JPH06138123A - Enzyme-labeling complex using small granulated hbs antigen and detecting method for hbs antibody using complex - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide an enzyme-labeling HBs antigen complex, which can label enzyme stably without imparing antigenicity and which is suitable for use in the enzyme-immunity measuring method (EIA) for HBs antibody. CONSTITUTION:In a sandwich enzyme-immunity measuring method for an enzyme-labeling HBs antigen complex and HBS antibody, an enzyme labeling is provided for the small granulated HBs antigen that is obtained by cleaving the-SS-group of the HBs antigen. This is the characteristic of the method. In this method, the above described enzyme-labeling HBs antigen complex is used as the enzyme-labeling HBs antigen complex.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、一般に、血液中のＨＢ
ｓ抗体の検出法に関する。さらに詳しくは、ＨＢｓ抗原
の−ＳＳ−結合を開裂して得られる小粒子化ＨＢｓ抗原
を酵素標識したことを特徴とする酵素標識ＨＢｓ抗原複
合体、および該複合体を用いたＨＢｓ抗体の酵素免疫測
定法(ＥＩＡ)に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention generally relates to HB in blood.
s antibody detection method. More specifically, an enzyme-labeled HBs-antigen complex characterized by enzymatically labeling a small-particle HBs-antigen obtained by cleaving the -SS- bond of the HBs-antigen, and enzyme immunization of an HBs antibody using the complex. Measurement method (EIA).

【０００２】[0002]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｂ型
肝炎ウイルス(以下、「ＨＢＶ」ともいう)は一般にデー
ン粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスであり、主要感
染経路は母子感染および血液等の体液を介する経路であ
る。ＨＢＶの感染は肝炎と関連することが知られてい
る。ＨＢＶ感染時の患者血液中には、直径４２ｎｍの上
記デーン粒子の他に直径２２ｎｍの小型球状粒子あるい
は同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍの管状粒子が存在す
る。ＨＢＶは直径２７ｎｍのコア粒子と厚さ７ｎｍの外
層の二層構造からなっており、コア粒子中には一部に一
本鎖ギャップを有する環状二本鎖ＤＮＡ(約３２００塩
基対)、ＤＮＡポリメラーゼ、プロテインキナーゼ等が
含まれる。BACKGROUND OF THE INVENTION Hepatitis B virus (hereinafter also referred to as "HBV") is a double-stranded DNA virus generally called Dane particle, and the main routes of infection are mother-to-child infection and blood and the like. It is a route through body fluids. HBV infection is known to be associated with hepatitis. In the blood of a patient at the time of HBV infection, in addition to the Dane particles having a diameter of 42 nm, small spherical particles having a diameter of 22 nm or tubular particles having the same outer diameter and a length of 50 to 700 nm are present. HBV consists of a two-layer structure consisting of a core particle with a diameter of 27 nm and an outer layer with a thickness of 7 nm. A circular double-stranded DNA (about 3200 base pairs) with a single-stranded gap in a part of the core particle, DNA polymerase , Protein kinases and the like.

【０００３】ＨＢＶの抗原としては、ＨＢＶの外被(sur
face)、芯(core)に対応して表面抗原(ＨＢｓ抗原)、核
抗原(ＨＢｃ抗原)、さらにＨＢｅ抗原があり、これら抗
原の血液中の出現・消失はＨＢＶの感染を受けた場合の
臨床経過の有力なマーカーとなることが知られている。
たとえば、ＨＢｓ抗原が血液中に存在するのは現在感染
していることを示し、ＨＢｅ抗原の存在は多数のＨＢＶ
の存在を示唆し、肝炎を発症している場合には活動性肝
炎である場合が多い。なお、ＨＢｃ抗原は単独では血液
中に存在せず、ＨＢｓ抗原に包まれて存在するので一般
には測定されない。As an antigen of HBV, the HBV envelope (sur
There are surface antigens (HBs antigens), nuclear antigens (HBc antigens), and HBe antigens corresponding to the face and the core, and the appearance and disappearance of these antigens in the blood is clinical in the case of HBV infection. It is known to be a powerful marker of progress.
For example, the presence of HBsAg in the blood indicates that it is currently infected, and the presence of HBeAg indicates a large number of HBVs.
If there is hepatitis, it is often active hepatitis. The HBc antigen does not exist alone in the blood, but is present in the HBs antigen and is not generally measured.

【０００４】一方、上記各抗原に対する抗体(ＨＢｓ抗
体、ＨＢｃ抗体、ＨＢｅ抗体)の変動も診断上重要であ
る。たとえば、ＨＢｓ抗体の存在は、原則的にはＨＢＶ
感染を経過しＨＢＶが過去に排除されたことを示すもの
で、再感染がないことを示すものである。ＨＢｃ抗体
は、ＨＢＶが関連した肝細胞破壊の結果として血液中に
出現する。ＩｇＭタイプの抗体はＢ型急性肝炎で出現
し、高値になることが多いためＢ型急性肝炎の診断に用
いられる。ＩｇＧタイプの抗体は、持続感染中であるか
感染終息期であることを示している。ＨＢｅ抗体の出現
はＨＢＶ産生を示しており、鎮静化の傾向にあることを
意味している。On the other hand, fluctuations in antibodies (HBs antibody, HBc antibody, HBe antibody) against each of the above antigens are also important for diagnosis. For example, the presence of HBs antibodies is, in principle, HBV
This indicates that HBV has been eliminated in the past after passing infection, and that there is no reinfection. HBc antibodies appear in the blood as a result of HBV-associated hepatocyte destruction. IgM type antibodies appear in acute hepatitis B and often have high values, and are therefore used for diagnosis of acute hepatitis B. IgG type antibodies have been shown to be in persistent infection or at the end of infection. The appearance of HBe antibody indicates HBV production, which means that it tends to be sedated.

【０００５】従って、血中ＨＢｓ抗体の測定は、上記の
ようにＨＢＶ感染の場合に再感染のおそれがないことの
確認となる。また、ＨＢＶ感染予防ワクチン投与後に血
中ＨＢｓ抗体が検出されることは、能動免疫が成立した
ことを意味し、今後ＨＢＶ感染の危険性のないことを示
している。このようにＨＢｓ抗体の測定は、ＨＢＶの感
染の有無を知ることやワクチン投与後の効果の判定に有
用である。Therefore, the measurement of blood HBs antibody confirms that there is no risk of reinfection in the case of HBV infection as described above. Further, the detection of HBs antibody in blood after administration of a vaccine for preventing HBV infection means that active immunity has been established, which indicates that there is no risk of HBV infection in the future. As described above, the measurement of HBs antibody is useful for knowing the presence or absence of HBV infection and for determining the effect after vaccination.

