JPH06125768A - 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 - Google Patents
酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法Info
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- JPH06125768A JPH06125768A JP8043592A JP8043592A JPH06125768A JP H06125768 A JPH06125768 A JP H06125768A JP 8043592 A JP8043592 A JP 8043592A JP 8043592 A JP8043592 A JP 8043592A JP H06125768 A JPH06125768 A JP H06125768A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は酵母による異種タンパク質の発現
及び生産量増大培養法の新規方法の開発を目的とするも
ので、選択培地の研究により、構成酵素のプロモーター
の支配下に異種遺伝子をつないだYEp型、YIp型お
よびYCp型のいずれのプラスミドを形質導入した株を
用いても、従来の培養法より生産性が少なく共2倍向上
を確認したことを背景とするものである。 【構成】 イーストナイトロゲンベース w/o アミノ
酸、グルコースを主剤とし、これに要求栄養素を添加し
た選択培地により酵母の形質転換株の生産量増大培養を
施す。
及び生産量増大培養法の新規方法の開発を目的とするも
ので、選択培地の研究により、構成酵素のプロモーター
の支配下に異種遺伝子をつないだYEp型、YIp型お
よびYCp型のいずれのプラスミドを形質導入した株を
用いても、従来の培養法より生産性が少なく共2倍向上
を確認したことを背景とするものである。 【構成】 イーストナイトロゲンベース w/o アミノ
酸、グルコースを主剤とし、これに要求栄養素を添加し
た選択培地により酵母の形質転換株の生産量増大培養を
施す。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明において、栄養培地とはY
PD培地である。本発明は酵母による異種タンパク質の
発現及び生産量増大培養法にかかり、請求項1〜5から
なり、請求項1は温度シフト培養法に関し、請求項2は
低温前培養法に関し、請求項3は請求項1、2の発明の
異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に関し、請求
項4は請求項1、2の発明の異種タンパク質を発現及び
生産するプロモーターの特定に関し、請求項5は請求項
1、2の発明の異種タンパク質を発現及び生産する酵母
ベクターの特定に関するもので、従来の培養法に比べ生
産量を数倍高くして酵素産業に貢献するものである。
PD培地である。本発明は酵母による異種タンパク質の
発現及び生産量増大培養法にかかり、請求項1〜5から
なり、請求項1は温度シフト培養法に関し、請求項2は
低温前培養法に関し、請求項3は請求項1、2の発明の
異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に関し、請求
項4は請求項1、2の発明の異種タンパク質を発現及び
生産するプロモーターの特定に関し、請求項5は請求項
1、2の発明の異種タンパク質を発現及び生産する酵母
ベクターの特定に関するもので、従来の培養法に比べ生
産量を数倍高くして酵素産業に貢献するものである。
【0002】
【従来の技術】従来、酵素産業において酵母等の形質転
換株の分泌生産性を向上させるため培地組成の検討等が
行なわれてきた。しかし従来法は培地のスクリーニング
に多大な時間を要し、生産性として僅か数%の向上がみ
られるのが限度であるから、より有効で簡単な培養法が
要求されている。
換株の分泌生産性を向上させるため培地組成の検討等が
行なわれてきた。しかし従来法は培地のスクリーニング
に多大な時間を要し、生産性として僅か数%の向上がみ
られるのが限度であるから、より有効で簡単な培養法が
要求されている。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記した
情況に鑑み、生産性が数倍向上する簡単な培養法を開発
することを解決する課題として研究した。この解決しよ
うとする課題は本発明の目的でもある。
情況に鑑み、生産性が数倍向上する簡単な培養法を開発
することを解決する課題として研究した。この解決しよ
