JPH05208999A - Cerine protease inhibitor and medicine composition containing same - Google Patents

Abstract

PURPOSE: To provide the compd. which has a single non-fragmented polypeptide chain, inhibits serine protease activity, has a specific amino acid sequence and is used for the treatment, etc. of protese intervened tissue destructive diseases, such as pulmonary emphysema, glomerulonephritis and muscle contraction.

CONSTITUTION: The objective refined serine protease inhibitor which has the single non-fragmented polypeptide chain, is capable of inhibiting at least one kind of the serine protease activity and has the amino acid sequence expressed by the formula (R₁ is Ser, Pro; R₇ is Ala, Pro; R₂, R₃, R₈, R₉ are Met, Val, Ala, Phe, Tyr, etc.; R₄ to R₆ are Met, Val) is obtd. by collecting human parotid secretions with a suction appliance attached to the outlet of a parotid conduit, adjusting the secretions to pH 6.0 with sodium hydroxide, subjecting the secretions to centrifugal sepn., subjecting the supernatant liquid to gel filtration, eluting the filtrate at a linear gradient of 0.005 to 1 M NaCl in a column, concentrating the active fraction by ultrafiltration and purifying the concd. matter by gel filtration.

COPYRIGHT: (C)1993,JPO

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、精製セリンプロテアー
ゼインヒビターおよびこのプロテアーゼインヒビターを
含有する医薬組成物に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a purified serine protease inhibitor and a pharmaceutical composition containing the protease inhibitor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】内因性蛋白分解酵素は、侵入する生物、
抗原−抗体複合体、および生物にとってもはや必要でな
いかまたは有用でないある種の組織蛋白質を分解するの
に役立っている。正常に機能する生物において、蛋白分
解酵素は、限定された量において導かれ、そしてプロテ
アーゼインヒビターの合成を通して部分的に調節され
る。BACKGROUND OF THE INVENTION Endogenous proteolytic enzymes are invading organisms,
It serves to break down antigen-antibody complexes and certain tissue proteins that are no longer needed or useful for the organism. In normally functioning organisms, proteolytic enzymes are directed in limited amounts and are partially regulated through the synthesis of protease inhibitors.

【０００３】非常に多数の天然に生成するプロテアーゼ
インヒビターは、内因性プロテアーゼを、局所的および
１時間にそれらの反応を限定することにより、制御する
のに役立っている。加えて、プロテアーゼインヒビター
は、感染剤により身体中に導かれるプロテアーゼを阻害
しうる。特に蛋白分解性攻撃および感染を受けやすい組
織、たとえば気道のそれはプロテアーゼインヒビターに
富んでいる。A large number of naturally-occurring protease inhibitors serve to control endogenous proteases locally and by limiting their reaction to one hour. In addition, protease inhibitors can inhibit the proteases introduced into the body by infectious agents. Especially tissues susceptible to proteolytic attack and infection, such as those of the respiratory tract, are rich in protease inhibitors.

【０００４】プロテアーゼインヒビターは、約１０％の
人血漿蛋白質からなる。少くとも８種のインヒビターが
この給源から単離されており、そして文献中に特徴づけ
られている。それらは、α₂ −マクログロブリン（α₂
Ｍ）、α₁ −プロテアーゼインヒビター（α₁ ＰＩ）、
α₁ −アンチキモトリプシン（α₁ Ａｃｈｙ）、β₁−
アンチコラゲナーゼ（β₁ ＡＣ）およびインターα−ト
リプシンインヒビター（ＩαＩ）を包含する。Protease inhibitors consist of approximately 10% human plasma proteins. At least 8 inhibitors have been isolated from this source and have been characterized in the literature. They are α ₂ -macroglobulin (α ₂
M), α ₁ -protease inhibitor (α ₁ PI),
α ₁ -antichymotrypsin (α ₁ Achy), β _1-
Includes anti-collagenase (β ₁ AC) and inter-α-trypsin inhibitor (IαI).

【０００５】プロテアーゼ／プロテアーゼインヒビター
平衡の乱れは、肺気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周炎、
筋萎縮症、腫瘍侵襲、および各種の他の病的状態を包含
するプロテアーゼ−介在組織破壊を導きうる。Disorders of protease / protease inhibitor equilibrium include emphysema, arthritis, glomerulonephritis, periodontitis,
It can lead to protease-mediated tissue destruction including muscular atrophy, tumor invasion, and various other pathological conditions.

【０００６】ある種の状況、たとえば敗血症または急性
白血病のような重篤な病的過程においては、存在する遊
離蛋白分解酵素の量は、分泌細胞からの酵素の放出に起
因し増加する。加えて、あるいは他の状況において別
に、生物の減少した調節インヒビター容量はまた、プロ
テアーゼ／プロテアーゼインヒビター平衡における変更
を生じうる。そのような減少した調節インヒビター容量
の例は、α₁ −プロテアーゼインヒビター欠乏であり、
それは肺気腫の発現と高度に関係している。In certain situations, such as in severe pathological processes such as sepsis or acute leukemia, the amount of free proteolytic enzyme present is increased due to the release of the enzyme from secretory cells. In addition, or otherwise in other circumstances, the reduced regulatory inhibitor capacity of the organism may also result in alterations in the protease / protease inhibitor equilibrium. An example of such a reduced regulatory inhibitor capacity is α ₁ -protease inhibitor deficiency,
It is highly associated with the development of emphysema.

【０００７】そのような異常な状態が存在している生物
においては、蛋白分解酵素を制御するための処置を取る
ことができなければ、生物に対する重篤な損傷が生じう
る。従って、蛋白分解酵素を制御するために、生物に対
し投与することのできるプロテアーゼインヒビターが求
められてきた。In organisms in which such abnormal conditions exist, serious damage to the organisms can occur if no action is taken to control proteolytic enzymes. Therefore, there has been a need for protease inhibitors that can be administered to organisms to control proteolytic enzymes.

【０００８】特に薬理学的興味をひく１つのプロテアー
ゼは、白血球エラスターゼである。白血球エラスターゼ
は、細胞外に放出されるとき、結合組織および他の価値
ある蛋白質を分解する。正常に機能する生物にとって、
ある量の結合組織および他の蛋白質を分解することが必
要であるけれども、過剰量の白血球エラスターゼの存在
は、各種の病的状態、たとえば肺気腫およびリウマチ性
関節炎と結び付いてきた。白血球エラスターゼが正常よ
り大きな量において存在するとき、その効果と対抗する
ために、白血球エラスターゼに特異であるプロテアーゼ
インヒビターが求められてきた。One protease of particular pharmacological interest is leukocyte elastase. Leukocyte elastase, when released extracellularly, degrades connective tissue and other valuable proteins. For a normally functioning organism,
Although it is necessary to degrade certain amounts of connective tissue and other proteins, the presence of excess leukocyte elastase has been linked to various pathological conditions such as emphysema and rheumatoid arthritis. When leukocyte elastase is present in greater than normal amounts, protease inhibitors that are specific to leukocyte elastase have been sought in order to counteract its effects.

【０００９】過去において、少くとも２種の白血球エラ
スターゼインヒビターが文献中に同定されている。Ｓｃ
ｈｉｅｓｓｌｅｒ等の“Ａｃｉｄ−Ｓｔａｂｌｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｎ
ｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ
Ｍｕｃｏｕｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、ｉｎ Ｎｅｕｔｒａ
ｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｏｆ ＨｕｍａｎＰｏｌｙｍ
ｏｒｐｈｏｎｅｕｃｌｅａｒ Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ、
Ｈａｖｅｍａｎｎ等（編集）、Ｕｒｂａｎ ａｎｄ Ｓ
ｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｉｎｃ．（１９７８）中に
記載されている１つの蛋白質は、人間の***血漿および
唾液から単離され、そしてＮ−末端アミノ酸としてチロ
シンを有する大きさ約１１Kdaであると特徴づけられ
た。In the past, at least two leukocyte elastase inhibitors have been identified in the literature. Sc
"Acid-Stable In" by Hiessler et al.
hibitors of Granulocyte N
Euthanal Proteases in Human
Mucous Secretions: Bioche
mistry and Possible Biolo
musical Function ”, in Neutra
l Proteases of HumanPolym
orphoneuclear Leucocytes,
Havemann et al. (Edited), Urban and S
chwarzenberg, Inc. One protein described in (1978) was isolated from human semen plasma and saliva and was characterized as being approximately 11 Kda in size with tyrosine as the N-terminal amino acid.

【００１０】この蛋白質の文献報告は、部分アミノ酸配
列のみを提供しているが、この部分配列さえもがこの蛋
白質は本発明の蛋白質から著しく異っていることを示し
ている。この蛋白質の配列の報告は、本発明の蛋白質に
ついての全アミノ酸配列データとの組合せにおいて、本
発明者等に対し、シースラー等により配列された生成物
は単一ポリペプチド鎖ではない分解された蛋白質であり
えたことを示している。Although the literature reports of this protein provide only a partial amino acid sequence, even this partial sequence shows that this protein is significantly different from the protein of the present invention. The report of the sequence of this protein indicates that, in combination with the total amino acid sequence data for the protein of the present invention, the product sequenced by Schiesler et al. It shows that it was possible.

【００１１】１例において人間血漿から単離される第２
の蛋白質は、α₁ −プロテアーゼインヒビターと命名さ
れている。この蛋白質についての業績は、Ｔｒａｖｉｓ
およびＳａｌｖｅｓｅｎによりＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉ
ｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５２：６５５
〜７０９（１９８３）中に要約されている。A second isolated in one example from human plasma
Protein is named α ₁ -protease inhibitor. The work on this protein is Travis
And Salvesen by Annual Revi
ew of Biochemistry, 52 : 655
~ 709 (1983).

【００１２】本発明の単一ポリペプチド鎖蛋白質と先行
技術の任意の単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼイ
ンヒビターとの間の構造における著しい相違の故に、先
行技術の単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒ
ビターは、本発明の蛋白質と“実質的に相同”（“ｓｕ
ｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ”）で
はない。Due to the striking difference in structure between the single polypeptide chain protein of the present invention and any of the prior art single polypeptide chain serine protease inhibitors, the prior art single polypeptide chain serine protease inhibitors are "Substantially homologous" to the protein of the invention ("su
bstantially homologous ").

【００１３】トリプシンは、薬理学的立場から特に興味
深い他のプロテアーゼである。トリプシンは、各種の急
性状態、たとえば膵炎の間の、ある種の軟器官組織、た
とえば膵臓組織の分解を開始させることが知られてい
る。種々の努力が、トリプシンの作用を阻害するであろ
うことが望まれた蛋白質の使用を通して、顕著な成功な
しに、それら状態の治療に向けられてきた。そのような
努力の例は、人間膵炎の治療における外因性牛トリプシ
ンインヒビターを使用する試みである。そのような技術
は欧州において試みられてきたけれども、それらはユー
・エス・フード・アンド・ドラッグ・アドミニストレー
ション（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍ
ｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって有効とは承認されな
かった。Trypsin is another protease of particular interest from a pharmacological standpoint. Trypsin is known to initiate the degradation of certain soft organ tissues, such as pancreatic tissue, during various acute conditions, such as pancreatitis. Various efforts have been directed to the treatment of these conditions without significant success through the use of proteins that were desired to inhibit the action of trypsin. An example of such an effort is the attempt to use exogenous bovine trypsin inhibitor in the treatment of human pancreatitis. Although such techniques have been tried in Europe, they are known as US Food and Drug Adms (US Food and Drug Adm).
Initiation) was not approved as valid.