【０００６】血液中の抗体の定量的測定法としては、抗
原・抗体反応を利用し、標識物として酵素を用いた酵素
免疫測定法(ＥＩＡ)が一般的に用いられている。ＥＩＡ
の１態様であるサンドイッチアッセイ法を例にとってＨ
Ｂｓ抗体測定法の手順を説明すると、まず精製したＨＢ
ｓ抗原を不溶性の支持体(たとえば、マイクロタイター
プレートのウエル内壁やビーズ等)に固定化する。つい
で、これに検査の対象となるＨＢｓ抗体含有サンプルを
分注し、固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ抗体の結合体を形成
させる。ついで洗浄し、この結合体に酵素標識したＨＢ
ｓ抗原を加えて固定化ＨＢｓ抗原−ＨＢｓ抗体−酵素標
識ＨＢｓ抗原の免疫複合体を生成させる。これを洗浄
後、基質を加え、標識酵素の活性により分解される基質
の反応を検出することにより測定を行う。上記サンドイ
ッチ法の他に、サンプルと酵素標識抗原とを先に反応さ
せてから固定化抗原を加える逆サンドイッチ法も用いら
れる。さらに、これら２ステップサンドイッチ法の代わ
りに、サンプル、酵素標識抗原および固定化抗原を同時
に加える１ステップサンドイッチ法も用いられる。[0006] As a quantitative measuring method of antibodies in blood, an enzyme immunoassay method (EIA) utilizing an antigen-antibody reaction and using an enzyme as a label is generally used. EIA
Taking the sandwich assay method which is one embodiment of
To explain the procedure for the Bs antibody measurement method, first, purified HB
The s antigen is immobilized on an insoluble support (for example, the inner wall of the well of a microtiter plate or beads). Then, the HBs antibody-containing sample to be tested is dispensed to form a bound HBs antigen-HBs antibody conjugate. It was then washed and the conjugate was enzymatically labeled HB
The s-antigen is added to generate an immune complex of immobilized HBs antigen-HBs antibody-enzyme-labeled HBs antigen. After washing this, a substrate is added and the reaction of the substrate decomposed by the activity of the labeling enzyme is detected to perform the measurement. In addition to the above sandwich method, a reverse sandwich method in which a sample and an enzyme-labeled antigen are first reacted and then an immobilized antigen is added is also used. Furthermore, instead of these two-step sandwich methods, a one-step sandwich method in which a sample, an enzyme-labeled antigen and an immobilized antigen are added simultaneously is also used.

【０００７】上記ＥＩＡにおいて不可欠な酵素標識抗原
を作製するには幾つかの問題点がある。まず、抗原や抗
体等のタンパク質に酵素を結合させるために化学的な処
理(過ヨウ素酸酸化法等)を行うと、一般に抗原あるいは
酵素の活性が失われたり、不必要な重合体を生じたりす
る場合がある。このような欠点を回避するために二価性
架橋剤を用いた直接酵素標識法が開発されたが、抗原と
酵素とがともに分子量が大きく、これらを反応させる場
合には両者の濃度を上げる必要があり、さらに、少しの
条件の変化が標識体の性質に影響し、再現性が悪いとい
う欠点が指摘されている。従って、ＨＢｓ抗原のように
分子量が２００万〜４００万という高分子量の高分子凝
集複合体(タンパク質、糖質、脂質からなる)の場合、酵
素との結合が可能な濃度に抗原を溶解するには界面活性
剤を多量に使用する必要があるが、このような条件下で
は多くの酵素が失活してしまうため、現在のところ直接
酵素標識法によっては標識体は得られていない。There are some problems in producing the enzyme-labeled antigen which is essential in the EIA. First, when chemical treatment (periodic acid oxidation method, etc.) is performed to bind an enzyme to a protein such as an antigen or an antibody, the activity of the antigen or the enzyme is generally lost, or an unnecessary polymer is produced. There is a case. In order to avoid such drawbacks, a direct enzyme labeling method using a divalent cross-linking agent was developed, but both the antigen and the enzyme have large molecular weights, and it is necessary to increase the concentration of both when reacting them. In addition, it has been pointed out that a slight change in conditions affects the properties of the labeled substance, resulting in poor reproducibility. Therefore, in the case of a high-molecular-weight macromolecular aggregation complex (comprising proteins, sugars, and lipids) with a molecular weight of 2 to 4 million, such as HBs antigen, it is necessary to dissolve the antigen at a concentration capable of binding with an enzyme. Requires the use of a large amount of a surfactant, but many enzymes are inactivated under such conditions, and thus a label has not been obtained by the direct enzyme labeling method at present.

【０００８】また、このような高分子量の分子の反応に
伴う問題を解決するため、抗体の抗原認識部位であるエ
ピトープのペプチドを合成または抗原の分解によって
得、これを抗原として用いる方法も開発されている。た
とえば、合成または遺伝子組換えによって得たペプチド
やポリペプチドをワクチン作製に用いる技術が開発され
ている(特開昭６０−２２０９８、特開昭６３−１８８
６３０、特開昭６３−４５２２７)。しかしながら、多
くの場合、認識部位にリジンやシステインのような酵素
標識中に反応に関与するアミノ酸が含まれており、さら
に、このようにサイズを小さくした部位が酵素で標識さ
れる場合、立体障害により抗原性が損なわれる可能性が
高くなり、これら方法にも限界がある。In order to solve the problem associated with the reaction of such a high molecular weight molecule, a method has been developed in which a peptide of an epitope, which is the antigen recognition site of an antibody, is obtained by synthesis or decomposition of the antigen and is used as the antigen. ing. For example, a technique of using a peptide or polypeptide obtained by synthesis or gene recombination for vaccine production has been developed (JP-A-60-22098, JP-A-63-188).
630, JP-A-63-45227). However, in many cases, the recognition site contains an amino acid involved in the reaction in the enzyme label such as lysine or cysteine, and further, when such a reduced size site is labeled with an enzyme, steric hindrance occurs. Therefore, there is a high possibility that the antigenicity is impaired, and these methods have limitations.

【０００９】さらに、酵素標識の代わりに蛍光物質や発
光物質を抗原やペプチド等に直接標識する方法も考えら
れているが、この場合もリジンやシステインが認識部位
に含まれるペプチド等においては上記欠点があり、不適
当である。以上のように、ＨＢｓ抗原に酵素を直接標識
するのは困難であるため、様々な工夫がなされている。
たとえば、その一つとして、ゲスドン(Ｇuesdon)らの
Ｊ.Ｈistochem.Ｃytochem.,Ｖol.２７、Ｎo.８、１１３
１〜１１３９(１９７９)に記載されているビオチン標識
体と酵素標識アビジンを用いたアビジン・ビオチン架橋
法の一つである標識アビジン−ビオチン法(Ｌabelled
Ａvidin−Ｂiotin 法；以下、「ＬＡＢ法」と称する)を１
ステップサンドイッチ法に応用できる。しかしながら、
アビジンやストレプトアビジン、その他の誘導体を標識
する酵素がβ−ガラクトシダーゼのような高分子の場合
(β−ガラクトシダーゼの分子量は約５４万)、たとえＨ
Ｂｓ抗原のビオチン化にアームの長い試薬を用いたとし
ても、β−ガラクトシダーゼ標識アビジンまたはストレ
プトアビジンの誘導体とビオチン化ＨＢｓ抗原との間で
酵素標識複合体は生成されない。これはＨＢｓ抗原とβ
−ガラクトシダーゼとが共に高分子であるため、抗原、
酵素、アビジン、ビオチン間で立体的要因によりアビジ
ン・ビオチン結合が阻害されているためと考えられる。Further, a method of directly labeling an antigen, a peptide or the like with a fluorescent substance or a luminescent substance instead of the enzyme label has been considered, but in this case also, the above-mentioned drawbacks are caused in the peptide etc. in which lysine or cysteine is contained in the recognition site. There is, and it is inappropriate. As described above, since it is difficult to directly label the HBs antigen with an enzyme, various measures have been taken.
For example, as one of them, Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem., Vol. 27, No. 8, 113.
1-1139 (1979), the labeled avidin-biotin method (Labeled biotin method, which is one of the avidin-biotin cross-linking methods using the biotin-labeled body and the enzyme-labeled avidin.
Avidin-Biotin method; hereinafter referred to as "LAB method") 1
It can be applied to the step sandwich method. However,
When the enzyme that labels avidin, streptavidin, and other derivatives is a polymer such as β-galactosidase
(The molecular weight of β-galactosidase is about 540,000), even if H
Even if a long-armed reagent is used for biotinylation of the Bs antigen, no enzyme-labeled complex is formed between the β-galactosidase-labeled avidin or streptavidin derivative and the biotinylated HBs antigen. This is HBs antigen and β
-Because both galactosidase and the macromolecule are macromolecules,
It is considered that the avidin-biotin bond is inhibited by a steric factor between the enzyme, avidin and biotin.

