JPH06128287A - Peptide and its production - Google Patents

Peptide and its production

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JPH06128287A
JPH06128287A JP4315515A JP31551592A JPH06128287A JP H06128287 A JPH06128287 A JP H06128287A JP 4315515 A JP4315515 A JP 4315515A JP 31551592 A JP31551592 A JP 31551592A JP H06128287 A JPH06128287 A JP H06128287A
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peptide
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opioid
amino acid
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正明 吉川
Shinichi Fukutome
真一 福留
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Abstract

PURPOSE:To obtain a peptide, having inhibiting action on angiotensin converting enzymes and useful as hypotensive agent, etc., by hydrolyzing a milk protein with a neutral or an alkaline protease derived from a microorganism and then recovering a fraction having the opioid activity. CONSTITUTION:A milk protein (e.g. cow's milk beta-casein) is incubated and hydrolyzed with a neutral or an alkaline protease (e.g. thermolysin) at 37 deg.C for 5hr and the enzyme is then inactivated by heating at 90 deg.C for 20min. The resultant substance is then centrifuged to remove insoluble substances. The obtained supernatant liquid is subsequently freeze-dried to afford a hydrolyzate, which is then subjected to reversed phase chromatography and eluted with a 0.1% trifluoroacetic acid having 0-40% concentration gradient of an acetonitrile solution concentration to collect a fraction having the opioid activity. Thereby, the objective peptide having an amino acid sequence expressed by formula I or II (Xaa is amino acid) and inhibiting activity against angiotensin converting enzymes is stably obtained in a large amount.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、オピオイド活性とアン
ジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドおよび
その塩、その製造方法、並びに当該ペプチドおよびその
塩を有効成分として含むオピオイド活性を有する剤およ
びアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有する剤に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a peptide having opioid activity and angiotensin converting enzyme inhibitory activity, a salt thereof, a process for producing the same, and an agent having an opioid activity and an angiotensin converting enzyme containing the peptide and the salt as an active ingredient. The present invention relates to agents having inhibitory activity.

【０００２】[0002]

【従来の技術】食品中には高次の生命活動に関与する多
数の生体調節因子が存在することが広く知られるように
なっており、それらの生体調節因子を健康の増進、病気
の予防や治療、老化の予防等に積極的に利用することが
近年色々試みられるようになっている。そのような生体
調節因子としては神経系、消化吸収系、循環系、生体防
御・免疫系、内分泌系、細胞分化・増殖系等に作用する
種々の因子が知られている。それらのうちで、ある種の
食品蛋白質中には神経系に作用してモルヒネ様の麻酔、
鎮痛作用等（いわゆるオピオイド活性）を有するペプチ
ド単位が存在していることが明らかになっており、その
ようなペプチドはオピオイドペプチドと一般に称されて
いる。2. Description of the Related Art It has become widely known that many bioregulatory factors involved in higher life activities are present in foods, and these bioregulatory factors are used to promote health and prevent diseases. In recent years, various attempts have been made to positively use it for treatment and prevention of aging. As such biological regulators, various factors that act on the nervous system, digestive absorption system, circulation system, biological defense / immune system, endocrine system, cell differentiation / proliferation system, etc. are known. Among them, some types of food proteins act on the nervous system to cause morphine-like anesthesia,
It has been revealed that there is a peptide unit having an analgesic effect and the like (so-called opioid activity), and such a peptide is generally called an opioid peptide.

【０００３】乳蛋白、特に牛乳β−カゼインは、そのよ
うなオピオイドペプチドを派生する食品蛋白質の一つで
ある。この蛋白質を起源とするオピオイドペプチドとし
ては、配列番号１７で表されるβ−casomorphin７［Bra
ntl et al.,Hoppe-Seyler'sZ.Physiol. Chem.,360，121
1(1979)]、配列番号１８で表されるβ−casomorphin５
［Henshen et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Che
m.，360，1217（1979）]、配列番号１９で表されるβ−
casomorphin４[Brantl et al.，Life Sic.，28，1903(1
981)］等が挙げられる。Milk protein, especially milk β-casein, is one of the food proteins derived from such opioid peptides. An opioid peptide originating from this protein is β-casomorphin7 [Bra represented by SEQ ID NO: 17].
ntl et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 360, 121
1 (1979)], β-casomorphin 5 represented by SEQ ID NO: 18
[Henshen et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Che
m., 360, 1217 (1979)], β-represented by SEQ ID NO: 19
casomorphin4 [Brantl et al., Life Sic., 28, 1903 (1
981)] and the like.

【０００４】これらの牛乳蛋白から派生するオピオイド
ペプチドは、市販のカゼインペプトン（牛乳を塩酸によ
り加水分解したものまたは牛乳をトリプシン、ペプシ
ン、パンクレアチンからなる複合酵素で加水分解したも
の）から単離され、構造決定された。しかしながら、こ
れらのペプチドがカゼインペプトンに含有される量は非
常に微量であり、上記したBrantl et al.，Hoppe-Seyle
r's Z. Physiol. Chem.,360，1211(1979）には、カゼイ
ンペプトンからの収率が約０．００５％、β−カゼイン
（カゼイン含量３０％として）からの収率が約０．０１
８％であると記載されている。そのため、実際は市販の
カゼインペプトンからそれらのペプチドを単離してオピ
オイドペプチド活性を有する剤として利用することは不
可能であった。また、牛乳β−カゼインから大量にオピ
オイドペプチドを得ようとする試みも色々なされてきた
が、未だ効果的な製造方法は報告されていない。These opioid peptides derived from cow's milk proteins are isolated from commercially available casein peptone (the one obtained by hydrolyzing milk with hydrochloric acid or the one obtained by hydrolyzing milk with a complex enzyme composed of trypsin, pepsin and pancreatin). , The structure was determined. However, the amount of these peptides contained in casein peptone is very small, and Brantl et al., Hoppe-Seyle described above.
In r's Z. Physiol. Chem., 360, 1211 (1979), the yield from casein peptone was about 0.005%, and the yield from β-casein (as a casein content of 30%) was about 0.01.
It is stated to be 8%. Therefore, in reality, it was impossible to isolate those peptides from commercially available casein peptone and use them as agents having opioid peptide activity. Further, various attempts have been made to obtain a large amount of opioid peptide from milk β-casein, but an effective production method has not been reported yet.

【０００５】また、血圧上昇をもたらす代表的な生体内
因子としてレニン・アンジオテンシン系が、また血圧降
下に働く代表的な生体内因子としてカリクレイン・キニ
ン系が知られているが、アンジオテンシン変換酵素（以
後「ＡＣＥ」という）はこのいずれの系にも大きく関与
している。その機構を簡単に説明すると、まずレニン・
アンジオテンシン系では、血中に分泌された腎臓の酵素
レニンが血中のアンジオテンシノーゲンに作用してデカ
ペプチドであるアンジオテンシンIを生成する。このア
ンジオテンシンIは血圧上昇作用を示さないが、これに
ＡＣＥが作用するとオクタペプチドであるアンジオテン
シンIIを生成する。このアンジオテンシンIIは末梢血管
を収縮させるとともに、副腎皮質に作用してアルドステ
ロンの産出を促し、アルドステロンは腎臓に作用してナ
トリウムの再吸収・体液量増加を招いて心拍出量の増大
をもたらし、そのいずれもが血圧を大きく上昇させる。The renin-angiotensin system is known as a typical in vivo factor that causes an increase in blood pressure, and the kallikrein-quinine system is known as a typical in-vivo factor that acts to decrease blood pressure. (Referred to as "ACE") is greatly involved in both of these systems. The mechanism is briefly explained. First, renin
In the angiotensin system, the renal enzyme renin secreted into the blood acts on blood angiotensinogen to produce the decapeptide angiotensin I. This angiotensin I has no blood pressure-increasing effect, but when ACE acts on it, it produces the octapeptide angiotensin II. This angiotensin II contracts peripheral blood vessels and acts on the adrenal cortex to promote the production of aldosterone, and aldosterone acts on the kidney to cause reabsorption of sodium and increase fluid volume, resulting in an increase in cardiac output. Both increase blood pressure significantly.

【０００６】一方、カリクレイン・キニン系では血中の
前駆体蛋白質であるキニノーゲンに血中酵素のカリクレ
インが作用してキニンを遊離産出するが、このキニンは
末梢血管を拡張させるとともにホスホリパーゼＡ2を活
性化してプロスタグランジンの合成を促進して血圧を降
下させる。ところがこのカリクレイン・キニン系にＡＣ
Ｅが働くと、ＡＣＥは末梢血管の拡張作用およびホスホ
リパーゼＡ2の活性化作用を有する上記キニンを分解・
不活性化してしまうために、血圧の降下が生じなくな
る。On the other hand, in the kallikrein-quinine system, the enzyme kallikrein in the blood acts on kininogen, which is a precursor protein in blood, to produce kinin in a free manner, and this kinin expands peripheral blood vessels and activates phospholipase A 2 . It promotes the synthesis of prostaglandins and lowers blood pressure. However, in this kallikrein-quinine system, AC
When E acts, ACE decomposes the above quinine, which has peripheral blood vessel dilating action and phospholipase A 2 activating action.
Since it is inactivated, the drop in blood pressure does not occur.

【０００７】したがって、ＡＣＥの上記のような働きを
阻害する物質（ＡＣＥ阻害剤）が存在すると、血圧上昇
物質であるアンジオテンシンIIの生成が抑制され、且つ
血圧降下物質として働くキニンの分解が防止されて、血
圧の上昇抑制および血圧降下が可能になる。かかる点か
ら、近年、天然蛋白質から得られたＡＣＥ阻害作用を有
するペプチドに関する研究が色々行われており、そのよ
うなペプチドがＡＣＥ阻害活性を有する剤として利用し
得ることが期待されている。Therefore, the presence of a substance that inhibits the above-mentioned actions of ACE (ACE inhibitor) suppresses the production of angiotensin II, which is a blood pressure-increasing substance, and prevents the decomposition of quinine, which acts as a blood pressure-lowering substance. As a result, it is possible to suppress an increase in blood pressure and reduce blood pressure. From this point of view, in recent years, various studies have been conducted on peptides obtained from natural proteins and having an ACE inhibitory action, and it is expected that such peptides can be used as agents having an ACE inhibitory activity.

【０００８】[0008]

【発明の内容】上記のような状況下に本発明者らは乳蛋
白からオピオイド活性を有するペプチドを高収率で得る
べく研究を進めてきた。その結果、乳蛋白を微生物由来
のプロテアーゼを使用して得た加水分解物に強いオピオ
イド活性が存在することを見出し、更にこのペプチド混
合物を高速液体クロマトグラフィーを用いた逆相クロマ
トグラフィーで分画すると、そのうちの特定の画分がオ
ピオイド活性を有するペプチドであることを確認した。Under the circumstances as described above, the present inventors have conducted research to obtain a peptide having opioid activity from milk protein in high yield. As a result, it was found that the hydrolyzate obtained by using a protease derived from a milk protein has a strong opioid activity, and when this peptide mixture was fractionated by reverse phase chromatography using high performance liquid chromatography. It was confirmed that a specific fraction among them was a peptide having opioid activity.

【０００９】特に、乳蛋白のうちでも牛乳中に多量に含
まれている牛乳β−カゼインを微生物起源の中性プロテ
アーゼまたは微生物起源のアルカリ性プロテアーゼを使
用して加水分解を行ってペプチド混合物を形成させ、そ
こから得られたオピオイド活性を有する画分を単離・精
製して、その構造決定をしたところ、配列番号３で表さ
れる１０個のアミノ酸の配列した新規なペプチドおよび
配列番号４で示される１０個のアミノ酸の配列した新規
なペプチドであることを見出した。Particularly, among milk proteins, milk β-casein, which is contained in a large amount in milk, is hydrolyzed by using a neutral protease of microbial origin or an alkaline protease of microbial origin to form a peptide mixture. The fraction having the opioid activity obtained therefrom was isolated and purified, and its structure was determined. As a result, a novel peptide having 10 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 were shown. It was found to be a novel peptide having a sequence of 10 amino acids.

【００１０】そして、上記で得た新規な２種類のペプチ
ドまたは該ペプチドを含有する混合物をアミノペプチダ
ーゼを使用して更に加水分解すると、配列番号３のペプ
チドからは配列番号５で表される新規なペプチドが、ま
た配列番号４のペプチドからは配列番号６で表される新
規なペプチドが得られ、配列番号５および配列番号６で
表されるそれらのペプチドが一層強力なオピオイド活性
を有することを見いだした。When the novel two kinds of peptides obtained above or a mixture containing the peptides are further hydrolyzed using aminopeptidase, the peptide of SEQ ID NO: 3 is replaced with a novel peptide represented by SEQ ID NO: 5. It was found that the peptides, and also the peptides of SEQ ID NO: 4, give novel peptides represented by SEQ ID NO: 6, and those peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 have more potent opioid activity. It was

【００１１】また、上記で得た配列番号３および配列番
号４で表されるペプチドまたは該ペプチドを含有する混
合物を、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダ
ーゼを使用して、同時にまたは順序を問わず逐時に加水
分解すると、配列番号６および配列番号１７で示される
ペプチドが得られることを見いだした。Further, the peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 or a mixture containing the peptides obtained above are hydrolyzed at the same time or in any order using aminopeptidase and carboxypeptidase. Then, it was found that the peptides shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 17 were obtained.