【００１４】従って、各種の急性および慢性状態におい
て、過剰のトリプシンの中和に有効なプロテアーゼイン
ヒビターについての要求がある。上記に論述した白血球
エラスターゼインヒビターの場合における如く、トリプ
シンインヒビターは、もしもそれが精製された形におい
て、そして医薬的に有用であるのに充分な量において単
離されそして製造されうるならば、特に有用であろう。Therefore, there is a need for protease inhibitors that are effective in neutralizing excess trypsin in various acute and chronic conditions. As in the case of the leukocyte elastase inhibitors discussed above, trypsin inhibitors are particularly useful if they can be isolated and produced in purified form and in an amount sufficient to be pharmaceutically useful. Will.

【００１５】カテプシンＧは、白血球中に大量に存在す
る別のプロテアーゼである。カテプシンＧは、補充経路
のそれらを包含する各種の価値ある蛋白質をインビトロ
で分解しうることが知られている。膵臓エラスターゼ
は、膵炎において役割を有しうる他のプロテアーゼであ
る。従って、それらプロテアーゼのインヒビターはま
た、強力な医薬価値のものである。Cathepsin G is another protease which is abundant in leukocytes. Cathepsin G is known to be capable of degrading various valuable proteins in vitro, including those of the recruitment pathway. Pancreatic elastase is another protease that may have a role in pancreatitis. Therefore, inhibitors of these proteases are also of strong pharmaceutical value.

【００１６】白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプ
シンＧおよび膵臓エラスターゼはセリンプロテアーゼと
して知られている１つの種類のプロテアーゼの例であ
り、これらは共通の構造および機構の要素を有してい
る。異った基質に対するそれらの活性および異ったイン
ヒビターに対するそれらの感受性は、僅か数個のアミノ
酸残基における変化からの結果と信じられる。類推によ
り、構造および機構の共通の要素をまた有する１つの種
類のセリンプロテアーゼインヒビターを予想することが
可能であり、それにおいては比較的少ないアミノ酸の変
化が異ったプロテアーゼの阻害を生じえ、そしてこの種
類の少くとも１つのものは前者の種類の各セリンプロテ
アーゼを阻害しうる。そこでこの種類のセリンプロテア
ーゼインヒビターは実質的な価値を有するものであろ
う。Leukocyte elastase, trypsin, cathepsin G and pancreatic elastase are examples of one type of protease known as serine proteases, which have common structural and mechanistic elements. Their activity on different substrates and their sensitivity to different inhibitors are believed to result from changes in only a few amino acid residues. By analogy, it is possible to predict one class of serine protease inhibitors that also have common elements of structure and mechanism, in which relatively few amino acid changes can result in the inhibition of different proteases, and At least one of this class can inhibit each serine protease of the former class. So this class of serine protease inhibitors would be of substantial value.

【００１７】[0017]

【発明の開示】本出願は、１９８４年１２月６日に出願
された米国特許出願第６７８，８２３号の部分継続出願
である。DISCLOSURE OF THE INVENTION This application is a continuation-in-part of US patent application Ser.

【００１８】驚くべきことには、本発明者等は、アミノ
酸配列が単一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒ
ビターの報告された配列から非常に異っている、耳下腺
分泌から精製された形において単離される１２Kda プロ
テアーゼインヒビターを見出した。本発明のプロテアー
ゼインヒビターは、少くとも２つの活性部位を有するも
のと信じられる。１つの部位は白血球エラスターゼ阻害
性質を示し、一方第２の部位はトリプシンに対し活性を
示す。本発明者等は、本新規プロテアーゼインヒビター
の全長を正確に配列づけした。この配列は、以後により
完全に示す。Surprisingly, we have found that in the purified form from the parotid secretion the amino acid sequence is very different from the reported sequence for a single polypeptide chain serine protease inhibitor. A 12 Kda protease inhibitor was found to be released. It is believed that the protease inhibitors of the present invention have at least two active sites. One site exhibits leukocyte elastase inhibitory properties, while the second site is active against trypsin. We have correctly sequenced the full length of the novel protease inhibitor. This sequence is shown more fully below.

【００１９】[0019]

【発明の要旨】本発明は、一般的にはプロテアーゼイン
ヒビター、そしてより特定的には、人間の多形核（ＰＭ
Ｎ）−顆粒球プロテアーゼを指向するインヒビターに関
する。特に、本発明は、人間白血球エラスターゼおよび
トリプシンを包含するセリンプロテアーゼインヒビター
の生物活性同族体に関する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is generally directed to protease inhibitors, and more specifically to human polymorphonuclear (PM).
N) -inhibitors directed against granulocyte proteases. In particular, the invention relates to bioactive analogs of serine protease inhibitors, including human leukocyte elastase and trypsin.

【００２０】本発明の目的は、１つまたは種々のものの
組合せのセリンプロテアーゼに対し活性である精製され
た形のプロテアーゼインヒビターを提供することにあ
る。本発明の付加的目的は、そのようなプロテアーゼイ
ンヒビターのアミノ酸配列の決定である。本発明の更に
他の目的は、白血球エラスターゼおよび他のセリンプロ
テアーゼに対し活性を発揮する医薬製剤として価値のあ
る精製された形のプロテアーゼインヒビターを提供する
ことを包含する。更に、高められたあるいは等価の性質
を有するそのようなプロテアーゼインヒビターの生物活
性同族体の同定はまた、本発明の目的の１つである。It is an object of the present invention to provide a purified form of a protease inhibitor which is active against one or a combination of various serine proteases. An additional object of the invention is the determination of the amino acid sequence of such protease inhibitors. Yet another object of the present invention involves providing a purified form of the protease inhibitor that is valuable as a pharmaceutical formulation that exerts activity against leukocyte elastase and other serine proteases. Moreover, the identification of bioactive homologues of such protease inhibitors with enhanced or equivalent properties is also one of the objects of the present invention.

【００２１】これらの目的を達成するため、そして本発
明の目的に従い、セリンプロテアーゼ、特にエラスター
ゼ、たとえば白血球エラスターゼに対し阻害活性を示す
プロテアーゼインヒビターが開示される。好ましいイン
ヒビターは、耳下腺分泌から精製された形で単離され
た。本プロテアーゼインヒビターは、完全に変性された
後に、ジスルファイド結合を形成または再形成する能力
を有し、そして生化学的刺激の不存在において所望のセ
リンプロテアーゼ阻害活性の発現をなしうる活性三次元
構造を構成または再構成するのに必要である適当な非共
有相互反応を受ける。To achieve these objects, and in accordance with the objects of the present invention, there are disclosed protease inhibitors that exhibit inhibitory activity against serine proteases, especially elastases such as leukocyte elastase. The preferred inhibitor was isolated from the parotid secretion in a purified form. The present protease inhibitors have the ability to form or reform disulfide bonds after being completely denatured, and have an active three-dimensional structure capable of producing the desired serine protease inhibitory activity in the absence of biochemical stimuli. Subject to the appropriate non-covalent interactions required to construct or reconstitute.

【００２２】本発明の好ましいインヒビターは、セリン
プロテアーゼインヒビター活性を示す少くとも１つの活
性部位を有する精製された単一ポリペプチド鎖蛋白質で
あり、そして耳下腺分泌から単離される天然セリンプロ
テアーゼインヒビターと実質的に一致する。好ましく
は、活性部位において示されるセリンプロテアーゼイン
ヒビター活性は、耳下腺分泌から単離される天然インヒ
ビターのそれと生物学的に等価である。A preferred inhibitor of the present invention is a purified single polypeptide chain protein having at least one active site which exhibits serine protease inhibitor activity, and a natural serine protease inhibitor isolated from parotid secretion. Substantially match. Preferably, the serine protease inhibitor activity exhibited in the active site is bioequivalent to that of the natural inhibitor isolated from parotid secretion.

【００２３】本発明の特に好ましいインヒビターは、次
のアミノ酸配列を有する：Particularly preferred inhibitors of the present invention have the following amino acid sequence:

【化３】 式中、Ｒ₁ はセリンまたはプロリンからなる群から選択
され、Ｒ₇ はアラニンまたはプロリンからなる群から選
択され、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₈ およびＲ₉ は、同一または異
なってメチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラニ
ン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、ロ
イシンまたはアルギニンからなる群から選択され、なら
びにＲ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ は、メチオニンまたはバリン
からなる群から選択される、ただしＲ₁ がセリンであ
り、Ｒ₂ がアルギニンであり、Ｒ₃、Ｒ₄ 、Ｒ₅ および
Ｒ₆ がメチオニンであり、Ｒ₇ がアラニンであり、そし
てＲ ₈ およびＲ₉ がロイシンである場合を除く。[Chemical 3]Where R₁Is selected from the group consisting of serine or proline
And R₇Is selected from the group consisting of alanine or proline
Selected, R₂, R₃, R₈And R₉Are the same or different
Becoming methionine, valine, alanine, phenylalani
, Tyrosine, tryptophan, lysine, glycine, ro
Selected from the group consisting of isine or arginine,
Bini R_Four, R_FiveAnd R₆Is methionine or valine
Is selected from the group consisting of R₁Is serine
R₂Is arginine, and R₃, R_Four, R_Fiveand
R₆Is methionine and R₇Is alanine, and
R ₈And R₉Except when is leucine.

【００２４】上記略語により示されるアミノ酸について
は、好ましい態様の記述において説明する。本発明のプ
ロテアーゼインヒビターの生物学的に活性な改善された
同族体は、インヒビターアミノ酸配列において各種の他
のアミノ酸を置換することにより得ることができる。付
加的に、目的を達成するためおよび本発明の目的に従
い、活性成分、本発明に従うプロテアーゼインヒビター
またはここに示したその生理学的に活性な同族体の少く
とも１つを含有する医薬組成物が開示される。The amino acids represented by the above abbreviations are explained in the description of preferred embodiments. Biologically active improved homologues of the protease inhibitors of the present invention can be obtained by substituting various other amino acids in the inhibitor amino acid sequence. In addition, in order to achieve the object and according to the object of the present invention, a pharmaceutical composition containing an active ingredient, a protease inhibitor according to the invention or at least one of its physiologically active homologues disclosed herein is disclosed. To be done.

【００２５】[0025]

【好ましい態様の記述】後記の実施例と一緒で、本発明
の原理を説明するのに役立つ論述を、本発明の目下好ま
しい態様について、ここで詳細に行う。上記に示した如
く、本発明は、精製された形において単離されたプロテ
アーゼインヒビターに関する。好ましくは、本発明のセ
リンプロテアーゼインヒビターは、人間の耳下腺分泌か
ら単離される天然セリンプロテアーゼインヒビターと実
質的に均一であり、そして最も好ましくは生物学的に等
価である単一ポリペプチド鎖蛋白質である。明細書およ
び請求の範囲を通して使用される“生物学的に等価”
（“ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｅｑｕｉｖａｌｅｎ
ｔ”）の用語は、本発明の組成物が天然プロテアーゼイ
ンヒビターと同じ程度である必要はないが同じ型のプロ
テアーゼ誘導組織損傷を阻害しうることを意味する。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS In conjunction with the examples below, a discussion useful in explaining the principles of the invention is now set forth in detail for the presently preferred embodiments of the invention. As indicated above, the present invention relates to protease inhibitors isolated in purified form. Preferably, the serine protease inhibitor of the present invention is a single polypeptide chain protein that is substantially homogeneous, and most preferably bioequivalent to a natural serine protease inhibitor isolated from human parotid secretion. Is. “Biologically equivalent” as used throughout the specification and claims
("Biologically equivalen
The term t ") means that the composition of the present invention can inhibit the same type of protease-induced tissue damage, although not necessarily to the same extent as the native protease inhibitor.