【００１０】このような立体障害を解消する手段も開発
されている。すなわち、酵素標識アビジンまたはストレ
プトアビジン、その他の誘導体の代わりにビオチンに対
する抗体(ビオチン抗体)を酵素標識して用いる方法であ
る(特開昭６０−２５０２５７)。しかしながら、抗原抗
体反応を利用して抗原の酵素標識をしているため用時調
製の必要があり、アビジン・ビオチン複合体のように予
め酵素標識複合体を形成させ、１ステップサンドイッチ
法に用いることは困難である。Means for eliminating such steric hindrance have also been developed. That is, it is a method in which an antibody against biotin (biotin antibody) is enzyme-labeled and used in place of enzyme-labeled avidin, streptavidin, or other derivative (JP-A-60-250257). However, since the antigen is labeled with an enzyme by using the antigen-antibody reaction, it needs to be prepared before use. It is necessary to form an enzyme-labeled complex in advance like the avidin-biotin complex and use it in the one-step sandwich method. It is difficult.

【００１１】また、二価性架橋剤を組み合わせてＨＢｓ
抗原と酵素間のアームを長くし、酵素標識抗原複合体を
得ようとする技術も開発されている(特開平２−２４７
５６５)。この方法では、抗原のアミノ基にヘテロ二価
性架橋剤でマレイミド基を導入し、酵素のペルオキシダ
ーゼ(以下、「ＰＯＤ」と略す)をＮ−スクシンイミジル−
３−(２−ピリジルジチオ)プロピオネート(以下、「ＳＰ
ＤＰ」と略す)でＳＨ化し、両者をカップリングする。し
かしながら、マレイミド化抗原は半減期が短いので製剤
の調製時間に制限がある。また、微妙な条件の差が標識
体の性質に反映され、再現性も悪いという欠点がある。In addition, HBs may be combined with a divalent crosslinking agent.
A technique for lengthening the arm between the antigen and the enzyme to obtain an enzyme-labeled antigen complex has also been developed (JP-A-2-247).
565). In this method, a maleimido group is introduced into the amino group of an antigen with a heterodivalent cross-linking agent, and the enzyme peroxidase (hereinafter abbreviated as “POD”) is added to N-succinimidyl-
3- (2-pyridyldithio) propionate (hereinafter, "SP
Abbreviated as "DP") to form SH, and both are coupled. However, since the maleimidated antigen has a short half-life, the preparation time of the preparation is limited. In addition, there is a drawback in that the subtle difference in conditions is reflected in the properties of the labeled body and the reproducibility is poor.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を克服し、抗原性を損なうことなく安定にＨＢｓ抗原
に酵素標識を施す方法を鋭意研究した結果、ＨＢｓ抗原
中に存在するジスルフィド(−ＳＳ−)結合を開裂して小
粒子化ＨＢｓ抗原を調製し、これに酵素標識を施せば抗
原性を損なうこともなく安定に酵素標識ＨＢｓ抗原複合
体が得られることを見い出し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、ＨＢｓ抗原の−ＳＳ−結合を
開裂して得られる小粒子化ＨＢｓ抗原に酵素標識したこ
とを特徴とする酵素標識ＨＢｓ抗原複合体、およびＨＢ
ｓ抗体のサンドイッチ酵素免疫測定法において、酵素標
識ＨＢｓ抗原複合体として上記酵素標識ＨＢｓ抗原複合
体を用いることを特徴とする方法を提供するものであ
る。本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原を酵素標識するには、
上記従来技術のところで説明したものを含む従来法のい
ずれをも採用することができる。[Means for Solving the Problems] The inventors of the present invention have earnestly studied a method for stably enzyme-labeling an HBs antigen without impairing the antigenicity, as a result of overcoming the above-mentioned problems, and as a result, it exists in the HBs antigen. It was found that by preparing a small particle HBs antigen by cleaving a disulfide (-SS-) bond and subjecting it to an enzyme label, an enzyme-labeled HBs antigen complex can be stably obtained without impairing antigenicity. The invention was completed. That is, the present invention provides an enzyme-labeled HBs-antigen complex, characterized in that the HBs-antigen is cleaved at the -SS- bond and the resulting HBs-antigen is labeled with an enzyme.
In the sandwich enzyme immunoassay method for s antibody, the above enzyme-labeled HBs-antigen complex is used as the enzyme-labeled HBs-antigen complex. To enzymatically label the small particle HBs antigen of the present invention,
Any of the conventional methods, including those described in the prior art section above, can be employed.

【００１３】ＨＢｓ抗原は、ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によ
る構成ペプチドの性質の研究により多くのジスルフィド
結合を有することが知られている。このジスルフィド結
合(−ＳＳ−)を比較的穏やかな条件で開裂することによ
り、抗原性を保持したまま、ペプチド断片までは分解さ
れていない小粒子化ＨＢｓ抗原(分子量約５０万〜１０
０万)が得られる(図１)。上記ジスルフィド結合の開裂
方法としては、たとえば、還元剤のジチオスレイトール
(以下、「ＤＴＴ」と略す)、ジチオエリスリトルなどを用
いることができる。反応条件としては、たとえば最終濃
度が２〜１０％となるようにＤＴＴを精製ＨＢｓ抗原溶
液に加え、３０℃で３０分間反応させればよい。このよ
うにして得られた本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原から、Ｌ
ＡＢ法により酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を得ることがで
きる。また、二価性架橋剤を用いた直接架橋法によって
も、酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を得ることができる。The HBs antigen is known to have a large number of disulfide bonds by studying the properties of constituent peptides by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). By cleaving this disulfide bond (-SS-) under relatively mild conditions, small-particle HBs antigen (molecular weight of about 500,000 to 10 million) that retains antigenicity and is not decomposed into peptide fragments
100,000) is obtained (Fig. 1). Examples of the method of cleaving the disulfide bond include dithiothreitol as a reducing agent.
(Hereinafter, abbreviated as “DTT”), dithioerythritol, or the like can be used. As the reaction conditions, for example, DTT may be added to the purified HBs antigen solution so that the final concentration becomes 2 to 10%, and the reaction may be performed at 30 ° C. for 30 minutes. From the small-particle HBs antigen of the present invention thus obtained, L
An enzyme-labeled HBs antigen complex can be obtained by the AB method. The enzyme-labeled HBs-antigen complex can also be obtained by a direct crosslinking method using a divalent crosslinking agent.