【００１２】そして、本発明者らは、上記で得られた配
列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６で
示される新規なペプチドについて、そのＡＣＥ阻害活性
を調べたところ、それら４種のペプチドはオピオイド活
性だけでなく、ＡＣＥの活性を阻害する作用をも有して
いることを見いだした。The inventors of the present invention investigated the ACE inhibitory activity of the novel peptides shown in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and found that It was found that the peptides of the species have not only opioid activity but also activity of inhibiting ACE activity.

【００１３】乳蛋白、そのうちでも特に牛乳カゼインは
容易に且つ多量に入手可能な蛋白質であり、乳蛋白を原
料として用いている本発明者らの見いだした上記方法に
よるときは、オピオイド活性およびＡＣＥ阻害活性を有
するペプチドを、多量に且つ容易に得ることができる。Milk protein, especially milk casein, is a protein that can be easily and abundantly obtained, and when the above method found by the present inventors using milk protein as a raw material is used, opioid activity and ACE inhibition are obtained. A large amount of active peptide can be easily obtained.

【００１４】更に本発明者らは、牛乳β−カゼインから
得られた上記の配列番号５または配列番号６で表される
ノナペプチドにおいて、そのＣ末端アミノ酸から２残基
目のヒスチジン（His）またはプロリン（Pro）を、アラ
ニン（Ala）、アルギニン（Arg）、グルタミン酸（Gl
u）、グリシン（Gly）、ロイシン（Leu）などの他のア
ミノ酸で置換した配列番号７〜配列番号１１で表される
新規なノナペプチドを化学合成し、それらのオピオイド
活性およびＡＣＥ阻害活性を測定したところ、該配列番
号７〜配列番号１１で表されるノナペプチドも、配列番
号５および配列番号６で表されるノナペプチドと同様
に、極めて高いオピオイド活性を有し且つＡＣＥ阻害活
性を有することを見いだした。そして、本発明者らによ
るかかる発見から、上記した配列番号５〜配列番号１１
のノナペプチドを包括する配列番号１（式中 Xaa はア
ミノ酸を示す)で表される新規なノナペプチド類が、一
般に極めて高いオピオイド活性を有し且つＡＣＥ阻害活
性をも有し、極めて有用性に富むことが明らかになっ
た。Further, in the nonapeptide represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 obtained from milk β-casein, the present inventors have made histidine (His) or proline at the second residue from the C-terminal amino acid. (Pro), alanine (Ala), arginine (Arg), glutamic acid (Gl
u), glycine (Gly), leucine (Leu) and other amino acids substituted, the novel nonapeptides represented by SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 11 were chemically synthesized, and their opioid activity and ACE inhibitory activity were measured. However, it was found that the nonapeptides represented by SEQ ID NOS: 7 to 11 also have extremely high opioid activity and ACE inhibitory activity, like the nonapeptides represented by SEQ ID NOS: 5 and 6. . Based on such discovery by the present inventors, the above-mentioned SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 11
The novel nonapeptides represented by SEQ ID NO: 1 (wherein Xaa represents an amino acid) that includes the nonapeptides of Escherichia coli generally have extremely high opioid activity and ACE inhibitory activity, and thus are extremely useful. Became clear.

【００１５】同様に、本発明者らは、牛乳β−カゼイン
から得られた上記の配列番号３または配列番号４で表さ
れるデカペプチドにおいて、そのＣ末端アミノ酸から２
残基目のヒスチジン(His)またはプロリン(Pro)を、アラ
ニン(Ala)、アルギニン(Arg)、グルタミン酸(Glu)、グ
リシン(Gly)、ロイシン(Leu)などの他のアミノ酸で置換
した配列番号１２〜配列番号１６で表される新規なデカ
ペプチドを化学合成し、そのオピオイド活性およびＡＣ
Ｅ阻害活性を測定したところ、それらの新規なデカペプ
チドも、配列番号３および配列番号４で表されるデカペ
プチドと同様に、オピオイド活性およびＡＣＥ阻害活性
を有することを見いだした。そして、本発明者らによる
かかる発見から、上記した配列番号３〜配列番号４およ
び配列番号１２〜配列番号１６のデカペプチドを包括す
る配列番号２（式中 Xaa はアミノ酸を示す）で表され
る新規なデカペプチド類が、一般に高いオピオイド活性
を有し且つＡＣＥ阻害活性をも有し、有用性に富むこと
が明らかになった。Similarly, in the decapeptide represented by the above SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 obtained from milk β-casein, the present inventors have 2 amino acids from the C-terminal amino acid.
SEQ ID NO: 12 in which the residue histidine (His) or proline (Pro) is replaced with another amino acid such as alanine (Ala), arginine (Arg), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), leucine (Leu) ~ Chemically synthesizing the novel decapeptide represented by SEQ ID NO: 16 to obtain its opioid activity and AC
When the E inhibitory activity was measured, it was found that these novel decapeptides also have opioid activity and ACE inhibitory activity, similar to the decapeptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Then, from such discovery by the present inventors, it is represented by SEQ ID NO: 2 (in the formula, Xaa represents an amino acid) including the decapeptides of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 16 described above. It has been revealed that the novel decapeptides generally have high opioid activity and also ACE inhibitory activity, and thus are highly useful.

【００１６】したがって、本発明は、配列番号１（式中
Xaa はアミノ酸を示す）で表されるペプチドおよびそ
の塩である。更に、本発明は、配列番号２（式中 Xaa
はアミノ酸を示す）で表されるペプチドおよびその塩で
ある。Accordingly, the present invention provides SEQ ID NO: 1 (wherein
Xaa represents an amino acid) and a salt thereof. Further, the present invention provides SEQ ID NO: 2 (wherein Xaa
Represents an amino acid) and a salt thereof.

【００１７】そして、本発明は、配列番号１（式中 Xaa
はアミノ酸を示す）または配列番号２（式中 Xaa はア
ミノ酸を示す）で表されるペプチドおよびその塩の１種
または２種以上を有効成分として含むオピオイド活性を
有する剤、並びにアンジオテンシン変換酵素阻害活性を
有する剤である。The present invention also provides SEQ ID NO: 1 (wherein Xaa
Represents an amino acid) or a peptide represented by SEQ ID NO: 2 (where Xaa represents an amino acid) and a salt thereof as an active ingredient, the agent having opioid activity, and angiotensin converting enzyme inhibitory activity It is an agent having

【００１８】配列番号１または配列番号２で表されるペ
プチドにおいて、Ｃ末端から２番目のアミノ酸；Xaa の
種類は限定されず任意のアミノ酸とすることができる
が、ヒスチジン(His)、プロリン(Pro)、アラニン(Al
a)、アルギニン(Arg)、グルタミン酸(Glu)、グリシン(G
ly)、ロイシン(Leu)などのアミノ酸が適当であり、その
場合には、各ペプチドは配列番号３〜配列番号１６で表
されるアミノ酸配列を有している。In the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, the second amino acid from the C terminus; the type of Xaa is not limited and can be any amino acid, but histidine (His), proline (Pro) ), Alanine (Al
a), arginine (Arg), glutamic acid (Glu), glycine (G
Amino acids such as ly) and leucine (Leu) are suitable, and in that case, each peptide has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 16.

【００１９】更に、本発明は、（１）乳蛋白を微生物起
源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを
使用して加水分解し、得られる加水分解物からオピオイ
ド活性を有するペプチドを回収することを特徴とするオ
ピオイドペプチドの製造方法であり、この(１)の方法で
製造されたオピオイドペプチドにはその化学構造が明ら
かなもの、および明らかでないオピオイドペプチドの両
方が含まれる。Furthermore, the present invention is characterized in that (1) milk protein is hydrolyzed using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, and a peptide having opioid activity is recovered from the resulting hydrolyzate. The method of producing an opioid peptide according to claim 1, wherein the opioid peptide produced by the method (1) includes both those whose chemical structure is clear and those whose chemical structure is not clear.

【００２０】上記（１）の方法により得られるオピオイ
ドペプチドには、配列番号３および配列番号４で表され
る新規なペプチドが含まれており、特に中性プロテアー
ゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼまたはアスペ
ルギルス起源の中性プロテアーゼを使用し、またアルカ
リ性プロテアーゼとしてバチルス起源のアルカリ性プロ
テアーゼを使用した場合には、配列番号３および配列番
号４で表されるペプチドを効率よく製造することができ
る。The opioid peptides obtained by the above method (1) include the novel peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and in particular, the neutral protease derived from Bacillus is a neutral protease or Aspergillus. When the original neutral protease is used and the alkaline protease of Bacillus origin is used as the alkaline protease, the peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 can be efficiently produced.

【００２１】また、本発明は、（２）乳蛋白を微生物起
源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを
使用して加水分解した後、アミノペプチダーゼを使用し
て更に加水分解し、得られる加水分解物からオピオイド
活性を有するペプチドを回収することを特徴とするオピ
オイドペプチドの製造方法を包含する。The present invention also provides (2) a milk protein hydrolyzed using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, and then further hydrolyzed using aminopeptidase. A method for producing an opioid peptide, which comprises recovering a peptide having opioid activity.

【００２２】この（２）の方法により得られるオピオイ
ドペプチドには、配列番号５および配列番号６で表され
る新規なペプチドが含まれており、特に中性プロテアー
ゼとしてバチルス起源の中性プロテアーゼまたはアスペ
ルギルス起源の中性プロテアーゼを使用し、アルカリ性
プロテアーゼとしてバチルス起源のアルカリ性プロテア
ーゼを使用し、またアミノペプチダーゼとしてロイシン
アミノペプチダーゼを使用した場合には、配列番号５お
よび配列番号６で表されるペプチドを効率よく製造する
ことができる。The opioid peptides obtained by the method (2) include the novel peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and in particular, the neutral protease derived from Bacillus or Aspergillus. When the neutral protease of origin is used, the alkaline protease of Bacillus origin is used as the alkaline protease, and leucine aminopeptidase is used as the aminopeptidase, the peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are efficiently prepared. It can be manufactured.

【００２３】更に、本発明は、（３）乳蛋白を微生物起
源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを
使用して加水分解した後、更にアミノペプチダーゼとカ
ルボキシペプチダーゼを同時または順序を問わず逐時に
使用して加水分解し、得られる加水分解物からオピオイ
ド活性を有するペプチドを回収することを特徴とするオ
ピオイドペプチドの製造方法を包含する。ここで、「ア
ミノペプチダーゼとカルボキシペプチダーゼを同時また
は順序を問わず逐時に使用して加水分解し」とは、中性
プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼを使用して
得た加水分解物を、アミノペプチダーゼとカルボキシペ
プチダーゼを同時に反応させて加水分解すること、また
はアミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼの
うちのいずれか一方を使用して加水分解した後、残りの
ペプチダーゼで加水分解することを意味する。Furthermore, the present invention (3) hydrolyzes milk protein using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, and then uses aminopeptidase and carboxypeptidase simultaneously or in any order, in sequence. And then hydrolyzing the resulting product to recover a peptide having opioid activity from the resulting hydrolyzate. Here, "hydrolyze using aminopeptidase and carboxypeptidase at the same time or at any time regardless of order" means that a hydrolyzate obtained by using a neutral protease or an alkaline protease is treated with aminopeptidase and carboxypeptidase. Are simultaneously reacted to hydrolyze, or hydrolyzed using either one of aminopeptidase and carboxypeptidase and then hydrolyzed with the remaining peptidase.

【００２４】この（３）の方法により得られるオピオイ
ドペプチドのうちには、配列番号６で表される新規なペ
プチドおよび配列番号１７で表される既知ペプチドが含
まれており、特に中性プロテアーゼとしてバチルス起源
の中性プロテアーゼまたはアスペルギルス起源の中性プ
ロテアーゼを、アルカリ性プロテアーゼとしてバチルス
起源のアルカリ性プロテアーゼを、アミノペプチダーゼ
としてロイシンアミノペプチダーゼを、またカルボキシ
ペプチダーゼとしてカルボキシペプチダーゼＡを使用し
た場合には、配列番号６および配列番号１７で表される
ペプチドを効率よく製造することができる。Among the opioid peptides obtained by the method (3), the novel peptide represented by SEQ ID NO: 6 and the known peptide represented by SEQ ID NO: 17 are included, and particularly as a neutral protease. When neutral protease of Bacillus origin or neutral protease of Aspergillus origin, alkaline protease of Bacillus origin as alkaline protease, leucine aminopeptidase as aminopeptidase, and carboxypeptidase A as carboxypeptidase are used, SEQ ID NO: 6 And the peptide represented by SEQ ID NO: 17 can be efficiently produced.

【００２５】そして、本発明は、上記（１）〜（３）の
いずれかの方法により製造された配列番号３、配列番号
４、配列番号５、配列番号６および配列番号１７で表さ
れるペプチドおよびその塩を包含する。Then, the present invention provides the peptides represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 17, which are produced by any of the above methods (1) to (3). And its salts.

【００２６】本発明では、上記した(１)〜(３)のいずれ
かの方法によって乳蛋白を加水分解して配列番号３〜配
列番号６および配列番号１７で表されるオピオイドペプ
チドを製造する方法を包含するが、配列番号３〜配列番
号１７で表されるペプチドの製造法は、上記した(１)〜
(３)の方法に限定されず、化学合成、化学合成と酵素加
水分解の併用、他の酵素加水分解法などによっても製造
することができる。In the present invention, a method for producing an opioid peptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 17 by hydrolyzing a milk protein by any one of the methods (1) to (3) described above. The method for producing the peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 17 includes the above-mentioned (1) to
The method is not limited to the method (3), and it can be produced by chemical synthesis, a combination of chemical synthesis and enzymatic hydrolysis, or another enzymatic hydrolysis method.