【００２６】明細書および請求の範囲を通して使用され
る“実質的に相同”（“ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ”）の用語は、先に報告された単
一ポリペプチド鎖セリンプロテアーゼインヒビター蛋白
質により示される相同性以上の天然耳下腺インヒビター
に対する相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）の程度を意味す
る。好ましくは、この相同性の程度は、４０％以上、最
も好ましくは５０％以上であって、蛋白質の特に好まし
い群は、天然耳下腺インヒビターに対し６０％以上の相
同性を有する。上記のパーセント相同性は、２つの配列
のより大きなもの中にもまた見出されうる２つの配列の
より小さなもの中にみいだされる成分のパーセントとし
て計算され、成分は４つの隣接するアミノ酸の配列とし
て理解される。As used throughout the specification and claims, "substantially homologous"("substantially")
The term "homologous") refers to a degree of homology to native parotid inhibitors that is greater than or equal to the homology exhibited by the previously reported single polypeptide chain serine protease inhibitor proteins. Preferably, this homology. The degree of sex is greater than or equal to 40%, most preferably greater than or equal to 50%, and a particularly preferred group of proteins has greater than or equal to 60% homology to native parotid gland inhibitors. A component is understood as a sequence of four contiguous amino acids, calculated as the percentage of the component found in the smaller of the two sequences that can also be found in the larger of one sequence.

【００２７】本発明のプロテアーゼインヒビターは、熱
および酸による変性に著しく抵抗性あり、そしてキモト
リプシン、マウス下顎プロテアーゼおよびクロストリパ
インを包含する多くの蛋白分解酵素にさらしたとき、活
性の損失に抵抗する。それらインヒビターはまた、必要
なジサルファイド結合を形成する能力を有し、そして生
化学的刺激の不存在においてセリンプロテアーゼインヒ
ビター活性を表現しうる活性三次元構造を構成するため
に適当な非共有相互反応をうけ、あるいはもしもジサル
ファイド結合が破壊されそして非共有相互反応が崩壊し
ているならば、生化学的刺激の不存在においてそのよう
な活性第三次元構造を再獲得するためにそのような結合
および相互反応を再形成する能力を有する。The protease inhibitors of the present invention are extremely resistant to heat and acid denaturation and resist loss of activity when exposed to many proteolytic enzymes including chymotrypsin, mouse submaxillary proteases and clostripain. .. The inhibitors also have the ability to form the required disulfide bonds and are suitable non-covalent interactions to form an active three-dimensional structure capable of expressing serine protease inhibitor activity in the absence of biochemical stimuli. , Or if the disulfide bond is broken and the noncovalent interactions are disrupted, to reacquire such an active tertiary structure in the absence of biochemical stimuli. It has the ability to reform binding and interaction.

【００２８】本発明の好ましいプロテアーゼインヒビタ
ーは耳下腺分泌中に発見され、そして初めて精製された
形で単離された。本発明の目的のために、“純粋形”
（“ｐｕｒｅ ｆｏｒｍ”）、あるいは“精製された
形”（“ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｏｒｍ”）の用語が、こ
こに開示されているプロテアーゼインヒビターに関して
使用されるとき、セリンプロテアーゼインヒビター蛋白
質ではない他の蛋白質を実質的に含んでいないことを意
味する。好ましく、本発明のプロテアーゼインヒビター
は少くとも９０％の純度、そして好ましく９５％の純度
を有する。The preferred protease inhibitors of the present invention were discovered during parotid secretion and were first isolated in purified form. For purposes of the present invention, "pure form"
The term ("pure form"), or "purified form", when used in reference to the protease inhibitors disclosed herein, refers substantially to other proteins that are not serine protease inhibitor proteins. Means not included in. Preferably, the protease inhibitors of the present invention have a purity of at least 90%, and preferably 95%.

【００２９】本発明の好ましい形においては、耳下腺分
泌は、人間から得られる。しかしながら、他の哺乳動物
給源から得られる耳下腺分泌が本発明のそれと等価の活
性のプロテアーゼインヒビターの製造において有用であ
ろうことは予測される。In a preferred form of the invention, the parotid secretion is obtained from humans. However, it is expected that parotid secretions from other mammalian sources will be useful in the production of protease inhibitors of activity equivalent to that of the present invention.

【００３０】本発明のプロテアーゼインヒビターは、 （ａ）哺乳動物の耳下腺分泌物を採取し； （ｂ）分泌中の蛋白性物質を分画することにより耳下腺
分泌からインヒビターを単離し； （ｃ）セリンプロテアーゼインヒビター活性、好ましく
は白血球エラスターゼインヒビター活性を有する画分を
同定し； （ｄ）セリンプロテアーゼインヒビター活性を示す画分
を濃縮することからなる方法により耳下腺分泌から純粋
形で単離しうる。The protease inhibitor of the present invention comprises: (a) collecting parotid gland secretions from mammals; (b) isolating the inhibitor from parotid secretions by fractionating secretory proteinaceous substances; (C) identifying a fraction having serine protease inhibitor activity, preferably leukocyte elastase inhibitor activity; and (d) isolating the fraction exhibiting serine protease inhibitor activity from the parotid secretion in pure form. Can be separated.

【００３１】この方法において、哺乳動物耳下腺分泌
は、任意の公知手段により採取しうる。それらは、イン
ヒビターを実質的に変形させる酵素を含有しうる他の口
中液体の採取される検体中への導入を防止するために耳
下腺導管に取り付けられる吸引装置の使用を通して採取
するのが好ましい。In this method, the mammalian parotid secretion can be collected by any known means. They are preferably collected through the use of a suction device attached to the parotid duct to prevent the introduction of other oral fluids, which may contain enzymes that substantially deform the inhibitor, into the collected sample. ..

【００３２】好ましい態様においては、耳下腺分泌中に
存在する蛋白性物質は、各種濃度の塩溶液の存在におい
てカチオン交換物質と結合するその能力に従う物質の分
離により分画される。本発明のプロテアーゼインヒビタ
ーは、クロマトグラフィカラム中に存在する強カチオン
交換物質から、０．００５Ｍから１．０Ｍまでの濃度範
囲、そしてより特定的には０．４Ｍから０．８Ｍまでの
濃度範囲内の塩化ナトリウム溶出の画分により溶出しう
る。しかしながら、特定のカチオン交換カラムの性質に
依存し、他の塩溶液濃度が、プロテアーゼインヒビター
を溶出するために必要でありうる。In a preferred embodiment, the proteinaceous substances present in the parotid secretion are fractionated by separation of the substances according to their ability to bind cation exchange substances in the presence of salt solutions of various concentrations. The protease inhibitors of the present invention are within the concentration range of 0.005M to 1.0M, and more particularly 0.4M to 0.8M from the strong cation exchange material present in the chromatography column. It can be eluted by the fraction of sodium chloride elution. However, depending on the nature of the particular cation exchange column, other salt solution concentrations may be needed to elute the protease inhibitors.

【００３３】かく得られた画分は、セリンプロテアーゼ
インヒビター、好ましくは白血球エラスターゼインヒビ
ター活性の存在につきスクリーニングされる。好ましく
は、これは画分を既知濃度のプロテアーゼ、好ましくは
白血球エラスターゼと混合し、そして残留活性酵素を分
光光度計で観察される如きメトキシサクシニルＡｌａ−
Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ ｐ−ニトロアニリドを加水分
解するその能力を検定することにより遂行される。同定
された画分の蛋白性物質は、ついで大きさに従い、好ま
しくはゲル濾過により分離される。もしもゲル濾過分離
が使用されるならば、好ましい溶出液は、０．５Ｍ塩化
ナトリウム溶液である。そのような活性を示す画分は、
ついでプロテアーゼインヒビターの精製されそして濃縮
された形を得るために、たとえば限外濾過のような手段
により濃縮される。The fractions thus obtained are screened for the presence of serine protease inhibitor, preferably leukocyte elastase inhibitor activity. Preferably, this mixes the fractions with a known concentration of protease, preferably leukocyte elastase, and the residual active enzyme is methoxysuccinyl Ala- as observed by spectrophotometer.
It is accomplished by assaying its ability to hydrolyze Ala-Pro-Val p-nitroanilide. The proteinaceous material of the identified fractions is then separated according to size, preferably by gel filtration. If gel filtration separation is used, the preferred eluent is a 0.5M sodium chloride solution. Fractions showing such activity are
It is then concentrated to obtain a purified and concentrated form of the protease inhibitor, for example by means such as ultrafiltration.

【００３４】上記方法により単離されるプロテアーゼイ
ンヒビターは、一般的に、セリンプロテアーゼ、たとえ
ば白血球エラスターゼに関係して理論当量的活性を示
す。理論当量的活性は、プロテアーゼインヒビターの各
分子が１分子の白血球エラスターゼと反応し、そしてそ
れによって活性を著しく減少させることを意味する。イ
ンヒビターおよび白血球エラスターゼが１０^-8Ｍもしく
はそれより大きな濃度で存在する本発明の好ましいイン
ヒビターの溶液において、そのようなインヒビターは、
白血球エラスターゼの等価分子量の少くとも９０％と反
応しうる。The protease inhibitors isolated by the above method generally exhibit theoretical equivalent activity in relation to serine proteases such as leukocyte elastase. Theoretical equivalent activity means that each molecule of protease inhibitor reacts with one molecule of leukocyte elastase and thereby significantly reduces the activity. In a solution of the preferred inhibitor of the invention, wherein the inhibitor and leukocyte elastase are present at a concentration of 10 ⁻⁸ M or greater, such inhibitor comprises:
It can react with at least 90% of the equivalent molecular weight of leukocyte elastase.

【００３５】上記の如く、本発明者等は、セリンプロテ
アーゼインヒビターを、耳下腺分泌から、従来得られて
いない精製された形で単離することに成功した。この酵
素の精製された形における単離は、インヒビターの正し
い配列決定のため、ならびにプロテアーゼインヒビター
およびその同族体を含有する医薬組成物を開発するため
の必須工程であった。As described above, the present inventors have succeeded in isolating serine protease inhibitors from the parotid secretion in a purified form which has never been obtained. Isolation of this enzyme in purified form has been an essential step for correct sequencing of the inhibitor as well as for developing pharmaceutical compositions containing the protease inhibitor and its homologues.

【００３６】ポリペプチド中のアミノ酸残基は、下記の
略語でそれぞれ示す。 アミノ酸 略 語 アラニン Ａｌａ バリン Ｖａｌ ロイシン Ｌｅｕ イソロイシン Ｉｌｅ プロリン Ｐｒｏ フェニルアラニン Ｐｈｅ トリプトファン Ｔｒｐ メチオニン Ｍｅｔ グリシン Ｇｌｙ セリン Ｓｅｒ スレオニン Ｔｈｒ システイン Ｃｙｓ チロシン Ｔｙｒ アスパラギン Ａｓｎ グルタミン Ｇｌｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ グルタミン酸 Ｇｌｕ リジン Ｌｙｓ アルギニン Ａｒｇ ヒスチジン ＨｉｓAmino acid residues in the polypeptide are shown by the following abbreviations. Amino acid abbreviations Alanine Ala Valine Val Leucine Leu Isoleucine Ile Proline Pro Phenylalanine Phe Tryptophan Trp Methionine Met Glycine Gly Serine Ser Threonine Thr cysteine Ar glusine glusine glusine glusine glusine asparagine Asparagine asparagine Asparagine asparagine Asglun asparagine Asparagine Asparagine asparagine Asglun asparagine Asglun asparagine asparagine asparagine asparagine asparagine asparagine asparagine asparagine asparagine.

