JPH06125787A - Production of l-threo-beta-hydroxyamino acid - Google Patents
Production of l-threo-beta-hydroxyamino acidInfo
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- JPH06125787A JPH06125787A JP28011792A JP28011792A JPH06125787A JP H06125787 A JPH06125787 A JP H06125787A JP 28011792 A JP28011792 A JP 28011792A JP 28011792 A JP28011792 A JP 28011792A JP H06125787 A JPH06125787 A JP H06125787A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、医薬や、医薬・農薬等
の中間体として有用なことが知られているＬ−スレオ−
β−ヒドロキシアミノ酸を製造する方法に関する。The present invention relates to L-threo-, which is known to be useful as an intermediate for medicines, medicines and agricultural chemicals.
It relates to a method for producing a β-hydroxy amino acid.
【０００２】[0002]
【従来の技術】従来、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミ
ノ酸の合成は、以下の方法により行われていた。即ち、
必要に応じて保護基を導入したアルデヒド誘導体とグリ
シンを強アルカリ存在下で縮合させることによりラセミ
−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体を
得た後、スレオ／エリスロ体の相互分離処理を行う。得
られたラセミ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸誘導体
の保護基を除去し、アミノ基部分に置換基を導入した
後、キニン、ブルシン等の光学分割剤を用いて光学分割
を行い、最後にアミノ基部分の置換基を除去するという
ものである。2. Description of the Related Art Conventionally, L-threo-β-hydroxyamino acid has been synthesized by the following method. That is,
If necessary, an aldehyde derivative having a protective group introduced and glycine are condensed in the presence of a strong alkali to obtain a racemic-threo / erythro-β-hydroxyamino acid derivative, and then a threo / erythro form is subjected to mutual separation treatment. After removing the protecting group of the obtained racemic-threo-β-hydroxyamino acid derivative and introducing a substituent into the amino group portion, optical resolution was performed using an optical resolving agent such as quinine and brucine, and finally the amino group. The partial substituent is removed.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする問題点】アルデヒド誘導体と
グリシンを縮合してβ−ヒドロキシアミノ酸を合成する
と、反応の立体選択性が低いために、スレオ／エリス
ロ，Ｄ／Ｌの組合せで４種類の異性体が不可避的に生成
する。Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の合成に当
たっては、これらの異性体を分離するための繁雑な工程
を必要とし、工業的製造法を開発する上で大きな問題と
なっていた。特に、従来のＤ／Ｌ体の光学分割法は、使
用する光学分割剤が高価であるだけでなく、工程及びそ
の制御が複雑で収率も低いという問題があった。さら
に、これらの操作で得られる不要の異性体を再度利用す
るためには、別途ラセミ化したり、分解したりする必要
があり、工程をさらに複雑にする原因となっていた。When β-hydroxyamino acid is synthesized by condensing an aldehyde derivative and glycine, the stereoselectivity of the reaction is low, and therefore threo / erythro and D / L are combined in four types of isomerism. The body inevitably produces. In the synthesis of L-threo-β-hydroxyamino acid, a complicated step for separating these isomers is required, which is a big problem in developing an industrial production method. In particular, the conventional D / L optical resolution method has a problem that not only the optical resolution agent used is expensive, but also the process and its control are complicated and the yield is low. Further, in order to reuse the unnecessary isomer obtained by these operations, it is necessary to separately racemize or decompose it, which causes the process to become more complicated.
【０００４】[0004]
【問題点を解決するための手段】これを解決する方法と
して、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−アロスレオニ
ンアルドラーゼを用いる酵素的分割法が知られている
（特開昭５８−１１６６９２号）。即ち、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼによって特異的にＤ−スレオ／エリスロ
体を分解し、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼによって
特異的にＬ−エリスロ体を分解し、Ｌ−スレオ体のみを
得る方法である。しかし、この方法は、β−ヒドロキシ
アミノ酸の中でも唯一Ｌ−スレオニンに適用できること
が知られているにすぎない。本発明者らは、Ｌ−スレオ
−β−ヒドロキシアミノ酸の合成方法に関し鋭意検討を
行った結果、意外にも、Ｄ−スレオニンアルドラーゼが
Ｄ−スレオニンとＤ−アロスレオニンのみでなく種々の
β−ヒドロキシアミノ酸のＤ−スレオ体とＤ−エリスロ
体に特異的に作用しグリシンと対応するアルデヒド化合
物に分解することを見出すとともに、Ｌ−アロスレオニ
ンアルドラーゼが意外にもＬ−アロスレオニンのみでな
く、種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−エリスロ体に
特異的に作用しグリシンと対応するアルデヒド化合物に
分解することを見出し、本発明を完成した。これによ
り、ラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸からの効率的なＬ
−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造が可能になる
のみならず、Ｄ−スレオ体、Ｄ−エリスロ及びＬ−エリ
スロ体の分解物は、原料として再度ラセミ体の合成に利
用することができる。さらに、遺伝子操作によってＤ−
スレオニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオニンアルド
ラーゼの生産性を大幅に向上せしめた組換え体を用いる
と、目的とするＬ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を
分解する酵素が菌体中に含まれる場合でも、それらの酵
素を除去することなく反応に用いることが出来る。ま
た、このような組換え体を用いると、Ｄ−体やＬ−エリ
スロ体の分解に多量の酵素を必要とするような反応性の
低いβ−ヒドロキシアミノ酸に対しても効率よく反応を
行うことが出来るため、広範囲のＬ−スレオ−β−ヒド
ロキシアミノ酸の合成が可能である。本発明は、一般式
（Ｉ）As a method for solving this problem, an enzymatic resolution method using D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase is known (Japanese Patent Laid-Open No. 58-116692). That is, it is a method of specifically degrading a D-threo / erythro form by a D-threonine aldolase and specifically decomposing an L-erythro form by an L-althreonine aldolase. However, this method is only known to be applicable to L-threonine among β-hydroxy amino acids. As a result of earnest studies on the method for synthesizing L-threo-β-hydroxyamino acid, the present inventors have surprisingly found that D-threonine aldolase is not limited to D-threonine and D-arosreonine, but also various β-hydroxy. It was found that the D-threo and D-erythro forms of amino acids specifically act and decompose into aldehydes corresponding to glycine, and unexpectedly, L-allose leonine aldolase is not limited to not only L-allose leonine but also various other compounds. The present invention has been completed by finding that it acts specifically on the L-erythro form of β-hydroxy amino acid and decomposes into aldehyde compounds corresponding to glycine. This allows efficient L from racemic-β-hydroxy amino acids.