【００２７】例えば、化学合成やその他の上記（１）以
外の方法によって配列番号３および配列番号４で表され
る各々のペプチドをつくり、それをロイシンアミノペプ
チダーゼ等のアミノペプチダーゼを使用して加水分解し
た場合にも、配列番号５および配列番号６で表される各
々のペプチドを製造することができる。For example, each peptide represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is prepared by chemical synthesis or other methods other than the above (1), and is hydrolyzed using aminopeptidase such as leucine aminopeptidase. Also in this case, each peptide represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 can be produced.

【００２８】また、上記と同様に、化学合成やその他の
上記（１）以外の方法によって配列番号３および配列番
号４で表される各々のペプチドをつくり、それをロイシ
ンアミノペプチダーゼ等のアミノペプチダーゼおよびカ
ルボキシペプチダーゼＡ等のカルボキシペプチダーゼを
使用して同時または順序を問わず逐時に使用して加水分
解した場合にも、配列番号６および配列番号１７で表さ
れる各々のペプチドを製造することができる。Further, similarly to the above, each peptide represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 is prepared by chemical synthesis or other methods other than the above (1), and is prepared with aminopeptidases such as leucine aminopeptidase and Even when carboxypeptidase such as carboxypeptidase A is used and hydrolyzed by simultaneous or sequential use in any order, the respective peptides represented by SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 17 can be produced.

【００２９】更に、配列番号１または配列番号２で表さ
れるペプチド類に包含される各々のペプチドを化学合成
のみによって製造してもよい。Further, each peptide included in the peptides represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 may be produced only by chemical synthesis.

【００３０】上記した本発明のペプチド類を乳蛋白の加
水分解を利用して製造する場合は、乳蛋白質として種々
の乳蛋白を使用することができるが、牛乳カゼインが好
ましく、牛乳β−カゼインが特に好ましい。牛乳β−カ
ゼインを使用する場合は、牛乳カゼインから精製された
牛乳β−カゼインのみからなるものを使用しても、また
は牛乳α、κカゼイン等の他のカゼインや蛋白質を含有
するものを使用してもよい。When the above-mentioned peptides of the present invention are produced by utilizing the hydrolysis of milk protein, various milk proteins can be used as the milk protein, but milk casein is preferable, and milk β-casein is preferable. Particularly preferred. When using milk β-casein, even if using only milk β-casein purified from milk casein, or using those containing other caseins or proteins such as milk α, κ casein. May be.

【００３１】本発明のペプチドは、その発端は天然の乳
蛋白の加水分解によって得られたものであり、その場合
にはペプチドを構成しているアミノ酸はいずれもＬ-ア
ミノ酸である。しかしながら、配列番号１または配列番
号２で表されるペプチド類に包含される本発明の新規な
ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸に限定さ
れず、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸
配列を有するペプチドであればどのような光学異性体で
あってもよい。例えば、アミノ酸の全部がＬ−アミノ酸
のみからなっていても、Ｄ−アミノ酸のみからなってい
ても、各ペプチドを構成するアミノ酸のうちのいずれか
がＬ−アミノ酸であって残りがＤ−アミノ酸であっても
よい。The peptide of the present invention has its origin obtained by hydrolysis of natural milk protein, and in this case, all the amino acids constituting the peptide are L-amino acids. However, the amino acids constituting the novel peptide of the present invention included in the peptides represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 are not limited to L-amino acids, and are represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. Any optical isomer may be used as long as it is a peptide having an amino acid sequence. For example, whether all of the amino acids consist of only L-amino acids or only D-amino acids, any of the amino acids constituting each peptide is an L-amino acid and the rest are D-amino acids. It may be.

【００３２】また、本発明における「オピオイド活性を
有する剤」とは、鎮痛、麻酔、情動、呼吸、脈動、体
温、消化管機能、摂食、免疫、インシュリンやソマトス
タチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心
筋の収縮調節等に関与するいわゆるオピオイド活性とし
て認識されている活性を有する剤をいう。更に、本発明
における「ＡＣＥ阻害活性を有する剤」とは血圧の上昇
に関与するＡＣＥの作用を阻害して、血圧の上昇抑制、
血圧降下等をもたらし得る剤をいう。Further, the "agent having opioid activity" in the present invention means analgesia, anesthesia, emotion, respiration, pulsation, body temperature, digestive tract function, feeding, immunity, secretion control of hormones such as insulin and somatostatin, and electrolytes. It refers to an agent having an activity recognized as so-called opioid activity involved in promoting absorption of erythrocyte, regulating contraction of myocardium, and the like. Further, the "agent having ACE inhibitory activity" in the present invention inhibits the action of ACE involved in the increase in blood pressure to suppress the increase in blood pressure,
An agent that can bring about a decrease in blood pressure.

【００３３】限定されるものではないが、牛乳β−カゼ
インの加水分解により本発明のペプチドを調製する場合
の例を以下に説明する。Although not limited thereto, an example of preparing the peptide of the present invention by hydrolysis of milk β-casein will be described below.

【００３４】［配列番号３および配列番号４で表される
ペプチドの製造方法］上記したように、牛乳β−カゼイ
ンを微生物起源の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プ
ロテアーゼを使用して加水分解すると、配列番号３およ
び配列番号４で表されるペプチドを含有するペプチド混
合物を得ることができる。この場合に、牛乳β−カゼイ
ンは、蒸留水または水道水に分散溶解させ、微生物由来
の中性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで加
水分解して、ペプチド混合物を調製する。[Method for producing peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4] As described above, when milk β-casein is hydrolyzed using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, SEQ ID NO: 3 And a peptide mixture containing the peptide represented by SEQ ID NO: 4 can be obtained. In this case, milk β-casein is dispersed and dissolved in distilled water or tap water and hydrolyzed with a microbial-derived neutral protease or alkaline protease to prepare a peptide mixture.

【００３５】微生物起源の中性プロテアーゼとしては、
バチルス起源の耐熱性プロテアーゼであるサーモライシ
ン、アスペルギルス起源の金属プロテアーゼ、ストレプ
トマイセス起源の金属プロテアーゼ、リゾプス起源の金
属プロテアーゼ等の金属プロテアーゼを挙げることがで
きる。また、微生物起源のアルカリ性プロテアーゼとし
ては、バチルス起源のセリンプロテアーゼ等のアルカリ
性プロテアーゼを挙げることができる。上記の中性プロ
テアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼは、１種類のみ
を使用しても、またはプロテアーゼ同士がお互いに悪影
響を及ぼさないかぎりは複数種を併用することもでき
る。複数の中性プロテアーゼを使用する場合は、同時に
作用させて加水分解を行っても、または１種類ずつ逐次
に作用させて加水分解を行ってもよい。この場合、バチ
ルス起源のサーモライシンを使用すると、目的物を高収
率で得ることができ好ましい。The neutral protease of microbial origin includes
Examples thereof include thermolyticin which is a thermostable protease derived from Bacillus, metalloprotease derived from Aspergillus, metalloprotease derived from Streptomyces, and metalloprotease derived from Rhizopus. Examples of the alkaline protease of microbial origin include alkaline proteases such as serine protease of Bacillus origin. The above-mentioned neutral protease or alkaline protease may be used alone or in combination of two or more as long as the proteases do not adversely affect each other. When a plurality of neutral proteases are used, they may be simultaneously actuated to effect hydrolysis, or may be actuated one by one sequentially to effect hydrolysis. In this case, when Bacillus-derived thermolysin is used, the desired product can be obtained in high yield, which is preferable.

【００３６】上記のプロテアーゼは、フリーの状態で使
用しても、または固定化して使用してもよい。プロテア
ーゼの使用量は、乾燥した牛乳β−カゼイン１０ｇ当た
り約５，０００〜１，０００，０００unitsの割合で使
用するのがよい。The above protease may be used in a free state or may be immobilized and used. The amount of protease used is preferably about 5,000 to 1,000,000 units per 10 g of dried milk β-casein.

【００３７】プロテアーゼ処理は、各々の状況（例えば
プロテアーゼの種類、プロテアーゼの使用形態等）に応
じて最適のｐＨ、温度、プロテアーゼ量、処理速度、処
理時間等の条件を選択して行うのがよい。効率よく行え
る例としては、サーモライシン等の前記プロテアーゼを
使用する場合は、一般的に温度約３０〜５０℃で、ｐＨ
約６〜８で、０.７５Ｍトリクロロ酢酸への溶解率が約
４０〜８０％になる程度で加水分解を行う方法を挙げる
ことができる。The protease treatment is preferably carried out by selecting optimum conditions such as pH, temperature, protease amount, treatment speed, treatment time and the like according to each situation (for example, type of protease, usage form of protease, etc.). . As an example that can be efficiently carried out, when the above-mentioned protease such as thermolysin is used, generally, at a temperature of about 30 to 50 ° C,
A method of performing hydrolysis at about 6 to 8 and a dissolution rate in 0.75 M trichloroacetic acid of about 40 to 80% can be mentioned.

【００３８】目的とする加水分解状態が達成された時点
で加熱によりプロテアーゼを失活させ、精製した不溶性
固形物を遠心分離等の適当な手段で分離除去し、ペプチ
ド混合物を含有する上澄液を回収する。When the desired hydrolysis state is achieved, the protease is inactivated by heating, the purified insoluble solid is separated and removed by an appropriate means such as centrifugation, and the supernatant containing the peptide mixture is obtained. to recover.

【００３９】次いで、このペプチド混合物を含有する上
澄液から下記に記載する方法によって、高速液体クロマ
トグラフィー（例えば逆相カラムを使用した高速液体ク
ロマトグラフィー）等により処理して配列番号３および
配列番号４で表されるペプチドを単離する。Then, the supernatant containing this peptide mixture was treated by high performance liquid chromatography (for example, high performance liquid chromatography using a reverse phase column) by the method described below to obtain SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3. The peptide represented by 4 is isolated.

【００４０】すなわち、上記の上澄液を高速液体クロマ
トグラフィー(使用カラムは例えばナカライテスク社製
のＯＤＳカラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲに供し
て、０.１％トリフルオロ酢酸水溶液（Ａ液）と０.１％
トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル溶液（Ｂ
液）で、Ｂ液の濃度が０％から４０％まで直線的に増加
する濃度勾配にて溶出し、アセトニトリル濃度が約３２
〜３３％の範囲のピーク画分（画分Ａ）と約３４〜３５
％の範囲のピーク（画分Ｂ）を分取し、そのオピオイド
活性を確認する。That is, the above supernatant was subjected to high performance liquid chromatography (the column used was, for example, Cosmosil 5C 18 -AR, which is an ODS column manufactured by Nacalai Tesque, Inc.), and a 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (solution A) And 0.1%
Acetonitrile solution containing trifluoroacetic acid (B
Solution), the concentration of solution B is linearly increased from 0% to 40%, and the concentration of acetonitrile is about 32.
Peak fraction (fraction A) in the range of ~ 33% and about 34-35
The peak (fraction B) in the range of% is collected and its opioid activity is confirmed.

【００４１】上記で得たオピオイド活性画分（画分Ａ、
画分Ｂ）から溶媒を乾燥等により除去する。これらの乾
燥物のアミノ酸配列を、例えばアプライドバイオシステ
ムス社製のプロテインシーケンサー（４７７−Ａ型）等
を使用して調べて、画分Ａは配列番号３、そして画分Ｂ
は配列番号４で表されるペプチドであることを確認す
る。The opioid active fraction obtained above (fraction A,
The solvent is removed from the fraction B) by drying or the like. The amino acid sequences of these dried products were examined using, for example, a protein sequencer (477-A type) manufactured by Applied Biosystems, and the fraction A was SEQ ID NO: 3 and the fraction B was
Is a peptide represented by SEQ ID NO: 4.

【００４２】［配列番号５および配列番号６で表される
ペプチドの製造方法］上記したように、配列番号５およ
び配列番号６で表されるペプチドは、配列番号３および
配列番号４で表されるペプチドまたは該ペプチドを含有
する混合物をアミノペプチダーゼを用いて加水分解する
ことによって得られる。[Method for producing peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6] As described above, the peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. Obtained by hydrolyzing the peptide or a mixture containing the peptide with aminopeptidase.

【００４３】アミノペプチダーゼは、ロイシンアミノペ
プチダーゼを使用すると目的物を高収率で得ることがで
き好ましい。その際に、アミノペプチダーゼは、フリー
の状態で使用しても、または固定化して使用してもよ
い。アミノペプチダーゼの使用量は、配列番号３および
配列番号４で表されるペプチドが純粋に単離されたもの
である場合またはペプチド混合物中に含有された形態に
なっている場合のいずれの場合も、乾燥した基質１０ｇ
当たり約１０，０００〜１００，０００units の割合で
使用するのがよい。As the aminopeptidase, it is preferable to use leucine aminopeptidase because the desired product can be obtained in high yield. At that time, the aminopeptidase may be used in a free state or may be immobilized and used. The amount of aminopeptidase to be used is either in the case where the peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 are purely isolated or in the form contained in the peptide mixture, 10g dried substrate
It is recommended to use at a rate of about 10,000 to 100,000 units per unit.

