JPH0611237B2 - 微生物学的試験方法 - Google Patents

微生物学的試験方法

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JPH0611237B2
JPH0611237B2 JP58501310A JP50131083A JPH0611237B2 JP H0611237 B2 JPH0611237 B2 JP H0611237B2 JP 58501310 A JP58501310 A JP 58501310A JP 50131083 A JP50131083 A JP 50131083A JP H0611237 B2 JPH0611237 B2 JP H0611237B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は微生物学的試験方法に関する。この発明は微生
物発育測定試験と病原微生物の臨床分離株に対する抗生
物質の最小阻止濃度試験(MIC試験）に用いることができ
る。
（従来の技術） 患者やその他から臨床的に分離した微生物の抗菌物質に
対する感受性や、代謝発育条件を試験することは、臨床
検査室で長い間行われてきている。このような試験の目
的は微生物を固定すること、及び／又は臨床的な面から
微生物の抗菌剤に対する感受性を評価することである。
これらの試験を補助するための多くの方法や装置が開発
されている。この目的のために特に便利なのは一連の培
養ウエルを有するマイクロタイタープレートである。各
ウエルは段階的に量の異なる抗菌剤（たとえば抗生物
質）、及び／又は発育促進物質（たとえばビタミン）を
時に微生物培養の他の成分と共に、しばしば乾燥状態又
は他の安定化された状態で含有している。このようなマ
イクロタイタープレートとその使用例は米国特許第3,71
3,985号明細書(Astle)、フランス国特許第1,488,866号
明細書(Sclavo)、そして英国特許明細書第1574707号(Un
ilever)に記載されている。後者の明細書には特に安定
化した形のマイクロタイタープレートが記載されてい
る。
使用に際しては上記のプレートや他の適当な装置に、必
要な培養材料や接種菌を接種し、培養結果が現れるまで
培養する。この培養結果は多くの場合マイクロタイター
プレートのウエルの底に発育の「ボタン」として見ら
れ、ふつう少なくとも18時間培養する必要がある。（あ
る種の増殖速度の早い微生物では７時間ですでに「ボタ
ン」形成のみられるものがあるが、通常、この段階では
感受性試験結果を判定することは不可能である。） 従って、培養結果が検出できるまでの培養時間を減少さ
せることが好ましい。
この目的のためにいくつかの方法がすでに提案されてい
る。特殊な方法がたとえば米国特許第4,236,211号(Pfiz
er)に記載されている（限られた数の菌株について培養
約５時間後に微生物による光の散乱を測定、さらに米国
特許第3,832,532号及び英国特許第1,554,134号(Pfizer)
も参照）。これらの方法を用いるには複雑で高価な装置
及び／又は観察された光散乱に基づく膨大な計算が必要
である。
また、米国特許第4,242,447号(Bio Research)は、微生
物に汚染された試験液を酵素誘導培地に約15-30分間接
触させた後、この混合液にフルオレセインジ−ベータ−
ガラクトシドを反応させ蛍光測定して液体中の微生物含
量を求めるという、蛍光検出方法を記載している。
米国特許第3509026号明細書(Litton Systems Inc.)は、
微生物の抗生物質感受性を調べる培養方法を記載してい
るため、特に関係がある。この方法では、培地、抗生物
質、そして加水分解可能な基質としてフラボン-3-ジフ
ォスフェートを含有する不活性の紙を台紙の上に使用し
て、蛍光によって微生物の発育を調べている。この米国
特許第3509026号は、記載の系により抗生物質感受性が
迅速に評価可能であることを示唆しており、４時間の培
養の後に蛍光下に培養液を調べた結果を示す例を掲げて
いる。４時間培養の後に抗生物質感受性の若干の指標が
得られているが、例の中にも不明瞭と指示された結果が
いくつかあり、この方法により単純で信頼性のある系を
作ることは少なくとも困難と思われる。
さらに最近T.UrbanとC.Jarstrandは J.Antimicrobial Chemotherapy(1981)8,363-369に、市
販のSensititre試験プレートを使用した微生物の同定、
およびMIC測定法を記載している。ここでは４時間培養
の後ニトロブルー−テトラゾリウムとフェナジンメトサ
ルフェートとを加え、微生物の発育があったところにホ
ルマザンの青い色を得ている。
しかし、MIC測定又は同定の後は、さらに試験するため
に培養液を捨てない方が好ましい場合が多いが、NBTとP
MSは培養微生物に対し毒性を有している。
さらに、種々の起源（既知であり、市販されている、そ
して酵素学的方法に用いられている）の酵素のための、
いくつかの蛍光原性基質が先行技術において使用されて
いる。これらの例として、種々の蛍光原性4-メチル−ウ
ンベリフエリル誘導体(4-メチル−ウンベリフェロンに