【００３７】これらのプロテアーゼインヒビターは、１
つ以上の明確な領域を有することが見出された。１つ以
上の明確な領域は、蛋白質が各種酵素に対し機能的であ
る複数の活性部位を有することを意味する。それら部位
の存在および位置は、プロテアーゼインヒビターの少く
とも２つの部分の間に実質的相同性の発見により決定さ
れた。明確な領域の存在は、本プロテアーゼインヒビタ
ーに、白血球エラスターゼおよびトリプシンの両者を包
含する各種のセリンプロテアーゼを阻害する能力を付与
するものと信じられる。These protease inhibitors are
It has been found to have one or more distinct areas. One or more distinct regions means that the protein has multiple active sites that are functional for various enzymes. The existence and location of these sites was determined by the finding of substantial homology between at least two parts of the protease inhibitor. The presence of a distinct region is believed to confer on the present protease inhibitors the ability to inhibit a variety of serine proteases, including both leukocyte elastase and trypsin.

【００３８】これらプロテアーゼインヒビターの明確な
領域の複数性に起因して、プロテアーゼインヒビター
は、各種の他の活性部位が付加性質を有するプロテアー
ゼインヒビターを創製するために構成されうる骨格とし
て役立ちうることが更に認められた。本発明の好ましい
態様は、白血球エラスターゼ、カテプシンＧおよびトリ
プシンを阻害するプロテアーゼインヒビターである。こ
れらの酵素はすべて、共通の機構および多くの構造特徴
を分けあうセリンプロテアーゼとして知られているプロ
テアーゼの１つの種類のものである。[0038] Due to the multiplicity of distinct regions of these protease inhibitors, it is further possible that various other active sites can serve as a scaffold that can be constructed to create protease inhibitors with additional properties. Admitted. A preferred embodiment of the present invention is a protease inhibitor that inhibits leukocyte elastase, cathepsin G and trypsin. All of these enzymes are of one type of protease known as serine proteases that share a common mechanism and many structural features.

【００３９】本発明のプロテアーゼインヒビター上の数
個のアミノ酸側鎖の改変を通して、インヒビターの多様
性が創製されるものと信じられ、各々は全種類のセリン
プロテアーゼの少くとも１つのものを阻害しうる。更
に、そのような側鎖変形は、上記のセリン蛋白質の種類
の特定のものに関して改善された阻害性質を有する複数
個のインヒビターを生成させることが期待できる。It is believed that through the modification of a few amino acid side chains on the protease inhibitors of the present invention, a diversity of inhibitors is created, each of which may inhibit at least one of all types of serine proteases. .. Furthermore, such side chain modifications can be expected to generate multiple inhibitors with improved inhibitory properties for certain of the above serine protein classes.

【００４０】これらの目標を達成するために必要とされ
るアミノ酸側鎖変化は、インヒビターの重要な機能部分
がＸ線結晶学を通して説明されてきた本発明の好ましい
インヒビターと他のセリンプロテアーゼインヒビターと
の間の構造類似性のある種の要素により示唆される。構
造類似性のそれら要素は、上記の本発明の好ましいセリ
ンプロテアーゼインヒビターのアミノ酸１７から２９ま
で、およびアミノ酸７０から８３までを包含する。トリ
プシン様セリンプロテアーゼに向けての、量または質の
いずれかにおけるインヒビター活性を改善することを示
唆する変化は、２０位のアミノ酸におけるＡｒｇからＬ
ｙｓへの、７２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅ
ｕからＬｙｓまたはＡｒｇへの、および７３位のアミノ
酸のＭｅｔからＬｙｓまたはＡｒｇへの１つもしくはそ
れ以上の変化を包含する。The amino acid side chain changes required to achieve these goals are due to the association of the preferred inhibitors of the present invention with other serine protease inhibitors in which the key functional part of the inhibitor has been described through X-ray crystallography. Suggested by certain elements of structural similarity between. Those elements of structural similarity include amino acids 17 to 29 and amino acids 70 to 83 of the preferred serine protease inhibitors of the present invention described above. A change suggesting improving trypsin-like serine proteases, either in quantity or quality, of inhibitor activity was from Arg to L at amino acid 20.
Le at position 72 or 74 to ys
Includes one or more changes from u to Lys or Arg and from the 73rd amino acid Met to Lys or Arg.

【００４１】キモトリプシン様のセリンプロテアーゼに
向けての、量または質のいずれかにおけるインヒビター
活性を改善することを示唆する変化は、２０位のアミノ
酸におけるＡｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへの７
２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅｕからＰｈ
ｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへのおよび７３位のアミノ酸に
おけるＭｅｔからＰｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐへの１つ
もしくはそれ以上の変化を包含する。膵臓エラスターゼ
様セリンプロテアーゼに向けての、量または質のいずれ
かにおけるインヒビター活性を改善することを示唆する
変化は、２０位のアミノ酸におけるＡｒｇからＡｌａへ
の、７２位または７４位のアミノ酸におけるＬｅｕから
Ａｌａへの、および７３位のアミノ酸におけるＭｅｔか
らＡｌａへの１つもしくはそれ以上の変化を包含する。A change towards a chymotrypsin-like serine protease suggesting improved inhibitor activity, either in quantity or quality, is a 7 at the amino acid at position 20 to Arg, Phe, Tyr or Trp.
Leu to Ph at the amino acid at position 2 or 74
e, Tyr or Trp and one or more changes from Met to Phe, Tyr or Trp at amino acid 73. Changes suggesting improving pancreatic elastase-like serine protease, either in quantity or quality, of inhibitor activity are from Arg at amino acid 20 to Ala, from Leu at amino acid 72 or 74. Includes one or more changes from Met to Ala and at the amino acid at position 73 from Ala.

【００４２】本発明の実施において、本蛋白質に対し新
しいプロテアーゼ阻害性質を賦与するためのアミノ酸配
列の変更は、白血球エラスターゼに向けて、またはトリ
プシンに向けてのインヒビター活性を破壊しうることを
心に留めなければならない。そのような効果は、本発明
に従い定常的実験により決定しうる。In practicing the present invention, it should be borne in mind that alteration of the amino acid sequence to confer new protease inhibiting properties on the protein may destroy the inhibitory activity towards leukocyte elastase or towards trypsin. I have to stop. Such effects may be determined by routine experimentation according to the present invention.

【００４３】更に、上記に示した如き別個のアミノ酸、
またはアミノ酸の別個の配列の置換は、本プロテアーゼ
インヒビターの白血球エラスターゼ阻害性質またはトリ
プシン阻害性質のいずれかを高めることが意図され、一
方高められていない領域の若干の活性を殺す。実際に、
インヒビター蛋白質の任意の領域の活性は適当なアミノ
酸置換により完全に不活性化しえ、それにより蛋白質が
正常に活性である酵素の１つもしくは若干のサブセット
に特異のインヒビター蛋白質を創製する。たとえば、２
０位のＡｒｇのＧｌｙへの置き換えはトリプシン阻害領
域を不活性化し、一方７３位のＭｅｔ、あるいは７２ま
たは７４位のＬｅｕのＧｌｙへの置き換えは、白血球阻
害領域を不活性化する。領域はまた分離蛋白質に分離し
え、その各々は所望の阻害機能を保持する。本請求の範
囲は、それら手段により導かれる他のインヒビターに拡
張される。Further, a separate amino acid as shown above,
Alternatively, the substitution of a separate sequence of amino acids is intended to enhance either the leukocyte elastase-inhibiting or trypsin-inhibiting properties of the protease inhibitor, while killing some activity in the un-enhanced region. actually,
The activity of any region of the inhibitor protein can be completely inactivated by appropriate amino acid substitutions, thereby creating an inhibitor protein specific for one or some subset of the enzymes for which the protein is normally active. For example, 2
Replacement of Arg at position 0 with Gly inactivates the trypsin inhibitory region, whereas replacement of Met at position 73, or Leu at position 72 or 74 with Gly inactivates the leukocyte inhibitory region. The regions can also be separated into separate proteins, each of which retains the desired inhibitory function. The claims extend to other inhibitors derived by these means.

【００４４】上記アミノ酸配列は好ましいものであり、
そして上記に列挙した特徴を有する白血球エラスターゼ
インヒビターを生成するけれども、本発明はまた、医薬
的立場からまた望ましいものである白血球エラスターゼ
阻害活性を包含する特徴を示すこのインヒビターのある
種の同族体を提供する。従って、そのような同族体はま
た、本発明の好ましい組成物である。特に、もしもアミ
ノ酸メチオニンがアミノ酸バリンに置換されたならば、
生成したインヒビターは、酸化的不活性化に対し改善さ
れた抵抗性を示し、従って改善された白血球エラスター
ゼおよびカテプシンＧインヒビター性質を示す。同様の
変化はタバコタールによる不活性化に対するインヒビタ
ーの抵抗性を改善するためになされうる。The above amino acid sequences are preferred,
And while producing a leukocyte elastase inhibitor having the above-listed characteristics, the present invention also provides certain homologues of this inhibitor which exhibit characteristics including leukocyte elastase inhibitory activity, which is also desirable from a pharmaceutical standpoint. To do. Therefore, such homologues are also preferred compositions of the present invention. In particular, if the amino acid methionine is replaced by the amino acid valine,
The inhibitors produced show improved resistance to oxidative inactivation and thus improved leukocyte elastase and cathepsin G inhibitor properties. Similar changes can be made to improve the resistance of inhibitors to inactivation by tobacco tar.

【００４５】追加置換は、特許請求されたプロテアーゼ
インヒビターの他の各種性質を高めえ、そして生成蛋白
質を蛋白分解酵素インヒビターとしてより有用なものと
するのに役立ちうる、本発明の実施を通して、この技術
分野において通常の熟練度の者には明らかとなるであろ
うことが可能である。そのような更に他の置換は本発明
の範囲内にあることが意図される。Throughout the practice of this invention, additional substitutions can enhance various other properties of the claimed protease inhibitors, and may serve to render the resulting proteins more useful as proteolytic enzyme inhibitors, throughout the practice of this invention. It will be apparent to those of ordinary skill in the art. Such yet other substitutions are intended to be within the scope of the invention.

【００４６】更に、蛋白質のアミノ酸配列における僅か
な変化は、たとえそれらが蛋白質の機能を高めないとし
ても、著しく減少した活性を有しない同族体を創製する
ことが、この技術分野において熟練している者により認
識される。従って、配列が上記に示した好ましい配列の
それから僅かの変化を含有する上記に論述したプロテア
ーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含さ
れることが意図される。特に、Ｃ−およびＮ−末端にお
けるアミノ酸配列の僅かな変更は、開示されたプロテア
ーゼインヒビターの活性を顕著には変化しないであろう
と信じられる。特に、Ｃ−またはＮ−末端における環化
アミノ酸たとえばプロリンでの置換は、所望のセリンプ
ロテアーゼ阻害活性を有するプロテアーゼインヒビター
を生成すると信じられる。また、Ｃ−またはＮ−末端に
おける変更を有し、その変更が同族体のセリンプロテア
ーゼインヒビター性質を破壊しない開示されたプロテア
ーゼインヒビターの同族体は、本発明の範囲内に包含さ
れる。Furthermore, slight changes in the amino acid sequence of proteins are well-known in the art to create homologues that do not have significantly diminished activity, even if they do not enhance protein function. Be recognized by the person. Thus, homologues of the above-described protease inhibitors whose sequences contain slight variations from that of the preferred sequences set forth above are intended to be included within the scope of the present invention. In particular, it is believed that slight changes in the amino acid sequence at the C- and N-termini will not significantly change the activity of the disclosed protease inhibitors. In particular, it is believed that substitution at the C- or N-terminus with a cyclized amino acid, such as proline, produces a protease inhibitor with the desired serine protease inhibitory activity. Also included within the scope of the invention are homologs of the disclosed protease inhibitors that have alterations at the C- or N-termini that do not destroy the serine protease inhibitor properties of the homologue.