【００１４】小粒子化したＨＢｓ抗原をＬＡＢ法で用い
る場合、抗原をビオチン化する必要がある。この際用い
るビオチン化試薬には、３−(Ｎ−マレイミドカプロイ
ル)ビオシチン(以下、「ＭＣＢ」と略す)等に代表される
マレイミド基を有しＳＨ基を修飾するものと、スルホサ
クシンイミジル２−(ビオチンアミド)エチル−１.３−
ジチオプロピオネート等に代表されるスクシンイミド基
を有しアミノ基を修飾するものとがあるが、本発明の小
粒子化ＨＢｓ抗原のビオチン化に際してはＳＨ基を修飾
するビオチン化試薬の方がアミノ基を修飾するビオチン
化試薬に比べて効率よくビオチン化できるので好まし
い。When the HBs antigen with small particles is used in the LAB method, it is necessary to biotinize the antigen. The biotinylation reagent used at this time includes those having a maleimide group represented by 3- (N-maleimidocaproyl) biocytin (hereinafter abbreviated as “MCB”) and the like, and those having sulfosuccinimidyl modified with an SH group. 2- (Biotinamido) ethyl-1.3-
Some of them have a succinimide group, such as dithiopropionate, and modify the amino group. However, when biotinylating the small particle HBs antigen of the present invention, the biotinylation reagent for modifying the SH group is more amino. It is preferable because it can be biotinylated more efficiently than a biotinylation reagent that modifies a group.

【００１５】これらビオチン化試薬を用いて精製ＨＢｓ
抗原および本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原のビオチン化を
行った。Ｆａｂ'(ＨＢｓマウスモノクローナル抗体)を
マイクロタイタープレート(ヌンク社製)に固定化し、別
に調製したビオチン化抗原を分注して固定化Ｆａｂ'−
ビオチン化抗原複合体を形成させた。洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識ビオチン抗体(ＰＯＤ標識マウスモノクロ
ーナル抗体)を分注し、固定化Ｆａｂ'−ビオチン化抗原
−ＰＯＤ標識マウスモノクローナル抗体の免疫複合体を
生成させた。洗浄後、基質を加え、標識酵素の活性によ
り分解される基質の反応をプレートリーダーで測定し
た。その結果を図２に示す。Purified HBs using these biotinylated reagents
The antigen and the small particle HBs antigen of the present invention were biotinylated. Fab ′ (HBs mouse monoclonal antibody) was immobilized on a microtiter plate (Nunc), and separately prepared biotinylated antigen was dispensed to immobilize Fab′-
A biotinylated antigen complex was formed. After washing, a peroxidase-labeled biotin antibody (POD-labeled mouse monoclonal antibody) was dispensed to generate an immobilized Fab′-biotinylated antigen-POD-labeled mouse monoclonal antibody immune complex. After washing, a substrate was added and the reaction of the substrate decomposed by the activity of the labeling enzyme was measured with a plate reader. The result is shown in FIG.

【００１６】図２に示す結果から明らかなように、精製
ＨＢｓ抗原と小粒子化ＨＢｓ抗原とのビオチン化率を比
較すると小粒子化ＨＢｓ抗原の方がビオチン化されやす
く、さらにビオチン化試薬においてはＳＨ基を利用した
方が効率が良かった。また、精製ＨＢｓ抗原および本発
明の小粒子化ＨＢｓ抗原のいずれのビオチン化において
も、アミノ基を利用するビオチン化試薬およびＳＨ基を
利用するビオチン化試薬のいずれの場合もＨＢｓ抗原の
抗原性は殆ど失われなかった。さらに、小粒子化ＨＢｓ
抗原をＬＡＢ法で用いる場合、酵素標識アビジンまたは
ストレプトアビジン、その他の誘導体と反応させるのに
好適な小粒子化ＨＢｓ抗原のビオチン化条件は、精製Ｈ
Ｂｓ抗原の場合に比べてビオチン化試薬は少量しか必要
とせず、しかも短い反応時間で充分である。As is clear from the results shown in FIG. 2, when comparing the biotinylation rates of the purified HBs antigen and the small particle HBs antigen, the small particle HBs antigen is more easily biotinylated. It was more efficient to use the SH group. In addition, in the biotinylation of both the purified HBs antigen and the small particle HBs antigen of the present invention, the antigenicity of the HBs antigen is not limited to the case of using the biotinylation reagent using the amino group and the biotinylation reagent using the SH group. Almost not lost. Furthermore, small particles HBs
When the antigen is used in the LAB method, the biotinylation conditions of the small-particle HBs antigen suitable for reacting with enzyme-labeled avidin or streptavidin or other derivative are purified HBs
Compared with the case of Bs antigen, only a small amount of biotinylation reagent is required, and a short reaction time is sufficient.

【００１７】本発明に用いる標識酵素としては、ＰＯ
Ｄ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸
デヒドロゲナーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等、ＥＩＡ
において一般に用いられる酵素がいずれも使用できる。
また、二価性架橋剤を用いる直接標識法の場合、酵素が
アミノ基とＳＨ基の両方を有する場合とアミノ基のみを
有する場合とがある。たとえば、ＰＯＤの場合はアミノ
基のみを有するのでヘテロ二価性架橋剤を用いる。β−
ガラクトシダーゼの場合はアミノ基とＳＨ基の両方を有
しているのでヘテロ二価性架橋剤またはホモ二価性架橋
剤のいずれも用いることができるが、以下に記載する理
由からホモ二価性架橋剤が好ましい。すなわち、この場
合、抗原側にも酵素側にもＳＨ基が多く存在すること、
さらにβ−ガラクトシダーゼのアミノ基を修飾すると微
妙な条件差で著しく酵素活性の失活を招くという公知事
実があるためである。ホモ二価性架橋剤の欠点として不
必要な重合体を形成することが挙げられるが、β−ガラ
クトシダーゼまたは小粒子化ＨＢｓ抗原をマレイミド化
する際に充分量のホモ二価性架橋剤を添加して酵素また
は抗原のＳＨ基をマレイミド化することにより自己凝集
を防ぐことができる。ついで、抗原と抗原濃度の数倍量
の酵素とをカップリングさせる。本発明の小粒子化ＨＢ
ｓ抗原の分子量は、図１に示すように８０数万前後のも
のが最も多く、またβ−ガラクトシダーゼの分子量は５
４万という高分子同士のカップリング反応であるため、
立体的要因から巨大な凝集体が形成される確率は小さ
く、酵素免疫測定法に好適な標識体を得ることができ
る。The labeling enzyme used in the present invention is PO
D, β-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, microperoxidase, etc., EIA
Any of the enzymes commonly used in can be used.
In the case of the direct labeling method using a divalent cross-linking agent, the enzyme may have both an amino group and an SH group or may have only an amino group. For example, in the case of POD, since it has only an amino group, a heterodivalent crosslinking agent is used. β-
In the case of galactosidase, since it has both an amino group and an SH group, either a heterodivalent cross-linking agent or a homo-divalent cross-linking agent can be used, but for the reasons described below, the homo-divalent cross-linking agent is used. Agents are preferred. That is, in this case, there are many SH groups on both the antigen side and the enzyme side,
This is because there is a known fact that modifying the amino group of β-galactosidase leads to a marked deactivation of enzyme activity due to subtle differences in conditions. A disadvantage of the homobivalent cross-linking agent is that it forms an unnecessary polymer. However, a sufficient amount of the homo-bivalent cross-linking agent is added when the β-galactosidase or the HBs antigen in the form of small particles is maleimidized. Self-aggregation can be prevented by maleimidating the SH group of the enzyme or antigen. Then, the antigen is coupled with the enzyme in an amount several times the antigen concentration. Small particle HB of the present invention
As shown in FIG. 1, the molecular weight of s-antigen is around 80,000 and the most, and the molecular weight of β-galactosidase is 5
Because it is a coupling reaction between 40,000 polymers,
The probability that huge aggregates will be formed due to steric factors is small, and a label suitable for enzyme immunoassay can be obtained.