うとする課題は本発明の目的でもある。
【0004】
【課題を解決するための手段】まず、本発明者らは構成
酵素のプロモーターをもつ酵母発現ベクター(YEp
型)に麹菌A.oryzaeのα−アミラーゼ(以後タカアミ
ラーゼAという)cDNAと、ヒトリゾチームcDNA
をそれぞれ別々につないだプラスミドを作製し酵母へ形
質転換した。この形質転換株を選択培地で前培養し、そ
の菌体ペレットを非選択培地に移植して低温で振とう培
養し、さらに適温で培養するすることにより、タカアミ
ラーゼA及びヒトリゾチームをともに長時間振とう培養
する従来の培養法よりも生産性が増大することを見出し
た。
酵素のプロモーターをもつ酵母発現ベクター(YEp
型)に麹菌A.oryzaeのα−アミラーゼ(以後タカアミ
ラーゼAという)cDNAと、ヒトリゾチームcDNA
をそれぞれ別々につないだプラスミドを作製し酵母へ形
質転換した。この形質転換株を選択培地で前培養し、そ
の菌体ペレットを非選択培地に移植して低温で振とう培
養し、さらに適温で培養するすることにより、タカアミ
ラーゼA及びヒトリゾチームをともに長時間振とう培養
する従来の培養法よりも生産性が増大することを見出し
た。
【0005】また、YIp型ベクターにタカアミラーゼ
cDNAを連結したプラスミド、あるいはYCp型ベク
ターにヒトリゾチームcDNAを連結したプラスミドを
酵母に導入し、得られた形質転換株を上述と同様の温度
シフト培養方法で異種タンパク質の分泌生産を行なった
ところ生産量は増大した。構成酵素のプロモーターの支
配下に異種遺伝子をつないだYEp型、YIp型および
YCp型、又は同効型のいずれのプラスミドを形質導入
した株を用いても、従来の培養法より生産性が少なくと
も2倍向上した。
cDNAを連結したプラスミド、あるいはYCp型ベク
ターにヒトリゾチームcDNAを連結したプラスミドを
酵母に導入し、得られた形質転換株を上述と同様の温度
シフト培養方法で異種タンパク質の分泌生産を行なった
ところ生産量は増大した。構成酵素のプロモーターの支
配下に異種遺伝子をつないだYEp型、YIp型および
YCp型、又は同効型のいずれのプラスミドを形質導入
した株を用いても、従来の培養法より生産性が少なくと
も2倍向上した。
【0006】本発明は前記の研究結果を背景とするもの
で、請求項1の発明は、前記各形質転換株を選択培地で
十分に生育するまで前培養し、その菌体ペレットを栄養
培地に移植して低温で培養した後、さらに酵母がよく生
育する温度で振とう培養を行なうことを特徴とする温度
シフト培養法に係り、請求項2の発明は前記各形質転換
株を前記の選択培地で低い温度により十分生育するまで
前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に移植し、
前記選択培地以上の温度で振とう培養することを特徴と
する低温前培養法に係り、請求項3の発明は請求項1、
2の発明の異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に
係り、請求項4の発は請求項1、2の発明の異種タンパ
ク質を発現及び生産するプロモーターの特定に係り、請
求項5の発明は請求項1、2の発明の異種タンパク質を
発現及び生産する酵母ベクターの特定に係るものであ
る。
で、請求項1の発明は、前記各形質転換株を選択培地で
十分に生育するまで前培養し、その菌体ペレットを栄養
培地に移植して低温で培養した後、さらに酵母がよく生
育する温度で振とう培養を行なうことを特徴とする温度
シフト培養法に係り、請求項2の発明は前記各形質転換
株を前記の選択培地で低い温度により十分生育するまで
前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に移植し、
前記選択培地以上の温度で振とう培養することを特徴と
する低温前培養法に係り、請求項3の発明は請求項1、
2の発明の異質タンパク質を高生産させる宿主の特定に
係り、請求項4の発は請求項1、2の発明の異種タンパ
ク質を発現及び生産するプロモーターの特定に係り、請
求項5の発明は請求項1、2の発明の異種タンパク質を
発現及び生産する酵母ベクターの特定に係るものであ
る。
【0007】本発明に用いた酵母発現ベクターは2μm
DNAをもつYEp型、染色体へ組込むYIp型及び酵
母セントロメアDNAをもつYCp型、または同効果型
の何れかのタイプである。また異種遺伝子を発現させる
ためのプロモーターは構成的に発現している酵素のアル
コールデヒドロゲナーゼ(ADH1)のプロモーターと
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G
