JP3754611B2 - Human aging marker and stress marker test method - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識する抗体を用いるそれらマーカーの検出方法及び検出用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、老化マーカーあるいはストレスマーカーに対する抗体、およびそれら抗体を利用したマーカーの検出法は存在する。例えば、ヒト老化マーカータンパク質ＳＭＰ30に対する抗体及び抗体を用いるヒトＳＭＰ30の測定方法は、特開平７−９７３９９及び特開平８−３１９２９８に示されている。その場合、老化するほどＳＭＰ30の血中濃度が下がることを利用した老化モニタリング、あるいは肝障害や腎障害でＳＭＰ30の血中濃度が増大することを利用した肝細胞障害モニタリング及び腎細尿管の破壊モニタリングに使用される。
【０００３】
また特開平７−１８１１８０に示されるように、骨格筋由来のストレスタンパク質ｐ20に対する抗体は、例えば、患者血清あるいは血漿中のストレスタンパク質ｐ20の濃度測定を可能にし、生体の受けたストレスの程度を測定することができる。さらには、Biochem. J. (2000) 345, 473-480及びBiochem. J. (2000) 345, 481-485に示されるように、Ｉ型コラーゲンα1鎖Ｃ末端テロペプチド由来の4種類の異性体ペプチド断片 （Asp¹²¹¹がそれそれ、aL体, aD体, βL体, 及びβD体）に対する抗体は、尿中の各ペプチド断片の定量を可能にし、コラーゲン分子の老化、コラーゲン代謝、骨代謝の測定、及び骨代謝異常の診断に有効である。
【０００４】
本発明者らは、ヒトのレンズに含まれるαAクリスタリンにおいて、老化とともに鎖中Asp の異性体が蓄積することを報告してきた。さらに本発明者らは、Molecular Vision (2000) 6, 1-5に示されるように、Asp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体を用いて、その異性体タンパク質が老化したレンズのコア部分に局在することを明らかにした。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーを認識するAsp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体を提供し、この抗体を組織・細胞に適用して、人の老化又は人のストレスのマーカーを検出するための方法及び検出試薬を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究した結果、Asp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体が、レンズ以外の組織中に存在する老化マーカーあるいはストレスマーカーに成り得る物質と反応することを見い出した。例えば、老人顔面皮膚内のエラスチン繊維、顔面脂漏性角化症の皮下組織、さらには老人皮膚組織の血管内皮が、本発明の抗体と際立った反応を示すことを明らかにした。さらにこれら抗体を用いた免疫学的検定法、及び免疫学的試薬を開発し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明はAsp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリンに対する抗体を用いて、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターすることができる。
【０００８】
本発明は、
１．下記の群より選ばれるポリペプチド又は該ポリペプチドを有するタンパク質を免疫学的に認識する抗体を用いることを特徴とする、ヒト老化マーカー及びストレスマーカーの検出方法；
▲１▼N末端より151番目のアスパラギン酸がD-β-アスパラギン酸（D-β-Asp）であるaAクリスタリン、
▲２▼N末端より151番目のアスパラギン酸がD-β-アスパラギン酸であるaAクリスタリン由来であるポリペプチド断片、
▲３▼アミノ酸配列がGly-X₁-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X₁は疎水性アミノ酸を示す）、
▲４▼アミノ酸配列がGly-X₁-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X₁はLeuあるいはValを示す）
▲５▼前記▲１▼〜▲４▼のポリペプチドと少なくとも約５０％のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、
▲６▼前記▲１▼〜▲４▼のアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチド。
２．前項１に記載のいずれか一に記載された検出方法に用いることを特徴とするヒトの老化マーカー又はストレスマーカーの検出用試薬。