【００４４】アミノペプチダーゼ処理も、アミノペプチ
ダーゼの種類に応じて反応条件を選択して行うのがよ
い。例えば、ロイシンアミノペプチダーゼを使用する場
合は、液のｐＨを６〜８に調整し、温度約３０〜５０℃
で約５〜１５時間加水分解を行うのがよい。目的とする
加水分解が達成された時点で加熱によりアミノペプチダ
ーゼを失活させ、反応液中に含まれる配列番号５および
配列番号６で表されるペプチドを回収する。The aminopeptidase treatment is also preferably carried out by selecting reaction conditions according to the type of aminopeptidase. For example, when using leucine aminopeptidase, the pH of the solution is adjusted to 6 to 8 and the temperature is set to about 30 to 50 ° C.
It is advisable to carry out hydrolysis for about 5 to 15 hours. When the desired hydrolysis is achieved, the aminopeptidase is inactivated by heating, and the peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 contained in the reaction solution are recovered.

【００４５】基質として、純粋に単離された配列番号３
および配列番号４で表されるペプチドを用いた場合は、
このアミノペプチダーゼ処理により、配列番号５および
配列番号６で表されるペプチドの各々がほぼ１００％の
収率で得られる。As substrate, purely isolated SEQ ID NO: 3
And when the peptide represented by SEQ ID NO: 4 is used,
By this treatment with aminopeptidase, each of the peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 is obtained in a yield of almost 100%.

【００４６】基質として、配列番号３および配列番号４
で表されるペプチドを含有する牛乳β−カゼインの酵素
分解物を用いた場合は、上記の逆相系カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーにより、配列番号５および配
列番号６のペプチドを単離する。条件は、配列番号３お
よび配列番号４で表されるペプチドに使用したのと同様
にして行い、アセトニトリル濃度が約２９〜３０％の範
囲のピーク画分（画分Ｃ）と約３１〜３２％の範囲のピ
ーク（画分Ｄ）を分取し、そのオピオイド活性を確認
し、上記と同様にしてアミノ酸配列を調べ、画分Ｃは配
列番号５のペプチドであり、画分Ｄは配列番号６のペプ
チドであることを確認する。SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as substrates
When the enzymatic degradation product of milk β-casein containing the peptide represented by is used, the peptides of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 are isolated by high performance liquid chromatography using the above-mentioned reversed phase column. . The conditions were the same as those used for the peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and the peak fraction (fraction C) having an acetonitrile concentration in the range of about 29 to 30% and about 31 to 32% were used. Of the peak (fraction D) in the range of 10%, the opioid activity thereof was confirmed, the amino acid sequence was examined in the same manner as described above, the fraction C was the peptide of SEQ ID NO: 5, and the fraction D was SEQ ID NO: 6. Confirm that the peptide is.

【００４７】［配列番号１７で表される既知のペプチド
であるβ-casomorphin７の製造方法]上記したように、
配列番号１７で表される既知のペプチドであるβ-casom
orphin７は、配列番号５で表されるペプチドまたは該ペ
プチドを含有する混合物をカルボキシペプチダーゼを用
いて加水分解することによって得られる。[Method for producing β-casomorphin7, a known peptide represented by SEQ ID NO: 17] As described above,
Β-casom, a known peptide represented by SEQ ID NO: 17
Orphin7 is obtained by hydrolyzing the peptide represented by SEQ ID NO: 5 or a mixture containing the peptide with carboxypeptidase.

【００４８】カルボキシペプチダーゼは、カルボキシペ
プチダーゼＡを使用すると目的物を高収率で得ることが
でき好ましい。その際に、カルボキシペプチダーゼは、
フリーの状態で使用しても、または固定化して使用して
もよい。カルボキシペプチダーゼの使用量は、配列番号
５で表されるペプチドが純粋に単離されたものであって
も、またはペプチド混合物中に含有された形態になって
いるものであっても、いずれの場合も、乾燥した基質１
０ｇ当り約１０,０００〜５００,０００unitsの割合で
使用するのがよい。Carboxypeptidase A is preferable because carboxypeptidase A can be used to obtain the desired product in high yield. At that time, carboxypeptidase,
It may be used in a free state or fixed and used. The amount of carboxypeptidase to be used is irrespective of whether the peptide represented by SEQ ID NO: 5 is a purely isolated peptide or a peptide contained in a peptide mixture. Dried substrate 1
It is recommended to use at a rate of about 10,000 to 500,000 units per 0 g.

【００４９】カルボキシペプチダーゼ処理も、カルボキ
シペプチダーゼの種類に応じて反応条件を選択して行う
のがよい。例えば、カルボキシペプチダーゼＡを使用す
る場合は、液のｐＨを６〜８に調整し、温度約３０〜５
０℃で約５〜１５時間加水分解を行うのがよい。目的と
する加水分解が達成された時点で加熱によりカルボキシ
ペプチダーゼを失活させ、反応液中に含まれる配列番号
１７で表される既知のペプチドであるβ−casomorphin
７を回収する。The carboxypeptidase treatment is also preferably carried out by selecting reaction conditions according to the type of carboxypeptidase. For example, when carboxypeptidase A is used, the pH of the liquid is adjusted to 6 to 8 and the temperature is set to about 30 to 5
The hydrolysis is preferably carried out at 0 ° C. for about 5 to 15 hours. When the desired hydrolysis is achieved, the carboxypeptidase is inactivated by heating, and β-casomorphin, which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 17 contained in the reaction solution.
Collect 7.

【００５０】基質として、純粋に単離された配列番号５
で表されるペプチドを用いた場合は、このカルボキシペ
プチダーゼ処理により、配列番号１７で表される既知の
ペプチドであるβ-casomorphin７がほぼ１００％の収率
で得られる。As a substrate, purely isolated SEQ ID NO: 5
When the peptide represented by the formula (3) is used, β-casomorphin7, which is the known peptide represented by SEQ ID NO: 17, is obtained in a yield of about 100% by this carboxypeptidase treatment.

【００５１】基質として、配列番号５で表されるペプチ
ドを含有する牛乳β−カゼインの酵素分解物を用いた場
合は、上記の逆相系カラムを用いた高速液体クロマトグ
ラフィーにより、配列番号１７で表される既知のペプチ
ドであるβ-casomorphin７を単離する。条件は、配列番
号３および配列番号４で表されるペプチドに使用したの
と同様にして行い、アセトニトリル濃度が約３４〜３５
％の範囲のピーク画分（画分Ｅ）を分取し、この画分の
オピオイド活性を確認し、上記と同様にしてアミノ酸配
列を調べ、画分Ｅは配列番号１７のペプチドであるβ-c
asomorphin７であることを確認する。When an enzymatic degradation product of milk β-casein containing the peptide represented by SEQ ID NO: 5 was used as a substrate, it was identified by SEQ ID NO: 17 by high performance liquid chromatography using the above reverse phase column. The known peptide, β-casomorphin7, is isolated. The conditions were the same as those used for the peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, and the acetonitrile concentration was about 34-35.
The peak fraction (fraction E) in the range of 10% was collected, the opioid activity of this fraction was confirmed, and the amino acid sequence was examined in the same manner as above. Fraction E was the peptide of SEQ ID NO: 17 β- c
Make sure it is asomorphin 7.

【００５２】また、配列番号１または配列番号２で表さ
れる本発明の新規なペプチドを化学合成により製造する
方法について、配列番号３で表されるペプチドを例にと
って説明すると、例えば次の方法を採用することができ
る。本発明ペプチドの化学合成法 米国バイオサーチ社のＳＡＭ ＴＷＯ 型自動ペプチド合
成装置を使用して同装置の標準プロトコールにしたがっ
て合成を行う。すなわち、Boc（ブトキシカルボニル)−
Asn−樹脂を４５％トリフルオロ酢酸を含むデブロック
液で処理した後に、Boc−Hisをジイソプロピルカルボジ
イミドの存在下でカップリングさせて、Boc−His−Asn
樹脂を得る。以下、上記と同様にデブロッキングとカッ
プリングを繰り返して、Boc−Val−Tyr（Cl2−Bzl）−P
ro−Phe−Pro−Gly−Pro−Ile−His−Asn樹脂を得る。
このペプチド樹脂を１０％アニソールを含むフッ化水素
中に入れて０℃で２時間撹拌する。フッ化水素を留去し
た後、エーテルで残留物を洗浄し、３０％酢酸でペプチ
ドを抽出する。抽出して得た粗ペプチドをＯＤＳカラム
による高速液体クロマトグラフィーを使用して精製する
ことにより、配列番号３で表されるペプチドを得る。A method for producing the novel peptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by chemical synthesis will be described by taking the peptide represented by SEQ ID NO: 3 as an example. Can be adopted. Method for chemically synthesizing peptide of the present invention Synthesis is carried out using a SAM TWO type automatic peptide synthesizer manufactured by Biosearch, Inc. according to a standard protocol of the same. That is, Boc (butoxycarbonyl)-
After treating the Asn-resin with a deblocking solution containing 45% trifluoroacetic acid, Boc-His was coupled in the presence of diisopropylcarbodiimide to give Boc-His-Asn
Get the resin. Thereafter, deblocking and coupling were repeated in the same manner as above to obtain Boc-Val-Tyr (Cl 2 -Bzl) -P.
A ro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn resin is obtained.
The peptide resin is placed in hydrogen fluoride containing 10% anisole and stirred at 0 ° C. for 2 hours. After distilling off hydrogen fluoride, the residue is washed with ether and the peptide is extracted with 30% acetic acid. The crude peptide obtained by extraction is purified using high performance liquid chromatography with an ODS column to obtain the peptide represented by SEQ ID NO: 3.

【００５３】また、配列番号１または配列番号２に包含
される他のペプチドについても、上記と同様の操作によ
って合成および精製を行うことにより、目的とするペプ
チドを得ることができる。The target peptide can be obtained by synthesizing and purifying other peptides included in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 by the same operation as described above.

【００５４】そして、上記のようにして製造された配列
番号１または配列番号２で表されるペプチドおよびその
塩、並びにその化学構造は未だ解明されていないが乳蛋
白、特に牛乳β−カゼインを微生物起源の中性プロテア
ーゼまたはアルカリ性プロテアーゼで加水分解して得ら
れるオピオイドペプチドおよびその塩を有効成分として
含有する本発明のオピオイド活性を有する剤は、鎮痛、
麻酔、情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免
疫、インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌
調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等に関与して
いる可能性があり、例えば鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管
ホルモン分泌促進剤、電解質吸収促進剤、腸管ぜん動抑
制による下痢改善剤等として、人間や種々の動物に投与
することができる。The peptide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 produced as described above and its salt, and its chemical structure have not yet been elucidated, but milk protein, particularly milk β-casein, is used as a microorganism. The agent having opioid activity of the present invention containing an opioid peptide obtained by hydrolysis with a neutral protease or alkaline protease of origin and a salt thereof as an active ingredient is analgesic,
Anesthesia, emotion, respiration, pulsation, body temperature, gastrointestinal function, feeding, immunity, regulation of secretion of hormones such as insulin and somatostatin, promotion of absorption of electrolytes, regulation of myocardial contraction, etc. It can be administered to humans and various animals as an analgesic anesthetic, hypnotic, digestive tract hormone secretagogue, electrolyte absorption enhancer, diarrhea improving agent by suppressing intestinal peristalsis.

【００５５】更に、配列番号１または配列番号２で表さ
れるペプチドおよびその塩を有効成分として含有する本
発明のＡＣＥ阻害活性を有する剤は、ＡＣＥ阻害活性に
より、血圧の上昇に関与するＡＣＥの作用を阻害して、
血圧の上昇抑制、血圧降下等に関与し、例えば血圧の上
昇抑制剤、血圧降下剤等として人間や種々の動物に投与
することができる。Furthermore, the agent having the ACE inhibitory activity of the present invention, which comprises the peptide represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and a salt thereof as an active ingredient, is the ACE inhibitory activity of ACE which is involved in elevation of blood pressure. Inhibit the action,
It is involved in suppression of increase in blood pressure, decrease in blood pressure and the like, and can be administered to humans and various animals as, for example, an agent for suppressing increase in blood pressure, an antihypertensive agent and the like.

【００５６】そして、上記のオピオイドペプチド活性を
有する剤およびＡＣＥ阻害活性を有する剤においては、
上記のペプチドおよびその塩を、１種類のみ使用しても
または２種以上のペプチドを含む混合物の形態で使用し
てもよい。それらの剤の好適な投与量は、投与される人
間や動物の年令、体重、性別、症状、動物の種類等の種
々の条件によって異なる。And in the above-mentioned agent having opioid peptide activity and agent having ACE inhibitory activity,
The above peptides and salts thereof may be used alone or in the form of a mixture containing two or more peptides. The suitable dose of these agents varies depending on various conditions such as age, weight, sex, symptom, kind of animal, etc. of the human or animal to be administered.