Not only is it possible to produce -threo-β-hydroxyamino acid, but also the decomposed products of the D-threo body, D-erythro and L-erythro body can be reused as raw materials for the synthesis of racemic bodies. Furthermore, by genetic manipulation D-
By using a recombinant having greatly improved productivity of threonine aldolase and L-allothreonine aldolase, even if the enzyme that decomposes the target L-threo-β-hydroxyamino acid is contained in the cells, It can be used in the reaction without removing the enzyme. Further, when such a recombinant is used, it is possible to efficiently perform a reaction even on a low-reactivity β-hydroxyamino acid which requires a large amount of enzyme for degrading the D-form and the L-erythro form. Therefore, a wide range of L-threo-β-hydroxyamino acids can be synthesized. The present invention has the general formula (I)
【０００５】[0005]
【化２】 （式中、Ｒは、置換又は非置換の脂肪族基、脂環式基、
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｄ−スレオ／エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応する
アルデヒドに分解する酵素、同酵素を産生する微生物菌
体あるいは菌体処理物と、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに
分解する酵素、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−β
−ヒドロキシアミノ酸の製造法に関する。[Chemical 2] (In the formula, R represents a substituted or unsubstituted aliphatic group, alicyclic group,
Represents an aromatic group or a heterocyclic group. ) To a racemic β-hydroxy amino acid, D-threo / erythro-
An enzyme that specifically decomposes β-hydroxyamino acid into an aldehyde corresponding to glycine, a microbial cell or a treated product of the enzyme, and an aldehyde that specifically corresponds L-erythro-β-hydroxyamino acid to glycine L-threo-β, which is characterized in that an enzyme that decomposes into chlorophyll, a microbial cell producing the enzyme or a treated product of the microbial cell is allowed to act.
-A method for producing hydroxyamino acids.
【０００６】本発明で用いられる原料ラセミ−β−ヒド
ロキシアミノ酸は、上記式（Ｉ）におけるＲが、置換又
は非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基又は複素環式
基を表す。具体的には、アルキル基、アルケニル基、ア
ルキニル基、脂環式炭化水素基、芳香族炭化水素基又は
複素環式炭化水素基より選ばれた置換基である化合物で
あり、置換基に含まれる水素のうち１個又は複数個が同
一又は相異なるアルキル基、アルケニル基、アルキニル
基、アルコキシル基、アルキレン基、脂環式炭化水素
基、芳香族炭化水素基、ヒドロキシル基、ニトロ基、又
はハロゲン基で置換されていてもよい。置換基の炭素数
が、直鎖脂肪族基の場合は好ましくは２０以下、特に好
ましくは１０以下であり、その他の置換基の場合は好ま
しくは３０以下、特に好ましくは２０以下である化合物
を用いると良好な結果を得ることができる。In the raw material racemic-β-hydroxyamino acid used in the present invention, R in the above formula (I) represents a substituted or unsubstituted aliphatic group, alicyclic group, aromatic group or heterocyclic group. . Specifically, it is a compound which is a substituent selected from an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an alicyclic hydrocarbon group, an aromatic hydrocarbon group or a heterocyclic hydrocarbon group, and is included in the substituents. Alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, alkoxyl group, alkylene group, alicyclic hydrocarbon group, aromatic hydrocarbon group, hydroxyl group, nitro group, or halogen group in which one or more of hydrogen is the same or different May be replaced with. When the carbon number of the substituent is a linear aliphatic group, it is preferably 20 or less, particularly preferably 10 or less, and in the case of other substituents, preferably a compound having 30 or less, particularly preferably 20 or less is used. And good results can be obtained.
【０００７】本発明においては、Ｌ−スレオ−β−ヒド
ロキシアミノ酸以外の異性体、すなわち、Ｄ−スレオ／
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸並びにＬ−エリスロ
−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応す
るアルデヒドに分解することから、こうして得られたグ
リシンと対応するアルデヒドはそれを再度合成に使用で
きる。In the present invention, isomers other than L-threo-β-hydroxyamino acid, that is, D-threo /
Since the erythro-β-hydroxy amino acid as well as the L-erythro-β-hydroxy amino acid are specifically decomposed into glycine and the corresponding aldehyde, the glycine and the corresponding aldehyde thus obtained can be used again in the synthesis.
【０００８】本発明においては、前記したように、Ｄ−
スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する
酵素を用いることがあげられるが、このような酵素とし
ては、Ｄ−スレオ及びエリスロ−β−ヒドロキシアミノ
酸を特異的に分解するものであれば、いずれも使用でき
る。このような酵素として特に好ましいものとしては、
Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異
的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する能力を有
するものがあげられる。また特に好ましいものとして
は、Ｄ体とＬ体の立体構造の違いを特異的に認識する
が、スレオ体とエリスロ体の構造上の差異には影響を受
けないものがあげられる。さらにまた一般式（Ｉ）に示
すような広範囲のβ−ヒドロキシアミノ酸に作用するも
のがあげられる。In the present invention, as described above, D-
An enzyme that decomposes threo / erythro-β-hydroxyamino acid may be used. As such an enzyme, any enzyme that specifically decomposes D-threo and erythro-β-hydroxyamino acid may be used. Can be used. Particularly preferred as such an enzyme is
Those having the ability to specifically decompose D-threo / erythro-β-hydroxyamino acid into glycine and the corresponding aldehyde. Particularly preferred are those that specifically recognize the difference in the three-dimensional structure between the D-form and the L-form, but are not affected by the structural difference between the threo form and the erythro form. Furthermore, those acting on a wide range of β-hydroxy amino acids as shown in the general formula (I) can be mentioned.
【０００９】このような酵素として特に好ましいもの
は、Ｄ−スレオニンアルドラーゼがあげられる。Ｄ−ス
レオニンアルドラーゼとしては、特公昭６４−１１２７
９号に記載されたものの他、その遺伝子を操作して得ら
れたもの（例えば、特開平３−１３９２８３号）などを
あげることができる。これらＤ−スレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＤ型
の立体異性体に作用し、これをグリシンと対応するアル
デヒドに分解せしめるという優れた特性を有している。
また、Ｄ−型の立体配位には非常に高い特異性を有する
にも拘らず、エリスロ／スレオといった立体配位に対し
ては、許容されうる寛容性を有するので、Ｄ−スレオ体
とＤ−エリスロ体の両方に作用してこれを分解するとい
う優れた特性を有している。Particularly preferred as such an enzyme is D-threonine aldolase. As D-threonine aldolase, Japanese Patent Publication No. 64-1127
In addition to those described in No. 9, those obtained by manipulating the gene (for example, JP-A-3-139283) and the like can be mentioned. Unexpectedly, these D-threonine aldolases have excellent properties of acting on various D-type stereoisomers of β-hydroxyamino acids and decomposing them into glycine and the corresponding aldehyde.
In addition, although it has a very high specificity for the D-type conformation, it has an acceptable tolerance for the conformation such as erythro / threo. It has the excellent property of acting on both erythro bodies and degrading them.
【００１０】本発明で用いられるＤ−スレオニンアルド
ラーゼは、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ生産菌あるいは
その変異株などから得ることが出来る。Ｄ−スレオニン
アルドラーゼ生産菌としては、例えば、アルカリゲネス
・ハエカリス(Alcaligenes faecalis)ＩＦＯ１２６６
９、シュードモナス(Pseudomonas) ＤＫ−２（微工研菌
寄６２００号）、アリスロバクター(Arthrobacter)ＤＫ
−１９（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス・オ
リゼー(Xanthomonas oryzae)ＩＡＭ１６５７などが知ら
れている（特公昭６４−１１２７９号及び特開平１−２
７３５８６号）。これらのＤ−スレオニンアルドラーゼ
生産菌から得られたＤ−スレオニンアルドラーゼの合成
に関与する遺伝子を担うＤＮＡを、遺伝子組換えの手法
を用いて導入して作成された組換え体は、より好適に本
発明に用いることが出来る。このような遺伝子を導入し
て利用しうる微生物としては、例えばエシェリヒア(Esc
herichia) 属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、キサン
トモナス(Xanthomonas) 属細菌、アセトバクター(Aceto
bacter) 属細菌、シュードモナス(Pseudomonas) 属細
菌、グルコノバクター(Gluconobacter) 属細菌、アゾト
バクター(Azotobacter) 属細菌、リゾビウム(Rhizobiu
m) 属細菌、アルカリゲネス(Alcaligenes) 属細菌、ク
レブシェラ(Klebsiella)属細菌、サルモネラ(Salmonell
a)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌などの原核微生物
や酵母などの下等真核生物などを用いることができる。The D-threonine aldolase used in the present invention can be obtained from a D-threonine aldolase-producing bacterium or a mutant strain thereof. Examples of D-threonine aldolase-producing bacteria include Alcaligenes faecalis IFO1266.
