JPH06153952A - Method for pretreatment for carrying out amplifying and labeling of unknown double-stranded dna molecule in trace amount - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enable the amplification of an unknown DNA in a test tube by finely dividing the unknown DNA molecules with plural specific restriction enzymes and then binding an adaptor to the terminal of the DNA molecules of various sizes. CONSTITUTION:Unknown DNA are made to react with plural kinds of restriction enzymes capable of recognizing the base pairs in the course of a DNA chain and preparing a cohesive end and finely divided. An adaptor of a suitable size is then bound to the resultant cohesive end to enable the amplification in a test tube by using a primer for the known region prepared in the unknown DNA molecule terminal.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】いまＤＮＡを扱う分子生物学の応
用範囲は、日々広がり、医学分野の病名診断を始め、様
々な医学基礎研究においても重要な位置を占めている。
他に、理学、農学、薬学、微生物工学、挙げれば枚挙に
暇が無い。本申請が関わる研究手法には、ハイブリダイ
ゼイション法や微量ＤＮＡのクローニングと呼ばれるも
のが考えられるが、いずれもＤＮＡ分子生物学で最も頻
繁に用いられる手法で、上記のいずれの分野に於いて
も、常に用いられているものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The field of application of molecular biology dealing with DNA is expanding day by day and occupying an important position in various basic medical researches including the diagnosis of disease names in the medical field.
Other than that, I have no time to list science, agriculture, pharmacy, and microbial engineering. The research method related to the present application may be a method called hybridization or cloning of a small amount of DNA, both of which are the most frequently used methods in DNA molecular biology, and in any of the above fields. Is always used.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＤＮＡの遺伝情報は、ＡＴＣＧの塩基の
配列に符号化されている。それ故ＤＮＡ分子の研究は、
同じ配列ないしは似通った配列があるかどうかを比較す
る研究手段が、頻繁に用いられる。この配列を比較する
方法の総称をハイブリダイゼイション法という。ハイブ
リダイゼイション法に用いる標識プローブは既知の物を
使うのみならず、未知のＤＮＡないしＲＮＡを用いるこ
とが、往々にある。この時標識プローブは、多量に準備
できるものであるなら問題はないが、一度に限られた量
しか得られないときには、再度標識プローブを得るため
に多くの手順を繰り返すことが必要であった。一度きり
しか資料が得られない場合には、標識プローブを使い果
たせば、それ以降の操作は不可能となっていた。2. Description of the Related Art Genetic information of DNA is encoded in the base sequence of ATCG. Therefore, the study of DNA molecules
Research tools that compare for the presence of identical or similar sequences are frequently used. The generic term for the method of comparing these sequences is called the hybridization method. As the labeled probe used in the hybridization method, not only a known probe but also an unknown DNA or RNA is often used. At this time, there is no problem if the labeled probe can be prepared in a large amount, but when only a limited amount can be obtained at one time, it was necessary to repeat many procedures to obtain the labeled probe again. When the data was obtained only once, the subsequent operation was impossible if the labeled probe was used up.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】現在では、既知の塩基
配列が二カ所にあれば、米国特許 No. 4,683,195 及びN
o.4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開
昭62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で、
2000bpぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管
内で増幅が可能である。しかし微量しか得られない全く
未知のＤＮＡを、試験管内で増幅することは不可能であ
った。本申請中の発明は、ハイブリダイゼイション法に
使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、そし
て存在比率は維持できないかも知れないが、全く未知の
ＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にするものであ
る。その結果として、ある細胞からその細胞内で発現し
ている遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発
現していない遺伝子をクローニングするのは難しいが、
発現遺伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅すること
で、クローニング出来る可能性を高める。さらに、ＤＮ
Ａ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いるなら
ば、ファインバーグとボウゲルスタインの方法、Anal B
iochem 132 巻6ー13頁にあるランダムプライマー標識法
以上に効率よく標識出来る、既知のプライマーを使った
標識法を提供するものである。At present, if there are known base sequences in two places, US Pat. No. 4,683,195 and N.
o.4,683,202 (published in JP-A-61-274697 and JP-A-62-281 in Japan) by the method (PCR reaction),
Up to about 2000 bp, the DNA in the region between them can be amplified in a test tube. However, it was impossible to amplify completely unknown DNA, which was obtained only in a trace amount, in vitro. The invention of the present application subdivides DNA molecules to the extent that they can be used in the hybridization method, and although the abundance ratio may not be maintained, it is possible to amplify completely unknown DNA in vitro. It is something to do. As a result, when making a library of genes that are expressed in a cell from a cell, it is difficult to clone a gene that is poorly expressed,
The possibility of cloning can be increased by amplifying the cDNA of the expressed gene using the present invention. Furthermore, DN
If a labeled monomer (labeled dNTP) is used during A replication, the method of Feinberg and Bougelstein, Anal B
It is intended to provide a labeling method using a known primer, which can perform labeling more efficiently than the random primer labeling method described in iochem 132, pp. 6-13.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明は、全く未知のＤ
ＮＡ分子が微量しか得られず、かつ様々なサイズの分子
の混合液として存在するとき、その全体を試験管内で増
幅することを可能にする準備手段であり、その基本的方
針は、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加するところにある。 （A）まず未知二重鎖ＤＮＡ分子の断端は、平滑末端で
ある保証がないので、酵素処理により、陥没した領域に
はＤＮＡモノマーを付加し、突出した領域は一部削り取
って、全ての断端を平滑にする。 （B）65℃ 15分程度熱処理やフェノールクロロホルム処
理により、（A）の反応を止め、ＤＮＡを回収する。 （C）次に、平滑末端に結合できるアダプター（［実施
例１］に実例あり）を加え、T4リガーゼの作用により、
結合する。 （D）アダプターを結合したＤＮＡ溶液を３分注する。
ひとつは、そのままポリアクリルアミドゲルの電気泳導
に掛けゲルを切り出すか、分子ふるいのカラムに掛け、
例えば500bp 以上のＤＮＡ分子を精製する。 （E）残り２つの分注分は、４塩基対を認識し粘着末端
を作る２種の制限酵素で、それぞれを処理する。 （F）それぞれの粘着末端に結合できるアダプター
（［実施例２］に実例あり）を加え、断片化した未知Ｄ
ＮＡの両端に結合する。もとからの断端には、既にC,の
項目の所に記載された処理で、アダプターが結合されて
いる（図１）。 （G）アダプターを結合した２つの分注分は、ポリアク
リルアミドゲルの電気泳導に掛けゲルを切り出すか、分
子ふるいのカラムに掛け、例えば500bp 以上のＤＮＡ分
子を精製する。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くし、米国
特許 No.4,683,195及びNo.4,683,202（日本では特開昭6
1-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開中）の
方法（ＰＣＲ反応）を用いて、ＤＮＡの増幅を行う。 （H）高塩基数ＤＮＡ分子の濃度を十分に高くすること
で、ＰＣＲ反応を用いて、ＤＮＡの増幅を行っても、低
塩基数のＤＮＡのみが増幅され、高塩基数のＤＮＡ分子
は確認もできないと言うことは起こらない。The present invention is based on the completely unknown D
When a small amount of NA molecule is obtained and it exists as a mixture of molecules of various sizes, it is a preparatory means that makes it possible to amplify the whole molecule in vitro, and its basic policy is to prepare various sizes. A known base sequence is added to each unknown DNA molecule of. (A) First, since the stump of the unknown double-stranded DNA molecule is not guaranteed to be a blunt end, a DNA monomer is added to the depressed region by the enzyme treatment, and the protruding region is partially scraped to remove all Smooth the stump. (B) Stop the reaction of (A) and recover the DNA by heat treatment at 65 ° C for about 15 minutes or phenol chloroform treatment. (C) Next, an adapter capable of binding to a blunt end (a practical example is given in [Example 1]) was added, and by the action of T4 ligase,
Join. (D) Inject the adapter-bound DNA solution for 3 minutes.
One is to cut the gel by electrophoresing the polyacrylamide gel as it is, or put it on a column of molecular sieves,
For example, a DNA molecule of 500 bp or more is purified. (E) The remaining two aliquots are treated with two restriction enzymes that recognize four base pairs and create sticky ends. (F) An unknown D fragmented by adding adapters (illustrated in [Example 2]) capable of binding to each sticky end
It binds to both ends of NA. At the original stump, the adapter was attached by the treatment already described under the item C, (Fig. 1). (G) The two aliquots to which the adapter is bound are electrophoresed on a polyacrylamide gel to cut out the gel or applied to a column of a molecular sieve to purify a DNA molecule of, for example, 500 bp or more. (H) The concentration of high-base-number DNA molecules is sufficiently increased, and US Pat.
A DNA is amplified using the method (PCR reaction) disclosed in JP 1-274697 A and JP 62-281 A). (H) By sufficiently increasing the concentration of the high nucleotide number DNA molecule, even if the DNA is amplified using the PCR reaction, only the low nucleotide number DNA is amplified and the high nucleotide number DNA molecule is confirmed. You can't say that you can't.