【００５７】上記の剤はいずれも経口または非経口によ
って投与可能であり、更に単独で投与しても、また製薬
工業において通常使用されている固体担体や液状担体と
一緒に投与してもよく、或は他の薬剤と混合または組合
わせて使用することができる。また投与形態は、錠剤、
丸剤、顆粒剤、カプセル、散剤、水溶液、注射剤等の任
意の形態が可能である。更に、本発明のオピオイド活性
を有する剤およびＡＣＥ阻害活性を有する剤は、食品や
飼料中に添加して、またはそれらと一緒に投与すること
もでき、その場合に乳蛋白から得られたペプチドが安全
性が高く望ましい。以下に、本発明を例を挙げて具体的
に説明するが本発明はそれらによって限定されない。Each of the above-mentioned agents can be administered orally or parenterally, and may be administered alone or in combination with a solid carrier or liquid carrier usually used in the pharmaceutical industry, Alternatively, it can be used as a mixture or combination with other drugs. The dosage form is a tablet,
Any form such as pills, granules, capsules, powders, aqueous solutions, injections, etc. is possible. Furthermore, the agent having an opioid activity and the agent having an ACE inhibitory activity of the present invention can be added to foods or feeds, or can be administered together therewith, in which case a peptide obtained from milk protein is used. Highly safe and desirable. The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

【００５８】[0058]

【実施例】実施例 １ ［牛乳β−カゼインの加水分解による配列番号３および
配列番号４で表されるペプチドの調製］牛乳β−カゼイ
ン１００ｍｇを１０ｍｌの蒸留水に分散溶解させ、サー
モライシン（ペプチド研究所製）０．５ｍｇ（約４，０
００units）を加えて３７℃で５時間インキュベートし
た。反応終了後、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活
させ、６，０００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を除
き、得られた上澄液を凍結乾燥して加水分解物約９０ｍ
ｇを得た。EXAMPLES Example 1 [Preparation of peptides represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 by hydrolysis of milk β-casein] 100 mg of milk β-casein was dispersed and dissolved in 10 ml of distilled water, and thermolysin (Peptide study was conducted. 0.5 mg (about 4.0)
00 units) was added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by heating at 90 ° C. for 20 minutes, the mixture was centrifuged at 6,000 G for 20 minutes to remove insoluble matter, and the obtained supernatant was freeze-dried to give about 90 m of hydrolyzate.
g was obtained.

【００５９】上記で得た加水分解物１０ｍｇをナカライ
テスク社製ＯＤＳカラムであるCosmosil ５Ｃ18−ＡＲ
（内径２０ｍｍ、長さ２５０ｍｍ）を使用した逆相クロ
マトグラフィーに供した。次いで０.１％トリフルオロ
酢酸水溶液（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢酸を含有
するアセトニトリル溶液（Ｂ液）を使用して、Ｂ液の濃
度が０％から４０％まで直線的に増加する濃度勾配にて
１０ｍｌ／分の流速で溶出させた。その時の波長２２０
ｎｍにおけるフローチャートを図１に示す。図１に示し
たフローチャートにおける各画分を分取してそのオピオ
イド活性を測定したところ、アセトニトリルの濃度が約
３２〜３３％の範囲で溶出してくる画分（画分Ａ）と約
３４〜３５％の範囲で溶出してくる画分（画分Ｂ）にオ
ピオイド活性が認められた。そこで、このオピオイド活
性画分（画分Ａ、画分Ｂ）を回収して、濃縮乾燥した。
なお、図１において、左側縦軸は溶離してきた液のＡｂ
ｓ．２２０を、右側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃
度（％）を示す。10 mg of the hydrolyzate obtained above was used as an ODS column manufactured by Nacalai Tesque Cosmosil 5C 18 -AR.
It was subjected to reverse phase chromatography using (inner diameter 20 mm, length 250 mm). Next, using 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution (Solution A) and acetonitrile solution containing 0.1% trifluoroacetic acid (Solution B), the concentration of Solution B was increased linearly from 0% to 40%. Elution was performed with a concentration gradient of 10 ml / min. Wavelength 220 at that time
A flow chart for nm is shown in FIG. Fractions in the flow chart shown in FIG. 1 were collected and their opioid activity was measured. As a result, the fraction eluted with a concentration of acetonitrile in the range of about 32 to 33% (fraction A) and about 34 to Opioid activity was observed in the fraction (fraction B) eluting in the range of 35%. Then, this opioid active fraction (fraction A, fraction B) was collected and concentrated and dried.
In FIG. 1, the left vertical axis represents Ab of the eluted liquid.
s. 220, and the vertical axis on the right side represents the concentration (%) of acetonitrile in the eluent.

【００６０】上記で得た乾燥物をアプライドバイオシス
テム社製のプロテインシーケンサー４７７−Ａ型を使用
してそのアミノ酸配列を調べたところ、画分Ａの乾燥物
は、構成アミノ酸のすべてがＬ体であり、Ｎ末端から順
次Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn の配列か
らなる配列番号３で表されるペプチドであることが確認
された。また、画分Ｂの乾燥物は、構成アミノ酸のすべ
てがＬ体であり、Ｎ末端から順次Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-
Gly-Pro-Ile-Pro-Asn の配列からなる配列番号４で表さ
れるペプチドであることが確認された。The amino acid sequence of the dried product obtained above was examined using a protein sequencer type 477-A manufactured by Applied Biosystems. As a result, the dried product of Fraction A had all the constituent amino acids in the L form. It was confirmed that the peptide was represented by SEQ ID NO: 3 consisting of the sequence of Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn in order from the N-terminal. In the dried product of fraction B, all of the constituent amino acids were L-form, and Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 4 consisting of the sequence of Gly-Pro-Ile-Pro-Asn.

【００６１】配列番号３および配列番号４で表される各
ペプチドの原料牛乳β−カゼインからの収率（％）を、
その分子量とＡｂｓ.280における分子吸光係数から求め
たところ、各々約１％および約１．５％であり、極めて
高い収率であった。The yield (%) of each peptide represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 from the raw milk β-casein was calculated as
From the molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs. 280, they were about 1% and about 1.5%, respectively, showing extremely high yields.

【００６２】また、シリカゲルプレートによる薄層クロ
マトグラフィーでＲｆ値を求めたところ、ブタノール：
酢酸：ピリジン：水＝１５：３：１０：１２の展開溶媒
を使用した場合のＲｆ値は、配列番号３で表されるペプ
チドが０．４９であり、配列番号４で表されるペプチド
が０.５７であった。When the Rf value was determined by thin layer chromatography on a silica gel plate, butanol:
The Rf value when using a developing solvent of acetic acid: pyridine: water = 15: 3: 10: 10 is 0.49 for the peptide represented by SEQ ID NO: 3 and 0 for the peptide represented by SEQ ID NO: 4. It was .57.

【００６３】実施例 ２ ［配列番号３および配列番号４で表されるペプチドから
の配列番号５および配列番号６で表されるペプチドの調
製］実施例１と同様の処理により、牛乳β−カゼインの
サーモライシン加水分解物８０ｍｇから、配列番号３で
表されるペプチド約８００μｇ、配列番号４で表される
ペプチド約１２００μｇを純粋に単離した（各ペプチド
量はその分子量とＡｂｓ．２８０における分子吸光係数
から求めた）。 Example 2 [Preparation of peptide represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 from peptide represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4] By the same treatment as in Example 1, milk β-casein was prepared. About 80 μg of the peptide represented by SEQ ID NO: 3 and about 1200 μg of the peptide represented by SEQ ID NO: 4 were purely isolated from 80 mg of thermolysin hydrolyzate (the amount of each peptide was determined from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs.280). Asked).

【００６４】上記で単離されたペプチドを１ｍｌの蒸留
水に溶解させ、１Ｎ NaOHでｐＨを７に調整した後、ロ
イシンアミノペプチダーゼ（シグマ社製）を各ペプチド
に対して、その重量に基づいて約５％（約２０units）
添加し、３６℃で約１６時間インキュベートした。反応
終了後、９０℃で２０分間加熱して酵素を失活させた
後、実施例１で用いたのと同様の高速液体クロマトグラ
フィーに供し、反応液中に含まれるペプチドを精製し
た。配列番号３のペプチドの加水分解物からは、アセト
ニトリルの濃度が約２９〜３０％の範囲で溶出してくる
画分にオピオイド活性が認められ、また配列番号４のペ
プチドの加水分解からはアセトニトリル濃度が約３１〜
３２％の範囲で溶出してくる画分にオピオイド活性が認
められた。そこで、これらのオピオイド活性画分を回収
し、濃縮乾燥した。The peptide isolated above was dissolved in 1 ml of distilled water, the pH was adjusted to 7 with 1N NaOH, and leucine aminopeptidase (manufactured by Sigma) was added to each peptide based on its weight. About 5% (about 20units)
Add and incubate at 36 ° C. for about 16 hours. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by heating at 90 ° C. for 20 minutes and then subjected to the same high performance liquid chromatography as used in Example 1 to purify the peptide contained in the reaction solution. From the hydrolyzate of the peptide of SEQ ID NO: 3, opioid activity was observed in the fraction eluted with the concentration of acetonitrile in the range of about 29 to 30%, and from the hydrolysis of the peptide of SEQ ID NO: 4, the concentration of acetonitrile was confirmed. Is about 31-
Opioid activity was observed in the fractions eluting in the 32% range. Therefore, these opioid active fractions were collected and concentrated and dried.

【００６５】上記で得た乾燥物を実施例１で用いたプロ
テインシーケンサーを使用してそのアミノ酸配列を調べ
たところ、配列番号３で表されるペプチドの加水分解物
から得られた乾燥物は、その構成アミノ酸のすべてがＬ
体であり、Ｎ末端から順次Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Il
e-His-Asn の配列からなる配列番号５で表されるペプチ
ドであることが確認された。また、配列番号４で表され
るペプチドの加水分解物から得られた乾燥物は、構成ア
ミノ酸のすべてがＬ体であり、Ｎ末端から順次Tyr-Pro-
Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn の配列からなる配列番号
６で表されるペプチドであることが確認された。When the amino acid sequence of the dried product obtained above was examined using the protein sequencer used in Example 1, a dried product obtained from the hydrolyzate of the peptide represented by SEQ ID NO: 3 was obtained. All of its constituent amino acids are L
Body, Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Il in order from the N-terminus
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 5 consisting of the e-His-Asn sequence. Further, the dried product obtained from the hydrolyzate of the peptide represented by SEQ ID NO: 4 has all the constituent amino acids in the L form, and Tyr-Pro-
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 6 consisting of the sequence of Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn.

【００６６】配列番号５および配列番号６で表される各
ペプチドの、配列番号３および配列番号４で表されるペ
プチドからの収率（％）を、その分子量とＡｂｓ.280に
おける分子吸光係数から求めたところ、いずれもほぼ１
００％であった。The yield (%) of each peptide represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 from the peptide represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was calculated from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs. 280 . When asked, both are almost 1
It was 00%.

【００６７】また、実施例１と同様にシリカゲルプレー
トによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたとこ
ろ、Ｒｆ値は配列番号５で表されるペプチドが０．４６
であり、配列番号６で表されるペプチドが０.５９であ
った。When the Rf value was determined by thin layer chromatography on a silica gel plate as in Example 1, the Rf value was 0.46 for the peptide represented by SEQ ID NO: 5.
And the peptide represented by SEQ ID NO: 6 was 0.59.

【００６８】実施例 ３ ［配列番号５で表されるペプチドからの配列番号１７で
表される既知のペプチドで あるβ−casomorphin７の
調製］実施例２で得られた配列番号５で表されるペプチ
ド５００μｇを１ｍｌの蒸留水に溶解させ、１Ｎ NaOH
でｐＨを７に調整した後、カルボキシペプチダーゼＡ
（シグマ社製）をペプチドに対して、その重量に基づい
て約５％（約１２．５units）添加し、３６℃で約１６
時間インキュベートした。反応終了後、９０℃で２０分
間加熱して酵素を失活させた後、反応液を実施例１で用
いたのと同様の高速液体クロマトグラフィーに供し、反
応液中に含まれるペプチドを精製した。配列番号５のペ
プチドの加水分解物からは、アセトニトリルの濃度が約
３４〜３５％の範囲で溶出してくる画分にオピオイド活
性が認められた。そこで、このオピオイド活性画分を回
収し、濃縮乾燥した。 Example 3 [Preparation of β-casomorphin7 which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 17 from the peptide represented by SEQ ID NO: 5] The peptide represented by SEQ ID NO: 5 obtained in Example 2 Dissolve 500 μg in 1 ml distilled water and add 1N NaOH.
After adjusting the pH to 7 with carboxypeptidase A
(Manufactured by Sigma) was added to the peptide in an amount of about 5% (about 12.5 units) based on the weight, and the amount was about 16 at 36 ° C.
Incubated for hours. After the reaction was completed, the enzyme was inactivated by heating at 90 ° C. for 20 minutes, and then the reaction solution was subjected to the same high performance liquid chromatography as that used in Example 1 to purify the peptide contained in the reaction solution. . From the hydrolyzate of the peptide of SEQ ID NO: 5, opioid activity was observed in the fraction eluted with the concentration of acetonitrile in the range of about 34 to 35%. Therefore, this opioid active fraction was collected and concentrated and dried.

【００６９】上記で得た乾燥物を実施例１で用いたプロ
テインシーケンサーを使用してそのアミノ酸配列を調べ
たところ、その構成アミノ酸のすべてがＬ体であり、Ｎ
末端から順次Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile の配列から
なる配列番号１７で表されるペプチドであるβ−casomo
rphin７であることが確認された。配列番号１７で表さ
れる既知のペプチドであるβ−casomorphin７の、配列
番号５で表されるペプチドからの収率（％）を、その分
子量とＡｂｓ.280における分子吸光係数から求めたとこ
ろ、ほぼ１００％であった。また、実施例１と同様にシ
リカゲルプレートによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ
値を求めたところ、Ｒｆ値は０.７２であった。When the amino acid sequence of the dried product obtained above was examined using the protein sequencer used in Example 1, all of the constituent amino acids were L-form and N-form.
Β-casomo, which is the peptide represented by SEQ ID NO: 17 consisting of the sequence of Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile in order from the end
It was confirmed to be rphin7. The yield (%) of β-casomorphin7, which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 17, from the peptide represented by SEQ ID NO: 5 was calculated from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs. 280 . It was 100%. Also, as in Example 1, Rf was determined by thin layer chromatography on a silica gel plate.
When the value was obtained, the Rf value was 0.72.