9, Pseudomonas DK-2 (Microtechnology Research Institute No. 6200), Alice Lobacter (Arthrobacter) DK
-19 (Microtechnical Research Institute No. 6201), Xanthomonas oryzae IAM1657 and the like are known (Japanese Patent Publication No. 64-11279 and Japanese Patent Laid-Open No. 1-279).
73586). A recombinant prepared by introducing a DNA responsible for a gene involved in the synthesis of D-threonine aldolase obtained from these D-threonine aldolase-producing bacteria using a gene recombination method is more preferably the present invention. It can be used in the invention. Examples of microorganisms into which such a gene can be introduced and used include Escherichia (Esc
herichia bacteria, Bacillus bacteria, Xanthomonas bacteria, Acetobacter
bacter bacteria, Pseudomonas bacteria, Gluconobacter bacteria, Azotobacter bacteria, Rhizobiu
m) bacteria, Alcaligenes bacteria, Klebsiella bacteria, Salmonella
a) Prokaryotic microorganisms such as genus bacteria and Serratia bacteria, and lower eukaryotes such as yeast can be used.
【００１１】このような組換え体のうち、特にＤ−スレ
オニンアルドラーゼを高度に生産する能力を有している
組換え体の例としては、キサントモナス属細菌に属する
ものがあげられる。微工研菌寄１０９７９号として寄託
されているキサントモナス・シトリー(Xanthomonas cit
ri) ＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）は、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼを高度に生産する能力を有しており（特
開平３−１３９２８３号）、特に好適なものである。Among such recombinants, those belonging to the bacterium of the genus Xanthomonas are mentioned as an example of the recombinant having a particularly high ability to produce D-threonine aldolase. Xanthomonas cit
ri) IFO3311 (pDT648) has the ability to highly produce D-threonine aldolase (JP-A-3-139283), and is particularly preferable.
【００１２】本発明においては、前記したように、Ｌ−
エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素を用
いることがあげられるが、このような酵素としては、Ｌ
−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を特異的に分解す
るものであれば、いずれも使用できる。このような酵素
として特に好ましいものとしては、Ｌ−エリスロ−β−
ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアル
デヒドに分解する能力を有するものがあげられる。さら
にまた一般式（Ｉ）に示すような広範囲のβ−ヒドロキ
シアミノ酸に作用するものがあげられる。このような酵
素として特に好ましいものは、Ｌ−アロスレオニンアル
ドラーゼがあげられる。Ｌ−アロスレオニンアルドラー
ゼとしては、特公昭６３−５４３５９号に記載されたも
のの他、その遺伝子を操作して得られたものなどをあげ
ることができる。これらＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼは、予想外にも種々のβ−ヒドロキシアミノ酸のＬ−
エリスロ体に特異的に作用し、これをグリシンと対応す
るアルデヒドに分解せしめるという優れた特性を有して
いる。In the present invention, as described above, L-
An example of using an enzyme that decomposes erythro-β-hydroxyamino acid is L.
Any one can be used as long as it specifically decomposes erythro-β-hydroxyamino acid. Particularly preferred as such an enzyme is L-erythro-β-
Those having the ability to specifically decompose hydroxyamino acids into aldehydes corresponding to glycine are mentioned. Furthermore, those acting on a wide range of β-hydroxy amino acids as shown in the general formula (I) can be mentioned. Particularly preferred as such an enzyme is L-alothreonine aldolase. Examples of L-alothreonine aldolase include those described in JP-B-63-54359, and those obtained by manipulating the gene thereof. Unexpectedly, these L-alothreonine aldolases have various L-amino acids of various β-hydroxy amino acids.
It has an excellent property that it acts specifically on the erythro body and decomposes it into aldehyde corresponding to glycine.
【００１３】本発明で用いられるＬ−アロスレオニンア
ルドラーゼは、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌
あるいはその変異株などから得ることができる。Ｌ−ア
ロスレオニンアルドラーゼ生産菌としては、例えば、バ
チルスＤＫ−３９（微工研菌寄６２０２号）、アルカリ
ゲネス・ハエカリスＩＦＯ１２６６９、シュードモナス
ＤＫ−２（微工研菌寄６２００号）、アリスロバクター
ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）、キサントモナス
・オリゼーＩＡＭ１６５７が知られている。これらのＬ
−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌から得られたＬ−
アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝子を
担うＤＮＡを、遺伝子組換えの手法を用いて導入して作
成された組換え体は、より好適に本発明に用いることが
出来る。The L-alothreonine aldolase used in the present invention can be obtained from an L-alothreonine aldolase-producing bacterium or a mutant strain thereof. Examples of the L-alothreonine aldolase-producing bacterium include, for example, Bacillus DK-39 (Microtechnical Lab. No. 6202), Alcaligenes haecaris IFO12669, Pseudomonas DK-2 (Microtechnical Co., Ltd. 6200), Alysobacter DK-. 19 (Ministry of Industrial Science and Technology, No. 6201), Xanthomonas oryzae IAM1657 are known. These L
-L-obtained from allothreonine aldolase-producing bacterium-
A recombinant produced by introducing a DNA responsible for a gene involved in the synthesis of arosreonine aldolase using a gene recombination technique can be more preferably used in the present invention.
【００１４】この様な組換え体の作成は、特願平４−２
７５９９６号記載の方法で行うことが出来る。すなわ
ち、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ生産菌から染色体
ＤＮＡを抽出し、制限酵素でＤＮＡを部分分解し、精製
後、適当なベクターＤＮＡに組み込み、得られた組換え
体ＤＮＡを宿主細胞に移入し、遺伝子ライブラリーを作
成する。そこから、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの
合成に関与する遺伝子を保有する株を、培養細胞のＬ−
アロスレオニンアルドラーゼ活性を調べることにより選
択し、その細胞株から組換えＤＮＡを抽出し、適当な制
限酵素でベクターＤＮＡから目的のＤＮＡを切り出す。
得られたＤＮＡ断片の解析を行い、Ｌ−アロスレオニン
アルドラーゼの合成に不必要な部分を欠失させ、小型化
し、再度適当なベクターＤＮＡに組み込み、宿主細胞に
導入することにより、目的の株を得ることが出来る。Preparation of such a recombinant is described in Japanese Patent Application No. 4-2.
It can be carried out by the method described in No. 75996. That is, a chromosomal DNA is extracted from an L-alothreonine aldolase-producing bacterium, the DNA is partially decomposed with a restriction enzyme, purified, and then incorporated into an appropriate vector DNA, and the obtained recombinant DNA is transferred into a host cell to produce a gene. Create a library. From there, a strain carrying a gene involved in the synthesis of L-alothreonine aldolase was added to L-cultured cells.
Selection is performed by examining the arosreonine aldolase activity, recombinant DNA is extracted from the cell line, and the desired DNA is excised from the vector DNA with an appropriate restriction enzyme.