に関するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明の抗体は、以下のタンパク質又はポリペプチドを免疫原として常法により調製される。▲１▼Asp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリン、▲２▼このαAクリスタリン由来のポリペプチド断片、▲３▼▲４▼アミノ酸配列がGly-X₁-D-β-Asp-Alaを含むポリペプチド（X₁は疎水性アミノ酸を示し、好ましくはLeuまたはValが例示される）、▲５▼これらポリペプチドと少なくとも約５０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するポリペプチド、のアミノ酸配列上の相同性を有するポリペプチド、▲６▼これらポリペプチドのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有するポリペプチドが免疫原として例示される。
【００１０】
免疫原として、利用されるポリペプチドは、その最小単位としては少なくともβD体のAsp¹⁵¹部位を保持し、３個以上のアミノ酸、好ましくは４個以上のアミノ酸、より好ましくは６個以上、さらに好ましくは８個以上の連続するアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好ましくは免疫学的に同定しうるポリペプチド又はペプチドを本発明の対象とする。これらのペプチドは、単独又はキャリア（例えば、キーホールリンペイトヘモシアニン又は卵白アルブミン）と結合して使用できるが、これらのように別種のタンパク質又は物質を結合したものも本発明の範囲に包含される。
【００１１】
さらに、このように特定されたポリペプチドは、１以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個で特に好ましくは１ないし数個のアミノ酸の欠失・置換・付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド又はペプチドも利用可能である。欠失・置換・付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法又はポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独又は適宜組み合わせて、例えば、Molecular Cloning;A Laboratory Manual、第２版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ehrlich,HE.編、ストックトンプレス、1989年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Science(1983)219:666）を利用することが出来る。
【００１２】
上記のような免疫原に用いるポリペプチドは、例えば常法に従ったペプチドの化学合成で十分量得ることができる。このうち、より簡単には、固相法による市販のペプチド合成機を用いる方法がある。すなわち、ポリマー性の支持体にペプチド断片のC末端側から、そのアミノ酸残基に対応した保護アミノ酸を縮合させペプチド結合を形成させる。縮合方法としては、例えば、DCC法、酸無水物法、活性エステル法等の方法を使用することができる。αアミノ基の保護基としてはBoc基又はFmoc基が使用できる。例えば、ペプチド自動合成機を用いて合成する時には、その装置のマニュアルに従い適宜アミノ酸の性質を考慮して合成方法を選択するのが好ましい。
【００１３】
抗体を産生するためには、上記ポリペプチドからなる免疫原を、アジュバントの存在又は非存在下で、単独又は担体に結合して、動物に対して体液性応答及び／又は細胞性応答等の免疫誘導をおこなうことによって行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法である。
【００１４】
モノクロ−ナル抗体を生産するためには、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓又はリンパ節由来）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、ペプチド断片をアジュバントと共にマウス、ラット等に注射し、抗体価が高くなった状態で脾臓を摘出し、その脾細胞をポリエチレングリコール等のような融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、その融合細胞群より当該抗体を産生するクローンを選択し増殖させ、腹腔中あるいは培養液中で大量細胞培養することにより、製造することができる。実例としては、ハイブリドーマ法（Kohler,G. and Milstein,C., Nature(1975)256:495-497）；トリオーマ法（Kozbor et al., Immunology Today(1983)4:72）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss,Inc.,(1985):77-96）に記載されるような種々の技法がある。
【００１５】
このようにして得られた抗体又はその抗原結合性フラグメントは、そのままで、あるいは酵素標識、放射標識、蛍光標識等を結合させて、組織中及び体液中に存在する該抗原を検出することに用いることができる。本発明の抗体を用いることにより、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターすることができる。さらに、本発明の抗体を用いることにより、ヒト組織の老化マーカーあるいはストレスマーカーを検出し、組織の老化の度合、ストレス度、及び病的変化をモニターする免疫学的試薬を得ることができる。
【００１６】