加水分解可能）や7-アミド-4-メチルクマリンの誘導体
がある（たとえば英国特許第1,547,747号明細書および
ヨーロッパ特許第0,000,063号明細書（味の素）参
照。） （発明が解決しようとする課題） 本発明によれば、簡単な方法を用いて培養後わずか４時
間で又ある場合にはさらに短時間で、有用に広範囲の微
生物のいかなるものについても、しばしば信頼できる培
養結果の得られる改良した方法が提供される。この方法
では必要な場合には確認のための通常の培養を続けるこ
とができ、ふつうの培養状態が得られる。
本発明では、培地の中に蛍光原性基質を含有させて微生
物の培養試験（たとえばMIC測定）をスピードアップ
し、培養液の蛍光を調べて微生物の発育の有無を測定す
る。
（課題を解決するための手段） 本発明の態様の一つでは、試験する微生物（たとえば敗
血症の臨床分離株の同定してないもの）に関して、抗菌
性物質の最小阻止濃度(MIC)測定の改良された方法が提
供される。この方法は、(a)MICを測定すべき抗菌性物質
を連続的に量を変えて含有するシリーズ（シリーズのひ
とつとしてゼロの量をおそらく含有する）の個々の部分
に栄養培地を加え、この一連の個々の培養部分のおのお
のの中で微生物を培養すること、(b)数個の培養部分で
微生物の発育の程度を検出すること、及び(c)個々の検
出された発育の程度を示すデータよりMICを評価する。
この改良法では(d)個々の培養部分に接種菌として約５
×104個/mから106個／ｍの範囲の微生物濃度（又必
ずしも５×105ｍである必要はなく好ましくはこれと
同じか又はこれ以下の数）を用いること；(e)微生物を
適切な発育条件、たとえば好ましい実施態様としては５
時間以下好ましくは約４時間培養すること；(f)各培養
部分に少なくとも１つの蛍光原性基質を培養中および／
または培養後に接触させること； 接触とは通常培地に蛍光原性基質を溶解させることで、
大抵の場合同時に培養が始まる。
蛍光原性基質とは化合物であって、ある種の微生物酵素
の存在下で修飾（例えば加水分解）され、通常は成分部
分に開裂する。その反応の生成物は蛍光物質を含み、蛍
光物質は出発物質即ち蛍光原性基質とは異なる蛍光特性
を有する。この特性の相違により、この反応の生成物の
存在を検出できる。
このような蛍光原性基質で、例えば、酵素フォスファタ
ーゼ用の基質は、蛍光物質前駆体とフォスフェートとの
共役結合体であろう。またペプチダーゼあるいはアミダ
ーゼ用の基質はペプチドあるいはアミノ酸と蛍光物質前
駆体との共役結合体、等々、であろう。クマリン、フル
オレセイン、及びインドキシル化合物はよく知られた蛍
光物質であって、それらの誘導体又はフォスフェート、
ペプチド、エステル、可能性としてはグリコシド等との
共役結合体は、酵素基質として作用し酵素的に修飾され
て蛍光物質を与え、次いで検出される。
この反応は検出可能な程度に修飾するのに充分な期間起
こさせる。しばしば１以上の蛍光原性基質が混合物中に
含まれ、これらの蛍光原性基質は種々の酵素用の基質と
して作用し、広範囲の微生物の発育を検出できるような
ものである。このような混合物中では、各々の蛍光原性
基質から生成された蛍光物質が同じ化合物であること
が、検出が容易であるために好ましい。
つまり、接触時間は蛍光原性基質が酵素的に加水分解す
るに充分な期間である。例えば、培養期間の間及び／又
は蛍光原性基質が培養の後に添加される場合には培養後
に、約30分間である。
(g)非破壊的な機器による蛍光測定、すなわち蛍光光度
法により各培養部分の蛍光を評価することにより、培養
時間（たとえばある好ましい実施態様では約4-7時間以
下、たとえば約3.5-5時間、好ましくは約４時間）後のM
IC値の評価に関する情報を得ること、の組み合せより成
る。結果を評価する前に培養微生物が少なくとも３世代
時間培養されることが好ましい。特に下記の例において
は４時間をルーチン的に使用した。
下記の実施態様は、培養時間が４時間で結果が得られ、
もし必要な場合は従来の16時間培養又はそれ以外の時間
に達するまでの間培養液を保持したり培養を続けたりし
て別の方法（たとえば一晩培養後に肉眼で調べる）によ
って結果が確認できるという点で、従来のMIC測定法よ
りすぐれている。もちろんこのように結果が早く得られ
ることは、治療決定が早くなり患者の治療の役に立つ。
蛍光発色が無いことを確認するために、抗生物質のはい
ってないウエルという形で、この方法には容易に陽性コ
ントロールを組み入れることができる。一般的に本法は
他の検出方法に比較して試験全体に必要な時間について
改良されている。
有益な結果を得るためには当然(f)段階において使用さ
れる蛍光原性基質は、発育の有無を調べるべき微生物の
産生する酵素により加水分解されなければならない。
原則としてこの微生物には未同定の微生物すべてが含ま
れるため、当然この条件を満足することは困難であると
考えられる。
しかしながら、驚いたことに蛍光原性基質又はその混合
物が下記の15種類のスクリーニング試験用微生物のおの
おのについて有効な発育の指標を示すなら、本法の迅速
MIC法における使用に適し、普通の微生物学的方法で得