【００７０】実施例 ４ ［牛乳β−カゼインの加水分解による配列番号５および
配列番号６で表されるペプチドの調製］牛乳β−カゼイ
ン１００ｍｇを１０ｍｌの蒸留水に分散溶解させ、サー
モライシン（ペプチド研究所製）０．５ｍｇ（約４，０
００units）を加えて３７℃で５時間インキュベートし
た。反応終了後、更にロイシンアミノペプチダーゼ（シ
グマ社製）を５ｍｇ（約１，０００units）添加し、３
６℃で約１６時間インキュベートした。反応終了後、９
０℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、６０００Ｇで
２０分間遠心分離して不溶物を除き、得られた上澄液を
凍結乾燥して加水分解物約８０ｍｇを得た。 Example 4 [Preparation of peptides represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 by hydrolysis of milk β-casein] 100 mg of milk β-casein was dispersed and dissolved in 10 ml of distilled water, and thermolysin (Peptide Institute) was used. Made) 0.5 mg (about 4,0
00 units) was added and incubated at 37 ° C. for 5 hours. After the reaction was completed, 5 mg (about 1,000 units) of leucine aminopeptidase (manufactured by Sigma) was further added, and 3
Incubated at 6 ° C for about 16 hours. After completion of the reaction, 9
The enzyme was inactivated by heating at 0 ° C. for 20 minutes, the mixture was centrifuged at 6000 G for 20 minutes to remove insoluble matter, and the obtained supernatant was freeze-dried to obtain about 80 mg of a hydrolyzate.

【００７１】上記で得た加水分解物１０ｍｇを実施例１
で用いたのと同様の高速液体クロマトグラフィーに供
し、溶出させた。その時の波長２２０ｎｍにおけるフロ
ーチャートを図２に示す。図２に示したフローチャート
における各画分を分取してそのオピオイド活性を測定し
たところ、アセトニトリルの濃度が約２９〜３０％の範
囲で溶出してくる画分（画分Ｃ）と約３１〜３２％の範
囲で溶出してくる画分（画分Ｄ）にオピオイド活性が認
められた。そこで、このオピオイド活性画分（画分Ｃ、
画分Ｄ）を回収して、濃縮乾燥した。なお、図２におい
て、左側縦軸は溶離してきた液のＡｂｓ．２２０を、右
側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃度（％）を示す。10 mg of the hydrolyzate obtained above was used in Example 1.
The sample was subjected to the same high-performance liquid chromatography as that used in 1. and eluted. A flow chart at a wavelength of 220 nm at that time is shown in FIG. The fractions in the flow chart shown in FIG. 2 were collected and the opioid activity thereof was measured. As a result, the fraction eluted with a concentration of acetonitrile in the range of about 29 to 30% (fraction C) and about 31 to 30%. Opioid activity was observed in the fraction eluting in the range of 32% (fraction D). Therefore, this opioid active fraction (fraction C,
Fraction D) was collected and concentrated to dryness. In FIG. 2, the left vertical axis indicates Abs. 220, and the vertical axis on the right side represents the concentration (%) of acetonitrile in the eluent.

【００７２】上記で得た乾燥物を実施例１で用いたプロ
テインシーケンサーを使用してそのアミノ酸配列を調べ
たところ、画分Ｃから得られた乾燥物は、その構成アミ
ノ酸のすべてがＬ体であり、Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-
Ile-His-Asn の配列からなる配列番号５で表されるペプ
チドであることが確認された。また、画分Ｄから得られ
た乾燥物は、構成アミノ酸の全てがＬ体であり、Tyr-Pr
o-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn の配列からなる配列番
号６で表されるペプチドであることが確認された。When the amino acid sequence of the dried product obtained above was examined using the protein sequencer used in Example 1, the dried product obtained from fraction C was found to have all the constituent amino acids in the L form. Yes, Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 5 consisting of the Ile-His-Asn sequence. Further, the dried product obtained from the fraction D had all the constituent amino acids in the L-form, and Tyr-Pr
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 6 consisting of the sequence o-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn.

【００７３】配列番号５および配列番号６で表される各
ペプチドの、原料牛乳β−カゼインからの収率（％）
を、その分子量とＡｂｓ.280における分子吸光係数から
求めたところ、各々、約０．９％および約１．４％であ
ることが確認された。Yield (%) of each peptide represented by SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 from raw milk β-casein
Was determined from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs. 280 , and it was confirmed to be about 0.9% and about 1.4%, respectively.

【００７４】また、実施例１と同様にシリカゲルプレー
トによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたとこ
ろ、Ｒｆ値は配列番号５で表されるペプチドが０．４６
であり、配列番号６で表されるペプチドが０.５９であ
った。When the Rf value was determined by thin layer chromatography on a silica gel plate in the same manner as in Example 1, the Rf value was 0.46 for the peptide represented by SEQ ID NO: 5.
And the peptide represented by SEQ ID NO: 6 was 0.59.

【００７５】実施例 ５ ［牛乳β−カゼインの加水分解による配列番号１７で表
される既知のペプチドであ るβ−casomorphin７の調
製］牛乳β−カゼイン１００ｍｇを１０ｍｌの蒸留水に
分散溶解させ、サーモライシン（ペプチド研究所製）
０．５ｍｇ（約４，０００units）を加えて３７℃で５
時間インキュベートした。反応終了後、更にロイシンア
ミノペプチダーゼ（シグマ社製）５ｍｇ(約１，０００u
nits）とカルボキシペプチダーゼＡ５ｍｇ（約２，５０
０units）を添加し、３６℃で約１６時間インキュベー
トした。反応終了後、９０℃で２０分間加熱して酵素を
失活させ、６０００Ｇで２０分間遠心分離して不溶物を
除き、得られた上澄液を凍結乾燥して加水分解物約８０
ｍｇを得た。 Example 5 [Preparation of β-casomorphin7, a known peptide represented by SEQ ID NO: 17 by hydrolysis of milk β-casein] 100 mg of milk β-casein was dispersed and dissolved in 10 ml of distilled water to prepare thermolysin. (Made by Peptide Institute)
Add 0.5mg (about 4,000units) and add 5 at 37 ℃
Incubated for hours. After the reaction, leucine aminopeptidase (manufactured by Sigma) 5 mg (about 1,000 u)
nits) and carboxypeptidase A 5 mg (about 2,500
0 units) was added and incubated at 36 ° C. for about 16 hours. After completion of the reaction, the enzyme was inactivated by heating at 90 ° C. for 20 minutes, centrifuged at 6000 G for 20 minutes to remove insoluble matter, and the resulting supernatant was lyophilized to hydrolyze about 80
mg was obtained.

【００７６】上記で得た加水分解物１０ｍｇを実施例１
で用いたのと同様の高速液体クロマトグラフィーに供
し、溶出させた。その時の波長２２０ｎｍにおけるフロ
ーチャートを図３に示す。図３に示したフローチャート
における各画分を分取してそのオピオイド活性を測定し
たところ、アセトニトリルの濃度が約３１〜３２％の範
囲で溶出してくる画分（画分Ｅ）と約３４〜３５％の範
囲で溶出してくる画分（画分Ｆ）にオピオイド活性が認
められた。そこで、これらのオピオイド活性画分（画分
Ｅ、画分Ｆ）を回収して、濃縮乾燥した。なお、図３に
おいて、左側縦軸は溶離してきた液のＡｂｓ．２２０
を、右側縦軸は溶離液中のアセトニトリル濃度（％）を
示す。10 mg of the hydrolyzate obtained above was used in Example 1.
The sample was subjected to the same high-performance liquid chromatography as that used in 1. and eluted. A flow chart at a wavelength of 220 nm at that time is shown in FIG. Fractions in the flow chart shown in FIG. 3 were collected and their opioid activity was measured. As a result, the fraction eluted with a concentration of acetonitrile of about 31 to 32% (Fraction E) and about 34 to Opioid activity was observed in the fraction (fraction F) eluting in the range of 35%. Then, these opioid active fractions (fraction E, fraction F) were collected and concentrated and dried. In FIG. 3, the left vertical axis indicates Abs. 220
And the vertical axis on the right side shows the concentration (%) of acetonitrile in the eluent.

【００７７】上記で得た乾燥物を実施例１で用いたプロ
テインシーケンサーを使用してそのアミノ酸配列を調べ
たところ、画分Ｅから得られた乾燥物は、構成アミノ酸
の全てがＬ体であり、Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pr
o-Asn の配列からなる配列番号６で表されるペプチドで
あることが確認された。また、画分Ｆから得られた乾燥
物は、その構成アミノ酸のすべてがＬ体であり、Tyr-Pr
o-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile の配列からなる配列番号１７で
表されるペプチドであることが確認された。When the amino acid sequence of the dried product obtained above was examined using the protein sequencer used in Example 1, the dried product obtained from fraction E was found to have all the constituent amino acids in the L form. , Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pr
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 6 consisting of the o-Asn sequence. Further, the dried product obtained from the fraction F has all of its constituent amino acids in the L form, and Tyr-Pr
It was confirmed to be the peptide represented by SEQ ID NO: 17 consisting of the o-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile sequence.

【００７８】また、配列番号６で表されるペプチドおよ
び配列番号１７で表される既知のペプチドであるβ-cas
omoriphin７の、原料牛乳β−カゼインに対する収率
（％）を、その分子量とＡｂｓ.280における分子吸光係
数から求めたところ、各々約１．４％および約０．７％
であることが確認された。Further, β-cas, which is a peptide represented by SEQ ID NO: 6 and a known peptide represented by SEQ ID NO: 17,
The yield (%) of omoriphin7 with respect to the raw milk β-casein was calculated from its molecular weight and the molecular extinction coefficient at Abs. 280, and it was about 1.4% and about 0.7%, respectively.
Was confirmed.

【００７９】また、実施例１と同様にシリカゲルプレー
トによる薄層クロマトグラフィーでＲｆ値を求めたとこ
ろ、実施例２と同様に配列番号６で表されるペプチドが
０．５９であり、実施例３と同様に配列番号１７で表さ
れる既知のペプチドであるβ-casomoriphin７が０.７２
であった。When the Rf value was determined by thin layer chromatography on a silica gel plate in the same manner as in Example 1, the peptide represented by SEQ ID NO: 6 was 0.59 as in Example 2, and Example 3 Similarly, β-casomoriphin7, which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 17, is 0.72.
Met.

【００８０】実施例 ６ ［配列番号３〜配列番号１６で表されるペプチドの化学
合成］配列番号３で表されるペプチドの合成は以下の方
法で行った。市販のBoc(ブトキシカルボニル)−Asn−樹
脂(置換率０.５ｍｅｑ／ｇ)０.２ｇと４５％トリフルオ
ロ酢酸および２.５％アニソールを含む塩化メチレン２
０ｍｌをバイオサーチ社のペプチド合成装置 ＳＡＭ Ｔ
ＷＯの反応槽の中で室温で２５分間反応させてBoc基を
除去した。次にBoc基の除去されたAsn−樹脂を塩化メチ
レンで洗浄し、次いで１０％のジイソプロピルエチルア
ミンを含む塩化メチレンにより中和した後、更に塩化メ
チレンで洗浄した。この樹脂に０.４Ｍ Boc−Hisのジメ
チルホルムアミド溶液５ｍｌ、０.４Ｍジイソプロピル
カルボジイミドの塩化メチレン溶液５ｍｌを混合して反
応槽に入れて室温で２時間撹拌下に反応させた。 Example 6 [Chemical synthesis of peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 16] The peptide represented by SEQ ID NO: 3 was synthesized by the following method. Methylene chloride 2 containing 0.2 g of commercially available Boc (butoxycarbonyl) -Asn-resin (substitution rate 0.5 meq / g) and 45% trifluoroacetic acid and 2.5% anisole.
0 ml of the biosearch peptide synthesizer SAM T
The Boc group was removed by reacting for 25 minutes at room temperature in a WO reactor. The Boc group-free Asn-resin was then washed with methylene chloride, then neutralized with methylene chloride containing 10% diisopropylethylamine, and then further washed with methylene chloride. This resin was mixed with 5 ml of a 0.4 M Boc-His dimethylformamide solution and 5 ml of a 0.4 M diisopropylcarbodiimide methylene chloride solution, and the mixture was placed in a reaction tank and reacted at room temperature for 2 hours with stirring.

【００８１】上記で得られた樹脂を、順にジメチルホル
ムアミド、塩化メチレン、ジイソプロピルエチルアミン
を１０％含有する塩化メチレン、塩化メチレンおよび塩
化メチレン／ジメチルホルムアミド混合液で洗浄してBo
c−His−Asn−樹脂を得た。引き続き上記と同様にしてB
oc基の除去、Boc−アミノ酸のカップリングを繰り返し
てBoc−Val−Tyr（Cl2−Bzl)−Pro−Phe−Pro−Gly−Pr
o−Ile−His−Asn樹脂からなる生成物を得た。The resin obtained above was washed successively with methylene chloride containing 10% of dimethylformamide, methylene chloride and diisopropylethylamine, methylene chloride and a methylene chloride / dimethylformamide mixed solution to obtain Bo.
A c-His-Asn-resin was obtained. Continue to B as above
removal of oc group, Boc-repeated coupling of the amino acid Boc-Val-Tyr (Cl 2 -Bzl) -Pro-Phe-Pro-Gly-Pr
A product consisting of o-Ile-His-Asn resin was obtained.