AP)のプロモーターである。宿主として酵母サッカロ
マイセス セレビジィエを用いた。
DNAをもつYEp型、染色体へ組込むYIp型及び酵
母セントロメアDNAをもつYCp型、または同効果型
の何れかのタイプである。また異種遺伝子を発現させる
ためのプロモーターは構成的に発現している酵素のアル
コールデヒドロゲナーゼ(ADH1)のプロモーターと
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(G
AP)のプロモーターである。宿主として酵母サッカロ
マイセス セレビジィエを用いた。
【0008】
【作用】本発明は後記の実施例(1)〜(3)について個々
に説明しているように、請求項1、請求項2の発明によ
り、酵母による異質タンパク質の発現及び生産量増大培
養法に貢献し、請求項3〜5の発明は請求項1及び2の
発明の作用を強化する。
に説明しているように、請求項1、請求項2の発明によ
り、酵母による異質タンパク質の発現及び生産量増大培
養法に貢献し、請求項3〜5の発明は請求項1及び2の
発明の作用を強化する。
【0009】
【実施例】本実施例の選択培地は、プラスミドA〜C、
E〜Fを形質導入した株については、0.67%イーストナ
イトロゲンベース w/o アミノ酸、2%グルコースを
主剤とし、20mg/l ヒスチジン、20mg/l ウラシル、30
mg/l ロイシン、20mg/lアデニン、30mg/l リジンを添
加したものとする。また、プラスミドDを形質導入した
株については、ウラシルの代わりに20mg/l トリプトフ
ァンを添加した。異種タンパク質生産のためのプラスミ
ド作成: プラスミドA〜プラスミドFの作製方法を例示
する。なおこれ等の酵母への形質転換はItoらの方法
(J.Ba-cteriol.,153,163(1983))に準
じた。また生産したタカアミラーゼAについてはAda
chiらの方法(J.Ferme-nt.Technol.,32,43
(1954))でα−アミラーゼ活性をヒトリゾチーム
についてはSuzukiらの方法(Mol.Gen.Genet.,
219,58(1989))で、リゾチーム活性を測定
し、生産したタンパク質量を算出した。
E〜Fを形質導入した株については、0.67%イーストナ
イトロゲンベース w/o アミノ酸、2%グルコースを
主剤とし、20mg/l ヒスチジン、20mg/l ウラシル、30
mg/l ロイシン、20mg/lアデニン、30mg/l リジンを添
加したものとする。また、プラスミドDを形質導入した
株については、ウラシルの代わりに20mg/l トリプトフ
ァンを添加した。異種タンパク質生産のためのプラスミ
ド作成: プラスミドA〜プラスミドFの作製方法を例示
する。なおこれ等の酵母への形質転換はItoらの方法
(J.Ba-cteriol.,153,163(1983))に準
じた。また生産したタカアミラーゼAについてはAda
chiらの方法(J.Ferme-nt.Technol.,32,43
(1954))でα−アミラーゼ活性をヒトリゾチーム
についてはSuzukiらの方法(Mol.Gen.Genet.,
219,58(1989))で、リゾチーム活性を測定
し、生産したタンパク質量を算出した。
【0010】◎ プラスミドAの作成方法: 2μmDN
A、ADH1プロモーター、CYC1ターミネーターと
選択マーカーとしてTRP1をもつ酵母ベクターpYc
DE−1をEcoRIで消化した後、アルカリフォスファ
ターゼで脱リン酸を行なう。これにタカアミラーゼcD
NAを含む約1.8kbのEcoRI断片を前記プロモー
ターと方向性が一致するように連結し、酵母発現プラス
ミドpYTA−1を作製した。図1はプラスミドAの前
記した作製の模図である。
A、ADH1プロモーター、CYC1ターミネーターと
選択マーカーとしてTRP1をもつ酵母ベクターpYc
DE−1をEcoRIで消化した後、アルカリフォスファ
ターゼで脱リン酸を行なう。これにタカアミラーゼcD
NAを含む約1.8kbのEcoRI断片を前記プロモー
ターと方向性が一致するように連結し、酵母発現プラス
ミドpYTA−1を作製した。図1はプラスミドAの前
記した作製の模図である。
【0011】◎ プラスミドBの作製方法: プラスミ
ドAの作製方法と同様に酵母ベクターpYcDEー1の
EcoRIサイトに、ヒトリゾチームcDNA約0.5kb
のEcoRI断片を連結し、pYHA−1を作製した。
図2はプラスミドBの前記した作製の模図である。
ドAの作製方法と同様に酵母ベクターpYcDEー1の
EcoRIサイトに、ヒトリゾチームcDNA約0.5kb