られた臨床分離菌の圧倒的多数のものに対して使用に適
することを本発明者らは見出した。これらの15種類のス
クリーニング試験微生物は、必ずしも圧倒的多数の場合
に現れるわけではないが、本発明の蛍光原性基質の有効
性をチェックするのに利用できる。これらの菌株は： バチルス スブチリス （Bacillus subtilis） スタフィロコッカス オーレウス （Staphylococcus aureus） スタフィロコッカス エピデルミディス （Staphylococcus epidermidis） ストレプトコッカス ピオゲネス （Streptococcus pyogenes） ストレプトコッカス フェカリス （Streptococcus faecalis） クレブシエラ エドワルドシー （Klebsiella edwardsii） クレブシエラ ニューモニア （Klebsiella pneumoniae） プロテウス ブルガリス （Proteus vulgaris） プロテウス ミラビリス （Proteus mirabilis） エシェリヒア コリ （Escherichia coli） シュードモナス エルギノーザ （Pseudomonas aeruginosa） シトロバクター フロインディー （Citrobacter freundii） セラチア マルスセンス （Serratia marcescens） サルモネラ アナータム （Salmonella anatum） これらの微生物はすべてふつうの微生物で、その野生株
は本発明に使用して蛍光原性基質を評価するのにきわめ
て適しているものであり、従って特別の分離培養菌を選
んだり特殊な培養菌株保存施設にあるものを選ぶ必要が
ないことを、誤解を避けるために強調しておく。本発明
者らは普通の菌種の６種類のおのおのについて６個の臨
床分離株を使用する実験において本発明の正しいことを
証明した。
従ってこの治験に従い、本発明の態様の一つは(f)工程
の原性基質として、前記した15種の微生物のおのおのを
培養することにより産生される酵素と反応し、加水分解
されて蛍光物質を生成する蛍光原性基質又はそれらの混
合物を用いる。
適当な蛍光原性基質の具体例としては4-メチル−クマリ
ンの加水分解可能な誘導体、たとえば(a)4-メチルウン
ベリフエリルオスフエートと4-メチルウンベリフエリル
脂肪酸エステル（たとえばヘキサノエート、オクタノエ
ート、又はノナノエート）、又は他の脂肪酸エステル
（たとえば炭素鎖の長さがC6-C16以内）との混合物、そ
して(b)4-メチルウンベリフエリルエステル（たとえば
好ましくはフォスフェート）と7-(N)-（アミノアシル又
はペプチジル）-7-アミド-4-メチルクマリン（たとえば
7-(N)-L-アラニル-7-アミド-4-メチルクマリン）又はこ
のアラニン誘導体のかわりに対応するロイシン誘導体と
の混合物がある。上記化合物の他の組み合せより成る混
合物でもよい。他のクマリンの対応する蛍光原性誘導体
も又使用可能である。
これらの蛍光原性基質は大多数の臨床分離菌のMIC測定
に適している。時におきる運が悪い場合でも培養の観察
において、均一な弱い蛍光が得られていることが肉眼で
判定できることが明らかで、したがってMIC値を間違え
ることはない。
具体的には、蛍光原性基質は培養液中で下記の濃度で都
合よく用いることができる。
4-メチルウンベリフエリルノナノエート： １２０マイクロモル； 4-メチルウンベリフエリルフォスフェート： １２０マイクロモル；そして 7-(N)-L-アラニル-7-アミド-4-メチルクマリン：１００
マイクロモル。
ふつう基質濃度はほとんどの場合30-300マイクロモルの
範囲である。
4-メチルウンベリフエリルノナノエートを用いる時はあ
る実施態様では、菌培養時間の最後又はその少し前 にエマルジョンの形（たとえばこのエステルと94％の水
を含有する６％v/vメチルセロソルブより成るもの）で
加え、蛍光収量とMICを求める前に約30分培養すること
が好ましい。もし必要な場合は培養時間中上記フォスフ
ェートとペプチドを加えておいてもよい。
本発明では又ここに示した蛍光原性基質と共に、微生物
の発育を促進及び／又は阻害する活性物質を含有させ
た、いくつかのマイクロタイターウエルを有するあらか
じめ調製したマイクロタイタープレートを用いてもよ
い。
このあらかじめ調製したマイクロタイタープレートでは
蛍光原性基質や他の成分の量や種類は、通常の栄養成分
や抗生物質の場合は通常の条件に従って選定され、蛍光
原性基質の場合は本明細書に示した方法に従って選定さ
れる。
たとえば約50-100マイクロリットル添加することを前提
とした（たとえば通常使用する場合は培養液を0.05ｍ
加える）約0.5ｍ容の普通の標準マイクロタイターウ
エル（これが本発明の使用に適している）の場合は、各
蛍光原性基質の量はウエル当たり６ナノモルのオーダー
が最も適している。
また、薄膜形成安定化剤（たとえばポリビニルアルコー
ル）を用いて蛍光原性基質（特にノナノエートのような
エステル）をエマルジョン（たとえばメトキシエタノー
ル中の）にしてから乾燥させて、たとえば英国特許第15
74707号明細書に記載されているような安定化薄膜を形