【０００５】本発明の中では、様々な酵素が使われてい
る。例えば制限酵素というのは、二重鎖ＤＮＡを特定の
塩基配列を認識して切断する細菌性酵素のことである。
T4ポリメレースというのは、Panet et al. Biochemistr
y 12巻5045-5050 頁にあるように、二重鎖ＤＮＡ末端を
平滑化するのに効果的に働き、E. coli ＤＮＡポリメレ
ース・クレノー断片も Klenow et al. Eur. J. Biochem
45巻371 頁にあるように、平滑化に働くほか、ＤＮＡ
複製に働く。この様な酵素は、何れも、安価にて入手可
能なものである。更に本発明の中で使われる、プライマ
ーも、ビューケージとカルサース法 （Tetrahedron Le
tters 22巻1859-1862頁 1981年）に従って、多孔ガラス
担体を固層カラムとして合成することが可能である。ア
ダプターも、相補的なオリゴヌクレオチドを加熱し徐々
に冷却することで、調整することが出来る。Various enzymes are used in the present invention. For example, a restriction enzyme is a bacterial enzyme that recognizes and cleaves a double-stranded DNA at a specific base sequence.
T4 Polymerase is Panet et al. Biochemistr
y 12: 5045-5050, it works effectively in blunting double-stranded DNA ends, and the E. coli DNA polymerase Klenow fragment also Klenow et al. Eur. J. Biochem.
As shown in Vol. 45, p. 371, it not only works for smoothing but also DNA
Works on replication. All such enzymes are available at low cost. Furthermore, the primer used in the present invention is also the view cage and the Calcers method (Tetrahedron Le
It is possible to synthesize a porous glass carrier as a solid-phase column according to tters 22: 1859-1862 1981). The adapter can also be adjusted by heating the complementary oligonucleotide and gradually cooling it.

【０００６】発明が解決しようとする課題の項目中に、
ＰＣＲ法では既知の塩基配列が二カ所にあれば、2000bp
ぐらいまでならばその間の部分のＤＮＡは試験管内で増
幅が可能であるとは書いたが、本発明の基本的方針にあ
る、様々なサイズの未知ＤＮＡ分子それぞれに対応し
て、既知の塩基配列を付加した場合には必ずしも当ては
まらない。2000bpまでも増幅可能なのは、テンプレート
になるＤＮＡ（２種のプライマーが相補的に結合できる
元のＤＮＡ分子）が、ＤＮＡ混液中にーカ所ないしは２
〜３カ所に限られているときである。ＰＣＲ反応で幾つ
もの増幅されたＤＮＡのバンドが電気泳導すると認めら
れる例がよく示されるが、プライマーの相補性が高い領
域が複数個ある場合である。本発明にあるように、プラ
イマーが結合する領域が多数ある場合は大きく状況が異
なる。まず、2000bpぐらいまでのＤＮＡ分子が増幅され
ていたものが、500bp を越える領域のＤＮＡ分子から増
幅されにくくなり、1000bp以上では不可能と思われる。
これは小さなＤＮＡ分子から大きなものまで、全てが同
じプライマーに相補的な領域を両端に有し、プライマー
や基質を競い合うとき、小さなＤＮＡが有利になり増幅
され易いためと考えられる。それ故、制限酵素による断
片化とアダプター結合の後、例えば500bp 以上のＤＮＡ
分子をアクリルアミドゲルで精製することにより、高塩
基数のテンプレートになるＤＮＡの濃度を上げた（ゲル
電気泳導による精製の精度は、米国特許No.4,683,195
日本では 特開昭61-274697号公報にあるＰＣＲ反応によ
る検出精度より遥かに低い）。もし低塩基数領域中にあ
るわずかのＤＮＡが失われるのを恐れるなら、例えば50
0bp 以下も精製してＰＣＲ反応を行えば良いが、高塩基
数領域のＤＮＡはほとんど増幅されない。例えば500bp
以上を精製してＰＣＲ反応を行えば、高塩基数領域に加
え、低塩基数領域も同時に増幅されてくる。In the items of the problem to be solved by the invention,
If there are two known nucleotide sequences in PCR, 2000bp
Although it was written that the DNA in the part between them can be amplified in vitro, the known base sequence corresponding to each unknown DNA molecule of various sizes, which is the basic principle of the present invention, is described. Is not always the case. It is possible to amplify up to 2000 bp because the template DNA (the original DNA molecule that can bind two kinds of primers in a complementary manner) is located in the DNA mixture at two or more positions.
It is when it is limited to 3 places. An example in which several bands of DNA amplified in a PCR reaction are recognized to be electrophoresed is often shown, but it is a case where there are a plurality of regions having high primer complementarity. As in the present invention, the situation is largely different when there are many regions to which the primer binds. First, a DNA molecule up to about 2000 bp has been amplified, but it becomes difficult to amplify from a DNA molecule in a region exceeding 500 bp, and it seems impossible at 1000 bp or more.
It is considered that this is because small DNA molecules to large ones all have regions complementary to the same primer at both ends, and when competing for primers and substrates, small DNA is advantageous and easily amplified. Therefore, after fragmentation with a restriction enzyme and adapter ligation, for example, DNA of 500 bp or more
By purifying the molecule with acrylamide gel, the concentration of DNA serving as a template having a high base number was increased (the accuracy of purification by gel electrophoresis is US Pat.
In Japan, it is much lower than the detection accuracy by the PCR reaction described in JP-A-61-274697). If you fear losing a small amount of DNA in the low nucleotide region, say 50
It is sufficient to purify 0 bp or less and perform PCR reaction, but DNA in the high nucleotide number region is hardly amplified. For example 500bp
If the above is purified and a PCR reaction is performed, a low base number region is simultaneously amplified in addition to a high base number region.