【００４７】本プロテアーゼインヒビターのＣ−または
Ｎ−末端に対するポリペプチド鎖の付加は、本発明の範
囲内にあることがまた意図される。特に、ポリペプチド
鎖は、蛋白融合技術を通していずれかの末端に結合しう
る。それらの追加ポリペプチドは、本プロテアーゼイン
ヒビターの薬学的有効性を高めるのに役立ちうる。たと
えば、ポリペプチドは、他の蛋白質との融合により、粘
膜に固定されうるようになって、プロテアーゼインヒビ
ターが特定部位、たとえば肺に留ることを生じるように
なしうる。Addition of a polypeptide chain to the C- or N-terminus of the protease inhibitor is also contemplated as being within the scope of this invention. In particular, the polypeptide chain may be attached to either end through protein fusion technology. These additional polypeptides may serve to enhance the pharmaceutical efficacy of the present protease inhibitors. For example, the polypeptide may be capable of being anchored to the mucosa by fusion with other proteins, causing the protease inhibitor to remain at a specific site, such as the lung.

【００４８】これら同族体において、アミノ酸配列の変
化は、プロテアーゼインヒビターが投与される生物にお
いて悪い免疫応答を生じさせるようなものであってはな
らない。生物学的分子が悪い免疫応答を生じさせるかど
うかを決定する方法は、この技術分野において通常の熟
練度の者には知られている。In these homologues, the amino acid sequence alterations should not be such that they produce an adverse immune response in the organism to which the protease inhibitor is administered. Methods of determining whether a biological molecule produces an adverse immune response are known to those of ordinary skill in the art.

【００４９】上記の置き換えは、各種の方法により行い
うる。たとえば、リコンビナントＤＮＡ法によりインヒ
ビターを導くために使用される一般的指示を、宿主微生
物が所望の同族体の合成を生じるように変更しうる。そ
のようなリコンビナント法は、１９８４年１２月６日に
出願された、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ０ｆ Ｓｅｒｉｎｅ
Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｂｉｖｉｔｏｒｓ ａｎｄ Ｄ
ＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｓ
ａｍｅと題するＰｒａｄｉｐ Ｋ．Ｂａｎｄｙｏｐａｄ
ｈｙａｙ等の米国特許出願第６７８，８２２号、および
それと同日に出願されたＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅ
ｒｉｎｅＰｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａ
ｎｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆ
ｏｒ Ｓａｍｅと題するＰｒａｄｉｐ Ｋ．Ｂａｎｄｙ
ｏｐａｄｈｙａｙ等の米国特許出願第６７８，８２３号
中に示されている。蛋白質同族体を生化学的に合成する
他の方法は、この技術分野において通常の熟練度の者に
は知られており、そしてそれらおよび他の同族体の創製
のために、本発明の範囲内に包含することが意図されて
いる。The above replacement can be performed by various methods. For example, the general instructions used to derive inhibitors by recombinant DNA methods may be modified so that the host microorganism produces the desired homologous synthesis. Such a recombinant method is described in Recombinant Methods, filed December 6, 1984.
for Isolation 0f Serine
Protease Invitors and D
NA Sequences Useful for S
Pradip K., entitled Ame. Bandyopad
US Patent Application No. 678,822 to Hyay et al., and Recombinant Me filed on the same date.
hows for Isolation of Se
lineProtease Inhibitors a
nd DNA Sequences Useful f
or Same Prad K. Bandy
It is shown in U.S. Patent Application No. 678,823 to Opadhyay et al. Other methods of biochemically synthesizing protein homologues are known to those of ordinary skill in the art and within the scope of the present invention for the creation of them and other homologues. It is intended to be included in.

【００５０】本発明のプロテアーゼインヒビターおよび
その同族体は、セリンプロテアーゼインヒビター活性、
特に白血球エラスターゼインヒビター活性を所有する医
薬製品の形において、人間および動物用途を意図され
る。活性成分少くとも１つ、本セリンプロテアーゼイン
ヒビター１つを含有する医薬製剤はまた、意図される投
薬形に依存し、適当な医薬的に受容しうる担体、希釈
剤、充填剤、結合剤および他の賦形薬を含有することが
期待される。The protease inhibitors and homologues thereof of the present invention have serine protease inhibitor activity,
It is intended for human and veterinary use, especially in the form of pharmaceutical products possessing leukocyte elastase inhibitor activity. Pharmaceutical formulations containing at least one active ingredient and one serine protease inhibitor of the invention also depend on the intended dosage form and are suitable pharmaceutically acceptable carriers, diluents, fillers, binders and other It is expected to contain the excipient.

【００５１】経口投与のためには、工程は、消化管中に
おける活性蛋白質の分解を防止するようになされなけれ
ばならない。腸溶被覆投薬形が、経口投与に適当な１つ
の形として意図される。もしも経口投与が選択されるな
らば、製剤は、水、または塩溶液、または他の医薬的に
受容しうる懸濁化剤を含有しうる。一般的に、非経口投
与が意図される製剤は、全製剤を体液と等張にするのに
充分な濃度における塩化ナトリウムを含有するのが好ま
しい。For oral administration, the process must be adapted to prevent degradation of active protein in the digestive tract. Enteric coated dosage forms are contemplated as one suitable form for oral administration. If oral administration is selected, the formulation may contain water, or saline, or other pharmaceutically acceptable suspending agent. In general, formulations intended for parenteral administration preferably contain sodium chloride in a concentration sufficient to render the total formulation isotonic with body fluids.

【００５２】本発明のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー、特に白血球エラスターゼインヒビター蛋白質を含有
する医薬製剤は、局所化酵素不均衡の治療のために、注
射または局所適用により局所的に投与されうることがま
た意図される。本インヒビター、特に白血球エラスター
ゼインヒビターはまた、特に肺気腫の治療における如く
肺に適用するとき、エアロゾルとして投与しうる。それ
らの場合、適当な担体、希釈剤およびプロペラントが使
用される。It is also intended that the pharmaceutical formulations containing the serine protease inhibitors of the invention, in particular the leukocyte elastase inhibitor protein, may be administered locally by injection or topical application for the treatment of localized enzyme imbalance. .. The inhibitors, especially leukocyte elastase inhibitors, may also be administered as aerosols, especially when applied to the lung, as in the treatment of emphysema. In those cases, suitable carriers, diluents and propellants are used.

【００５３】投与されるプロテアーゼインヒビターの量
は、各投薬状態において、生物中に存在する過剰の蛋白
分解酵素の量に依存する。適当な用量を決定するために
は、存在する蛋白分解酵素の過剰量を定量し、そして投
与される特定の種のプロテアーゼインヒビターまたはそ
れらの混合物の活性に基き、過剰の蛋白分解酵素を中和
するのに必要なプロテアーゼインヒビターの総量を決定
しうる。そのような決定は免疫学的障害の治療における
治療用量の決定において、この技術分野において通常の
熟練度の者により定常的になされ、そして特に標準検定
およびここに開示された検定の知識の下に、彼等により
過度の実験なしに定常的に遂行される課業の範囲内にあ
る。しかしながら、本発明のプロテアーゼインヒビター
の大過剰量は、過剰の蛋白分解酵素を有する生物に投与
するとき、毒性でなくまたは悪い反応を生じないと信じ
られることは認識されるべきである。最適量に比し少な
い量よりはむしろプロテアーゼインヒビターの最適量の
過剰における量を使用するのが好ましい。The amount of protease inhibitor administered depends on the amount of excess proteolytic enzyme present in the organism in each dosage state. To determine the appropriate dose, the excess amount of proteolytic enzyme present is quantified, and the excess proteolytic enzyme is neutralized based on the activity of the particular species of protease inhibitor or mixture administered. The total amount of protease inhibitor required for the treatment can be determined. Such determinations are routinely made by those of ordinary skill in the art in determining therapeutic doses in the treatment of immunological disorders, and particularly under the knowledge of standard assays and the assays disclosed herein. , They are within the scope of routine tasks performed by them without undue experimentation. However, it should be appreciated that large excesses of protease inhibitors of the present invention are believed not to be toxic or produce adverse reactions when administered to organisms having excess proteolytic enzymes. It is preferred to use an amount in excess of the optimal amount of protease inhibitor rather than a less than optimal amount.

【００５４】特定の問題または環境に対する本発明の教
示の適用は、ここに含まれる教示の知識の下に、この技
術分野において通常の知識を有する者の能力の範囲内に
あることは理解されるべきである。It is understood that the application of the teachings of the invention to a particular problem or environment is within the ability of one of ordinary skill in the art, with the knowledge of the teachings contained herein. Should be.

【００５５】[0055]

【実施例】以下の実施例は本発明に係る生成物の例、な
らびにそれらの単離および製造のための例示的方法を示
すものである。EXAMPLES The following examples set forth examples of products according to the present invention and exemplary methods for their isolation and manufacture.

【００５６】例１ 耳下腺分泌からの人間白血球エラスターゼインヒビター
の精製 耳下腺分泌を、志願者から、耳下腺導管の出口に付した
吸引器具で採取した。分泌は、酢っぱいキャンデーをし
ゃぶることにより刺激した。２〜３リットルの集めた耳
下腺分泌を、水酸化ナトリウムで pＨ６．０にもってい
き、そして遠心分離して、沈澱を除去した。上澄液を
０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、 pＨ６．０およ０．００５
Ｍ塩化ナトリウムで平衡化したＳＰセファデックス（Ｓ
ＥＰＨＡＤＥＸ：登録商標）Ｃ５０の２．５×４０．０
cmカラムに適用した。カラムを０．００５から１Ｍまで
の塩化ナトリウムの線状グラジエントで溶出した。得ら
れた画分を、インヒビターの存在につき免疫検定により
試験した。Example 1 Purification of Human Leukocyte Elastase Inhibitor from Parotid Secretion Parotid secretion was collected from volunteers by a suction device attached to the outlet of the parotid duct. Secretion was stimulated by sucking a sour candy. 2-3 liters of collected parotid secretions were brought to pH 6.0 with sodium hydroxide and centrifuged to remove the precipitate. The supernatant is 0.05M sodium acetate, pH 6.0 and 0.005.
SP Sephadex (S
EPHADEX: C50 2.5 x 40.0
applied to a cm column. The column was eluted with a linear gradient of sodium chloride from 0.005 to 1M. The obtained fractions were tested by immunoassay for the presence of inhibitors.

【００５７】活性のピークに相当する画分は、０．６Ｍ
付近で得られたものであった。それら画分をアミコン
（ＡＭＩＣＯＮ：登録商標）ＵＭ２フィルターに通す限
外濾過により３mlに濃縮し、そして濃縮物を０．０５Ｍ
トリス、 pＨ７．４および０．５Ｍ塩化ナトリウムで平
衡化したセファデックスＧ５０の１．６×１００cmカラ
ムに適用した。カラムをついでこのバッファーで溶出
し、そして画分を免疫検定により試験した。活性画分を
貯蔵し、そして上記の如く限外濾過により濃縮した。２
〜４mgのインヒビターが回収され、これは実質的に１０
０％活性であった。The fraction corresponding to the peak of activity was 0.6M.
It was obtained in the vicinity. The fractions were concentrated to 3 ml by ultrafiltration through an AMICON® UM2 filter and the concentrate was concentrated to 0.05M.
Applied to a 1.6 x 100 cm column of Sephadex G50 equilibrated with Tris, pH 7.4 and 0.5 M sodium chloride. The column was then eluted with this buffer and the fractions tested by immunoassay. Active fractions were pooled and concentrated by ultrafiltration as above. Two
~ 4 mg of inhibitor was recovered, which is substantially 10
It was 0% active.