成させると便利である。
本発明の実施態様のひとつでは、微生物の接種と同時に
ウエルに蛍光原性基質を添加する。多くの通常の抗生物
質感受性試験用の臨床手順では、安定化し乾燥した抗生
物質の一定量ずつを含有する乾燥したマイクロタイター
プレートが使われる（たとえば本発明者らの英国特許明
細書第1574707号に記載）。この乾燥したウエルのおの
おのに微生物の浮遊液を含有する培地を一定量添加す
る。接種菌の培地浮遊液はバッチ（たとえば10ｍ）と
して調製することが可能であり、ウエルの中へ手で又は
自動接種器を用いて加えることができる。本発明の実施
態様のひとつでは、抗生物質感受性試験用の１セットの
マイクロタイターウエルに添加するための接種液は、本
明細書に記載た種類の蛍光原性基質の少なくとも１つ又
は２つ以上を、本明細書に記載した濃度で含有するよう
に調製される。たとえば抗生物質感受性試験をするため
の大腸菌(E.coli)の臨床分離株の一種を接種した10ｍ
の培地に、約１マイクロモルのAAMC(7-(N)-L-アラニル-
7-アミド-4-メチルクマリン）を加え、培地中のAAMC濃
度を約100マイクロモルとしている。未同定の臨床分離
株については、接種培地10ｍ当たり各基質を約１マイ
クロモル含有する2-成分又は3-成分蛍光原性基質グルー
プを用いると特に便利である。
もし必要な場合は接種菌を調製用の容器例えば10ｍ試
験管；キャップ又はフタ；試験管やその他の容器の上部
のネジの部分に、１種類又は２種類以上の蛍光原性基質
を、たとえば英国特許明細書第1574707号に記載した水
溶性の薄膜形成安定化剤（たとえば水溶性ポリビニルア
ルコール）の薄層で安定化し乾燥したものを調製してお
いてもよい。
接種菌に蛍光原性基質混合物を添加する別の方法は、接
種液調製用の接種試験管又はその他の容器の中に、あら
かじめ決められた適当な量とした蛍光原性基質の乾燥調
製物を固体の担体（たとえばビーズ、又は穴のあいてな
いシート、細片や紙片）に結合して挿入することであ
る。
従って抗生物質感受性試験用キットの好ましい実施態様
は、種々のウエルに公知の方法であらかじめ抗生物質を
加えてあるマイクロタイタートレイと、トレイのウエル
に接種するための接種液を調製する接種液調製容器とを
含んで成る。接種液調製容器は、菌の発育がある場合に
は培地による希釈、および試験管中の培養、および加水
分解後に蛍光が検出されるような量で、しかし菌の発育
がない場合は明らかに異なるか又はより弱い蛍光を発す
るような量で、ここに記載した１つ又は２つ以上の蛍光
原性基質を乾燥し安定化させた形で含有している。
（蛍光原性基質とはそれ自身は蛍光が無いか又は変蛍
光、すなわち対応する酵素により修飾された生成物とは
明らかに異なる方法（たとえば色又は強度）で現れる蛍
光を有するものである。蛍光装置使用者は、酵素による
修飾により現れる蛍光信号を共存する他の蛍光から区別
するために、公知の適当な励起及び検出波長を用い
る。） 一般的培養条件に適切な注意を払えば、この方法によれ
ば培養４時間後に大多数の臨床分離菌株が感度よく検出
でき、又電気光学的蛍光検出器（たとえばパルス−キセ
ノンＵＶ源のようなキセノンランプ源と光増幅蛍光検出
器の組み合せ）を用いた場合は特にすぐれている。50-1
00マイクロリットルで0-14マイクロモル濃度の範囲の蛍
光物質が検出できるような検出範囲が適当に選ばれる
が、この範囲で1.6マイクロモルか又はそれ以下の濃度
変化を検出することが好ましい。
（実施例） 以下に本発明の実施例を示す。
実施例１と２ 本例においては4-メチルウンベリフエリルフォスフェー
ト（MUP）（実施例１）と4-メチルウンベリフエリルノ
ナノエート（MUN）（実施例２）を培養した菌と接触さ
せ、蛍光測定による4-メチルウンベリフェロン（4-MU）
への変換の程度により菌の発育量の度合いを測定した。
マイクロタイターウエルに（実施例１）カゼイン加水分
解物（1.75%w/w）；Difco（商標）ブレインハートイン
フュージョン（0.45％）、CaCl2(0.017％）、MgCl2(0.0
25％）、及び（MUPの場合は）120マイクロモルのMUPを
含有する培地0.05ｍを添加した。実施例２ではあとの
工程でMUNを添加した。
接種菌を加えた場合と加えない場合、及び通常使用され
るいくつかの治療用抗生物質のおのおのを種々の濃度で
加えた場合と加えない場合につき、いろいろな組み合せ
を試験した。
試験接種液を作るために、蛍光原性基質を加えないこと
を除いては前記したものと同じ培地で、前記した15種の
試験菌を一晩培養した。これらの培養液を、105細胞/ｍ
（接種したウエル中の最終の細胞数）の濃度で各50マ
イクロリットル含有するマイクロタイターウエル用の試
験接種菌源として使用した。
プレートは37℃で４時間以上培養した。MUNプレートの
場合は、この培養後、MUNを添加したメトキシエタノー
ルと水とのエマルジョン（15ｍのメトキシエタノール
に15.82mgのMUNを溶解し、純水で乳化させて25ｍと
し、エマルジョン中の基質濃度が２mMとなるように作っ
た）18マイクロリットルをそれぞれ関係するウエルに加