のEcoRI断片を連結し、pYHA−1を作製した。
図2はプラスミドBの前記した作製の模図である。
【0012】◎ プラスミドCの作製方法: TRP1
遺伝子を持つpTRP11をBamHIで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにp
YTA−1よりBamHIで切り出した約3.4kbの断片
(ADH1プロモーターとタカアミラーゼcDNAを含
む)を連結し、酵母染色体組込み型プラスミドpTAT
−11を作製した。図3はプラスミドCの前記した作製
の模図である。
遺伝子を持つpTRP11をBamHIで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにp
YTA−1よりBamHIで切り出した約3.4kbの断片
(ADH1プロモーターとタカアミラーゼcDNAを含
む)を連結し、酵母染色体組込み型プラスミドpTAT
−11を作製した。図3はプラスミドCの前記した作製
の模図である。
【0013】◎ プラスミドDの作製方法: CEN
6、ADH1プロモーター、CYC1ターミネーターと
選択マーカーとしてURA3をもつ酵母セントロメアベ
クターpRS316−ACをEcoRIで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにヒ
トリゾチームcDNAを含む0.5kbのEcoRI断片を
前記プロモーターと方向性が一致するように連結し、酵
母セントロメアプラスミドpCHA−1を作製した。図
4はプラスミドDの前記した作製の模図である。
6、ADH1プロモーター、CYC1ターミネーターと
選択マーカーとしてURA3をもつ酵母セントロメアベ
クターpRS316−ACをEcoRIで消化した後、ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸を行なう。これにヒ
トリゾチームcDNAを含む0.5kbのEcoRI断片を
前記プロモーターと方向性が一致するように連結し、酵
母セントロメアプラスミドpCHA−1を作製した。図
4はプラスミドDの前記した作製の模図である。
【0014】◎ プラスミドEの作製方法: 2μmD
NA、GAPプロモーター、PGKターミネーターと選
択マーカーとしてTRP1をもつ酵母ベクターpG−3
をBamHIで消化した後、平滑末端処理を行なう。こ
れに平滑末端にしたタカアミラーゼcDNAを含む約
1.8kbの断片を前記プロモーターと方向性が一致する
ように連結して、酵母発現プラスミドpYGTAAを作
製した。図5はプラスミドEの前記した作製の模図であ
る。
NA、GAPプロモーター、PGKターミネーターと選
択マーカーとしてTRP1をもつ酵母ベクターpG−3
をBamHIで消化した後、平滑末端処理を行なう。こ
れに平滑末端にしたタカアミラーゼcDNAを含む約
1.8kbの断片を前記プロモーターと方向性が一致する
ように連結して、酵母発現プラスミドpYGTAAを作
製した。図5はプラスミドEの前記した作製の模図であ
る。
【0015】◎ プラスミドFの作製方法: プラスミ
ドEの作製法と同様に、酵母ベクターpG−3のBamH
Iを平滑末端化したものに、平滑末端にしたヒトリゾチ
ームcDNA約0.5kbの断片を連結し、pYGHLY
を作製した。図6はプラスミドFの前記した作製の模図
である。
ドEの作製法と同様に、酵母ベクターpG−3のBamH
Iを平滑末端化したものに、平滑末端にしたヒトリゾチ
ームcDNA約0.5kbの断片を連結し、pYGHLY
を作製した。図6はプラスミドFの前記した作製の模図
である。
【0016】◆ 異種タンパク質を生産させるための酵
母形質転換体の作製 タカアミラーゼA、ヒトリゾチームを分泌生産させる前
記のプラスミドA〜Fを前記Itoらの方法により形質
転換した。すなわち、酵母(YPH250)を10mlの
栄養培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グ
ルコース)中で30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠
心分離により集菌した。TE緩衝液で洗浄後同じ緩衝液
に2x107 セル/mlの濃度で懸濁した。この0.5ml
を小試験管に移し、等容量の0.2M酢酸リチウム溶液
を添加し、30〜60分間30℃で振とうした。この中
から0.1mlを1.5mlのエッペンドルフチューブに移
し、プラスミドDNA溶液5μl(2μg/μl)を加え
30℃、30分間静置培養した。次に、殺菌した70%