【０００７】米国特許 No.4,683,195 及び No.4,683,20
2（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭62-281号
公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、プライマ
ーは、リバースとフォワードのそれぞれは、違ったもの
として取り扱われていた。しかし、これは違った配列で
ある必要はなく、全く同じ物であっても構わないことが
分かり、本発明の中で利用されている。プライマーが安
定に相補的ＤＮＡ分子に付く温度のことを、アニーリン
グ温度と言うが、これはＧＣ含量に大きく依存する。塩
基配列が違えばこの温度も異なる。しかしプライマーが
リバースとフォワードとも同一であると、同一の温度で
二カ所に安定した相補的結合を作るので、理想的であ
る。適切なアダプター（実施例３では図３のアダプター
III やアダプターIV）を未知ＤＮＡの制限酵素処理前の
両端に結合するものに用いると、プライマーは（図１の
星印の付いた部分）一種類で、全てに対応するように仕
組むことが、可能である。US Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,20
In the method of 2 (published in JP-A-61-274697 and JP-A-62-281) in Japan (PCR reaction), the primer is treated as a different reverse and forward primer. Was there. However, it has been found that this does not have to be a different sequence, it can be the same one, and is utilized in the present invention. The temperature at which a primer stably attaches to a complementary DNA molecule is called the annealing temperature, which depends largely on the GC content. If the base sequence is different, this temperature is also different. However, it is ideal that the primer is the same in both reverse and forward, because it creates stable complementary bonds at two positions at the same temperature. Suitable adapter (in Example 3 the adapter of FIG. 3)
If III or adapter IV) is used for binding to both ends of unknown DNA before restriction enzyme treatment, one kind of primer (the part marked with an asterisk in Fig. 1) can be used and the primer can be designed to correspond to all. It is possible.

【０００８】[0008]

【作用】本申請中の発明は、ハイブリダイゼイション法
に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するものの、全
く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能にす
る。ハイブリダイゼイション法に使用するプローブは、
様々な大きさのＤＮＡを用いることが可能であるが、低
塩基数のＤＮＡで遺伝子を検出するのに十分役立ち、高
塩基数のＤＮＡであればあるほど扱いが難しくなる。組
織中のＤＮＡ分子を検出するのに用いる、インサイチュ
ウハイブリダイゼイション法では、50-200bpぐらいが望
ましい。それ故、４塩基対を認識して切断する制限酵素
で処理することにより、ＤＮＡ分子の256bp （４の４
剰）に一カ所の確率で切断されるので、非常に都合のい
いサイズの分子が得られる。大きすぎるサイズや、小さ
すぎるサイズに切断される部分が出来るが、２種類の４
塩基対を認識して切断する制限酵素で、分注したそれぞ
れを処理すると、相補的に補い合うので、大きなＤＮＡ
分子であってもその塩基配列のほとんどの部分は、ハイ
ブリダイゼイション法で検出する対照とすることが出来
る（実施例２を参照）。最終的に一つの目的とするＤＮ
Ａ分子が、本発明の処理を経たものから見つかったな
ら、遺伝子全体の塩基配列はcDNAライブラリーから再ク
ローニングすることで知ることが出来る。それ故４塩基
対を認識して切断する制限酵素で処理することは、本発
明の利点となっても、欠点とはならない。更に、ある細
胞からその細胞内で発現している遺伝子のライブラリー
を作るとき、わずかしか発現していない遺伝子をクロー
ニングするのは難しいが、発現遺伝子のｃＤＮＡを本発
明を用いて増幅することで、代わりにそのｃＤＮＡの一
部をクローニングする可能性を高める。According to the invention of the present application, although a DNA molecule is subdivided within the range applicable to the hybridization method, completely unknown DNA can be amplified in a test tube. The probe used for the hybridization method is
Although it is possible to use DNA of various sizes, it is sufficiently useful for detecting a gene with a low base number DNA, and the higher the base number DNA, the more difficult it is to handle. In the in situ hybridization method used to detect DNA molecules in tissues, about 50-200 bp is desirable. Therefore, by treating with a restriction enzyme that recognizes and cleaves 4 base pairs, 256 bp (4 of 4
Since it is cleaved with a single probability, the molecule of very convenient size can be obtained. There are some parts that are cut into too big or too small, but there are 2 types of 4
Treating each aliquot with a restriction enzyme that recognizes and cleaves base pairs complementarily complements each other.
Even if it is a molecule, most of its nucleotide sequence can be used as a control for detection by the hybridization method (see Example 2). Ultimately one objective DN
When the A molecule is found from the one that has undergone the treatment of the present invention, the nucleotide sequence of the entire gene can be known by recloning from the cDNA library. Therefore, treating with a restriction enzyme that recognizes and cleaves 4 base pairs does not become a drawback even if it is an advantage of the present invention. Furthermore, when making a library of genes that are expressed in a cell from a cell, it is difficult to clone a gene that is only slightly expressed, but it is possible to amplify the cDNA of the expressed gene using the present invention. , Instead, increase the likelihood of cloning a portion of that cDNA.

【０００９】本発明は、全く未知のＤＮＡ分子が微量し
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。The present invention may not maintain the abundance ratio when completely unknown DNA molecules are obtained in a trace amount and exist as a mixed solution of molecules of various sizes.
The whole was allowed to be amplified in vitro. Furthermore, the present invention provides a labeling method using a known primer, which enables efficient labeling if a labeling monomer (labeled dNTP) is used during DNA replication.