本発明の試薬の検体としては、ヒトの臓器、組織、血液、尿、髄液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。組織等の抗原を検出する場合は、常法に従って免疫組織化学の手法が用いられる。すなわちオートプシーされた組織をスライドに固定した後、この抗体を反応させ、さらに例えばパーオキシダーゼ等で標識した抗IgG抗体を反応させる。そして基質液を反応させることにより抗原の存在部位を染色することができる。
【００１７】
また本発明の抗体は、体液中の抗原を検出するために、常法に従って免疫測定法に広く利用することができる。この免疫測定法としては、例えば酵素免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、凝集免疫測定法、免疫比濁測定法、ウェスタンブロット法等を挙げることができ、これらのいずれの測定法を採用しても、該抗原の測定を十分行なうことができる。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００１９】
【実施例１】
免疫原の作製
１）Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thrの合成。
市販のFmoc-Thr(tBu)-Wang樹脂0.2ｇをジメチルホルムアミド（DMF）で膨潤させた後、ペプチド合成機の反応器に入れた。樹脂を20％ピペリジン/DMFで処理しFmoc基を除去してアミノ基を遊離させ、DMFで洗浄した。このアミノ基に次のアミノ酸Fmoc-AlaをHOBt/PyBop法で縮合した。
【００２０】
以後同様に、Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Glyを順次縮合し、反応を完了した。
【００２１】
樹脂を乾燥した後、94%トリフルオロ酢酸（TFA）/5%アニソール/1%エタンジチオールで2時間処理し、ペプチドを樹脂から切り離すとともにペプチドの保護基を除去した。この脱保護ペプチドをジエチルエーテルで洗浄し乾燥した。これを20%アセトニトリル/0.1%TFAに溶解し、C18マイクロボンダスフェアーカラム（ウォータ−ズ社）を装着したＨＰＬＣ装置にてグラジエント溶出し精製した。この精製ペプチド分画を集め凍結乾燥し、白色粉末10.1 mgを得た。
【００２２】
２）上記の合成ペプチドとキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）との複合体を作製し、免疫原とした。すなわち、ＫＬＨ５mgとペプチド5 mgを各々2.5ｍlの0.1M NaH₂CO₃溶液に溶解し、両者を混合した。次にジメチルアジピミデート（DMA）10 mgを冷やした純水1 mlに溶かし、その内の0.25 mlを直ちに上記混合物に添加した。室温で3時間振とう反応した後、免疫原とした。
【００２３】
【実施例２】
抗体の作製
実施例１で調製した免疫原を完全フロイントアジュバントと１：１の割合で混合し、ウサギ背部皮内10カ所に注射した（0.4 mg/ウサギ）。2週間後に、免疫原を不完全フロイントアジュバントと１：１の割合で混合し、ウサギ背部皮下10カ所に注射した（0.2 mg/ウサギ）。以降2週間隔で繰り返し、5回目の免疫終了１週間後に採血し抗血清を得た。抗血清中のペプチド特異抗体（ポリクローナル抗体）は、この抗血清5 mlをペプチド5 mgを結合させた1 mlのアガロースビーズカラム（Aff-Gel 10; Bio-Rad社）に通すことにより精製した。収量は1 mgであった。安定化のためにウシ血清アルブミンを10 mg/mlになるように添加し−20℃に保存した。
【００２４】
【実施例３】
免疫組織染色
バイオプシーされたヒト皮膚を常法に従ってパラフィン切片にした。脱パラフィンの後、次の手順にて組織免疫染色を実施した。すなわち、１）TBS（0.05Mトリス塩酸, pH7.6/ 0.15M NaCl）で5分間インキュベーションする、２）0.025%プロナーゼ/0.05Mトリス塩酸, pH7.6中で20分間インキュベーションする、３）3％過酸化水素水/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、４）2％正常ブタ血清/TBS中で20分間インキュベーションする、５）本発明のウサギポリクローナル抗体（約5μg/ml；2%正常ブタ血清/TBS中）と４℃で一晩インキュベーションする、６）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、７）ビオチン化ブタ抗ウサギIgG（DAKO社製、コード番号E353、500倍希釈で使用）と30分間インキュベーションする、８）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、９）StreptABComplex/HRP（DAKO社、コード番号 K377）を用いて30分間インキュベーションする、１０）0.2%ツイーン/TBS中で5分間を3回インキュベーションする、１１）ペルオキシダーぜ基質液と5−15分間インキュベーションする、１２）純水で洗浄する、１３）ヘマトキシリンで対比染色した後、観察する。この実験の結果を図１〜５に示した。
【００２５】
皮膚の場合、普段露出している顔面では老人で強い染色がみられた。一方、普段被覆されている胸部では染色がみられなかった。また、若齢者では顔面でも全く染色がみられなかった。老人の血管内皮、あるいは顔面脂漏性角化症の皮下組織でも強い染色がみられた。
【００２６】
【実施例４】
ウェスタンブロッティング