えた。添加したウエルを37℃で30分間培養した。
使用した蛍光検出装置はパルス光キセノン電源と蛍光光
度計（この場合はキセノンランプシステム3021とパルス
光光度計装置3010，Chelsea Instruments 社，ロンド
ン）で、光ガイド長500mmと分枝光繊維束径４mmのSchot
t2-分枝光繊維UV光ガイド（Schott Glass社）で操作さ
れる。励起波長は363nm、蛍光（検出）波長は450nmを使
用した。この波長の組合せがこれらの基質に対し4-MU生
成物からの吸光度と競合するMUPとMUNからの吸光度との
双方を満足させる最適の波長であった。
もう一つの光学装置はパーキンエルマー（Perkin-Elme
r)1000蛍光装置で、励起波長363nm、蛍光波長450nm、狭
いスリット幅、エネルギー レベル400、スケール伸度
１、光長0.5cmそして温度は37℃である。
パルス光キセノン装置は培養液をウエルに入れたまま測
定ができるという利点があった。
培養後検出された蛍光濃度がバックグラウンド濃度の２
倍より小さくなったウエルの抗生物質の最小濃度を、抗
生物質試験のMIC値とした。
前記の試験では指示した量のMUPを用いると培養４時間
後に黄色ブドウ球菌(S.aureus)，Strep.ピオゲネス(Str
ep.pyogenes)，Kl.エドワルドシィー(Kl.edwardsii)，
肺炎桿菌(Kl.pneumoniae)，Pr.ミラビリス(Pr.mirabili
s)，大腸菌(E.coli)，Citr.フロインディー(Citr.freun
dii)，レイ菌(Serr.marcescens)，そしてSalm.アナータ
ム(Salm.anatum)について発育と抗生物質の阻害がみら
れた。
MUNのみを使用した場合は枯草菌(B.subtilis)，黄色ブ
ドウ球菌(S.aureus)，表皮ブドウ球菌(Staph.epidermid
is),Strep.ピオゲネス(Strep.pyogenes)，肺炎桿菌(Kl.
pneumoniae)，緑膿菌(Ps.aeruginesa)，レイ菌(Serr.ma
rcescens)，そしてSalm.アナータ(Salm.anatum)につい
て発育と抗生物質の阻害がみられた。
追加例(1+2)として実施例１のMUP含有培地を基礎とした
培養ウエルを実施例２のようにMUNで処理することによ
りMUNとMUPを一緒に用いた試験を行った。この組み合せ
を用いると前記の15種のすべての試験菌で発育と抗生物
質の阻害がみられた。
実施例３ 実施例１の方法と同様にして7-(N)-L-アラニル-7-アミ
ド-4-メチルクマリン(AAMC)を蛍光原性基質として用い
ると、４時間の培養後前記15種のすべての試験微生物に
ついて発育と抗生物質の阻害がみられた。たとえばある
場合には枯草菌(B.subtilis)と黄色ブドウ球菌(S.aureu
s)についてもう少し強い結果を得るのにAAMCが有効であ
り、またある場合にはAAMCをMUNと組み合せて使用する
ことが有効であった。
実施例４ 本例では接種菌の培地の浮遊液に蛍光原性基質を適用す
ることより成る、菌のMIC測定を改良するのに蛍光原性
基質を用いる好ましい方法を示す。本例に使用した器具
はMIC測定用の標準調製プレート（英国のSeward Labora
tory，米国のGibco Diagnosticsの“Sensititre”（商
標））であり、0.05mの培養浮遊液を加えるためのマ
イクロタイターウエルが12×８個ある。
プラスチック製ネジ口のついた、実施例１に記載の栄養
培地を滅菌したものを10ｍ含有する、標準形の10ｍ
容の滅菌済接種試験管を用いて菌の培地浮遊液を調製し
た。BaSO4のMacFarlan標準浮遊液及び／又は微生物学技
師の熟練した肉眼の判断を用い、10-40倍濃縮液（たと
えば107/ｍ）との濁度の光学的比較により、菌浮遊液
の最終濃度を2.5×105個／ｍにした。接種菌を分散さ
せる前に培地を接種試験管中で37℃にあらかじめ加熱
し、できるだけ熱によるショックを避けるようにした。
蛍光原性基質4-メチルウンベリフエリルフォスフェート
(MUP)、4-メチルウンベリフエリルノナノエート(MUN)、
そして7-(N)-L-アラニル-7-アミド-4-メチルクマリン(A
AMC)は以下のようにして微生物の培地溶液に導入した。
添付の図面の第１図と第２図に示したような滅菌培地用
試験管用の２つ目のスクリューキャップに、調製した基
質をあらかじめ加えておき使用するまで乾燥して水分を
透過させないように包装して保存した。
下記の組成の基質調製物は以下に述べる順序で調製し
た。
(a)307.3mgのMUPを５ｍの0.5％ポリビニルアルコール
水溶液（水溶性、Sigma Chemical社のSigmaタイプp-813
6)に溶解し、次にここに (b)10ｍの2-メトキシエタノールに溶解した246.2mgの
AAMCを加え、最後にここに (c)10ｍの2-メトキシエタノールに溶解した380.0mgの
MUNを加えた。
混合液は、蛍光原性基質をあらかじめ添加したスクリュ
ーキャップを1000個作るのに充分な量であった。第１図
と第２図に模式的に示すように接種用標準試験管キャッ