The obtained DNA fragment is analyzed, and a portion unnecessary for the synthesis of L-alothreonine aldolase is deleted, miniaturized, reintegrated into an appropriate vector DNA, and introduced into a host cell to obtain the target strain. You can get it.
【００１５】このような遺伝子を導入して利用しうる微
生物としては、前記Ｄ−スレオニンアルドラーゼのとこ
ろであげたものがあげられる。このような組換え体のう
ち、特にＬ−アロスレオニンアルドラーゼを高度に産生
する能力を有している組換え体の例としては、キサント
モナス属細菌に属するものがあげられる。キサントモナ
ス・オリゼーＩＡＭ１６５７の染色体ＤＮＡから単離し
たＬ−アロスレオニンアルドラーゼの合成に関与する遺
伝子を担うＤＮＡとプラスミドｐＢＲ３２８を連結した
組換えプラスミドｐＬＡ５５６を、キサントモナス・シ
トリーＩＦＯ３３１１に導入して得られた形質転換体キ
サントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬＡ５５
６）は、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを高度に生産
する能力を有しており、特に好適なものである（特願平
４−２７５９９６号）。Examples of microorganisms into which such a gene can be introduced and used include those listed above for D-threonine aldolase. Among such recombinants, those belonging to Xanthomonas bacteria can be mentioned as an example of a recombinant having a particularly high ability to produce L-alothreonine aldolase. Transformation obtained by introducing a recombinant plasmid pLA556 in which a DNA carrying a gene involved in the synthesis of L-alothreonine aldolase isolated from the chromosomal DNA of Xanthomonas oryzae IAM1657 and plasmid pBR328 was introduced into Xanthomonas citrie IFO3311. Body Xanthomonas citri IFO3311 (pLA55
6) has the ability to highly produce L-alothreonine aldolase, and is particularly suitable (Japanese Patent Application No. 4-275996).
【００１６】また、Ｄ−スレオニンアルドラーゼとＬ−
アロスレオニンアルドラーゼは、同一の菌株由来のもの
であっても、それぞれ異なる菌株由来のものであって
も、同様に用いることが出来るし、さらに前記したよう
に遺伝子操作を行って、一方のみを特異的に生産せしめ
るようにしたものから得られたものも使用できるが、そ
の両者を効率よく生産せしめるようにした組換え体を用
いれば、１種類の菌株で両酵素を効率よく生産出来る。Further, D-threonine aldolase and L-
Arosreonine aldolase can be used in the same manner whether it is derived from the same strain or different strains, and it is further engineered as described above to make only one specific. Although it is possible to use a product obtained from a product which is designed to be produced efficiently, a recombinant strain capable of producing both of them can be used to efficiently produce both enzymes with one strain.
【００１７】本発明に用いる微生物は常法に従って培養
することができる。培養に用いられる培地は微生物の生
育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培
地である。ここで用いられる炭素源としては、グルコー
ス、ガラクトース、可溶性デンプンなどがあげられ、窒
素源としては塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、ペプトン、肉エキス、イーストエキ
ス、コーンスティプリカー、大豆粉、綿実カスなどがあ
げられる。また、塩化ナトリウム、カリウム塩、カルシ
ウム塩、アンモニウム塩、燐酸塩などの他、亜鉛、マグ
ネシウム、鉄、マンガンなどの無機物も使用できる。更
に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加する
と望ましい結果が得られる場合が多い。培養は、好気的
条件下でｐＨ４から１０、温度２０から５０℃の任意の
範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。組換え
体を用いる場合、使用する菌株に応じて、アンピシリ
ン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加
してもよい。The microorganism used in the present invention can be cultured according to a conventional method. The medium used for culturing is an ordinary medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of microorganisms. Examples of the carbon source used here include glucose, galactose, and soluble starch, and as the nitrogen source, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, soybean powder, cottonseed residue. And so on. In addition to sodium chloride, potassium salt, calcium salt, ammonium salt, phosphate and the like, inorganic substances such as zinc, magnesium, iron and manganese can be used. In addition, the addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids often produces desirable results. The culture may be performed under aerobic conditions at a pH of 4 to 10 and a temperature of 20 to 50 ° C. in an arbitrary range for 1 to 10 days. When the recombinant is used, antibiotics such as ampicillin and chloramphenicol may be added to the culture medium depending on the strain used.
【００１８】酵素反応にあたっては、菌体の培養液、培
養液から分離した菌体、凍結乾燥などによる乾燥菌体、
菌体破砕液、粗酵素抽出液、精製酵素、さらには、上記
の処理物および固定化物、その他何れも使用できるが、
使用する酵素液あるいは菌体にＬ−スレオニンアルドラ
ーゼやＬ−スレオニンデアミナーゼのような目的とする
Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を分解するような
活性が含まれている場合には、効率的な合成を行うため
に、その活性を除去してから反応に用いるのが好まし
い。これらの分解活性を除去する方法としては、酵素液
の硫安分画・カラムクロマト分画などによる方法が好ま
しいが、それに限定されることなく、分解活性を選択的
に除去出来る方法であればいずれも用いることが出来
る。また、遺伝子操作によってＤ−スレオニンアルドラ
ーゼ及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼの生産性を大
幅に向上せしめた組換え体であれば、これらの分解活性
を除去することなく反応に用いることができる。In the enzymatic reaction, the culture solution of the bacterial cells, the bacterial cells separated from the culture solution, the dried bacterial cells by freeze-drying,
Bacterial cell lysate, crude enzyme extract, purified enzyme, further, treated products and immobilization products described above can be used,
When the enzyme solution or cells to be used contains an activity such as L-threonine aldolase or L-threonine deaminase which decomposes the desired L-threo-β-hydroxyamino acid, efficient synthesis In order to carry out, it is preferable to remove the activity before use in the reaction. As a method for removing these decomposition activities, a method using ammonium sulfate fractionation / column chromatography fractionation of an enzyme solution is preferable, but the method is not limited thereto, and any method capable of selectively removing the decomposition activity can be used. Can be used. In addition, a recombinant whose genetic productivity has significantly improved the productivity of D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase can be used in the reaction without removing their degrading activity.
【００１９】酵素反応を実施する方法は、水性媒体中に
て基質であるラセミ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を、上に記した微生物の培養液、菌体、菌体
処理物、酵素、あるいはこれらを通常の方法で固定化し
たものと接触させれば良い。かかる反応時の水性媒体と
しては、例えば、水、緩衝液、含水有機溶媒等が使用で
きる。反応における酵素、微生物菌体あるいは菌体処理
物等の濃度は、Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシ
アミノ酸とＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を完
全に分解できるならば特に制限はないが、Ｄ−スレオニ
ンアルドラーゼ活性（１ＵはＤ−スレオニンから１分間
に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必要な酵素量
を表わす）とＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性（Ｉ
ＵはＬ−アロスレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグ
リシンを生成するのに必要な酵素量を表わす）が、とも
に０．１Ｕ／ｍｌ以上であることが望ましい。特に、と
もに１Ｕ／ｍｌ以上であれば反応を速やかに終了させる
ことが出来る。反応は、２種類の酵素を同時に作用させ
ても順次作用させても行うことが可能であり、順次作用
させる場合、その順序は問わない。The method for carrying out the enzymatic reaction is as follows: racemic-threo / erythro-β-hydroxyamino acid, which is a substrate in an aqueous medium, is mixed with a culture solution of the above-mentioned microorganism, cells, treated cells, enzyme, Alternatively, these may be contacted with those immobilized by a usual method. As the aqueous medium at the time of the reaction, for example, water, a buffer solution, a water-containing organic solvent or the like can be used. The concentration of the enzyme, microbial cell or treated product of the microbial cell in the reaction is not particularly limited as long as D-threo / erythro-β-hydroxyamino acid and L-erythro-β-hydroxyamino acid can be completely decomposed. -Threonine aldolase activity (1 U represents the amount of enzyme required to produce 1 μmole of glycine per minute from D-threonine) and L-alothreonine aldolase activity (I
U represents the amount of enzyme required to produce 1 μmole of glycine per minute from L-alose leonine), and both are preferably 0.1 U / ml or more. In particular, if both are 1 U / ml or more, the reaction can be quickly terminated. The reaction can be carried out by simultaneously or sequentially acting two kinds of enzymes, and in the case of sequentially acting, the order does not matter.