【００１０】[0010]

【実施例１】本実験は、低塩基数ＤＮＡの平滑末端にそ
のままアダプターを結合する場合でも、本特許申請内容
が有効に働くことを示すために行った。模擬実験とし
て、バクテリオファージΦΧ174ＤＮＡを制限酵素 HaeI
IIで切断したものを、未知ＤＮＡ分子と見なし、アダプ
ターＩ（図３）をファージＤＮＡの平滑末端に、T4リガ
ーゼを作用させることにより、結合した。ファージＤＮ
Ａの液にアダプターＩを0.1μM以下ではあるが、ファー
ジＤＮＡ濃度よりは十分に高い濃度になるように加え
る。この混合液にT4リガーゼを加え、アダプターとファ
ージＤＮＡ断片を結合する。このリガーゼによる結合で
は、アダプター合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けて
いないので、アダプター同士は同じ平滑末端を介しても
結合することはない。Example 1 This experiment was conducted to show that the contents of the present patent application work effectively even when an adapter is directly attached to the blunt end of a low nucleotide number DNA. As a simulation experiment, bacteriophage ΦΧ174 DNA was restricted with HaeI
Those cleaved with II were regarded as unknown DNA molecules, and adapter I (FIG. 3) was ligated to the blunt ends of phage DNA by the action of T4 ligase. Phage DN
Adapter I is added to solution A at a concentration of 0.1 μM or less, but sufficiently higher than the phage DNA concentration. T4 ligase is added to this mixed solution to bind the adapter to the phage DNA fragment. In this ligase ligation, a phosphate group is not attached to the 5′-terminal side during the synthesis of the adapter, so that the adapters do not bind to each other through the same blunt end.

【００１１】バクテリオファージΦΧ174 ＤＮＡを制限
酵素 HaeIIIで切断したものは、(1,353 1,078 872 6
03 310 281 271 234 194 118 72)の塩基数であ
る。アダプターＩは、（化１、化２）の２つのオリゴデ
オキシリボヌクレオチドより合成した。The bacteriophage ΦΧ174 DNA digested with the restriction enzyme HaeIII was (1,353 1,078 872 6
03 310 281 271 234 194 118 72). Adapter I was synthesized from two oligodeoxyribonucleotides (Chemical Formula 1 and Chemical Formula 2).

【００１２】[0012]

【化１】 [Chemical 1]

【００１３】[0013]

【化２】 [Chemical 2]

【００１４】オリゴヌクレオチド合成法 ビューケージとカルサース法（Tetrahedron Letters 22
巻1859-1862頁1981年）に従って、多孔ガラス担体を固
層カラムとして合成した。カラムからは、30%水酸化ア
ンモニウム溶液を注入し反応させ、カラムから生成物を
遊離させ、55℃で、一晩反応を進め、保護基を外す。濃
縮、沈澱、精製の処理後、260 nmの紫外光吸収度によ
り、その濃度を算出する。Oligonucleotide synthesis method View cage and Calcers method (Tetrahedron Letters 22
Vol. 1859-1862 (1981)), a porous glass carrier was synthesized as a solid phase column. From the column, 30% ammonium hydroxide solution is injected and reacted, the product is released from the column, the reaction is allowed to proceed overnight at 55 ° C., and the protecting group is removed. After the concentration, precipitation, and purification treatments, the concentration is calculated from the ultraviolet light absorbance at 260 nm.

【００１５】アダプターの合成法 精製されたオリゴヌクレオチド（化１）と（化２）の溶
液を等モル数量づつ混合し、一度95℃にまで加熱し、そ
の後緩やかに温度を室温にまで下げる。この段階で、オ
リゴヌクレオチド（化１）と（化２）は互いにハイブリ
ダイズし、二重鎖構造を持ったアダプターＩが調製され
る。Method for synthesizing adapters Purified oligonucleotides (Chemical Formula 1) and (Chemical Formula 2) solutions are mixed in equimolar amounts, once heated to 95 ° C., and then gradually cooled to room temperature. At this stage, the oligonucleotides (Chemical Formula 1) and (Chemical Formula 2) hybridize with each other to prepare an adapter I having a double-stranded structure.

【００１６】アダプターＩを結合したΦΧ174ＤＮＡの
混合物を、8%ポリアクリルアミドゲル電気泳導に掛ける
ことにより、500bp以上のＤＮＡ分子を精製した。増幅
のための準備が出来たかどうかを確かめる目的で、米国
特許 No. 4,683,195及び No.4,683,202（日本では特開
昭61-274697号公報及び特開昭62-281号公報にて公開
中）の方法（ＰＣＲ反応）で、精製前後のΦΧ174 ＤＮ
Ａをテンプレートとし、（化２）をプライマー、ＤＮＡ
合成酵素には TTHポリメレース（高度好熱菌ＤＮＡポリ
メレース）を用いて、増幅反応を試験管内で行った。テ
ンプレートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプタ
ーを結合し、ニックが入ったままの状態にあるので、Ｐ
ＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応に
より、ニックを除くステップを始めにおいた。The mixture of ΦΧ174 DNA to which adapter I was bound was subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis to purify DNA molecules of 500 bp or more. The method of U.S. Pat. Nos. 4,683,195 and 4,683,202 (published in JP-A-61-274697 and JP-A-62-281 in Japan) for the purpose of checking whether or not preparation for amplification is completed. (PCR reaction), Φ174174 DN before and after purification
A as a template, (Chemical Formula 2) as a primer, DNA
An amplification reaction was carried out in vitro using TTH polymerase (high thermophile DNA polymerase) as a synthase. The template DNA has an unphosphorylated 5'-end adapter bound to it and remains nicked.
The CR reaction cycle was initiated by the step of removing the nick by polymerizing reaction at 72 ° C for 1 minute.

【００１７】反応によって生成されたＤＮＡを8%ポリア
クリクアミドゲルで電気泳導し、増幅の程度を確かめた
（図２レーン２、３）。その結果、500bp 以上のＤＮＡ
分子を精製してテンプレートとしたものでは、500bp 以
上のＤＮＡ分子も増幅されていたが、500bp 以下のＤＮ
Ａ分子も効率よく増幅されていた。アクリルアミドゲル
による精製では、上記増幅反応でも増幅されないほどに
精度高く500bp 以下のＤＮＡ分子を除去出来なかったと
考えられる。The DNA produced by the reaction was electrophoresed on an 8% polyacrylamido gel to confirm the degree of amplification (Fig. 2, lanes 2 and 3). As a result, DNA of 500 bp or more
When the molecule was purified and used as a template, a DNA molecule of 500 bp or more was also amplified, but DN of 500 bp or less was used.
The A molecule was also efficiently amplified. It is considered that the purification by acrylamide gel could not remove the DNA molecule of 500 bp or less with high accuracy so that it was not amplified even in the above amplification reaction.

【００１８】実施例１により、1000bp以下の二重鎖ＤＮ
Ａ分子であるなら、両端にアダプターＩを結合し、ＰＣ
Ｒ反応に供する500bp 以上のテンプレートＤＮＡ分子濃
度を精製して高めることで、全体に均一ではないが増幅
可能であり、本特許申請内容の一部が、ＰＣＲ増幅反応
の前処理として有効に働くことが示された。According to Example 1, double-stranded DN of 1000 bp or less
If it is A molecule, connect adapter I to both ends and
By purifying and increasing the template DNA molecule concentration of 500 bp or more used in the R reaction, amplification is possible even though it is not uniform throughout, and part of the contents of this patent application works effectively as a pretreatment for the PCR amplification reaction. It has been shown.