バイオプシーにて得られたヒト老人皮膚を純水で抽出後、残査に６Mグアニジン塩酸を加え、抽出されたタンパク質をウェスタンブロッティングに供した。すなわち、抽出サンプルを12.5％ゲルを用いたSDS-PAGEにかけ、分離されたタンパク質をPVDF膜にブロットした。このPVDF膜と本発明のウサギポリクローナル抗体（約1μg/ml；1%ウシ血清アルブミン/0.05%ツイーン20/PBS中）を室温で1時間反応させた後、PBSで3回洗浄した。次にヤギ抗ウサギIgG−HPR複合体と室温で30分間反応させた後、PBSで3回洗浄し、0.6 mg 3−アミノ−９−エチルカルバゾール/0.03% H₂O₂/0.2M酢酸緩衝液 (pH5.2)と反応させた。この実験により分子量50kDa付近の染色バンドが検出された（図６）。
【００２７】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、Asp¹⁵¹がβD体であるαAクリスタリンに対して特異的な抗体が、レンズ以外の組織中に存在する老化マーカーあるいはストレスマーカーと反応することを見い出した。これにより、ヒト組織中又は体液中に存在するそれらマーカーを検出及び定量することができるようになった。従って、本発明は、老化の度合、ストレス度、及び病的変化の観察に大いに寄与するものと考えられる。
【００２８】
【図面の簡単な説明】
【図１】82歳女性の顔面皮膚の免疫組織染色を示しており、いろいろな部位に染色がみられる。
【図２】72歳男性の胸部皮膚の免疫組織染色を示しており、染色はみられない。
【図３】9歳男性の顔面皮膚の免疫組織染色を示しており、染色はみられない。
【図４】69歳男性の顔面脂漏性角化症皮下の免疫組織染色を示しており、エラスチン繊維に強い染色がみられる。
【図５】69歳男性の顔面脂漏性角化症皮下の免疫組織染色を示しており、血管内皮に強い染色がみられる。
【図６】老人顔面皮膚由来タンパク質のウェスタンブロッティングを示しており、分子量50kDa付近の染色バンドが検出された。レーン１は標準マーカー、レーン２は老人皮膚のクーマシーブリリアントブルー染色、レーン３は老人皮膚の本発明ポリクローナル抗体によるウェスタンブロッティングであり、矢印は分子量５０kDa付近の染色バンドを示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a marker detection method and a detection reagent using antibodies that recognize human aging markers and stress markers.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, there are antibodies against aging markers or stress markers, and marker detection methods using these antibodies. For example, an antibody against human aging marker protein SMP30 and a method for measuring human SMP30 using the antibody are disclosed in JP-A-7-97399 and JP-A-8-319298. In that case, monitoring of aging using the fact that the blood concentration of SMP30 decreases as the patient ages, or monitoring of hepatocyte damage using the increase of the blood concentration of SMP30 due to liver damage or kidney damage, and destruction of the renal tubule Used for monitoring.
[0003]
As disclosed in JP-A-7-181180, an antibody against stress protein p20 derived from skeletal muscle, for example, enables measurement of the concentration of stress protein p20 in patient serum or plasma, and measures the degree of stress received by a living body. can do. Furthermore, as shown in Biochem. J. (2000) 345, 473-480 and Biochem. J. (2000) 345, 481-485, four types of isomers derived from type I collagen α1 chain C-terminal telopeptide. Antibodies against peptide fragments (Asp ¹²¹¹ , aL, aD, βL, and βD) allow quantification of each peptide fragment in urine, and measure collagen molecule aging, collagen metabolism, bone metabolism And effective for diagnosis of abnormal bone metabolism.