【００２０】基質であるラセミ−スレオ／エリスロ−β
−ヒドロキシアミノ酸の濃度は、反応を著しく阻害しな
い程度であればよく１ｍＭから１００ｍＭが好ましく、
基質の供給は、一括、連続、分割の何れの手段でも実施
できる。反応温度は、１０から５５℃がよく、２０から
４０℃がより好適である。反応時のｐＨは５から１０、
好ましくは６から８である。ピリドキサール−５’−リ
ン酸を反応系に１０ｎＭ〜１０ｍＭ、好ましくは１μＭ
〜１００μＭの濃度で添加することにより好ましい結果
が得られる。また、Ｍｇ2+、Ｍｎ2+、Ｃｏ2+、Ｆｅ2+等
の２価金属イオンを塩の形で１００μＭ〜１００ｍＭ、
好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で添加すると好まし
い結果が得られる。反応形式はバッチ方式、連続方式の
何れでもよいが、かくして、反応は０．５から５０時間
程度で終了する。The substrate racemic threo / erythro-β
-The concentration of hydroxyamino acid may be 1 mM to 100 mM, as long as it does not significantly inhibit the reaction,
The substrate can be supplied by any means of batch, continuous and division. The reaction temperature is preferably 10 to 55 ° C, more preferably 20 to 40 ° C. The reaction pH is 5 to 10,
It is preferably 6 to 8. Pyridoxal-5'-phosphate was added to the reaction system at 10 nM to 10 mM, preferably 1 μM.
Preferred results are obtained by adding at a concentration of -100 μM. In addition, divalent metal ions such as Mg 2+ , Mn 2+ , Co 2+ , and Fe 2+ in the form of a salt of 100 μM to 100 mM,
A preferable result is obtained when it is preferably added at a concentration of 1 mM to 10 mM. The reaction system may be either a batch system or a continuous system, and thus the reaction is completed in about 0.5 to 50 hours.
【００２１】反応終了後、反応液は遠心分離や限外濾過
等により除菌・除タンパクし、まず有機溶媒抽出等によ
り生成アルデヒドを分離する。抽出には、アルデヒドの
溶解性が高く、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸及
びグリシンがほとんど不溶である溶媒であれば使用する
ことができるが、エーテルを使用すると良好な結果が得
られる。After the completion of the reaction, the reaction solution is sterilized and deproteinized by centrifugation or ultrafiltration, and the aldehyde produced is separated by organic solvent extraction or the like. For extraction, any solvent can be used as long as it has high solubility of aldehyde and almost insoluble of L-threo-β-hydroxyamino acid and glycine, but good results can be obtained by using ether.
【００２２】溶媒相からは減圧濃縮等によりアルデヒド
を回収することが出来る。水相からのＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアミノ酸とグリシンの単離回収は、通常のイ
オン交換樹脂を用いたクロマト分離によって行うことが
出来る。すなわち、水相を陽イオン交換樹脂を充填した
カラムに通液、水洗後、希アンモニア水等により溶出を
行う。The aldehyde can be recovered from the solvent phase by concentration under reduced pressure or the like. L-threo-β-from the aqueous phase
Isolation and recovery of hydroxyamino acid and glycine can be performed by chromatographic separation using a usual ion exchange resin. That is, the aqueous phase is passed through a column packed with a cation exchange resin, washed with water, and then eluted with diluted ammonia water or the like.
【００２３】純度が低い場合には、さらに晶析・水再結
晶を行うことにより精製度を高めることが出来る。上記
反応生成物の単離精製法は、一つの代表的な方法を例示
したものであり、本発明においてはそれに限定されるこ
となく各種の分離精製法が適用できる。このような方法
の例としては、メタノール、エタノール等のアルコール
系溶媒、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素系溶
媒、酢酸エチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチル
エチルケトン等のケトン溶媒、ジメチルスルホキシド等
のスルホキシド類溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
等のアミド溶媒、アセトニトリルなどのニトリル系溶
媒、エチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン
等のエーテル系溶媒、メチレンクロライド等のハロゲン
化炭化水素溶媒及びそれらの混合溶媒あるいはそれらの
水性溶媒などを用いた溶媒抽出などの分離法、カラムク
ロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、高速液体
クロマトグラフィー、再結晶化法などの方法をあげるこ
とができる。When the purity is low, the degree of purification can be increased by further performing crystallization and water recrystallization. The above-mentioned method for isolating and purifying the reaction product exemplifies one typical method, and various separation and purification methods can be applied to the present invention without being limited thereto. Examples of such a method include alcohol solvents such as methanol and ethanol, aromatic hydrocarbon solvents such as benzene and toluene, ester solvents such as ethyl acetate, ketone solvents such as acetone and methyl ethyl ketone, and dimethyl sulfoxide. Sulfoxide solvents, amide solvents such as N, N-dimethylformamide, nitrile solvents such as acetonitrile, ether solvents such as ethyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, halogenated hydrocarbon solvents such as methylene chloride and mixed solvents thereof. Separation methods such as solvent extraction using the above-mentioned aqueous solvent, column chromatography, reverse phase chromatography, high performance liquid chromatography, recrystallization method and the like can be mentioned.