【００１９】[0019]

【実施例２】本実験は、高塩基数ＤＮＡを制限酵素で、
細分化した際にも、本特許申請内容が有効に働くことを
示すために行った。模擬実験として、pUC19プラスミッ
ドＤＮＡを未知ＤＮＡ分子と見なし、制限酵素 Sau3AI
ないしはHapIIで切断し、アダプターII（図３）をＤＮ
Ａの粘着末端に、T4リガーゼを作用させることにより、
結合した。Example 2 In this experiment, high base number DNA was treated with a restriction enzyme,
This was done to show that the contents of this patent application work effectively even when subdivided. As a simulation experiment, pUC19 plasmid DNA was regarded as an unknown DNA molecule, and the restriction enzyme Sau3AI was used.
Or by cutting with HapII, and adapter II (Fig. 3) is DN
By making T4 ligase act on the sticky end of A,
Combined

【００２０】pUC19プラスミッドＤＮＡ （2,686bp の環
状ＤＮＡ）を、制限酵素 Sau3AIないしはHapII で切断
したものは、 Sau3AI : 955 585 341 258 141 105 78 75 46
36 18 17 12 11 8 HapII : 501 489 404 331 242 190 147 111 1
10 67 34 34 26 の様な、それぞれ14本と12本の二重鎖ＤＮＡ分子に分か
れる。このうち、100bp以下の大きさのＤＮＡ分子は、
ハイブリダイゼイション法のプローブとしても、クロー
ニングする対象物としても小さすぎる。しかし元のＤＮ
Ａを含む溶液を、二分注しておき、一方をSau3AIで、他
方をHapII で切断するならば、相補的に一方では、100b
p以下の分子に切断される部分も、他方では100bp以上の
分子内に含まれ、ハイブリダイゼイション法のためのプ
ローブなどに使用することが出来る。pUC19ＤＮＡ分子2
686bp のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下の
ＤＮＡ分子中に含まれてしまう部分はなかった（図
４）。When pUC19 plasmid DNA (2686 bp circular DNA) was cleaved with restriction enzymes Sau3AI or HapII, Sau3AI: 955 585 341 258 141 105 78 75 46
36 18 17 12 11 8 HapII: 501 489 404 331 242 190 147 111 1
It is divided into 14 and 12 double-stranded DNA molecules, respectively, such as 10 67 34 34 26. Of these, DNA molecules with a size of 100 bp or less
It is too small as a probe for the hybridization method and as an object to be cloned. But the original DN
If the solution containing A is aliquoted in two, and one is cleaved with Sau3AI and the other with HapII, complementary
On the other hand, a portion cleaved by a molecule of p or less is also contained in the molecule of 100 bp or more, and can be used as a probe for the hybridization method. pUC19 DNA molecule 2
Of the 686 bp, no portion was included in the DNA molecule of 100 bp or less by any restriction enzyme treatment (Fig. 4).

【００２１】ここで用いたアダプターは、図３に記した
が、一方の端が、Sau3AIの切断に依って出来る粘着末端
に相補的な配列の突出があり、他方の端はHapII の切断
に依って出来る粘着末端に相補的な配列の突出がある。
さらにこのアダプター内部にNotIの認識部位があるの
で、アダプター結合がクローニングの際にも役立つ。さ
らに米国特許 No. 4,683,195 及び No.4,683,202（日本
では特開昭61-274697 号公報及び特開昭62-281号公報に
て公開中）の方法（ＰＣＲ反応）で増幅したときには、
制限酵素 EcoRIの認識部位も出来るように工夫されてい
る（図３）。アダプターIIは、（化３、化４）の２つの
オリゴデオキシリボヌクレオチドより合成した。As shown in FIG. 3, the adapter used here has an overhang of a sequence complementary to the sticky end formed at one end by cleavage of Sau3AI, and the other end at the end of HapII cleavage. There is a complementary sequence overhang at the sticky end.
Furthermore, since the NotI recognition site is inside this adapter, adapter binding is also useful during cloning. Further, when amplified by the method (PCR reaction) of US Pat. Nos. 4,683,195 and No. 4,683,202 (published in JP 61-274697 and JP 62-281 in Japan),
The recognition site for the restriction enzyme EcoRI has also been devised (Fig. 3). Adapter II was synthesized from two oligodeoxyribonucleotides (Chemical Formula 3 and Chemical Formula 4).

【００２２】[0022]

【化３】 [Chemical 3]

【００２３】[0023]

【化４】 [Chemical 4]

【００２４】精製されたオリゴヌクレオチド（化３）と
（化４）の溶液を等モル数量ずつ混合し、一度95℃にま
で加熱し、その後緩やかに温度を室温にまで下げる。こ
の段階で、オリゴヌクレオチド（化３）と（化４）は互
いにハイブリダイズし、二重鎖構造を持ったアダプター
IIが調製される。The purified oligonucleotides (Chemical Formula 3) and (Chemical Formula 4) solutions are mixed in equimolar amounts, heated to 95 ° C. once, and then the temperature is gradually lowered to room temperature. At this stage, the oligonucleotides (Chemical Formula 3) and (Chemical Formula 4) hybridize with each other and have an adapter having a double-stranded structure.
II is prepared.

【００２５】HapII による切断の場合は、未知ＤＮＡは
アダプターIIのHapII 用粘着末端側で両側に結合する。
Sau3AIによる切断の場合は、未知ＤＮＡはアダプターII
のSau3AI用粘着末端側で両側に結合する（図３）。ＰＣ
Ｒ反応の際に必要とするプライマーは、HapII による切
断の場合は、どちらの方向の複製も（reverse andforwa
rd）同一のプライマー（化４）が働く。Sau3AI による
切断の場合は、どちらの方向の複製にも、同一のプライ
マー（化３）が働く。米国特許 No. 4,683,195及び No.
4,683,202（日本では特開昭61-274697号公報及び特開昭
62-281号公報にて公開中）の方法（ＰＣＲ反応）では、
双方向の複製に働くプライマーは、それぞれ異なったも
のとして記載されていたが、同一のものであってもその
増幅の効率は変わらないと思われた。増幅されたＤＮＡ
は、8%ポリアクリクアミドゲルに掛けて、図２のレーン
４〜８に示す（図２）。In the case of cleavage with HapII, unknown DNA binds to both sides at the HapII sticky end of adapter II.
In case of cleavage by Sau3AI, unknown DNA is adapter II
The Sau3AI cohesive end side is bonded to both sides (Fig. 3). PC
The primers required for the R reaction are such that in the case of cleavage with HapII, replication in either direction (reverse andforwa
rd) The same primer (Chemical Formula 4) works. In the case of cleavage with Sau3AI, the same primer (Chemical Formula 3) works for replication in either direction. U.S. Patent Nos. 4,683,195 and No.
4,683,202 (In Japan, JP-A-61-274697 and JP-A-6-274697
Published in 62-281)) (PCR reaction),
Although the primers working for bidirectional replication have been described as different from each other, it seems that the efficiency of amplification is the same even if they are the same. Amplified DNA
Are shown in lanes 4-8 of Figure 2 on an 8% polyacryamide gel (Figure 2).