【００１８】本発明に用いるホモ二価性架橋剤の例とし
ては、ビスマレイミドヘキサン(ＢＭＨ)に代表されるマ
レイミド基を２つ有する二価性架橋剤が挙げられる。本
発明に用いるヘテロ二価性架橋剤の例としては、Ｎ−
(ε−マレイミドカプロイロキシ)スクシンイミド(以
下、「ＥＭＣＳ」と略す)に代表されるマレイミド基とス
クシンイミド基の両基を有する二価性架橋剤が挙げられ
る。Examples of the homodivalent cross-linking agent used in the present invention include a di-valent cross-linking agent having two maleimide groups represented by bismaleimidohexane (BMH). Examples of the heterodivalent crosslinking agent used in the present invention include N-
(ε-maleimidocaproyloxy) succinimide (hereinafter, abbreviated as “EMCS”) includes a divalent crosslinking agent having both a maleimide group and a succinimide group.

【００１９】本発明の酵素標識小粒子化ＨＢｓ抗原複合
体をＬＡＢ法によって調製する場合、調製に用いる酵素
標識アビジンまたはストレプトアビジン、その他のアビ
ジン誘導体は多くが市販されているため入手が容易であ
る。さらに、ビオチンとアビジンやストレプトアビジン
との結合力は強く、希薄な溶液中でも定量的に結合でき
るため、再現性良く標識体を得ることができる。本発明
のβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を用いた
ＥＩＡでは、蛍光基質を用いた高感度の１ステップサン
ドイッチ法を行うことができる。とりわけ、本発明にお
けるＬＡＢ法で作製したβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢ
ｓ抗原複合体で蛍光基質を用いたＥＩＡを行った場合、
短時間の免疫反応で測定が可能である。β−ガラクトシ
ダーゼを特に例示する理由としては、蛍光基質の安定性
の良さと血中に存在しない酵素であるという点が挙げら
れる。このような迅速なＨＢｓ抗体のスクリーニングが
可能となったことは、実際の臨床におけるＨＢｓ抗体検
査において極めて有用な効果をもたらすものである。When the enzyme-labeled small particle HBs antigen complex of the present invention is prepared by the LAB method, many of the enzyme-labeled avidin or streptavidin and other avidin derivatives used for the preparation are readily available because they are commercially available. . Furthermore, since the binding force between biotin and avidin or streptavidin is strong and the biotin can be quantitatively bound even in a dilute solution, the labeled substance can be obtained with good reproducibility. In EIA using the β-galactosidase-labeled HBs antigen complex of the present invention, a highly sensitive one-step sandwich method using a fluorescent substrate can be performed. In particular, β-galactosidase-labeled HB produced by the LAB method in the present invention
When EIA using a fluorescent substrate was performed with the s-antigen complex,
It can be measured by a short-term immune reaction. The reason why β-galactosidase is specifically exemplified is that the stability of the fluorescent substrate is good and the enzyme is not present in blood. The fact that such rapid screening of HBs antibodies has become possible brings about an extremely useful effect in actual clinical HBs antibody tests.

【００２０】[0020]

【実施例】つぎに、本発明を実施例に基づいてさらに詳
しく説明するが、本発明はこれらに限られるものではな
い。実施例１ (ＬＡＢ法によるβ−ガラクトシダーゼ標識Ｈ
Ｂｓ抗原複合体の作製) (ａ)ＨＢｓ抗原の小粒子化 １ｍｇ／ｍｌに調製した精製ＨＢｓ抗原溶液(０.１５Ｍ
ＮａＣｌ、０.０１％ＮａＮ₃、１０ｍＭリン酸緩衝
液、ｐＨ７.２)に最終濃度で１０％になるようにＤＴＴ
溶液を添加し、３０℃で３０分間インキュベートした。
ついで、１ｍＭＥＤＴＡ、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ
６.０)で透析し、小粒子化ＨＢｓ抗原を得た。EXAMPLES Next, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited thereto. Example 1 (β-galactosidase labeled H by LAB method)
Preparation of Bs Antigen Complex) (a) HBs Antigen Small Particles Purified HBs antigen solution prepared to 1 mg / ml (0.15M
NaCl, 0.01% NaN ₃ , 10 mM phosphate buffer, pH 7.2) to a final concentration of 10% DTT
The solution was added and incubated at 30 ° C for 30 minutes.
Then, 1 mM EDTA, 0.1 M phosphate buffer (pH
It dialyzed by 6.0) and the small-particle HBs antigen was obtained.

【００２１】(ｂ)小粒子化ＨＢｓ抗原のビオチン化 上記工程(ａ)で得た小粒子化ＨＢｓ抗原(２５０μｇ)を
含む抗原溶液(１ｍＭＥＤＴＡ、０.１Ｍリン酸緩衝液、
ｐＨ６.０)に、Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド(ＤＭＳ
Ｏ)で溶解したＭＣＢを２μｇ／ｍｇ ＨＢｓ抗原となる
ように加え、３０℃で２０分間インキュベートした。反
応後、セファデックスＧ−２５(ファルマシア社製；１.
０×２５ｃｍ)にてゲル濾過し、ビオチン化小粒子化Ｈ
Ｂｓ抗原を得た。 (ｃ)カップリング 上記工程(ｂ)で得たビオチン化小粒子化ＨＢｓ抗原(２
００μｇ)を含む溶液にβ−ガラクトシダーゼ標識スト
レプトアビジン(ベーリンガー社製；５００Ｕ)を混合
し、３７℃で１時間インキュベートした。反応後、凝集
体の生成を防ぐため、未反応のビオチン結合部位をブロ
ックするためｄ−ビオチン(２ｍｇ)を添加し、３７℃で
３０分間インキュベートした。反応後、セントリプレッ
プ−１０(アミコン社製)で濃縮して１.５ｍｌとし、未
反応のβ−ガラクトシダーゼ標識ストレプトアビジンを
除去するためにセファロース６Ｂ(ファルマシア社製；
１.６×４３ｃｍ)によりゲル濾過してβ−ガラクトシダ
ーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を得た(図３)。(B) Biotinylation of small particle HBs antigen (1 mM EDTA, 0.1 M phosphate buffer, containing the small particle HBs antigen (250 μg) obtained in the above step (a))
pH 6.0, N, N-dimethyl sulfoxide (DMS)
MCB dissolved in (O) was added so as to be 2 μg / mg HBs antigen, and the mixture was incubated at 30 ° C. for 20 minutes. After the reaction, Sephadex G-25 (manufactured by Pharmacia; 1.
Gel filtration with 0 x 25 cm) and biotinylated small particles H
Bs antigen was obtained. (c) Coupling The biotinylated HBs antigen (2) obtained in the above step (b)
The solution containing 00 μg) was mixed with β-galactosidase-labeled streptavidin (Boehringer; 500 U), and the mixture was incubated at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, d-biotin (2 mg) was added to block unreacted biotin-binding sites in order to prevent the formation of aggregates, and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. After the reaction, it was concentrated to 1.5 ml with Centriprep-10 (manufactured by Amicon), and Sepharose 6B (manufactured by Pharmacia; to remove unreacted β-galactosidase-labeled streptavidin).
Gel filtration was performed (1.6 × 43 cm) to obtain β-galactosidase-labeled HBs antigen complex (FIG. 3).