【００２４】本発明の方法によると、 （１）Ｄ−スレオニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオ
ニンアルドラーゼは、それぞれ、広い範囲のＤ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸及びＬ−エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸に作用してこれを分解することができるので、様
々なラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸からのＬ−β−ヒ
ドロキシアミノ酸の合成が可能である。 （２）Ｄ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸
及びＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸は共に合成
原料であるグリシンとアルデヒドに分解されるため、そ
れらは反応液から回収して再度ラセミ−スレオ／エリス
ロ−β−ヒドロキシアミノ酸合成にリサイクル使用する
ことが出来る。 （３）従って、ラセミ化の必要はなく、目的物が高収率
で得られるので、工程が複雑で高価な光学分割剤を用い
る必要がある従来の光学分割法に比べ、大幅に工程を単
純化出来る。 （４）遺伝子組換えによりＤ−スレオニンアルドラーゼ
及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼの生産性が大幅に
向上した菌株を用いれば、目的とするＬ−スレオ−β−
ヒドロキシアミノ酸を分解する酵素が菌体中に含まれる
場合でもそれらの酵素を除去することなく反応に用いる
ことが出来、また、Ｄ−体及びＬ−エリスロ体の分解に
多量の酵素を必要とするような反応性の低いβ−ヒドロ
キシアミノ酸に対しても効率よく反応を行うことが出来
るため、Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸類の製造
に幅広く利用することができる。According to the method of the present invention, (1) D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase act on a wide range of D-β-hydroxy amino acid and L-erythro-β-hydroxy amino acid, respectively. Can be decomposed, which allows the synthesis of L-β-hydroxy amino acids from various racemic-β-hydroxy amino acids. (2) Since both D-threo / erythro-β-hydroxy amino acid and L-erythro-β-hydroxy amino acid are decomposed into glycine and aldehyde which are synthetic raw materials, they are recovered from the reaction solution and again racemic-threo / It can be recycled for erythro-β-hydroxy amino acid synthesis. (3) Therefore, since the target product can be obtained in high yield without the need for racemization, the process is much simpler than the conventional optical resolution method which requires complicated and expensive optical resolving agents. Can be converted. (4) Use of a strain in which the productivity of D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase is significantly improved by gene recombination can be used to obtain the target L-threo-β-
Even if the enzyme that decomposes hydroxyamino acid is contained in the bacterial cell, it can be used for the reaction without removing the enzyme, and a large amount of enzyme is required for the decomposition of D-form and L-erythro form. Since the β-hydroxyamino acid having such low reactivity can be efficiently reacted, it can be widely used for producing L-threo-β-hydroxyamino acids.
【００２５】[0025]
【実施例】次に、実施例により本発明の方法を更に詳し
く説明するが、本発明は実施例により限定されるもので
はない。例中％は重量％を示す。 実施例１ ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．５％、塩化ナト
リウム０．５％からなるｐＨ７．５の培地を調製し、５
リットルの培養槽にその３リットルを添加し、１２０℃
で１５分間加熱殺菌した。その培地にアリスロバクター
ＤＫ−１９（微工研菌寄６２０１号）を接種し、ｐＨ
７．５に保ちながら３０℃で２０時間通気及び撹拌をし
つつ培養した。培養終了後、培養液から菌体を遠心分離
で集菌、水洗後、０．０１ｍＭピリドキサ−ル−５’−
リン酸及び１．０ｍＭ塩化マグネシウムを含むｐＨ７．
５の０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ（N-2-Hydroxyethylpiperazi
ne-N-2-ethanesulfonic acid) 緩衝液５００ｍｌに懸濁
し、この菌体懸濁液を２０ｋＨｚ、３分間の超音波破砕
処理を４回行い、破砕液の懸濁物質を遠心分離で除去し
て粗酵素液を調製した。次に、この粗酵素液の分画を硫
酸アンモニウムを用いて行い、硫酸アンモニウム濃度２
５から６０％画分の析出物を分取し、上記緩衝液に溶解
し１００ｍｌの硫安分画酵素液を調製した。得られた硫
安分画酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性（１Ｕ
はＤ−スレオニンから１分間に１μｍｏｌｅのグリシン
を生成するのに必要な酵素量を表わす）及びＬ−アロス
レオニンアルドラーゼ活性（ＩＵはＬ−アロスレオニン
から１分間に１μｍｏｌｅのグリシンを生成するのに必
要な酵素量を表わす）を測定したところ、それぞれ、
０．３４Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍｌであった。得られ
た硫安分画酵素液１００ｍｌにＤ，Ｌ−スレオ／エリス
ロ−フェニルセリン（４種異性体の等量混合物）１００
ｍｇを加え、３０℃で１０時間反応させた。反応終了
後、反応液のフェニルセリン異性体及びグリシンを、ｏ
−フタルアルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンに
より誘導体化し、ＯＤＳカラムを用いてＨＰＬＣにより
定量した。また、ベンズアルデヒドは、２，４−ジニト
ロフェニルヒドラジンと反応させ、ＯＤＳカラムを用い
てＨＰＬＣにより定量した。EXAMPLES Next, the method of the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited to the examples. In the examples,% means% by weight. Example 1 A medium containing 0.5% of polypeptone, 0.5% of yeast extract and 0.5% of sodium chloride and having a pH of 7.5 was prepared.
Add 3 liters to a liter culture tank,
And heat sterilized for 15 minutes. The medium was inoculated with Alysobacter DK-19 (Microtechnical Laboratory, No. 6201), and the pH was adjusted.
The culture was carried out at 30 ° C. for 20 hours with aeration and stirring while maintaining the temperature at 7.5. After completion of the culturing, cells were collected from the culture solution by centrifugation, washed with water, and then 0.01 mM pyridoxal-5'-
PH 7. containing phosphoric acid and 1.0 mM magnesium chloride
5 0.2M HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazi
ne-N-2-ethanesulfonic acid) suspended in 500 ml of buffer solution, this suspension of cells is ultrasonically disrupted 4 times at 20 kHz for 3 minutes, and the suspended substances in the disrupted solution are removed by centrifugation. A crude enzyme solution was prepared. Next, fractionation of this crude enzyme solution was carried out using ammonium sulfate to obtain an ammonium sulfate concentration of 2
Precipitates of 5 to 60% fractions were collected and dissolved in the above buffer to prepare 100 ml of ammonium sulfate fractionated enzyme solution. D-threonine aldolase activity (1 U of the obtained ammonium sulfate fractionated enzyme solution)
Represents the amount of enzyme required to produce 1 μmole of glycine per minute from D-threonine) and L-alothreonine aldolase activity (IU is required to produce 1 μmole of glycine per minute from L-arothreonine). It represents the amount of enzyme
It was 0.34 U / ml and 0.29 U / ml. 100 ml of the obtained ammonium sulfate fractionated enzyme solution was mixed with 100 parts of D, L-threo / erythro-phenylserine (equal mixture of four isomers).
mg was added and reacted at 30 ° C. for 10 hours. After completion of the reaction, the phenylserine isomer and glycine in the reaction solution were
Derivatized with -phthalaldehyde and N-acetyl-L-cystine and quantified by HPLC using an ODS column. Further, benzaldehyde was reacted with 2,4-dinitrophenylhydrazine and quantified by HPLC using an ODS column.
【００２６】 Ｌ−スレオ−フェニルセリン ： １．３６ｍＭ（残存
率９７．８％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−スレオ−フェニルセリン ： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ４．００ｍＭ ベンズアルデヒド ： ３．８９ｍＭ 反応液に１Ｎ塩酸を１０ｍｌ加えた後、遠心分離で不溶
物を除去した。この遠心上清に２００ｍｌのエチルエー
テルを加え、撹拌・静置し、エーテル相を分離、減圧乾
固を行い、４０ｍｇのベンズアルデヒドを得た。水相
を、強酸性陽イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ ５０Ｗ×８を
充填したカラム（１０ｍｍφ×１００ｍｍ）に通液、脱
イオン水による十分な洗浄後、０．５Ｎのアンモニア水
で吸着物質を溶出させ、フェニルセリン画分とグリシン
画分に分けて採取した。両画分を減圧乾固したところ、
それぞれ２３ｍｇ、２９ｍｇの結晶を得た。フェニルセ
リン画分より得られた結晶の異性体分析（ｏ−フタルア
ルデヒドとＮ−アセチル−Ｌ−システィンによる誘導体
化後、ＯＤＳカラムでＨＰＬＣ分析）を行ったところ、
残存フェニルセリンは全てＬ−スレオ体であった。L-threo-phenylserine: 1.36 mM (residual rate 97.8%) L-erythro-phenylserine: 0 mM (residual rate 0%) D-threo-phenylserine: 0 mM (residual rate 0% ) D-erythro-phenylserine: 0 mM (residual rate 0%) Glycine: 4.00 mM Benzaldehyde: 3.89 mM After adding 10 ml of 1N hydrochloric acid to the reaction solution, the insoluble matter was removed by centrifugation. 200 ml of ethyl ether was added to this centrifuged supernatant, and the mixture was stirred and left standing, the ether phase was separated and dried under reduced pressure to give 40 mg of benzaldehyde. The aqueous phase was passed through a column (10 mmφ × 100 mm) packed with a strongly acidic cation exchange resin DOWEX 50W × 8, and after sufficient washing with deionized water, the adsorbed substance was eluted with 0.5N ammonia water, and phenyl was added. Serine and glycine fractions were collected separately. When both fractions were dried under reduced pressure,
23 mg and 29 mg of crystals were obtained, respectively. The crystals obtained from the phenylserine fraction were subjected to isomer analysis (after derivatization with o-phthalaldehyde and N-acetyl-L-cystine, HPLC analysis with an ODS column).