[0004]
The present inventors have reported that the isomer of Asp in the chain accumulates with aging in αA crystallin contained in human lenses. Furthermore, as shown in Molecular Vision (2000) 6, 1-5, the present inventors aged the isomeric protein using an antibody specific for αA crystallin in which Asp ¹⁵¹ is a βD form. It was clarified that it is localized in the core part of the lens.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide an antibody specific to αA crystallin in which Asp ^151, which recognizes a human aging marker and a stress marker, is βD, and this antibody is applied to tissues / cells to It is to provide a method and detection reagent for detecting a marker of human stress.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research, the present inventors have found that an antibody specific to αA crystallin in which Asp ¹⁵¹ is a βD form reacts with a substance that can be an aging marker or stress marker present in tissues other than the lens. I found it. For example, it has been clarified that elastin fiber in the facial skin of the elderly, subcutaneous tissue of facial seborrheic keratosis, and vascular endothelium of the elderly skin tissue show a marked reaction with the antibody of the present invention. Furthermore, immunological assay methods and immunological reagents using these antibodies were developed to complete the present invention.
[0007]
That is, the present invention can detect an aging marker or a stress marker of human tissue using an antibody against αA crystallin in which Asp ¹⁵¹ is a βD form, and monitor the degree of aging, the degree of stress, and a pathological change in the tissue. .
[0008]
The present invention
1. A method for detecting a human aging marker and a stress marker, characterized by using an antibody that immunologically recognizes a polypeptide selected from the following group or a protein having the polypeptide:
(1) aA crystallin in which the 151st aspartic acid from the N-terminus is D-β-aspartic acid (D-β-Asp),
(2) a polypeptide fragment derived from aA crystallin in which the 151st aspartic acid from the N-terminus is D-β-aspartic acid,
(3) A polypeptide whose amino acid sequence contains Gly-X ₁ -D-β-Asp-Ala (X ₁ represents a hydrophobic amino acid),
(4) A polypeptide whose amino acid sequence contains Gly-X ₁ -D-β-Asp-Ala (X ₁ represents Leu or Val)
(5) A polypeptide having at least about 50% amino acid sequence homology with the polypeptide of (1) to (4) above,
(6) A polypeptide having a mutation such as deletion, substitution, addition or insertion of one to several amino acids in the amino acid sequence of (1) to (4).
2. A reagent for detecting a human aging marker or stress marker, which is used for the detection method according to any one of the preceding items.
It is about.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The antibody of the present invention is prepared by a conventional method using the following protein or polypeptide as an immunogen. (1) αA crystallin in which Asp ¹⁵¹ is βD form, (2) polypeptide fragment derived from this αA crystallin, (3) (4) polypeptide whose amino acid sequence contains Gly-X ₁ -D-β-Asp-Ala (X ₁ represents a hydrophobic amino acid, preferably Leu or Val is exemplified), (5) These polypeptides and at least about 50% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, A polypeptide having homology on the amino acid sequence of a polypeptide having a homology of preferably about 90% or more, most preferably about 95% or more, (6) In the amino acid sequence of these polypeptides, 1 to several A polypeptide having a mutation such as amino acid deletion, substitution, addition or insertion is exemplified as an immunogen.
[0010]
A polypeptide used as an immunogen retains at least the βD-form Asp ¹⁵¹ site as a minimum unit and is 3 or more amino acids, preferably 4 or more amino acids, more preferably 6 or more, and even more preferably. Consists of an amino acid sequence composed of 8 or more consecutive amino acids, and is preferably a polypeptide or peptide that can be immunologically identified. These peptides can be used alone or in combination with a carrier (for example, keyhole limpet hemocyanin or ovalbumin), but those having other kinds of proteins or substances bound thereto are also included in the scope of the present invention. .