【００５８】例２ 化膿性気管支粘膜から人間白血球エラスターゼインヒビ
ターの精製 気管支粘液を、小吸気疾患の病院患者から採取し、そし
て貯蔵した。貯蔵物を凍結し、そして凍結乾燥した。凍
結乾燥粉末を５％過塩素酸の***液に懸濁し、そしてこ
の混合物を２時間激しく撹拌し、そして４Ｍ水酸化カリ
ウムの添加により中和した。混合物を、０℃において１
２，０００ｇで３０分間遠心分離して、不溶物を除去し
た。Example 2 Purification of Human Leukocyte Elastase Inhibitor from Purulent Bronchial Mucosa Bronchial mucus was collected and stored from a hospital patient with small inspiration disease. Stocks were frozen and lyophilized. The lyophilized powder was suspended in a cold solution of 5% perchloric acid and the mixture was vigorously stirred for 2 hours and neutralized by the addition of 4M potassium hydroxide. Mix the mixture at 0 ° C with 1
Insoluble matter was removed by centrifugation at 2,000 g for 30 minutes.

【００５９】この蛋白質の粗溶液を、１００，０００ダ
ルトンより大きい、そして１０，０００ダルトンより小
さい分子量のすべての物質を除去するように設計された
膜に通す限外濾過により分画した。第１工程中におい
て、溶液は、薄チャンネル限外濾過装置中のアミコンＸ
Ｍ １００Ａ膜に再循環した。膜を通した物質を、つい
でＭＸ １００Ａ膜をＹＭ １０に置換した同じ装置に
通した。物質は、ミニタン（ＭＩＮＩＴＡＮ：登録商
標）装置中におけるミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ：登
録商標）１００Ｋ膜上の最初の再循環により分画するこ
とがまた可能であった。この場合、フィルターを通過す
る物質は、ついで１０Ｋ膜を有する同じ装置に通した。
両方の場合において、膜により保持された物質は、引続
く処理のために回収された。The crude solution of this protein was fractionated by ultrafiltration through a membrane designed to remove all substances of molecular weight above 100,000 Daltons and below 10,000 Daltons. In the first step, the solution was Amicon X in a thin channel ultrafiltration device.
Recycled to M100A membrane. The material through the membrane was then passed through the same equipment with the MX 100A membrane substituting YM 10. It was also possible to fractionate the material by first recirculating over the Millipore® 100K membrane in a Minitan® device. In this case, the material passing through the filter was then passed through the same device with a 10K membrane.
In both cases, the material retained by the membrane was recovered for subsequent processing.

【００６０】限外濾液を、逆相高圧液体クロマトグラフ
ィ（ＨＰＬＣ）カラム上、クロマトグラフィに付した。
蛋白質総量約２０mgおよびインヒビター約０．６mgを含
有する約１mlを、ＲＰ８カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ Ｉ
ｎｃ．製、Ｌｉｎｄｅｎ，Ｉｎｄｉａｎａ）上に、１分
当たり１mlの流速でのせた。蛋白質を、水中のトリフル
オロ酢酸の０．０５％溶液、ついでアセトニトリル中の
０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の０％溶液から
５０％溶液までの線状グラジエントで溶出した。画分を
採取し、そして既知量のキモトリプシンと混合し、引続
いて上記標準方法を使用して残留活性キモトリプシンを
決定することにより、プロテアーゼインヒビター活性に
つき検定した。活性物質は、２５％および３０％アセト
ニトリル溶液の間で溶出した。それら画分を、更に処理
するために貯蔵した。The ultrafiltrate was chromatographed on a reverse phase high pressure liquid chromatography (HPLC) column.
About 1 ml containing about 20 mg of total protein and about 0.6 mg of inhibitor was added to an RP8 column (Synchrom I).
nc. Manufactured by Linden, Indiana) at a flow rate of 1 ml per minute. The protein was eluted with a 0.05% solution of trifluoroacetic acid in water followed by a linear gradient from 0% to 50% solution of 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) in acetonitrile. Fractions were collected and assayed for protease inhibitor activity by mixing with known amounts of chymotrypsin and subsequently determining residual active chymotrypsin using the standard method described above. The active substance eluted between 25% and 30% acetonitrile solutions. The fractions were stored for further processing.

【００６１】ＲＰ８カラムからの集めた画分を凍結乾燥
し、そして、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、 pＨ６．０
に溶かし、そして同じバッファーで平衡化したブラウン
リーＣＸ３００カチオン交換カラムに適用した。カラム
を０から１００％までの０．５Ｍリン酸ナトリウム、 p
Ｈ６．０の線状グラジエントで溶出した。活性画分を、
それらのキモトリプシンを阻害する能力につき、再び検
出した。０．２４Ｍ、０．２６Ｍおよび０．２８Ｍホス
フェートで溶出する３つの活性ピークを検出した。活性
物質の３つの貯蔵物を作り、そしてそれらを凍結して貯
蔵するのに先立ち、ＹＭ １０膜を有するアミコン装置
中で脱塩および濃縮した。The collected fractions from the RP8 column were lyophilized and washed with 0.05M sodium phosphate, pH 6.0.
And applied to a Brownley CX300 cation exchange column equilibrated in the same buffer. The column is loaded with 0 to 100% 0.5 M sodium phosphate, p
Elution was performed with a linear gradient of H6.0. The active fraction
Again their ability to inhibit chymotrypsin was detected. Three activity peaks were detected eluting with 0.24M, 0.26M and 0.28M phosphate. Three stocks of active substance were made and they were desalted and concentrated in an Amicon device with a YM 10 membrane prior to freezing and storage.

【００６２】各画分の活性をキモトリプシンに対する検
定により決定し、そして蛋白質濃度はプラッドフォード
検定法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ａｓｓａｙ）［Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２：２４８（１９７
６）］により決定した。各画分は、例１の耳下腺分泌か
ら精製されたインヒビターにつき観察されたそれの約８
０％であるキモトリプシンに対する活性を有した。The activity of each fraction was determined by an assay for chymotrypsin and the protein concentration was determined by the Bradford assay [Analy.
mechanical Biochem. , 72 : 248 (197)
6)]. Each fraction contained about 8 of that observed for the inhibitor purified from parotid secretion of Example 1.
It had an activity on chymotrypsin that was 0%.

【００６３】例３ 耳下腺分泌から単離された白血球エラスターゼインヒビ
ターのアミノ酸配列の決定 天然インヒビターを、標準方法により還元およびカルボ
キシメチル化した。インヒビター１．０mg（８０ｎ ｍ
ｏｌ）を、ジチオスレイトール１．３２ｍｏｌおよびト
リスバッファー、 pＨ８．０を含有する０．１Ｍトリス
ＨＣｌ、 pＨ８．０中の６Ｍグアニジウム塩酸塩溶液６
００リットル中に溶かした。３７℃で一時間後に、（２
− ³Ｈ）ヨウド酢酸３．３２ｎ ｍｏｌを加え、そして
インキュベーションを３７℃で更に一時間継続した。ジ
チオスレイトール０．６６ｎｍｏｌ、そして３７℃で一
時間インキュベート後に、別の（２− ³Ｈ）ヨウド酢酸
１．３６ｎ ｍｏｌを加えた。Example 3 Determination of Amino Acid Sequence of Leukocyte Elastase Inhibitor Isolated from Parotid Secretion Native inhibitors were reduced and carboxymethylated by standard methods. Inhibitor 1.0 mg (80 nm
ol) is 1.32 mol of dithiothreitol and 0.1 M Tris-HCl containing Tris buffer, pH 8.0, 6M guanidinium hydrochloride solution 6 in pH 8.0.
Dissolved in 00 liters. After 1 hour at 37 ° C, (2
⁻³ H) 3.32 nmol iodoacetic acid was added and the incubation continued at 37 ° C. for another hour. Dithiothreitol 0.66Nmol, and after one hour incubation at 37 ° C., was added another (2- ³ H) iodo acetate 1.36n mol.

【００６４】３７℃で一時間インキュベートの後、反応
混合物を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含有するトリスバ
ッファー、 pＨ８．０に対し広範に透析した。生成した
溶液をシンクロムＲＰ８ ＨＰＬＣカラムに適用し、そ
して生成物を水中の０．０５％ＴＦＡ、ついでアセトニ
トリル中の０．０５％ＴＦＡの線状グラジエントで、カ
ラムから溶出した。還元されたカルボキシメチル化蛋白
質は、２１５および２８０ｎｍにおける吸収、ならびに
それら画分の（ ³Ｈ）含量により決定される如く、２２
％のアセトニトリル溶液において溶出した。この物質
を、次の使用のために真空下に乾燥した。After incubation for 1 hour at 37 ° C., the reaction mixture was extensively dialyzed against Tris buffer, pH 8.0, containing 0.1 M sodium chloride. The resulting solution was applied to a Syncrom RP8 HPLC column and the product was eluted from the column with a linear gradient of 0.05% TFA in water followed by 0.05% TFA in acetonitrile. The reduced carboxymethylated protein had 22% as determined by absorption at 215 and 280 nm, and the ( ³ H) content of those fractions.
% Acetonitrile solution. This material was dried under vacuum for subsequent use.

【００６５】還元されたカルボキシメチル化蛋白質は、
アミノ酸配列の残基１から４１までの同定を生じる自動
エドマン分解により配列づけした。それらは次の如くで
ある：The reduced carboxymethylated protein is
Sequenced by automated Edman degradation resulting in the identification of residues 1 to 41 of the amino acid sequence. They are as follows:

【化４】 [Chemical 4]

【００６６】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、
マウス下顎プロテアーゼでの消化に付し、そして生成し
たペプチドをシンクロムＲＰ８カラム上、上記と同じ溶
液およびグラジエントを使用する逆相ＨＰＬＣにより分
離した。２０％アセトニトリル溶液で溶出するそれらペ
プチドの１つを自動化エドマン分解により配列づけし、
そして次の結果を得た：The reduced carboxymethylated protein is
Subjected to digestion with mouse mandibular protease and the resulting peptides were separated by reverse phase HPLC on a Syncrom RP8 column using the same solution and gradient as above. One of those peptides eluting with a 20% acetonitrile solution was sequenced by automated Edman degradation,
And got the following results:

【化５】 [Chemical 5]

【００６７】この同じペプチドを、キモトリプシンでの
消化に付して２つの新しいペプチドを得、それを再び上
記に示した如くシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬ
Ｃにより分離した。１７％ＭｅＣＮアセトニトリルで溶
出するそれらの１つを自動化エドマン分解により配列づ
けし、そして次の配列を得た：This same peptide was subjected to digestion with chymotrypsin to give two new peptides which were again analyzed by reverse phase HPL on a syncrom RP8 column as shown above.
Separated by C. One of them eluting with 17% MeCN acetonitrile was sequenced by automated Edman degradation and the following sequence was obtained:

【化６】 [Chemical 6]

【００６８】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を、
Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼで消化し、そして生成したペプ
チドをシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより
分離した。１３％および１５％アセトニトリルの間で溶
出する（ ³Ｈ）含有物質のピークをエドマン分解に付
し、それは次の配列を与えた。The reduced carboxymethylated protein is
It was digested with Lys-C protease and the resulting peptides were separated by reverse phase HPLC on a Syncrom RP8 column. The ( ³ H) -containing material peak eluting between 13% and 15% acetonitrile was subjected to Edman degradation, which gave the following sequence:

【化７】 [Chemical 7]

【００６９】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーのマウス下顎プロテアーゼ消化から得られ、そして２
６％および２８％アセトニトリルの間で溶出するペプチ
ドを自動化エドマン分解により配列づけし、そして次の
配列を得た：Obtained from mouse mandibular protease digestion of reduced carboxymethylation inhibitors, and 2
Peptides eluting between 6% and 28% acetonitrile were sequenced by automated Edman degradation and the following sequences were obtained:

【化８】 [Chemical 8]

【００７０】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーをＶ８プロテアーゼでの消化に付し、そしてペプチド
をシンクロムＲＰ８カラム上の逆相ＨＰＬＣにより分離
した。１９％アセトニトリルで溶出するペプチドを自動
化エドマン分解により配列づけし、そして次の配列を得
た：The reduced carboxymethylation inhibitor was subjected to digestion with V8 protease and the peptides were separated by reverse phase HPLC on a Syncrom RP8 column. The peptides eluting with 19% acetonitrile were sequenced by automated Edman degradation and the following sequences were obtained:

【化９】 [Chemical 9]

【００７１】還元されたカルボキシメチル化インヒビタ
ーの下顎プロテアーゼ消化から生成し、そしてシンクロ
ムＲＰ８カラムから２６％および２８％アセトニトリル
の間で溶出するペプチドを、更にトリプシンで消化し
た。生成したペプチドを同じカラム上の逆相ＨＰＬＣに
より分離し、９％アセトニトリルで溶出するペプチドを
手操作エドマン分解により配列づけして、次の配列を得
た。The peptide generated from the mandibular protease digestion of the reduced carboxymethylation inhibitor and eluting from the Synchrome RP8 column between 26% and 28% acetonitrile was further digested with trypsin. The resulting peptides were separated by reverse phase HPLC on the same column and the peptides eluting with 9% acetonitrile were sequenced by manual Edman degradation to give the next sequence.