【００２２】実施例２(直接架橋法によるβ−ガラクト
シダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体の作製) (ａ)ＨＢｓ抗原の小粒子化 実施例１工程(ａ)と同様の手順により小粒子化を行っ
た。 (ｂ)β−ガラクトシダーゼのマレイミド化 β−ガラクトシダーゼ(８００μｇ)を含有する抗原溶液
(１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６.０)
に、Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)で溶解し
たＢＭＨ(ピアス社製)を５００μｇ／ｍｇ β−Ｇａｌ
となるように加え、３０℃で３０分間インキュベートし
た。反応後、セファデックスＧ−２５(ファルマシア社
製；１.０×２５ｃｍ)にてゲル濾過してマレイミド化β
−ガラクトシダーゼを得た。 Example 2 ( Preparation of β-galactosidase-labeled HBs antigen complex by direct cross-linking method) (a) Small particle of HBs antigen Small particles were prepared by the same procedure as in step (a) of Example 1. (b) Maleimidation of β-galactosidase Antigen solution containing β-galactosidase (800 μg)
(1 mM EDTA, 0.1 M phosphate buffer, pH 6.0)
Was added with 500 μg / mg β-Gal of BMH (manufactured by Pierce) dissolved in N, N-dimethyl sulfoxide (DMSO).
And was incubated at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction, gel filtration with Sephadex G-25 (Pharmacia Co., Ltd .; 1.0 × 25 cm) was carried out for maleimidated β.
-Galactosidase was obtained.

【００２３】(ｃ)カップリング 上記工程(ａ)で得た小粒子化ＨＢｓ抗原と工程(ｂ)で得
たマレイミド化β−ガラクトシダーゼをモル比で１：３
になるように混合し、３０℃で２時間インキュベートし
た。反応後、セントリプレップ−１０(アミコン社製)で
濃縮して１.５ｍｌとし、未反応のβ−ガラクトシダー
ゼを除去するためにセファロース６Ｂ(ファルマシア社
製；１.６×４３ｃｍ)によりゲル濾過してβ−ガラクト
シダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合体を得た(図４)。(C) Coupling The small-particle HBs antigen obtained in the above step (a) and the maleimidated β-galactosidase obtained in the step (b) are mixed at a molar ratio of 1: 3.
And mixed at 30 ° C. for 2 hours. After the reaction, it was concentrated to 1.5 ml with Centriprep-10 (Amicon), and gel-filtered with Sepharose 6B (Pharmacia; 1.6 × 43 cm) to remove unreacted β-galactosidase. A β-galactosidase labeled HBs antigen complex was obtained (FIG. 4).

【００２４】実施例３(ＬＡＢ法による標識体を用いた
ＨＢｓ抗体の測定) (ａ)ＨＢｓ抗原の固定化 精製ＨＢｓ抗原を０.１Ｍ炭酸緩衝液(ｐＨ９.６)で１０
μｇ／ｍｌの濃度に調製し、ヌンク−イムノモジュール
マキシソープＦ１６ブラック(ヌンク社製)に１００μｌ
／ウエルにて分注し、室温で２時間静置した。このプレ
ートを生理食塩水で洗浄し、０.５％ウシ血清アルブミ
ン(ＢＳＡ)、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、０.１Ｍリン酸緩衝
液(ｐＨ７.０)を３００μｌ／ウエルにて分注し、室温
で１時間ブロックした。再び生理食塩水で洗浄し、１％
β−シクロデキストリン、０.５％ＢＳＡ、０.１５Ｍ
ＮａＣｌ、０.１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ７.０)を３００μ
ｌ／ｍｌ／ウエルにて分注し、室温で３０分間コーティ
ングした。ついで、コーティング液を除去し、室温で真
空乾燥させた。 Example 3 (Measurement of HBs antibody using a labeled substance by LAB method) (a) Immobilization of HBs antigen Purified HBs antigen was mixed with 0.1 M carbonate buffer (pH 9.6) for 10 times.
Prepare to a concentration of μg / ml, and add 100 μl to Nunc-ImmunoModule Maxisorp F16 Black (Nunc).
/ Well was dispensed, and it was allowed to stand at room temperature for 2 hours. This plate was washed with physiological saline, 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.15M NaCl, 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) was dispensed at 300 μl / well, and at room temperature. Blocked for 1 hour. Wash again with physiological saline, 1%
β-cyclodextrin, 0.5% BSA, 0.15M
NaCl, 0.1M phosphate buffer (pH 7.0) 300μ
It was dispensed at 1 / ml / well and coated at room temperature for 30 minutes. Then, the coating liquid was removed and vacuum dried at room temperature.

【００２５】(ｂ)ＬＡＢ法による標識体を用いたＨＢｓ
抗体の測定 上記工程(ａ)で調製したＨＢｓ抗原プレートのウエル
に、実施例１で得たβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗
原複合体を５Ｕ／ｍｌに調製したコンジュゲート液(５
０μｌ)を加え、３７℃で５分間予備加温した。検体(血
清)(５０μｌ)を加え、３７℃で８分間振盪しながらイ
ンキュベートした。ついで、０.５Ｍ ＮａＣｌ液で８回
洗浄し、よく水分を取り除いて蛍光基質を用いた酵素活
性測定を行った。すなわち、予め３７℃に加温しておい
た基質溶液(４５０μＭ ４−メチルウンベリフェリル−
β−Ｄ−ガラクトシド、７５ｍＭ ＮａＣｌ、０.０４％
ＭｇＣｌ₂、０.０２％ＮａＮ₃、０.０５％ＢＳＡ、３％
エチレングリコール、ｐＨ７.０)(２００μｌ)を各ウエ
ルに加え、タイターテックフルオロスキャンＩＩ(フロ
ウラボラトリーズ社製)で２分間の蛍光光度の増加を測
定した。その結果、陽性検体と陰性検体との間で蛍光強
度に差がみられた。(B) HBs using a labeled substance by the LAB method
Antibody measurement In the wells of the HBs antigen plate prepared in the above step (a), the conjugate solution (5% of the β-galactosidase-labeled HBs antigen complex prepared in Example 1 was prepared at 5 U / ml).
0 μl) was added and pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes. A sample (serum) (50 μl) was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 8 minutes with shaking. Then, it was washed 8 times with a 0.5 M NaCl solution, water was thoroughly removed, and enzyme activity was measured using a fluorescent substrate. That is, the substrate solution (450 μM 4-methylumbelliferyl-
β-D-galactoside, 75 mM NaCl, 0.04%
MgCl ₂ , 0.02% NaN ₃ , 0.05% BSA, 3%
Ethylene glycol, pH 7.0 (200 μl) was added to each well, and the increase in fluorescence intensity for 2 minutes was measured by Titer Tech Fluoroscan II (manufactured by Flow Laboratories). As a result, there was a difference in fluorescence intensity between the positive and negative samples.