プ１を使用し、これを非透過性の包装剤２で密封した。
これを使用する時に包装剤２よりはずし、菌の培地浮遊
液４を含む接種用標準(10ｍ）試験管３にキャップを
した。この試験管キャップ１は水及び溶媒に非透過性の
密封パッキング５を含むプラスチックキャップ本体より
成る。（必要な場合は）各パッキングの中央に小さなく
ぼみを作り、ここに調製した基質を一滴(0.025ｍｇ）
添加した。添加及び乾燥の方法と条件は 「Sensititre」製品の調製法で常識になっているもので
あり、詳細は英国特許明細書第1574707号、第1520745号
及び第1508747号に記載されている。こうして各キャッ
プの中に基質混合物を含有する乾燥部分６（第１図、第
２図参照）が得られる。次に各キャップに1.2マイクロ
モルのMUP、１マイクロモルのMUNそして1.2マイクロモ
ルのAAMCを加える。標準接種用試験管中で暖かい（37
℃）菌浮遊培養液を調製した場合は、そのあとでその試
験管のふつうのスクリューキャップ（図面には記してな
い）を第２図に示したように前記の調製済スクリューキ
ャップ１のひとつと交換し、約30秒攪拌しキャップパッ
ミング上の蛍光原性基質を溶解及び／又は分散させた。
こうして蛍光原性基質を満たした調製済培地浮遊液を通
常の方法で「Sensititre」プレートに添加し、培養時間
が通常の18-20時間のかわりに４時間である以外は通常
の方法で培養した。
0-3マイクロモルと14マイクロモル濃度までの範囲で遊
離の蛍光物質（7-アミド-4-メチルクマリンに換算）を
含有する試料50マイクロリットルより使用可能な読み出
し値を得るために、充分な感度が得られるよう過少及び
過不過の運転について調整した蛍光検出器を用いて、培
養４時間後に各ウエルの蛍光を読んだ。３マイクロモル
の7-アミド-4-メチルクマリンの濃度は、本発明に従っ
て調製した接種菌液を４時間培養後にふつうに見られる
蛍光の大きさに対応する。
本法の重要な利点は、（必要があればいつでも）蛍光プ
レートを通常の方法で一晩培養し従来の培養結果を得る
ことができることである。このために臨床関係の使用者
は４時間培養後に得られる結果の正しさに関し安心でき
る。
この系を利用したり応用したりする場合の方法上の重要
なポイントは、微生物の発育の有無を判定する基準、標
準「Sensititre」法で得られた結果と互いに相関がよい
ことが証明されている他の（マニュアル）最小阻止濃度
試験で得られた結果との相関を判定する基準である。
(D.S.Reeves et al.,Antimicrobial Agents and Chemot
herapy,December,1980,18(6),pp844-852を参照） 本例では陰性対照として、微生物を加えない以外は全操
作を行った対照ウエルの蛍光収量をとった。（かわりの
方法又は追加の方法としてウエルに加えた微生物が発育
ししないような高濃度の抗生物質を含むウエルの蛍光収
量をとってもよい。） 発育が明らかに認められるシリーズの最初のウエルの前
の（単一の抗生物質濃度が順に減少していくシリーズ
の）最後のウエルの抗生物質濃度に基づいて単一MICを
決める。
本例において「明らかに発育」とは４時間の培養後に陰
性コントロールに比較して蛍光収量が増加している場合
を示す。ただし ()ウエルの蛍光収量が陰性コントロールと陰性コント
ロールウエルと問題の菌の最高収量（抗生物質ゼロ）の
範囲の1/3との合計より大きくない場合，そして ()そのウエルの蛍光収量が、そのウエルとその列又
はセット、すなわち単一の抗生物質希釈シリーズで試験
したウエルの平均との差の1.6マイクロモル(4-メチルウ
ンベリフェロンの濃度として）の蛍光の差以上できない
とき；そして ()そのウエルの蛍光収量が陰性コントロールよ
り、試験したウエルの平均の標準偏差の1.96倍以上大き
くないとき は「明らかな発育」とみなさい。
ある一列あるいはカラムのウエルを評価するに際して
は、ある抗生物質の希釈シリーズについて最初のウエル
の蛍光収量をまずバックグランド強度と考え、それ以降
は調べたウエルで明らかな発育を示さないものの強度の
平均をバックグランドの蛍光強度とする。２番目のウエ
ルを計算するときは標準偏差を2.5％と考え、その次か
らは列の中で調べたウエルのうち発育のみられないもの
の強度から計算する。
この計算方法は本発明者らが考えたものであり現存のMI
C法とは最もよい相関を示すデータを与えることは特筆
すべきである。また誘導耐性現象（下記）があると考え
ると本発明の方法は現在のMIC法と非常によく一致す
る。
しかしこの計算方法は、現在のMICであると認められて
いる濃度の抗生物質が存在するウエルにときどきみられ
る低レベルの発育を故意に無視している。実際現存の標
準法では18-20時間培養の後でさえこのような低レベル
の発育を検出するのは不可能である。このような場合従
来のMIC値は低くとりすぎており、治療方針決定のため
の適切なMIC濃度は、本発明の方法を使用し、現在一般
に認められているMIC値の近辺でときどきみられる低レ
ベルの菌の発育を無視しない変更した計算方法を用いる
ことによって得られるやや高い濃度にあると本発明者ら