PEG−4000、150μlを加えよく混合した。3
0℃で60分間静置した後、エッペンドルフチューブを
47℃の恒温槽で10分間静置後、菌体を直ちに室温ま
で冷却し、殺菌水で洗浄し、選択培地で生育させた形質
転換体を得た。プラスミドCについては制限酵素Stu
Iで処理し、直鎖状にしたDNA溶液10μl(5μg/
μl)について上述の形質転換を行なった。
母形質転換体の作製 タカアミラーゼA、ヒトリゾチームを分泌生産させる前
記のプラスミドA〜Fを前記Itoらの方法により形質
転換した。すなわち、酵母(YPH250)を10mlの
栄養培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グ
ルコース)中で30℃で振とう培養し、対数増殖期に遠
心分離により集菌した。TE緩衝液で洗浄後同じ緩衝液
に2x107 セル/mlの濃度で懸濁した。この0.5ml
を小試験管に移し、等容量の0.2M酢酸リチウム溶液
を添加し、30〜60分間30℃で振とうした。この中
から0.1mlを1.5mlのエッペンドルフチューブに移
し、プラスミドDNA溶液5μl(2μg/μl)を加え
30℃、30分間静置培養した。次に、殺菌した70%
PEG−4000、150μlを加えよく混合した。3
0℃で60分間静置した後、エッペンドルフチューブを
47℃の恒温槽で10分間静置後、菌体を直ちに室温ま
で冷却し、殺菌水で洗浄し、選択培地で生育させた形質
転換体を得た。プラスミドCについては制限酵素Stu
Iで処理し、直鎖状にしたDNA溶液10μl(5μg/
μl)について上述の形質転換を行なった。
【0017】◆実施例(1) 酵母形質転換体による異種タンパク質の生産を増加させ
る培養法 プラスミドEおよびFを導入した形質転換株を選択培地
10mlで30℃24時間前培養した後集菌した。得られ
た菌体ペレットを栄養培地に移植し、10〜30℃で4
8時間さらに30℃40〜50時間、好ましくは48時
間振とう培養を行なった。培養液を遠心分離することに
より培養上清を得、それぞれについてα−アミラーゼ活
性、リゾチーム活性を測定し、タンパク質の生産量を調
べた。図7はタカアミラーゼ生産量及びヒトリゾチーム
生産量と低温培養時の温度℃の関係を示したグラフであ
る。
る培養法 プラスミドEおよびFを導入した形質転換株を選択培地
10mlで30℃24時間前培養した後集菌した。得られ
た菌体ペレットを栄養培地に移植し、10〜30℃で4
8時間さらに30℃40〜50時間、好ましくは48時
間振とう培養を行なった。培養液を遠心分離することに
より培養上清を得、それぞれについてα−アミラーゼ活
性、リゾチーム活性を測定し、タンパク質の生産量を調
べた。図7はタカアミラーゼ生産量及びヒトリゾチーム
生産量と低温培養時の温度℃の関係を示したグラフであ
る。
【0018】◆実施例(2) 温度シフト培養法及び低温前培養法を用いた異種タンパ
ク質の生産 プラスミドEおよびFを導入した形質転換株を選択培地
10ml、30℃で十分生育するまで前培養した後集菌
し、得られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、1
5℃で40〜50時間、好ましくは48時間培養し、さ
らに30℃で40〜50時間、好ましくは48時間振と
う培養を行なった。(温度シフト培養法:請求項1参照) 前記の形質転換株を選択培地10mlで15℃3日間ある
いは1日間十分生育するまで前培養した後集菌した。得
られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、30℃で
90〜100時間、好ましくは96時間振とう培養し
た。(低温前培養法:請求項2参照)
ク質の生産 プラスミドEおよびFを導入した形質転換株を選択培地
10ml、30℃で十分生育するまで前培養した後集菌
し、得られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、1
5℃で40〜50時間、好ましくは48時間培養し、さ
らに30℃で40〜50時間、好ましくは48時間振と
う培養を行なった。(温度シフト培養法:請求項1参照) 前記の形質転換株を選択培地10mlで15℃3日間ある
いは1日間十分生育するまで前培養した後集菌した。得
られた菌体ペレットを栄養培地に移植した後、30℃で
90〜100時間、好ましくは96時間振とう培養し
た。(低温前培養法:請求項2参照)
【0019】以上の二培養法のそれぞれの培養液を遠心
分離することにより培養上清を得、それぞれについてα
−アミラーゼ活性、リゾチーム活性を測定し、タンパク
質の生産量を調べた。ここで対照として、プラスミドA