[0011]
Furthermore, the polypeptide thus identified is 1 or more, for example 1 to 100, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, further preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to several. Polypeptides or peptides consisting of amino acid sequences having mutations such as deletion, substitution, addition or insertion of individual amino acids can also be used. Deletion, substitution, addition or insertion means are known per se, for example, site-directed mutagenesis, gene homologous recombination, primer extension or polymerase chain amplification (PCR), alone or in combination, , Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd edition, edited by Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; [Lab Manual Genetic Engineering], edited by Masami Muramatsu, Maruzen Stock Company, 1988; [PCR technology, DNA amplification principles and applications], Ehrlich, HE., Edited by Stockton Press, 1989, etc. For example, the Ulmer technique (Science (1983) 219: 666) can be used.
[0012]
A sufficient amount of the polypeptide used for the immunogen as described above can be obtained by, for example, chemical synthesis of a peptide according to a conventional method. Among these, a simpler method is to use a commercially available peptide synthesizer by a solid phase method. That is, a protected amino acid corresponding to the amino acid residue is condensed on the polymeric support from the C-terminal side of the peptide fragment to form a peptide bond. As the condensation method, for example, a DCC method, an acid anhydride method, an active ester method, or the like can be used. As the protecting group for the α-amino group, a Boc group or an Fmoc group can be used. For example, when synthesizing using an automatic peptide synthesizer, it is preferable to select a synthesis method in consideration of the properties of amino acids according to the manual of the apparatus.
[0013]
In order to produce an antibody, an immunogen comprising the above polypeptide is immunized against an animal, such as a humoral response and / or a cellular response, alone or bound to a carrier in the presence or absence of an adjuvant. This is done by guiding. The carrier is not particularly limited as long as it does not cause harmful effects on the host itself, and examples thereof include cellulose, polymerized amino acid, albumin and the like. As the animal to be immunized, a mouse, rat, rabbit, goat, horse or the like is preferably used. Polyclonal antibodies are obtained by a method for recovering antibodies from sera known per se. A preferred means is immunoaffinity chromatography.
[0014]
In order to produce a monoclonal antibody, antibody-producing cells (for example, derived from spleen or lymph nodes) are collected from an animal that has been subjected to the above-described immunization means, and known per se proliferative cells (for example, the P3X63Ag8 strain) This is carried out by introducing a means of transformation into a myeloma strain. For example, peptide fragments are injected into mice, rats and the like together with an adjuvant, the spleen is removed in a state where the antibody titer is high, and the spleen cells are fused with myeloma cells using a fusion agent such as polyethylene glycol. A clone that produces the antibody can be selected from the fused cell group, grown, and cultured in large quantities in the peritoneal cavity or in a culture solution. Illustrative examples are the hybridoma method (Kohler, G. and Milstein, C., Nature (1975) 256: 495-497); the trioma method (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4:72); and the EBV-hybridoma. There are various techniques as described in the method (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., (1985): 77-96).
[0015]
The antibody or antigen-binding fragment thereof thus obtained is used as it is or by binding an enzyme label, radiolabel, fluorescent label, etc. to detect the antigen present in tissues and body fluids. be able to. By using the antibody of the present invention, it is possible to detect an aging marker or a stress marker in human tissue, and monitor the degree of aging, the degree of stress, and pathological changes in the tissue. Furthermore, by using the antibody of the present invention, it is possible to detect an aging marker or stress marker in human tissue and obtain an immunological reagent for monitoring the degree of tissue aging, the degree of stress, and pathological changes.
[0016]
Examples of the specimen of the reagent of the present invention include, but are not limited to, human organs, tissues, blood, urine, spinal fluid and the like. When detecting an antigen such as a tissue, an immunohistochemical technique is used according to a conventional method. That is, after autopsyed tissue is fixed on a slide, this antibody is reacted, and further, for example, an anti-IgG antibody labeled with peroxidase or the like is reacted. Then, the site where the antigen is present can be stained by reacting the substrate solution.