は考えている。
この結果の解釈の基準が選ばれたところでは、「明かな
発育」のための条件()は無視されるか又は閾値が陰性
コントロールと最大発育蛍光収量の幅の６分の１又は10
分の１まで落としてもよい。
こうして使用すると本発明の方法は迅速で好適な結果を
与えるだけでなく、現存の方法と比較すると感度と判定
においても利点があると考えられる。
本発明の方法を使用しそれを解釈するもうひとつの理由
を記載する。それは試験中の抗生物質に対する耐性誘導
の現象である。
ある微生物、特に黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)では抗生物質、特にペニシリ
ンやセファロスポリン系のベータラクタム系抗生物質に
対する耐性が、その抗生物質の存在下でわずか一晩の培
養で現れることがしばしばある。従ってどのような方法
を使用するにせよ４時間の培養結果は抗生物質による阻
害を示すが、18時間培養の結果は耐性誘導の後の回復と
発育を示す。
この種の影響があると疑われるときは４時間の培養の結
果を注意深く扱い確認をするか、又は長期的に耐性が現
れると考えられる場合は抗生物質が影響を受けるのを避
けるようなステップをとることもできる。
たとえばMIC試験用のベータラクタム系抗生物質耐性株
の接種浮遊液を得るために前培養をする場合は、それ自
体公知の方法で耐性に関与するベータラクタマーゼ酵素
形成を誘導するのに用いるような濃度で、ペニシリンＧ
やメチシリンのようなベータラクタム系抗生物質の非致
死量の存在下で前培養をすることができる。この条件の
ための濃度としてはたとえばメチシリン誘導体１ｍに
つき0.25マイクログラムのオーダーである。
前記した系の変法としてその他の多くの化合物を蛍光原
性基質として使用可能である。たとえば、ウンベリフェ
ロンのペプチドおよびエステル、4-メチルウンベリフェ
ロン、3-カルボキシ-7-ヒドロキシクマリン、3-カルボ
キシアミド-7-ヒドロキシクマリン、3-フェニル-7-ヒド
ロキシクマリン、3-アセチル-7-ヒドロキシクマリン、3
-カルボキシエチル-7-ヒドロキシクマリン、3-シアノ-7
-ヒドロキシクマリン、7-アミド-4-メチルクマリン、7-
アミド-4-トリフルオロメチルクマリン、2-ナフチルア
ミン、4-メトキシ-B-ナフチルアミン、ナフトール-AS(3
-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸アニリド）、インドキシルお
よび酢酸Ｎ−メチルインドキシルと酢酸インドキシルを
含む1-（アルファ）−及び2-（ベータ）−ナフトール誘
導体、レソルフィン、ヨウ化1-メチル-7-ヒドロキシキ
ノリウム、及び6-アミノ−キノリン（それ自身公知の物
質である）がある。
実施例５ 本例は本発明の態様の幾つかの実施に適した安定化した
蛍光原性基質を含むマイクロタイターウエルの調製法を
示す。
70℃の湯浴中で攪拌しながら307mgの4-メチルウンベリ
フエリルフォスフェート(Koch-Light)を５ｍの蒸留水
に溶かし、次に濾過滅菌する。121℃で15分オートクレ
ーブにかけてから冷却した５ｍの５％W/Vのポリビニ
ルアルコール（シグマタイプII，No.P8136)を混合す
る。トリフルオロ酢酸塩の形で市販されている(Cambrid
ge Research Biochemicals)7-(N)-L-アラニル-7-アミド
-4-メチルクマリン660mgを20ｍの2-メトキシエタノー
ルに溶かす。304mgの4-メチルウンベリフエリルノナノ
エート(Koch-Light)を20ｍの2-メトキシエタノールに
溶かす。
この２種類の2-メトキシエタノール溶液を合わせてから
上記のPVA溶液を加える。各マイクロタイターウエルに1
00マイクリットルずつ分注し55℃、20Torrで１時間乾燥
させる。使用するときまで乾燥剤を入れて遮光密封した
容器に保持する。こうして標準量の栄養培地中の微生物
浮遊物を接種すべきマイクロタイターウエルができあが
る。
必要なときは、マイクロタイターウエル中で培養するの
に必要な標準発育阻害物質又は発育促進物質の適当量を
メトキシエタノール／ポリビニルアルコール混合液中に
加えておくと便利である。あるいはこれらの物質を別に
分注乾燥して加えておくか、又は菌の接種前に液体添加
物として加えてもよい。
培養のその他の詳細は標準的な方法であり、蛍光の結果
の読み方は本明細書において前記したとおりである。
実施例６ 本例は接種培養試験プレートの培地中の接種用菌浮遊液
に加えるための添加済紙片の調製方法を示す。この方法
は実施例３に記載した乾燥キャップ調製法とは又別の方
法である。方法は下記の通りである。
153.5mgの4-メチルウンベリフエリルフォスフェート(Ko
ch-Light)を75℃の湯浴中で攪拌しながら2.5ｍの蒸留
水に溶かし、次に濾過滅菌する。121℃で15分オートク
レーブ後冷却し、30％W/Vポリビニルアルコール（シグ
マタイプIINO.P8136)2.5ｍ混合する。トリフルオロ酢
酸塩の形で市販されている7-(N)-L-アラニル-7-アミド-
4-メチルクマリン(Cambridge Research Biochemicals)3