The remaining phenylserine was all L-threo body.
【００２７】実施例２ 実施例１と同様の方法で、シュードモナスＤＫ−２（微
工研菌寄６２００号）、アルカリゲネス・ハエカリスＩ
ＦＯ１２６６９及びキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１
６５７を培養し、その硫安分画酵素液を調製した。得ら
れた硫安分画酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性
及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定した結
果を表１に示す。Example 2 In the same manner as in Example 1, Pseudomonas DK-2 (Ministry of Engineering, Microbiology No. 6200), Alcaligenes flycaris I
FO12669 and Xanthomonas oryzae IAM1
657 was cultured to prepare the ammonium sulfate fractionated enzyme solution. Table 1 shows the results of measuring the D-threonine aldolase activity and the L-arothreonine aldolase activity of the obtained ammonium sulfate fractionated enzyme solution.
【００２８】[0028]
【表１】 [Table 1]
【００２９】得られた硫安分画酵素液を用い、実施例１
と同様に反応を行った。反応液の異性体分析により求め
た各異性体の残存率を表２に示す。Using the obtained ammonium sulfate fractionated enzyme solution, Example 1
The reaction was performed in the same manner as in. Table 2 shows the residual ratio of each isomer obtained by the isomer analysis of the reaction solution.
【００３０】[0030]
【表２】 [Table 2]
【００３１】実施例３ キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４
８）とキサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１（ｐＬ
Ａ５５６）を、培地にクロラムフェニコールを５０μｇ
／ｍｌの濃度で添加してそれぞれ培養し、得られた培養
液の６０分の１量を破砕・アセトン分画せずにそのまま
洗浄・凍結乾燥して両者を混合し１００ｍｌの懸濁液
（Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性０．２２Ｕ／ｍｌ，
Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼ活性０．２Ｕ／ｍｌ）
として反応に用いる以外は、全て実施例１と同様の方法
で行った。反応終了後、反応液中のフェニルセリン異性
体、グリシン、ベンズアルデヒドを前出の方法で定量
し、次の値を得た。 Ｌ−スレオ−フェニルセリン ： １．３４ｍＭ（残存
率９７．１％） Ｌ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−スレオ−フェニルセリン ： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） Ｄ−エリスロ−フェニルセリン： ０ ｍＭ（残存
率０ ％） グリシン ： ４．０３ｍＭ ベンズアルデヒド ： ３．９８ｍＭ 各成分を反応液より分画・精製したところ、ベンズアル
デヒド４１ｍｇ、フェニルセリンの結晶２２ｍｇ、グリ
シンの結晶３０ｍｇを得た。フェニルセリン画分より得
た結晶の異性体分析を行ったところ、残存フェニルセリ
ンは全てＬ−スレオ体であった。Example 3 Xanthomonas citrie IFO3311 (pDT64
8) and Xanthomonas citri IFO3311 (pL
A556) and 50 μg of chloramphenicol in the medium
1/60 of the resulting culture solution was crushed and washed directly without acetone fractionation, freeze-dried, and the two were mixed to prepare a 100 ml suspension (D -Threonine aldolase activity 0.22 U / ml,
L-alothreonine aldolase activity 0.2 U / ml)
Was carried out in the same manner as in Example 1 except that the above was used in the reaction. After completion of the reaction, the phenylserine isomer, glycine and benzaldehyde in the reaction solution were quantified by the above-mentioned method to obtain the following values. L-threo-phenylserine: 1.34 mM (residual rate 97.1%) L-erythro-phenylserine: 0 mM (residual rate 0%) D-threo-phenylserine: 0 mM (residual rate 0%) D- Erythro-phenylserine: 0 mM (residual rate 0%) Glycine: 4.03 mM Benzaldehyde: 3.98 mM When each component was fractionated and purified from the reaction solution, 41 mg of benzaldehyde, 22 mg of phenylserine crystals, and 30 mg of glycine crystals were obtained. Obtained. The isomer analysis of the crystals obtained from the phenylserine fraction revealed that all the residual phenylserine was the L-threo body.
【００３２】実施例４ 実施例１と同様の方法で、バチルスＤＫ−３９（微工研
菌寄６２０２号）を培養し、その硫安分画酵素液を調製
した。得られた硫安分画酵素液のＤ−スレオニンアルド
ラーゼ活性及びＬ−アロスレオニンアルドラーゼ活性を
測定したところ、それぞれ０Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍ
ｌであった。実施例３の方法で得たキサントモナス・シ
トリーＩＦＯ３３１１（ｐＤＴ６４８）の凍結乾燥菌体
をこの硫安分画酵素液に懸濁し、混合酵素液を得た。こ
の混合酵素液のＤ−スレオニンアルドラーゼ活性及びＬ
−アロスレオニンアルドラーゼ活性を測定したところ、
それぞれ０．２２Ｕ／ｍｌ、０．２９Ｕ／ｍｌであっ
た。得られた混合酵素液を用いて実施例１と同様に反応
を行った。反応液の異性体分析を行ったところ、Ｌ−ス
レオ体のみが残存しており、その残存率は９６．０％で
あった。Example 4 In the same manner as in Example 1, Bacillus DK-39 (Microtechnology Research Institute Co., Ltd. No. 6202) was cultured to prepare an ammonium sulfate fractionated enzyme solution. When the D-threonine aldolase activity and the L-althreonine aldolase activity of the obtained ammonium sulfate fractionation enzyme solution were measured, they were 0 U / ml and 0.29 U / m, respectively.
It was l. Freeze-dried bacterial cells of Xanthomonas citrie IFO3311 (pDT648) obtained by the method of Example 3 were suspended in this ammonium sulfate fractionated enzyme solution to obtain a mixed enzyme solution. D-threonine aldolase activity and L of this mixed enzyme solution
-When the arosreonine aldolase activity was measured,
They were 0.22 U / ml and 0.29 U / ml, respectively. A reaction was performed in the same manner as in Example 1 using the obtained mixed enzyme solution. When the reaction solution was subjected to isomer analysis, only the L-threo body remained, and the remaining rate was 96.0%.