およびB形質転換株を前培養後、30℃96時間培養し
た培養上清を用いた。表1は温度シフト培養法及び低温
前培養法を用いた異種タンパク質の生産を示したもので
ある。
分離することにより培養上清を得、それぞれについてα
−アミラーゼ活性、リゾチーム活性を測定し、タンパク
質の生産量を調べた。ここで対照として、プラスミドA
およびB形質転換株を前培養後、30℃96時間培養し
た培養上清を用いた。表1は温度シフト培養法及び低温
前培養法を用いた異種タンパク質の生産を示したもので
ある。
【表1】
【0020】◆実施例(3) 温度シフト培養法を用いた異種タンパク質の生産に対す
る酵母発現ベクターの影響 プラスミドA〜Fを導入した形質転換株を選択培地で前
記の温度シフト培養法に準じて得られた培養上清のα−
アミラーゼ活性とリゾチーム活性を測定し生産量を調べ
た。ここで対照としては、各形質転換株を30℃で前培
養後、30℃90〜100時間、好ましくは96時間培
養した培養上清を用いた。表2は温度シフト培養法を用
いた異種タンパク質の生産に対する酵母発現ベクターの
影響を示したものである。
る酵母発現ベクターの影響 プラスミドA〜Fを導入した形質転換株を選択培地で前
記の温度シフト培養法に準じて得られた培養上清のα−
アミラーゼ活性とリゾチーム活性を測定し生産量を調べ
た。ここで対照としては、各形質転換株を30℃で前培
養後、30℃90〜100時間、好ましくは96時間培
養した培養上清を用いた。表2は温度シフト培養法を用
いた異種タンパク質の生産に対する酵母発現ベクターの
影響を示したものである。
【表2】
【0021】
【発明の効果】本発明の請求項1〜5の発明は酵母によ
る異種タンパク質の発現及び生産量増大により寄与し、
もしくは寄与効果を向上するもので、従来方法による生
産量の少なくとも2倍の生産量を挙げることができる顕
著な効果をもつ。
る異種タンパク質の発現及び生産量増大により寄与し、
もしくは寄与効果を向上するもので、従来方法による生
産量の少なくとも2倍の生産量を挙げることができる顕
著な効果をもつ。
【図1】プラスミドA作製の模図
【図2】プラスミドB作製の模図
【図3】プラスミドC作製の模図
【図4】プラスミドD作製の模図
【図5】プラスミドE作製の模図
【図6】プラスミドF作製の模図
【図7】実施例(1)のタカアミラーゼ生産量およびヒト
リゾチーム生産量とを、低温培養時の温度℃の関係を示
したグラフ
リゾチーム生産量とを、低温培養時の温度℃の関係を示
したグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12N 15/62 // C12N 15/56 (C12N 1/16 C12R 1:865) (C12N 9/30 C12R 1:865) (C12N 9/36 C12R 1:865) (72)発明者 五味 勝也 東京都北区滝野川2−6−30 国税庁醸造 試験所内 (72)発明者 山本 綽 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内 (72)発明者 長島 直 愛知県安城市昭和町19番10号 新日本化学 工業株式会社内
Claims (5)
- 【請求項1】 形質転換株を、イーストナイトロゲンベ
ース w/o アミノ酸、グルコースを主剤とし、これに
要求栄養素を添加した選択培地(以下単に選択培地とい
う)で十分に生育するまで適温で前培養し、その菌体ペ
レットを栄養培地に移植して低温で培養した後、さらに
酵母がよく生育する温度で振とう培養を行なうことを特
徴とする温度シフト培養法。 - 【請求項2】 形質転換株を選択培地で十分生育するま
で低温で前培養した後、その菌体ペレットを栄養培地に
移植し、前記選択培地による前培養以上の温度で振とう
培養することを特徴とする低温前培養法。 - 【請求項3】 異種タンパク質を高生産させる宿主を微
生物中の酵母とすることを特徴とする請求項1の温度シ
フト培養法又は請求項2の低温前培養法。 - 【請求項4】 異種タンパク質を発現及び生産するプロ
モーターを、構成的に発現している酵素のプロモーター
とすることを特徴とする請求項1の温度シフト培養法又
は請求項2の低温前培養法。 - 【請求項5】 酵母により異種タンパク質を発現及び生
産するための酵母ベクターを2μmDNAをもつYEp
型又は染色体に組込むYIp型若しくは酵母セントロメ
アDNAをもつYCp型若しくは同効型の何れか1種と
することを特徴とする請求項1の温度シフト培養法又は