【化１０】 [Chemical 10]

【００７２】同じ組成および配列のペプチドは、蛋白質
のＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ消化から単離しうる。このペ
プチドは、シンクロムＲＰ８カラムから８および１０％
アセトニトリルの間で溶出する。Peptides of the same composition and sequence can be isolated from the Lys-C protease digest of the protein. This peptide is 8 and 10% from the Synchrome RP8 column.
Elute between acetonitrile.

【００７３】還元されたカルボキシメチル化蛋白質を６
Ｍ塩酸中で加熱することにより加水分解し、そしてＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動からの分子量約１
４，０００に基くその構成アミノ酸は次のものであると
決定された： Ａｌａ ３．５ Ａｒｇ ５．８ Ａｓｐ ８．５ Ｃｙｓ １５．７ Ｇｌｕ ５．２ Ｇｌｙ １０．６ Ｈｉｓ ０．０ Ｉｌｅ １．０ Ｌｅｕ ５．０ Ｌｙｓ １６．２ Ｍｅｔ ４．０ Ｐｈｅ ２．１ Ｐｒｏ １４．８ Ｓｅｒ ３．７ Ｔｈｒ ２．４ Ｔｙｒ ２．１ Ｖａｌ ４．７The reduced carboxymethylated protein was added to 6
Hydrolyzes by heating in M hydrochloric acid and SD
Molecular weight of about 1 from S-polyacrylamide gel electrophoresis
Its constituent amino acids based on 4,000 were determined to be: Ala 3.5 Arg 5.8 Asp 8.5 Cys 15.7 Glu 5.2 Gly 10.6 His 0.0 Ile 1. 0 Leu 5.0 Lys 16.2 Met 4.0 Phe 2.1 Pro 14.8 Ser 3.7 Thr 2.4 Tyr 2.1 Val 4.7

【００７４】上記データは、還元されたカルボキシメチ
ル化インヒビターから得られる１組の重なり合うペプチ
ドを限定することが決定された。従って、本インヒビタ
ーの全配列は次の如くである：The above data was determined to limit the set of overlapping peptides obtained from reduced carboxymethylation inhibitors. Thus, the full sequence of this inhibitor is as follows:

【化１１】 [Chemical 11]

【００７５】この蛋白質の塩酸加水分解物から予測され
たアミノ酸組成は、次の如くである： Ａｌａ ３ Ａｒｇ ５ Ａｓｐ ９ Ｃｙｓ １６ Ｇｌｙ ９ Ｇｌｕ ７ Ｈｉｓ ０ Ｉｌｅ １ Ｌｅｕ ５ Ｌｙｓ １５ Ｍｅｔ ４ Ｐｈｅ ２ Ｐｒｏ １３ Ｓｅｒ ６ Ｔｈｒ ４ Ｔｙｒ ２ Ｔｒｐ １ Ｖａｌ ５ 更に、Ｃｙｓ残基のすべてはお互いに結合してジスルフ
ァイド結合を形成するものと信じられる。The amino acid composition predicted from the hydrochloric acid hydrolyzate of this protein is as follows: Ala 3 Arg 5 Asp 9 Cys 16 Gly 9 Glu 7 His 0 Ile 1 Leu 5 Lys 15 Met 4 Phe 2 Pro 13 Ser 6 Thr 4 Tyr 2 Trp 1 Val 5 Furthermore, it is believed that all of the Cys residues bind to each other to form a disulfide bond.

【００７６】例４ 気管支粘膜からのエラスターゼインヒビターの、耳下腺
からのそれとの同定 ブラウンリーＣＸ３００カラムから０．２８Ｍホスフェ
ートで溶出されるインヒビターは、次の如く特徴づけら
れた： （ａ）インヒビターの検体を、標準条件下に、６Ｍ塩酸
中で加熱することにより加水分解した。本インヒビター
のアミノ酸組成は、 Ａｌａ ３．８ Ａｒｇ ５．０ Ａｓｐ ８．８ Ｇｌｙ １１．３ Ｇｌｕ ６．３ Ｈｉｓ ０ Ｉｌｅ １．３ Ｌｅｕ ５．０ Ｌｙｓ １３．８ Ｍｅｔ ３．８ Ｐｈｅ ２．５ Ｐｒｏ １２．５ Ｓｅｒ ６．３ Ｔｈｒ ３．８ Ｔｙｒ １．３ Ｖａｌ ５．０ である。これは、耳下腺からのインヒビターのアミノ酸
組成、あるいは上記配列から計算されるそれと著しくは
相違していない。Example 4 Identification of an elastase inhibitor from the bronchial mucosa with that from the parotid gland The inhibitor eluted at 0.28 M phosphate from a Brownley CX300 column was characterized as follows: (a) Inhibitor The specimen was hydrolyzed by heating in 6M hydrochloric acid under standard conditions. The amino acid composition of the present inhibitor is as follows: Ala 3.8 Arg 5.0 Asp 8.8 Gly 11.3 Glu 6.3 His 0 Ile 1.3 Leu 5.0 Lys 13.8 Met 3.8 Phe 2.5 Pro. It is 12.5 Ser 6.3 Thr 3.8 Tyr 1.3 Val 5.0. This does not differ significantly from the amino acid composition of the inhibitor from the parotid gland, or that calculated from the above sequence.

【００７７】（ｂ）インヒビターを、耳下腺からのイン
ヒビターにつき上に記した条件下に還元し、そしてカル
ボキシメチル化した。この蛋白質をついでマウス下顎プ
ロテアーゼで消化し、そして生成物をシンクロムＲＰ８
カラム上の逆相ＨＰＬＣにより分析した。消化パターン
は、ピークが耳下腺インヒビターの異った検体間でさえ
も溶出位置において異っている３１および３５％アセト
ニトリルの間で溶出するピークの形状を除いて、同時に
操作した耳下腺からの還元されたカルボキシメチル化イ
ンヒビターのそれと区別できないようにみえる。これは
多分、単一ペプチドの化学的変形から生じる。(B) The inhibitor was reduced and carboxymethylated under the conditions described above for the inhibitor from the parotid gland. This protein was then digested with mouse mandibular protease and the product was syncrom RP8.
It was analyzed by reverse phase HPLC on a column. The digestion pattern is similar to that of the parotid glands that were operated at the same time, except for the shape of the peak eluting between 31 and 35% acetonitrile, where the peaks differed in elution position even between samples with different parotid inhibitors It seems indistinguishable from that of the reduced carboxymethylation inhibitor of. This probably results from the chemical modification of a single peptide.

【００７８】（ｃ）本インヒビターを自動化エドマン分
解に付し、そして第１の１４アミノ酸について次のアミ
ノ酸配列を得た：(C) The inhibitor was subjected to automated Edman degradation and the following amino acid sequence was obtained for the first 14 amino acids:

【化１２】 そのＸ、ＹおよびＺは、同定するには低すぎる水準で回
収されるアミノ酸である。気管支粘液から単離されたイ
ンヒビターと耳下腺分泌から単離されたそれとの間の強
い類似製は、それら２つの蛋白質の間の相違についてど
のような証拠も不存在であることと一緒で、それらが同
一かほぼ同一であることを示す。[Chemical 12] The X, Y and Z are amino acids recovered at levels too low to be identified. The strong analogy between the inhibitor isolated from bronchial mucus and that isolated from the parotid secretion, along with the absence of any evidence for a difference between the two proteins, Indicates that they are identical or nearly identical.

【００７９】例５ それを白血球エラスターゼのインヒビターとして臨床使
用に適当なものとするインヒビターの特徴の同定 （ａ）例１の耳下腺インヒビターの溶液 pＨ８．０バッ
ファーおよび人間血清アルブミンの存在において白血球
エラスターゼの溶液に加え、そして残留遊離酵素を、メ
トキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
ｐ−ニトロアニリドを加水分解するその能力を検定する
ことにより決定した。データーは、１インヒビターが１
酵素を不活性化し、そして酵素−インヒビター複合体の
解離定数が５×１０^-10 Ｍである酵素−インヒビター相
互反応の標準モデルに適合する。EXAMPLE 5 Identification of Inhibitor Characteristics That Make It Suitable for Clinical Use as an Inhibitor of Leukocyte Elastase (a) Leukocyte elastase in the presence of a solution of the parotid gland inhibitor of Example 1 pH 8.0 buffer and human serum albumin. Solution of methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val.
It was determined by assaying its ability to hydrolyze p-nitroanilide. The data shows that 1 inhibitor is 1
The enzyme is inactivated and a standard model of enzyme-inhibitor interaction where the dissociation constant of the enzyme-inhibitor complex is 5 x 10 ^-10 M is fitted.

【００８０】同様の実験において、いくつかの他の人間
プロテアーゼを阻害する本インヒビターの能力を決定し
た。それらの解離定数を下記表に示す。In similar experiments, the ability of the present inhibitors to inhibit several other human proteases was determined. Their dissociation constants are shown in the table below.

【表１】 ２５℃および pＨ７．８における 例１のインヒビターとの複合体の セリンプロテアーゼ 解離定数 人間白血球エラスターゼ ５×１０^-10 Ｍ 人間カテプシンＧ １．５×１０^-8Ｍ 人間トリプシン １．５×１０^-9Ｍ 人間キモトリプシン １．５×１０^-10 Ｍ 人間膵臓エラスターゼ ２×１０^-8ＭTable 1 Serine protease dissociation constant of complex with the inhibitor of Example 1 at 25 ° C and pH 7.8 Human leukocyte elastase 5x10 ^-10 M human cathepsin G 1.5x10 ^-8 M human trypsin 1.5x 10 ^-9 M human chymotrypsin 1.5 × 10 ^-10 M human pancreatic elastase 2 × 10 ^-8 M

【００８１】（ｂ）０．２ＭトリスＨＣｌ、 pＨ７．８
中の耳下腺の溶液を栓つきチューブ中で７０℃に加熱
し、そして検体を各時間に検定のために採取した。結果
は、インヒビターが大略第１次カイネチックスで活性を
失い、そして約１０時間の半減期を有することを示し
た。この安定性の程度は、溶液中の蛋白質につき例外的
であり、そしてエラスターゼインヒビターとしての臨床
使用のための蛋白質の製剤において、顕著な利点を構成
する。(B) 0.2 M Tris HCl, pH 7.8
The solution of the parotid gland was heated to 70 ° C. in a stoppered tube and samples were taken for assay at each hour. The results showed that the inhibitor lost activity at roughly the first kinetics and had a half-life of approximately 10 hours. This degree of stability is exceptional for proteins in solution and constitutes a significant advantage in formulating proteins for clinical use as elastase inhibitors.

