]
【発明の効果】請求項１〜請求項３のペプチド及び請求
項４のペプチド誘導体は、エンドセリン−１分子の特定
の抗原決定基（３番目及び１１番目のシステインの間の
ループ構造）とのみ結合するので、抗エンドセリン−１
抗体の精製用リガンドもしくは検出試薬となり、また、
抗エンドセリン−１抗体を得るための免疫原タンパク質
の原料となる。請求項５の抗エンドセリン−１抗体誘導
性タンパク質は、エンドセリン−１の分子の特定の抗原
決定基（３番目及び１１番目のシステインの間のループ
構造）とのみ反応する抗エンドセリン−１抗体を得るた
めの免疫原タンパク質である。請求項６の方法により、
煩雑な分離精製を要することなくエンドセリン−１の分
子の特定の抗原決定基（３番目及び１１番目のシステイ
ンの間のループ構造）を認識する抗エンドセリン−１抗
体を製造できる。The peptides of claims 1 to 3 and the peptide derivative of claim 4 bind only to a specific antigenic determinant of the endothelin-1 molecule (loop structure between the 3rd and 11th cysteines). So anti-endothelin-1
It serves as a ligand for antibody purification or a detection reagent.
It is a raw material of an immunogenic protein for obtaining anti-endothelin-1 antibody. The anti-endothelin-1 antibody-inducible protein according to claim 5 obtains an anti-endothelin-1 antibody which reacts only with a specific antigenic determinant (loop structure between the 3rd and 11th cysteines) of the molecule of endothelin-1. Is an immunogenic protein for. According to the method of claim 6,
An anti-endothelin-1 antibody that recognizes a specific antigenic determinant (loop structure between the 3rd and 11th cysteines) of the molecule of endothelin-1 can be produced without requiring complicated separation and purification.
【００４３】[0043]
【図１】エンドセリン−１の分子の２次構造を示す模式
図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing the secondary structure of the molecule of endothelin-1.
Claims (6)
されるペプチド。1. A peptide represented by Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (I).
るペプチド。2. A peptide represented by Ser-Ser-Leu-Met-Asp-Lys (II).
るペプチド。3. A peptide represented by Ser-Leu-Met-Asp-Lys-Glu (III).
プチドの末端のアミノ基もしくはカルボキシル基、又は
側鎖のアミノ基、カルボキシル基もしくは水酸基の、一
部もしくは全部が随意に遮断もしくは保護されたペプチ
ド誘導体。4. A part or all of the terminal amino group or carboxyl group or the side chain amino group, carboxyl group or hydroxyl group of the peptide of claim 1, claim 2 or claim 3 is optionally blocked or protected. Peptide derivative.
請求項３のペプチド又は請求項４のペプチド誘導体を結
合させてなる、抗エンドセリン−１抗体誘導性タンパク
質。5. An anti-endothelin-1 antibody-inducible protein obtained by binding the peptide of claim 1, claim 2 or claim 3 or the peptide derivative of claim 4 to a protein.
プチド、請求項４のペプチド誘導体又は請求項５の抗エ
ンドセリン−１抗体誘導性タンパク質で動物を免疫する
ことを含む、抗エンドセリン−１抗体の製造方法。6. An anti-endothelin-comprising immunization of an animal with the peptide of claim 1, claim 2 or claim 3, the peptide derivative of claim 4 or the anti-endothelin-1 antibody-inducible protein of claim 5. 1 Method for producing antibody.
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