30mgを10ｍの2-メトキシエタノールに溶かす。
この２種類の2-メトキシエタノール溶液を合わせ次に前
記のPVA溶液を加える。抗生物質の乾燥に用いられる非
多孔性の９mm×14.7mmの紙片に100マイクロリットル添
加し、55℃、20Torrで１時間乾燥させる。使用するとき
まで乾燥剤を入れて遮光密封した容器に保存する。
結論として本発明は広範囲の抗生物質感受性試験改良
法、それらに対応する培養法、添加済試験プレート、及
びそれらに適合するマイクロタイタープレート、培地容
器、栓および挿入物を与える。これらの方法より当業者
は各々の目的に適した方法を選択することができる。た
とえば大腸菌(E.coli)やその他のほとんど全てのグラム
陰性腸内細菌について試験をしたいときはAAMCを用いる
方法が好適であり、大量の未同定の野生の母集団からの
分離株の感受性のスクリーニングには蛍光原性基質を種
々組み合わせた方法が有用である。ある場合には未同定
の微生物を蛍光原性基質又はその選んだ組合せと接触さ
せて予備スクリーニングを実施し、充分な量の蛍光を発
すること確認することが好適である。
本明細書及び請求の範囲に示した特徴は、いかなる組合
せでも実施、利用可能であり、ここに示した実施例に限
られるものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、接種用の標準試験管キャップ、第２図は接種
用の標準試験管のそれぞれ断面図を示す。 （符号の説明） １…接種用標準試験管キャップ、 ２…包装剤、 ３…接種用標準試験管、 ４…培地浮遊液、 ５…密封パッキング、 ６…乾燥部分
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨブリング・イアン イギリス国ノ−ザンプトンシヤ−・ラツシ ユデン・リンフオ−ド・ウエイ25 (72)発明者 サンズ・ト−マス・ジヨン イギリス国ノ−ザンプトンシヤ−・ウエリ ングボロウ・ソマ−フオ−ド・ロ−ド52ビ −

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微生物培養試験法の改良法であり、発育促
    進および／または抑制物質の存在下、試験微生物を培養
    し、 酵素的に加水分解して蛍光物質を生成する蛍光原性基質
    と反応させ、 微生物の発育を、前記蛍光原性基質の加水分解によって
    生成する蛍光物質の蛍光収量で測定し、 前記蛍光原性基質は、 (a)7-(N)-(アミノアシル)-7-アミド-4-メチルクマリン (b)4-メチルウンベリフエリルフォスフェートおよび4-
    メチルウンベリフエリルノナノエートから成るグループ
    から選ばれる１または２の蛍光原性基質 を含んで成ることを特徴とする微生物学的試験方法。
  2. 【請求項２】微生物培養試験法の改良法であり、試験微
    生物を培養し、 酵素的に加水分解して蛍光物質を生成する蛍光原性基質
    と反応させ、 微生物の発育を、前記蛍光物質の蛍光収量で測定し、 前記蛍光原性基質は、 (a)7-(N)-(アミノアシル)-7-アミド-4-メチルクマリン
    および (b)4-メチルウンベリフエリルフォスフェートと4-メチ
    ルウンベリフエリルノナノエートから成るグループから
    選ばれる１または２の蛍光原性基質 を含んで成り、 前記蛍光原性基質の存在下において、試験微生物を発育
    させることを特徴とする微生物学的試験方法。
  3. 【請求項３】微生物の発育が発育促進および／または抑
    制物質の存在下に行われる特許請求の範囲第２項記載の
    方法。
  4. 【請求項４】別の評価方法によって培養結果を確認でき
    るように、さらに培養するのに適した形で試験微生物を
    保持するステップを含むことを特徴とする特許請求の範
    囲第１項又は第２項記載の方法。
  5. 【請求項５】少なくとも５×104個/mの濃度範囲の微
    生物を使用することを特徴とする特許請求の範囲第１項
    又は第２項記載の方法。
  6. 【請求項６】試験微生物を4-7時間培養する特許請求の
    範囲第１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】試験微生物を3.5-5時間培養する特許請求
    の範囲第１項又は第２項に記載の方法。
  8. 【請求項８】蛍光原性基質の濃度が、30-300マイクロモ
    ルである特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】試験微生物の培養は、試験抗生物質の希釈
    系列を含有する一連の培養容器で行われ、 試験微生物は、接種浮遊液として接種され、 培養は4-7時間行われ、 蛍光収量による培養液中の微生物の発育の有無によっ
    て、MIC(最小発育阻止濃度）レベルを評価する特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
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