【００８２】この樹脂を１０％のアニソールを含有する
フッ化水素２０ｍｌに入れて０℃で２時間撹拌してペプ
チドを樹脂から遊離させた。その後、フッ化水素を減圧
留去し、残留物を３０％酢酸で抽出し、それを凍結乾燥
して粗ペプチド１００ｍｇを得た。これをナカライテス
ク株式会社製のＯＤＳカラムであるCosmosil ５Ｃ18−
ＡＲを用いた逆相クロマトグラフィーにより精製して最
終生成物３０ｍｇを得た。そのアミノ酸組成（モル比）
は、Val：Tyr：Pro：Phe：Gly：Ile：His：Asn＝１：
１：３：１：１：１：１：１であった。更に実施例１で
使用したプロテインシーケンサーにより分析したとこ
ろ、配列番号３で表されるペプチドであることが確認さ
れた。また該生成物の薄層クロマトグラフィーのＲｆ値
は、実施例１の生成物と同様に０.４９であった。The resin was placed in 20 ml of hydrogen fluoride containing 10% anisole and stirred at 0 ° C. for 2 hours to release the peptide from the resin. Then, hydrogen fluoride was distilled off under reduced pressure, the residue was extracted with 30% acetic acid, and it was freeze-dried to obtain 100 mg of a crude peptide. This is Cosmosil 5C 18 − which is an ODS column manufactured by Nacalai Tesque, Inc.
Purification by reverse phase chromatography using AR gave 30 mg of final product. Its amino acid composition (molar ratio)
Is Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: His: Asn = 1:
It was 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1. Further analysis by the protein sequencer used in Example 1 confirmed that it was the peptide represented by SEQ ID NO: 3. The Rf value of the product by thin layer chromatography was 0.49 as in the case of the product of Example 1.

【００８３】また、配列番号４〜配列番号１６で表され
るペプチドの場合も、配列番号３で表されるペプチドの
場合と同様にして、市販のBoc−Asn−樹脂(置換率０.５
ｍｅｑ／ｇ)０．２ｇから目的とする最終生成物（各ペ
プチド）を製造した。その際の最終生成物（各ペプチ
ド）の収量、アミノ酸組成（モル比）および該最終生成
物の薄層クロマトグラフィーのRf値は、下記の表１に示
すとおりであった。Also in the case of the peptides represented by SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 16, the commercially available Boc-Asn-resin (substitution rate 0.5
The desired final product (each peptide) was produced from 0.2 g of meq / g). The yield of the final product (each peptide), the amino acid composition (molar ratio) and the Rf value of the final product by thin layer chromatography were as shown in Table 1 below.

【００８４】[0084]

【表１】 配列 収量 アミノ酸組成(モル比) Rf値 番号 (mg) ３ 30 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:His:Asn＝1:1:3:1:1:1:1:1 0.49 ４ 40 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn＝1:1:4:1:1:1:1 0.57 ５ 28 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:His:Asn＝1:3:1:1:1:1:1 0.46 ６ 35 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn＝1:4:1:1:1:1 0.59 ７ 30 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Ala:Asn＝1:3:1:1:1:1:1 0.59 ８ 22 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Arg:Asn＝1:3:1:1:1:1:1 0.76 ９ 20 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Glu:Asn＝1:3:1:1:1:1:1 0.54 10 18 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn＝1:3:1:2:1:1 0.62 11 20 Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Leu:Asn＝1:3:1:1:1:1:1 0.77 12 35 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Ala:Asn＝1:1:3:1:1:1:1:1 0.56 13 25 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Arg:Asn＝1:1:3:1:1:1:1:1 0.65 14 25 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Glu:Asn＝1:1:3:1:1:1:1:1 0.46 15 27 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Asn＝1:1:3:1:2:1:1 0.53 16 22 Val:Tyr:Pro:Phe:Gly:Ile:Leu:Asn＝1:1:3:1:1:1:1:1 0.66 [Table 1] Sequence Yield Amino acid composition (molar ratio) Rf value Number (mg) 3 30 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: His: Asn ＝ 1: 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.49 4 40 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Asn ＝ 1: 1: 4: 1: 1: 1: 1 0.57 5 28 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: His: Asn ＝ 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.46 6 35 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Asn ＝ 1: 4: 1: 1: 1: 1 0.59 7 30 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Ala: Asn ＝ 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.59 8 22 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Arg: Asn = 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.76 9 20 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Glu: Asn = 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.54 10 18 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Asn ＝ 1: 3: 1: 2: 1: 1 0.62 11 20 Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Leu: Asn = 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.77 12 35 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Ala: Asn = 1: 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.56 13 25 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Arg: Asn = 1: 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.65 14 25 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Glu: Asn = 1: 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.46 15 27 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Asn = 1: 1: 3: 1: 2: 1: 1 0.53 16 22 Val: Tyr: Pro: Phe: Gly: Ile: Leu: Asn = 1: 1: 3: 1: 1: 1: 1: 1 0.66

【００８５】上記の実施例１〜６における各画分のオピ
オイド活性および配列番号３〜配列番号１６で表される
新規なペプチド、並びに配列番号１７で表される既知の
ペプチドであるβ-casomorphin７、配列番号２０で表さ
れる既知のペプチドであるpro−β-casomorphin７のオ
ピオイド活性は、いずれも次のようにして測定した。The opioid activity of each fraction and the novel peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 16 and the known peptide β-casomorphin7 represented by SEQ ID NO: 17 in Examples 1 to 6 above, The opioid activity of pro-β-casomorphin7, which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 20, was measured as follows.

【００８６】《オピオイド活性の測定法》体重２００〜
２５０ｇのモルモットより摘出した回腸縦走筋をアイソ
トニックトランデューサー(日本光電工業株式会社製：
ＴＢ ６１２−Ｔ)に接続して０.５ｇの張力をかける。
３６℃に保温した２ｍｌ容量のマグヌス管内に、Ｋrebs
等張液(NaCl １１８ｍＭ、KCl ４.７５ｍＭ、CaCl2 ２.
５４ｍＭ、MgSO4 １．２ｍＭ、NaHCO3 ２５ｍＭ、KH2PO
4 １.１９ｍＭ、グルコース１１ｍＭ）を満たしたもの
の中に回腸縦走筋を浸して、ボンベから通気（02 ９５
％：CO2 ５％）を行った。このようにして約２時間安定
化させた後、３０Ｖで０．５ｍsec の電気刺激を与え、
回腸縦走筋を電気収縮させた。電気収縮が安定した後、
アミノペプチダーゼ阻害剤等を含むインヒビター５０μ
ｌを加え、実施例１〜６における各画分および配列番号
３〜配列番号１７で表されるペプチドの各々を添加し、
回腸縦走筋の電気収縮の変化をレコーダーで記録した。
オピオイド活性は画分およびペプチドの各々の添加後の
電気収縮の抑制と１０-４Ｍナロキソン２０μｌ添加に
よる抑制の解除によって判定した。そして回腸縦走筋の
電気収縮を５０％抑制する濃度(ＩＣ50)を測定した。<< Measurement Method of Opioid Activity >> Weight 200-
An isotonic transducer (manufactured by Nihon Kohden Kogyo Co., Ltd.) was used as a longitudinal muscle of the ileum extracted from a 250 g guinea pig.
TB 612-T) and apply a tension of 0.5 g.
Krebs in a 2 ml Magnus tube kept at 36 ℃
Isotonic solution (NaCl 118 mM, KCl 4.75 mM, CaCl 2 2.
54 mM, MgSO 4 1.2 mM, NaHCO 3 25 mM, KH 2 PO
4 1.19 mm, immersed ileum longitudinal muscle in glucose 11 mM) that satisfies the vent from the cylinder (0 2 95
%: CO 2 5%). In this way, after stabilizing for about 2 hours, electrical stimulation of 0.5 msec at 30 V was applied.
The longitudinal muscle of the ileum was electrically contracted. After the electric contraction has stabilized,
Inhibitor 50μ including aminopeptidase inhibitor
1 and each of the fractions in Examples 1 to 6 and each of the peptides represented by SEQ ID NOs: 3 to 17 are added,
Changes in the electrical contraction of the longitudinal muscle of the ileum were recorded with a recorder.
Opioid activity was determined by inhibition of electrical contraction after addition of each fraction and peptide and removal of inhibition by addition of 20 μl of 10 −4 M naloxone. Then, the concentration at which the electrical contraction of the ileal longitudinal muscle was suppressed by 50% (IC 50 ) was measured.

【００８７】その結果、上記実施例で得られた配列番号
３〜配列番号１６で表される新規なペプチド、配列番号
１７で表される既知のペプチドであるβ-casomorphin７
のオピオイド活性のＩＣ50は下記の表２に示すとおりで
あった。参考のため配列番号２０で表される既知のペプ
チドであるpro-β-casomorphin７のオピオイド活性を上
記と同様にして測定したときのＩＣ50を下記の表２に併
記する。As a result, the novel peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 16 obtained in the above examples, β-casomorphin7 which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 17
The IC 50 of the opioid activity of E. coli was as shown in Table 2 below. For reference, the IC 50 when the opioid activity of pro-β-casomorphin 7 which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 20 is measured in the same manner as above is also shown in Table 2 below.

【００８８】更に、配列番号３〜配列番号１６で表され
る新規なペプチドのＡＣＥ阻害活性、および配列番号１
７で表される既知のペプチドであるβ-casomorphin７の
ＡＣＥ阻害活性、並びに配列番号２０で表される既知の
ペプチドであるpro-β-casomorphin７のＡＣＥ阻害活性
は、いすれも下記のようにして測定した。Furthermore, the ACE inhibitory activity of the novel peptides represented by SEQ ID NOs: 3 to 16 and SEQ ID NO: 1
The ACE inhibitory activity of β-casomorphin7 which is a known peptide represented by 7 and the ACE inhibitory activity of pro-β-casomorphin7 which is a known peptide represented by SEQ ID NO: 20 are as follows: It was measured.

【００８９】《ＡＣＥ測定活性の測定法》ＡＣＥ阻害活
性の測定は、Biochemical Pharamacology 20;1937(197
1)に記載のCheung and Cushman 法に準じて下記の方法
により行った。酵素基質 ：Bz(ベンジル)-Gyl-His-Leu ８６ｍｇを蒸留
水８ｍｌとリン酸緩衝液８ｍｌに溶解した溶液酵素溶液 ：ウサギの肺のアセトンパウダー(シグマ社製)
１ｇを５０ｎＭリン酸緩衝液１０ｍｌ中で粉砕した後、
遠心分離した上澄液 上記の酵素基質１００μｌ、酵素溶液１２μｌおよび配
列番号３〜配列番号１７で表されるペプチドの所定量を
混合し、蒸留水を加えて全体の液量を２５０μｌとした
後、酢酸エチル１.５ｍｌを加えて１５秒間撹拌し、そ
れを遠心分離した。酢酸エチル層から１ｍｌを分取して
酢酸エチルを留去し、残留物に蒸留水１ｍｌを加えて溶
解させた。溶解液の２２８ｎｍにおける紫外吸収値（Ｏ
Ｄ228）を測定した。<< Measurement method of ACE measurement activity >> ACE inhibitory activity was measured by Biochemical Pharamacology 20; 1937 (197).
According to the Cheung and Cushman method described in 1), the following method was used. Enzyme substrate : Bz (benzyl) -Gyl-His-Leu 86 mg dissolved in distilled water 8 ml and phosphate buffer 8 ml Enzyme solution : Rabbit lung acetone powder (Sigma)
After crushing 1 g in 10 ml of 50 nM phosphate buffer,
Centrifuged supernatant 100 μl of the above enzyme substrate, 12 μl of the enzyme solution and a predetermined amount of the peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 17 were mixed and distilled water was added to make the total liquid volume 250 μl. 1.5 ml of ethyl acetate was added and stirred for 15 seconds, which was then centrifuged. 1 ml was taken from the ethyl acetate layer, ethyl acetate was distilled off, and the residue was dissolved by adding 1 ml of distilled water. Ultraviolet absorption value of the solution at 228 nm (O
D 228 ) was measured.

【００９０】ＡＣＥ活性阻害率は、ペプチド（阻害剤）
なしで上記と同様に反応させた時のＯＤ228を１００％
とし、かつ反応開始前（反応時間０分の時）のＯＤ228
を０％とした時に、ＡＣＥ活性阻害率が５０％になると
きの阻害剤の濃度をＩＣ50として求めた。その結果、上
記実施例で得られた配列番号３〜配列番号１６で表され
る新規なペプチド、配列番号１７で表される既知のペプ
チドであるβ-casomorphin７のＡＣＥ阻害活性のＩＣ50
は下記の表２に示すとおりであった。参考のため配列番
号２０で表される既知のペプチドであるpro-β-casomor
phin７のＡＣＥ阻害活性を上記と同様にして測定した時
のＩＣ50を表２に併記する。The ACE activity inhibition rate was determined by the peptide (inhibitor)
100% OD 228 when reacted in the same manner as above without
And OD 228 before the start of the reaction (when the reaction time is 0 minutes)
The concentration of the inhibitor when the ACE activity inhibitory rate was 50% was determined as IC 50 . As a result, the IC 50 of the ACE inhibitory activity of β-casomorphin7, which is the novel peptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 16 and the known peptide represented by SEQ ID NO: 17, obtained in the above Examples.
Was as shown in Table 2 below. For reference, pro-β-casomor is a known peptide represented by SEQ ID NO: 20.
Table 2 also shows the IC 50 when the ACE inhibitory activity of phin7 was measured in the same manner as above.