【００２６】テンプレートＤＮＡには、非燐酸化5'末端
を持つアダプターを結合し、ニックが入ったままの状態
にあるので、ＰＣＲ反応サイクルには72℃で１分間ポリ
メレース反応により、ニックを除くステップを始めにお
いた。Since the template DNA is bound with an adapter having a non-phosphorylated 5'end and the nick is still present, a step of removing the nick by a polymerase reaction at 72 ° C. for 1 minute in the PCR reaction cycle. I started.

【００２７】[0027]

【実施例３】実際に、未知ＤＮＡ混合液で、実施例１、
実施例２を組み合わせて、増幅実験を行った。ラットの
脳の一領域を切り出し、この部分からｍＲＮＡを抽出し
て、ｃＤＮＡを合成した。ｍＲＮＡの抽出はPharmacia
P-L Biochemicals, Analects1988 16巻1- にある方法に
従い、ｃＤＮＡの合成は Gubler & Hoffman Gene,25
巻 263-269頁の方法に従った。ｃＤＮＡはＲＮＡ逆転写
酵素により、ｍＲＮＡにより合成され、ＲＮＡ，ＤＮＡ
ハイブリッドにＲＮａｓｅＨを作用させて切れ目を入
れ、ポリメレースＩとリガーゼにより二本鎖ＤＮＡにす
る、クレノーフラグメントによって、末端を平滑にし、
続いてGubler & Hoffmanの方法では、両端にリンカーを
付けるところを、代わりにアダプターＩ（図３）を結合
した。アダプターを0.1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ
濃度よりは十分に高い濃度になるように加える。この混
合液にT4リガーゼを加え、アダプターと未知ＤＮＡ断片
を結合する。このリガーゼによる結合では、アダプター
合成の際に、5'末端側に燐酸基を付けていないので、ア
ダプター同士は同じ平滑末端を介しても結合することは
ない。[Example 3] Actually, using an unknown DNA mixture, Example 1,
An amplification experiment was carried out by combining Example 2. A region of rat brain was cut out, mRNA was extracted from this region, and cDNA was synthesized. Extracting mRNA from Pharmacia
PL Biochemicals, Analects1988 Volume 16 1-cDNA synthesis according to Gubler & Hoffman Gene, 25
Volume 263-269 was followed. cDNA is synthesized from mRNA by RNA reverse transcriptase to produce RNA or DNA.
The RNase H was allowed to act on the hybrid to make a cut, and double ends DNA was formed by using Polymerase I and ligase. The Klenow fragment blunted the ends,
Subsequently, in the method of Gubler & Hoffman, adapters I (Fig. 3) were attached instead of linkers at both ends. Unknown DNA, even if the adapter is less than 0.1 μM
Add so that the concentration is sufficiently higher than the concentration. T4 ligase is added to this mixed solution to bind the adapter to the unknown DNA fragment. In this ligase ligation, a phosphate group is not attached to the 5′-terminal side during the synthesis of the adapter, so that the adapters do not bind to each other through the same blunt end.

【００２８】アダプターIの代わりに、制限酵素Sau3AI
で切断する分注分には、アダプターIII、HaeIII で切断
する分注分には、アダプターIV（図３）を結合すると、
ＰＣＲ反応の際のプライマーを一種類にすることができ
る。Instead of adapter I, the restriction enzyme Sau3AI
When the adapter III and HaeIII are combined with the adapter IV (Fig. 3),
One kind of primer can be used in the PCR reaction.

【００２９】４分注して、一つは保存し、一つはポリア
クリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイ
ズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。After being dispensed for 4 minutes, one was stored and the other was electrophoresed on a polyacrylamide gel to separate into DNA of 500 bp or more and DNA of the following size.

【００３０】残り二つの1/4量は、一方はSau3AI で他方
はHaeIIIという二種類の制限酵素でＤＮＡ分子を切断し
た。そして、それぞれの液にアダプターII（図３）を0.
1μM以下ではあるが、未知ＤＮＡ濃度よりは十分に高い
濃度になるように加える。この混合液にT4リガーゼを加
え、アダプターと未知ＤＮＡ断片を結合する。このリガ
ーゼによる結合では、アダプター合成の際に、5'末端側
に燐酸基を付けていないので、アダプター同士は相補的
な粘着末端を介しても結合することはない。The remaining 1/4 amount was obtained by cleaving the DNA molecule with two restriction enzymes, one of which was Sau3AI and the other of which was HaeIII. Then, add Adapter II (Fig. 3) to each solution.
Add 1 μM or less, but add a concentration that is sufficiently higher than the unknown DNA concentration. T4 ligase is added to this mixed solution to bind the adapter to the unknown DNA fragment. In this ligation, a phosphate group is not attached to the 5′-terminal side during the synthesis of the adapter, so that the adapters do not bind to each other even through the complementary sticky ends.

【００３１】アダプターを結合した未知ＤＮＡは、ポリ
アクリルアミドゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサ
イズのＤＮＡと以下のサイズのものとに分離した。The unknown DNA to which the adapter was bound was electrophoresed on a polyacrylamide gel and separated into DNA of 500 bp or more and DNA of the following size.

【００３２】それぞれの分注分で、直接及び、低塩基数
ＤＮＡ精製分、高塩基数ＤＮＡ精製分から、ＰＣＲ反応
のテンプレートとして一部を取り、（化３）ないし（化
４）をプライマーとしてＰＣＲ反応を行った。テンプレ
ートＤＮＡには、非燐酸化5'末端を持つアダプターを結
合し、ニックが入ったままの状態にあるので、ＰＣＲ反
応サイクルには72℃で１分間ポリメレース反応により、
ニックを除くステップを始めにおいた。In each of the aliquots, a portion was taken as a template for the PCR reaction directly from the purified DNA having a low base number and the purified DNA having a high base number, and PCR was performed using (Chemical Formula 3) to (Chemical Formula 4) as primers. The reaction was carried out. The template DNA has an unphosphorylated 5'end attached to the adapter, and the nick is still present. Therefore, the PCR reaction cycle is carried out at 72 ° C for 1 minute by the polymerase reaction.
I started the steps except Nick.