【００８２】（ｃ）７０％のギ酸中の本インヒビターの
溶液を３７℃で４０時間維持し、そして検定したとき、
そのもとの活性の少くとも８０％を維持することが認め
られた。 （ｄ）本インヒビターの溶液を、マウス下顎プロテアー
ゼ、クロストリパインおよびサーモリシンで処理した。
後者酵素のみが、３７℃において３時間で、阻害活性の
著しい損失を生じた。この酵素により分解に対する抵抗
性は、それが化膿性気管支粘液中に存在しうる型の他の
酵素に対するインヒビターの一般的抵抗性を支持するの
で、インビボにおける白血球エラスターゼインヒビター
としてのこの蛋白質の使用において著しい利点を構成す
る。(C) A solution of the present inhibitor in 70% formic acid was maintained at 37 ° C. for 40 hours and assayed,
It was found to maintain at least 80% of its original activity. (D) A solution of this inhibitor was treated with mouse mandibular protease, clostripain and thermolysin.
Only the latter enzyme produced a significant loss of inhibitory activity at 37 ° C. for 3 hours. Resistance to degradation by this enzyme is significant in the use of this protein as a leukocyte elastase inhibitor in vivo, as it supports the general resistance of the inhibitor to other types of enzymes that may be present in purulent bronchial mucus. Make up the benefits.

【００８３】（ｅ）すべての限定された小僧を失った他
の蛋白質との類似性により予測して、６Ｍグアニジウム
塩酸塩および３０ｍＭジチオスレイトール中の本インヒ
ビターの溶液は、酸化グルタチオンを使用したジチオス
レイトールの１０倍過剰において加え、そして溶液を２
５ｍＭトリスＨＣｌ、 pＨ９．０で１０倍希釈したと
き、その天然の阻害活性の少くとも９０％が回収され
た。この結果は、本蛋白質の活性構造がポリペプチド鎖
の安定な構造であることを示す。結果は更に、本蛋白質
が各種の苛酷な処理下に活性を保ち、そして活性を破壊
する若干の条件下においてさえも、それら条件が逆転さ
れたとき活性を回復する能力を保持しうることを意味す
る。(E) A solution of the present inhibitor in 6M guanidinium hydrochloride and 30 mM dithiothreitol, predicted by its similarity to other proteins that have lost all restricted kid, was treated with dithiolated glutathione. Add in 10-fold excess of threitol and add solution to 2
At least 90% of its natural inhibitory activity was recovered when diluted 10-fold with 5 mM Tris HCl, pH 9.0. This result indicates that the active structure of this protein is a stable structure of the polypeptide chain. The results further indicate that the protein remains active under a variety of harsh treatments and, even under some conditions that destroy activity, retains the ability to restore activity when those conditions are reversed. To do.

【００８４】この技術分野において熟練している者に
は、各種の変形および変化が本発明の方法および生成物
に対しなしうることは明らかであろう。従って、本発明
は、それらが添付された請求の範囲およびそれらの均等
内に入ると言う条件で、本発明の変形および変化を包含
する。It will be apparent to those skilled in the art that various modifications and variations can be made to the methods and products of this invention. Accordingly, this invention includes variations and modifications of the invention provided they come within the scope of the appended claims and their equivalents.

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 単一の非断片化ポリペプチド鎖を有し、
少なくとも１種のセリンプロテアーゼのプロテアーゼ活
性を阻害可能であり、次のアミノ酸配列を有する精製セ
リンプロテアーゼインヒビター。 【化１】 式中、Ｒ₁ はセリンまたはプロリンからなる群から選択
され；Ｒ₇ は、アラニンまたはプロリンからなる群から
選択され；Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₈ およびＲ₉ は、同一または
異なってメチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラ
ニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、
ロイシンまたはアルギニンからなる群から選択され；な
らびにＲ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ は、メチオニンまたはバリ
ンからなる群から選択される、但し、Ｒ₁ がセリンであ
り、Ｒ₂ がアルギニンであり、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ および
Ｒ₆ がメチオニンであり、Ｒ₇ がアラニンであり、そし
てＲ₈ およびＲ₉ がロイシンである場合を除く。1. Having a single, unfragmented polypeptide chain,
A purified serine protease inhibitor capable of inhibiting the protease activity of at least one serine protease and having the following amino acid sequence: [Chemical 1] Wherein R ₁ is selected from the group consisting of serine or proline; R ₇ is selected from the group consisting of alanine or proline; R ₂ , R ₃ , R ₈ and R ₉ are the same or different and are methionine or valine. , Alanine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, lysine, glycine,
Selected from the group consisting of leucine or arginine; and R ₄ , R ₅ and R ₆ are selected from the group consisting of methionine or valine, provided that R ₁ is serine, R ₂ is arginine and R ₃ , R ₄ , R ₅ and R ₆ are methionine, R ₇ is alanine and R ₈ and R ₉ are leucine. 【請求項２】 Ｒ₁ がセリンであり、およびＲ₇ がアラ
ニンである請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒ
ビター。2. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein R ₁ is serine and R ₇ is alanine. 【請求項３】 Ｒ₂ およびＲ₃ がメチオニンである請求
項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。3. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein R ₂ and R ₃ are methionine. 【請求項４】 Ｒ₂ およびＲ₃ がアルギニンである請求
項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。4. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein R ₂ and R ₃ are arginine. 【請求項５】 Ｒ₂ がアルギニンであり、およびＲ₃ が
メチオニンである請求項１に記載のセリンプロテアーゼ
インヒビター。5. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein R ₂ is arginine and R ₃ is methionine. 【請求項６】 Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ がメ
チオニンであり、ならびにＲ₈ およびＲ₉ がロイシンで
ある請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー。6. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ and R ₆ are methionine, and R ₈ and R ₉ are leucine. 【請求項７】 Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₈ ま
たはＲ₉ の１個以上がバリンであり、天然セリンプロテ
アーゼインヒビターに比して酸化的不活性化に対してよ
り抵抗性である請求項１に記載のセリンプロテアーゼイ
ンヒビター。7. A _{R 2, R 3, R 4} , R 5, 1 or more is valine R _6, R ₈ or R _9, with respect to oxidative inactivation than the native serine protease inhibitor The serine protease inhibitor of claim 1, which is more resistant. 【請求項８】 Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₈ ま
たはＲ₉ の１個以上がアラニンであり、天然セリンプロ
テアーゼインヒビターに比して膵臓エラスターゼの阻害
においてより活性である請求項１に記載のセリンプロテ
アーゼインヒビター。8. One or more of R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ or R ₉ is alanine, which is more active in inhibiting pancreatic elastase than natural serine protease inhibitors. The serine protease inhibitor according to claim 1. 【請求項９】 Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₈ ま
たはＲ₉ の１個以上がフェニルアラニン、チロシンおよ
びトリプトファンからなる群から選択され、天然セリン
プロテアーゼインヒビターに比してカテプシンＧの阻害
においてより活性である請求項１に記載のセリンプロテ
アーゼインヒビター。9. One or more of R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈ or R ₉ is selected from the group consisting of phenylalanine, tyrosine and tryptophan, relative to the natural serine protease inhibitor. The serine protease inhibitor of claim 1, which is more active in inhibiting cathepsin G. 【請求項１０】 Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ 、Ｒ₆ 、Ｒ₈
またはＲ₉ の１個以上がリジンまたはアルギニンからな
る群から選択され、天然セリンプロテアーゼインヒビタ
ーに比してトリプシンの阻害においてより活性である請
求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビター。10. R ₂ , R ₃ , R ₄ , R ₅ , R ₆ , R ₈
Alternatively, one or more R ₉ is selected from the group consisting of lysine or arginine and is more active in inhibiting trypsin as compared to native serine protease inhibitors. 【請求項１１】 Ｒ₂ がグリシンであり、白血球エラス
ターゼを阻害するがトリプシンを阻害しない請求項１に
記載のセリンプロテアーゼインヒビター。11. The serine protease inhibitor of claim 1, wherein R ₂ is glycine and inhibits leukocyte elastase but not trypsin. 【請求項１２】 Ｒ₃ 、Ｒ₈ およびＲ₉ の少なくとも１
つがグリシンであり、トリプシンを阻害するが白血球エ
ラスターゼを阻害しない請求項１に記載のセリンプロテ
アーゼインヒビター。12. At least one of R ₃ , R ₈ and R ₉ .
2. The serine protease inhibitor of claim 1, wherein one is glycine and inhibits trypsin but not leukocyte elastase. 【請求項１３】 Ｒ₁ およびＲ₇ の少なくとも１つがプ
ロリンであり、セリンプロテアーゼの少なくとも１種を
阻害する請求項１に記載のセリンプロテアーゼインヒビ
ター。13. The serine protease inhibitor according to claim 1, wherein at least one of R ₁ and R ₇ is proline and inhibits at least one serine protease. 【請求項１４】 単一の非断片化ポリペプチド鎖を有
し、少なくとも１種のセリンプロテアーゼのプロテアー
ゼ活性を阻害可能であり、次のアミノ酸配列： 【化２】 式中、Ｒ₁ はセリンまたはプロリンからなる群から選択
され；Ｒ₇ は、アラニンまたはプロリンからなる群から
選択され；Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₈ およびＲ₉ は、同一または
異なってメチオニン、バリン、アラニン、フェニルアラ
ニン、チロシン、トリプトファン、リジン、グリシン、
ロイシンまたはアルギニンからなる群から選択され；な
らびにＲ₄ 、Ｒ₅ およびＲ₆ は、メチオニンまたはバリ
ンからなる群から選択される、但し、Ｒ₁ がセリンであ
り、Ｒ₂ がアルギニンであり、Ｒ₃ 、Ｒ₄ 、Ｒ₅ および
Ｒ₆ がメチオニンであり、Ｒ₇ がアラニンであり、そし
てＲ₈ およびＲ₉ がロイシンである場合を除く；を有す
る精製セリンプロテアーゼインヒビターおよび医薬的に
許容される担体からなる医薬組成物。14. A single unfragmented polypeptide chain, capable of inhibiting the protease activity of at least one serine protease and having the following amino acid sequence: Wherein R ₁ is selected from the group consisting of serine or proline; R ₇ is selected from the group consisting of alanine or proline; R ₂ , R ₃ , R ₈ and R ₉ are the same or different and are methionine, valine , Alanine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, lysine, glycine,
Selected from the group consisting of leucine or arginine; and R ₄ , R ₅ and R ₆ are selected from the group consisting of methionine or valine, provided that R ₁ is serine, R ₂ is arginine and R ₃ , R ₄ , R ₅ and R ₆ are methionine, R ₇ is alanine, and R ₈ and R ₉ are leucine; and a pharmaceutically acceptable carrier A pharmaceutical composition comprising: 【請求項１５】 経口投与、非経口投与、局所投与およ
びエアロゾル投与からなる群から選択される経路による
投与に適した形態である請求項１４に記載の組成物。15. The composition according to claim 14, which is in a form suitable for administration by a route selected from the group consisting of oral administration, parenteral administration, topical administration and aerosol administration.