【００９１】[0091]

【表２】 オピオイド活性 ＡＣＥ阻害活性 ペプチドの種類 ＩＣ50 ＩＣ50 配列番号１に含まれるノナペプチド 配列番号５のペプチド 14 55 配列番号６のペプチド 11.4 450 配列番号７のペプチド 14 100 配列番号８のペプチド 24 115 配列番号９のペプチド 20 34 配列番号10のペプチド 16 37 配列番号11のペプチド 14 40配列番号２に含まれるデカペプチド 配列番号３のペプチド 141 170 配列番号４のペプチド 270 250 配列番号12のペプチド 150 200 配列番号13のペプチド 150 200 配列番号14のペプチド 170 150 配列番号15のペプチド 120 200 配列番号16のペプチド 140 250配列番号17の既知ペプチド 14 500 (β-casomorphin７) 配列番号20の既知ペプチド 240 330 (pro-β-casomorphin７) [Table 2] Opioid activity ACE inhibitory activity Peptide type IC 50 IC 50 Nonapeptide included in SEQ ID NO: 1 Peptide of SEQ ID NO: 5 14 55 Peptide of SEQ ID NO: 11.4 450 Peptide of SEQ ID NO: 7 100 14 Peptide of SEQ ID NO: 8 24 115 SEQ ID NO: 9 Peptide 20 34 SEQ ID NO: 10 peptide 16 37 SEQ ID NO: 11 peptide 14 40 Decapeptide contained in SEQ ID NO: 2 peptide 141 SEQ ID NO: 3 peptide 141 170 SEQ ID NO: 4 peptide 270 250 SEQ ID NO: 12 peptide 150 200 SEQ ID NO: 13 Peptide 150 200 SEQ ID NO: 14 peptide 170 150 SEQ ID NO: 15 peptide 120 200 SEQ ID NO: 16 peptide 140 250 SEQ ID NO: 17 known peptide 14 500 (β-casomorphin 7) SEQ ID NO: 20 known peptide 240 330 (pro-β -casomorphin7)

【００９２】上記表２の結果から、配列番号３〜配列番
号１６で表される本発明の新規なペプチドがオピオイド
活性を有し、そのうちでも配列番号１で表されるペプチ
ドに包含される配列番号５〜配列番号１１で表されるノ
ナペプチドが高いオピオイド活性を有することがわか
る。また、配列番号３〜配列番号１６で表される本発明
の新規なペプチドは、配列番号１７で表される既知のペ
プチドに比べて少ない量でＡＣＥの活性を阻害し得るこ
とがわかる。From the results shown in Table 2 above, the novel peptides of the present invention represented by SEQ ID NOS: 3 to 16 have opioid activity, and among them, the SEQ ID NOs: included in the peptide represented by SEQ ID NO: 1 5 that the nonapeptides represented by SEQ ID NO: 11 have high opioid activity. It is also found that the novel peptides of the present invention represented by SEQ ID NOS: 3 to 16 can inhibit the activity of ACE in a smaller amount than the known peptides represented by SEQ ID NO: 17.

【００９３】[0093]

【発明の効果】本発明のペプチドおよびその塩はオピオ
イド活性を有しているので、該ペプチドおよびその塩を
有効成分とする剤は極めて少量の投与で、鎮痛、麻酔、
情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫、イ
ンシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、
電解質の吸収促進、心筋の収縮調節機能を示す可能性が
あるため、鎮痛麻酔剤、催眠剤、消化管ホルモン分泌促
進剤、電解質の吸収促進剤、胃腸輸送筋収縮による下痢
改善剤としての利用が期待できる。配列番号２で表され
るペプチド類に包含されるペプチドは、配列番号１で表
されるペプチド類に包含されるペプチドに比べてオピオ
イド活性が低いが、生体内で加水分解されて配列番号１
で表されるペプチドになり高活性化される可能性があ
り、プロドラッグとして使用できる可能性が大きい。EFFECTS OF THE INVENTION Since the peptide of the present invention and its salt have opioid activity, an agent containing the peptide and its salt as an active ingredient can be used for analgesia, anesthesia,
Emotion, respiration, pulsation, body temperature, digestive tract function, feeding, immunity, secretion control of hormones such as insulin and somatostatin,
Since it may have a function of promoting absorption of electrolytes and regulating contraction of myocardium, it can be used as an analgesic anesthetic, hypnotic, gastrointestinal hormone secretagogue, electrolyte absorption promoter, and diarrhea improving agent by gastrointestinal transport muscle contraction. Can be expected. The peptide included in the peptides represented by SEQ ID NO: 2 has a lower opioid activity than the peptide included in the peptides represented by SEQ ID NO: 1, but is hydrolyzed in vivo to produce SEQ ID NO: 1
There is a possibility that it will be a peptide represented by and highly activated, and there is a high possibility that it can be used as a prodrug.

【００９４】更に、配列番号１または配列番号２で表さ
れる本発明のペプチドおよびその塩は、ＡＣＥ阻害活性
をも有しており、極めて少量の投与で、血圧の上昇に関
与するＡＣＥの作用を阻害し、血圧の上昇抑制、血圧降
下機能を示し得るので、血圧の上昇抑制剤および血圧降
下剤としての利用も期待できる。Furthermore, the peptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and a salt thereof also have ACE inhibitory activity, and the action of ACE involved in the elevation of blood pressure can be achieved by administration of an extremely small amount. Since it can inhibit the increase of blood pressure and suppress the increase of blood pressure and the function of lowering blood pressure, it can be expected to be used as a blood pressure increase inhibitor and a blood pressure lowering agent.

【００９５】上記のオピオイド活性剤およびＡＣＥ活性
阻害剤としてしようする場合に、本発明のペプチドおよ
びその塩は、水溶性の白色粉末であるため、そのままで
または水等に溶解させて経口および非経口のいずれの方
法によっても極めて簡単に投与することができる。When used as the above-mentioned opioid activator and ACE activity inhibitor, the peptide of the present invention and its salt are water-soluble white powders. Therefore, they are orally or parenterally as they are or dissolved in water or the like. It can be administered very easily by any of the above methods.

【００９６】また、配列番号１または配列番号２で表さ
れる本発明の新規なペプチドおよびその塩は、９または
１０個のアミノ酸が配列しただけの極めて簡単な構造を
有する低分子量化合物であるため、化学合成によって簡
単に製造することができる。更に、配列番号３〜配列番
号６および配列番号１７で表されるペプチドは、牛乳β
−カゼイン等の乳蛋白を加水分解することによって、高
収率で確実に得ることができる。The novel peptide of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 and salts thereof are low molecular weight compounds having an extremely simple structure in which only 9 or 10 amino acids are arranged. , Can be easily manufactured by chemical synthesis. Furthermore, the peptides represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 17 are milk β
-By hydrolyzing milk protein such as casein, it can be reliably obtained in high yield.

【００９７】[0097]

【配列表】[Sequence list]

【００９８】配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 1 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【００９９】配列番号：２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 2 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１００】配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 3 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０１】配列番号：４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 4 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０２】配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 5 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０３】配列番号：６ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 6 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０４】配列番号：７ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 7 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０５】配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 8 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０６】配列番号：９ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 9 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０７】配列番号：１０ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 10 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０８】配列番号：１１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 11 Sequence length: 9 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１０９】配列番号：１２ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 12 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１０】配列番号：１３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 13 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１１】配列番号：１４ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 14 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１２】配列番号：１５ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 15 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１３】配列番号：１６ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 16 Sequence length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１４】配列番号：１７ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 17 Sequence length: 7 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１５】配列番号：１８ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 18 Sequence length: 5 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１６】配列番号：１９ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 19 Sequence length: 4 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【０１１７】配列番号：２０ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド SEQ ID NO: 20 Sequence length: 8 Sequence type: Amino acid Topology: Linear Sequence type: Peptide

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】牛乳β−カゼインをサーモライシンで加水分解
して得られたペプチド混合物を高速液体クロマトグラフ
ィーに通し、その吸着成分を直線濃度勾配を有する特定
の溶離液により溶離した時の該成分の吸光度を測定した
フローチャートである。FIG. 1 is a graph showing the absorbance of a peptide mixture obtained by hydrolyzing milk β-casein with thermolysin through high performance liquid chromatography and adsorbing the adsorbed component with a specific eluent having a linear concentration gradient. It is the flowchart which measured.

【図２】牛乳β−カゼインをサーモライシンとロイシン
アミノペプチダーゼで加水分解して得られたペプチド混
合物を高速液体クロマトグラフィーに通し、その吸着成
分を直線濃度勾配を有する特定の溶離液により溶離した
時の該成分の吸光度を測定したフローチャートである。FIG. 2 shows a peptide mixture obtained by hydrolyzing milk β-casein with thermolysin and leucine aminopeptidase, which was passed through high performance liquid chromatography, and the adsorbed components were eluted with a specific eluent having a linear concentration gradient. It is a flowchart which measured the light absorbency of this component.

【図３】牛乳β−カゼインをサーモライシン、ロイシン
アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼＡで
加水分解して得られたペプチド混合物を高速液体クロマ
トグラフィーに通し、その吸着成分を直線濃度勾配を有
する特定の溶離液により溶離した時の該成分の吸光度を
測定したフローチャートである。FIG. 3: A peptide mixture obtained by hydrolyzing milk β-casein with thermolysin, leucine aminopeptidase and carboxypeptidase A was subjected to high performance liquid chromatography, and its adsorbed component was subjected to a specific eluent having a linear concentration gradient. It is a flowchart which measured the light absorbency of the said component at the time of elution.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＥＱ 8314−4Ｃ Ｃ０７Ｋ 99:00 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification number Office reference number FI technical display location A61K 37/64 AEQ 8314-4C C07K 99:00

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 配列番号１（式中 Xaa はアミノ酸を示
す）で表されるペプチドおよびその塩。1. A peptide represented by SEQ ID NO: 1 (in the formula, Xaa represents an amino acid) and a salt thereof. 【請求項２】 配列番号２（式中 Xaa はアミノ酸を示
す）で表されるペプチドおよびその塩。2. A peptide represented by SEQ ID NO: 2 (in the formula, Xaa represents an amino acid) and a salt thereof. 【請求項３】 配列番号１（式中 Xaa はアミノ酸を示
す）または配列番号２（式中 Xaa はアミノ酸を示す）
で表されるペプチドおよびその塩の１種または２種以上
を有効成分として含むオピオイド活性を有する剤。3. SEQ ID NO: 1 (wherein Xaa represents an amino acid) or SEQ ID NO: 2 (wherein Xaa represents an amino acid)
An agent having opioid activity, which comprises, as an active ingredient, one or two or more of the peptides represented by and the salts thereof. 【請求項４】 配列番号１(式中 Xaa はアミノ酸を示
す）または配列番号２（式中 Xaa はアミノ酸を示す)で
表されるペプチドおよびその塩の１種または２種以上を
有効成分として含むアンジオテンシン変換酵素阻害活性
を有する剤。4. An active ingredient comprising one or more of the peptide represented by SEQ ID NO: 1 (wherein Xaa represents an amino acid) or SEQ ID NO: 2 (wherein Xaa represents an amino acid) and salts thereof. An agent having angiotensin converting enzyme inhibitory activity. 【請求項５】 乳蛋白を微生物起源の中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解し、
得られる加水分解物からオピオイド活性を有するペプチ
ドを回収することを特徴とするオピオイドペプチドの製
造方法。5. A milk protein is hydrolyzed using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin,
A method for producing an opioid peptide, which comprises recovering a peptide having opioid activity from the resulting hydrolyzate. 【請求項６】 オピオイドペプチドが配列番号３および
配列番号４で表されるペプチドである請求項５の製造方
法。6. The method according to claim 5, wherein the opioid peptide is a peptide represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4. 【請求項７】 乳蛋白を微生物起源の中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解した
後、アミノペプチダーゼを使用して更に加水分解し、得
られる加水分解物からオピオイド活性を有するペプチド
を回収することを特徴とするオピオイドペプチドの製造
方法。7. A milk protein is hydrolyzed by using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, and further hydrolyzed by using aminopeptidase, and a peptide having an opioid activity is recovered from the resulting hydrolyzate. A method for producing an opioid peptide, comprising: 【請求項８】 オピオイドペプチドが配列番号５および
配列番号６で表されるペプチドである請求項７の製造方
法。8. The method according to claim 7, wherein the opioid peptide is a peptide represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6. 【請求項９】 乳蛋白を微生物起源の中性プロテアーゼ
またはアルカリ性プロテアーゼを使用して加水分解した
後、アミノペプチダーゼとカルボキシペプチダーゼを同
時または順序を問わず逐時に使用して更に加水分解し、
得られる加水分解物からオピオイド活性を有するペプチ
ドを回収することを特徴とするオピオイドペプチドの製
造方法。9. A milk protein is hydrolyzed using a neutral protease or alkaline protease of microbial origin, and then aminopeptidase and carboxypeptidase are used simultaneously or in any order to further hydrolyze,
A method for producing an opioid peptide, which comprises recovering a peptide having opioid activity from the resulting hydrolyzate. 【請求項１０】 オピオイドペプチドが配列番号６およ
び配列番号１７で表されるペプチドである請求項９の製
造方法。10. The method according to claim 9, wherein the opioid peptide is a peptide represented by SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 17. 【請求項１１】 請求項５〜１０のいずれか１項の方法
により製造された配列番号３〜配列番号６および配列番
号１７で表されるペプチドおよびその塩。11. A peptide represented by SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 6 and a salt thereof, which is produced by the method according to any one of claims 5 to 10.
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