【００３３】ＰＣＲ反応産物を再びポリアクリルアミド
ゲルにかけて電気泳導し500bp 以上のサイズのＤＮＡを
得てテンプレートＤＮＡとして使用することもできる
が、できれば元の精製した溶液を使うことが望ましい。
ＰＣＲ反応を繰り返している間に、溶液中に含まれる分
子の多様性が失われて行くことが考えられるからであ
る。The PCR reaction product can be electrophoresed again on a polyacrylamide gel to obtain a DNA having a size of 500 bp or more, which can be used as a template DNA, but it is preferable to use the original purified solution if possible.
This is because the diversity of molecules contained in the solution may be lost during the repeated PCR reaction.

【００３４】増幅された反応産物を、同じく8%ポリアク
リルアミドゲルにかけて図５に示す。The amplified reaction product was also run on an 8% polyacrylamide gel and is shown in FIG.

【００３５】[0035]

【発明の効果】［実施例１］から［実施例３］において
示された様に、本申請中の発明は、ハイブリダイゼイシ
ョン法に使用可能な範囲でＤＮＡ分子を細分化するもの
の、全く未知のＤＮＡを試験管内で増幅することを可能
にした。更に、ある細胞からその細胞内で発現している
遺伝子のライブラリーを作るとき、わずかしか発現して
いない遺伝子をクローニングするのは難しいが、発現遺
伝子のｃＤＮＡを本発明をもちいて増幅することで、代
わりにそのｃＤＮＡの一部をクローニングする可能性を
高める。INDUSTRIAL APPLICABILITY As shown in [Example 1] to [Example 3], although the invention of the present application subdivides a DNA molecule within the range applicable to the hybridization method, It allowed unknown DNA to be amplified in vitro. Furthermore, when making a library of genes that are expressed in a cell from a cell, it is difficult to clone a gene that is only slightly expressed, but it is possible to amplify the cDNA of the expressed gene by using the present invention. , Instead, increase the likelihood of cloning a portion of that cDNA.

【００３６】本発明は、全く未知のＤＮＡ分子が微量し
か獲られず、かつ様々なサイズの分子の混合液として存
在するとき、存在比率は維持できないかも知れないが、
その全体を試験管内で増幅することを可能にした。さら
にＤＮＡ複製の時に標識モノマー（標識dNTP）を用いる
ならば、効率よく標識出来る、既知のプライマーを使っ
た標識法を提供するものである。The present invention may not maintain the abundance ratio when completely unknown DNA molecules are obtained in a trace amount and exist as a mixed solution of molecules of various sizes.
The whole was allowed to be amplified in vitro. Furthermore, the present invention provides a labeling method using a known primer, which enables efficient labeling if a labeling monomer (labeled dNTP) is used during DNA replication.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】未知ＤＮＡを増幅するための準備過程の、総合
した模式図。図にあるアダプターI とIIは、図３にその
実際例を示す。星印を付けたオリゴヌクレオチドは、Ｐ
ＣＲ増幅の際のプライマーとなる部分を示す。FIG. 1 is an overall schematic diagram of a preparation process for amplifying unknown DNA. The adapters I and II in the figure show a practical example in FIG. Oligonucleotides with a star are P
The part which becomes a primer at the time of CR amplification is shown.

【図２】実施例１、実施例２の準備処理後、ＰＣＲ増幅
を行ったＤＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気
泳導したもの。左の数は塩基数(bp)を示す。アダプター
を付け、高塩基数領域を精製したものをテンプレートＤ
ＮＡに用いたときに、より高塩基数領域まで増幅するこ
とが出来た。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳導で高塩基数領域を
精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン３：ΦΧ174 ＤＮＡを制限酵素 HaeIIIで切断し
たものにアダプターIを付け電気泳動せずにＰＣＲ増幅
を行ったＤＮＡ混液 レーン４：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導せず直接ＰＣ
Ｒ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で高塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：pUC19プラスミッドＤＮＡを、Sau3AI で切断
したものにアダプターIIを付け、電気泳導で低塩基数領
域を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液FIG. 2 shows a DNA mixture obtained by PCR amplification after performing the preparatory treatments of Examples 1 and 2 on an 8% acrylamide gel. The number on the left indicates the number of bases (bp). Template D was prepared by purifying the high base number region with an adapter.
When used for NA, amplification was possible up to a higher base number region. Lane 1: Marker (Bacteriophage Φ174174 DN
A digested with A restriction enzyme HaeIII) Lane 2: DNA mixture prepared by PCR amplification after purifying the high nucleotide region by electrophoresis with adapter I attached to Φ174 DNA digested with a restriction enzyme HaeIII. : DNA mixture obtained by PCR amplification of Φ174 DNA cleaved with restriction enzyme HaeIII with adapter I and without electrophoresis Lane 4: pUC19 plasmid DNA cleaved with Sau3AI with adapter II DNA mixture obtained by purifying the high base number region by PCR and performing PCR amplification Lane 5: pUC19 plasmid DNA was cleaved with Sau3AI and attached with adapter II, and the low base number region was purified by electrophoresis to perform PCR. Amplified DNA mixture lane 6: pUC19 plasmid DNA cleaved with Sau3AI was attached with adapter II, and PC was used directly without swimming.
R-amplified DNA mixture lane 7: pUC19 plasmid DNA digested with Sau3AI and attached to adapter II, and purified by PCR to obtain a high nucleotide number region DNA mixture lane 8: pUC19 A DNA mixture obtained by cutting plasmid DNA with Sau3AI, attaching adapter II, purifying the low nucleotide number region by electrophoresis, and performing PCR amplification

【図３】実施例１、実施例２、実施例３にて使用した、
アダプターの構造を示す図。破線の囲みは、制限酵素No
tIの認識部位。FIG. 3 was used in Example 1, Example 2 and Example 3,
The figure which shows the structure of an adapter. Enclosed by broken line is restriction enzyme No.
Recognition site of tI.

【図４】pUC19 を、制限酵素Sau3AIないしはHaeIIIで切
断した時の、制限酵素切断地図。pUC19ＤＮＡ分子2686b
p のうち、いずれの制限酵素処理でも100bp 以下のＤＮ
Ａ分子中に含まれてしまう部分はなく、ハイブリダイゼ
イション法のための対象領域になり得ることを示す。FIG. 4 is a restriction enzyme digestion map when pUC19 was digested with restriction enzymes Sau3AI or HaeIII. pUC19 DNA molecule 2686b
DN of 100 bp or less by treatment with any of the restriction enzymes
It shows that there is no part included in the A molecule and that it can be a target region for the hybridization method.