【００２６】(ｃ)検量線の作成 コントロール血清のヘパトロールＡnti−Ｓ(国際試薬社
製)およびＨＢｓ抗体陰性プール血清を用い、上記工程
(ｂ)の手順に従ってＨＢｓ抗体の検量線を作成した。そ
の結果を図５に示す。 (ｄ)市販キットとの相関関係 比較のため、患者血清２９検体を用い、オーサブ・ＥＩ
Ａ(アボット社製)との相関関係を調べた。その結果、Ｙ
＝１.０９４Ｘ＋０.５７４、相関係数０.９１４３と良
好な結果が得られた(図６)。 (ｅ)再現性 同時再現性を上記コントロール血清を用いて１１０ｍＩ
Ｕ／ｍｌと９００ｍＩＵ／ｍｌについて８回測定し、そ
のばらつきを変動係数(ＣＶ値)で検討した。１１０ｍＩ
Ｕ／ｍｌではＣＶ＝９.９％、９００ｍＩＵ／ｍｌでは
ＣＶ＝４.０％と良好な結果が得られた。(C) Preparation of calibration curve Using the control sera Hepatrol Anti-S (manufactured by Kokusai Reagent Co.) and HBs antibody negative pooled sera, the above steps were carried out.
A calibration curve of HBs antibody was prepared according to the procedure of (b). The result is shown in FIG. (d) Correlation with commercial kit For comparison, 29 patient sera were used and
The correlation with A (manufactured by Abbott) was examined. As a result, Y
Good results were obtained with a correlation coefficient of 0.9143 and a correlation coefficient of 0.9143 (FIG. 6). (e) Reproducibility Simultaneous reproducibility was 110 ml using the above control serum.
U / ml and 900 mIU / ml were measured 8 times, and the variation was examined by the coefficient of variation (CV value). 110 ml
Good results were obtained with CV = 9.9% at U / ml and CV = 4.0% at 900 mIU / ml.

【００２７】実施例４(直接架橋法による標識体を用い
たＨＢｓ抗体の測定) (ａ)ＨＢｓ抗原の固定化 実施例３工程(ａ)と同様の手順により固定化ＨＢｓ抗原
を調製した。 (ｂ)直接架橋法による標識体を用いた測定法 工程(ａ)で調製したＨＢｓ抗原プレートのウエルに、実
施例２で得たβ−ガラクトシダーゼ標識ＨＢｓ抗原複合
体を２.６Ｕ／ｍｌに調製したコンジュゲート液を用
い、実施例３工程(ｂ)の測定法に従い測定を行った。そ
の結果、陽性検体と陰性検体との間で蛍光強度に差がみ
られた。 (ｃ)検量線の作成 上記工程(ｂ)の測定法に従い、コントロール血清のヘパ
トロールＡnti−Ｓ(国際試薬社製)およびＨＢｓ抗体陰
性プール血清を用いてＨＢｓ抗体の検量線を作成した。
その結果を図７に示す。 Example 4 (Measurement of HBs Antibody Using Labeled Body by Direct Crosslinking Method) (a) Immobilization of HBs Antigen An immobilized HBs antigen was prepared by the same procedure as in step (a) of Example 3. (b) Assay Method Using Labeled Body by Direct Crosslinking Method In the well of the HBs antigen plate prepared in step (a), the β-galactosidase-labeled HBs antigen complex obtained in Example 2 was prepared at 2.6 U / ml. Using the above conjugate solution, measurement was carried out according to the measuring method of Example 3 step (b). As a result, there was a difference in fluorescence intensity between the positive and negative samples. (c) Preparation of calibration curve According to the measurement method of the above step (b), a calibration curve of HBs antibody was prepared using hepatrol Anti-S (manufactured by International Reagents Co., Ltd.) and HBs antibody negative pooled serum as control sera.
The result is shown in FIG. 7.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 ＨＢｓ抗原のジスルフィド結合の開裂により
得られた本発明による小粒子化ＨＢｓ抗原のゲル濾過に
よる分子量分布を示すグラフ。FIG. 1 is a graph showing the molecular weight distribution by gel filtration of the small-particle HBs antigen of the present invention obtained by cleavage of the disulfide bond of HBs antigen.

【図２】 精製ＨＢｓ抗原と本発明の小粒子化ＨＢｓ抗
原のビオチン化を比較したグラフ。FIG. 2 is a graph comparing purified HBs antigen and biotinylation of the small particle HBs antigen of the present invention.

【図３】 実施例１のＬＡＢ法により作製した酵素標識
ＨＢｓ抗原複合体のセファロース６Ｂでの溶出位置を示
すグラフ。FIG. 3 is a graph showing the elution position of the enzyme-labeled HBs-antigen complex prepared by the LAB method of Example 1 on Sepharose 6B.

【図４】 実施例２の直接架橋法により作製した酵素標
識ＨＢｓ抗原複合体のセファロース６Ｂでの溶出位置を
示すグラフ。FIG. 4 is a graph showing the elution position on Sepharose 6B of the enzyme-labeled HBs-antigen complex prepared by the direct crosslinking method of Example 2.

【図５】 実施例３に従い、ＬＡＢ法により作製した酵
素標識ＨＢｓ抗原複合体で求めた検量線を示すグラフ。FIG. 5 is a graph showing a calibration curve obtained with an enzyme-labeled HBs-antigen complex prepared by the LAB method according to Example 3.

【図６】 実施例３に従い、ＬＡＢ法により作製した酵
素標識ＨＢｓ抗原複合体で求めたアボット社製オーサブ
・ＥＩＡとの相関関係を示すグラフ。FIG. 6 is a graph showing the correlation with Abbott's Ausub EIA, which was obtained by the enzyme-labeled HBs-antigen complex prepared by the LAB method according to Example 3.

【図７】 実施例４に従い、直接架橋法により作製した
酵素標識ＨＢｓ抗原複合体で求めた検量線を示すグラ
フ。FIG. 7 is a graph showing a calibration curve obtained with an enzyme-labeled HBs-antigen complex prepared by the direct crosslinking method according to Example 4.