【００３３】実施例５ 一般式（１）におけるＲがそれぞれ、エチル基、オクチ
ル基、アリル基、シクロヘキシル基、５−ヒドロキシ−
２−ニトロフェニル基及びイミダゾリル基であるβ−ヒ
ドロキシアミノ酸のＤ，Ｌ−スレオ／エリスロ体（４種
異性体の等量混合物）を基質に用い、実施例１と２で得
た硫安分画酵素液及び実施例３で得た菌体懸濁液を実施
例１と同様の方法で反応させ、反応液の異性体分析によ
り求めた各異性体の残存率をそれぞれ表３、表４及び表
５に示す。Example 5 R in the general formula (1) is an ethyl group, an octyl group, an allyl group, a cyclohexyl group, and 5-hydroxy-, respectively.
Ammonium sulfate fractionation enzymes obtained in Examples 1 and 2 using D, L-threo / erythro isomers (equivalent mixture of four isomers) of β-hydroxy amino acids having 2-nitrophenyl group and imidazolyl group as substrates The liquid and the bacterial cell suspension obtained in Example 3 were reacted in the same manner as in Example 1, and the residual ratio of each isomer determined by isomer analysis of the reaction solution is shown in Table 3, Table 4 and Table 5, respectively. Shown in.
【００３４】[0034]
【表３】 [Table 3]
【表４】 [Table 4]
【表５】 [Table 5]
【００３５】[0035]
【発明の効果】本発明によれば、光学分割のための置換
基の導入や除去が不要であり、高価な光学分割剤を用い
る必要もなく、生成するグリシンとアルデヒド誘導体を
原料合成にリサイクル使用することが可能で、繁雑なラ
セミ化を行う必要がないため、従来の方法に比べて極め
て有利な方法である。特に遺伝子組換えによりＤ−スレ
オニンアルドラーゼ及びＬ−アロスレオニンアルドラー
ゼの生産性が大幅に向上した菌体を用いることにより、
さらに広範囲のラセミ−β−ヒドロキシアミノ酸から、
Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアミノ酸を簡単かつ経済的
に製造することが出来る。According to the present invention, it is not necessary to introduce or remove a substituent for optical resolution, there is no need to use an expensive optical resolution agent, and the produced glycine and aldehyde derivative can be recycled for raw material synthesis. This is an extremely advantageous method as compared with the conventional method because it can be carried out and complicated racemization is not required. In particular, by using a bacterial cell in which the productivity of D-threonine aldolase and L-allothreonine aldolase is significantly improved by genetic recombination,
From a wider range of racemic-β-hydroxy amino acids,
L-threo-β-hydroxyamino acid can be produced easily and economically.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:64） ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Office reference number FI technical display location C12R 1:64)
Claims (7)
芳香族基又は複素環式基を表す。）で表わされるラセミ
−β−ヒドロキシアミノ酸に、Ｄ−スレオ／エリスロ−
β−ヒドロキシアミノ酸を特異的にグリシンと対応する
アルデヒドに分解する酵素、同酵素を産生する微生物菌
体あるいは菌体処理物と、Ｌ−エリスロ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに
分解する酵素、同酵素を産生する微生物菌体あるいは菌
体処理物を作用させることを特徴とするＬ−スレオ−β
−ヒドロキシアミノ酸の製造法。1. A compound represented by the general formula (I): (In the formula, R represents a substituted or unsubstituted aliphatic group, alicyclic group,
Represents an aromatic group or a heterocyclic group. ) To a racemic β-hydroxy amino acid, D-threo / erythro-
An enzyme that specifically decomposes β-hydroxyamino acid into an aldehyde corresponding to glycine, a microbial cell or a treated product of the enzyme, and an aldehyde that specifically corresponds L-erythro-β-hydroxyamino acid to glycine L-threo-β, which is characterized in that an enzyme that decomposes into chlorophyll, a microbial cell producing the enzyme or a treated product of the microbial cell is allowed to act.
-A method for producing hydroxyamino acids.
ミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解
する酵素がＤ−スレオニンアルドラーゼである請求項１
記載の方法。2. The enzyme which specifically decomposes D-threo / erythro-β-hydroxy amino acid into aldehyde corresponding to glycine is D-threonine aldolase.
The method described.
特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する酵素
が、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼである請求項１記
載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the enzyme that specifically decomposes L-erythro-β-hydroxyamino acid into an aldehyde corresponding to glycine is L-allothreonine aldolase.
ミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解
する酵素を産生する微生物が、アルカリゲネス属、シュ
ードモナス属、アリスロバクター属、キサントモナス属
に属する微生物よりなる群より選ばれた少なくとも１種
の微生物よりなる請求項１記載の方法。4. A microorganism that produces an enzyme that specifically decomposes D-threo / erythro-β-hydroxyamino acid into an aldehyde corresponding to glycine belongs to the genera Alcaligenes, Pseudomonas, Alislovobacter, and Xanthomonas. The method of claim 1, comprising at least one microorganism selected from the group consisting of:
特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する酵素
を産生する微生物が、アルカリゲネス属、シュードモナ
ス属、アリスロバクター属、キサントモナス属、バチル
ス属、エシェリヒア属に属する微生物よりなる群より選
ばれた少なくとも１種の微生物よりなる請求項１記載の
方法。5. A microorganism that produces an enzyme that specifically decomposes L-erythro-β-hydroxy amino acid into an aldehyde corresponding to glycine is a gene of Alcaligenes, Pseudomonas, Arythrobacter, Xanthomonas, Bacillus, Escherichia. The method according to claim 1, comprising at least one microorganism selected from the group consisting of microorganisms belonging to the genus.
微生物由来のＤ−スレオ／エリスロ−β−ヒドロキシア
ミノ酸を特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解
する能力を有する酵素が、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ
の合成に関与する遺伝子を担うＤＮＡとベクターＤＮＡ
とを結合せしめてなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形
質転換体から得られたものである請求項１記載の方法。6. An enzyme having the ability to specifically decompose D-threo / erythro-β-hydroxyamino acid derived from a microorganism transformed by genetic recombination into glycine and an aldehyde corresponding thereto is a D-threonine aldolase. DNA carrying genes involved in synthesis and vector DNA
The method according to claim 1, which is obtained from a transformant carrying a recombinant DNA obtained by ligating and.
微生物由来のＬ−エリスロ−β−ヒドロキシアミノ酸を
特異的にグリシンと対応するアルデヒドに分解する能力
を有する酵素が、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼの合
成に関与する遺伝子を担うＤＮＡとベクターＤＮＡとを
結合せしめてなる組換え体ＤＮＡを保有せしめた形質転
換体から得られたものである請求項１記載の方法。7. An enzyme having the ability to specifically decompose L-erythro-β-hydroxyamino acid derived from a microorganism transformed by genetic recombination into aldehyde corresponding to glycine, and synthesizing L-arothreonine aldolase. The method according to claim 1, which is obtained from a transformant carrying a recombinant DNA obtained by ligating a DNA carrying a gene involved in the vector with a vector DNA.
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|---|---|---|---|
| JP28011792A JP3240011B2 (en) | 1992-10-19 | 1992-10-19 | Method for producing L-threo-β-hydroxyamino acid |
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| JPH06125787A true JPH06125787A (en) | 1994-05-10 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3240011B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007190009A (en) * | 2005-08-26 | 2007-08-02 | Research Institute Of Innovative Technology For The Earth | Highly stereoselective l-threoninealdolase and gene encoding the same |
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- 1992-10-19 JP JP28011792A patent/JP3240011B2/en not_active Expired - Fee Related
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