[0017]
In addition, the antibody of the present invention can be widely used in immunoassays according to conventional methods for detecting antigens in body fluids. Examples of the immunoassay include an enzyme immunoassay, a radioimmunoassay, a fluorescence immunoassay, an agglutination immunoassay, an immunoturbidimetric assay, a Western blot method, and the like. Even if is adopted, the antigen can be sufficiently measured.
[0018]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, these do not limit the scope of the present invention.
[0019]
[Example 1]
Preparation of immunogen 1) Synthesis of Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr-Gly-Leu-D-β-Asp-Ala-Thr.
After 0.2 g of commercially available Fmoc-Thr (tBu) -Wang resin was swollen with dimethylformamide (DMF), it was put into a reactor of a peptide synthesizer. The resin was treated with 20% piperidine / DMF to remove the Fmoc group, liberate the amino group, and washed with DMF. The amino acid Fmoc-Ala was condensed with this amino group by the HOBt / PyBop method.
[0020]
Similarly, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Thr (tBu), Fmoc-Ala, Fmoc-D-Asp-OtBu, Fmoc-Leu, and Fmoc-Gly were condensed sequentially to complete the reaction.
[0021]
After the resin was dried, it was treated with 94% trifluoroacetic acid (TFA) / 5% anisole / 1% ethanedithiol for 2 hours to cleave the peptide from the resin and remove the protecting group of the peptide. The deprotected peptide was washed with diethyl ether and dried. This was dissolved in 20% acetonitrile / 0.1% TFA, and purified by gradient elution with an HPLC apparatus equipped with a C18 micro bonder sphere column (Waters). The purified peptide fractions were collected and lyophilized to obtain 10.1 mg of white powder.
[0022]
2) A complex of the above synthetic peptide and keyhole limpet hemocyanin (KLH) was prepared and used as an immunogen. That is, 5 mg of KLH and 5 mg of peptide were dissolved in 2.5 ml of 0.1M NaH ₂ CO ₃ solution, and both were mixed. Next, 10 mg of dimethyl adipimidate (DMA) was dissolved in 1 ml of cooled pure water, and 0.25 ml thereof was immediately added to the above mixture. The mixture was shaken at room temperature for 3 hours, and then used as an immunogen.
[0023]
[Example 2]
Preparation of antibody The immunogen prepared in Example 1 was mixed with complete Freund's adjuvant at a ratio of 1: 1, and injected into 10 sites in the back of the rabbit (0.4 mg / rabbit). Two weeks later, the immunogen was mixed with incomplete Freund's adjuvant in a ratio of 1: 1 and injected subcutaneously at 10 sites on the back of the rabbit (0.2 mg / rabbit). Thereafter, the test was repeated every 2 weeks, and blood was collected one week after completion of the fifth immunization to obtain antiserum. The peptide-specific antibody (polyclonal antibody) in the antiserum was purified by passing 5 ml of this antiserum through a 1 ml agarose bead column (Aff-Gel 10; Bio-Rad) bound with 5 mg of the peptide. Yield was 1 mg. For stabilization, bovine serum albumin was added to 10 mg / ml and stored at -20 ° C.
[0024]
[Example 3]
Immunohistochemical staining Biopsy human skin was cut into paraffin sections according to a conventional method. After deparaffinization, tissue immunostaining was performed by the following procedure. 1) Incubate for 5 minutes with TBS (0.05M Tris-HCl, pH7.6 / 0.15M NaCl) 2) Incubate for 20 minutes in 0.025% Pronase / 0.05M Tris-HCl, pH7.6 3) 3% Incubate 3 times for 5 minutes in hydrogen peroxide / TBS 4) Incubate for 20 minutes in 2% normal pig serum / TBS 5) Rabbit polyclonal antibody of the present invention (approximately 5 μg / ml; 2% normal pig) Incubate overnight at 4 ° C with serum / TBS), 6) Incubate 3 times for 5 minutes in 0.2% Tween / TBS, 7) Biotinylated porcine anti-rabbit IgG (DAKO, code number E353, 500 times) Incubate for 30 minutes with dilution) 8) Incubate 3 times for 5 minutes in 0.2% Tween / TBS, 9) Incubate for 30 minutes with StreptABComplex / HRP (DAKO, code number K377) 10) 0.2% tweezers / In TBS incubation 3 times for 5 min, 11) peroxidase ze incubated substrate solution and 5-15 min, 12) is washed with pure water, 13) was counterstained with hematoxylin and observed. The results of this experiment are shown in FIGS.