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【手続補正書】[Procedure amendment]

【提出日】平成６年１月１７日[Submission date] January 17, 1994

【手続補正１】[Procedure Amendment 1]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】０００２[Name of item to be corrected] 0002

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【０００２】[0002]

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】Ｂ型
肝炎ウイルス(以下、「ＨＢＶ」ともいう)は一般にデー
ン粒子と呼ばれる二本鎖ＤＮＡウイルスであり、主要感
染経路は母子感染および血液等の体液を介する経路であ
る。ＨＢＶの感染は肝炎と関連することが知られてい
る。ＨＢＶ感染時の患者血液中には、直径４２ｎｍの上
記デーン粒子の他に直径２２ｎｍの小型球状粒子あるい
は同じ外径で長さ５０〜７００ｎｍの管状粒子が存在す
る。ＨＢＶは直径２７ｎｍのコア粒子と厚さ７ｎｍ程度
の外層の二層構造からなっており、コア粒子中には一部
に一本鎖ギャップを有する不完全環状二本鎖ＤＮＡ(約
３２００塩基対)、ＤＮＡポリメラーゼ、プロテインキ
ナーゼ等が含まれる。BACKGROUND OF THE INVENTION Hepatitis B virus (hereinafter also referred to as "HBV") is a double-stranded DNA virus generally called Dane particle, and the main routes of infection are mother-to-child infection and blood and the like. It is a route through body fluids. HBV infection is known to be associated with hepatitis. In the blood of a patient at the time of HBV infection, in addition to the Dane particles having a diameter of 42 nm, small spherical particles having a diameter of 22 nm or tubular particles having the same outer diameter and a length of 50 to 700 nm are present. HBV consists of a two-layer structure consisting of a core particle with a diameter of 27 nm and an outer layer with a thickness of about 7 nm, and an incomplete circular double-stranded DNA (about 3200 base pairs) with a single-stranded gap in part in the core particle. , DNA polymerase, protein kinase and the like.

【手続補正２】[Procedure Amendment 2]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１３[Correction target item name] 0013

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１３】ＨＢｓ抗原は、ドデシル硫酸ナトリウムポ
リアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)によ
る構成ペプチドの性質の研究により多くのジスルフィド
結合を有することが知られている。このジスルフィド結
合(−ＳＳ−)を比較的穏やかな条件で開裂することによ
り、抗原性を保持したまま、ペプチド断片までは分解さ
れていない小粒子化ＨＢｓ抗原(分子量約５０万〜１０
０万)が得られる(図１)。上記ジスルフィド結合の開裂
方法としては、たとえば、還元剤のジチオスレイトール
(以下、「ＤＴＴ」と略す)、ジチオエリスリトールなどを
用いることができる。反応条件としては、たとえば最終
濃度が２〜１０％となるようにＤＴＴを精製ＨＢｓ抗原
溶液に加え、３０℃で３０分間反応させればよい。この
ようにして得られた本発明の小粒子化ＨＢｓ抗原から、
ＬＡＢ法により酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を得ることが
できる。また、二価性架橋剤を用いた直接架橋法によっ
ても、酵素標識ＨＢｓ抗原複合体を得ることができる。The HBs antigen is known to have a large number of disulfide bonds by studying the properties of constituent peptides by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). By cleaving this disulfide bond (-SS-) under relatively mild conditions, small-particle HBs antigen (molecular weight of about 500,000 to 10 million) that retains antigenicity and is not decomposed into peptide fragments
100,000) is obtained (Fig. 1). Examples of the method of cleaving the disulfide bond include dithiothreitol as a reducing agent.
(Hereinafter, abbreviated as “DTT”), dithioerythritol and the like can be used. As the reaction conditions, for example, DTT may be added to the purified HBs antigen solution so that the final concentration becomes 2 to 10%, and the reaction may be performed at 30 ° C. for 30 minutes. From the thus-obtained small particle HBs antigen of the present invention,
The enzyme-labeled HBs antigen complex can be obtained by the LAB method. The enzyme-labeled HBs-antigen complex can also be obtained by a direct crosslinking method using a divalent crosslinking agent.

【手続補正３】[Procedure 3]

【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement

【補正対象項目名】００１４[Correction target item name] 0014

【補正方法】変更[Correction method] Change

【補正内容】[Correction content]

【００１４】小粒子化したＨＢｓ抗原をＬＡＢ法で用い
る場合、抗原をビオチン化する必要がある。この際用い
るビオチン化試薬には、３−(Ｎ−マレイミドカプロイ
ル)ビオシチン(以下、「ＭＣＢ」と略す)等に代表される
マレイミド基を有しＳＨ基を修飾するものと、スルホサ
クシンイミジル２−(ビオチンアミド)エチル−１,３'−
ジチオプロピオネート等に代表されるスクシンイミド基
を有しアミノ基を修飾するものとがあるが、本発明の小
粒子化ＨＢｓ抗原のビオチン化に際してはＳＨ基を修飾
するビオチン化試薬の方がアミノ基を修飾するビオチン
化試薬に比べて効率よくビオチン化できるので好まし
い。When the HBs antigen with small particles is used in the LAB method, it is necessary to biotinize the antigen. The biotinylation reagent used at this time includes those having a maleimide group represented by 3- (N-maleimidocaproyl) biocytin (hereinafter abbreviated as “MCB”) and the like, and those having sulfosuccinimidyl modified with an SH group. 2- (Biotinamido) ethyl-1,3'-
Some of them have a succinimide group, such as dithiopropionate, and modify the amino group. However, when biotinylating the small particle HBs antigen of the present invention, the biotinylation reagent for modifying the SH group is more amino. It is preferable because it can be biotinylated more efficiently than a biotinylation reagent that modifies a group.

Claims (6)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 ＨＢｓ抗原の−ＳＳ−結合を開裂して得
られる小粒子化ＨＢｓ抗原に酵素標識したことを特徴と
する酵素標識ＨＢｓ抗原複合体。1. An enzyme-labeled HBs-antigen complex, which is obtained by enzymatically labeling a small-particle HBs-antigen obtained by cleaving the -SS- bond of HBs-antigen. 【請求項２】 該小粒子化ＨＢｓ抗原の分子量が約５０
万〜１００万である請求項１に記載の複合体。2. The molecular weight of the small particle HBs antigen is about 50.
The composite body according to claim 1, which has an amount of 1,000,000 to 1,000,000. 【請求項３】 該小粒子化ＨＢｓ抗原の酵素標識を、ビ
オチン化した小粒子化ＨＢｓ抗原と酵素標識アビジンと
を結合させることにより行う、請求項１または２に記載
の複合体。3. The complex according to claim 1, wherein the enzyme labeling of the small particle HBs antigen is performed by binding a biotinylated small particle HBs antigen and an enzyme-labeled avidin. 【請求項４】 該小粒子化ＨＢｓ抗原の酵素標識を、ア
ビジン化した小粒子化ＨＢｓ抗原と酵素標識ビオチンと
を結合させることにより行う、請求項１または２に記載
の複合体。4. The complex according to claim 1, wherein the enzyme labeling of the small particle HBs antigen is performed by binding an avidinized small particle HBs antigen and an enzyme-labeled biotin. 【請求項５】 該小粒子化ＨＢｓ抗原の酵素標識を、二
価性架橋剤を用いて行う、請求項１または２に記載の複
合体。5. The complex according to claim 1 or 2, wherein the enzyme labeling of the small particle HBs antigen is carried out using a bivalent cross-linking agent. 【請求項６】 ＨＢｓ抗体のサンドイッチ酵素免疫測定
法において、酵素標識ＨＢｓ抗原複合体として請求項
１、２、３、４または５に記載の酵素標識ＨＢｓ抗原複
合体を用いることを特徴とする方法。6. A method for sandwich enzyme immunoassay of HBs antibody, which comprises using the enzyme-labeled HBs-antigen complex according to claim 1, 2, 3, 4 or 5 as the enzyme-labeled HBs-antigen complex. .