【図５】実施例３の準備処理後、ＰＣＲ増幅を行ったＤ
ＮＡ混液を、8%アクリルアミドゲルにて電気泳導したも
の。左の数は塩基数(bp)を示す。何れの例でも、高塩基
数領域を精製してＰＣＲ増幅したもので、相対的により
高塩基数領域までの増幅がみられた。精製せずに直接Ｐ
ＣＲ増幅したものと、低塩基数領域を精製してＰＣＲ増
幅したものでは、相対的に同様の低塩基数領域のＤＮＡ
が増幅されてきた。 レーン１：マーカー（バクテリオファージΦΧ174 ＤＮ
Ａを制限酵素 HaeIIIで切 断したもの） レーン２：ラットの脳の一部から取ったmRNAより二重鎖
cDNAを得て、アダプターＩを付け、直接ＰＣＲ増幅を行
ったＤＮＡ混液 レーン３：同cDNAにアダプターＩを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン４：同cDNAにアダプターＩを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン５：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン６：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン７：同cDNAにアダプターＩを付け、Sau3AI制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領域
(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン８：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、直接ＰＣＲ増
幅を行ったＤＮＡ混液 レーン９：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限酵
素処理をし、さらにアダプターIIを付け、高塩基数領域
(500 bp以上)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混液 レーン１０：同cDNAにアダプターＩを付け、HapII 制限
酵素処理をし、さらにアダプターIIを付け、低塩基数領
域(500 bp以下)を精製してＰＣＲ増幅を行ったＤＮＡ混
液FIG. 5: D subjected to PCR amplification after the preparation treatment of Example 3
An NA mixture was electrophoresed on an 8% acrylamide gel. The number on the left indicates the number of bases (bp). In both cases, the high base number region was purified and PCR-amplified, and amplification up to the relatively high base number region was observed. Direct P without purification
In the case of CR-amplified and the PCR-amplified by purifying the low nucleotide number region, relatively similar low nucleotide number region DNA
Has been amplified. Lane 1: Marker (Bacteriophage Φ174174 DN
(A is cut with a restriction enzyme HaeIII) Lane 2: Double strand from mRNA taken from a part of rat brain
DNA mixture obtained by obtaining cDNA, attaching adapter I and performing direct PCR amplification Lane 3: Attaching adapter I to the same cDNA, high base number region
DNA mixture obtained by purifying (500 bp or more) and performing PCR amplification Lane 4: Adapter I was attached to the same cDNA to give a low nucleotide number region
DNA mixture containing purified (500 bp or less) and PCR-amplified lane 5: DNA mixture containing the same cDNA with adapter I, treated with Sau3AI restriction enzyme, and further with adapter II, and subjected to direct PCR amplification lane 6 : Adapter I attached to the same cDNA, treated with Sau3AI restriction enzyme, and then attached to adapter II, high nucleotide region
DNA mixture obtained by purifying (500 bp or more) and performing PCR amplification Lane 7: Adapter I was attached to the same cDNA, Sau3AI restriction enzyme treatment was performed, and adapter II was further attached to the low nucleotide region.
DNA mixture obtained by purifying (less than 500 bp) and subjected to PCR amplification Lane 8: DNA mixture obtained by carrying out direct PCR amplification by attaching adapter I to the same cDNA, HapII restriction enzyme treatment, and further attaching adapter II. : Adapter I was attached to the same cDNA, HapII restriction enzyme treatment was performed, and adapter II was further attached to the high nucleotide region
DNA mixture obtained by purifying (500 bp or more) and PCR-amplifying lane 10: adapter I was attached to the same cDNA, HapII restriction enzyme treatment was performed, and adapter II was further attached to the low nucleotide region (500 bp or less). Purified and PCR-amplified DNA mixture

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 微量にしか得ることの出来ない、未知二
重鎖ＤＮＡ分子の両端を、酵素処理により平滑末端と
し、適切な大きさのアダプターを結合して、分子両端部
に既知領域を作る。含まれる高塩基数ＤＮＡ分子につい
ては細分化する目的で、２種以上の、ＤＮＡ鎖途中の４
塩基対を認識し粘着末端を作る制限酵素で、分注した溶
液中のＤＮＡをそれぞれ切断し、その粘着末端に結合で
きる適切な大きさのアダプターを結合して分子両端部に
既知領域を作る。この未知ＤＮＡ分子末端に作られた既
知領域に対するプライマーを用い、既存のＤＮＡ試験管
内増幅法を活用できるように準備する方法。1. An unknown double-stranded DNA molecule, which can be obtained only in a trace amount, is blunt-ended by enzymatic treatment at both ends, and an adapter of an appropriate size is bound to create known regions at both ends of the molecule. . For the purpose of subdividing the high-base-number DNA molecules contained, two or more kinds of 4 in the middle of the DNA chain
Each of the DNAs in the dispensed solution is cleaved with a restriction enzyme that recognizes a base pair to form a sticky end, and an adapter of an appropriate size capable of binding to the sticky end is bound to form known regions at both ends of the molecule. A method of using the primer for the known region created at the end of this unknown DNA molecule so that the existing DNA in vitro amplification method can be utilized. 【請求項２】 微量にしか得ることの出来ない、未知二
重鎖ＤＮＡ分子の両端の３’端に、同種塩基を重合させ
る酵素を用い、分子両端部に既知領域を作る。以降［請
求項１］の制限酵素処理以下の操作をする方法。2. A known region is created at both ends of an unknown double-stranded DNA molecule, which can be obtained only in a trace amount, by using an enzyme that polymerizes a homologous base at the 3'end of each end. Thereafter, a method for performing the following operations of restriction enzyme treatment according to [claim 1]. 【請求項３】 ［請求項１］［請求項２］にある方法
で、ＤＮＡ分子両端部に既知領域を作り、既知領域に対
するプライマー及び標識モノマー（標識dNTP）を用い
て、未知二重鎖ＤＮＡを標識する方法。3. An unknown double-stranded DNA is prepared by forming known regions at both ends of a DNA molecule by the method according to [1] and [2] and using a primer and a labeling monomer (labeled dNTP) for the known regions. How to label. 【請求項４】 微量未知ＤＮＡ分子を増幅する準備をす
るキットであって、（A）未知ＤＮＡの平滑末端に結合
するためのアダプター一種を入れたコンテナー、（B）
結合試薬を入れたコンテナー、（C）２種の粘着末端を
作る制限酵素を入れたコンテナー、（D）制限酵素によ
って出来た粘着末端に結合するアダプターを入れたコン
テナー、（E）上記のアダプターを構成し、増幅反応
や、標識反応のときのプライマーにな るオリゴヌ
クレオチドを入れたコンテナー、少なくとも以上のもの
を有するパッケージタイプの多コンテナー型ユニットか
ら成るキット。4. A kit for preparing to amplify a trace amount of unknown DNA molecule, (A) a container containing one kind of adapter for binding to a blunt end of unknown DNA, (B)
A container containing a binding reagent, (C) a container containing a restriction enzyme that creates two types of sticky ends, (D) a container containing an adapter that binds to a sticky end made by a restriction enzyme, (E) the above adapter A kit consisting of a container containing an oligonucleotide that serves as a primer for amplification reactions and labeling reactions, and a package-type multi-container unit having at least the above.