請求項2の低温前培養法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8043592A JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8043592A JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06125768A true JPH06125768A (ja) | 1994-05-10 |
JPH0783709B2 JPH0783709B2 (ja) | 1995-09-13 |
Family
ID=13718190
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8043592A Expired - Lifetime JPH0783709B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 酵母による異種タンパク質の発現及び生産量増大培養法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0783709B2 (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0737546A2 (en) * | 1995-04-10 | 1996-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Apparatus for holding substrate to be polished and apparatus and method for polishing substrate |
US6739958B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-05-25 | Applied Materials Inc. | Carrier head with a vibration reduction feature for a chemical mechanical polishing system |
JP2005538711A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
-
1992
- 1992-03-02 JP JP8043592A patent/JPH0783709B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0737546A2 (en) * | 1995-04-10 | 1996-10-16 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Apparatus for holding substrate to be polished and apparatus and method for polishing substrate |
EP0737546A3 (en) * | 1995-04-10 | 1997-01-29 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Holding device for a substrate and method and device for polishing a substrate |
US6739958B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-05-25 | Applied Materials Inc. | Carrier head with a vibration reduction feature for a chemical mechanical polishing system |
JP2005538711A (ja) * | 2002-09-13 | 2005-12-22 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
JP4927332B2 (ja) * | 2002-09-13 | 2012-05-09 | コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー | 酵母表面提示ベクターを利用して改良型酵素活性を有するリパーゼをスクリーニングする方法及びそのリパーゼ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0783709B2 (ja) | 1995-09-13 |
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