[0025]
In the case of the skin, the old face showed strong staining on the normally exposed face. On the other hand, there was no staining in the breast that was usually covered. Also, no staining was seen on the face of young people. Strong staining was also seen in the vascular endothelium of the elderly or the subcutaneous tissue of facial seborrheic keratosis.
[0026]
[Example 4]
The human aged skin obtained by Western blotting biopsy was extracted with pure water, 6M guanidine hydrochloride was added to the residue, and the extracted protein was subjected to Western blotting. That is, the extracted sample was subjected to SDS-PAGE using 12.5% gel, and the separated protein was blotted onto a PVDF membrane. This PVDF membrane and the rabbit polyclonal antibody of the present invention (about 1 μg / ml; in 1% bovine serum albumin / 0.05% Tween 20 / PBS) were reacted at room temperature for 1 hour, and then washed with PBS three times. Next, after reacting with a goat anti-rabbit IgG-HPR complex at room temperature for 30 minutes, it was washed 3 times with PBS, and 0.6 mg 3-amino-9-ethylcarbazole / 0.03% H ₂ O ₂ /0.2M acetate buffer. (pH 5.2). In this experiment, a staining band having a molecular weight of about 50 kDa was detected (FIG. 6).
[0027]
【The invention's effect】
As described above, the present invention has found that an antibody specific for αA crystallin in which Asp ¹⁵¹ is a βD form reacts with an aging marker or a stress marker present in tissues other than the lens. This makes it possible to detect and quantify those markers present in human tissues or body fluids. Therefore, the present invention is considered to greatly contribute to the observation of the degree of aging, the degree of stress, and pathological changes.
[0028]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows immunohistochemical staining of the face skin of an 82-year-old woman, with various sites showing staining.
FIG. 2 shows immunohistochemical staining of breast skin of a 72-year-old man, with no staining seen.
FIG. 3 shows immunohistochemical staining of the facial skin of a 9-year-old man, with no staining.
FIG. 4 shows immunohistochemical staining of a 69-year-old male undercutting facial seborrheic keratosis, with strong staining of elastin fibers.
FIG. 5 shows immunohistochemical staining of a 69-year-old male under the facial seborrheic keratosis, with strong staining on the vascular endothelium.
FIG. 6 shows Western blotting of a protein derived from the skin of an aged face, and a stained band having a molecular weight of about 50 kDa was detected. Lane 1 is a standard marker, Lane 2 is Coomassie brilliant blue staining of aged skin, Lane 3 is Western blotting of the aged skin with the polyclonal antibody of the present invention, and an arrow indicates a stained band having a molecular weight of about 50 kDa.

Claims (2)

少なくともアミノ酸配列Gly-X₁-D-β-Asp-Ala（X₁はLeuあるいはValを示す）を認識する抗体を用い、皮膚組織を検体とすることを特徴とする、ヒト老化マーカーの検出方法。A method for detecting a human aging marker comprising using an antibody recognizing at least the amino acid sequence Gly-X ₁ -D-β-Asp-Ala (X ₁ represents Leu or Val) as a specimen of skin tissue . 請求項１に記載された皮膚組織を検体とする検出方法に用いる試薬であって、少なくともアミノ酸配列Gly-X₁-D-β-Asp-Ala（X₁はLeuあるいはValを示す）を認識する抗体を含むことを特徴とするヒト老化マーカーの検出用試薬。A reagent for use in the detection method using the skin tissue as described in claim 1, which recognizes at least the amino acid sequence Gly-X ₁ -D-β-Asp-Ala (X ₁ represents Leu or Val) A reagent for detecting a human aging marker, comprising an antibody.

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